KR101363573B1

KR101363573B1 - 관 형상의 생체적합성 및 생분해성 스캐폴드 제조방법

Info

Publication number: KR101363573B1
Application number: KR1020120143602A
Authority: KR
Inventors: 안성수; 따나발
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2012-12-11
Publication date: 2014-02-21

Abstract

본 발명은 관 형상의 생체적합성 및 생분해성 스캐폴드 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 마이크로 크기의 직경을 가지며, 다공성 구조이고, 생체적합성 및 생분해성 특성을 갖는 관 형상의 고분자 스캐폴드를 효율적으로 제조할 수 있다. 본 발명에 의하여 제조된 고분자 스캐폴드는 소실 또는 손실된 혈관의 대체물로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

관 형상의 생체적합성 및 생분해성 스캐폴드 제조방법{Method for Preparing Biocompatible and Biodegradable Tubular Scaffolds}

본 발명은 관 형상의 생체적합성 및 생분해성 스캐폴드 제조방법에 관한 것이다.

전 세계적으로, 심혈관 질환에서의 혈관 손상은 사망의 주요 원인이다. 협심증 및 다른 혈관 질환의 재건 수술에서 사용하기 위하여 혈관을 환자 또는 다른 포유동물의 동맥으로부터 얻고 있다. 그러나, 천연 혈관의 공급은 다수의 혈관우회술(multiple bypass) 혹은 반복된 절차에는 적당하지 않다. 상기 한계점을 극복하기 위하여, 혈관 조직 공학에서의 이용을 위하여 합성 폴리머로부터 마이크로튜브와 마이크로섬유가 제조되었다. 폴리에틸렌 테레프타레이트(polyethylene terephthalate)와 폴리테트라플루오르에틸렌(polytetrafluoroethylene)과 같은 비-분해성 폴리머를 사용하여 성공적으로 혈관을 제조하였으며, 이는 큰 혈관 (macrovascular) 수준에서 성공하였다(> 6 mm 내경). 그럼에도 불구하고, 비-분해성 합성 폴리머로 제작된 작은 혈관 그래프트(< 6 mm 내경)의 임상적 사용은 혈전증, 맥관 내막 비후(intimal hyperplasia), 감염 및 아테롬성 동맥경화증의 진행에 의하여 제한되고 있는 실정이다. 또한, 분해성 공중합체로 제조된 스캐폴드 역시 변성 및 고정된 성장인자의 감소된 생활성(bioactivity)과 같은 문제점을 가지고 있다.

이러한 문제점을 극복하기 위하여, 생분해성 천연 폴리머로 제조된 혈관에 대한 연구가 집중되고 있다. 또한, 천연 폴리머로 제조된 튜브는 약물, 단백질 및 펩타이드를 고정하는데 요구되는 다공성 구조 및 표면 거칠기에 있어 많은 이점을 가지고 있다. 로딩 된 생체분자(biomolecules)의 활성을 보존하는 생체적합성 마이크로튜브는 특정 조직의 재생을 촉진시킬 수 있다. 더욱이, 이러한 다공성 구조는 세포 생존의 증진, 영양분의 확산 촉진 및 폐 대사산물의 제거를 위한 세포 부착에 유용한 추가적인 앵커를 제공할 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 혈관 이식, 특히 마이크로 크기의 미세혈관의 이식에 사용될 수 있는 생체적합성 및 생분해성 고분자 스캐폴드를 제조하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 관 형상의 고분자 스캐폴드를 제조하기 위한 관 구조물을 고안하였으며, 종래에 이용되던 동결건조법 혹은 몰딩 장치를 사용하지 않고, 상기 관 구조물을 이용한 겔-용매추출법을 사용하여 마이크로 크기의 직경을 가지며, 다공성 구조이고, 세포 부착율 및 생존율이 우수한 고분자 스캐폴드를 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 관 형상의 생체적합성 및 생분해성 스캐폴드 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 관 형상의 생체적합성 및 생분해성 스캐폴드 제조방법을 제공한다:

(a) 피브리노겐, 피브린, 젤라틴 및 콜라겐으로 구성된 군으로부터 선택된 겔화 단백질을 포함하는 용액을 얻는 단계;

