CN115105631B - 一种冷浇注法制备的光聚合人工外泌体血管、其制备方法及应用 - Google Patents

一种冷浇注法制备的光聚合人工外泌体血管、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冷浇注法制备的光聚合人工外泌体血管、其制备方法及应用，所述人工外泌体血管的制备过程如下：（1）将透明质酸或胶原蛋白或明胶溶解在去离子水中，加入甲基丙烯酸酐，搅拌，透析，冷冻干燥；或在溶解的透明质酸或胶原蛋白或明胶中逐滴加入酪胺，搅拌，透析，冷冻干燥，获得甲基丙烯酸酐或酪胺的透明质酸、胶原蛋白或明胶物质；（2）将外泌体悬溶解于PBS缓冲液中，按体积比混合加入步骤（1）所得固体的PBS溶液中，并摇床混合，加入光交联引物后，在摇床内避光混合从而获得凝胶前体；将凝胶前体在避光条件下，注入模具中，光引发聚合反应，获得完全交联的血管结构，在水浴环境中剥离模具、获得人工血管。

Description

一种冷浇注法制备的光聚合人工外泌体血管、其制备方法及 应用
技术领域
本发明属于人工心血管的制备及应用领域，具体涉及一种冷浇注法制备的光聚合人工泌体血管、其制备方法及应用。
背景技术
目前，心血管疾病是西方社会死亡的主要原因。通过构建旁路手术恢复循环被认为是治疗外周血管疾病的金标准，为此需要制备符合生物相容性和一定机械支撑力的移植物。大隐静脉通常不可用，合成移植物也有其局限性。每年，全世界约有1760万人死于心脑血管疾病，通常与小直径血管（SDBV）相关。由于或患者的健康状况和前期研究结果，发现受伤的自体旁路手术在临床上并不是完全可行的。尽管市售的膨体聚四氟乙烯（ePTFE）血管移植物已广泛应用于大口径人工血管移植领域，然而，它们作为SDBV移植物的使用受到血栓形成和再狭窄等问题的限制。构建人工血管通常需要三个基本要素：结构支架、细胞和培育环境。结构支架提供临时骨架，为组织生长提供所需的形状，直到细胞能够产生足够的细胞外基质(ECM)。目前，大多数结构支架的制造策略是基于胶原蛋白和可生物降解的聚合物形成组织工程支架；另一种策略是在体外使用将自体或同种异体平滑肌细胞(SMC)、成纤维细胞和内皮细胞(EC)接种在组织支架上并进行培养，直到产生具有最佳机械性能的细胞化血管，然后撤除支架并植入人体。
但是，该类移植物本身有一些无法避免的缺陷：1. 移植物需要较长的体外准备时间，通常为1至3个月，因此不能在紧急情况下使用；2. 培养时间延长会增加感染的风险，并增加所需的人力、设备和材料成本，且用作构建人工血管支架的大多数可生物降解聚合物已经获得FDA批准。这实际上可能是倒退了一步。我们需要一种适合用作血管导管的生物聚合物和制备方式。
理想的血管移植物应当具备顺应性、无血栓形成性、抗感染性以及促进组织愈合、重塑、收缩和分泌正常血管产物的能力。与天然组织相比，水凝胶因其具有相似的柔韧性、高含水量和分子扩散等独特特性而引起了广泛关注。水凝胶的应用已经从材料科学领域的超吸收剂、隐形眼镜、传感器和致动器扩展到人工植入物、生物医学设备、组织工程和再生医学等。近几十年来，坚韧且高度可拉伸的水凝胶受到关注，因为它们可以极大地模仿人体坚韧和可拉伸的软组织，这使其成为生物医学工程的有前途的生物材料。
透明质酸（HA）是一种线性多糖，由(1-β-4)-葡萄糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-d-氨基葡萄糖的重复二糖单元组成，通过功能化HA可获得生物相容性良好的凝胶。胶原蛋白（Collagen）是ECM中最重要的蛋白质之一，包含两条α1(I)链和一条α2(I)链，具有优异的生物相容性，可在生理条件下自组装成水凝胶。其主要的一种变性形式是明胶(Gelatin)，其粘性较高，具有良好的生物相容性及降解性。作为细胞外基质中含量最高的成分，这三种材料的主链上具有丰富的可用官能团（羧基、羟基），可通过活化和修饰制备成为光敏材料，从而应用于人工血管领域。
