KR20100041027A

KR20100041027A - 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 다공성 3차원 지지체

Info

Publication number: KR20100041027A
Application number: KR1020080100005A
Authority: KR
Inventors: 민병현; 장지욱
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2008-10-13
Filing date: 2008-10-13
Publication date: 2010-04-22
Also published as: KR101056069B1; WO2010044577A2; JP2012505013A; EP2345435B1; EP2345435A4; CN102238970B; US20110195107A1; WO2010044577A3; JP5483035B2; EP2345435A2; CN102238970A

Abstract

본 발명의 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법은, 동물 유래 조직을 분말화하는 단계와, 상기 동물 유래 조직의 분말화 이전 또는 이후에, 또는 분말화와 동시에 탈세포하는 단계와, 상기 탈세포된 동물 유래 조직의 분말을 입자추출법을 이용하여 다공성 3차원 지지체로 형성하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르는 다공성 3차원 지지체는 다양한 크기, 다공성, 형태 및 구조를 가짐으로써 치료목적 내지는 사용목적에 알맞게 임상에 적용될 수 있고, 이식 시 면역 거부 반응이나 염증 반응이 없고, 임상에 적용가능한 생체적합성이 우수하며, 연골재생에 있어서도 콜라겐 및 다른 합성고분자 지지체 보다 연골재생 효과가 우수하다. 또한, 세포의 이동, 성장, 및 분화에 적합한 환경을 제공하고, 연골 재생에 적합한 구성성분과 성장인자 등을 포함하고 있으며, 우수한 생체 적합성 및 생분해성 그리고 3차원 구조로 인해 연골 결손에 있어 조직공학적 지지체로 유용하게 사용될 수 있다.

동물조직, 연골, 분말, 입자추출법, 몰드, 가교, 3차원 지지체, 탈세포

Description

동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 다공성 3차원 지지체{Method for preparing three-dimensional scaffold using animal tissue powder and three-dimensional scaffold manufactured by the same method}

본 발명은 동물조직 분말을 이용한 3차원 형태의 다공성 지지체 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 3차원 형태의 다공성 지지체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물조직 분말을 입자추출법으로 3차원 형태의 다공성 지지체로 제조하여 치료목적 내지는 사용목적에 맞는 다양한 크기, 다공성, 형태 및 구조를 갖는 3차원 형태의 다공성 지지체를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 제조된 3차원 형태의 다공성 지지체에 관한 것이다.

관절 연골세포는 연골에서만 발견되는 특화된 중간엽 유래 세포이다. 연골은 연골세포에 의해 생성된 세포외기질로 구성된 무혈관 조직으로 일단 손상을 받으면 염증반응을 일으키지 않고, 자가 치유가 일어나지 않는다. 따라서, 일단 손상을 받으면 자기 치유가 극히 제한적이고 궁극적으로 골관절염을 초래하여 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미친다.

현재 손상된 연골 치유 방법에는 소파성형술 및 미세골절술 등의 골수자극술과, 골, 연골조직을 이식하는 모자이크플라스티와, 자가연골세포를 배양해서 이식하는 자가연골세포이식술 등이 있다.

골수자극술은 관절경을 이용하여 최소한의 침습으로 단시간에 시술을 할 수 있어 간단한 시술 방법과 짧은 시술 시간이라는 장점으로 많이 사용되지만, 연골 치유에 핵심적인 혈액과 줄기세포로 형성된 혈병(blood clot, 줄기세포 포함)을 유지시키기 어렵고, 물리적으로도 불안정하여 정상연골로의 재생이 어렵다. 즉, 시술 과정 중 골수로부터 유래한 혈병을 유지할 수가 없어 재생된 연골이 정상 연골보다는 섬유성 연골로 되기 때문에 성공적인 치유를 기대하기 어렵다.

모자이크플라스티는 체중부하와 마찰이 적은 부위의 연골조직을 채취하여 손상부위에 채워주는 방법으로 우수한 치유효과가 있지만, 2차 손상을 가져오는 문제점이 있다.

최근에는 자가 세포를 배양해서 이식하는 자가연골세포이식술(autologous chondrocytes implantation, ACI)이 연골치료에 사용되고 있다. 현재, 자가연골세포이식술은 임상적으로 승인된 세포이식법(Brittberg, M., et al., New Eng. J. Med., 331 ~ 889, 1994)이다. 그러나, 자가연골세포이식술에서는 골막을 채취하여 연골결손부위를 치밀하게 봉합하여 덮어야 하고, 또한 골막이 연골을 과다 증식시켜 수술 후 환부에 동통을 초래할 우려가 있다. 아울러 두 단계의 수술과정을 거쳐야한다는 번거로움이 있다. 처음에는 관절경 시술 하에 자가 연골을 채취하여 체외에서 연골세포를 분리 및 장기간 배양한 다음 다시 세포 혼탁액을 결손부위에 이식 한다. 따라서, 자가연골세포이식술은 연골을 채취해서 수술해야 하는 단점과 장기간 배양해야 하는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 동물의 조직, 특히 동물의 연골을 채취한 후 "연골의 분말화"와 "입자추출법 사용"으로 3차원 지지체를 형태로 제작하여 이식하면 궁극적인 목적인 초자 연골조직의 재생효과를 증진시킬 수 있을 뿐만아니라 물성, 다공성, 형태, 구조 및 크기에 제약이 없는 3차원 형태의 지지체를 제공할 수 있을 것으로 판단하였다.

