CN106166307A - 一种含活细胞的3d组织工程产品及其制备方法 - Google Patents

一种含活细胞的3d组织工程产品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种3D组织材料，以猪小肠粘膜脱细胞基质作为支架材料，其特征在于：含有细胞、核黄素或其衍生物。本发明所制得的3D组织材料所含化学成分与人细胞外基质成分高度接近，含有丰富的生长因子，具有良好的生物相容性，有利于细胞的生长。本发明制作工艺简单，仅需白炽灯作为生产设备，不需要复杂的设备，整个操作过程不含有对细胞有害的成分，也不造成环境污染。

Description

一种含活细胞的3D组织工程产品及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种含活细胞的3D组织工程产品的产品及制作方法。
背景技术
体外构建3D组织工程产品在医学生物学基础研究，体外药物筛选评价及组织再生方面具有广阔的应用前景。包括3D打印等多种技术是构建3D组织工程产品的重要工艺。
构建含活细胞的3D组织工程产品要求支架材料的生物相容性好，能支持细胞生长，同时需要一种简便易行的加工工艺，能够实现支架材料从液态向固态的相变，将细胞固定在支架材料中并形成具有一定3D结构的产品。
常用的支架材料包括合成材料和天然来源的细胞外基质材料，细胞外基质材料以胶原蛋白为代表，但其在形成3D组织工程产品时常需要对胶原分子进行改性加入特殊基团，同时添加化学交联剂帮助实现胶原溶液的相变。这一过程工艺复杂，改性和交联过程残存的化学试剂对细胞不利。
发明内容
为解决以上问题，本发明开发了一种简便有效的含活细胞的3D组织工程产品及其制作方法。
一种3D组织材料，以猪小肠粘膜脱细胞基质(small intestinal submucosa，SIS)作为支架材料，含有细胞、核黄素或其衍生物。
本发明以具有猪小肠粘膜基质为原材料，以核黄素或其衍生物为交联剂，通过可见光交联诱发，增强分散度很高的基团间键能，有效的将溶液相变为固体凝胶，并保持良好组织相容性和生物活性。
本发明可在创面原位成胶无任何创伤，原位形成具活性的细胞的凝胶进行组织再生修复；同时能保留SIS中的多种细胞因子，并具有生物活性，有利于组织重塑和伤口修复。
上述3D组织材料，核黄素：猪小肠粘膜脱细胞基质质量百分比优选为1-4∶10-40。
上述3D组织材料的制备方法，将细胞和核黄素加入猪小肠粘膜脱细胞基质，白炽灯照射3-5min。
上述3D组织材料的制备方法，包括猪小肠粘膜脱细胞基质的制备、加入核黄素和细胞、光照射、体外培养。
上述3D组织材料的制备方法，包括以下步骤：
1、SIS原料的准备
(1)取新鲜猪小肠，通过机械方法将小肠的浆膜层和肌层去除，生理盐水反复冲洗干净；
(2)用甲醇和氯仿(1∶1，V/V)脱脂溶液浸泡搅拌12～24h(优选为12h，重复2遍)，并用去离子水漂洗3～5次除去有机溶剂；
(3)将SIS浸泡在0.05％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中，室温下振荡消化12小时，生理盐水溶液反复洗涤去除胰蛋白酶；
(4)将SIS置于0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)生理盐水中摇晃振荡4小时，并用生理盐水溶液彻底冲洗以除去洗涤剂；
(5)将SIS浸于0.5％醋酸溶液中过夜，用打浆机粉碎(加入冷的醋酸溶液，防止温度升高)，加胃蛋白酶(质量比：酶/膜＝1/100)室温下酶解2天后双层纱布过滤。
(6)滤液用2摩尔的氯化钠溶液盐析24h，7800转/分离心1h，取沉淀。将沉淀用10倍体积的0.5％醋酸完全溶解，继续用2摩尔氯化钠溶液盐析24h，7800转/分离心1h，取沉淀；
(7)将沉淀溶于0.1％醋酸，装在8000道尔顿透析袋中，置于0.1％醋酸溶液的大烧杯里透析24h，每4-6h换液1次；
(8)透析后sis溶液置于培养皿中-20℃冷冻后，用冷冻干燥机在-40℃条件下冷冻干燥48小时，打粉机粉碎后得到SIS粉末；
2、3D组织工程材料的制备
(1)将0.5％-2％SIS粉末溶解于0.01M盐酸或醋酸，彻底溶解后与1/10体积的0.1MNaOH混合，调pH值至中性；
(2)配制100mg/ml的核黄素原液；
(3)将核黄素与中性SIS溶液混合均匀，核黄素终浓度为0.05％-0.2％；
(4)将细胞与第(3)步中的溶液混合，细胞终浓度为100000个/ml；
(5)将混合的溶液滴入96孔板或其他模具中，用200W的白炽灯泡距离96孔板或模具10-30cm处照射3-5min，溶液即发生相变，形成凝胶；
3、体外培养
将3D组织凝胶放入含10％胎牛血清的DMEM培养基，5％CO2、37℃进行培养。
有益效果
(1)本发明以猪小肠粘膜脱细胞基质作为天然的细胞外基质成分，所制得的3D组织材料所含化学成分与人细胞外基质成分高度接近，含有丰富的生长因子，具有良好的生物相容性，更有利于支持细胞的生长。
(2)本发明制作工艺简单，除原材料外，仅需白炽灯作为生产设备，不需要复杂的设备，整个操作过程不含有对细胞有害的成分，不造成环境污染。