(b) 상기 용액을 관 구조물에 주입하고, 용액 내 겔화 단백질을 겔화(gelation) 시키는 단계, 여기서 (i) 상기 관 구조물은 외부 관 및 내부 관을 포함하되, 상기 내부 관은 외부 관의 내경(inner diameter)과 내부 관의 외경(outer diameter) 사이에 공간이 생기도록 외부 관안에 삽입된 구조이고, (ii) 상기 용액은 외부 관과 내부 관 사이의 공간으로 주입되며, 주입된 용액 내의 겔화 단백질은 겔화되어 관 형상의 고분자 스캐폴드가 형성되고; 그리고

(c) 상기 고분자 스캐폴드를 관 구조물로부터 분리하기 전에 또는 분리한 후에 고분자 스캐폴드에 탈용매(desolvation) 처리하는 단계.

본 발명은 포유류의 신체 내, 예컨대 환자의 신체 내로 삽입될 때(특히, 결손 자리에 삽입되는 경우), 허용되는(tolerated) 관 형상의 고체 스캐폴드를 제공한다(생체적합성). 특히, 본 발명의 스캐폴드는 합성 고분자를 이용한 스캐폴드와 달리, 생체 내 이식 시 요구되지 않은 염증, 면역 반응 및 독성을 최소화할 수 있다. 또한, 본 발명의 스캐폴드는 외과적 시술 등의 방법을 통하여 제거되지 않아도, 예컨대 신체 내 결손이 스캐폴드 이식을 통하여 주변 조직 혹은 세포의 이동 및 성장에 의하여 적절하게 회복되는 때, 시간에 따라 생체분해(bio-degrade) 될 수 있다(생분해성).

이하, 본 방법의 각 단계에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명의 단계 (a)에서는 스캐폴드를 구성하는 겔화 단백질이 함유된 용액을 얻는다.

본 명세서에서 용어, "겔화 단백질"이란 적절한 조건에 따라 혹은 자연적으로(by itself) 겔화되어 고분자를 형성하는 단백질을 의미한다. 일반적으로, 겔화된 단백질은 3차원적 그물구조를 갖게 된다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 겔화 단백질은 피브리노겐, 피브린, 젤라틴 및 콜라겐으로 구성된 군으로부터 선택된다.

하나의 특정예에서는 상기 겔화 단백질은 피브리노겐 또는 피브린이다. 피브리노겐은 척추동물의 혈장 속에 존재하는 글로불린에 속하는 단백질로서, 효소 트롬빈에 의하여 불용성인 피브린이 된다. 피브리노겐 및 피브린은 혈액응고에 중요한 작용을 한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 겔화 단백질은 재조합 단백질이거나, 혹은 동종 또는 이종의 포유류부터 분리된 야생형 단백질 또는 이의 변이체이다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 용액(이하, "스캐폴드 제조용 용액"이라 한다)은 겔화 단백질 및 적절한 용매와 혼합되어 제공된다. 본 발명에서는 선택된 겔화 단백질의 겔화(gelation)를 방해하지 않는 용매이면 어떠한 용매라도 사용할 수 있다.

하나의 특정예에서는 상기 스캐폴드 제조용 용액은 수용액이다.

다른 특정예에서는 상기 스캐폴드 제조용 용액은 겔화 단백질 및 버퍼를 포함한다. 또 다른 특정예에서는 상기 버퍼는 PBS(Phosphate bufferd saline)이다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 스캐폴드 제조용 용액 내의 겔화 단백질은, 생물학적으로 활성인 분자(단백질, 펩타이드, 당단백질 등)와 가교결합 된 형태이다. 겔화 단백질은 세포 부착, 세포 성장 및 증식, 또는 기타 세포 기능에 필요한 상호작용을 제공하기 위하여 생물학적으로 활성인 분자를 이용하여 변형되는 것이다.

하나의 특정예에서는 상기 겔화 단백질은 생물학적으로 활성인 분자와 공유결합으로 가교결합된다. 본 발명에서는 상기 겔화 단백질의 가교를 위하여 화학적 가교, 열가교, 방사선 조사 가교 등 당업계에 공지된 가교방법을 선택하여 사용할 수 있다.

하나의 특정예에서, 상기 겔화 단백질과 생물학적으로 활성인 분자와의 가교 결합을 위하여 겔화 단백질은 화학적 가교제로 활성화 된다. 본 발명에서 사용 가능한 화학적 가교제는 글루타알데히드, 디알데히드 및 숙신산알데히드 등의 알데히드류 가교제, 그리고 카르복실기를 활성화시키기 위한 SCBH(sodium cyanoborohydride), EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide) 및 EDC/NHS(N-Hydroxy succinimide)를 포함한다.