최근에는 동종(allogenic) 또는 이종(xenogenic) 조직이나 장기를 채취한 후, 세포를 제거(acellularized)하여 여러 가지 형태의 지지체나 막으로 사용하는 기술이 주목을 받고 있다.

현재까지 소장의 점막하조직(SIS), 방광(UBM), 피부(skin), 및 양막(HAM) 등이 상품화되었거나 연구가 진행되고 있다. 예를 들면, 기증자로부터 피부를 제공받아 탈세포화하여 개발한 Alloderm 및 소장점막하조직(SIS)을 탈세포화하여 상처 드레싱제로 개발한 OASIS, 그리고 돼지 방광조직을 탈세포화하여 개발한 UBM 등이 있다. 또한, 연골 재생을 위해 개발된 것으로서 제1형, 제3형 교원질로 제작한 Chondro-gide(상표명임)(bilayer collagen membrane)를 이용한 연골재생 연구가 활발히 진행되고 있다.

참고로, 연골조직의 생화학적 구성은 조직액, 거대분자 및 기타 기질로 나눌 수 있다. 조직액은 65~80%의 수분과 단백질, 무기염류, 가스 및 각종 대사물질로 이루어져 있고, 음전하를 띈 단백당과의 균형을 이루기 위해 전체적으로 양전하의 농도가 높다.

거대분자는 약 60% 정도가 교원질이며 세포외 기질내의 단백당과 결합하여 그물망 구조를 형성함으로써 연골의 형태를 유지하게 하고 장력 또는 탄성력을 제공하고 있다. 연골의 대부분(90~95%)은 제 2형 교원질로 이루어져 있으며, 모두 3가닥의 α형 사슬이 나선구조를 하고 이들이 모여 섬유모양을 이룬다. 단백당은 중심이 되는 단백질(core protein)에 콘드로이틴 4-설페이트(chondroitin 4-sulfate), 콘드로이틴 6-설페이트(chondroitin 6-sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate) 등의 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan)(GAG)이 결합하여 이루어진 복합체인데, 이들은 거의 대부분(80~90%) 연골에서 서로 뭉쳐서 어그리칸(aggrecan)이라 불리는 큰 분자를 이룬다.

기타 기질로는 비-콜라겐 단백질(noncollagenous protein)과 당단백질(glycoprotein) 등이 연골의 건조 중량의 10~15%를 차지하고 있으며, 주로 기질 거대분자의 구조를 안정화시키고 유기조직을 형성하는 것을 도와준다.

그런데, 이종 및 동종 조직 이식시 세포항원은 숙주에 의해서 인식되므로 조직의 염증반응이나 면역 거부반응을 야기한다. 하지만 세포외기질의 구성물은 일반적으로 동종 수여자에게 구성물에 대한 내성이 있다. 따라서, 심혈관, 혈관, 피부, 신경, 골근, 건, 방광, 간 등을 포함한 조직의 다양한 세포외기질은 조직공학과 재생의학의 응용에 많은 연구가 되고 있다. 탈세포화의 목적은 효율적으로 세포, 핵 등을 제거하고 구성물에 대한 거부반응을 줄이고 세포외 기질의 기계적 강도를 높이는 것이다.

참고로, 일반적으로 사용되는 최적화된 탈세포 방법은 물리적 방법과 화학적 방법을 포함한다. 물리적 방법은 교반이나 초음파처리, 기계적 압력, 동결이나 해동 절차를 포함한다. 이 방법은 세포막을 분열시키고, 세포 구성물을 노출시킨다. 그 이후 씻어내는 공정을 수행하고 세포외기질로부터 세포를 제거하게 된다. 그러나, 이 물리적 방법은 일반적으로 완벽한 탈세포에는 불충분하다. 따라서, 물리적 방법은 화학적 방법과 결합되어 시행되어야 한다. 트립신 같은 효소적 처리나 이온용액 같은 화학적 처리는 세포막을 분열시키고 세포내부와 세포외부의 연결고리를 해체시킨다. 탈세포 공정 동안 세포외기질은 기본 골격을 유지하면서 알맞게 분열되는데, 탈세포 공정은 조직에서 세포물질들을 제거하며 처리액(chaotropic)에 모든 세포들을 알맞게 노출시키도록 한다. 대부분 탈세포 공정의 목적은 분열을 최소화하고 원래의 기계적 특성이나 생물학적 특성을 유지하는 것이다.

이와 관련하여 천연조직의 세포외 기질을 이용하여 다공성 지지체를 제조하는 종래기술들이 개시되어 있다. 예를 들어, 미국공개특허 제2007/0248638A1호에서는 연골세포와 같은 천연의 조직세포에 산화제와 세정제를 동시에 처리하여 탈세포화하고 이를 동결건조를 통해 다공성의 지지체로 형성하는 것을 개시하고 있고, 미국공개특허 제2008/0124374A1호에서는 척추동물의 골수세포에 있어서 세포외기질로부터 탈세포화하는 방법 및 이를 이용한 치료용 기구를 개시하고 있다.

이들 선행기술들은 천연의 연골세포조직이나 골수세포조직에서 탈세포된 이종의 세포외기질이 다공성 3차원 지지체 형태를 갖는 것을 이용하는 기술들이었다. 이들은 조직의 탈세포화를 통해 다공성 3차원 지지체를 제작하여 면역거부 반응을 줄일 수는 있으나, 자연 조직을 그대로 이용하므로 지지체의 크기, 다공성, 형태, 구조에 제한이 있어 상업적으로 그리고 치료목적으로 적용에 제한이 있는 문제점이 있었다.

