CN114854053B - 一种聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇‑壳聚糖双网络水凝胶及其制备方法和应用，属于医用新材料技术领域。所述方法：将经EDCI/NHS活化的KGN溶液与Tetra‑PEG‑NH2反应，得到KGN‑Tetra‑PEG‑NH2，并将其配制成第一溶液；将壳聚糖溶液与Tetra‑PEG‑NHS按含有氨基和NHS的摩尔比为（0.01~0.25）：1反应10~300s，得到第二溶液；将第一溶液和第二溶液按含有氨基与NHS的摩尔比为（0.8~1.2）：1混合后静置成胶，经激活处理，得到聚乙二醇‑壳聚糖双网络水凝胶。本发明中的水凝胶具有力学强度高、成软骨诱导分化微环境、软骨修复效果佳等优点。

Description

一种聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医用新材料技术领域，尤其涉及一种聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
运动相关外伤或退行性变均可导致软骨损伤，由于软骨无血管、无神经、无淋巴管、低代谢率和低细胞密度的特性，使其损伤发生后难以自我修复。目前，传统的临床治疗方法主要包括关节镜清理、软骨磨削成型、骨髓刺激技术、自体或同种异体骨软骨移植、自体软骨细胞移植、金属或硅橡胶移植局部替代等，但存在纤维软骨再生、供体部位并发症、移植物失败、种子细胞去分化、替代物松动翻修等局限性和不足。幸运的是，组织工程技术为软骨损伤提供了一种很有希望的治疗策略，具有修复大面积组织缺损、避免供体并发症和两期侵袭性手术的独特优势，支架材料、生长信号和种子细胞是组织工程的三个基本要素。
水凝胶作为一种典型的生物支架材料，具有高含水量和良好的生物相容性，可为组织再生提供富含水的三维网络结构，用于输送种子细胞、生长因子、营养物质和代谢废物。同时，还可以根据特殊需要，使用物理或化学交联方法、聚合物种类、不同分子的掺入，调节水凝胶的溶胀率、降解率、孔隙率、生物相容性、力学强度等性能，进行定制。近年来，水凝胶被广泛作为细胞/生长因子载体的组织工程支架来促进软骨修复再生，并显示出较好的软骨修复效果。当水凝胶作为承重组织再生的支架材料时，其力学性能至关重要。因为水凝胶不仅为种子细胞提供生长、增殖和分化所需要的微环境，而且还提供了力学支撑及维持软骨细胞表型所必须的三维结构。双网络（double network, DN）水凝胶以硬而脆的非均相聚电解质为第一网络，以软而韧的中性聚合物为第二网络，两种物理性质差异较大的互穿网络可以在刚度和韧性之间实现力学性能的平衡，从而赋予DN水凝胶优异的力学性能。作为一种高水含量、高力学强度和高韧性的新型材料，其力学性能明显优于传统的水凝胶，能够承受连续的、高强度的加载-卸载过程，并且具有损伤后自愈合的能力，因此越来越多被作为生物支架材料应用于承重组织的修复再生。
Kartogenin（KGN），分子式C20H15NO3，作为一种非蛋白小分子软骨形成诱导剂通过与丝状蛋白A（filamin A, FLNA）、核心结合因子β（core-binding factor β, CBFβ）和转录因子RUNX1相互作用诱导软骨形成，显著促进间充质干细胞成软骨诱导分化，增强软骨基质（如COL-2和GAG）的合成，同时，KGN可以绕过免疫反应、无任何毒性作用、具有低成本和半衰期长等突出优势。重要的是，KGN作为一种非常稳定的小分子，可以在室温下储存和运输。因此，与蛋白类生长因子相比，KGN具有明显的优势，在软骨再生方面具有广阔的应用前景。
中国专利申请CN112646202A公开了一种功能化双网络水凝胶及其制备方法，该专利申请中的双网络水凝胶由壳聚糖交联网络和四臂聚乙二醇交联网络相互穿插形成，所述壳聚糖交联网络由偶联有KGN的壳聚糖交联而成；所述四臂聚乙二醇交联网络由第一前体和第二前体经化学反应而成，所述第一前体为Tetra-PEG-NH2，所述第二前体为Tetra-PEG-NHS，但是该专利申请中的壳聚糖交联网络和四臂聚乙二醇交联网络两者之间相互穿插，两者之间相对独立，彼此之间的作用力很小，这导致该专利申请中的功能化双网络水凝胶存在交联密度低、力学强度低等问题；此外，该专利申请中的功能化双网络水凝胶还存在溶胀率过大、表现出的软骨修复效果有待进一步提高等问题。
因此，非常有必要在现有技术的基础上提供一种聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶及其制备方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的一个或者多个技术问题，本发明提供了一种聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶及其制备方法。
本发明在第一方面提供了一种聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶的制备方法，所述方法包括如下步骤：
（1）将经EDCI/NHS活化的KGN溶液与Tetra-PEG-NH2反应，得到KGN-Tetra-PEG-NH2；
（2）将所述KGN-Tetra-PEG-NH2配制成第一溶液；
（3）将壳聚糖溶液与Tetra-PEG-NHS反应10~300s，得到第二溶液；所述壳聚糖溶液中含有的氨基与所述Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为（0.01~0.25）：1；
（4）将所述第一溶液和所述第二溶液混合后静置成胶，得到复合水凝胶，然后将所述复合水凝胶进行激活处理，得到聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶；所述第一溶液中含有的氨基与所述第二溶液中含有的NHS基团的摩尔比为（0.8~1.2）：1。
优选地，步骤（3）中，所述反应的时间为60~180s。
