CN115354029B - 神经类器官的制备方法和神经类器官 - Google Patents
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Abstract
本发明属于类器官技术领域,尤其涉及一种神经类器官的制备方法和神经类器官,所述方法包括以下步骤:对人脂肪间充质干细胞进行分化培养;其中,所述分化培养依次包括:成球培养、神经诱导培养;所述成球培养,包括在成球培养基中对人脂肪间充质干细胞进行培养;在允许细胞成熟为神经元的条件下培养上述的培养物,以获得所述神经类器官。通过对成本较低的人脂肪间充质干细胞进行处理,使用分阶段的培养方案,可以更快、更简便地获取到神经类器官。
Description
技术领域
本发明属于类器官技术领域,尤其涉及一种神经类器官的制备方法和神经类器官。
背景技术
大脑类器官/神经类器官是一种体外模拟人类大脑发育和疾病发病机理的细胞3D培养组织,为体外研究类器官提供了一个很好的平台。上述类器官可以用作研究神经的发育机制以及研究神经疾病的发病机制,并进一步用于神经疾病的药物筛选。目前获得的类器官大都是只具有单一功能单元,而人类大脑是包含多模块功能单元,且各个模块之间会产生交互连接。已有研究者通过融合或者是包埋形态发生素的方法获得不同模块的类器官来研究神经元之间的相互投射和迁移。大脑类器官是一种新兴的大脑研究模型,具有人类大脑的关键特征, 如多种大脑特异性细胞类型、顶-基底极性、神经干细胞的分裂和神经元迁移模式等。与传统动物模型相比,大脑类器官模型不存在种属差异,具有和人体高度相关的结构与细胞类型;与二维培养模型相比,具有与体内相似的细胞微环境、具有多种大脑细胞种群、能够模拟大脑中的神经电信号等优势。因此体外大脑类器官的构建为研究人类大脑发育和疾病 提供了一个有效的模型系统。
现有的大脑类器官/神经类器官的培养方案均为下述培养方案或其变体,主要包括四个阶段:拟胚体形成、神经外胚层诱导、神经上皮分化和大脑类器官成熟。现有技术中通常使用人胚胎干细胞,而人胚胎干细胞价格昂贵,还具有胚胎干细胞培养条件苛刻,技术要求较高;获取困难,存在伦理争议的缺点。
发明内容
本申请提供了一种神经类器官的制备方法和神经类器官,以解决现有神经类器官成本较高且培养周期长的技术问题。
第一方面,本申请提供了一种神经类器官的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(1)对人脂肪间充质干细胞进行分化培养;其中,所述分化培养依次包括:成球培养、神经诱导培养;
所述成球培养,包括在成球培养基中对人脂肪间充质干细胞进行培养,所述成球培养基包含:LG-DMEM培养基、碱性成纤维生长因子、转化生长因子-β、维生素C、透明质酸钠;
其中,碱性成纤维生长因子在所述成球培养基的浓度为8-10ng/ml,转化生长因子-β的浓度为0.8-1ng/ml、维生素C的浓度为45-50ug/ml、透明质酸钠的浓度为0.8-1ug/ml;
(2)在允许细胞成熟为神经元的条件下培养步骤(1)的培养物,以获得所述神经类器官。
在本申请的一方面的实施例中,所述神经诱导培养包括在含核糖核酸和脱氧核糖核酸的神经诱导培养基中进行培养,所述神经诱导培养基包含:二甲基亚砜、丁基羟基茴香醚和透明质酸钠;
其中,二甲基亚砜在所述神经诱导培养基中的质量浓度为0.8%-1%;丁基羟基茴香醚的质量浓度为90-100μM ;透明质酸钠的质量浓度为0.8-1μg/ml。
在本申请的一方面的实施例中,所述步骤(2)培养包括在含Neurobasal基础培养基中进行培养,
所述Neurobasal基础培养基还包含:表皮细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、脑 源性神经营养因子、B27细胞添加剂、透明质酸钠和Y27632二盐酸盐;