(3)本发明可用作细胞治疗的载体，原位形成带细胞的凝胶进行组织再生修复。本发明还可用与3D打印相结合，制备不同形状和含不同类型细胞及不同结构的复杂3D组织工程产品。除制作3D组织工程产品外，还可用于杂交瘤细胞的体外半固体筛选。
附图说明
图1 3D组织凝胶；
图2 3D组织工程材料中细胞存活和生长情况；A-体外培养1天后细胞存活情况，B-体外培养3天后细胞存活情况。
图3 3D组织凝胶用于动物创伤原位修复；左侧为对照组，右侧为实验组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
含细胞的3D组织工程产品的快速构建，包括以下步骤：
1、SIS原料的准备
(1)取新鲜猪小肠，通过机械方法将小肠的浆膜层和肌层去除，生理盐水反复冲洗干净。
(2)用甲醇和氯仿(1∶1，V/V)脱脂溶液浸泡搅拌12～24h(优选为12h，重复2遍)，并用去离子水漂洗3～5次除去有机溶剂。
(3)将SIS浸泡在0.05％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中，室温下振荡消化12小时，生理盐水溶液反复洗涤去除胰蛋白酶。
(4)将SIS置于0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)生理盐水中摇晃振荡4小时，并用生理盐水溶液彻底冲洗以除去洗涤剂。
(5)将SIS浸于0.5％醋酸溶液中过夜，用打浆机粉碎(加入冷的醋酸溶液，防止温度升高)，加胃蛋白酶(质量比：酶/膜＝1/100)室温下酶解2天后双层纱布过滤。
(6)滤液用2摩尔的氯化钠溶液盐析24h，7800转/分离心1h，取沉淀。将沉淀用10倍体积的0.5％醋酸完全溶解，继续用2摩尔氯化钠溶液盐析24h，7800转/分离心1h，取沉淀。
(7)将沉淀溶于0.1％醋酸，装在8000道尔顿透析袋中，置于0.1％醋酸溶液的大烧杯里透析24h，每4-6h换液1次。
(8)透析后sis溶液置于培养皿中-20℃冷冻后，用冷冻干燥机在-40℃条件下冷冻干燥48小时，打粉机粉碎后得到SIS粉末。
2、含细胞3D组织工程产品制作
(1)将0.5％-2％的猪小肠粘膜基质(SIS)溶解于0.01M盐酸或醋酸，彻底溶解后与1/10体积的0.1M NaOH混合，调pH值至中性。
(2)配制100mg/ml的核黄素(维生素B2)原液备用。
(3)将核黄素与中性SIS混合均匀，核黄素终浓度为0.05％-0.2％。
(4)将小鼠骨髓间充质干细胞与第(3)步中的溶液混合，细胞终浓度为100000个/ml。
(5)将混合的溶液滴入96孔板或其他模具(如动物创伤处)中，用200W的白炽灯泡距离96孔板或模具10-30cm处照射3-5min，溶液即发生相变，形成凝胶，其形态如图1所示。
3、含细胞3D组织工程体外培养
将3D组织凝胶放入DMEM培养基(含10％胎牛血清)，5％CO2，37℃进行培养，分别在培养1天和3天后进行活死细胞染色，评价3D组织工程产品中的细胞存活和生长情况，1天和3天培养后的细胞存活的染色(活-死细胞染色试剂盒，Invitrogen)情况如图2所示，结果表明本方法构建的含细胞3D组织工程产品生物相容性好，其中包含的细胞生长良好。
图2-A中，培养1天后活细胞为绿色，死细胞为红色。在图中可以看到，细胞成功的长在水凝胶内，并且没有任何死细胞，细胞生长良好。这证明光引发的SIS水凝胶对细胞无任何毒副作用，有良好的细胞相容性。
图2-B中，培养3天后，与培养一天的照片相比，细胞数量增多，这说明细胞已经开始繁衍，而且扩散均匀，并无任何死细胞。这表现SIS光引发的水凝胶不仅生物相容性良好，并且能促进和支撑细胞生殖繁衍，能够锚定细胞，是良好的生物材料支架。
4.含细胞3D组织材料中的细胞因子检测
采用ELISA分别检测原材料猪小肠粘膜基质SIS以及3D组织材料中细胞因子VEGF，b-FGF，TGF-b，and TNF-a含量如表1所示。
表1
VEGF b-FGF TGF-b TNF-a
猪小肠粘膜基质SIS 50.68ng/mg 6.18pg/ml 7.23pg/ml 5.03mg/ml
光敏凝胶 43.12ng/mg 5.17pg/mg 6.03pg/mg 1.38mg/mg
5.植入动物体后原位修复实验
将含细胞的3D组织工程产品植入小鼠，包括以下步骤：
(1)小鼠麻醉，背部脱毛，用punch在小鼠背部制作一个直径6mm的皮肤缺损；
(2)将本实施例步骤2(4)制得的混合溶液0.1ml滴在小鼠皮肤缺损处，用200w白炽灯距创面20cm处照射6min，即可成胶，结果如图3所示，左侧为未做任何处理的创伤对照组，右侧为创面直接成胶的实验组。
实施例2
用于杂交瘤细胞的半固体筛选
(1)配置1％浓度的SIS中性溶液，加入终浓度为0.1％核黄素混合均匀。
(2)配制2X RPMI1640细胞培养液(其中含胎牛血清20％，丙酮酸钠0.22g/L，L-谷氨酰胺0.15％，青霉素200IU/mL，链霉素200ug/mL，2X HAT)。
(3)将(1)和(2)等体积混合均匀。
(4)将常规融合后的杂交瘤细胞用(3)中的溶液重悬，混匀。
(5)将上述细胞悬液3mL放入六孔板中，用200W的白炽灯泡距离96孔板或模具10-30cm处照射3-5min，溶液即发生相变，形成凝胶。
(6)37℃、5％CO2培养7-10天后，肉眼可见培养基内形成白色斑点，每个斑点即为杂交瘤细胞克隆。