하나의 특정예에서, 상기 생물학적으로 활성인 분자는 세포 외 기질(ECM) 분자, 기능성 펩티드, 세포에 신호를 전달할 수 있는 프로테오글리칸 및 당단백질, 성장 인자, 기타 최적의 세포 기능을 위한 분자, 그리고 이의 조합을 포함한다.

다른 특정예에서, 상기 생물학적으로 활성인 분자는 세포 부착 분자이다. 본 발명에서 이용 가능한 세포 부착 분자는 피브로넥틴, 비트로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 아그레칸, 아그린, 연골기질단백질, 피브리노겐, 피브린, 엔탁틴, 라미닌, 콜라겐, 오스테오폰틴, 카드헤린 및 셀렉틴을 포함한다.

본 발명의 단계 (b)에서, 상기 스캐폴드 제조용 용액은 관 구조물에 주입되고, 겔화된다. 이때, 고분자 스캐폴드를 제조하기 위한 특수한 구조의 관 구조물을 이용한다. 구체적으로, 상기 관 구조물은 외부 관 및 내부 관 등 두 개의 관을 포함하고, 상기 내부 관은 외부 관의 내경(inner diameter)과 내부 관의 외경(outer diameter) 사이에 공간이 생기도록 외부 관안에 삽입된다.

하나의 특정예에서는 상기 관 구조물은 도 1에 도시된 바와 같이 설계된다. 구체적으로, 상기 관 구조물은 지면으로부터 일정 높이에 위치하는 받침대 위에 외부관이 배치되고, 지면으로부터 일정 높이에 위치하는 두 개의 기둥으로 구성된 스탠드의 하나의 기둥에, 내부 관의 일 말단이 고정되고 외부 관 사이를 통과한 후, 타 말단이 스탠드의 나머지 기둥에 고정되어 형성된다.

상기 스캐폴드 제조용 용액은 관 구조물의 외부 관과 내부 관 사이의 공간으로 주입되고, 용액 내의 겔화 단백질이 주입된 공간 안에서 겔화됨으로써 관 모양의 고분자 스캐폴드가 형성된다.

하나의 특정예에서, 관 구조물은 겔화 단백질의 겔화를 위하여 겔화에 적절한 온도(예컨대 저온, 구체적으로 0-10℃, 0-7℃ 또는 0-5℃)에서 인큐베이션된다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 고분자 스캐폴드는 다양한 형상의 관으로 제조된 관 구조물을 이용하여 제조되어, 다양한 형상으로 제조된다.

하나의 특정예에서는 상기 고분자 스캐폴드는 횡단면이 원형, 타원형 또는 다각형이고, 다른 특정예에서는 횡단면이 원형이다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 관 구조물은 실리콘으로 제조된다. 하나의 특정예에서는 상기 관 구조물은 실리콘 고무로 제조된다.

본 발명의 단계 (c)에서는 단계 (b)에서 형성된 고분자 스캐폴드를 관 구조물로부터 분리하기 전 또는 분리한 후에 탈용매(desolvation) 처리하여 관 구조물 내의 잔류 용매 또는 고분자 스캐폴드의 표면에 흡착되어 있는 잔류 용매를 제거한다. 상기 고분자 스캐폴드는 스캐폴드 제조용 용액(겔화 단백질 및 용매 포함)이 관 구조물 안으로 주입되고 용액 내의 겔화 단백질이 겔화되어 형성된 고분자 스캐폴드로서, 관 구조물안에는 스캐폴드 제조용 용액의 용매(예컨대, PBS 버퍼)가 잔류하게 된다. 따라서, 본 명세서에서 용어, "탈용매 처리"는 고분자 스캐폴드가 형성되어 있는 관 구조물 내의 잔류 용매 및/또는 고분자 스캐폴드의 표면에 흡착/부착되어 있는 잔류 용매를 제거하는 것을 의미한다. 본 명세서에서는 용어 "탈용매 처리", "용매추출" 및 "겔-용매추출"을 상호 교환적으로 사용한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 탈용매 처리는 고분자 스캐폴드가 관 구조물에 존재하는 상태에서 실시한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 용매추출은 관 구조물 또는 고분자 스캐폴드에 직접 탈용매제를 처리하여 수행한다. 이때, 상기 탈용매제 처리는 관 구조물 또는 고분자 스캐폴드의 전부 또는 일부를 탈용매제가 함유된 용기에 담기도록(immersed in) 처리하여 실시할 수 있다. 관 구조물 또는 고분자 스캐폴드를 탈용매제에 완전히 담구어 탈용매 하는 경우 탈용매 효율을 보다 높일 수 있다.