优选地，在步骤（3）中，所述壳聚糖溶液中含有的氨基与所述Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为（0.1~0.2）：1。
优选地，步骤（1）包括如下子步骤：
（a）用水将KGN、EDCI和NHS混合均匀，得到混合液，然后将所述混合液的pH值调节至5.5~5.8后在30~40℃反应2h，得到经EDCI/NHS活化的KGN溶液；
（b）往经EDCI/NHS活化的KGN溶液中加入Tetra-PEG-NH2和溶剂并混合均匀，然后在30~40℃反应，经透析与冻干，得到KGN-Tetra-PEG-NH2。
优选地，在步骤（b）中，所述溶剂为水；和/或所述KGN-Tetra-PEG-NH2含有的KGN与含有的氨基的摩尔比为（0.02~2）：1。
优选地，所述KGN-Tetra-PEG-NH2含有的KGN与含有的氨基的摩尔比为（0.2~1.5）：1。
优选地，所述激活处理为：将所述复合水凝胶浸泡于多价阴离子溶液中8~18h；所述多价阴离子溶液中含有的多价阴离子为柠檬酸根、磷酸根、亚磷酸根、硫酸根、亚硫酸根、过硫酸根、硼酸根中的一种或多种。
本发明在第二方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶。
本发明在第三方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶在构建组织工程软骨产品中的应用。
优选地，所述组织工程软骨产品的构建包括如下步骤：
S1、获得PB-MSCs种子细胞，然后将PB-MSCs种子细胞配制成PB-MSCs悬液；
S2、将所述聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶冷冻干燥后与所述PB-MSCs悬液复合，得到组织工程软骨产品。
本发明与现有技术相比至少具有如下有益效果：
（1）本发明得到的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶由壳聚糖网络和聚乙二醇网络（四臂聚乙二醇网络）交联而成，交联密度大，力学强度高。
（2）本发明中的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶模拟天然软骨的力学特征，水凝胶具备更好的力学性能，能够吸收压缩载荷，抵抗纵向变形，足以应对关节腔内复杂的力学环境，同时具有更小的溶胀率。
（3）本发明中的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶具有合理的微观孔隙结构，利于细胞浸润、迁移，营养物质、电解质、代谢废物的扩散和交换，并且具有与软骨的生长速度相匹配的生物降解性。
（4）本发明中的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶具有很好的细胞亲和性和功能特异性，能负载生物活性因子并能使得缓释生物活性因子的速率更合适，具有适宜种子细胞黏附、增殖和分化的仿生微环境，且具有更好的免疫调节特性，能够很好地诱导M2型巨噬细胞极化，软骨修复效果更佳。
（5）本发明中的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶在构建组织工程软骨产品时，以PB-MSCs作为种子细胞，PB-MSCs可通过微创的方式获得，患者认可度高，易于培养，且在成软骨分化微环境下能产生足够的COL-2、蛋白多糖和其他ECM成分。
（6）本发明制备聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶所用原料及降解产物安全无毒，具有良好的生物安全性。
（7）本发明中的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶使用小分子化合物KGN作为成软骨诱导分化的生物活性因子，KGN性能稳定，具有良好生物安全性、低成本和半衰期长等突出优势，从而有利于组织工程软骨产品室温下储存和长距离运输。
（8）本发明中的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶制备流程简单、显著减少制造时间及生产成本，便于储存及运输。
附图说明
图1是本发明实施例1~实施例5、对比例1~对比例3中的双网络水凝胶的压缩应力对比图；
图2是本发明实施例1~实施例5、对比例1~对比例3中的双网络水凝胶的压缩弹性模量对比图；
图3是本发明实施例1以及对比例3中的双网络水凝胶在含有蛋白酶K的PBS溶液中或不含有蛋白酶K的PBS溶液中6周的体外降解曲线（n=3）；
图4是本发明实施例1以及对比例3中的双网络水凝胶在含有蛋白酶K的PBS溶液中不同时间点的KGN累积释放率曲线；
图5是本发明实施例1以及对比例3中的双网络水凝胶中COL-2和GAG的含量结果图；在图5中，A表示的是COL-2含量结果图，B表示的是GAG含量结果图；
图6是空白组、本发明对比例3以及实施例1中的双网络水凝胶对兔骨软骨缺损修复4周、8周和12周后的甲苯胺蓝染色结果图；
图7是空白组、本发明对比例3以及实施例1中的双网络水凝胶对兔骨软骨缺损修复4周、8周和12周的Wakitani组织学评分结果图；
在图7中，在4周、8周和12周时间点的评分从左至右依次表示的是空白组、PEG-CHI-KGN、KGN-PEG-CHI的评分结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明在第一方面提供了一种聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶的制备方法，所述方法包括如下步骤：