즉, 수술환자의 손상 부위, 손상 면적, 환자 마다의 특성에 따라 치료에 적용되는 다공성 3차원 지지체의 크기, 형태나 구조를 다양화시킬 필요가 있으나, 천연 연골조직을 단순히 탈세포화하는 방식은 이러한 치료의 다양화를 기할 수 없다는 한계를 갖고 있었다.

한편, 미국특허 제7,201,917호는 세포외기질을 액상으로 하여 슬러리로 만든 후 동결건조를 통해 다공성의 지지체로 제조하는 방법을 제공하고 있으나, 이 방법은 자연조직의 세포외기질을 액상 슬러리화하는 것을 특징으로 하고 있다. 또한, 미국특허 제4,656,137호은 동물의 연골분말 제조에 관한 것으로서 동물로부터 연골을 수득하여 효소제 처리를 통해 연골에 부착된 각종의 단백질 및 지방조직을 제거하고 1차로 4 to 8 mm 크기로 분쇄한 후, 동결건조를 통해 수분제거 및 2차 분쇄를 통해 40 to 70μmm의 크기로 분말화하는 기술을 개시하고 있다.

그러나, 이들 기술은 자연조직에서 탈세포화하여 기존 조직의 세포외 기질을 그대로 이용하는 방식으로서 지지체의 크기, 다공성, 형태, 구조에 제한이 있어 상업적으로 그리고 치료목적으로 적용에 제한이 있는 문제점이 있었으며, 연골의 분말화에 관한 미국특허 제4,656,137호는 다양한 크기, 형태, 구조를 갖는 연골분말의 3차원적 지지체 제조에 대해서 개시하고 있는 것이 아니라 상처 등의 치료목적으로 연골을 분말화하는 기술에 관한 것이었다.

따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 초자 연골조직의 재생효과를 증진시킬 수 있을 뿐만아니라 물성, 다공성, 형태, 구조 및 크기에 제약이 없는 3차원 형태의 지지체를 제공하는 기술이 요구되고 있다고 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 동물의 조직, 예를 들어 연골을 채취한 후 "분말화"와 "입자추출법 사용"으로 다공성 3차원 지지체를 제작하여 물성, 다공성, 형태, 구조 및 크기에 제약이 없는 다공성 3차원 지지체를 개발하였다.

한편, 조직공학에서 입자추출법은 PLA, PGA 및 PLGA 등의 합성고분자를 3차원 지지체로 제작하는데 사용되고 있다. 입자추출법에서는 공극 유도 물질(porogen)로서 원하는 공극 크기의 물질(염, 유기당, 파라핀, 얼음입자 등)을 일정량의 고분자 용액에 첨가하고 혼합하여 일정한 형태로 가공한 후 캐스팅이나 동결건조로 유기 용매를 완전히 제거하고, 공극 유도 물질(porogen)을 물이나 적당한 용매 또는 건조 등으로 용해시키거나 제거하면 원하는 크기의 공극을 가진 3차원 지지체를 완성할 수 있다. 본 발명자들은 이러한 기본적인 입자추출법의 원리를 이용하되, 유기용매나 기타 용매를 이용하여 재료를 용해시키지 않고 동물 유래 조직의 분말과 공극 유도 물질을 혼합하고, 분말을 결합시키기 위해 가교제(EDC)를 사용하였다.

또한, 동물의 조직, 예를 들어 연골의 분말화 과정 이전 또는 이후에, 또는 분말화와 동시에 탈세포 공정을 추가하여 제작된 연골분말의 다공성 3차원 지지체는 이식 시 염증 반응이 없고, 임상에 적용 가능한 생체적합성이 우수한 것으로 판명되었다.

본 발명은 동물의 조직, 예를 들어 연골분말을 입자추출법으로 3차원 형태의 다공성 지지체로 제조하여 치료목적 내지는 사용목적에 맞는 다양한 크기, 다공성, 형태 및 구조를 갖는 3차원 형태의 다공성 지지체 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 3차원 형태의 다공성 지지체를 제공하는데 그 목적이 있다.

보다 구체적으로, 본 발명은 동물의 조직, 예를 들어 연골을 채취한 후 "분말화"와 "입자추출법 사용"으로 3차원 지지체를 제작하여 초자 연골조직의 재생효과를 증진시킬 수 있을 뿐만아니라 물성, 다공성, 형태, 구조 및 크기에 제약이 없는 3차원 형태의 다공성 지지체 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 3차원 형태의 다공성 지지체를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 동물의 조직, 예를 들어 연골을 채취한 후 분말화 과정을 수행하기 이전 또는 분말화 과정을 수행한 이후에, 또는 분말화와 동시에 물리적 방법 및/또는 화학적 방법을 이용한 탈세포 공정을 추가하여 이식 시 염증 반응이 없고, 임상에 적용 가능한 생체적합성이 우수한 3차원 형태의 다공성 지지체 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 3차원 형태의 다공성 지지체를 제공하는데 그 목적이 있다.