하나의 특정예에서는 상기 관 구조물에 탈용매제를 주입하여 흘려줌으로써 관 구조물 내에 존재하는 잔류 용매(예컨대, PBS 버퍼) 및/또는 고분자 스캐폴드의 표면에 흡착/부착되어 있는 잔류 용매를 제거한다.

하나의 특정예에서는 상기 탈용매제는 아세톤이다. 다른 특정예에서는 상기 아세톤은 저온의 아세톤이고, 또 다른 특정예에서는 상기 저온의 아세톤은 -5 - 5℃로 식혀진 아세톤이며, 또 다른 특정예에서는 0 - 5℃의 아세톤이다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 방법에 의하여 제조된 스캐폴드는 다공성 구조이다. 이러한 다공성 구조는 세포의 부착, 이동, 성장, 증식 및 생존에 유용한 지지체로서 기능할 수 있어, 다공성 구조의 고분자 스캐폴드는 생체 내 결손 부위의 보강 혹은 치료(회복)에 보다 유용하게 적용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 방법에 의하여 제조된 스캐폴드는 생체 내 혈관 이식용이다. 본 발명의 스캐폴드는 손상 혹은 소실된 혈관의 대첼물로서 사용될 수 있는 것이다.

하나의 특정예에서는 상기 스캐폴드는 내경이 500-850 μm이다. 따라서, 본 발명의 스캐폴드는 미세혈관의 이식 혹은 대체물로서 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 마이크로 크기의 직경을 가지며, 다공성 구조이고, 생체적합성 및 생분해성 특성을 갖는 관 형상의 고분자 스캐폴드를 효율적으로 제조할 수 있다.

(ii) 본 발명에 의하여 제조된 고분자 스캐폴드는 소실 또는 손실된 혈관의 대체물로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 스캐폴드 제조방법 및 관 구조물의 구조를 보여준다.
도 2는 겔화 과정 후의 원통형의 Fbg-겔 튜브 형태를 보여주는 광학현미경 사진이다.
a) 정상 이미지,
b) 그레이 스캐일 이미지.
도 3은 FN/Fbg 마이크로튜브의 SEM 이미지이다.
A) 및 B) 튜브의 외부 형태를 보여주는 이미지,
C) 일정한 벽 두께의 원형 마이크로 튜브를 보여주는 횡단면 이미지,
D) 부드러운 표면을 갖는 튜브 내부 표면을 보여주는 이미지.
도 4는 Fbg에 FN이 일정하게 결합(conjugated)되어 있음을 보여주는 형광현미경 이미지이다(스케일 바, 400 μm).
도 5는 FN 가교결합 된 FN/Fbg 마이크로튜브의 FT-IR 스펙트럼을 보여준다. 피크 강도의 증가 및 피크 시프트는 펩티드 결합의 증가에 의한 것이다.
도 6은 다른 시간 간격에서 Fbg 및 FN/Fbg 마이크로튜브의 섬유소 분해속도를 보여주는 그래프이다(n=3).
도 7A는 FN/Fbg 마이크로튜브 상에서 마우스 섬유아세포를 5일간 배양한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7B는 FN/Fbg 마이크로튜브의 인 비트로 생체적합성 분석 결과를 보여주는 이미지이다. 형광이미지는 마이크로튜브의 외부표면(a) 또는 내부표면(b, 화살표로 표시)에 부착된 대사적으로 활성인 섬유아세포를 나타낸다(스케일 바, 400 μm).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