目前，组织工程血管移植物的制造需要使用天然组织组织的细胞。这些细胞需要能够增殖、产生承载基质并随着支架降解而重组。传统方式多用自体原代细胞作为血管组织工程的细胞来源，降低排斥反应，加速血管愈合。小直径血管组织工程领域首先将内皮细胞植入合成移植物的内腔，以提高血管的通畅性。这些细胞构成天然血管的内膜，调节凝血、血小板粘附、炎症和屏障功能。与普通聚合物相比，将内皮细胞接种到管腔表面血管移植物上可改善通畅性并降低血栓形成。流体流动下调节内皮细胞产生与流体剪切平行排列的单层并改善内皮化的保留。血管中膜含有致密的平滑肌细胞(SMC)层，通过血管收缩和血管舒张调节血管的口径。这些细胞还合成细胞外基质蛋白--弹性蛋白-这有助于血管的弹性和顺应性。在组织工程中使用SMC的挑战在于，当从天然组织中分离出来时，它们会失去收缩表型。只有可收缩的SMC才能产生成熟的弹性蛋白纤维。平滑肌细胞的循环机械拉伸已被证明可以促进细胞增殖、细胞外基质合成、和细胞比对。外膜为血管提供刚性和形状，并充当将其固定在适当位置的护套。成纤维细胞是外膜中发现的主要细胞，可合成几种不同的细胞外基质蛋白，并在伤口愈合中发挥关键作用。在血管组织工程的背景下，大多数研究都集中在胶原蛋白合成上。TGF-β和抗坏血酸补充剂已被证明可促进胶原蛋白合成和稳定胶原蛋白纤维，从而使血管具有更好的机械性能。与SMC类似，成纤维细胞在脉动机械刺激下排列并产生更多的细胞外基质。周的脉动刺激后，基于成纤维细胞的血管可以达到生理爆裂压力。血液与内皮细胞、收缩型平滑肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等之间的交流，主要是依靠各类物质以及信号的传递。而外泌体正是细胞间传递信号的重要组成部分，在维持组织间稳态以及行为调控方向起到了重要的作用。外泌体，粒径尺寸一般在40nm-150nm之间，通过进入细胞内部，调控细胞行为。外泌体中包含着母细胞的RNA以及相关的蛋白质、肽段、抗原等因子，在进入细胞后，可以更加精确的地给予靶细胞以母细胞释放的良性信号，从而显著减少细胞与细胞间交流时间，迅速调控细胞活性和功能，从而起到促进材料表面快速内皮化的作用。
为综上所述，通过将外泌体（血液血清、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、血管内皮细胞或血管收缩型平滑肌细胞来源）与凝胶材料混合，借助凝胶的仿生环境维持外泌体的体外活性，使用冷浇注法制备成人工血管，制备一种具有内皮化和抗凝效果的人工外泌体血管，达到促进人工血管表面的收缩型平滑肌愈合和快速内皮化的进程。目前尚无相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冷浇注法制备的光聚合人工泌体血管、其制备方法及应用。
基于上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种冷浇注法制备光聚合人工外泌体血管的方法，包括如下步骤：
步骤一：（方法一）将透明质酸或胶原蛋白或明胶溶解在去离子水中，搅拌溶解后，将溶液温度升至37-60℃，逐滴加入甲基丙烯酸酐，搅拌，将获得的澄清溶液在透析膜中进行透析，37-60℃干燥12-48小时，取出冷冻干燥，获得多孔固态的甲基丙烯酸脂化透明质酸（HAMA）或甲基丙烯酸脂化胶原蛋白（ColMA）或甲基丙烯酸脂化明胶(GelMA)，避光置于4℃保存；甲基丙烯酸酐与透明质酸或胶原蛋白或明胶的质量比为（1~2）:（3~10）；
