CN108939151B - 纳米多孔微支架在组织再生修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了纳米多孔微支架在组织再生修复中的应用，所述纳米多孔微支架为纳米载体‑海藻酸钠三维多孔微支架；所述纳米载体为介孔二氧化硅纳米颗粒；所述海藻酸钠为改性海藻酸钠；所述纳米载体‑海藻酸钠三维多孔微支架采用液氮速冻高速破碎法制得。所述海藻酸钠三维多孔微支架在组织再生修复中的应用的具体使用方法为：向制备好的微支架中加入微支架总体积50％～80％的PBS，得到可注射微支架，将其注射于损伤组织部位。本发明的纳米多孔微支架能够促进组织再生，高效促干细胞扩增和定向分化，可注射，临床实用性强。本发明还公开了纳米多孔微支架在促进干细胞增殖、促进干细胞分化、促进组织自我再生修复中的应用。

Description

纳米多孔微支架在组织再生修复中的应用
技术领域
本发明涉及一种支架在组织再生修复中的应用，属于再生医学领域，特别涉及纳米多孔微支架在组织再生修复中的应用。
背景技术
生物支架通过模拟人体天然微环境的理化特性，能有效促进干细胞的自我更新、增殖以及定向分化等，近年来被广泛应用于再生医学领域。
一般地，以干细胞为基础的生物支架按其状态主要分为多孔支架和水凝胶支架。其中，多孔支架具有大量相互连通的三维多孔结构，相比于水凝胶等，更利于细胞在支架内的迁移和营养物质的供给。一般认为，100-300μm的三维多孔结构比较适宜细胞和组织的长入，因此多孔支架被大量应用在组织再生和肿瘤免疫治疗研究领域。
然而，目前传统的多孔支架具有较大的物理尺寸，阻碍了营养物质和细胞进入支架内部，严重影响了支架上细胞的存活和扩增。
针对这一问题，国内外有研究团队制备出了具有更小物理尺寸的“微支架”。由于微支架的物理尺寸很小(约800-2,000μm)，营养物质和细胞能够顺利进入支架内部，从而促进细胞在支架上存活、增殖和后期的定向分化等。例如，Y.N.Du等曾报道，他们利用明胶和聚乙二醇分别制备出微支架以增强肝细胞的存活和扩增。
但是目前几乎所有的传统多孔支架都不能以简单注射的方式进行体内移植，仍然需要通过创伤性较大的传统外科手术方式进行植入。可注射生物支架使用简便且能有效充分填充组织缺损，具有较大的临床应用前景，近年来成为了生物材料的前沿研究方向。
目前的可注射支架大都为凝胶状，这类支架结构致密，阻碍了营养物质/代谢产物的交换，同时也不利于细胞的迁移。而常见的多孔支架由于其结构特点，难于通过注射的方式植入体内。因此，近年来有许多研究人员致力于开发可注射的多孔支架。D.J.Mooney等人制备出一种可注射的复合海藻酸钠水凝胶支架，该支架能够在体内原位形成多孔结构，从而有效促进包被在凝胶中的干细胞迁移至缺损部位。Milica Radisic等人通过结构单元设计，制备出可注射的血管可降解生物芯片(单层网状结构)。
然而，目前仍未开发出能有效促进干细胞存活、扩增、定向分化的可注射三维多孔微支架。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供纳米多孔微支架在组织再生修复中的应用，所述纳米多孔微支架为纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架，能够促进组织再生，能够高效促干细胞扩增和定向分化，可注射，临床实用性强。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供纳米多孔微支架在组织再生修复中的应用，所述纳米多孔微支架为纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架。
进一步地，所述组织再生修复为在缺损组织部位有一定量的相应组织的细胞增殖、分化、形成新的组织；
所述纳米载体为介孔二氧化硅纳米颗粒；
所述海藻酸钠为改性海藻酸钠；
所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架采用液氮速冻高速破碎法制得。
所述海藻酸钠三维多孔微支架在组织再生修复中的应用的具体使用方法为：向制备好的微支架中加入微支架总体积50％～80％的PBS，得到可注射微支架，将其注射于损伤组织部位。
优选地，所述介孔二氧化硅纳米颗粒为生物活性物质修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒；
所述生物活性物质为具有促进细胞功能维持、增殖和定向分化的蛋白、多肽或小分子，包括但不限于骨形成蛋白家族系列、血管内皮生长因子、载氧蛋白、阿司匹林、不同类型细胞因子、促胰岛细胞生长因子、促肝脏细胞生长因子以及促心肌细胞生长因子；
所述改性海藻酸钠为RGD多肽共价接枝修饰海藻酸钠；所述改性海藻酸钠的改性方法包括如下步骤：
将EDC/NHS加入海藻酸钠溶液，于室温搅拌4h后，加入RGD多肽搅匀后于4℃静止过夜；接着将该溶液转入透析袋透析3d后冷冻干燥24h；密封，-20℃储藏；
所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架在组织再生修复中的应用的具体使用方法中，还包括在微支架中滴加少许低浓度海藻酸钠溶液充分混匀，再转移至注射器。
进一步地，所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架具有三维多孔结构，支架为球状，最小能做成直径为1mm的微球，孔径可根据具体组织特性需求调整，孔径范围为50～300μm。