추가로, 본 발명은 연골세포나 뼈세포, 줄기세포 등의 세포가 접종된 3차원 지지체를 포함한 세포치료제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법은, 동물 유래 조직을 분말화하는 단계와, 상기 동물 유래 조직의 분말화 이전 또는 이후에, 또는 분말화와 동시에 탈세포하는 단계와, 상기 탈세포된 동물 유래 조직의 분말을 입자추출법을 이용하여 다공성 3차원 지지체로 형성하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법의 일실시예에 있어서, 상기 입자추출법은 유기용매나 기타 용매를 이용하여 재료를 용해시키지 않고, 상기 탈세포된 동물 유래 조직의 분말과 공극 유도 물질을 혼합하고, 상기 탈세포된 동물 유래 조직의 분말을 결합시키기 위해 가교제를 사용한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법의 일실시예에 있어서, 상기 입자추출법은 공극 유도 물질(porogen)로서, 예를 들어 염화나트륨과 같은 염 입자, 유기당 입자, 덱스트란 입자, 설탕 입자, 얼음 입자 및 파라핀 입자로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 입자를 사용할 수 있다.

본 발명의 방법의 일실시예에 있어서, 상기 다공성 3차원 지지체로 형성하는 단계에서, 탈세포된 동물 유래 조직의 분말과, 입자추출법에 사용되는 공극 유도 물질(porogen)의 입자를 섞어 몰드에 넣은 후 가압성형하여 사용목적 및 치료부위에 따라 여러가지 형태 및 크기를 갖는 다공성 3차원 지지체를 제작하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법의 일실시예에 있어서, 자외선(UV), EDC, NHS, 탈수열건조법(dehydrothermal method) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 구성된 군으로 부터 선택된 적어도 한 가지 방법으로 다공성 3차원 지지체를 가교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 방법의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 동물 유래 조직의 분말에 하나 이상의 성장인자를 넣어 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 방법의 더욱 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 입자추출법을 이용하여 형성된 다공성 3차원 지지체에 연골세포를 접종한 다음, 재배양하여 조직공학적 연골조직을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 방법의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 동물 유래 조직은 돼지, 소, 양, 말, 개 또는 고양이 등의 척수동물에서 유래한 연골일 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 동물 유래 조직의 분말은 돼지 연골 분말이다.

본 발명의 방법의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 동물 유래 조직을 분말화하는 단계는 동물 유래의 연골조직으로부터 연골을 분리한 다음 분쇄기를 이용하여 분쇄하는 단계와, 분쇄한 연골을 동결분쇄기를 통하여 분쇄하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법의 다른 일실시예에서, 상기 동물 유래 조직은 돼지, 소, 양, 말, 개 또는 고양이 등의 척수동물에서 유래한 양막, 피부, 소장점막하 조직, 근막, 또는 척수막일 수 있다.

본 발명의 방법의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 탈세포하는 단계는 물리적 탈세포 방법, 화학적 탈세포 방법 또는 물리적 및 화학적 방법을 조합한 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.

상기 물리적 탈세포 방법은 동결-해동법, 초음파 처리, 또는 물리적 교반을 포함한다. 상기 화학적 탈세포 방법은 상기 동물 유래 조직의 분말을 저장액, 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, DNase, RNase 또는 트립신으로 처리하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 탈세포하는 단계는 약 0~50 ℃의 온도범위에서 수행하는 것이 바람직하다.

상기 화학적 탈세포 방법에 있어서, 상기 저장액은 트리스 HCl(Tris HCl)(pH 8.0) 용액이고, 상기 음이온성 계면활성제는 소디움도데실설페이트(SDS), 소디움데옥시초레이트(sodium deoxycholate), 또는 트리톤 X-200(Triton X-200)이며, 상기 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100)이고, 상기 양이온성 계면활성제는 CHAPS, 술포베타인-10(Sulfobetaine-10, SB-10), 술포베타인-16(SB-16), 또는 트리-n-부틸포스페이트(Tri-n-butyl phosphate)일 수 있다.

본 발명의 다공성 3차원 지지체의 제조방법에 의해 제조된 다공성 3차원 지지체는 연골 재생용 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 다공성 3차원 지지체는 관절연골조직의 제작 뿐 아니라 디스크, 뼈조직의 제작에도 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다공성 3차원 지지체는 하나 이상의 성장인자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 더욱 바람직한 다공성 3차원 지지체는 연골세포가 접종된 후, 연골세포를 재배양하여 조직공학적 연골조직이 추가로 형성된 것일 수 있다.

본 발명에 따르는 동물의 조직, 예를 들어 연골의 분말을 이용한 다공성 3차 원 지지체는 다양한 크기, 다공성, 형태 및 구조를 가짐으로써 치료목적 내지는 사용목적에 알맞게 임상에 적용될 수 있는 장점이 있다. 즉, 본 발명에 따르면 초자 연골조직의 재생효과를 증진시킬 수 있을 뿐만아니라 물성, 다공성, 형태, 구조 및 크기에 제약이 없는 3차원 형태의 다공성 지지체를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 동물의 조직, 예를 들어 연골의 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체는 동물의 조직, 예를 들어 연골을 채취한 후 분말화 과정을 수행하기 이전 또는 수행한 이후에, 또는 분말화와 동시에 물리적 방법 및/또는 화학적 방법을 이용한 탈세포 공정을 추가하여 제작됨으로써 이식 시 면역 거부 반응이나 염증 반응이 없고, 임상에 적용가능한 생체적합성이 우수하며, 연골재생에 있어서도 콜라겐 및 다른 합성고분자 지지체 보다 연골재생 효과가 우수하다.