其中,表皮细胞生长因子在所述Neurobasal基础培养基中的质量浓度为8-10ng/ml;碱性成纤维生长因子的质量浓度为8-10ng/ml;脑源性神经营养因子的质量浓度为45-50ng/ml;透明质酸钠的质量浓度为0.8-1μg/ml;Y27632二盐酸盐的质量浓度为0.08-0.1ng/ml。
在本申请的一方面的实施例中,所述成球培养的时间为20-24h;和/或,
所述神经诱导培养的时间为40-48h;和/或,
所述步骤(2)培养的时间为4-5天。
在本申请的一方面的实施例中,步骤(1)和步骤(2)中所述的培养在低吸附细胞培养皿中进行;和/或,
所述步骤(1)和步骤(2)中所述的培养分别独立的非贴壁细胞培养皿中进行;和/或,
步骤(2)中所述的培养在震荡条件下进行。
在本申请的一方面的实施例中,所述成球培养还包括,将容纳有人脂肪间充质干细胞培养基置于37℃、5%CO2的细胞培养箱培养。
在本申请的一方面的实施例中,所述成球培养之后,人脂肪间充质干细胞以聚团的方式生长。
第二方面,本申请实施例提供了一种神经类器官,所述神经类器官由第一方面所述的方法得到。
在本申请的一方面的实施例中,所述神经类器官的形状为球缺形;优选为一个球被平面截下一部分后的形状;优选为外周随机分布神经花环状结构。
第三方面,本申请实施例提供了第二方面所述的大脑类器官模型在神经机制研究、神经疾病模型、神经药物开发及神经毒性分析中的应用。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点:
本申请实施例提供的该方法,通过对成本较低的人脂肪间充质干细胞进行处理,使用分阶段的培养方案,可以更快、更简便地获取到神经类器官;提供了一种低成本制备神经类器官且培养周期短的制备方法。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分,示出了符合本发明的实施例,并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍,显而易见地,对于本领域普通技术人员而言,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例的诱导过程细胞形态图;
图2为本申请实施例和对比例提供的类器官中代表性神经类基因的表达情况。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本申请的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的,并不是旨在限制本发明的保护范围。例如,室温可以是指10~35℃区间内的温度。
本文中,在培养的第1-5天(例如第1-4天,第1-3天,第1-2天,第2-4天,第2-3天,第3-5天,第3-4天或第4-5天,例如第1天,第2天,第3天,第4天或第5天)。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等,均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
BFGF(碱性成纤维细胞生长因子)是具有多功能的细胞生长因子,由146个氨基酸组成的活性多肽,通过促进表皮细胞生长及迁移来减少和预防皱纹的产生,能促进成纤维细胞分裂,从而促进胶原蛋白和弹性蛋白的形成,减轻皮肤色素的沉着,增强皮肤弹性,使肌肤养分充足,肤色红润。
转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。这一家族除TGF-β外,还有活化素(activins)、抑制素(inhibins)、缪勒氏管抑制质(Mullerian inhibitor substance,MIS)和骨形成蛋白(bone morpho-genetic proteins,BMPs),具有调节细胞转录状态、细胞功能和细胞命运决定的作用。