进一步地，所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架的制备方法包括以下步骤：
(1)介孔二氧化硅纳米颗粒的合成：
在圆底烧瓶中加入Pluronic P-123(Sigma)3～9g、去离子水125～130mL和浓HCl18～25mL，剧烈搅拌1.5～4h，充分混匀后将烧瓶置50℃水浴中，搅拌下加入正硅酸乙酯5～10g，搅拌20h。接着升温至80～85℃，静置恒温24～30h；然后离心(5000～6000G)，用去离子水洗涤沉淀，干燥后在马弗炉中煅烧；
(2)纳米载体-海藻酸钠三维多孔支架的制备：
将改性海藻酸钠溶解于去离子水中，与介孔二氧化硅纳米颗粒混合均匀；将混合液置于4℃后置于-20℃，冷冻干燥；加入氯化钙溶液，PBS浸洗后再次冷冻干燥，密封干燥保存；
(3)纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架的制备：
将纳米载体-海藻酸钠三维多孔支架置于离心管中，加入液氮，快速用均质仪将支架破碎；待液氮挥发完全后，加入氯化钙溶液，反应后进行过滤，将所得颗粒进行冷冻干燥，即得纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架。
优选地，步骤(1)中，所述介孔二氧化硅纳米颗粒的合成方法还包括包埋生物活性物质，包括如下步骤：
将介孔二氧化硅纳米颗粒加入生物活性物质溶液中反应，沉淀即为生物活性物质修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒，密封保存；
所述生物活性物质为具有促进细胞功能维持、增殖和定向分化的蛋白、多肽或者小分子，包括但不限于骨形成蛋白家族系列、血管内皮生长因子、载氧蛋白、阿司匹林、不同类型细胞因子、促胰岛细胞生长因子、促肝脏细胞生长因子以及促心肌细胞生长因子。
更优选地，包埋生物活性物质的具体操作为：将介孔二氧化硅纳米颗粒加入生物活性物质溶液中，使其终浓度为1000μg/mL，反应1h，离心去掉上清溶液，沉淀即为生物活性物质修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒，用PBS洗涤2次后离心，将沉淀冷冻干燥，密封4℃保存。
优选地，步骤(2)中，所述改性海藻酸钠为RGD多肽共价接枝修饰海藻酸钠，其改性方法包括如下步骤：
将EDC/NHS加入海藻酸钠溶液，于室温搅拌4h后，加入RGD多肽搅匀后于4℃静止过夜；接着将该溶液转入透析袋透析3d后冷冻干燥24h；密封，-20℃储藏；
更优选地，步骤(2)具体操作为：将改性海藻酸钠充分溶解于去离子水中，使其终浓度为1.5％(w/v)，与介孔二氧化硅纳米颗粒混合均匀；将混合液转移至模具(如试剂板、玻璃皿等)，置于4℃放置1～4h，后置于-20℃放置8～20h，冷冻干燥24～48h；加入终浓度为2％(w/v)的氯化钙溶液，交联15min，PBS浸洗3次后再次冷冻干燥12h，密封干燥4℃保存。
优选地，步骤(3)中，液氮加入量为离心管容积(15mL或50mL)的10％～45％；氯化钙溶液的终浓度为2％(w/v)，交联反应2～15min；采用均质仪高速破碎支架所用转速为20,000～40,000rpm，高速破碎30s～2min；所述过滤采用孔径1.2～1.5mm的标准筛。
进一步地，所述组织包括但不限于心肌、肝脏、胰腺、神经、组织工程皮肤、成骨、软骨、脊髓、组织工程耳朵和膀胱；
所述纳米多孔微支架在组织再生修复中的应用可通过以下四种方式使用：
一，可以不包埋任何组织细胞直接注射到相应的部位；二，微支架中包埋某一组织的组织细胞，然后注射到相应的部位；三，微支架中包埋具有治疗作用的蛋白、多肽或者小分子，直接注射到相应的组织；四，以上三种混合使用；
所述纳米多孔微支架在组织再生修复的应用中，在微支架中包埋组织细胞具体方法为：将组织细胞培养传代至第4代后，用胰酶消化、离心、重悬后与制备好的微支架溶液充分混合均匀，注射于损伤组织部位。
所述纳米多孔微支架可应用于制备组织再生修复材料、制备促进干细胞增殖材料、制备提高干细胞贴壁性能材料、制备促进干细胞分化材料、制备促进组织自我再生修复材料。
所述材料为包括但不限于药物。
本发明提供纳米多孔微支架在促进干细胞增殖中的应用，所述干细胞包括但不限于神经细胞、心肌细胞、骨髓间充质干细胞、间质干细胞、肝脏细胞、成肌细胞和胰岛细胞；
所述海藻酸钠三维多孔微支架在组织再生修复中的应用的具体使用方法为：向制备好的微支架中加入微支架总体积50％～80％的PBS，得到可注射微支架，将其注射于损伤组织部位；
所述纳米多孔微支架在促进干细胞增殖中的应用可通过以下四种方式使用：
一，可以不包埋任何组织细胞直接注射到相应的部位；二，微支架中包埋某一组织的组织细胞，然后注射到相应的部位；三，微支架中包埋具有治疗作用的蛋白、多肽或者小分子，直接注射到相应的组织；四，以上三种混合使用；
所述纳米多孔微支架在促进干细胞增殖中的应用通过以下两种方法实现：
一，制备支架尺寸为50～300μm的微支架，让营养物质和细胞能更充分地进入支架内部，并以此促进干细胞在多孔微支架内的存活和增殖率；二，支架中包埋具有治疗作用的蛋白、多肽或者小分子，具有仿生缓释过程，为干细胞增殖和生长提供持续的生长因子。
