CN111424009B - 多孔纳米材料在调控胚胎干细胞多能性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明针对传统的维持胚胎干细胞多能性所需的白血病抑制因子(LIF)存在的价格昂贵、稳定性差等问题，创造性的应用多孔纳米材料来调控小鼠胚胎干细胞的多能性。多孔纳米材料(有机多孔纳米材料和无机多孔纳米材料)能够在不添加白血病抑制因子(LIF)的培养条件下，对胚胎干细胞多能性具有调控作用。多孔纳米材料拥有良好的生物相容性，节约成本，利于储存等优点，将更好地推动胚胎干细胞的基础研究及应用。

Description

多孔纳米材料在调控胚胎干细胞多能性中的应用
技术领域
本发明属于干细胞多能性调控的领域，具体涉及多孔纳米材料在胚胎干细胞培养中对其多能性进行调控的应用。
背景技术
胚胎干细胞是来源于胚泡内细胞团(ICM)的细胞，其具有自我更新及分化两种特性。自我更新是细胞在相同状态下增殖的能力，分化是具有发育成所有细胞谱系的能力。在人体衰老或病理状态下，干细胞可以通过分化为多种类型的细胞，也可以通过旁分泌作用直接刺激组织再生或招募细胞因子促进组织修复。基于上述特点，干细胞在临床医学领域的研究迅速发展，干细胞临床试验涉及脊髓损伤、多发性硬化、中风、肌萎缩侧索硬化症、老年痴呆症、骨关节炎、股骨头坏死、椎间盘退化、心肌梗死、肝硬化、克罗恩病、间质性肺病、系统性红斑狼疮、勃起功能障碍以及卵巢早衰等等上百种疾病。但是，相关研究成果的临床转化还面临诸多问题。
国内外关于鼠胚胎干细胞培养主要有以下几种方法：目前，胚胎干细胞的多能性主要是通过白血病抑制因子(Lif)以及通过鼠源滋养层细胞分泌细胞因子来维持。细胞外基质信号调节激酶(MEK)和糖原合成激酶(GSK-3)的抑制剂(2i)也用于维持胚胎干细胞的多能性。然而，一方面，鼠源滋养层细胞提取比较繁琐，并且面临着临床应用时动物源性细胞安全问题的风险。另一方面，Lif以及小分子抑制剂的费用及储存等问题也成为细胞治疗临床转化方面的障碍。
作为近年来新兴的功能性多孔材料，多孔框架材料(如金属有机纳米笼材料，MOPs；金属-有机框架材料，MOFs；多孔二氧化硅纳米材料,SiO2)，凭借高比表面积、孔道大小可调、结构多样、易于修饰、优良的热稳定性及化学稳定性等优点，其在气体吸附与分离、传感器、催化、药物传递等领域的应用发展迅猛。多孔纳米材料在干细胞多能性调控方面的研究未见报道。纳米技术作为一门新型交叉学科，现如今已经成为前沿热点研究领域。纳米材料本身具有尺寸效应、比表面积大以及多种特有的物理化学性质，其对于干细胞表型、细胞活性及多能性具有一定的调节作用。有研究表明石墨烯纳米材料、水凝胶等材料通过调控细胞骨架蛋白，影响胚胎干细胞自我更新与分化。
本发明针对传统胚胎干细胞多能性调节因子存在的稳定性差、造价昂贵等问题，创造性地筛选和设计多孔纳米材料作为调节因子，利用其易于修饰，高稳定性，高比表面积和多孔性等优良特性，制备新型胚胎干细胞多能性调节制剂，以克服传统材料在胚胎干细胞领域应用的限制。进一步的探讨多孔纳米材料调节胚胎干细胞自我更新与分化能力及可能机制，能够为其在再生医学中的应用提供理论依据与技术基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控胚胎干细胞多能性的多孔纳米材料，其特征在于多孔纳米材料作为制剂用来调控干细胞的多能性。
本发明提供一种多孔纳米材料在制备干细胞多能性调控剂方面的用途，其特征在于，所述多孔纳米材料为有机多孔纳米材料或无机多孔纳米材料。
优选的，所述有机多孔纳米材料为金属有机笼材料。
优选的，所述金属有机笼材料为VMOP-1、VMOP-2或VMOP-3。
优选的，所述无机多孔纳米材料为多孔二氧化硅纳米材料。