α-MEM细胞培养基,又称低限量Eagle培养基(Minimal Essential Medium),在Eagle's基础培养基(BME)上修改而来,删去赖氨酸、生物素,氨基酸浓度增加,适合多种细胞单层生长,有可高压灭菌品种,是一种最基本、适用范围最广的培养基,但因其营养成分所限,针对生产之特定细胞培养与表达时,并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。
二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物,是一种渗透性保护剂,能够降低细胞冰点,减少冰晶的形成,减轻自由基对细胞损害,改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。
B27添加剂是无血清添加剂,用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性。B-27 添加剂是50X 的液体,可以与Neurobasal 培养基或Neurobasal-A培养基组合使用,用于神经细胞培养而不需要再添加饲养层细胞。B27添加剂,是一个复杂的产品,使用的时候在标准品的基础上稀释100倍。
BHA一般指丁基羟基茴香醚,又名叔丁基-4-羟基茴香醚、丁基大茴香醚,简称BHA,为两种成分(3-BHA和2-BHA)的混合物。分子式为C11H16O2,相对分子质量为180.25。丁基羟基茴香醚的抗氧化作用是由它放出氢原子阻断油脂自动氧化而实现。
EGF,一般指表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor),是人体内分泌的一种重要细胞生长因子,有很强的生理活性。
脑源性神经营养因子(BDNF)是一种蛋白质,你可以把它看作是大脑的肥料。BDNF帮助大脑产生新的神经连接,修复衰竭的脑细胞,并保护健康的脑细胞。
透明质酸钠,化学式为(C14H20NO11Na)n,是人体内一种固有的成分,是一种葡聚糖醛酸,没有种属特异性,它广泛存在于胎盘、羊水、晶状体、关节软骨、皮肤真皮层等组织、器官中。它分布在细胞质、细胞间质中,对其中所含的细胞和细胞器官本身起润滑与滋养作用。
Y27632二盐酸盐,Y-27632作用于PKC,cAMP依赖的蛋白激酶和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)几乎没有活性,Ki分别为26μM,25μM,和>250μM。Y-27632通过选择性抑制CaY-27632处理,阻断Rho调节的肌动球蛋白的激活,也阻断LPA刺激的MM1细胞入侵活性,Chemicalbook这种作用存在浓度依赖性。10μMY-27632处理在无血清悬浮(SFEB)培养基中的人类胚胎干细胞(hES),显著减少分离诱导的凋亡,提高克隆效率(从1%提高到约27%),转基因后促进亚克隆,且使SFEB培养的hES细胞存活及分化成Bf1+皮质和基底端脑祖细胞。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题,总体思路如下:
根据本发明一种典型的实施方式,提供了一种神经类器官的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(1)对人脂肪间充质干细胞进行分化培养;其中,所述分化培养依次包括:成球培养、神经诱导培养;所述成球培养,包括在成球培养基中对人脂肪间充质干细胞进行培养,所述成球培养基包含:LG-DMEM培养基、碱性成纤维生长因子、转化生长因子-β、维生素C、透明质酸钠;
其中,碱性成纤维生长因子在所述成球培养基的浓度为8-10ng/ml,转化生长因子-β的浓度为0.8-1ng/ml、维生素C的浓度为45-50ug/ml、透明质酸钠的浓度为0.8-1ug/ml;
(2)在允许细胞成熟为神经元的条件下培养步骤(1)的培养物,以获得所述神经类器官。