本发明提供纳米多孔微支架在促进干细胞分化中的应用，所述干细胞包括但不限于神经细胞、心肌细胞、骨髓间充质干细胞、间质干细胞、肝脏细胞、成肌细胞和胰岛细胞。
所述海藻酸钠三维多孔微支架在组织再生修复中的应用的具体使用方法为：向制备好的微支架中加入微支架总体积50％～80％的PBS，得到可注射微支架，将其注射于损伤组织部位；
所述纳米多孔微支架在促进干细胞分化中的应用可通过以下四种方式使用：
一，可以不包埋任何组织细胞直接注射到相应的部位；二，微支架中包埋某一组织的组织细胞，然后注射到相应的部位；三，微支架中包埋具有治疗作用的蛋白、多肽或者小分子，直接注射到相应的组织；四，以上三种混合使用；
所述纳米多孔微支架在促进干细胞分化中的应用通过以下两种方法实现：
一，制备支架尺寸为50～300μm的微支架，让营养物质和细胞能更充分地进入支架内部，并以此促进干细胞在多孔支架内的存活和分化；二，支架中包埋具有治疗作用的蛋白、多肽或者小分子，具有仿生缓释过程，为干细胞分化和成熟提供持续的生长因子。
以骨组织为例，本发明提供的纳米多孔微支架可应用于促进干细胞矿化；具体地，可应用于制备促进干细胞矿化材料。
本发明提供纳米多孔微支架在促进组织自我再生修复中的应用，所述干细胞包括但不限于神经细胞、心肌细胞、骨髓间充质干细胞、间质干细胞、肝脏细胞、成肌细胞和胰岛细胞；
所述海藻酸钠三维多孔微支架在组织再生修复中的应用的具体使用方法为：向制备好的微支架中加入微支架总体积50％～80％的PBS，得到可注射微支架，将其注射于损伤组织部位；
所述组织自我再生修复是通过促进宿主自身干细胞的定向迁移机制实现。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架，具有高连通率的三维多孔结构，具有更小的物理尺寸，利于营养物质的进入，有利于细胞及组织的长入，促进了细胞的贴壁、存活和增殖；
(2)本发明所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架，一，可以不包埋任何组织细胞直接注射，注射到某种组织后，微支架内会生长相应的组织细胞；二，微支架中包埋某一组织的组织细胞，然后注射到相应的部位，加快相应的组织细胞生长；三，微支架中包埋具有治疗作用的蛋白、多肽或者小分子，直接注射到相应的组织，可以缓慢释放在病患处，减少用药量；四，以上三种可以混合使用；
(3)本发明所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架，通过加入生物活性物质修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒，会在适当的生长阶段将生物活性物质释放出，刺激组织分化，为促进组织分化和成熟提供持续的“动力”，我们将其形象地称之为“生物引擎”；
(4)本发明所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架，可促进组织再生修复，主要通过促进干细胞增殖、分化，提高干细胞贴壁性能，以及促进组织自我再生修复实现，可应用于相应材料的制备；
(5)本发明所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架，利用液氮速冻高速破碎法，开发出一种可注射生物支架，改变了通过创伤性较大的传统外科手术方式进行植入的方式，使用简便且能有效充分填充组织缺损，具有巨大的临床应用前景。
附图说明
图1A为实施例2中可注射NAC/MS的实物图和SEM图；
图1B为实施例2中不同支架的物理尺寸；
图1C为实施例2中不同支架的孔径表征结果；
图2为实施例2中可注射NAC/MS在致密软组织中可注射性验证结果；
图3A为实施例2中不同支架的弹性模量测试结果；
图3B为实施例2中BFP-1在不同支架中的缓释曲线；
图3C为实施例2中荧光标记(FITC-)BFP-1在不同支架中的保留情况；
图4A为实施例4中hMSCs增殖速率测定结果(CCK-8)；
图4B为实施例4中hMSCs在各支架上的生长形貌SEM图(3天)；
图4C为实施例4中hMSCs在各支架上生长的分布和数量定性测定；
图4D为实施例4中hMSCs在各支架上生长的整合素-β1表达情况(7天)；
图4E为实施例4中hMSCs在各支架上生长的明场照片(7天)；
图5A为实施例4中“成骨生物引擎”原理图；
图5B为实施例4中体外ALP活性检测结果；
图5C为实施例4中成骨相关基因检测结果；
图5D为实施例4中相关蛋白表达Westernblot检测结果；
图6A为实施例5中裸鼠皮下异位成骨实验示意图；
图6B为实施例5中体内异位成骨4周后，植入体H&E和茜素红染色结果；
图6C为实施例5中植入体micro-CT分析图；
图6D为实施例5中矿化骨组织micro-CT定量计算结果；
图6E、F为实施例5中成骨相关蛋白免疫荧光染色分析结果；
图7A为实施例6中比格犬颅骨缺损修复Micro-CT分析结果；
图7B、C、D为实施例6中骨缺损再生修复定量检测结果；
图8A为实施例6中新生骨钙绿素标记CLMS图；
图8B为实施例6中新生骨相对荧光强度；
图8C为实施例6中新生骨马松染色结果。
具体实施方式
现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明旨在公开纳米载体-海藻酸钠微支架在组织再生修复中的应用。
本发明公开的一种纳米载体-海藻酸钠复合微支架体系，以高效促干细胞扩增和定向分化效率，快速实现组织再生修复。我们把载有生物活性物质的纳米载体包被在海藻酸钠多孔支架中，利用液氮速冻破碎法，开发出载有“生物引擎”的三维多孔微支架体系。
