JP2012505013A - 動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法およびこれを利用して製造された多孔性３次元支持体 - Google Patents

Abstract

本発明の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法は、動物由来組織を粉末化する段階と、前記動物由来組織の粉末化の以前または以後に、または粉末化と同時に脱細胞化する段階と、前記脱細胞化した動物由来組織の粉末を粒子抽出法を利用して多孔性３次元支持体に形成する段階と、を含む。
【選択図】図３

Description

本発明は、動物組織の粉末を利用した３次元形態の多孔性支持体製造方法およびこれを利用して製造された３次元形態の多孔性支持体に関するものであって、さらに詳しくは、動物組織の粉末を粒子抽出法で３次元形態の多孔性支持体に製造し、治療ないし使用の目的に適した多様な大きさ、多孔性、形態および構造を有する３次元形態の多孔性支持体を製造する方法およびこれを利用して製造された３次元形態の多孔性支持体に関する。

関節軟骨細胞は、軟骨のみで発見される特化された間葉系由来細胞である。軟骨は、軟骨細胞によって生成された細胞外マトリックスで構成された無血管組織であって、一旦損傷を受けると炎症反応が生じず、自家治癒が起きない。したがって、一旦損傷を受けると自家治癒が極めて制約的になり、究極的には骨関節炎を引き起こし、患者のクオリティ・オブ・ライフに大いに影響を及ぼす。

現在、損傷された軟骨治癒方法には掻爬術および微小骨折術などの骨髄刺激法と、骨、軟骨組織を移植するモザイクプラスティと、自家軟骨細胞を培養して移植する自家軟骨細胞移植術などがある。

骨髄刺激法は、関節鏡を利用して最小限の侵襲により短時間で施術することができるため、簡単な施術法かつ短い施術時間という長所により多く行われているものの、軟骨治癒の核心といえる血液と幹細胞で形成された血餠（ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔ、幹細胞含む）を維持させることが難しく、物理的にも不安定で、正常軟骨への再生が難しい。すなわち、施術過程中、骨髄から由来した血餠を維持することができず、再生された軟骨が正常軟骨となるよりは繊維性軟骨となるため、成功的な治癒を期待することが難しい。

モザイクプラスティは、荷重と磨耗の少ない部位の軟骨組織を採取し、損傷部位に補ってあげる方法であって、優れた治癒効果があるものの、２次損傷をもたらすという問題点がある。

最近は、自家細胞を培養して移植する自家軟骨細胞移植術（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＡＣＩ）が軟骨治療に利用されている。現在、自家軟骨細胞移植術は、臨床承認を受けた細胞移植法（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３１：８８９， １９９４）である。しかしながら、自家軟骨細胞移植術では骨膜を採取し、軟骨欠損部位を緻密に縫合して覆わなければならず、また、骨膜が軟骨を過剰に増殖させてしまい、手術後、患部に疼痛を招く恐れがある。合わせて、２段階にわたる手術過程を経なければならないという面倒さがある。初めは、関節鏡施術の下、自家軟骨を採取し、体外で軟骨細胞を分離および長期間培養した後、再び細胞懸濁液を欠損部位に移植する。したがって、自家軟骨細胞移植術は、軟骨を採取して手術しなければならないという短所と、長期間培養しなければならないという問題点がある。

これに本発明者は、動物の組織、特に動物の軟骨を採取した後、“軟骨の粉末化”と“粒子抽出法の使用”により３次元支持体を形態として作製して移植すれば、窮極の目的である硝子軟骨組織の再生効果を増進させることができるばかりでなく、物性、多孔性、形態、構造および大きさに制約のない３次元形態の支持体を提供することができるものと判断した。

最近には、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）組織や臓器を採取した後、細胞を除去（ａｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）し、色々な形態の支持体や膜として使用する技術が注目を集めている。

現在まで小腸の粘膜下組織（ＳＩＳ）、膀胱（ＵＢＭ）、皮膚（ｓｋｉｎ）、および羊膜（ＨＡＭ）などの商品化または研究が進められている。例えば、ドナーから皮膚の提供を受け、脱細胞化して開発されたＡｌｌｏｄｅｒｍおよび小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）を脱細胞化して創傷ドレッシング剤として開発されたＯＡＳＩＳ、そしてブタの膀胱組織を脱細胞化して開発されたＵＢＭなどがある。また、軟骨再生のために開発されたものとして、第１型、第３型コラーゲンで作製されたＣｈｏｎｄｒｏ−ｇｉｄｅ（商標名である）（ｂｉｌａｙｅｒ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を利用した軟骨再生研究が活発に行われている。

参考までに、軟骨組織の生化学的構成は、組織液、巨大分子およびその他の基質に分けることができる。組織液は６５〜８０％の水分と蛋白質、無機塩類、ガスおよび各種の代謝物質からなり、陰電荷を帯びた蛋白糖との均衡をなすために全体として陽電荷の濃度が高い。