根据本申请实施例,分化培养依次包括:成球培养、神经诱导培养可以利用人脂肪间充质干细胞培养出神经类器官,采用成球培养基中取出血清等贴壁相关因子,使得细胞悬浮聚团生长。聚团的细胞在进行神经分化诱导,使得诱导出的神经细胞在三维空间中相互链接。实际上是利用间充质非贴壁状态下自动聚集的特性,使得细胞先聚集后分化,分化过程在三维空间进行,更有利于分化出的神经细胞相互链接。利用分化过程中细胞自组装特性,使得更接近体内状态;克服了利用人脂肪间充质干细胞进行分化培养的问题,且人脂肪间充质干细胞培养相对简单成熟,对技术要求相对较低;比较容易获取,不存在伦理争议。
根据本申请实施例,本申请的方法主要包括间充质干细胞成球培养、神经诱导培养、类器官成熟三个主要步骤。
根据本申请的实施例,上述方法可以在3-14天制备出分化成熟稳定的神经类器官,优选的3-8天可以制备出来。如用40天以上的时间制备出成熟稳定的神经类器官,则该神经类器官具有特定部位的神经细胞的功能,该神经类器官更为复杂和精准。
在一些实施例中,LG-DMEM培养基按4×105-5×105细胞/ml悬浮,若密度过低,则存在短时间内细胞难以融合,不易成为球状胚体,不易具有一定厚度的大脑类器官的缺点;若密度过高,则影响细胞开始分化时的状态,培养过程中死细胞过多。
在一些实施例中,所述神经诱导培养包括在含核糖核酸和脱氧核糖核酸的神经诱导培养基中进行培养,所述神经诱导培养基包含:二甲基亚砜、丁基羟基茴香醚和透明质酸钠;
其中,二甲基亚砜在所述神经诱导培养基中的质量浓度为0.8%-1%;丁基羟基茴香醚的质量浓度为90-100μM ;透明质酸钠的质量浓度为0.8-1μg/ml。
根据本申请实施例,神经诱导培养,采用含核糖核酸和脱氧核糖核酸的神经诱导培养基中二甲基亚砜,可以促进间充质干细胞的神经分化;透明质酸钠可以使得三维条件下生长的细胞外基质更稳定,有利于神经类器官的形成;克服了利用人脂肪间充质干细胞进行神经诱导的分化效率低、类器官不均一和不稳定的困难,使得获得的类器官更均一和稳定。
在一些实施例中,所述步骤(2)培养包括在含Neurobasal基础培养基中进行培养,所述Neurobasal基础培养基还包含:表皮细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、脑源性神经 营养因子、B27细胞添加剂、透明质酸钠和Y27632二盐酸盐;
其中,表皮细胞生长因子在所述Neurobasal基础培养基中的质量浓度为8-10ng/ml;碱性成纤维生长因子的质量浓度为8-10ng/ml;脑源性神经营养因子的质量浓度为45-50ng/ml;透明质酸钠的质量浓度为0.8-1μg/ml;Y27632二盐酸盐的质量浓度为0.08-0.1ng/ml。
根据本申请实施例,神经上皮分化培养,采用Neurobasal基础培养基经过优化和验证的神经细胞培养成球培养体系,我们采用该体系作为基础有利于神经类器官的形成、存活和功能稳定。
在一些实施例中,所述成球培养的时间为20-24h,间充质干细胞自动聚集成团的积极作用。
在一些实施例中,所述神经诱导培养的时间为40-48h,使得间充质干细胞在恰当的状态下有效往神经方向分化的作用。
在一些实施例中,所述步骤(2)培养的时间为4-5天,成为神经细胞的主要阶段,时间上足够细胞的分化和自组装的作用。
在一些实施例中,步骤(1)和步骤(2)中所述的培养在低吸附细胞培养皿中进行。
根据本申请实施例,由于单层贴壁细胞在生长的过程中会均匀接触到分化因子,从而难以由于因子的浓度梯度、细胞间相互作用等产生具有异质性自组织的结构,因此在大脑类器官培养过程中,需要先将干细胞在低粘附U型底孔板或采用悬滴法形成拟胚体小球,再将经过神经诱导后的拟胚体进行包被基质胶(Matrigel),随后转入至低粘附的培养板或生物反应器中进行动态培养。
在一些实施例中,所述步骤(1)和步骤(2)中所述的培养分别独立的非贴壁细胞培养皿中进行,使得细胞团稳定在三维空间的作用。
现有技术中,利用单层贴壁培养的多能干细胞,通过边界限制其生长范围,一般使用贴壁细胞培养皿,而本申请使用非贴壁细胞培养皿,可以达到稳定细胞外微环境和提高培养规模。
在一些实施例中,步骤(2)中所述的培养在震荡条件下进行,促进细胞外基质的稳定和保障细胞的三维生存状态。