（1）将经EDCI/NHS活化的KGN溶液与Tetra-PEG-NH2反应，得到KGN-Tetra-PEG-NH2；在本发明中，步骤（1）是为了使得Tetra-PEG-NH2上偶联KGN，得到KGN-Tetra-PEG-NH2，在本发明中，也可以将KGN-Tetra-PEG-NH2记作(KGN)x-Tetra-PEG-(NH2)y，其中，x+y=4，优选的是，x/y=0.02~2；本发明通过调节Tetra-PEG-NH2与KGN的投料比，可以得到不同接枝率的(KGN)x-Tetra-PEG-(NH2)y；
（2）将所述KGN-Tetra-PEG-NH2配制成第一溶液；在步骤（2）中，所述第二溶液以PBS溶液（磷酸盐缓冲溶液）为溶剂，本发明对所述第一溶液的浓度没有特别的限制，优选的是，所述第一溶液的浓度为100~300mg/mL；特别说明的是，本发明中溶液的浓度，均指的是溶液中含有的溶质的浓度；
（3）将壳聚糖溶液与Tetra-PEG-NHS反应10~300s（例如10、15、30、60、80、100、120、150、180、200、250或300s），得到第二溶液；反应前，所述壳聚糖溶液中含有的氨基与所述Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为（0.01~0.25）：1（例如0.01:1、0.05:1、0.08:1、0.1:1、0.12:1、0.15:1、0.18:1、0.2:1或0.25:1）；在本发明中，所述壳聚糖溶液与Tetra-PEG-NHS的反应，可以是直接将Tetra-PEG-NHS加入到壳聚糖溶液中进行反应，或者是先将Tetra-PEG-NHS配制成Tetra-PEG-NHS溶液之后，再与壳聚糖溶液进行反应；所述壳聚糖溶液和/或所述Tetra-PEG-NHS溶液以PBS溶液（即磷酸盐缓冲溶液）为溶剂；本发明对所述壳聚糖溶液和/或所述Tetra-PEG-NHS溶液的浓度没有特别的要求，例如可以为20~200mg/mL；在本发明中，步骤（3）的反应时间控制在10~300s以及使得所述壳聚糖溶液中含有的氨基与所述Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为（0.01~0.25）：1尤为重要，如此可以在使壳聚糖上的NH2与Tetra-PEG-NHS上的NHS发生反应从而使得壳聚糖能够与Tetra-PEG-NHS具有一定程度的化学交联的同时，可以控制两者的交联程度，避免过度交联；
（4）将所述第一溶液和所述第二溶液混合后静置成胶，得到复合水凝胶，然后将所述复合水凝胶进行激活处理，得到聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶；混合前，所述第一溶液中含有的氨基与所述第二溶液中含有的NHS基团的摩尔比为（0.8~1.2）：1（例如0.8:1、0.85:1、0.9:1、0.95:1、1:1、1.1:1或1.2:1）；在本发明中，步骤（4）中所述混合例如可以通过圆周振荡仪进行；在本发明中，将聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶简记为KGN-PEG-CHI双网络水凝胶或直接简记为KGN-PEG-CHI。
在本发明中，Tetra-PEG-NHS为带有-NHS修饰基团的四臂PEG，Tetra-PEG-NH2为带有-NH2修饰基团的四臂PEG，这两种四臂PEG均为市面上可以直接购买的产品；在本发明中，涉及的PBS溶液均指的是pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，所述PBS溶液可以采用市面上直接购买的产品或者通过现有方法配制均可；本发明对壳聚糖、KGN(中文名称为2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸)、EDCI（中文名称为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和NHS（中文名称为N-羟基琥珀酰亚胺）等的来源没有特别的限制，均为市面上可以直接购买的产品。本发明选择的是KGN小分子化合物作为成软骨诱导分化的生物活性因子，用于构建聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶，以利于后续组织工程软骨产品的储存及运输；但其实选用其它种类的生物活性因子也是可以的。本发明可以实现生物活性因子KGN的控制释放。
中国专利申请CN112646202A公开了一种功能化双网络水凝胶的制备方法，其是先形成CHI-KGN化合物，然后将壳聚糖-KGN化合物和Tetra-PEG-NH2配制成第一前体溶液，将Tetra-PEG-NHS配制成第二前体溶液，将第一前体溶液和第二前体溶液混合后静置成胶，得到复合水凝胶，然后将复合水凝胶进行激活处理，得到功能化双网络水凝胶；该专利申请将壳聚糖-KGN化合物和Tetra-PEG-NH2同时与Tetra-PEG-NHS混合，虽然在与KGN反应之后得到的壳聚糖-KGN化合物上可能还剩余有少量的氨基，但Tetra-PEG-NHS与Tetra-PEG-NH2之间反应较快，Tetra-PEG-NHS基本上绝大部分会与Tetra-PEG-NH2反应，通过Tetra-PEG-NH2的氨基与Tetra-PEG-NHS的NHS基团的反应形成四臂聚乙二醇交联网络，同时利用壳聚糖-KGN化合物的同步混合与成胶，这使得CN112646202A得到的是由壳聚糖交联网络和四臂聚乙二醇交联网络相互穿插形成的双网络水凝胶，该专利申请中，壳聚糖交联网络与四臂聚乙二醇交联网络相对独立，彼此之间的作用力很小，这导致该专利申请中的功能化双网络水凝胶存在交联密度低、力学强度低等问题；此外，本发明发现，该专利申请中的功能化双网络水凝胶还存在溶胀率过大、表现出的软骨修复效果有待进一步提高等问题。