巨大分子は、約６０％程がコラーゲンであり、細胞外マトリックス内の蛋白糖と結合して網構造を形成することによって軟骨の形態を維持するようにして張力または弾性力が提供されている。軟骨の大部分（９０〜９５％）は、第２型コラーゲンから成されており、全て３本のα型鎖が螺旋構造をなし、これらが集まって繊維状をなす。蛋白糖は中心となる蛋白質（ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）にコンドロイチン４−硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ４−ｓｕｌｆａｔｅ）、コンドロイチン ６−硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ６−ｓｕｌｆａｔｅ）、ケラタン硫酸（ｋｅｒａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）などのグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）（ＧＡＧ）が結合してなされた複合体であるが、これらはほとんどが（８０〜９０％）軟骨でお互い固まってアグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）と呼ばれる大きい分子をなす。

その他の基質としては、非−コラーゲン蛋白質（ｎｏｎｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）と糖蛋白質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）などが軟骨の乾燥重量１０〜１５％を占めており、主にマトリックスの巨大分子の構造を安定化させ、有機組織を形成することを手助けする。

ところが、異種および同種組織の移植時、細胞抗原は宿主によって認識されるため、組織の炎症反応や免疫拒否反応を引き起こす。しかしながら、細胞外マトリックスの構成物は一般に同種レシピエントに構成物に対する耐性がある。したがって、心血管、血管、皮膚、神経、骨筋、腱、膀胱、肝などを含む組織の多様な細胞外マトリックスは、組織工学と再生医学の応用に多いに研究されている。脱細胞化の目的は、效率的に細胞、核などを除去して構成物に対する拒否反応を減らし、細胞外マトリックスの機械的強度を高めるものである。

参考までに、一般に使われる最適化した脱細胞方法は、物理的方法と化学的方法を含む。物理的方法としては撹はんや超音波処理、機械的圧力、凍結や解凍の手順を含む。該方法は細胞膜を分裂させ、細胞構成物を露出させる。その後、洗浄工程を行い、細胞外マトリックスから細胞を除去する。しかし、該物理的方法は、一般に完壁な脱細胞には不充分である。したがって、物理的方法は化学的方法と結びつけて施行されなければならない。トリプシンのような酵素的処理やイオン溶液のような化学的処理は、細胞膜を分裂させ、細胞内部と細胞外部との連結を解体させる。脱細胞化工程の間、細胞外マトリックスは基本骨格を維持しながら適合に分裂されるが、脱細胞化工程は、組織から細胞物質を除去して処理液（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）にあらゆる細胞を適合に露出させるようにする。大抵、脱細胞化工程の目的は、分裂を最小化して元来の機械的特性や生物学的特性を維持するものである。

これと関連し、天然組織の細胞外マトリックスを利用して多孔性支持体を製造する従来技術が開示されている。例えば、米国公開特許第２００７／０２４８６３８Ａ１号においては、軟骨細胞のような天然の組織細胞に酸化剤と洗剤を同時に処理して脱細胞化し、これを凍結乾燥を通し多孔性の支持体に形成することが開示されており、米国公開特許第２００８／０１２４３７４Ａ１号においては、脊椎動物の骨髄細胞において細胞外マトリックスから脱細胞化する方法およびこれを利用した治療用器具が開示されている
これら先行技術は、天然の軟骨細胞組織や骨髄細胞組織から脱細胞化した異種の細胞外マトリックスが多孔性３次元支持体形態を有することを利用する技術であった。これらは組織の脱細胞化を通し、多孔性３次元支持体を作製し、免疫拒否反応を抑えることはできるものの、自然組織をそのまま利用しているため、支持体の大きさ、多孔性、形態、構造に制限があって、商業的にもそして治療目的への適用にも制限があるという問題点があった。

すなわち、手術患者の損傷部位、損傷面積、患者それぞれの特性に応じて治療に適用される多孔性３次元支持体の大きさ、形態や構造を多様化させる必要があるが、天然軟骨組織を単純に脱細胞化する方式は、このような治療の多様化を期することができないという限界を持っていた。

一方、米国特許第７，２０１，９１７号は、細胞外マトリックスを液状にしてスラリーにした後、凍結乾燥を通し、多孔性の支持体に製造する方法を提供しているが、該方法は自然組織の細胞外マトリックスを液状スラリー化することを特徴としている。また、米国特許第４，６５６，１３７号は、動物の軟骨粉末製造に関するものであって、動物から軟骨を収得し、酵素剤処理を通し、軟骨に付着した各種の蛋白質および脂肪組織を除去し、１次に４〜８ｍｍ大きさに粉砕した後、凍結乾燥を通し、水分除去および２次粉砕を通し４０〜７０μｍｍの大きさに粉末化する技術が開示されている。

しかしながら、これらの技術は、自然組織から脱細胞化して既存の組織の細胞外マトリックスをそのまま利用する方式であって、支持体の大きさ、多孔性、形態、構造に制限があり、商業的にかつ治療目的への適用において制限があるという問題点があり、また、軟骨の粉末化に関する米国特許第４，６５６，１３７号は、多様な大きさ、形態、構造を有する軟骨粉末の３次元的支持体製造について開示されているのでなく、傷などの治療目的に軟骨を粉末化する技術に関するものである。