为了验证该支架的生物学效果，我们以骨再生修复为范例，通过“生物引擎”仿生释放成骨多肽BFP-1，促进hMSCs成骨分化和成熟。
体内外结果显示，具有更小物理尺寸的NAC/MS能够有效促进hMSCs的贴壁、存活和增殖，“成骨生物引擎”通过在干细胞快速增殖末期持续缓释BFP-1有效促进了hMSCs的成骨分化和成熟，最终获得了大量的矿化骨组织。而且，该NAC/MS复合体系还能促进骨缺损的自我再生修复，这缘于该支架能够促进宿主干细胞的增殖和成骨分化。
以上所有研究结果表明，我们开发的可注射NAC/MS制备方法简单，使用操作简便，具有极大的临床实用价值，该体系还具有应用于肝组织再生和心肌修复等领域的潜力。
本发明通过将载有生物活性物质的纳米载体包被在海藻酸钠多孔支架中，利用液氮速冻破碎法，开发出一种纳米载体-海藻酸钠复合微支架体系，该体系具有能高效促干细胞扩增和定向分化，操作简便，临床实用性强等特点。
本发明具体内容如下：
一、可注射纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架(NAC/MS)制备及表征：
将液氮加入离心管，浸没未交联的纳米载体-海藻酸钠三维多孔支架(NACS)，韧性较大的支架将变得十分的脆性，均质仪高速旋转将产生较大的剪切力，最终将尺寸较大的支架破碎成尺寸非常小的多孔颗粒，再经过氯化钙交联和冻干后这些颗粒就是制得的三维多孔微支架(NAC/MS)。
相比其他方式制备该微支架(比如用剪子、刀片剪切)，本方法中液氮瞬时超低温能快速将NACS(或者AS)的多孔结构固定，以致不会被后续剪切力破坏。
另外，本方法在低温下操作，不会影响支架里包被生物因子的活性。
为了使微支架具可注射性，我们将冻干的微支架浸泡在PBS中，目的是去除微支架表面残留的多余Ca2+，待其充分吸水溶胀后，滤掉PBS后在微支架中滴加少许低浓度海藻酸钠溶液充分混匀，再转移至注射器(1mL规格)中冷冻干燥。体内实验时，只需将细胞悬液加至微支架中充分混匀即可进行注射。
滴加的海藻酸钠溶液起一定的“润滑”作用，能使微支架颗粒顺利通过注射针。由于海藻酸钠溶液的浓度较低，注射进动物体内后将很快被进一步稀释掉，不会影响支架内接种的细胞活性。
本发明所得纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架具有三维多孔结构，支架为球状，最小能做成直径为1mm的微球，孔径可根据具体组织特性需求调整，具体孔径大小根据某组织生长所需最适孔径进行调整，可调控范围为50～300μm。
本发明所制备得到的纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架及其复合体系，一，可以不包埋任何组织细胞直接注射，注射到某种组织后，微支架内会生长相应的组织细胞；二，微支架中包埋某一组织的组织细胞，然后注射到相应的部位，加快相应的组织细胞生长；三，微支架中包埋具有治疗作用的蛋白、多肽或者小分子，直接注射到相应的组织，可以缓慢释放在病患处，减少用药量；四，以上三种可以混合使用。
本发明所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架，可促进组织再生修复，主要通过促进干细胞增殖、分化、提高干细胞贴壁性能，以及促进组织自我再生修复实现，可应用于相应材料的制备。即本发明所制备得到的纳米多孔微支架可应用于制备组织再生修复材料、制备促进干细胞增殖材料、制备提高干细胞贴壁性能材料、制备促进干细胞分化材料、制备促进组织自我再生修复材料。
所述材料为包括但不限于药物。
所述干细胞包括但不限于神经细胞、心肌细胞、骨髓间充质干细胞、间质干细胞、肝脏细胞、成肌细胞和胰岛细胞。
纳米载体是一种药物或生物活性物质的载体，它的作用是在支架基础上进一步减缓药物或生物活性物质缓释速率。
为了更形象地展示将BFP-1“装载”在介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)中再包被于纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架(NAC/MS)中，比直接将BFP-1包被于海藻酸钠支架(pep@AMS)中具有更长缓释周期，我们测定了两种体系中BFP-1的缓释曲线和荧光保留图。
实验结果表明，NAC/MS中的BFP-1表现出了明显更缓慢的释放速率，将BFP-1“装载”于MSNs将能够有效实现该仿生缓释过程。NAC/MS中“装载”的BFP-1，比直接将BFP-1包被于海藻酸钠支架中(pep@AMS)具有更长缓释周期。pep@AMS中的BFP-1在第5d时已释放近一半，而NAC/MS中的BFP-1直到第10d才释放总量的一半。荧光标记BFP-1的荧光保留图显示，NAC/MS中的BFP-1表现出了明显更缓慢的释放速率，支持了缓释曲线的测定结果，证明了MSNs对生物因子具有延时、持续地缓释作用。
本发明中的介孔二氧化硅纳米颗粒作为生物因子的载体，可以根据应用背景需要，运载多种活性物质，如具有促进细胞功能维持、增殖和定向分化的蛋白、多肽或小分子等活性物质，即具有治疗作用的蛋白、多肽或者小分子，活性物质包括但不限于骨形成蛋白家族系列、血管内皮生长因子、载氧蛋白、阿司匹林、不同类型细胞因子、促胰岛细胞生长因子、促肝脏细胞生长因子以及促心肌细胞生长因子，并以持续、稳定的方式长时间缓释。例如，若将本支架用于心肌梗死治疗，则可以在纳米颗粒中“装载”促干细胞心肌分化及成熟的因子，我们将该载生物因子的纳米颗粒称为“生物引擎”。