Fbg 마이크로튜브 제작

Fbg(bovine fibrinogen, fraction Type I, MW 340 KDa) 및 혈장 FN(bovine fibrinogen)은 Sigma-Aldrich Inc.(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. FN-고정된 Fbg(FN/Fbg) 마이크로튜브를 겔-용매추출법과 실리콘 고무 튜브를 사용하여 제조하였다. 간략히 설명하면, 스탠드에서 작은 내부 튜브(외경: 0.600 mm)를 외부 튜브(내경: 1.5 mm)안으로 삽입하였다. 외부 튜브와 내부 튜브 사이에 간격을 만들기 위하여 스탠드에서 고정하였다(도 1). FN/Fbg 마이크로튜브의 제작은 두 단계를 포함한다: 동시의 삽입, 겔화(gelation) 및 가교 과정, 및 탈용매 (desolvation). 먼저, Fbg 용액(15 wt%)을 PBS(phosphate buffered saline)를 사용하여 제조하였다. 다음으로 EDC 0.1 mM(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 및 NHS 1 mM(N-hydroxysuccinimide)을 첨가하여 FN을 미리 활성화시키고, 약한 교반과 함께 실온에서 15분간 인큐베이션 하였다. 이후, Fbg 용액 5 ㎖ 및 전-활성화된 FN(2 mg/㎖) 5 ㎕를 혼합하였다. 제 1 단계로, 혼합된 단백질 용액을 즉시 바깥 실리콘 튜브의 한쪽 말단으로부터 다른 쪽 말단으로 주입하고, Fbg와 Fn 사이의 펩티드 결합을 위하여 0-4℃에서 6시간 동안 인큐베이션 하였다. 제 2 단계로, FN/Fbg 겔 튜브를 저온의 아세톤(0-4℃)에 담가 두었다. 완전한 용매추출이 완료된 후 FN/Fbg 마이크로튜브를 실리콘 튜브로부터 제거하였다. 끝으로, FN/Fbg 마이크로튜브를 진공상태에서 2일간 건조하였다. 건조된 스캐폴드를 3 mM EDC 15 ㎖를 사용하여 0-4℃에서 6시간 동안 추가적으로 가교하였다. Fbg 마이크로튜브는 상기에서 설명한 방법에 따라, FN 없이 EDC 및 NHS를 사용하여 제조하였다. 즉, Fbg 용액을 EDC와 혼합한 다음 실리콘 튜브에 주입하였다.

형태학적 특징

Fbg 및 Fbg/FN 마이크로튜브의 외부 표면과 내부 표면 및 다공성 구조를 확인하기 위하여, 마이크로튜브의 외부 형태와 횡단면 형태를 SEM(scanning electron microscopy; FE-SEM, Hitachi S-4700 Type II, Hitachi Inc., 일본)으로 관찰하였다. 수직으로 절단한 후, 횡단면을 내부 모양 및 표면을 조사하였다. FN 그래프팅의 확인을 위하여 goat anti-mouse IgG 항체로 형광 라벨된 Alexa Fluor 488 을 사용하였다. NIS 엘레멘트 소프트웨어를 사용하여 형광현미경(Nikon Eclipse 80i, 일본)으로 Fbg/FN 마이크로튜브를 관찰하였다.

FT-IR 스펙트럼 분석

FN과 Fbg 튜브간의 가교결합을 확인하기 위하여 FN-Fbg 튜브에 대하여 퓨리에 변환 적외선 스펙트럼(Fourier transform infra-red spectrum; FT-IR, TENSOR 27, Burker)을 실시하였다.

효소에 의한 분해(Enzymatic degradation)

Fbg 및 FN/Fbg 마이크로튜브의 인 비트로 생분해를 확인하기 위하여, 플라스미노겐(Haematologic Technologies, Inc., Essex Junction, 미국) 및 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA; Haematologic Technologies, Inc.)를 첨가하고 피브린 용해(fibrinolysis)를 튜브 중량 손실로 확인하였다. 마이크로튜브(60 mg)를 100 ㎕에 TBS(Tris-buffered saline, 25 ㎕), CaCl₂(10 ㎕ of 50 mM), lys-plasminogen (2.5 ㎕ of 1 mM) 및 tPA(20 ㎕ of 20 μg/㎖)를 함유하는 효소 분해배지 (enzymatic degradation medium)에 담가두었다. 혼합물을 약한 교반과 함께 37℃에서 7주간 인큐베이션 하였다. 상기 분해배지를 동량의 배지로 주마다 교환하여 주었다. 중량 손실은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다:

[수학식 1]

중량 손실 (%) = (W₀ - W₁)/W₀ × 100

상기 식에서, W₀ 및 W₁은 단백질 분해(proteolytic degradation) 전과 후의 무게이다. 중량 손실은 3개 샘플의 평균값으로 구하였다. 또한, 생분해를 다른 시간 간격에서 SEM으로 관찰하였다.