したがって、本発明が属する技術分野においては、硝子軟骨組織の再生効果を増進させることができるばかりでなく、物性、多孔性、形態、構造および大きさに制約のない３次元形態の支持体を提供する技術が要求されていると言える。

これに本発明者は、動物の組織、例えば軟骨を採取した後、“粉末化”と“粒子抽出法の使用”により多孔性３次元支持体を作製し、物性、多孔性、形態、構造および大きさに制約のない多孔性３次元支持体を開発した。

一方、組織工学において、粒子抽出法はＰＬＡ、ＰＧＡおよびＰＬＧＡなどの合成高分子を３次元支持体に作製するのに用いられている。粒子抽出法においては、ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）として所望する孔隙の大きさの物質（塩、有機糖、パラフィン、氷粒子等）を一定量の高分子溶液に添加して混合し、一定の形態に加工した後、鋳造または凍結乾燥で有機溶媒を完全に除去し、ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）を水や適当な溶媒または乾燥などで溶解する、または除去すれば所望の大きさの孔隙を有する３次元支持体を完成することができる。本発明者は、このような基本的な粒子抽出法の原理を利用するものの、有機溶媒やその他の溶媒を利用して材料を溶解することなく、動物由来組織の粉末とポロゲンとを混合し、粉末を結合させるために架橋剤（ＥＤＣ）を用いた。

また、動物の組織、例えば軟骨の粉末化の過程の以前または以後に、または粉末化と同時に脱細胞化工程が追加で作製された軟骨粉末の多孔性３次元支持体は、移植時、炎症反応が起こらず、臨床に適用可能な生体適合性に優れていることが判明された。

米国公開特許公報ＵＳ２００７／０２４８６３８Ａ１号 米国公開特許公報ＵＳ２００８／０１２４３７４Ａ１号 米国特許公報ＵＳ７，２０１，９１７号 米国特許公報ＵＳ４，６５６，１３７号

本発明は、動物の組織、例えば、軟骨粉末を粒子抽出法で３次元形態の多孔性支持体に製造し、治療目的ないしは使用目的に適合する多様な大きさ、多孔性、形態および構造を有する３次元形態の多孔性支持体の製造方法およびこれを利用して製造された３次元形態の多孔性支持体を提供することにその目的がある。

さらに具体として、本発明は、動物の組織、例えば軟骨を採取した後、“粉末化”と“粒子抽出法の使用”により３次元支持体を作製し、硝子軟骨組織の再生効果を増進させることができるばかりでなく、物性、多孔性、形態、構造および大きさに制約のない３次元形態の多孔性支持体の製造方法およびこれを利用して製造された３次元形態の多孔性支持体を提供することにその目的がある。

また、本発明は、動物の組織、例えば、軟骨を採取した後、粉末化の過程を遂行する以前または粉末化の過程を遂行した以後に、または粉末化と同時に物理的方法および／または化学的方法を利用した脱細胞化工程を追加し、移植時に炎症反応が起こらず、臨床に適用可能な生体適合性に優れた３次元形態の多孔性支持体の製造方法およびこれを利用して製造された３次元形態の多孔性支持体を提供することにその目的がある。

さらに、本発明は、軟骨細胞や骨細胞、幹細胞などの細胞が接種された３次元支持体を含む細胞治療剤を提供することにその目的がある。

前記目的を達成するため、本発明の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法は、動物由来組織を粉末化する段階と、前記動物由来組織の粉末化の以前または以後に、または粉末化と同時に脱細胞化する段階と、前記脱細胞化した動物由来組織の粉末を粒子抽出法を利用して多孔性３次元支持体に形成する段階と、を含む。

本発明の方法の一実施例において、前記粒子抽出法は、有機溶媒やその他の溶媒を利用して材料を溶解させることなく、前記脱細胞化した動物由来組織の粉末とポロゲンとを混合し、前記脱細胞化した動物由来組織の粉末を結合させるために架橋剤を用いたことを特徴とする。

本発明の方法の一実施例において、前記粒子抽出法は、ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）として、例えば塩化ナトリウムのような塩粒子、有機糖粒子、デキストラン粒子、砂糖粒子、氷粒子およびパラフィン粒子で構成された群から選択された少なくともいずれかの粒子を使用することができる。

本発明の方法の一実施例において、前記多孔性３次元支持体に形成する段階において、脱細胞化した動物由来組織の粉末と、粒子抽出法に使われるポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）の粒子を混ぜてモールドに入れた後、加圧成形し、使用目的および治療部位によって多様な形態および大きさを有する多孔性３次元支持体を作製することを特徴とする。

本発明の方法の一実施例において、紫外線（ＵＶ）、ＥＤＣ、ＮＨＳ、脱水熱乾燥法（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｔｈｏｄ）およびグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）で構成された群から選択された少なくともいずれかの方法により多孔性３次元支持体を架橋する段階と、をさらに含むことができる。

本発明の方法の好ましい一実施例において、前記動物由来組織の粉末に１つ以上の成長因子を入れて凍結乾燥する段階をさらに含むことができる。

本発明の方法のより好ましい一実施例において、前記粒子抽出法を利用して形成された多孔性３次元支持体に軟骨細胞を接種した後、再培養して組織工学的軟骨組織を収得する段階と、をさらに含むことができる。