本发明与现有技术CN112646202A相比，提高了壳聚糖网络与聚乙二醇交联网络之间的相互作用，由于壳聚糖有部分会通过化学键的形式连接在聚乙二醇网络中，还有部分单独壳聚糖存在于网络中，那么能够较好的提高两个网络之间的相互作用，从而进一步增加交联程度，降低溶胀率和提高力学性能，虽然现有技术中也可以通过提高壳聚糖的含量来提高材料的力学性能等，但是壳聚糖含量过高的话，也会导致材料的降解速率变慢，对于组织工程中起到临时支架作用的水凝胶材料而言，若降解速率太慢，会不利于自身细胞的长入，并且壳聚糖含量过高也会导致材料的孔隙率降低等，这些都最终会导致材料的修复效果明显变差；而本发明制得的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶相比CN112646202A中制得的PEG-CHI-KGN双网络水凝胶，在提高力学性能的同时，具有更合适的降解速率和KGN释放速率，两者之间相匹配的效果更好，本发明材料适当较快的降解速率更有利于自身组织的长入，具有更好的软骨修复效果。
本发明与CN112646202A相比，并不是简单地调整了KGN的偶联位置以及壳聚糖与Tetra-PEG-NH2与Tetra-PEG-NHS的混合顺序。本发明材料的制备构思与CN112646202A相比完全不同是：本发明先将KGN偶联到Tetra-PEG-NH2上，通过调整两者的投料比，使得Tetra-PEG-NH2上接枝有一定的KGN，但仍剩余与一定数量的NH2，并将其配制成第一溶液；然后，本发明将壳聚糖溶液与Tetra-PEG-NHS按含有氨基和NHS基团的摩尔比为（0.01~0.25）：1反应10~300s，得到第二溶液，使得壳聚糖上的NH2能够与Tetra-PEG-NHS上的NHS基团发生反应，从而能够使得壳聚糖能够与PEG具有一定程度的化学交联，并由于Tetra-PEG-NHS与壳聚糖上的NH2反应相对较慢，控制二者含有的NHS和NH2的摩尔比和反应时间，能很好地控制二者的交联程度，避免过度交联；最后将第一溶液和第二溶液混合后，使得第一溶液中剩余未反应的-NH2和第二溶液中剩余未反应的-NHS反应，最后通过原位成胶和盐溶液浸泡离子交联成胶相结合的方法制备了由壳聚糖网络和四臂聚乙二醇网络交联而成的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶。在本发明中，通过提前将Tetra-PEG-NHS与壳聚糖进行反应10~300s，提高了二者的反应程度，增加了彼此之间的作用力，然后再与KGN-Tetra-PEG-NH2混合从而将Tetra-PEG-NHS上的NHS基团完全反应，实现了交联程度的灵活调控；通过调节第一溶液中剩余的氨基和第二溶液中剩余的NHS基团的摩尔比，就能够进一步调节复合凝胶的交联程度。
本发明与CN112646202A相比，明显提高了壳聚糖网络和四臂聚乙二醇网络之间的交联密度，因而能够提升聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶的力学性能；本发明中的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶模拟天然软骨的力学特征，水凝胶具备更好的力学性能，能够吸收压缩载荷，抵抗纵向变形，足以应对关节腔内复杂的力学环境，同时具有更小的溶胀率；本发明中的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶具有合理的微观孔隙结构，利于细胞浸润、迁移，营养物质、电解质、代谢废物的扩散和交换，并且具有与软骨的生长速度相匹配的生物降解性；本发明中的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶具有很好的细胞亲和性和功能特异性，能负载并能使得缓释生物活性因子的速率更合适，具有适宜种子细胞黏附、增殖和分化的仿生微环境，且具有更好的免疫调节特性，能够很好地诱导M2型巨噬细胞极化，软骨修复效果更佳。
根据一些优选的实施方式，在步骤（3）中，所述反应的时间为60~180s（例如60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170或180s）。本发明发现，在步骤（3）中，优选为所述反应的时间为60~180s，若反应时间太短，则壳聚糖上的氨基与Tetra-PEG-NHS上的NHS基团反应程度不够，若反应时间太长，则壳聚糖上的氨基与Tetra-PEG-NHS上的NHS基团反应过度，两者均会最终导致壳聚糖网络和四臂聚乙二醇网络之间的交联度不够，会降低聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶的力学强度，也会影响聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶的溶胀性能、可降解性能以及修复效果等。
根据一些优选的实施方式，在步骤（3）中，所述壳聚糖溶液中含有的氨基与所述Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为（0.1~0.2）：1（例如0.1:1、0.12:1、0.15:1、0.18:1或0.2:1）。本发明发现，在步骤（3）中，优选为所述壳聚糖溶液中含有的氨基与所述Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为（0.1~0.2）：1，更有利于使得所述壳聚糖与Tetra-PEG-NHS之间发生合适程度的反应，从而最终有利于得到壳聚糖网络和四臂聚乙二醇网络之间交联合适的双网络水凝胶；对于本发明而言，步骤（3）中，严格控制所述反应的时间与反应时所述壳聚糖溶液中含有的氨基与所述Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比，在提高壳聚糖与Tetra-PEG-NHS之间的反应的同时，能很好地控制两者之间的交联程度，避免过度交联，对得到本发明中综合性能更佳的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶是至关重要的。
根据一些优选的实施方式，步骤（1）包括如下子步骤：