또한, 본 발명의 동물의 조직, 예를 들어 연골의 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체는 3차원으로 제조되어 세포의 이동, 성장, 및 분화에 적합한 환경을 제공하고, 연골 재생에 적합한 구성성분과 성장인자 등을 포함하고 있으며, 우수한 생체 적합성 및 생분해성 그리고 3차원 구조로 인해 연골 결손에 있어 조직공학적 지지체로 유용하게 사용될 수 있다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

<참조예 1> 돼지 연골의 분리

돼지연골의 분리는 EN 12442의 "Animal tissues and their derivatives utilized in the manufacture of medical devices, part 1; Analysis and management of risk, part 2; controls on sourcing, collection and handling"을 참조하여 기준에 부합하는 시설의 돼지의 연골을 구입하여 사용하였다.

돼지 연골에서 연골을 잘라내어 연골 조각(약 20×30㎜)을 만들고 여기에 생리식염수를 이용하여 10분간 3회 세척하였다. 세척된 연골 조각을 1% 항균-항진균제(antibiotic-antimycotic)가 포함된 PBS에 담은 후, -80 ℃에서 초저온냉장고에서 최종 보관을 하였다(도 1의 (a) 참조).

<실시예 1> 돼지 연골의 분쇄

세척한 연골 조각은 당업계에 널리 알려지고 상업적으로 입수가능한 분쇄기(후드믹서 HMF-505, 한일(Hanil), Korea)를 사용하여 약 2×2 ㎜ 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 연골 조각은 동결건조를 하고, 최종적으로 건조된 연골 조각을 동결분쇄기(JAI, JFC-300, Japan)를 사용하여 약 10 ㎛ 사이즈 정도로 동결 분쇄하였다.

1-1. 돼지연골분말의 형태 분석

주사전자현미경(scanning electron microscope)을 사용하여 동결 분쇄한 돼지연골분말의 형태를 분석하였다. 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 실시예 1에서 분쇄한 돼지연골분말을 1시간 정도 고정시킨 후 인산염완충용액(phosphate buffer solution)으로 세척하였다. 시료를 에탄올로 탈수시킨 후 건조하여 전자현미경(JEOL, JSM-6380, Japan; 20KV)으로 파우더 크기 및 형태를 관찰하였다. 크기는 약 10 ㎛ 정도로 관찰되었다(도 1의 (c)).

<실시예 2> 돼지연골분말의 탈세포 및 특성 분석

2-1. 돼지연골분말의 탈세포화

돼지연골분말에 존재하는 연골세포 및 유전자 성분을 제거하고, 순수한 세포외기질을 얻기 위하여 다음과 같이 탈세포화 과정을 수행하였다.

실시예 1에서 제조한 돼지연골분말을 10 g당 0.1%의 SDS(sodium dodecyl sulfate, Bio-rad, USA) 1ℓ용액에 넣고 100 rpm에서 24시간 동안 교반하였다. SDS 처리 후 3차 증류수로 100 rpm에서 30분간 5회 세척하였다.

세척수의 교환에 있어서 연골분말을 침전시키기 위해 초고속원심분리기(US-21SMT, Vision, Korea)를 사용하여 10,000 rpm에서 1시간 동안 연골분말을 침전시켰다.

다음으로, 200 U/㎖의 농도의 DNase(Sigma, USA) 200 ㎖을 넣고, 37 ℃에서 100 rpm으로 24시간 교반시켰다. 3차 증류수의 세척수로 100 rpm에서 30분간 5회 세척하였다. 세척수의 교환은 전술한 바와 같은 SDS 세척에서의 원심분리 조건으로 진행하였다. 탈세포화된 연골분말은 도 1의 (b)에 도시된 바와 같다.

한편, 본 발명의 실시예에서는 연골분말 제조 후 탈세포 과정을 수행하였으나, 연골의 분말화 전에 탈세포를 수행하고 분말화하는 것 역시 본 발명의 방법이 배제하는 것이 아님을 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다.

2-2. 탈세포된 돼지연골분말의 DNA 함량 분석

탈세포 이전의 연골 조직(이하, "PC"로 약칭함)과 탈세포 공정을 거친 연골조각(PC) 및 탈세포 공정을 거친 연골분말(이하, "PCP"로 약칭함)을 시편으로 하여, Qubic DNA 정량 기기(Qubic, BIORAD, USA)로 DNA를 정량적으로 분석하였다. 그 분석 결과를 하기의 표 1 및 도 2의 그래프로 나타내었다. 참고로, 탈세포화 과정은 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였다.

[표 1] DNA 잔존량을 수치화한 결과

	DNA 잔존량(함량)	C.V 값
탈세포 전 PC	485	13.22876
탈세포 후 PC	394	4.358899
탈세포후 PCP	9.48	0

<실시예 3> 탈세포된 돼지연골분말을 이용한 3차원 지지체 제조 및 특성 분 석

3-1. 다공성 3차원 지지체 제조

실시예 2-1에 기술한 방법으로 탈세포한 연골분말을 1:9 비율로 염화나트륨(NaCl, 결정 크기 250~350 ㎛)과 골고루 섞는다. 여기에 3차 증류수에 용해시킨 100mM EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride, Sigma, USA) 용액을 10 % 비율로 섞는다.

EDC 용액을 연골분말 및 염화나트륨 혼합물에 골고루 섞은 후 자체 제작한 초경합금 몰드에 혼합물 시료를 넣고 1000 psi 압력에서 가압하여 디스크 형태의 성형물을 제조한다. 몰드는 일반적인 몰드와 같이 고정부재와 가동부재로 구성되고 고정부재 및/또는 가동부재 내부에 원하는 3차원 지지체의 형상을 형성한다. 본 실시예에서는 디스크 형태의 3차원 지지체를 제조하였으나, 사용목적 및 치료부위에 따라 여러가지 형태 및 크기를 갖는 3차원 지지체 제작이 가능하다.