优选的，本发明提出的应用，具体步骤如下：
(1)多孔纳米材料的制备。
(2)采用完全培养基培养胚胎干细胞24小时后，在不含Lif因子的基础培养基中添加步骤(1)得到的多孔纳米材料，继续进行干细胞培养；所述基础培养基包括以下成分：DMEM培养基、15％FBS血清、1％谷氨酰胺(100X)、1％双抗(100X)、1％非必需氨基酸(100X)500μL、β-巯基乙醇1mmol/L；
(3)通过碱性磷酸酶染色、检测多能性相关基因蛋白、检测经多孔纳米材料处理的胚胎干细胞的多能性。
优选的，所述细胞培养包括但不限于贴壁培养、悬浮培养。
优选地，本发明所述的干细胞包括但不限于小鼠的胚胎干细胞、大鼠的胚胎干细胞、人的胚胎干细胞中的任意一种。
优选的，在步骤3)中检测小鼠胚胎干细胞在裸鼠上畸胎瘤形成能力，说明该细胞仍具有多潜能性。
优选地，本发明所述的干细胞的多能性包括但不限于自我更新、分化。
优选地，本发明所述的金属有机笼材料(MOPs)，包括但不限于VMOP-1、VMOP-2、VMOP-3。
金属有机纳米笼材料(Metal organic polyhedras，MOPs)是由金属离子(或金属簇)以及具有特定官能团和形状的有机配体来合成，因此可以根据需要来设计合成孔道尺寸和形状合适的、高比表面积和高孔道率的、具有良好热和溶剂稳定性的材料。
本发明提出了多孔纳米材料用于干细胞培养领域的新用途，在无白血病抑制因子(Lif)存在的情况下，能够调控胚胎干细胞的多能性。使用化学制剂替代原有生物制剂，节约成本，简化流程，也解决了生物制剂的储存要求高的问题。
附图说明：
图1：多孔有机纳米材料(VMOP-2)粉末衍射图。
图2：多孔有机纳米材料(VMOP-2)扫描电镜图。
图3：多孔有机纳米材料(VMOP-2)在PBS溶液中的紫外吸收光谱随时间的变化。
图4：使用添加VMOP-2材料的培养基培养的小鼠胚胎干细胞(右)碱性磷酸酶染色结果；使用不添加VMOP-2材料的培养基培养的小鼠胚胎干细胞(左)碱性磷酸酶染色结果。标尺，50μm。
图5：蛋白质免疫印迹检测使用添加VMOP-2材料培养基培养的小鼠胚胎干细胞自我更新相关蛋白的表达。
图6：苏木素伊红染色(Hematoxylin and eosin,HE)检测使用添加VMOP-2材料培养基培养的小鼠胚胎干细胞体内分化成内胚层、中胚层、外胚层三个胚层的情况，箭头分别指示上皮组织(内胚层)，骨组织(中胚层)，神经组织(外胚层)。标尺，50μm。
图7：逆转录PCR(Reverse transcription PCR)检测使用添加SiO2材料培养基体外分化过程中外胚层相关基因Msil的表达情况。
具体实施方式：
通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。这些实施例完全是例证性的，他们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1
VMOP-2的制备。
称取0.03g氯化钒，0.02g 2-氨基对苯二甲酸放于20mL高温反应釜中，并向其中加入2mL N，N-二甲基甲酰胺和0.5mL无水乙醇。将该体系放入烘箱中，150℃持续加热48小时。反应结束后，将反应混合物离心，弃上清液，得到黄绿色固体，用无水乙醇多次洗涤。放入干燥器内，室温干燥24小时。图1:粉末衍射数据表明合成的VMOP-2与其结构模拟结果一致，说明VMOP-2制备成功。图2：扫描电子显微镜结果表明VMOP-2晶体为正八面体结构。
VMOP-1的制备。
称取0.03g氯化钒，0.02g 2-对苯二甲酸放于20mL高温反应釜中，并向其中加入2mL N，N-二甲基甲酰胺和0.5mL无水乙醇。将该体系放入烘箱中，150℃持续加热48小时。反应结束后，将反应混合物离心，弃上清液，得到黄绿色固体，用无水乙醇多次洗涤。放入干燥器内，室温干燥24小时。