（a）用水将KGN、EDCI（中文名称1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和NHS（中文名称N-羟基琥珀酰亚胺）混合均匀，得到混合液，然后将所述混合液的pH值调节至5.5~5.8后在30~40℃反应2h，得到经EDCI/NHS活化的KGN溶液；
（b）往经EDCI/NHS活化的KGN溶液中加入Tetra-PEG-NH2和溶剂并混合均匀，然后在30~40℃反应，经透析与冻干，得到KGN-Tetra-PEG-NH2；在步骤（b）中，优选的是，所述溶剂为水；在步骤（b）中，优选的是，在37℃下搅拌反应24h；本发明对所述冻干的条件没有特别的限制，采用常规的冻干条件即可。
根据一些具体的实施方式，KGN-Tetra-PEG-NH2的合成为：
（a）称取KGN 120 mg，EDCI 726 mg，NHS 434.8 mg溶于20 mL蒸馏水中，调节溶液pH值至5.7，37℃下搅拌反应2h，得到经EDCI/NHS活化的KGN溶液；
（b）称取Tetra-PEG-NH2 4000 mg加入至上述经EDCI/NHS活化的KGN溶液中，并进一步添加蒸馏水使溶液总体积至150 mL，37℃条件下搅拌反应24h，然后将反应后得到的反应产物置于截留分子量为1kD的透析袋内透析，每12h更换一次蒸馏水，持续透析72h；经冻干后可制备得到纯化的(KGN)x-Tetra-PEG-(NH2)y化合物，即KGN-Tetra-PEG-NH2。
根据一些优选的实施方式，所述KGN-Tetra-PEG-NH2含有的KGN与含有的氨基的摩尔比为（0.02~2）：1。
根据一些优选的实施方式，所述KGN-Tetra-PEG-NH2含有的KGN与含有的氨基的摩尔比为（0.2~1.5）：1。
根据一些优选的实施方式，所述激活处理为：将所述复合水凝胶浸泡于多价阴离子溶液中8~18h；所述多价阴离子溶液中含有的多价阴离子为柠檬酸根、磷酸根、亚磷酸根、硫酸根、亚硫酸根、过硫酸根、硼酸根中的一种或多种；在本发明中，所述多价阴离子溶液例如为多价阴离子水溶液。
根据一些具体的实施方式，所述聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶的制备包括如下步骤：
（1）往经EDCI/NHS活化的KGN溶液中加入Tetra-PEG-NH2混合均匀后，经反应，得到KGN-Tetra-PEG-NH2；
（2）以PBS溶液为溶剂将所述KGN-Tetra-PEG-NH2配制成浓度为200mg/mL的第一溶液；
（3）以PBS溶液为溶剂将壳聚糖配制成浓度为25mg/mL壳聚糖溶液，并按所述壳聚糖溶液中含有的氨基与所述Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为（0.01~0.25）：1称取Tetra-PEG-NHS，然后将Tetra-PEG-NHS加入到壳聚糖溶液中进行反应，反应温度为室温，反应时间为10~300s，得到第二溶液。
（4）将所述第一溶液和所述第二溶液按照所述第一溶液中含有的氨基与所述第二溶液中含有的NHS基团的摩尔比为（0.8~1.2）：1混合后通过圆周振荡仪快速混匀，静置成胶，待成胶完全，得到复合水凝胶，将得到的复合水凝胶浸泡在饱和柠檬酸钠溶液中进行激活处理，静置过夜，得到聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶。
本发明在第二方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶。
本发明在第三方面提供了由本发明在第一方面所述的制备方法制得的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶在构建组织工程软骨产品中的应用。
种子细胞是组织工程软骨产品的基本要素之一，间充质干细胞（Mesenchymalstem cells, MSCs）作为多能祖细胞具有自我更新和成软骨分化的能力，被认为是软骨修复的替代细胞来源。骨髓、脂肪、滑膜、脐带等多种组织中均可分离获得MSCs，但存在取样过程创伤大、不能反复取样、患者认可度低、伦理限制、免疫排斥及疾病传播风险。与其他组织来源的MSCs相比，外周血MSCs（peripheral blood-derived MSCs, PB-MSCs）具有取样方式微创、可反复取样、患者认可度高等独特的优势，因此在理论上更适合临床应用，到目前为止，体内应用PB-MSCs修复软骨均取得了较好的治疗效果，无明显不良事件发生。
然而，目前，尚无研究报道同时具备种子细胞微创易得、力学强度高、生物相容性好、与软骨的生长速度相匹配的生物降解性、良好的细胞亲和性和功能特异性，能负载并缓释生物活性因子，具有适宜种子细胞黏附、增殖和分化的仿生微环境，制备过程简单、易于储存和运输等特征的组织工程软骨产品。若该种组织工程软骨产品成功制备，则有望尽快实现临床转化，并应于软骨、半月板等承重组织修复再生相关领域。
为此，在本发明的一些优选的实施方式中，所述组织工程软骨产品的构建包括如下步骤：
S1、获得PB-MSCs种子细胞，然后将PB-MSCs种子细胞用PBS溶液配制成PB-MSCs悬液；PB-MSCs悬液的浓度例如可以为1×107个/mL；在本发明中，PB-MSCs种子细胞的获得方式，例如可以是经粒细胞集落刺激因子（G-CSF）及CXCR4拮抗剂AMD3100动员外周血，使用密度梯度离心法及细胞贴壁法从动员的外周血中分离培养获得PB-MSCs；
S2、将所述聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶冷冻干燥后与所述PB-MSCs悬液复合，得到组织工程软骨产品，本发明只要在冷冻干燥过程中保证无菌即可，对冷冻干燥的具体工艺条件不做具体的限定，采用现有常规操作即可；在本发明中，所述复合例如可以是将所述PB-MSCs悬液滴注在冷冻干燥后的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶的表面，并进一步采用离心法促进PB-MSCs种子细胞与聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶的复合，然后放入细胞培养箱内孵育2h。