本発明の方法の好ましい一実施例において、前記動物由来組織としては、ブタ、牛、羊、馬、犬または猫などの脊髄動物から由来した軟骨があり得る。より好ましいものとしては前記動物由来組織の粉末としては、ブタ軟骨粉末である。

本発明の方法の好ましい一実施例において、前記動物由来組織を粉末化する段階は、動物由来の軟骨組織から軟骨を分離した後、粉砕機を利用して粉砕する段階と、粉砕した軟骨を凍結粉砕機を通して粉砕する段階と、を含む。

本発明の方法のもう１つの一実施例において、前記動物由来組織は、ブタ、牛、羊、馬、犬または猫などの脊髄動物から由来した羊膜、皮膚、小腸の粘膜下組織、筋膜、または脊髓膜があり得る。

本発明の方法の好ましい一実施例において、前記脱細胞化する段階は、物理的脱細胞方法、化学的脱細胞方法または物理的および化学的方法を組み合わせた方法により行われることを特徴とする。

前記物理的脱細胞方法は、凍結−解凍法、超音波処理、または物理的撹はんを含む。前記化学的脱細胞方法は、前記動物由来組織の粉末を低張液、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅまたはトリプシンで処理することを特徴とする。また、前記脱細胞化する段階は、約０〜５０℃の温度範囲で行うのが好ましい。

前記化学的脱細胞方法において、前記低張液はトリス−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ）（ｐＨ８．０）溶液であり、前記陰イオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、またはトリトンＸ−２００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−２００）であり、前記非イオン性界面活性剤はトリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）であり、前記陽イオン性界面活性剤はＣＨＡＰＳ、スルホベタイン−１０（Ｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１０， ＳＢ−１０）、スルホベタイン−１６（ＳＢ−１６）、またはトリ−ｎ−ブチルホスフェート（Ｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とすることができる。

本発明の多孔性３次元支持体の製造方法により製造された多孔性３次元支持体は、軟骨再生用とすることを特徴とする。また、本発明の多孔性３次元支持体は、関節軟骨組織の作製ばかりでなく、ディスク、骨組織の作製にも使われることができる。

本発明の好ましい多孔性３次元支持体は、一以上の成長因子をさらに含むことができる。

本発明の最も好ましい多孔性３次元支持体は、軟骨細胞が接種された後、軟骨細胞を再培養して組織工学的軟骨組織がさらに形成されたものであるとすることができる。

本発明による動物の組織、例えば軟骨の粉末を利用した多孔性３次元支持体は、多様な大きさ、多孔性、形態および構造を有することによって、治療目的ないしは使用目的に適合に臨床に適用されることができる長所がある。すなわち、本発明によれば硝子軟骨組織の再生効果を増進させることができるばかりでなく、物性、多孔性、形態、構造および大きさに制約のない３次元形態の多孔性支持体を提供することができる。

また、本発明の動物の組織、例えば軟骨の粉末を利用した多孔性３次元支持体は、動物の組織、例えば軟骨を採取した後、粉末化過程を遂行する以前または遂行した以後に、または粉末化と同時に物理的方法および／または化学的方法を利用した脱細胞化工程を追加して作製することによって、移植時、免疫拒否反応や炎症反応がなく、臨床に適用可能な生体適合性に優れ、軟骨再生においてもコラーゲンおよびその他の合成高分子の支持体より軟骨再生効果に優れている。

また、本発明の動物の組織、例えば軟骨の粉末を利用した多孔性３次元支持体は、３次元に製造され細胞の移動、成長、および分化に適合した環境を提供し、軟骨再生に適合した構成成分と成長因子などを含んでおり、優秀な生体適合性および生分解性、そして３次元構造により軟骨欠損において組織工学的支持体に有用に使用されることができる。