VMOP-3的制备。
称取0.03g氯化钒，0.02g 2-溴基对苯二甲酸放于20mL高温反应釜中，并向其中加入2mL N，N-二甲基甲酰胺和0.5mL无水乙醇。将该体系放入烘箱中，150℃持续加热48小时。反应结束后，将反应混合物离心，弃上清液，得到黄绿色固体，用无水乙醇多次洗涤。放入干燥器内，室温干燥24小时。
用乙醇对上述所得固体进行溶剂交换，保持每天交换4次的频率，交换三天，将所得固体室温下自然晾干。即得到维持干细胞多能性的制剂。
实施例2
将1mg VMOP-2材料溶解于1mL PBS溶液中，分别于1小时，1天，2天，3天，4天取出，利用紫外分光光度计对VMOP-2溶液进行全波长扫描(200-800nm)。结果如图3所示，VMOP-2紫外光谱至4天时仍能保持一致，证明该材料在溶液状态下稳定性保持良好。
实施例3
VMOP-2对小鼠胚胎干细胞自我更新的调控
(1)碱性磷酸酶染色检测本发明纳米材料对干细胞自我更新的调控：将指数期的胚胎干细胞铺于六孔板中，待细胞贴壁后，将实验组原有培养基中传统多能性制剂Lif更换为VMOP-2，将原有含有多能性制剂Lif的培养基更换为不含有Lif的培养基作为对照组，放到CO2恒温培养箱培养48小时。吸走上清，4％多聚甲醛固定，缓冲液清洗1-2遍。配制BCIP/NBT染色工作液3.03mL，具体方法如下：在3mL碱性磷酸酶显色缓冲液中，加入BCIP溶液(300×)10μL,NBT溶液(150×)20μL，混合均匀。在最后一次洗涤完毕后，吸去洗涤液，加入适量染色液，室温避光孵育5-30min。吸走上清，缓冲液清洗1-2遍后镜下观察。实验结果见图4，由图4可知，材料处理的细胞碱性磷酸酶染色比对照组细胞深，表明多孔材料VMOP-2可以维持胚胎干细胞的自我更新，标尺:50μm。
(2)蛋白质免疫印迹在细胞水平检测本发明纳米材料处理胚胎干细胞自我更新相关蛋白的表达：将指数期的胚胎干细胞细胞铺于六孔板中，待细胞贴壁后，将实验组原有培养基中传统多能性制剂Lif更换为VMOP-2，将原有含有多能性制剂Lif的培养基更换为不含有Lif的培养基作为对照组，放到CO2恒温培养箱培养48h。吸走上清，用PBS清洗1-2遍，加入90μL蛋白裂解液处理细胞30min，以13400r转速4℃离心15min，100℃加热10min使蛋白变性。配制10％SDS-PAGE分离胶，将处理好的样本按照顺序加入到上样孔中，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。取与胶同样大小PVDF膜，以甲醇处理后浸泡于转移缓冲液待用。按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。将转移夹放入转移槽，以250mA,电流转模1.5h。封闭后，使用多能性蛋白八聚体结合转录因子4(Octamer-bindingtranscription factor 4，OCT4)一抗4℃孵育过夜。次日，二抗室温孵育1h后曝光。实验结果见图5，由图5可知，使用β微管蛋白(β-Tubulin)蛋白作为体系内参，VMOP-2处理的细胞多能性蛋白OCT4表达明显高于对照组细胞，表明多孔材料VMOP-2能够维持胚胎干细胞的自我更新能力。