Claims (6)

1.一种3D组织材料，以猪小肠粘膜脱细胞基质作为支架材料，其特征在于：含有细胞、核黄素或其衍生物。
2.如权利要求1所述3D组织材料，核黄素或其衍生物：猪小肠粘膜脱细胞基质质量百分比为1-4:10-40。
3.权利要求1或2所述3D组织材料的制备方法，将细胞和核黄素或其衍生物加入猪小肠粘膜脱细胞基质，白炽灯照射3-5min。
4.权利要求3所述3D组织材料的制备方法，包括猪小肠粘膜脱细胞基质的制备、加入核黄素或其衍生物和细胞、光照射、体外培养。
5.权利要求4所述3D组织材料的制备方法，所述加入核黄素或其衍生物和细胞包括以下步骤：
①将0.5%-2% SIS粉末溶解于0.01M 盐酸或醋酸，彻底溶解后与1/10体积的0.1M NaOH混合，调pH值至中性；
②配制100mg/ml的核黄素原液；
③将核黄素与中性SIS溶液混合均匀，核黄素终浓度为0.05%-0.2%；
④将细胞与第（3）步中的溶液混合，细胞终浓度为100000个/ml；
所述和光照射是将混合的溶液滴入模具中，用200W的白炽灯泡距离96孔板或模具10-30cm处照射3-5min，溶液即发生相变，形成凝胶。
6.权利要求3所述3D组织材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）SIS原料的准备
①取新鲜猪小肠，通过机械方法将小肠的浆膜层和肌层去除，生理盐水反复冲洗干净；
②用甲醇和氯仿（1：1，V / V）脱脂溶液浸泡搅拌12~24h（优选为12h，重复2遍），并用去离子水漂洗3~5次除去有机溶剂；
③将SIS浸泡在0.05％胰蛋白酶/ 0.05％乙二胺四乙酸溶液中，室温下振荡消化12小时，生理盐水溶液反复洗涤去除胰蛋白酶；
④将SIS置于0.5％十二烷基硫酸钠（SDS）生理盐水中摇晃振荡4小时，并用生理盐水溶液彻底冲洗以除去洗涤剂；
⑤将SIS浸于0.5％醋酸溶液中过夜，用打浆机粉碎（加入冷的醋酸溶液，防止温度升高），加胃蛋白酶（质量比：酶/膜=1/100）室温下酶解2天后双层纱布过滤；
⑥滤液用2摩尔的氯化钠溶液盐析24h，7800转/分离心1h，取沉淀；将沉淀用10倍体积的0.5%醋酸完全溶解，继续用2摩尔氯化钠溶液盐析24h，7800转/分离心1h，取沉淀；
⑦将沉淀溶于0.1%醋酸，装在8000道尔顿透析袋中，置于0.1%醋酸溶液的大烧杯里透析24h，每4-6h换液1次；
⑧透析后sis溶液置于培养皿中-20℃冷冻后，用冷冻干燥机在-40℃条件下冷冻干燥48小时，打粉机粉碎后得到SIS粉末；
（2）3D组织工程材料的制备
①将0.5%-2% SIS粉末溶解于0.01M 盐酸或醋酸，彻底溶解后与1/10体积的0.1M NaOH混合，调pH值至中性；
②配制100mg/ml的核黄素原液；
③将核黄素与中性SIS溶液混合均匀，核黄素终浓度为0.05%-0.2%；
④将细胞与第（3）步中的溶液混合，细胞终浓度为100000个/ml；
⑤将混合的溶液滴入96孔板或其他模具中，用200W的白炽灯泡距离96孔板或模具10-30cm处照射3-5min，溶液即发生相变，形成凝胶；
（3）体外培养
将3D组织凝胶放入含10%胎牛血清的DMEM培养基，5%CO2、37℃进行培养。
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