在一些实施例中,所述成球培养还包括,将容纳有人脂肪间充质干细胞培养基置于37℃、5%CO2的细胞培养箱培养,具有可以培养具有活性的人脂肪间充质干细胞。
在本申请的一方面的实施例中,所述成球培养之后,人脂肪间充质干细胞以聚团的方式生长,使悬浮的单个细胞自发用聚集成球,便于脂肪间充质干细胞后续分化为神经类器官。
根据本发明另一种典型的实施方式,提供了一种神经类器官,所述神经类器官由第一方面所述的方法得到。
在本申请的一方面的实施例中,所述神经类器官的形状为球缺形;优选为一个球被平面截下一部分后的形状;优选为外周随机分布神经花环状结构。
第三方面,本申请实施例提供了第二方面所述的大脑类器官模型在神经机制研究、神经疾病模型、神经药物开发及神经毒性分析中的应用。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本发明的方法进行详细说明。
正常培养的人脂肪间充质干细胞可以自己进行制备,可以按照Estes BT,Diekman BO, Gimble JM, Guilak F. Isolation of adipose-derived stem cells andtheir induction to a chondrogenic phenotype. Nat Protoc. 2010 Jul;5(7):1294-311. doi: 10.1038/nprot.2010.81. Epub 2010 Jun 17. PMID: 20595958; PMCID:PMC3219531.文章中记载的方法进行制备。
LG-DMEM培养基:购自Gibco公司,且有两个类型,含HEPES型其中,HEPES型中葡萄糖为1000mg/L,L-谷氨酰胺为4.0mM,丙酮酸钠为110mg/L,HEPES为25mM;不含HEPES型中葡萄糖为1000mg/L,L-谷氨酰胺为4.0mM,丙酮酸钠为110mg/L且其不含HEPES。
α- MEM培养基:购自GIBCO公司,其成分包含核糖核酸和脱氧核糖核酸。
Neurobasal培养基:购自GIBCO公司,其成分包含:胰岛素18-22μg/mL、地塞米松10-15ng/mL、抗坏血酸35-40μg/mL、β-谷甾醇15-25μg/mL、纳米钛酸钡18-22ng/mL、辣木叶提取物18-25ng/mL、脱羧肌肽5-10ng/mL、NGF 20-30mg/mL。
实施例1
本申请提供了一种神经类器官的制备方法,所述方法包括以下步骤:
1、取正常培养的人脂肪间充质干细胞,用LG-DMEM培养基按5×105细胞/ml悬浮,添加10ng/ml的bFGF、1ng/ml的TGF-β1、50ug/ml的vitamin C、1μg/ml的透明质酸钠,接种于非贴壁培养皿,置于37℃、5%CO2的 细胞培养箱培养24小时,24小时后细胞聚团生长,细胞团体积约1-2微米。
2、将聚团生长的人脂肪间充质干细胞悬液取出,800转/分钟离心5分钟,弃掉上清,用LG-DMEM寄出培养基洗细胞1次。加入神经诱导培养基(α-MEM,1%DMSO,100μM BHA,1μg/ml 透明质酸钠),体积至原来细胞培养的总体积,即培养体积不变;移入新的非贴壁培养皿中,置于二氧化碳培养箱继续培养48小时。
3、将步骤2得到细胞团悬液移入离心管,600转/分钟离心5分钟,弃掉上清。细胞团沉淀用Neurobasal寄出培养基洗1次。用Neurobasal培养基(Neurobasal基础培养基,10ng/mlEGF,10ng/ml bFGF,50ng/ml BDNF,1×B27,1μg/ml透明质酸钠,0.1ng/ml Y27632)重新悬浮细胞团块,移入新的非贴壁细胞培养皿,二氧化碳培养箱继续培养。每天更换新鲜培养基,继续培养5天。培养结束,细胞呈球块状。
实施例2
本申请提供了一种神经类器官的制备方法,所述方法包括以下步骤:
1、取正常培养的人脂肪间充质干细胞,用LG-DMEM培养基按5×105细胞/ml悬浮,添加8ng/ml的bFGF、0.8ng/ml的TGF-β1、45ug/ml的vitamin C、0.8μg/ml的透明质酸钠,接种于非贴壁培养皿,置于37℃、5%CO2的 细胞培养箱培养23小时,23小时后细胞聚团生长。