図１の（ａ）は、ブタ軟骨を分離したブタ軟骨欠片の写真であり、図１の（ｂ）は、ブタ軟骨を凍結粉砕後、脱細胞した粉末の写真であり、図１の（ｃ）は、脱細胞化したブタ軟骨粉末のＳＥＭ写真である。 ブタ軟骨（Ｎａｔｉｖｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ；脱細胞前ＰＣ）、脱細胞したブタ軟骨欠片（Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ、ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒ ＰＣ）、そして脱細胞した軟骨粉末（Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｐｏｗｄｅｒ、ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒ ＰＣＰ）のＤＮＡ残存量を定量した結果をグラフで示す図面である。 本発明による軟骨粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造工程を説明する模式図である。 本発明の一実施例に従って製造した軟骨粉末を利用した多孔性３次元支持体の写真である。 本発明の一実施例に従って製造した軟骨粉末を利用した多孔性３次元支持体のＳＥＭ写真である。図５の（ａ）は、表面の２０倍写真であり、図５の（ｂ）は、表面の５０倍写真であり、図５の（ｃ）は、横面の２０倍写真であり、図５の（ｄ）は、横面の５０倍写真である。 本発明の一実施例に従って製造した軟骨粉末を利用した多孔性３次元支持体の多孔分布図である。 本発明の一実施例に従って製造した軟骨粉末を利用した多孔性３次元支持体の親水性の実験結果の写真である。 生体外条件において細胞を培養して有効性を評価する前のコラーゲン支持体と、本発明のブタ軟骨粉末支持体の写真である。図８の（ａ）は、コラーゲン支持体の正面写真であり、図８の（ｂ）は、コラーゲン支持体の横面写真であり、図８の（ｃ）は、本発明のブタ軟骨粉末支持体の正面写真であり、図８の（ｄ）は、本発明のブタ軟骨粉末支持体の横面写真である。 対照群であるコラーゲン支持体と本発明のブタ軟骨粉末支持体に細胞を接種した後、細胞接種率を分析した結果を表す図表である。 生体外培養の一週間後、対照群であるコラーゲン支持体と本発明のブタ軟骨粉末支持体の成長様子を表す写真である。図１０の（ａ）は、コラーゲン支持体の正面写真であり、図１０の（ｂ）は、コラーゲン支持体の横面写真であり、図１０の（ｃ）は、本発明のブタ軟骨粉末支持体の正面写真であり、図１０の（ｄ）は、本発明のブタ軟骨粉末支持体の横面写真である。 生体外培養の一週間後、対照群であるコラーゲン支持体と本発明のブタ軟骨粉末支持体のサフラニン−Ｏ（Ｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏ）染色写真である。図１１の（ａ）は、コラーゲン支持体の２０倍写真であり、図１１の（ｂ）は、コラーゲン支持体の１００倍写真であり、図１１の（ｃ）は、本発明のブタ軟骨粉末支持体の２０倍写真であり、図１１の（ｄ）は、本発明のブタ軟骨粉末支持体の１００倍写真である。 生体外培養の二週間後、対照群であるコラーゲン支持体と本発明のブタ軟骨粉末支持体の成長様子を表す写真である。図１２の（ａ）は、コラーゲン支持体の正面写真であり、図１２の（ｂ）はコラーゲン支持体の横面写真であり、図１２の（ｃ）は、本発明のブタ軟骨粉末支持体の正面写真であり、図１２の（ｄ）は、本発明のブタ軟骨粉末支持体の横面写真である。 生体外培養の二週間後、対照群であるコラーゲン支持体と本発明のブタ軟骨粉末支持体のサフラニン−Ｏ（Ｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏ）染色写真である。図１３の（ａ）は、コラーゲン支持体の２０倍写真であり、図１３の（ｂ）は、コラーゲン支持体の１００倍写真であり、図１３の（ｃ）は、本発明のブタ軟骨粉末支持体の２０倍写真であり、図１３の（ｄ）は、本発明のブタ軟骨粉末支持体の１００倍写真である。

以下では、本発明を限定しない実施例に沿って本発明を詳細に説明する。本発明の下記の実施例は、本発明を具体化するためだけのものであって、本発明の権利範囲を制限したり限定するものでないことはもちろんである。したがって、本発明の詳細な説明および実施例から本発明が属す技術分野の専門家が容易に類推することができるものは、本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明に引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。

＜参照例１＞ブタ軟骨の分離
ブタ軟骨の分離はＥＮ １２４４２の“Ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ， ｐａｒｔ１；Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｉｓｋ、ｐａｒｔ２；ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｏｎ ｓｏｕｒｃｉｎｇ、ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｈａｎｄｌｉｎｇ”を参考として、基準に符合する施設のブタ軟骨を購入して使用した。

ブタ軟骨から軟骨を切り出し、軟骨欠片（約２０×３０ｍｍ）を作り、ここに生理食塩水を利用して１０分間３回洗浄した。洗浄した軟骨欠片を１％坑菌−抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）が含まれたＰＢＳに漬けた後、−８０℃において超低温冷蔵庫で最終の保管をした（図１の（ａ）参照）。

＜実施例１＞ブタ軟骨の粉砕
洗浄した軟骨欠片は、当業界に広く知られ、商業的に入手可能な粉砕機（フードミキサーＨＭＦ−５０５、韓日（Ｈａｎｉｌ）、Ｋｏｒｅａ）を使用し、約２×２ｍｍサイズに粉砕した。粉砕した軟骨欠片は凍結乾燥をし、最終的に乾燥した軟骨欠片を凍結粉砕機（ＪＡＩ、ＪＦＣ−３００、Ｊａｐａｎ）を使用して約１０μｍサイズ程度に凍結粉砕した。

１−１．ブタ軟骨粉末の形態の分析
走査電子顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して凍結粉砕したブタ軟骨粉末の形態を分析した。２．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）で実施例１にて粉砕したブタ軟骨粉末を１時間程度の間固定させた後、リン酸塩緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄した。試料をエタノールで脱水させた後、乾燥し、電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、ＪＳＭ−６３８０、Ｊａｐａｎ；２０ＫＶ）でパウダーの大きさおよび形態を観察した。大きさは約１０μｍ程度に観察された（図１の（ｃ））。