本发明构建了一种同时具有种子细胞微创易得、力学强度高、生物相容性好、细胞亲和性佳、生物可降解、制备过程简单、成软骨诱导分化微环境、易于储存和运输、不涉及有毒引发剂和丙烯酰胺类起始材料、生物安全性高等特征的组织工程软骨产品，以适用于软骨、半月板等承重组织的修复再生及后续的临床转化。本发明通过将本发明所述的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶与微创易得的外周血间充质干细胞（PB-MSCs）复合，可实现上述组织工程软骨产品的构建。
下文将通过举例的方式对本发明进行进一步的说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
实施例1
①KGN-Tetra-PEG-NH2的合成：
（a）称取KGN 120 mg，EDCI 726 mg，NHS 434.8 mg溶于20 mL蒸馏水中，调节溶液pH值至5.7，37 ℃下搅拌反应2 h，得到经EDCI/NHS活化的KGN溶液；
（b）称取Tetra-PEG-NH2（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020700209，分子量1W）4000 mg加入至上述经EDCI/NHS活化的KGN溶液中，并进一步添加蒸馏水使溶液总体积至150 mL，37℃条件下搅拌反应24h，然后将反应后得到的反应产物置于截留分子量为1kD的透析袋内透析，每12h更换一次蒸馏水，持续透析72h；经冻干后可制备得到纯化的(KGN)x-Tetra-PEG-(NH2)y化合物（x/y=0.28:1），即KGN-Tetra-PEG-NH2。
②以PBS溶液（pH=7.4）为溶剂将步骤①得到的所述KGN-Tetra-PEG-NH2配制成浓度为200mg/mL的第一溶液。
③以PBS溶液（pH=7.4）为溶剂将壳聚糖配制成浓度为25mg/mL壳聚糖溶液，并按所述壳聚糖溶液中含有的氨基与Tetra-PEG-NHS（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020702009）中含有的NHS基团的摩尔比为0.1:1称取Tetra-PEG-NHS，然后将Tetra-PEG-NHS加入到壳聚糖溶液中进行反应，反应温度为室温，反应时间为180s，得到第二溶液。
④将所述第一溶液和所述第二溶液按照所述第一溶液中含有的氨基与所述第二溶液中含有的NHS基团的摩尔比为1:1.05（通过核磁共振氢谱确定）混合后通过圆周振荡仪快速混匀，静置成胶，待成胶完全，得到复合水凝胶，然后加入饱和柠檬酸钠水溶液使饱和柠檬酸钠水溶液没过所述复合水凝胶进行浸泡，静置过夜，得到聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶（KGN-PEG-CHI）。
实施例2
实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于：
③以PBS溶液（pH=7.4）为溶剂将壳聚糖配制成浓度为25mg/mL壳聚糖溶液，并按所述壳聚糖溶液中含有的氨基与Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为0.15:1称取Tetra-PEG-NHS，然后将Tetra-PEG-NHS加入到壳聚糖溶液中进行反应，反应温度为室温，反应时间为120s，得到第二溶液。
实施例3
实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于：
③以PBS溶液（pH=7.4）为溶剂将壳聚糖配制成浓度为25mg/mL壳聚糖溶液，并按所述壳聚糖溶液中含有的氨基与Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为0.2:1称取Tetra-PEG-NHS，然后将Tetra-PEG-NHS加入到壳聚糖溶液中进行反应，反应温度为室温，反应时间为60s，得到第二溶液。
实施例4
实施例4与实施例1基本相同，不同之处在于：
③以PBS溶液（pH=7.4）为溶剂将壳聚糖配制成浓度为25mg/mL壳聚糖溶液，并按所述壳聚糖溶液中含有的氨基与Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为0.01:1称取Tetra-PEG-NHS，然后将Tetra-PEG-NHS加入到壳聚糖溶液中进行反应，反应温度为室温，反应时间为300s，得到第二溶液。
实施例5
实施例5与实施例1基本相同，不同之处在于：
③以PBS溶液（pH=7.4）为溶剂将壳聚糖配制成浓度为25mg/mL壳聚糖溶液，并按所述壳聚糖溶液中含有的氨基与Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为0.25:1称取Tetra-PEG-NHS，然后将Tetra-PEG-NHS加入到壳聚糖溶液中进行反应，反应温度为室温，反应时间为10s，得到第二溶液。
对比例1
对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于：
③以PBS溶液（pH=7.4）为溶剂将壳聚糖配制成浓度为25mg/mL壳聚糖溶液，并按所述壳聚糖溶液中含有的氨基与Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为0.3:1称取Tetra-PEG-NHS，然后将Tetra-PEG-NHS加入到壳聚糖溶液中进行反应，反应温度为室温，反应时间为30s，得到第二溶液。
对比例2
对比例2与实施例1基本相同，不同之处在于：