（方法二）将透明质酸或胶原蛋白或明胶溶解在去离子水中，搅拌溶解后，将溶液温度升至37-60℃，逐滴加入酪胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC），搅拌，将获得的澄清溶液在透析膜中进行透析，37-60℃干燥12-48小时，取出冷冻干燥，获得多孔固态的获得酪胺透明质酸（HATyr）或酪胺胶原蛋白（ColTyr）或酪胺明胶(GelTyr)，避光置于4℃保存；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、酪胺和透明质酸或胶原蛋白或明胶三者的质量比为1:（1~2）:（3~10）；
步骤二、将外泌体(exosome)悬溶解于PBS缓冲液中获得浓度为2µg/µL~200µg/µL的外泌体悬液，并将HAMA或HATyr或ColMA或ColTyr或GelMA或GelTyr溶解于PBS缓冲液中获得HAMA或HATyr或ColMA或ColTyr或GelMA或GelTyr溶液，使固体浓度为0.01 g/mL~0.1g/mL，将外泌体悬液按照1:2~200体积比加入到HAMA或HATyr或ColMA或ColTyr或GelMA或GelTyr的溶液中，并在摇床内以40~200圈/分，4℃~40℃的环境下避光混合30s~1h，获得的混合水凝胶标记为HAMA-外泌体或HATyr-外泌体或ColMA-外泌体或ColTyr-外泌体或GelMA-外泌体或GelTyr-外泌体悬液。按照水凝胶-外泌体悬液的体积计，加入0.1%-1%的Irgacure 2959或VA-086或曙红Y等光交联引物，在摇床内以40~200圈/分，4℃~40℃的环境下进行避光混合从而获得凝胶前体。将凝胶前体在避光条件下，使用针管将凝胶前体以1μL/s-10μL/s注入内径为1mm-10mm的定制玻璃模具支架中，以350-550nm的光引发10s-30min的聚合反应，获得完整的血管结构。在冰水浴环境中浸泡10min-1h后，将人工血管剥离模具。
进一步地，透明质酸的分子量为2000KDa-1000000KDa；冷冻干燥是指先在冰箱中-80℃冷冻4-12小时，再在冷冻干燥机中-80℃冷冻干燥12-48小时。
进一步地，步骤（1）中所述透析膜的截留分子量为1kDa~10 kDa；所述透析膜先在15v%乙醇溶液透析24小时，再在去离子水中透析24小时，优选地，所述透析膜为RC透析膜。
进一步地，所述外泌体来源于血液血清、干细胞、内皮细胞或收缩型平滑肌细胞；所述外泌体粒径尺寸为40nm~150nm，提取方式为超速离心、超滤和试剂沉淀。
当所述外泌体来源于干细胞、内皮细胞和平滑肌细胞时，具体获得过程如下：
（1）将细胞采用100mm培养皿进行扩增，在收集之前采用无血清培养基进行3天饥饿培养，后收集上清（10mL至50mL），使用高速离心机按照10000g/min进行离心，离心条件为70分钟，4℃；
（2）将初离心的液体弃上清，使用PBS缓冲液进行重悬，并使用高速离心机按照100000 g/min进行离心，离心条件为70分钟，4℃；
（3）弃上清，使用PBS缓冲液重悬；
（4）使用BCA试剂盒确定外泌体浓度，使得浓度为2µg/µL-100µg/µL；
（5）-80℃保存外泌体。
当所述外泌体来源于血液时，具体获得过程如下：
（1）使用采血管获得正常志愿者的血液10m，并以3000g/min离心15分钟后，取上清；