二、可注射纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架(NAC/MS)组织工程的应用：
所述组织包括但不限于心肌、肝脏、胰腺、神经、组织工程皮肤、成骨、软骨、脊髓、组织工程耳朵和膀胱。
作为验证和示范，我们将NAC/MS体系应用于骨组织工程，以BFP-1作为促干细胞成骨分化的生物因子。
研究结果表明，以NAC/MS为支架，能够促进干细胞细胞增殖及成骨分化。NAC/MS能明显促进hMSCs的ALP活性，缓释出的BFP-1发挥了作用。进一步地，成骨相关基因和蛋白表达测试结果显示，NAC/MS能有效上调hMSCs各成骨相关基因(包括Runx2、OCN、Col1a1、OPN和ALP)的表达；Western blotting结果显示Runx2、OCN、Col1a1蛋白的表达水平同样支持了基因和ALP活性检测的结论。
本发明验证了NAC/MS对hMSCs存活和增殖的影响。促进干细胞增殖是NAC/MS设计的重要功能之一，我们旨在通过制备比传统普通多孔支架尺寸更小的微支架，让营养物质和细胞能更充分地进入支架内部，并以此促进干细胞在多孔支架内的存活和增殖率。
为了进一步探究NAC/MS促进hMSCs的成骨分化效果，我们将载hMSCs的NAC/MS注射到裸鼠皮下进行异位成骨实验。结果表明，物理尺寸更小的微支架能够有效促进hMSCs的增殖和矿化，微支架里的“成骨生物引擎”能够进一步大大提高hMSCs的矿化程度。
为探究NAC/MS促进骨缺损修复的能力，我们将该材料注射至比格犬颅骨缺损模型中，以验证其原位促进骨再生效果。实验结果证实了NAC/MS复合支架体系能够快速、有效的促进宿主骨缺损的再生修复。
体内原位骨缺损修复实验主要为探究NAC/MS促进宿主自身干细胞的定向迁移、扩增和成骨分化，因此NAC/MS中不携带hMSCs。
以下通过具体较佳实施例结合附图进一步说明本发明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
实施例1纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架的制备
1.1.多肽修饰介孔二氧化硅纳米颗粒(peptide-laden mesoporous silicananoparitcles，pep@MSNs)的合成
介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)来源于华东理工大学魏杰实验室。具体制备方法为：在圆底烧瓶中加入Pluronic P-123(Sigma)3～9g、去离子水125～130mL和浓HCl 18～25mL，剧烈搅拌1.5～4h，充分混匀后将烧瓶置50℃水浴中，搅拌下加入正硅酸乙酯5～10g，搅拌20h。接着升温至80～85℃，静置恒温24～30h；然后离心(5000～6000G)，用去离子水洗涤沉淀，干燥后在马弗炉中煅烧。
本研究中，我们使用的多肽是来源于骨形成蛋白-7非成熟区的一段多肽，命名为BFP-1(GQGFSYPYKAVFSTQ，购自上海强耀)。
将100mgMSNs粉末加入10mLBFP-1溶液(10-4mol/L)中反应1h，然后离心分离(2000rpm，2min)，去掉上清溶液。该沉淀即为pep@MSNs，用PBS洗涤2遍后离心，将沉淀冷冻干燥，然后密封4℃保存。
1.2.纳米载体-海藻酸钠三维多孔支架(nanocarriers-alginate compositesscaffolds，NACS)的制备
本研究所使用的海藻酸钠(alginate)为RGD多肽(GGGGRGDASSP，购自上海强耀)。
RGD-alginate(RA)的改性方法：
将EDC/NHS加入海藻酸钠溶液，于室温搅拌4h后，加入RGD多肽搅匀后于4℃静止过夜；接着将该溶液转入透析袋(3.5kDa)透析3d后冷冻干燥24h即制得RA；密封、-20℃储藏。
将2.0g RA溶于100mL去离子水中，待其充分溶解后加入pep@MSNs粉末并充分混合均匀。接着将混合液转移至24孔板中，0.5ML/孔，然后依次将孔板放置于4℃冰箱2h，-20℃冰箱8h后，冷冻干燥24h。冷冻干燥完成后，将氯化钙(2％，w/v)溶液加入孔板中，1mL/孔，交联15min。然后用PBS浸洗3遍，再次冷冻干燥12h，密封干燥置于4℃保存。
未混pep@MSNs粉末纯RA制备的多孔支架为常见海藻酸钠多孔支架(AS)，为对照组。
1.3.纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架(nanocarriers-alginate compositesmicro-scaffolds，NAC/MS)的制备
利用液氮速冻多孔支架并用均质仪高速破碎的方法制备NAC/MS：
在50mL离心管中放1片NACS(或AS)，然后加入10mL液氮，快速用均质仪将支架破碎(35,000rpm，1min)。待液氮挥发完全后，向离心管内加入10mL氯化钙溶液(2％，w/v)，交联5min，然后用孔径1.2～1.5mm的标准筛进行过滤，截留直径在1.0mm左右的颗粒。然后将所得颗粒置于-20℃冷冻4～8h后，再冷冻干燥8～24h，即制得NAC/MS。