＜実施例２＞ブタ軟骨粉末の脱細胞および特性の分析
２−１．ブタ軟骨粉末の脱細胞化
ブタ軟骨粉末に存在する軟骨細胞および遺伝子成分を除去し、純粋な細胞外マトリックスを得るため、次の通り、脱細胞化過程を行った。

実施例１にて製造したブタ軟骨粉末を１０ｇ当たり０．１％のＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、Ｂｉｏ−ｒａｄ， ＵＳＡ）１ｌの溶液に入れ、１００ｒｐｍで２４時間の間撹はんした。ＳＤＳ処理後３次蒸溜水で１００ｒｐｍで３０分間５回洗浄した。

洗浄水の交換において、軟骨粉末を沈殿させるため、超高速遠心分離機（ＵＳ−２１ＳＭＴ， Ｖｉｓｉｏｎ， Ｋｏｒｅａ）を使用し、１０，０００ｒｐｍで１時間の間軟骨粉末を沈殿させた。

次に、２００Ｕ／ｍｌの濃度のＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）２００ｍｌを入れ、３７℃において１００ｒｐｍで２４時間撹はんさせた。３次蒸溜水の洗浄水で１００ｒｐｍで３０分間５回洗浄した。洗浄水の交換は前述したようなＳＤＳ洗浄における遠心分離条件で進めた。脱細胞化した軟骨粉末は図１の（ｂ）に示された通りである。

一方、本発明の実施例においては、軟骨粉末の製造後、脱細胞過程を行ったが、軟骨の粉末化前に脱細胞を行い、粉末化することもやはり本発明の方法が排除されるものでないことを本発明が属する技術分野の当業者ならば容易に理解するはずである。

２−２．脱細胞化したブタ軟骨粉末のＤＮＡ含有量の分析
脱細胞以前の軟骨組織（以下、“ＰＣ”とする）と、脱細胞化工程を経た軟骨欠片（ＰＣ）および脱細胞化工程を経た軟骨粉末（以下、“ＰＣＰ”とする）を試験片とし、Ｑｕｂｉｃ ＤＮＡ定量機器（Ｑｕｂｉｃ， ＢＩＯＲＡＤ， ＵＳＡ）でＤＮＡを定量的に分析した。その分析の結果を下記の表１および図２のグラフで表した。参考までに、脱細胞化過程は実施例２−１と同じ方法で行った。

表１：ＤＮＡ残存量を数値化した結果

＜実施例３＞脱細胞化したブタ軟骨粉末を利用した３次元支持体の製造および特性の分析
３−１．多孔性３次元支持体の製造
実施例２−１に記述した方法にて、脱細胞した軟骨粉末を１：９の割合で塩化ナトリウム（ＮａＣｌ， 結晶の大きさ２５０〜３５０μｍ）とまんべんなく混ぜる。ここに３次蒸溜水に溶解させた１００Ｍｍ ＥＤＣ（Ｎ−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）溶液を１０％の割合で混ぜる。

ＥＤＣ溶液を軟骨粉末および塩化ナトリウム混合物にまんべんなく混ぜた後、自作製した超硬合金モールドに混合物試料を入れ、１０００ｐｓｉ圧力で加圧し、ディスク形態の成形物を製造する。モールドは一般的なモールドのように固定部材と可動部材で構成され、固定部材および／または可動部材の内部に所望する３次元支持体の形状を形成する。本実施例においては、ディスク形態の３次元支持体を製造したが、使用目的および治療部位によっていろいろな形態および大きさを有する３次元支持体の作製が可能である。

本実施例においては、多孔性３次元支持体の形成におけるポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）として塩化ナトリウム粒子を用いたが、他の物質、例えば、砂糖粒子や氷粒子も本発明の方法に適用可能であることを本発明が属する技術分野の当業者ならば容易に理解できるはずである。

次に、ディスク形態の成形物を常温で乾燥させた後、１００ｍＭ ＥＤＣ（９９．９％のエタノールに溶解させた溶液）で４時間の間架橋させ、１００ｍＭのＮＨＳ（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ， Ｆｌｕｋａ， Ｊａｐａｎ）を入れ、再び４時間反応させる。架橋反応は、軟骨粉末の多孔性３次元支持体の物性を良くし、分解期間を延長させるために行う。

架橋反応が終われば、塩を溶出させるために３次蒸溜水に入れ、少なくとも５回以上入れ換え、塩を完全に除去する。架橋結合後、未反応基を除去するため、ＮＨ２ＰＯ４で３回洗浄する。最後に３次蒸溜水で３回洗浄した後、凍結乾燥する。

図３には軟骨粉末の多孔性３次元支持体の製造工程が示されており、図４にはこのような製造工程に従って作製された最終製品が示されている。

３−２．ブタ軟骨粉末支持体の多孔構造分析
走査電子顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用し、ブタ軟骨粉末支持体の多孔構造を分析した。２．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）で実施例３−１にて作製したブタ軟骨粉末支持体を１時間程度の間固定させた後、リン酸塩緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄した。試料をエタノールで脱水させた後、乾燥して電子顕微鏡（ＪＥＯＬ， ＪＳＭ−６３８０，日本；２０ＫＶ）で支持体の多孔の大きさおよび形態を観察した。