세포 생존율 및 부착율 분석

마우스 섬유아세포(C2C12, NanoEnt Inc., 한국)의 Fbg 및 FN/Fbg 마이크로튜브에 대한 결합력을 확인하였다. 비-개질된 및 FN-개질된 마이크로튜브(3 cm 길이)를 작은 조작으로 자르고, 30분 동안 UV 빛에서 살균한 다음 세포를 접종하기 전에 1시간 동안 DMEM에서 미리 적셔주었다. 세포(1 × 10⁵ 세포밀도)를 소태아혈청(10%)을 함유하는 DMEM 1 ㎖가 담긴 12 웰 플레이트의 각 웰에 접종하고 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 이후, 상기 배지를 동량의 FN/Fbg 및 Fbg 마이크로튜브를 함유하는 DMEM(1%)으로 교체하였다. 대조군 세포는 마이크로튜브 없이 상기에서 설명한 방법에 따라 유지시켰다. 플레이트를 정상 세포성장 조건에서 5일간 다시 인큐베이션 시키고 나서 미토콘드리아 활성을 WST-1 증식 키트를 사용하여 측정하였다. 동시에, 특정 시간 동안 세포에 마이크로튜브를 처리한 후 calcein AM 0.2 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 20분 동안 인큐베이션 한 다음 형광현미경으로 관찰하였다. 마이크로튜브의 외부 및 내부 표면상에 부착된 대사적으로 활성인 세포를 시각화하기 위한 이미지를 얻었다.

실험결과

마이크로튜브 제조 및 형태 특성

용매추출 과정 동안(도 1)에 수상의 Fbg 용액과 아세톤 사이에 화학반응은 일어나지 않았다. 이런 이유로, 스피노달 분해(spinodal decomposition)인 상기 추출 과정에서 Fbg 용액의 고밀도 상이 보다 더 우세해지는 경우, 마이크로튜브의 추출은 접점(interface)에서의 물질이동(mass transfer)에 의하여 지배될 것이다. 또한, 용매추출은 튜브의 내경 및 점성과 이차적 흐름으로부터의 물질이동과 같은 coaxial 파라미터에 기반하기 때문에, 스피노달 분해의 운동 속도(kinetic rate) 역시 마이크로튜브 표면 화학 및 다공성 구조를 지배할 것이다. 관 모양의 겔-용매추출 시스템에서, 초기 요동(initial fluctuation)은 수상 Fbg 용액과 아세톤 사이의 접점에서 일어날 것이며, 이것은 수상 추출(aqueous extraction, 상 분리) 작용에 강력한 영향을 미칠 수 있다. 이 젖음 현상(wetting phenomenon)은 surface-directed 스피노달 분해와 모세관력을 유도할 수 있고, 튜브 형성을 야기할 수 있다.

겔화 단계 후(용매추출 과정 전), 외부 실리콘 고무 튜브를 조심스럽게 회전하여 제거하고 안쪽 튜브 역시 제거한 다음, Fbg-겔 튜브를 광학 현미경으로 관찰하였다. 이미지는 Fbg-겔 튜브가 원통형으로 형성되었음을 보여주었다(도 2). 또한, 15 wt% Fbg 용액과 FN으로 제조된 Fbg/FN 마이크로튜브의 SEM 이미지를 얻었다(도 3). 그 결과, Fbg/FN 마이크로튜브의 외부 형상 및 다공성 구조를 명확하게 확인하였다. Fbg/FN 마이크로튜브의 측정된 내경 및 외경은 각각 대략적으로 500 μm 및 850-900 μm 이었다. SEM 분석에서, Fbg와 FN/Fbg 마이크로튜브 사이에 유의성 있는 형상의 차이는 확인되지 않았다. 마이크로튜브의 다공성 구조는 Fbg 입자의 계면 장력(interfacial tension)과 벽면 젖음 사이의 상호작용 및 확산에 기반한 이동의 상대적 역학에 의한 것으로 판단된다. 또한, Fbg/FN 마이크로튜브의 미세한 횡단면 구조를 SEM으로 확인한 결과, 매우 부드러운 안쪽 표면임을 확인할 수 있었다.