③以PBS溶液（pH=7.4）为溶剂将壳聚糖配制成浓度为25mg/mL壳聚糖溶液，并按所述壳聚糖溶液中含有的氨基与Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为0.01:1称取Tetra-PEG-NHS，然后将Tetra-PEG-NHS加入到壳聚糖溶液中进行反应，反应温度为室温，反应时间为360s，得到第二溶液。
对比例3
①CHI-KGN化合物的制备
利用碳二亚胺化学法使KGN末端羧基与CHI胺基之间形成化学连接的酰胺键，制备CHI-KGN化合物。
制备方法包括如下步骤：
称取KGN120mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI）726mg，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)434.8mg溶于20mL蒸馏水中，调节溶液pH值至5.7，37℃下搅拌反应2h，充分活化KGN的羧基，得到活化的KGN溶液。
称取壳聚糖4000 mg加入至上述活化的KGN溶液中，再添加蒸馏水使溶液总体积达到150 mL，37 ℃条件下搅拌反应24 h。
将反应后的反应物置于截留分子量为20 kD的透析袋内透析，每12 h更换一次蒸馏水，持续透析72 h。
将透析后的反应物冻干，得到纯化的材料，即为CHI-KGN化合物，-20 ℃下保存，备用。
②PEG-CHI-KGN双网络水凝胶（简记为PEG-CHI-KGN）的制备
称取制得的CHI-KGN化合物200 mg溶于8 mL的PBS溶液（pH=7.4）中，再加入400 mg的Tetra-PEG-NH2（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020700209），充分溶解，制备前体溶液1。
称取Tetra-PEG-NHS（购自厦门赛诺邦格，产品编号06020702009）400mg溶于2 mL的PBS溶液（pH=7.4）中，制备前体溶液2。
将前体溶液1和2混合后使用圆周震荡仪快速混匀，静置成胶，待成胶完全，获得PEG-CHI-KGN复合水凝胶，然后加入饱和柠檬酸钠水溶液使得饱和柠檬酸钠水溶液没过所述PEG-CHI-KGN复合水凝胶进行浸泡，静置过夜，获得PEG-CHI-KGN双网络水凝胶。
本发明对实施例1~5以及对比例1~3制得的双网络水凝胶进行了性能测试。
本发明通过压缩试验评估了双网络水凝胶的压缩性能，各实施例以及对比例对应的双网络水凝胶的压缩弹性模量及水凝胶破裂时的压缩应力（n=3）结果如表1所示，特别说明的是，本发明中的“n”均表示的是每个实验组进行实验的样本数。本发明还给出了实施例1~5、对比例1~3中的双网络水凝胶的压缩应力以及压缩弹性模量对比图（n=3），分别如图1和图2所示。
本发明对实施例1~5以及对比例1~3制得的双网络水凝胶的溶胀率进行了测试，本发明发现将各双网络水凝胶在PBS溶液中孵育24h后均能达到溶胀平衡，测得的各实施例以及对比例的平均溶胀率（n=3）结果如表1所示。
本发明以含有蛋白酶K的PBS溶液为降解介质，进一步模拟各实施例以及对比例中的双网络水凝胶在体内的降解过程。测得各实施例以及对比例中的双网络水凝胶在含有蛋白酶K的PBS溶液（PBS溶液中含有的蛋白酶K的浓度为200 μg/mL）中6周的质量损失率（n=3），结果如表1所示。
本发明还给出了实施例1和对比例3中的双网络水凝胶在含有蛋白酶K的PBS溶液中或不含有蛋白酶K的PBS溶液中6周的体外降解曲线（n=3），如图3所示，在含有蛋白酶K的PBS溶液中，实施例1和对比例3对应的双网络水凝胶的质量损失率分别约为61.2%和54.5%；在不含有蛋白酶K的PBS溶液中，实施例1和对比例3对应的双网络水凝胶的质量损失率分别约为17.6%和14.2%。
本发明使用紫外可见分光光度法测定各实施例以及对比例中双网络水凝胶在含有蛋白酶K的PBS溶液中6周的KGN的释放行为，KGN的累积释放率（n=3）结果如表1所示。本发明还给出了实施例1和对比例3中的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶在含有蛋白酶K的PBS溶液中不同时间点的KGN累积释放率曲线，如图4所示，从图4可以看出，实施例1和对比例3中两种聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶在含蛋白酶K的PBS溶液中缓慢平稳释放KGN，在第6周时分别约释放49%和43%。
表1
Figure 57729DEST_PATH_IMAGE001
组织工程软骨产品的构建：
①经粒细胞集落刺激因子（G-CSF）及CXCR4拮抗剂AMD3100动员外周血，使用密度梯度离心法及细胞贴壁法从动员的外周血中分离培养获得PB-MSCs；
②将各实施例以及对比例中的双网络水凝胶冷冻干燥，同时制备PB-MSCs悬液（PB-MSCs悬液的浓度为1×107个/mL，以PBS溶液为溶剂），将PB-MSCs悬液分别与各双网络水凝胶复合，构建组织工程软骨产品；所述复合是将所述PB-MSCs悬液滴注在冷冻干燥后的双网络水凝胶的表面，并进一步采用离心法促进PB-MSCs种子细胞与双网络水凝胶的复合，然后放入细胞培养箱内孵育2h。
构建的组织工程软骨产品的体外验证试验：
将实施例1以及对比例3中的双网络水凝胶按上述步骤①和②的方法构建组织工程软骨产品，将构建的组织工程软骨产品在细胞培养箱内体外培养2周，在2周内，通过ELISA和DMMB法分别测定实施例1以及对比例3中的双网络水凝胶中COL-2（n=3）和GAG的含量（n=3）。本发明给出了实施例1以及对比例3中的双网络水凝胶中2型胶原蛋白（COL-2）和糖胺聚糖（GAG）的含量结果图，如图5所示。图5中，实施例1对应的高的COL-2和GAG含量，表明本发明中的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶支架具有优异的成软骨分化的作用。