多孔の大きさは約２００μｍ内外であり、相互多孔連結性は優れていた。また、全体の多孔分布も均一であり、表面多孔も開いた形態になっていた（図５参照）。

３−３．ブタ軟骨粉末支持体の多孔度の分析
水銀ポロシメトリー（Ｍｅｒｃｕｒｙ ｐｏｒｏｓｉｍｅｔｅｒ）を使用し、ブタ軟骨粉末支持体の多孔度を分析した。分析試料の重さは０．０１９３ｇであり、分析圧力は５０μｍＨｇ、時間は５分、水銀充填圧力は０．４４ｐｓｉａであった。測定した結果、ブタ軟骨粉末支持体の多孔度は８２．３９％であった（図６参照）。

＜実施例４＞ブタ軟骨粉末支持体の親水性の評価
ブタ軟骨粉末支持体の親水性の特性を把握するため、染料を利用して水吸収度を肉眼で確認できた。ブタ軟骨粉末支持体上に２．５％のトリパンブルー細胞染色溶液を落としてから１０秒後、写真を撮って評価したところ、染料が支持体にすぐに吸収されることが確認された。したがって、ブタ軟骨粉末支持体は、親水性に優れていることを確認することができた（図７参照）。

＜実施例５＞ブタ軟骨粉末支持体の有効性の評価
５−１．ブタ軟骨粉末支持体を利用した軟骨細胞の培養
生後２週以内のニュージーランド産うさぎの軟骨から軟骨細胞を分離した。膝軟骨から軟骨組織だけを採取した後、これを１〜２ｍｍ程に細かく刻み、０．１％コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｔｙｐｅＩＩ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＵＳＡ）で３７℃の細胞培養器で１２時間処理することによって軟骨細胞の分離がなされる。０．１％のコラゲナーゼの１２時間処理後、細胞濾過器で軟骨細胞だけをろ過し、遠心分離（１７００ｒｐｍ， １０分）して軟骨細胞のみを分離した。

前述したような実施例１、実施例２および実施例３にて説明された方法で製造した軟骨粉末の多孔性３次元支持体（直径５ｍｍ、高さ２ｍｍ）に分離されたうさぎ軟骨細胞を５×１０６細胞の濃度に接種した。

一方、培地［ＤＭＥＭ＋１％の抗生−抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）＋ＩＴＳ｛１．０ｍｇ／ｍｌのインシュリン， ０．５５ｍｇ／ｍｌのヒト・トランスフェリン（ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、０．５ｍｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ）で構成）＋５０μｍ／ｍｌのアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）＋１．２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）＋１００ｎＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）＋４０μｍ／ｍｌのプロリン」は一週に３回入れ換えた。

５−２．ブタ軟骨粉末支持体の細胞接種率の評価
うさぎ軟骨細胞を５×１０６細胞で計数した後、ブタ軟骨粉末支持体に静的接種方法で接種した。細胞が支持体に付着するよう４時間の間、３７℃の細胞培養器で培養した上、培養液を入れた。この時、支持体に付着せずに、底に落ちた細胞を計数した。また、２４時間後、支持体を新しいプレートに移して底に落ちた細胞を計数した。

細胞接種率を評価した結果、４時間後、コラーゲン支持体（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｐｏｎｇｅ）の細胞接種率は９０．５％であり、ブタ軟骨粉末支持体の細胞接種率は８０％であった。２４時間後、細胞接種率はコラーゲン支持体が９０％に計算され、ブタ軟骨粉末支持体が７９％に計算された。

コラーゲン支持体がより高い細胞接種率を表したが、軟骨粉末支持体も８０％程の高い細胞接種率を表していることを確認することができた（図９参照）。

５−３．時間の経過にともなう軟骨組織形成能の比較
本発明の３次元支持体との比較のため、第１型アテロコラーゲン（ａｔｅｌｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ）（ＭＡＴＲＩＸＥＮＴＭ， バイオランド， Ｋｏｒｅａ）を１％の濃度で溶解させ、凍結乾燥法にてスポンジとして作製したものを対照群に使用した。

前述したような方法でうさぎ軟骨細胞を播種した対照群のコラーゲン支持体と本発明の軟骨粉末の３次元支持体を１週と２週の間培養した後、一定期間にサンプルを回収し、１０％のホルマリンで２４時間固定した。固定されたサンプルはパラフィン包埋後、切片を作ってサフラニン−Ｏ（ｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏ）染色とＨ＆Ｅ染色をし、軟骨組織形成能を比較した。

その結果、培養後１週になった時点で、対照群のコラーゲン支持体と本発明の軟骨粉末の３次元支持体のいずれからも白色の半透明な組織が形成された（図１０参照）。サフラニン−Ｏ（Ｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏ）染色の結果、対照群のコラーゲン支持体と本発明の軟骨粉末の３次元支持体のいずれから軟骨細胞が分布していることが確認されたが、本発明の軟骨粉末の３次元支持体がコラーゲン支持体より細胞の分布図が高く、本発明の３次元支持体壁に沿ってグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）の合成および軟骨化の進行も優れた（図１０参照）。