由AS制得的微支架称为AMS，作为另一对照组。
实施例2纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架的表征
扫描电子显微镜(SEM；S-4800；Hitachi，Japan)用于表征AS、AMS和NAC/MS的微观结构(孔径、多孔形态等)以及微支架尺寸；压缩弹性模量测试仪(ElectroForce 3100；Bose，USA)用于测定各支架的弹性模量。
将冻干的微支架浸泡在PBS中，待其充分吸水溶胀后，滤掉PBS后在微支架中滴加少许低浓度海藻酸钠溶液充分混匀，再转移至注射器(1mL规格)中冷冻干燥。体内实验时，只需将细胞悬液加至微支架中充分混匀即可进行注射。以致密的组织验证其可注射性。
包被在NAC/MS中的BFP-1的缓释特性通过测定BFP-1随时间的缓释曲线表征。简单地，用于制备测定缓释性能的NAC/MS所使用的BFP-1被荧光标签标记过，将NAC/MS浸没于PBS中(37℃)，在预设好的时间点采集一定量上清溶液，利用荧光酶标仪测定溶液的吸光度值，然后通过计算得出溶液中缓释出的BFP-1质量随时间的关系曲线，即得到缓释曲线。
实验结果：
如图1A所示，SEM结果显示NAC/MS具有高连通率的三维多孔结构，其孔结构也未受损坏；如图1B-C所示，其支架尺寸约为1mm的微球，孔径约为110μm，该孔径有利于细胞及组织的长入。
如图2所示，该可注射支架能被轻松地注射进致密的组织内，如牛肉。
如图3A所示，微支架的降解速率在第三周后明显高于AS，Ca2+交联支架降解的原因是因为Ca2+与溶液中的单价阳离子交换所致。NAC/MS和AMS的比表面积要远大于AS，因此NAC/MS和AMS中的Ca2+交换速率要快于AS，而这差异在第三周后被明显地表现出来了。NAC/MS中的BFP-1缓释速率与支架的降解速率有一定的关系，支架的降解将会加快BFP-1的释放速率。
如图3B-C所示，NAC/MS中的BFP-1表现出了明显更缓慢的释放速率，证明了MSNs对生物因子具有延时、持续地缓释作用。
大量前期研究发现，通过仿生的方式在干细胞快速增殖期后刺激其定向分化将有效提高细胞的扩增速率和促进干细胞的定向分化。
实验结果表明，将BFP-1“装载”于MSNs将能够有效实现该仿生缓释过程，该体系的构建将为后续研究奠定基础。
实施例3可注射NAC/MS制备
将制备好的NAC/MS浸泡于PBS中，4℃，48h；然后过滤掉PBS，将NAC/MS转移至1ml注射器中，塞上注射活塞，冷冻干燥后4℃密封保存。
实施例4人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在支架上的增殖
4.1.细胞培养和接种
人骨髓间充质干细胞(hMSCs；ScienCell，CA，USA)在高糖DMEM(Hyclone，USA)培养基(添加10％体积胎牛血清，1％体积双抗)中扩增，并将该培养基称为增殖培养基。
当hMSCs传代至第4代(P4)后，用胰酶(0.05％trypsin/EDTA，Gibco)消化、离心、重悬后接种至各支架，接种数量为1x105cells/孔。
当于培养箱孵育2h后，补加增殖培养基至每孔1.5mL。
接种后第二天，换加成骨诱导培养基，其组成为低糖DMEM，并添加胎牛血清(10％体积)、双抗(1％体积)、β-甘油磷酸(10mM)、抗坏血酸(50ug/mL)、地塞米松(0.1uM)。所有细胞每两天换一次液。
4.2.hMSCs的增殖
使用细胞计数试剂盒(CCK-8；Dojindo，Japan)分别于细胞接种后的第1、3、7和14天测定各支架上细胞的增殖速率。
4.3.hMSCs的形貌分析
使用SEM观察各支架上细胞的形貌；用鬼笔环肽标记细胞骨架并用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察。
4.4.体外成骨相关标志物检测
使用碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒(南京建成)测定各组细胞内的ALP活性；通过real-time PCR仪测定各组细胞内的成骨相关基因表达水平，包括一型胶原(Col1a1)、骨钙素(OCN)、骨桥素(OPN)、ALP、Runx2，内参为β-actin；进一步结合Western Blotting分析方法对成骨相关蛋白表达水平进行检测，包括Col1a1、OCN和Runx2。
实验结果：
如图4A所示，CCK-8测试结果表明在AMS和NAC/MS中的hMSCs具有较高的增殖速率，且在培养3天后，其增殖速率要远高于AS支架中的hMSCs。原因是，相较于AS，AMS和NAC/MS都具有更小的物理尺寸，正如前面所述，小物理尺寸的多孔支架更利于营养物质的进入，促进了hMSCs的快速增殖；而AS中的细胞由于得不到足够的营养供给，在细胞接种后的第三天即表现出了较低的增殖速率。
另外，我们还对细胞贴壁形态、分布和数量等进行了分析。如图4B所示，AMS和NAC/MS中的hMSCs表现出较宽平的铺展形态，而AS中的hMSCs则显得更瘦小。而这样的结果这主要是由细胞贴壁性的高低所决定的，贴壁效果越好，细胞将铺展得越宽平。
为了进一步验证该结论，我们对各支架中与hMSCs贴壁性能相关的整合素β1(integrinβ1)表达情况进行了分析。