（2）ExoQuick外泌体试剂盒进行外泌体提取：按照1:2-6的比例向上清中加入外泌体提取液，混合均匀，并在4℃条件下过夜反应（反应时间为8~16h）；
（3）1000g低速离心30-60 min，去上清，使用PBS缓冲液重悬；
（4）使用BCA试剂盒确定外泌体浓度，使得浓度为2µg/µL-200µg/µL；
（5）-80℃保存外泌体；
进一步地，步骤二中所述PBS及外泌体提取时PBS缓冲液的pH为7.4。
上述制备方法制得人工外泌体血管，所述血管内径为1.0mm~10.0mm，壁厚为500μm~2mm。
人工外泌体血管在人工血管中的应用。
本发明的反应过程和机理主要包括以下两个部分：第一部分，使用光聚合反应来实现对外泌体的封装。水凝胶的光聚合过程是在适合外泌体活性的pH值环境下和光条件下进行的，具有良好的生物相容性。由于外泌体具有正常的细胞膜结构，而凝胶可以与细胞壁蛋白的胺基或巯基之间形成共价键而保证外泌体稳定稳定存在于凝胶环境中。此外，由于凝胶均具备大量的羧基和羟基，为后续的修饰提供了大量位点，可进一步提升材料功能性。第二部分，使用外泌体凝胶和定制玻璃模具可在光照条件下形成血管结构。交联反应，HAMA、ColMA、GelMA、HATyr、ColTyr、GelTyr均可在光引发剂存在条件下，产生自发的连增长和自聚合反应，稳定包裹外泌体，形成血管结构。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.通过使水凝胶包裹外泌体，使外泌体具备了缓释的效果并能够更好的适应外部环境；
2. 使用冷浇注光聚合反应形成的血管结构，生物相容性良好且具有优异的力学性能；
3. 外泌体可以在进入细胞后，通过外泌体内含物（RNA、蛋白质，肽段和抗原等生物因子）调节靶细胞内部的蛋白质合成，加速血管的内皮化，抑制血栓的产生；
4. 该人工外泌体血管的制备工艺流程比较易操作，无需昂贵复杂的设备，工艺成本较低，效果显著。
附图说明
图1 为定制玻璃模具支架图纸；
图2为外泌体（Exosomes）免疫蛋白印迹（WB）的结果；
图3为外泌体的NTA的颗粒直径分布结果；
图4为（a）GelMA及（b）GelMA-外泌体的拉伸-应变曲线；
图5为HATyr-外泌体人工血管浸提液与内皮细胞共培养1天后的细胞核的DPAI光染色结果；
图6为GelMA-外泌体人工血管畅通情况。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的方法作进一步详细的说明。
如无特别说明，下述实施例中步骤二和步骤三中涉及的PBS缓冲液均为pH=7.4、浓度为10mM的PBS缓冲液。培养箱条件为稳定的温度（37℃）、稳定的CO2水平（5%）、恒定的酸碱度（pH值：7.2~7.4）、较高的相对饱和湿度（95%）。该实例中所使用的外泌体提取试剂均来自SBI公司的ExoQuick。DMEM培养基购自Thermo Fisher，牛胎儿血清（FBS）购自BI，青链霉素混合液（×100）和DAPI购自索莱宝，蛋白定量试剂盒购自Sigma-Aldrich。使用的骨髓间充质干细胞（MSC）购自赛百慷细胞库，内皮细胞购自赛贝细胞库，人血液采集自身体健康的志愿者。所使用的合成材料，包括HA、collagen、gelatin、甲基丙烯酸酯和酪胺均购买自阿拉丁。
实施例1：
本实施例提出了HAMA-外泌体人工血管的制备方法，具体过程如下：