(3)畸胎瘤实验在动物水平检测本发明纳米材料处理胚胎干细胞的多能性：购买6-8周龄的雌性裸鼠，按照体重腹腔注射10μL/g水合氯醛溶液(质量体积比为4％)使其处于麻醉状态。将104-106个VMOP-2处理的胚胎干细胞与相同数目的对照组胚胎干细胞分别皮下注射到裸鼠肩部左右侧，使用游标卡尺测量畸胎瘤的体积。一个月后，按照体重腹腔注射10μL/g水合氯醛溶液(质量体积比为4％)使其处于麻醉状态,进行开胸手术使其暴露心脏，将注射器针头刺入左心室，剪破右心耳，先注射生理盐水冲洗血管，然后用4％多聚甲醛溶液灌注固定。剪开后背皮肤，小心剥离肿瘤，置于4％多聚甲醛中固定。将已经固定组织放入石蜡包埋盒中做好标记，并通过梯度乙醇、二甲苯完成脱水、透明及包埋过程。将包埋的石蜡块切成5μm薄片，置于40℃温水中展平，使用粘附载玻片捞出并放于烘片机烘片。按照脱水步骤相反的顺序梯度复水。苏木素染色3min，伊红染色15s，流水冲洗。依次放入在75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇(1)、100％乙醇(2)脱水，在各个浓度溶液中维持10min。依次放入二甲苯(1)、二甲苯(2)中透明，在两种溶液中维持10min。中性树胶封片。使用显微镜观察畸胎瘤内、中、外三个胚层的分化情况。实验结果见图6，由图6可知，材料处理的细胞可以体内分化成三个胚层的组织，包括：柱状上皮(内胚层)、骨(中胚层)、神经(外胚层)，表明本发明VMOP-2制剂培养的胚胎干细胞具有发育成所有三个胚层多种组织的能力，标尺:50μm。
实施例4
SiO2纳米材料对小鼠胚胎干细胞分化的调控
将指数期生长的胚胎干细胞消化成单细胞，在1000rpm的转速下离心5min。吸走上清，使用含有SiO2的EB培养基重悬细胞，使用不含有SiO2的EB培养基重悬的细胞作为对照组，并将其接种于不粘附的培养皿进行悬浮培养，于37℃、5％CO2培养箱中培养使其形成EB，随后将培养皿中形成的EB接种于预先铺有基质胶的EB培养基。待EB贴壁两天后，收集细胞样本置于1mL Trizol，混匀静置5分钟，加入0.2mL氯仿后用力振荡15s后静置2min。于12000g的条件下4℃离心15min，加入0.5mL异丙醇混匀后，室温静置10min。于12000g的条件下4℃离心10min，加入75％乙醇，混匀后在7500g的条件下4℃离心5min。晾干后适量dd H2O溶解，作为模板反转形成mRNA,再进行逆转录(reverse transcription,RT)与PCR，检测目的基因Msil(神经干细胞高表达)的表达情况。实验结果见图7，由图7可知，与不含有SiO2制剂对照组相比，SiO2处理的细胞体外分化过程中Msil表达上调。说明本发明中SiO2制剂促进胚胎干细胞发育成外胚层神经组织。

Claims (5)

1.一种多孔纳米材料在体外调控胚胎干细胞多能性方面的应用，其特征在于，所述有机多孔纳米材料为金属有机笼材料，所述金属有机笼材料为VMOP-1、VMOP-2或VMOP-3。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：(1)多孔纳米材料的制备；(2)采用完全培养基培养胚胎干细胞24小时后，在不含Lif因子的基础培养基中添加步骤(1)得到的多孔纳米材料，继续进行干细胞培养；所述基础培养基包括以下成分：DMEM培养基、15％FBS血清、1％谷氨酰胺(100×)、1％双抗(100×)、1％非必需氨基酸(100×)500μL、β-巯基乙醇1mmol/L；(3)通过碱性磷酸酶染色、检测多能性相关基因蛋白、检测经多孔纳米材料处理的胚胎干细胞的多能性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞培养为贴壁培养或悬浮培养。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述多能性为细胞自我分化或更新。
5.根据权利要求1-3任一项中所述的应用，其特征在于，所述干细胞为小鼠的胚胎干细胞、大鼠的胚胎干细胞、人的胚胎干细胞中的任意一种。
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