図１１に示すように、培養後２週になった時点でも２つのグループいずれも半透明な形態を表した。サフラニン−Ｏ染色の結果、２グループとも培養後１週になった時点より優れた軟骨再生効果を表したが、本発明の軟骨粉末の３次元支持体からほぼ全体として軟骨再生効果が現われた（図１２参照）。

したがって、本発明の多孔性３次元支持体は軟骨再生であって、物性、多孔性、形態、構造および大きさに制約がなく、３次元で製造され軟骨細胞の移動、成長、および分化に適合した環境を提供し、優れた生体適合性および生分解性そして３次元構造により軟骨欠損において組織工学的支持体に有用に使われることができることを確認することができた。

以上、本発明を前述した実施例により説明したが、本発明は開示された実施例に制限されるものではない。当業者であれば、本発明の趣旨により修正変更可能であり、このような修正変更もまた本発明の範囲に属するということを理解することができる。

Claims (20)

1. 動物由来組織を粉末化する段階と、
   前記動物由来組織の粉末化の以前または以後に、或いは粉末化と同時に脱細胞化する段階と、
   前記脱細胞化した動物由来組織の粉末を、粒子抽出法を利用して多孔性３次元支持体に形成する段階と、を含む動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
2. 前記粒子抽出法は、有機溶媒やその他の溶媒を利用して材料を溶解することなく、前記脱細胞化した動物由来組織の粉末とポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）とを混合し、前記脱細胞化した動物由来組織の粉末を結合させるために架橋剤を用いたことを特徴とする、請求項１に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
3. 前記粒子抽出法は、ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）として塩化ナトリウムのような塩粒子、有機糖粒子、デキストラン粒子、砂糖粒子、氷粒子およびパラフィン粒子で構成された群から選択された少なくとも１つの粒子を用いることを特徴とする、請求項２に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
4. 前記多孔性３次元支持体に形成する段階において、
   脱細胞化した動物由来組織の粉末と粒子抽出法に用いられるポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）の粒子とを混ぜてモールドに入れた後、加圧成形し、使用の目的および治療部位に応じていろいろな形態および大きさを有する多孔性３次元支持体を作製することを特徴とする、請求項１に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
5. 紫外線（ＵＶ）、ＥＤＣ、ＮＨＳ、脱水熱乾燥法（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｔｈｏｄ）およびグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）で構成された群から選択された少なくとも１つの方法により、多孔性３次元支持体を架橋する段階をさらに含む、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
6. 前記動物由来組織の粉末に一以上の成長因子を入れて凍結乾燥する段階を、さらに含む、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
7. 前記粒子抽出法を利用して形成された多孔性３次元支持体に軟骨細胞を接種した上、再培養し組織工学的軟骨組織を収得する段階を、さらに含む、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
8. 前記動物由来組織は、ブタ、牛、羊、馬、犬または猫から由来した軟骨であることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
   
9. 前記動物由来組織の粉末は、ブタ軟骨粉末であることを特徴とする、請求項８に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
10. 前記動物由来組織を粉末化する段階は、動物由来の軟骨組織から軟骨を分離した後、粉砕機を利用して粉砕する段階と、粉砕した軟骨を凍結粉砕機を通して粉砕する段階と、を含むことを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
11. 前記動物由来組織は、ブタ、牛、羊、馬、犬または猫から由来した羊膜、皮膚、小腸粘膜下組織、筋膜、または脊髓膜であることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
12. 前記脱細胞化する段階は、物理的脱細胞方法、化学的脱細胞方法または物理的および化学的方法を組み合わせた方法により行われることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
13. 前記物理的脱細胞方法は、凍結−解凍法、超音波処理または物理的撹はんを含み、前記化学的脱細胞方法は、前記動物由来組織の粉末を低張液、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅまたはトリプシンで処理することを特徴とする、請求項１２に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
14. 前記脱細胞化する段階は、０〜５０℃の温度範囲で行われることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
15. 前記化学的脱細胞方法において、前記低張液はトリス− ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ８．０）溶液であり、前記陰イオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、またはトリトンＸ−２００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−２００）であり、前記非イオン性界面活性剤は、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）であり、前記陽イオン性界面活性剤はＣＨＡＰＳ、スルホベタイン−１０（Ｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１０， ＳＢ−１０）、スルホベタイン−１６（ＳＢ−１６）、またはトリ−ｎ−ブチルホスフェート（Ｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であることを特徴とする、請求項１３に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法。
16. 請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の製造方法に従って製造された動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体。
17. 軟骨再生用であることを特徴とする、請求項１６に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体。
18. 関節軟骨組織の作製、ディスク組織の作製、または骨組織の作製に用いられることを特徴とする、請求項１６に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体。
19. １つ以上の成長因子をさらに含む、請求項１６に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体。
20. 軟骨細胞が接種された後、軟骨細胞を再培養し、組織工学的軟骨組織がさらに形成されたことを特徴とする、請求項１６に記載の動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体。

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