步骤一，将1g透明质酸(分子量为100000KDa)溶解在100mL去离子水中，经过12h的磁力搅拌溶解后，将溶液温度升至60℃，并逐滴加入260mg甲基丙烯酸酐（MA），经过24h的搅拌后，将获得的澄清溶液使用RC透析膜（截留分子量为10KDa），依次在15v%乙醇溶液和去离子水中分别进行24小时透析，后在烘干机中，以40℃干燥24h，后取出放置在-80℃超低温冰箱中12小时，后使用冷冻干燥设备在抽真空条件下，-80℃进行24小时的冷冻干燥，获得多孔固体状的甲基丙烯酸酐透明质酸（HAMA），避光置于4℃保存。
步骤二，当所述外泌体来源于内皮细胞时，具体获得过程如下：
（1）将细胞采用100mm培养皿进行扩增，在收集之前采用无血清培养基进行3天饥饿培养，后收集上清（10mL至50mL），使用高速离心机按照10000 g/min进行离心，离心条件为70分钟，4℃；
（2）将初离心的液体弃上清，使用PBS缓冲液进行重悬，并使用高速离心机按照100000 g/min进行离心，离心条件为70分钟，4℃；
（3）弃上清，使用PBS缓冲液重悬；
（4）使用BCA试剂盒确定外泌体浓度，测得浓度为20µg/µL；
（5）-80℃保存外泌体。
步骤三，HAMA-外泌体人工血管的制备
将步骤二得到的初始浓度为20µg/µL的外泌体(exosome)悬溶解于70 µLPBS缓冲液中获得浓度为2µg/µL的外泌体悬液，并将步骤一得到的HAMA溶解于5 mL的PBS缓冲液中得到浓度为0.1g/mL的HAMA溶液。以外泌体悬液和HAMA溶液体积比=1:10计，将外泌体悬液加入到HAMA溶液中，在摇床内37℃的环境下以60圈/分避光混合30秒，获得HAMA-外泌体悬液。加入HAMA-外泌体悬液体积1%的Irgacure 2959光交联引物后，在摇床内以100圈/分进行避光混合1min从而获得凝胶前体。将凝胶前体在避光条件下，如图1所示，从浇注口5以2μL/s注入芯材3直径为2.0mm、空心管材4内径为3.0mm的定制玻璃模具支架中，以350nm的光引发60s的聚合反应，获得血管结构，在4℃的冰水浴环境中浸泡30min后剥离模具，获得内径2.0mm、厚度500µm 、长度5cm的HAMA-外泌体人工血管。
图1 为定制玻璃模具支架的结构示意图，如图1所示，包括支撑台1、空心管材4和芯材3，芯材3的长度大于空心管材4的长度，空心管材4套设在芯材3外，空心管材4和芯材3的底部和支撑台1接触，芯材3的上端通过夹具2固定在支撑台1上，空心管材4的上端口形成浇注口5；
图2为外泌体免疫蛋白印迹（WB）的结果。CD63和HSP70是外泌体的特异表达蛋白，其高表达表明了提取的外泌体符合标准。
实施例2：
该实施例列举了一种GelMA-外泌体人工血管的制备方法，具体过程如下：
步骤一，将500mg明胶溶解在10mL去离子水中，经过24h的磁力搅拌溶解后，将溶液温度升至60℃，并逐滴加入100mg甲基丙烯酸酐（MA），经过24h的磁力搅拌后，将澄清溶液使用RC透析膜（截留分子量为10KDa），依次在15v%乙醇溶液和去离子水中分别进行24小时透析，后在烘干机中以55℃干燥24h，后取出放置在-80℃超低温冰箱中12小时，后使用冷冻干燥设备在抽真空条件下，-80℃进行48小时的冷冻干燥，获得多孔固体状甲基丙烯酸明胶（GelMA），避光置于4℃保存。
步骤二，提取骨髓间充质干细胞（MSC）的外泌体：
（1）将细胞采用100mm培养皿进行扩增，在收集之前采用无血清培养基进行3天饥饿培养，后收集上清（10mL至50mL），使用高速离心机按照10000 g/min进行离心，离心条件为70分钟，4℃；
（2）将初离心的液体弃上清，使用PBS缓冲液进行重悬，并使用高速离心机按照100000 g/min进行离心，离心条件为70分钟，4℃；
（3）弃上清，使用PBS缓冲液重悬；