마이크로뷰브상의 FN 고정

활성화된 생체분자의 증가된 가교결합은 보다 견고한 구조를 만들 수 있었으며, 분해시간을 연장시킬 수도 있었고, 이는 물질의 생체활성(material bioactivity)을 증가시킬 수 있었다. 이런 이유로, 마이크로튜브로의 부착 혹은 편입(incorporation) 후의 단백질의 생물학적 활성의 보존은 중요하다. 본 연구에서, FN은 상처 치료뿐만 아니라, 세포 부착, 이동, 분화 및 생존과 관련된 세포외 기질(ECM) 단백질이기 때문에, Fbg 마이크로튜브와의 가교결합을 위하여 선택하였다. FN-고정된 Fbg 마이크로튜브의 형광현미경 사진을 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, FN은 마이크로튜브의 표면에 고르게 분포되어 있었다.

FT-IR 특성 분석

FN이 Fbg 튜브에 공유결합으로 가교결합 되었는지에 대한 추가적인 확인을 위하여, bare Fbg, EDC-가교결합 된 Fbg 및 FN/Fbg 마이크로튜브를 800 - 1,800 cm^-1의 진동주파수 범위의 FT-IR 스펙트럼으로 조사하였다. 상기 단백질 기반의 폴리머는 상기 스펙트럼 범위에서 펩타이드 또는 아미드 결합 특성을 보여주었다. -C=O 신축 진동(stretching vibration)에 의한 아미드 I(1645 cm^-1), 및 지방족 아미드의 -C(O) 신축 및 면내 N-H 벤딩 모드(in-plane N-H bending mode)에 의한 아미드 II(1542 cm^-1) 지역에서의 피크가 천연 단백질의 모든 클래스에서 관찰되었다. N-H 벤딩 및 복합 진동 모드 아미드 III(complex vibration mode Amide III; 1247 cm^-1)의 결과가 Fbg에서 관찰되었다.

EDC-가교결합 된 Fbg 튜브의 경우, 아미드 I 피크는 1645로부터 1636 cm^-1로, 아미드 II 피크는 1542로부터 1525 cm^-1로 시프트 되었다. 이러한 높은 파장으로부터 낮은 파장으로의 피크 시프트 및 증가된 피크 강도는, 카복실 그룹과 아미노 그룹 사이의 강력한 분자 내 가교결합(intra-molecular cross-linking; 펩티드 결합)을 뒷받침한다. EDC로 가교결합 된 FN/Fbg 스캐폴드의 경우에는, 증가된 피크 강도 및 피크 시프트가 모든 3개의 아미드 밴드(아미드 I, 아미드 II 및 아미드 III)에서 EDC 가교결합 된 Fbg 튜브를 넘었으며, 이러한 결과는 분자 내 가교결합뿐만 아니라 Fbg와 FN 사이의 분자간 가교결합(inter-molecular cross-linking) 역시 일어났음을 의미한다(도 5). FN/Fbg 튜브는 Fbg와 FN 사이의 강력한 가교결합에 의한 최대 피크 시프트를 나타내었으며, 이는 증가된 결합 길이 및 감소된 신축진동(stretching frequency)을 초래하였으며, 궁극적으로 이것은 높은 진동부위로부터 낮은 진동부위로의 파장 시프트를 초래하였다. 그리고, 증가된 피크 강도는증가된 펩티드 결합 형성에 의한 것이다. 상기 IR 스페트럼은 가교결합 된 Fbg-FN 네트워크를 형성하기 위한 폴리머 스캐폴드와 타겟 분자 사이의 분자 내(intra-) 및 분자간(inter-) 가교결합을 확인시켜주었다. 끝으로, 물리적 조사는 추가적인 피크가 가교결합 후에 관찰되지 않았음을 나타내었고, 이러한 결과는 Fbg와 EDC 혹은 FN과 EDC 사이에 화학적 상호작용이 없었음을 나타낸다.