图4C为整合素β1表达量的免疫荧光分析结果，从图中可以看到接种在AMS和NAC/MS中的hMSCs比在AS中有更多的整合素β1表达。从细胞分布和数量分析结果(图4C-E)可以看出，AMS和NAC/MS中的hMSCs分布均匀，然而AS中的hMSCs仅在边缘分布较多，中心部位几乎无细胞存活(我们称之为“边缘效应”)。
以上结果证实了我们制备的微支架能够有效促进hMSCs的贴壁、存活和增殖，而且pep@MSNs的引入不会影响hMSCs以上性质。
NAC/MS中最核心的部分是“成骨生物引擎”体系，该体系的工作原理图如5A所示。载有BFP-1的pep@MSNs将会在适当的生长阶段将其释放出刺激hMSCs成骨分化，为促进hMSCs成骨分化和成熟提供持续的“动力”，因此我们将其形象地称之为“成骨生物引擎”。
ALP是干细胞成骨分化前期非常重要的标志物，其活性越高表明成骨分化程度越高。图5B显示在第14天时，NAC/MS能明显促进hMSCs的ALP活性，缓释出的BFP-1发挥了作用。
结合前面BFP-1缓释曲线可知，在第4天BFP-1才发挥作用，因此NAC/MS和AMS在第7天的ALP活性无统计学差异。
为了进一步探究和验证各组中hMSCs成骨分化程度，我们进一步对成骨相关基因和蛋白进行了检测(图5C-D)，结果显示NAC/MS能有效上调hMSCs各成骨相关基因(包括Runx2、OCN、Col1a1、OPN和ALP)的表达；Westernblotting结果显示Runx2、OCN、Col1a1蛋白的表达水平同样支持了基因和ALP活性检测的结论。
实施例5体内皮下异位成骨实验
装于注射器的hMSCs悬液(0.2mL)通过鲁尔接头与另外一支装有0.4cm3NAC/MS的注射器相连接，然后充分混合均匀。然后，换上针头(14号)，载有hMSCs的微支架注射至裸鼠皮下，每只注射0.2cm3。
植入材料一个月后，将裸鼠安乐死，取出植入物并进行后续检测。通过micro-CT分析植入物内矿化程度；通过组织病理分析，包括H&E、马松、钙结节等染色进一步验证植入物的矿化；通过免疫荧光染色，分析成骨相关蛋白的表达水平，包括Col1a1、OCN、Runx2、OPN。
实验结果：
将载hMSCs的NAC/MS注射到裸鼠皮下进行异位成骨实验的结果如图6A所示。
如图6B所示，H&E和茜素红染色结果显示在AS组中仍然存在“边缘效应”，AS组植入体边缘细胞明显多于其中心部位，且边缘的细胞量也比NAC/MS和AMS组植入体的少。NAC/MS中hMSCs矿化程度最高。
如图6C-D所示，micro-CT结果支持了钙结节染色结果，通过定量计算，NAC/MS中的矿化骨体积有1.0mm3左右，而AMS和AS中的矿化骨体积分别为0.6mm3和0.16mm3。
以上结果表明，物理尺寸更小的微支架能够有效促进hMSCs的增殖和矿化，微支架里的“成骨生物引擎”能够进一步大大提高hMSCs的矿化程度。
如图6E-F所示，免疫荧光结果显示成骨相关蛋白表达水平支持了矿化和micro-CT结果。
实施例6体内原位骨缺损修复实验
装于注射器的生理盐水(0.2mL)通过鲁尔接头与另外一支装有0.4cm3NAC/MS的注射器相连接，然后充分混合均匀。将装于注射器中的NAC/MS注射至比格犬颅骨缺损中(缺损直径1.2cm)，缝好伤口，待动物苏醒后将其转移至犬舍。
于手术后第4周，通过静脉注射钙黄绿素(Sigma-Aldrich，USA)标记新生骨组织。
手术后一个月安乐死比格犬，取出样本进行后续检测。通过micro-CT检测缺损修复程度；通过CLSM检测新生骨荧光强度和信号分布规律；通过马松染色进一步分析新生骨形成情况。
实验结果：
如图7A，micro-CT结果显示NAC/MS能够有效促进骨缺损的修复，且缺损中心部位已有一定量的骨组织形成，效果明显优于其它各对照组。
如图7B-D，定量计算结果显示，NAC/MS组中新生骨体积为130mm3左右，AMS组中新生骨体积约为120mm3，AS组中新生骨体积约为55mm3，空白缺损新生骨体积约为25mm3，微支架两组(NAC/MS和AMS)能明显促进骨缺损再生修复。AS支架能一定程度促进骨再生，但效果远不如微支架组，其新生骨主要分布在缺损边缘，及AS边缘，再一次证实了“边缘效应”存在于AS中。
我们进一步对组织样进行了病理切片分析。
如图8A-B所示，新生骨荧光标记结果，荧光的强度表示新生骨体积的多少。NAC/MS组的荧光强度明显高于其它各组，证实了前面的micro-CT结果。图8C马松染色结果显示，加AS和空白对照组在缺损部位几乎无新生骨形成；而AMS组中能够看到大量新生骨组织出现，边缘部位较多；NAC/MS组中的新生骨组织基本已把缺损填满，且还能看见部分未降解的微支架。AMS和NAC/MS两组促骨缺损修复结果的差异表明，“成骨生物引擎”的引入，不仅能促进宿主(比格犬)干细胞的成骨分化和成熟，还能促进其迁移和扩增，其主要原因可能是缓释出的BFP-1改善了成骨微环境。以上实验结果证实了NAC/MS复合支架体系能够快速、有效的促进宿主骨缺损的再生修复。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

Claims (8)

1.纳米多孔微支架在组织再生修复中的应用，其特征在于：所述纳米多孔微支架为纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架；
所述组织再生修复为在缺损组织部位有一定量的相应组织的细胞增殖、分化、形成新的组织；
所述纳米载体为介孔二氧化硅纳米颗粒；
所述海藻酸钠为改性海藻酸钠；