（4）使用BCA试剂盒确定外泌体浓度，测得浓度为100µg/µL；
（5）-80℃保存外泌体。
步骤三，GelMA-外泌体人工血管的制备
将步骤二得到的初始浓度为100 µg/µL的外泌体(exosome)悬溶解于50 µL PBS缓冲液中获得浓度为10 µg/µL的外泌体悬液，并将步骤一得到的GelMA溶解于10mL的PBS缓冲液中获得浓度为0.05g/mL的GelMA溶液。以外泌体悬液和GelMA溶液体积比=1:50计，将外泌体悬液加入到GelMA溶液中，在摇床内37℃的环境下以80圈/分避光混合60秒，获得GelMA-外泌体悬液。加入GelMA-外泌体悬液体积1%的RU-SPS光交联引物（使用PBS配制浓度均为5mM的RU和SPS的溶液，获得RU-SPS交联剂）后，在摇床内以200圈/分进行避光混合1min从而获得凝胶前体。将凝胶前体在避光条件下，使用注射器从浇注口5以4μL/s注入芯材3直径为2.0mm、空心管材4内径为4.0mm的定制玻璃模具支架中，以500 nm的光引发120s的聚合反应，获得血管结构，在4℃的冰水浴环境中浸泡15min后剥离模具，获得厚度为1mm，内径为2.0mm，长度为3cm的GelMA-外泌体人工血管。
图3为外泌体的NTA的颗粒直径分布结果。外泌体的粒径主要分布在50-200nm之间，该结果表明提取的骨髓间充质干细胞（MSC）外泌体符合国际上外泌体的粒径范围。
图4中（a）为GelMA及（b）GelMA-外泌体的拉伸-应变曲线。GelMA的弹性模量在20.7KPa，应变（断裂伸长率）为48.087%；GelMA-外泌体的弹性模量在25.0 KPa，应变（断裂伸长率）为128.59%。表示材料具有良好的强度和延展性，能够作为人工血管的材料。
实施例3：
一种HATyr-外泌体人工血管的制备方法，具体过程如下：
步骤一，将分子量350000KDa的200 mg透明质酸溶解在5mL的去离子水中，经过20h的磁力搅拌溶解后，将溶液温度升至30℃，并逐滴加入150mg酪胺(Tyr)和50mg的EDC，经过24h的磁力搅拌后，将澄清溶液使用RC透析膜（截留分子量为10KDa），依次在15v%乙醇溶液和去离子水中分别进行24小时透析，后在烘干机中以55℃干燥24h，后取出放置在-80℃超低温冰箱中12小时，后使用冷冻干燥设备在抽真空条件下，-80℃进行24小时的冷冻干燥，获得多孔固体状酪胺透明质酸（HATyr），避光置于4℃保存。
步骤二，提取源自血液的外泌体：
（1）使用采血管获得正常志愿者的血液10mL，并以3000g/min离心15分钟后，取上清；
（2）ExoQuick外泌体试剂盒进行外泌体提取：按照1:4的比例向上清中加入外泌体提取液，混合均匀，并在4℃条件下过夜反应（反应时间为8~16h）；
（3）1000g低速离心30 min，去上清，使用PBS缓冲液重悬
（4）使用BCA试剂盒确定外泌体浓度，使得浓度为200µg/µL。
（5）-80℃保存外泌体。
步骤三，HATyr-外泌体人工血管的制备
将步骤二得到的初始浓度为200 µg/µL的外泌体(exosome)悬溶解于200 µLPBS缓冲液中获得浓度为20µg/µL的外泌体悬液，并将步骤得到的HATyr溶解于10mL的PBS缓冲液中获得0.15g/mL的HATyr溶液。以外泌体悬液和HATyr溶液体积比=1:50计，将外泌体悬液加入到HATyr溶液中，在摇床内37℃的环境下以200圈/分避光混合120秒，获得HATyr-外泌体悬液。加入HATyr-外泌体悬液体积0.7%的RU-SPS光交联引物（使用PBS缓冲液配制浓度均为5mM的RU和SPS的混合溶液，获得RU-SPS交联剂）后，在摇床内以200圈/分进行避光混合1min从而获得凝胶前体。将凝胶前体在避光条件下，使用注射器从浇注口5以2μL/s注入芯材3直径为4.0mm、空心管材4内径为5.5mm的定制玻璃模具支架中，以500 nm的光引发120s的聚合反应，获得血管结构，在4℃的冰水浴环境中浸泡15min后剥离模具，获得内径为4.0mm、长5cm、壁厚0.75mm的GelMA-外泌体人工血管。