본 실시예에서는 다공성 3차원 지지체 형성에 있어서의 공극 유도 물질(porogen)로서 염화나트륨 입자를 사용하였으나, 다른 물질, 예를 들어, 설탕 입자나 얼음 입자도 본 발명의 방법에 적용이 가능함을 본 발명이 속한 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다.

다음으로, 디스크 형태의 성형물을 상온에서 건조시킨 후, 100 mM EDC(99.9% 에탄올에 녹인 용액)에서 4시간 동안 가교시키고, 100mM의 NHS(N-Hydroxysuccinimide, Fluka, Japan)를 넣고 다시 4시간 반응시킨다. 가교반응은 연 골분말의 다공성 3차원 지지체의 물성을 좋게 하고 분해기간을 연장시키기 위해 수행한다.

가교 반응이 끝나면 염을 용출하기 위해 3차 증류수에 넣고 최소 5회 이상 교환하여 염을 완전히 제거한다. 가교 후 미반응기를 제거하기 위하여 NH₂PO₄로 3회 세척한다. 마지막으로 3차 증류수로 3회 세척한 후 동결건조한다.

도 3에는 연골분말의 다공성 3차원 지지체의 제조공정이 도시되어 있으며, 도 4에는 이러한 제조공정에 따라 제작된 최종 제품이 도시되어 있다.

3-2. 돼지연골분말지지체의 다공구조 분석

주사전자현미경(scanning electron microscope)을 사용하여 돼지연골분말지지체의 다공구조를 분석하였다. 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 실시예 3-1에서 제작한 돼지연골분말지지체를 1시간 정도 고정시킨 후 인산염완충용액(phosphate buffer solution)으로 세척하였다. 시료를 에탄올로 탈수시킨 후 건조하여 전자현미경(JEOL, JSM-6380, 일본; 20KV)으로 지지체의 다공 크기 및 형태를 관찰하였다.

다공크기는 약 200 ㎛ 내외였으며, 상호 다공 연결성은 우수하였다. 또한, 전체 다공 분포도 균일하였으며, 표면다공도 열린 형태로 되어 있었다(도 5 참조).

3-3. 돼지연골분말지지체의 다공도 분석

수은다공 측정계(Mercury porosimeter)를 사용하여 돼지연골분말지지체의 다공도를 분석하였다. 분석 시료의 무게는 0.0193g이었으며 분석 압력은 50 ㎛Hg, 시간은 5분, 수은 충진 압력은 0.44 psia이었다. 측정한 결과 돼지연골분말지지체의 다공도는 82.39%였다(도 6 참조).

<실시예 4> 돼지연골분말지지체의 친수성 평가

돼지연골분말지지체의 친수성 특성을 파악하기 위해 염료를 이용하여 물 흡수도를 육안으로 확인하였다. 돼지연골분말지지체 위에 2.5%의 트리판블루 세포 염색 용액을 떨어뜨리고 10초 후 사진을 찍어서 평가한 결과 염료가 지지체에 바로 흡수되는 것을 확인하였다. 따라서, 돼지연골분말지지체는 친수성이 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

<실시예 5> 돼지연골분말지지체의 유효성 평가

5-1. 돼지연골분말지지체를 이용한 연골세포 배양

생후 2주 이내의 뉴질랜드산 토끼의 연골에서 연골세포를 분리하였다. 무릎 연골에서 연골 조직만을 채취한 후 이를 1~2 ㎜ 정도로 잘게 자르고 0.1% 콜라게나아제(Collagenase type Ⅱ, Washington, USA)로 37℃ 세포 배양기에서 12시간 처리함으로써 연골 세포의 분리가 이루어진다. 0.1% 콜라게나아제의 12시간 처리 후 세포여과기로 연골세포만을 거르고, 원심분리(1700rpm, 10분)하여 연골세포만을 분리 하였다.

전술한 바와 같은 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3에서 설명된 방법으로 제조한 연골분말의 다공성 3차원 지지체(직경 5㎜, 높이 2㎜)에 분리된 토끼 연골세포를 5×10⁶세포의 농도로 파종하였다.

한편, 배지[DMEM + 1% 항생-항진균제(antibiotic-antimycotic) + ITS{1.0㎎/㎖의 인슐린, 0.55㎎/㎖의 인간 트랜스페린(human transferrin), 0.5㎎/㎖의 소듐 셀레나이트(sodium selenite)로 구성} + 50㎍/㎖의 아스코르브산(ascorbic acid) + 1.25㎎/㎖의 소혈청 알부민(bovine serum albumin) + 100 nM 덱사메타손(dexamethasone) + 40㎍/㎖의 프롤린]는 일주일에 3번 교환하여 주었다.

5-2. 돼지연골분말지지체의 세포접종률 평가

토끼 연골세포를 5×10⁶세포로 계수한 후 돼지연골분말지지체에 정적 접종 방법으로 접종하였다. 세포가 지지체에 부착되도록 4시간 동안 37℃ 세포 배양기에서 배양한 후 배양액을 넣어 주었다. 이때 지지체에 부착되지 않고 바닥에 떨어진 세포를 계수하였다. 또한, 24시간 후 지지체를 새 플레이트로 옮기고 바닥에 떨어진 세포를 계수하였다.

세포접종률을 평가한 결과, 4시간 후 교원질 지지체(collagen sponge)의 세포접종률은 90.5%였고, 돼지연골분말지지체의 세포접종률은 80%였다. 24시간 후 세포접종률은 교원질 지지체가 90%로 계산되었고, 돼지연골분말지지체가 79%로 계산 되었다.