분해 특성 분석

플라스민에 의한 Fbg 또는 FN/Fbg 마이크로튜브의 분해는 이의 형태 조절에 중요할 것이다. 플라스미노겐 및 tPA의 첨가에 의하여 관형의 Fbg 및 FN/Fbg 마이크로튜브의 구조는 5주 후에 분해되기 시작하였으며, 6주(Fbg 마이크로튜브) 및 7주(FN/Fbg마이크로튜브) 내에 완전히 분해되었다(도 6). Fbg 마이크로튜브는 FN/Fbg 마이크로튜브 보다 약간 빠른 분해속도를 나타내었고, FN과 Fbg 사이의 가교결합(공유결합)은 FN/Fbg 마이크로튜브상의 플라스민 결합 및 절단부위를 감소시킬 수 있었다. 그러나, Fbg 분해 속도는 EDC 농도의 증가 혹은 감소를 통하여 변경할 수 있었고, 증가된 가교결합은 외부 형태와 구조적 배열에 의존하였다.

세포 생존율 및 부착율 분석

C2C12 마우스 섬유아세포를 Fbg 및 FN/Fbg 마이크로튜브의 표면에서 5일간 배양하였다. Fbg 및 FN/Fbg 마이크로튜브 상에서 배양된 세포의 증식을 미토콘드리아 활성을 측정하여 평가하였다. FN이 풍부한 Fbg 표면에서는 1-5일 동안 높은 증식율을 보여주었다. 비록 대조군 및 세포가 처리된 Fbg 튜브는 24시간에서 유사한 증식을 보여주었으나, FN/Fbg 튜브가 보다 높은 증식율을 보여주었다. 그리고, 도 7A에 나타난 바와 같이, FN/Fbg 튜브가 처리된 3일과 5일은 대조군과 bare Fbg 튜브에 비하여 높은 증식 세포수를 나타내었다. bare Fbg 튜브 상에서 배양된 마우스 섬유아세포를 세포질 염색을 위한 Calcein AM에 염색되었다(도 7B). 녹색 형광 이미지는 Fbg 마이크로튜브 외부 표면상에서의 온전한 세포 부착 및 상기 세포의 안쪽 공간으로의 온전한 이동을 보여주었다.

상기의 결과는, 두 마이크로튜브(Fbg 및 FN/Fbg) 모두 세포 친화적이고, 생체적합성임을 명백히 보여준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 관 형상의 생체적합성 및 생분해성 스캐폴드 제조방법:
(a) 피브리노겐, 피브린, 젤라틴 및 콜라겐으로 구성된 군으로부터 선택된 겔화 단백질을 포함하는 용액을 얻는 단계;
(b) 상기 용액을 관 구조물에 주입하고, 용액 내 겔화 단백질을 겔화(gelation) 시키는 단계, 여기서 (i) 상기 관 구조물은 외부 관 및 내부 관을 포함하되, 상기 내부 관은 외부 관의 내경(inner diameter)과 내부 관의 외경(outer diameter) 사이에 공간이 생기도록 외부 관안에 삽입된 구조이고, (ii) 상기 용액은 외부 관과 내부 관 사이의 공간으로 주입되며, 주입된 용액 내의 겔화 단백질은 겔화되어 관 형상의 고분자 스캐폴드가 형성되고; 그리고
(c) 상기 고분자 스캐폴드를 관 구조물로부터 분리하기 전 또는 분리한 후에 탈용매(desolvation) 처리하여 관 구조물 내의 잔류 용매 또는 고분자 스캐폴드의 표면에 흡착되어 있는 잔류 용매를 제거하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 횡단면이 원형, 타원형 또는 다각형인 것을 특징으로 하는 스캐폴드 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 다공성 구조인 것을 특징으로 하는 스캐폴드 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 생체 내 혈관 이식용인 것을 특징으로 하는 스캐폴드 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 내경이 500-850 μm인 것을 특징으로 하는 스캐폴드 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 겔화 단백질은 피브로넥틴, 비트로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 아그레칸, 아그린, 연골기질단백질, 피브리노겐, 피브린, 엔탁틴, 라미닌, 콜라겐, 오스테오폰틴, 카드헤린 및 셀렉틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 부착 분자와 가교결합된 것을 특징으로 하는 스캐폴드 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 관 구조물은 실리콘으로 제조된 것을 특징으로 하는 스캐폴드 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 탈용매 처리는 관 구조물 또는 고분자 스캐폴드에 아세톤을 처리하여 관 구조물 내의 잔류 용매 또는 고분자 스캐폴드의 표면에 흡착되어 있는 잔류 용매를 제거하는 것을 특징으로 하는 스캐폴드 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 아세톤은 -5 - 5℃로 저온처리 된 것을 특징으로 하는 스캐폴드 제조방법.