使用HATyr和HATyr-外泌体材料制备浸提液，具体过程是：取10mm*10mm的材料，加入0.67mL DMEM培养基，后置于培养箱中24小时，取上清作为浸提液。后使用500μL浸提液培养内皮细胞1天，置于37℃，5%CO2的培养箱中。后取出使用100μL 的4%多聚甲醛固定3小时，并使用100μL浓度为0.05%的DAPI对内皮细胞核进行5分钟的染色，并使用PBS冲洗3遍。使用倒置显微镜观察并记录结果，具体详见图5。由图5可知，HATyr-外泌体人工血管具有更好的促进内皮细胞增殖的效果。
实施例4：
该实施例列举了一种GelMA-外泌体人工血管的制备方法，具体过程如下：
步骤一，将800mg明胶溶解在pH值8.5的200mL去离子水中，经过36h的磁力搅拌溶解后，将溶液温度升至50℃，并逐滴加入220mg甲基丙烯酸酐（MA），经过24h的磁力搅拌后，将澄清溶液使用RC透析膜（截留分子量为10KDa），依次在15v%乙醇溶液和去离子水中分别进行24小时透析，后在烘干机中以60℃干燥12h，后取出放置在-80℃超低温冰箱中6小时，后使用冷冻干燥设备在抽真空条件下，-80℃进行48小时的冷冻干燥，获得多孔固体状甲基丙烯酸明胶（GelMA），避光置于4℃保存。
步骤二，提取源自血液的外泌体：
（1）使用采血管获得正常志愿者的血液10mL，并以3000g/min离心15分钟后，取上清；
（2）ExoQuick外泌体试剂盒进行外泌体提取：按照1:4的比例向上清中加入外泌体提取液，混合均匀，并在4℃条件下过夜反应（反应时间为8~16h）；
（3）1000g低速离心60 min，去上清，使用PBS缓冲液重悬；
（4）使用BCA试剂盒确定外泌体浓度，获得浓度为200 µg/µL的外泌体；
（5）-80℃保存。
步骤三，GelMA -外泌体人工血管的制备
将步骤二的初始浓度为200 µg/µL的外泌体(exosome)悬溶解于100 µLPBS缓冲液中获得浓度为20 µg/µL的外泌体悬液，并将步骤一得到的GelMA溶解于1mL的PBS缓冲液中获得浓度为0.05 g/mL的GelMA溶液。以外泌体悬液和GelMA溶液体积比=1:50计，将外泌体悬液加入到GelMA悬液后，在摇床内37℃的环境下以200圈/分避光混合120秒，获得GelMA-外泌体悬液。加入GelMA-外泌体悬液体积0.7%的RU-SPS（使用PBS缓冲液配制浓度均为5mM的RU和SPS的混合溶液，获得RU-SPS交联剂）光交联引物后，在摇床内以100圈/分进行避光混合2min从而获得凝胶前体。将凝胶前体在避光条件下，使用注射器从浇注口5以3μL/s注入芯材3直径为3.0mm、空心管材4内径为5.0mm的定制玻璃模具支架中，以500 nm的光引发200s的聚合反应，获得血管结构，在4℃的冰水浴环境中浸泡15min后剥离模具，获得内径3.0mm、长5cm、壁厚1mm的GelMA-外泌体人工血管。
使用针管向实施例4制得的内径3.0mm、外径5.0mm人工血管中注射PBS缓冲液，如图6所示，其通畅性良好。

Claims (9)