교원질 지지체가 더 높은 세포 접종률을 나타내었지만, 연골분말지지체도 80% 정도의 높은 세포접종률을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 9 참조).

5-3. 시간의 경과에 따른 연골 조직 형성능 비교

본 발명의 3차원 지지체와의 비교를 위해 아텔라 제 1형 교원질(MATRIXEN^TM _, 바이오랜드, Korea)을 1%의 농도로 녹여 동결건조법으로 스폰지로 제작한 것을 대조군으로 사용하였다.

전술한 바와 같은 방법으로 토끼 연골 세포를 파종한 대조군의 교원질 지지체와 본 발명의 연골분말 3차원 지지체를 1주와 2주 동안 배양한 후 일정한 기간에 샘플을 회수하여 10% 포르말린으로 24시간 고정하였다. 고정된 샘플은 파라핀 포매(包埋)후 절편을 만들고 사프라닌-O(safranin-O) 염색과 H&E 염색을 하여 연골 조직 형성능을 비교하였다.

그 결과, 배양 후 1주가 된 시점에서 대조군의 교원질 지지체와 본 발명의 연골분말 3차원 지지체 모두에서 흰색의 반투명한 조직이 형성되었다(도 10 참조). 사프라닌-O(Safranin-O) 염색 결과, 대조군의 교원질(콜라겐) 지지체와 본 발명의 연골분말 3차원 지지체 모두에서 연골세포가 분포되어 있음을 확인하였지만, 본 발명의 연골분말 3차원 지지체가 교원질 지지체 보다 세포 분포도가 높았고, 본 발명의 3차 지지체 벽을 따라 글리코스아미노글리칸의 합성 및 연골화 진행도 우수하였 다(도 10 참조).

도 11에 도시된 바와 같이, 배양 후 2주가 된 시점에서도 두 그룹 모두 반투명한 형태를 나타냈다. 사프라닌-O 염색 결과 두 그룹 모두 배양 후 1주가 된 시점 보다 우수한 연골재생 효과를 나타냈지만, 본 발명의 연골분말 3차원 지지체에서 는 거의 전체적으로 연골 재생 효과를 나타냈다(도 12 참조).

따라서, 본 발명의 다공성 3차원 지지체는 연골재생에서 있어서 물성, 다공성, 형태, 구조 및 크기에 제약이 없고, 3차원으로 제조되어 연골세포의 이동, 성장, 및 분화에 적합한 환경을 제공하고, 우수한 생체 적합성 및 생분해성 그리고 3차원 구조로 인해 연골 결손에 있어 조직공학적 지지체로 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상 본 발명을 전술한 실시예에 따라 설명하였으나, 본 발명은 개시된 실시예에 제한되는 것은 아니다. 당업자라면, 본 발명의 취지에 따라 수정 변경이 가능하며, 이러한 수정 변경 또한 본 발명의 범위에 속한다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

도 1의 (a)는 돼지연골을 분리한 돼지연골 조각의 사진이고, 도 1의 (b)는 돼지연골을 동결분쇄 후 탈세포한 분말의 사진이며, 도 1의 (c)는 탈세포된 돼지연골분말의 SEM 사진이다.

도 2는 돼지 연골(Native porcine cartilage; 탈세포 전 PC), 탈세포한 돼지연골 조각(Decellular porcine cartilage, decellular PC), 그리고 탈세포한 연골 분말(Decellular porcine cartilage powder, decellular PCP)의 DNA 잔존량을 정량한 결과를 그래프로 나타낸 도면이다.

도 3은 본 발명에 따르는 연골분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조공정을 설명하는 모식도이다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 연골분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 사진이다.

도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 연골분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 SEM 사진이다. 도 5의 (a)는 표면의 20배 사진이고, 도 5의 (b)는 표면의 50배 사진이며, 도 5의 (c)는 옆면의 20배 사진이고, 도 5의 (d)는 옆면의 50배 사진이다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 연골분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 다공분포도이다.

도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조한 연골분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 친수성 실험 결과 사진이다.

도 8은 생체외 조건에서 세포를 배양하여 유효성을 평가하기 전의 교원질 지지체와 본 발명의 돼지연골분말지지체의 사진이다. 도 8의 (a)는 교원질 지지체의 정면 사진이고, 도 8의 (b)는 교원질 지지체의 옆면 사진이며, 도 8의 (c)는 본 발명의 돼지연골분말지지체의 정면 사진이고, 도 8의 (d)는 본 발명의 돼지연골분말지지체의 옆면 사진이다.

도 9는 대조군인 교원질 지지체와 본 발명의 돼지연골분말지지체에 세포를 접종한 후 세포접종률을 분석한 결과를 나타내는 도표이다.

도 10은 생체 외 배양 일주일 후 대조군인 교원질 지지체와 본 발명의 돼지연골분말지지체의 성장 모습을 나타내는 사진이다. 도 10의 (a)는 교원질 지지체의 정면 사진이고, 도 10의 (b)는 교원질 지지체의 옆면 사진이며, 도 10의 (c)는 본 발명의 돼지연골분말지지체의 정면 사진이고, 도 10의 (d)는 본 발명의 돼지연골분말지지체의 옆면 사진이다.