所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架采用液氮速冻高速破碎法制得；
所述海藻酸钠三维多孔微支架在组织再生修复中的应用的具体使用方法为：向制备好的微支架中加入微支架总体积50％～80％的PBS，得到可注射微支架，将其注射于损伤组织部位。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述介孔二氧化硅纳米颗粒为生物活性物质修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒；
所述生物活性物质为具有促进细胞功能维持、增殖和定向分化的蛋白、多肽或者小分子，包括但不限于骨形成蛋白家族系列、血管内皮生长因子、载氧蛋白、阿司匹林、不同类型细胞因子、促胰岛细胞生长因子、促肝脏细胞生长因子以及促心肌细胞生长因子；
所述改性海藻酸钠为RGD多肽共价接枝修饰海藻酸钠；所述改性海藻酸钠的改性方法包括如下步骤：
将EDC/NHS加入海藻酸钠溶液，于室温搅拌4h后，加入RGD多肽搅匀后于4℃静止过夜；接着将该溶液转入透析袋透析3d后冷冻干燥24h；密封，-20℃储藏；
所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架在组织再生修复中的应用的具体使用方法中，还包括在微支架中滴加少许低浓度海藻酸钠溶液充分混匀，再转移至注射器。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架具有三维多孔结构，支架为球状，最小能做成直径为1mm的微球，孔径可根据具体组织特性需求调整，孔径范围为50～300μm。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架的制备方法包括以下步骤：
(1)介孔二氧化硅纳米颗粒的合成：
在圆底烧瓶中加入Pluronic P-123(Sigma)3～9g、去离子水125～130mL和浓HCl18～25mL，剧烈搅拌1.5～4h，充分混匀后将烧瓶置50℃水浴中，搅拌下加入正硅酸乙酯5～10g，搅拌20h；接着升温至80～85℃，静置恒温24～30h；然后离心(5000～6000G)，用去离子水洗涤沉淀，干燥后在马弗炉中煅烧；
(2)纳米载体-海藻酸钠三维多孔支架的制备：
将改性海藻酸钠溶解于去离子水中，与介孔二氧化硅纳米颗粒混合均匀；将混合液置于4℃后置于-20℃，冷冻干燥；加入氯化钙溶液，PBS浸洗后再次冷冻干燥，密封干燥保存；
(3)纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架的制备：
将纳米载体-海藻酸钠三维多孔支架置于离心管中，加入液氮，快速用均质仪将支架破碎；待液氮挥发完全后，加入氯化钙溶液，反应后进行过滤，将所得颗粒进行冷冻干燥，即得纳米载体-海藻酸钠三维多孔微支架。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
步骤(1)中，所述介孔二氧化硅纳米颗粒的合成方法还包括包埋生物活性物质，包括如下步骤：
将介孔二氧化硅纳米颗粒加入生物活性物质溶液中反应，沉淀即为生物活性物质修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒，密封保存；
所述生物活性物质为具有促进细胞功能维持、增殖和定向分化的蛋白、多肽或者小分子，包括但不限于骨形成蛋白家族系列、血管内皮生长因子、载氧蛋白、阿司匹林、不同类型细胞因子、促胰岛细胞生长因子、促肝脏细胞生长因子以及促心肌细胞生长因子；
步骤(2)中，所述改性海藻酸钠为RGD多肽共价接枝修饰海藻酸钠，其改性方法包括如下步骤：
将EDC/NHS加入海藻酸钠溶液，于室温搅拌4h后，加入RGD多肽搅匀后于4℃静止过夜；接着将该溶液转入透析袋透析3d后冷冻干燥24h；密封，-20℃储藏；
步骤(3)中，液氮加入量为离心管容积的10％～45％；氯化钙溶液的终浓度为2％(w/v)，交联反应2～15min；采用均质仪高速破碎支架所用转速为20,000～40,000rpm，高速破碎30s～2min；所述过滤采用孔径1.2～1.5mm的标准筛。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述组织包括但不限于心肌、肝脏、胰腺、神经、组织工程皮肤、成骨、软骨、脊髓、组织工程耳朵和膀胱；
所述纳米多孔微支架在组织再生修复中的应用可通过以下四种方式使用：
一，可以不包埋任何组织细胞直接注射到相应的部位；二，微支架中包埋某一组织的组织细胞，然后注射到相应的部位；三，微支架中包埋具有治疗作用的蛋白、多肽或者小分子，直接注射到相应的组织；四，以上三种混合使用；
所述纳米多孔微支架可应用于制备组织再生修复材料、制备促进干细胞增殖材料、制备提高干细胞贴壁性能材料、制备促进干细胞分化材料、制备促进组织自我再生修复材料。
7.根据权利要求6所述纳米多孔微支架在促进干细胞增殖中的应用，其特征在于：所述干细胞包括但不限于神经干细胞、心肌细胞、骨髓间充质干细胞、间质干细胞、肝脏细胞、成肌细胞和胰岛细胞。
8.根据权利要求6所述纳米多孔微支架在促进干细胞分化中的应用，其特征在于：所述干细胞包括但不限于神经细胞、心肌细胞、骨髓间充质干细胞、间质干细胞、肝脏细胞、成肌细胞和胰岛细胞。
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