1.一种冷浇注法制备光聚合人工外泌体血管的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将透明质酸或胶原蛋白或明胶溶解在去离子水中，搅拌溶解后，将溶液温度升至37-60℃，逐滴加入甲基丙烯酸酐，搅拌，将获得的澄清溶液在透析膜中进行透析，37-60℃干燥12-48小时，取出冷冻干燥，获得多孔固态的甲基丙烯酸酯化透明质酸或甲基丙烯酸酯化胶原蛋白或甲基丙烯酸酯化明胶，避光保存；甲基丙烯酸酐与透明质酸或胶原蛋白或明胶的质量比为（1~2）:（3~10）；
或者将透明质酸或胶原蛋白或明胶溶解在去离子水中，搅拌溶解后，将溶液温度升至37-60℃，逐滴加入酪胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，搅拌，将获得的澄清溶液在透析膜中进行透析，37-60℃干燥12-48小时，取出冷冻干燥，获得多孔固态的酪胺透明质酸或酪胺胶原蛋白或酪胺明胶，避光保存；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、酪胺和透明质酸或胶原蛋白或明胶三者的质量比为1:（1~2）:（3~10）；
（2）将外泌体溶解于PBS缓冲液中获得浓度为2µg/µL~200µg/µL的外泌体悬液，并将步骤（1）冷冻干燥后的固体溶解于PBS缓冲液中获得水凝胶溶液，使固体浓度为0.01 g/mL~0.1g/mL，按照外泌体悬液和水凝胶溶液体积比=1: 2~200将外泌体悬液加入到水凝胶溶液中，在摇床避光混合，获得水凝胶-外泌体悬液，加入水凝胶-外泌体悬液体积的0.1%-1%的光交联引物，在摇床内避光混合从而获得凝胶前体，在避光条件下，使用针管将凝胶前体以1μL/s-10μL/s注入模具中，光引发聚合反应，反应完成后，获得完整的血管结构，在冰水浴环境中浸泡后，将人工血管剥离模具，即得。
2.根据权利要求1所述冷浇注法制备光聚合人工外泌体血管的方法，其特征在于，步骤（1）中透明质酸的分子量为2000KDa-1000000KDa；冷冻干燥是指先在冰箱中-80℃冷冻4-12小时，再在冷冻干燥机中-80℃冷冻干燥12-48小时。
3.根据权利要求1所述冷浇注法制备光聚合人工外泌体血管的方法，其特征在于，步骤（1）中所述透析膜的截留分子量为1kDa~10 kDa；所述透析膜先在15v%乙醇溶液透析24小时，再在去离子水中透析24小时。
4.根据权利要求1所述冷浇注法制备光聚合人工外泌体血管的方法，其特征在于，步骤（2）中所述光交联引物为Irgacure 2959或VA-086或曙红Y或RU/SPS，光引发的波长为350-550nm。
5.根据权利要求1所述冷浇注法制备光聚合人工外泌体血管的方法，其特征在于，所述摇床以40~200圈/分，4℃~40℃的环境下进行。
6.根据权利要求1所述冷浇注法制备光聚合人工外泌体血管的方法，其特征在于，所述外泌体来源于血液血清、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、血管内皮细胞或血管收缩型平滑肌细胞；所述外泌体粒径尺寸为40nm~200nm，提取方式为超速离心、超滤和试剂沉淀。
7.根据权利要求1所述冷浇注法制备光聚合人工外泌体血管的方法，其特征在于，步骤（2）中所述PBS缓冲液的pH=7.4。
8.权利要求1至7任一项所述的制备方法制得的冷浇注光聚合人工外泌体血管，其特征在于，所述血管内径为1mm~10mm，壁厚为500μm~2mm。
9.权利要求8所述的冷浇注光聚合人工外泌体血管在人工血管中的应用。
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