도 11은 생체 외 배양 일주일 후 대조군인 교원질 지지체와 본 발명의 돼지연골분말지지체의 사프라닌-O(Safranin-O) 염색 사진이다. 도 11의 (a)는 교원질 지지체의 20배 사진이고, 도 11의 (b)는 교원질 지지체의 100배 사진이며, 도 11의 (c)는 본 발명의 돼지연골분말지지체의 20배 사진이고, 도 11의 (d)는 본 발명의 돼지연골분말지지체의 100배 사진이다.

도 12는 생체 외 배양 2주일 후 대조군인 교원질 지지체와 본 발명의 돼지연골분말 지지체의 성장 모습을 나타내는 사진이다. 도 12의 (a)는 교원질 지지체의 정면 사진이고, 도 12의 (b)는 교원질 지지체의 옆면 사진이며, 도 12의 (c)는 본 발명의 돼지연골분말지지체의 정면 사진이고, 도 12의 (d)는 본 발명의 돼지연골분말지지체의 옆면 사진이다.

도 13은 생체 외 배양 2주일 후 대조군인 교원질 지지체와 본 발명의 돼지연골분말지지체의 사프라닌-O(Safranin-O) 염색 사진이다. 도 13의 (a)는 교원질 지지체의 20배 사진이고, 도 13의 (b)는 교원질 지지체의 100배 사진이며, 도 13의 (c)는 본 발명의 돼지연골분말지지체의 20배 사진이고, 도 13의 (d)는 본 발명의 돼지연골분말지지체의 100배 사진이다.

Claims

동물 유래 조직을 분말화하는 단계와,

상기 동물 유래 조직의 분말화 이전 또는 이후에, 또는 분말화와 동시에 탈세포하는 단계와,

상기 탈세포된 동물 유래 조직의 분말을 입자추출법을 이용하여 다공성 3차원 지지체로 형성하는 단계를 포함하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 입자추출법은 유기용매나 기타 용매를 이용하여 재료를 용해시키지 않고, 상기 탈세포된 동물 유래 조직의 분말과 공극 유도 물질을 혼합하고, 상기 탈세포된 동물 유래 조직의 분말을 결합시키기 위해 가교제를 사용한 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제2항에 있어서,

상기 입자추출법은 공극 유도 물질(porogen)로서 염화나트륨과 같은 염 입자, 유기당 입자, 덱스트란 입자, 설탕 입자, 얼음 입자 및 파라핀 입자로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 입자를 사용하는 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 다공성 3차원 지지체로 형성하는 단계에서, 탈세포된 동물 유래 조직의 분말과, 입자추출법에 사용되는 공극 유도 물질(porogen)의 입자를 섞어 몰드에 넣은 후 가압성형하여 사용목적 및 치료부위에 따라 여러가지 형태 및 크기를 갖는 다공성 3차원 지지체를 제작하는 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

자외선(UV), EDC, NHS, 탈수열건조법(dehydrothermal method) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한 가지 방법으로 다공성 3차원 지지체를 가교하는 단계를 더 포함하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 동물 유래 조직의 분말에 하나 이상의 성장인자를 넣어 동결건조하는 단계를 더 포함하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 입자추출법을 이용하여 형성된 다공성 3차원 지지체에 연골세포를 접종 한 다음, 재배양하여 조직공학적 연골조직을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 동물 유래 조직은 돼지, 소, 양, 말, 개 또는 고양이에서 유래한 연골인 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제8항에 있어서,

상기 동물 유래 조직의 분말은 돼지 연골 분말인 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 동물 유래 조직을 분말화하는 단계는 동물 유래의 연골조직으로부터 연골을 분리한 다음 분쇄기를 이용하여 분쇄하는 단계와, 분쇄한 연골을 동결분쇄기를 통하여 분쇄하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 동물 유래 조직은 돼지, 소, 양, 말, 개 또는 고양이에서 유래한 양막, 피부, 소장점막하 조직, 근막, 또는 척수막인 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 탈세포하는 단계는 물리적 탈세포 방법, 화학적 탈세포 방법 또는 물리적 및 화학적 방법을 조합한 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제12항에 있어서,

상기 물리적 탈세포 방법은 동결-해동법, 초음파 처리 또는 물리적 교반을 포함하고, 상기 화학적 탈세포 방법은 상기 동물 유래 조직의 분말을 저장액, 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, DNase, RNase 또는 트립신으로 처리하는 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 탈세포하는 단계는 0~50 ℃의 온도범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제13항에 있어서,

상기 화학적 탈세포 방법에 있어서, 상기 저장액은 트리스 HCl(Tris HCl)(pH 8.0) 용액이고, 상기 음이온성 계면활성제는 소디움도데실설페이트(SDS), 소디움데옥시초레이트(sodium deoxycholate), 또는 트리톤 X-200(Triton X-200)이며, 상기 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100)이고, 상기 양이온성 계면활성제는 CHAPS, 술포베타인-10(Sulfobetaine-10, SB-10), 술포베타인-16(SB-16), 또는 트리-n-부틸포스페이트(Tri-n-butyl phosphate)인 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 제조방법에 따라 제조된 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체.
제16항에 있어서,

연골 재생용 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체.
제16항에 있어서,

관절연골조직의 제작, 디스크 조직의 제작, 또는 뼈조직의 제작에 사용되는 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체.
제16항에 있어서,

하나 이상의 성장인자를 추가로 포함하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3 차원 지지체.
제16항에 있어서,

연골세포가 접종된 후, 연골세포를 재배양하여 조직공학적 연골조직이 추가로 형성된 것을 특징으로 하는 동물조직 분말을 이용한 다공성 3차원 지지체.