将构建的组织工程软骨产品植入实验动物体内，并进行软骨组织再生评价，具体为：在新西兰大白兔膝关节股骨滑车沟进行骨软骨缺损造模，通过直径5mm的角膜环钻进行直径5mm、深度2mm的骨软骨缺损造模，并将提前制备好的同样直径深度的含有PB-MSCs的上述步骤①和②构建的组织工程软骨产品填充到缺损中，进行体内验证实验。
巨噬细胞对机体的免疫调节作用至关重要，巨噬细胞通过经典激活途径激活为M1型即经典活化的巨噬细胞（CD86+），其具有促炎作用，促进机体早期炎症反应的激活，不利于组织修复；而巨噬细胞也可以激活为M2型即替代性活化的巨噬细胞（CD206+），发挥抗炎的作用，有利于组织的修复，本发明对8周时浸润在各双网络水凝胶周围的巨噬细胞进行了免疫组化分析，得到了水凝胶周围浸润巨噬细胞M2型占比%（n=5），如表2所示。从本发明表2的结果表明，本发明实施例1~5中的双网络水凝胶M2极化占比大，具有促进巨噬细胞向M2极化的作用；表2中，空白组指的是，未填充组织工程软骨产品组。
表2
Figure 718518DEST_PATH_IMAGE002
本发明采用甲苯胺蓝染色对组织修复情况进行质量评价，如图6所示。4周时，空白组（指的是未填充组织工程软骨产品组）软骨缺损仍然存在，再生组织和软骨下骨结构紊乱，再生组织与周围软骨融合欠佳；8周时缺损处被再生组织填充，但软骨下骨结构异常。术后12周时软骨缺损重新出现，修复组织为结构紊乱的不规则纤维组织，缺损周围炎症细胞浸润。对比例3对应的PEG-CHI-KGN组在4周和8周时，软骨缺损被再生组织填充，但与周围正常软骨融合欠佳，可见明显界限。12周时，再生组织的厚度较周围正常软骨薄，仍可清晰辨别界限。相比之下，本发明实施例1中的双网络水凝胶对应构建的组织工程软骨产品组（简记为KGN-PEG-CHI组）表现出持续的软骨修复和再生，修复软骨厚度及结构与正常软骨相似，与周围组织融合良好，表面光滑。
本发明还对实施例1以及对比例3对应构建的组织工程软骨产品同样进行了Wakitani组织学评分（n=5），结果如图7所示。
本发明未详细说明部分为本领域技术人员公知技术。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围；例如使用不同分子量的壳聚糖（CHI）及其衍生物、不同分子量/活性基团的四臂聚乙二醇（PEG）及其衍生物、包括但不限于柠檬酸盐在内的离子交联剂、包括但不限于KGN的小分子化合物作为成软骨诱导分化因子、不同组织来源的PB-MSCs种子细胞，构建组织工程软骨产品时均应在本发明保护范围以内；当本发明中的组织工程软骨产品或主要构成成分被用于除软骨之外的组织再生时，如半月板、骨、肌腱、肌肉、韧带、椎间盘、皮肤等，均在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将经EDCI/NHS活化的KGN溶液与Tetra-PEG-NH2反应，得到KGN-Tetra-PEG-NH2；
（2）将所述KGN-Tetra-PEG-NH2配制成第一溶液；
（3）将壳聚糖溶液与Tetra-PEG-NHS反应60~180s，得到第二溶液；所述壳聚糖溶液中含有的氨基与所述Tetra-PEG-NHS中含有的NHS基团的摩尔比为（0.1~0.2）：1；
（4）将所述第一溶液和所述第二溶液混合后静置成胶，得到复合水凝胶，然后将所述复合水凝胶进行激活处理，得到聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶；所述第一溶液中含有的氨基与所述第二溶液中含有的NHS基团的摩尔比为（0.8~1.2）：1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）包括如下子步骤：
（a）用水将KGN、EDCI和NHS混合均匀，得到混合液，然后将所述混合液的pH值调节至5.5~5.8后在30~40℃反应2h，得到经EDCI/NHS活化的KGN溶液；
（b）往经EDCI/NHS活化的KGN溶液中加入Tetra-PEG-NH2和溶剂并混合均匀，然后在30~40℃反应，经透析与冻干，得到KGN-Tetra-PEG-NH2。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
在步骤（b）中，所述溶剂为水；和/或
所述KGN-Tetra-PEG-NH2中含有的KGN与含有的氨基的摩尔比为（0.02~2）：1。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述KGN-Tetra-PEG-NH2中含有的KGN与含有的氨基的摩尔比为（0.2~1.5）：1。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其特征在于：
所述激活处理为：将所述复合水凝胶浸泡于多价阴离子溶液中8~18h；
所述多价阴离子溶液中含有的多价阴离子为柠檬酸根、磷酸根、亚磷酸根、硫酸根、亚硫酸根、过硫酸根、硼酸根中的一种或多种。
6.由权利要求1至5中任一项所述的制备方法制得的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶。
7.由权利要求1至5中任一项所述的制备方法制得的聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶在构建组织工程软骨产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述组织工程软骨产品的构建包括如下步骤：
S1、获得PB-MSCs种子细胞，然后将PB-MSCs种子细胞配制成PB-MSCs悬液；
S2、将所述聚乙二醇-壳聚糖双网络水凝胶冷冻干燥后与所述PB-MSCs悬液复合，得到组织工程软骨产品。
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