2、将聚团生长的人脂肪间充质干细胞悬液取出,800转/分钟离心5分钟,弃掉上清,用LG-DMEM寄出培养基洗细胞1次。加入神经诱导培养基(α-MEM,0.8%DMSO,90μM BHA,0.8μg/ml 透明质酸钠),体积至原来细胞培养的总体积,移入新的非贴壁培养皿中,置于二氧化碳培养箱继续培养44小时。
3、将步骤2得到细胞团悬液移入离心管,600转/分钟离心5分钟,弃掉上清。细胞团沉淀用Neurobasal寄出培养基洗1次。用Neurobasal培养基(Neurobasal基础培养基,8ng/mlEGF,10ng/ml bFGF,45ng/ml BDNF,1×B27,0.8μg/ml透明质酸钠,0.08ng/ml Y27632)重新悬浮细胞团块,移入新的非贴壁细胞培养皿,二氧化碳培养箱继续培养。每天更换新鲜培养基,继续培养4.5天。培养结束,细胞呈球块状。
实施例3
本申请提供了一种神经类器官的制备方法,所述方法包括以下步骤:
1、取正常培养的人脂肪间充质干细胞,用LG-DMEM培养基按5×105细胞/ml悬浮,添加9ng/ml的bFGF、0.9ng/ml的TGF-β1、48ug/ml的vitamin C、0.9μg/ml的透明质酸钠,接种于非贴壁培养皿,置于37℃、5%CO2的 细胞培养箱培养23.5小时,23.5小时后细胞聚团生长。
2、将聚团生长的人脂肪间充质干细胞悬液取出,800转/分钟离心5分钟,弃掉上清,用LG-DMEM寄出培养基洗细胞1次。加入神经诱导培养基(α-MEM,0.9%DMSO,95μM BHA,0.9μg/ml 透明质酸钠),体积至原来细胞培养的总体积,移入新的非贴壁培养皿中,置于二氧化碳培养箱继续培养44.5小时。
3、将步骤2得到细胞团悬液移入离心管,600转/分钟离心5分钟,弃掉上清。细胞团沉淀用Neurobasal寄出培养基洗1次。用Neurobasal培养基(Neurobasal基础培养基,9ng/mlEGF,9ng/ml bFGF,48ng/ml BDNF,1×B27,0.9μg/ml透明质酸钠,0.09ng/ml Y27632)重新悬浮细胞团块,移入新的非贴壁细胞培养皿,二氧化碳培养箱继续培养。每天更换新鲜培养基,继续培养4天。培养结束,细胞呈球块状。
本申请提供了一种神经类器官的制备方法,所述方法包括以下步骤:
1取正常培养的人脂肪间充质干细胞,用常规的培养人胚胎干细胞的方法进行制备,没有得到神经类器官。
性能检测
将实施例和对比例得到的类器官进行检测,将实施例1中步骤3中的球块状细胞团在诱导1天和5天分别取样,转录检测Nestin,GFAP,TUB-Ⅲ,NeuN,MAP2,CHAT表达量,将对比例得到细胞团转录检测Nestin,GFAP,TUB-Ⅲ,NeuN,MAP2,CHAT表达量,结果如图2所示,图2中,横坐标为上述不同的神经细胞中具有代表性的基因,纵坐标为差异倍数,诱导5天后与诱导1天后的细胞中,诱导5天后基因的表达远远高于诱导1天后的细胞,说明了诱导5天的细胞已经分化为成熟的神经细胞,诱导5天后与诱导1天后的细胞,与对照组的细胞相比,基因表达量高出一大截,说明本申请方法制备的类器官已经成功定向分化为神经类器官。
对实施例的神经类器官制备过程进行记录,得到如图1所示的结果;图1为人脂肪间充质干细胞分化过程中的细胞状态图。MSC代表了脂肪间充质干细胞,D代表天数,D1代表了诱导1天,D3代表了诱导3天,D5代表了诱导5天,D7代表了诱导7天;说明了实施例1得到了立体状或三维的神经类器官。
转录检测的操作方法具体为使用诺为赞生物的试剂盒进行的检测,具体检测方法如其说明书。转录检测的引物如表1所示。
表1荧光定量PCR引物。
应用例1 神经类器官成熟鉴定
对分化5天后,还包括分化10天、15天、20天、25天、35天45天等的类器官进行电生理检测,步骤如下:将成熟的神经类器官经1%低熔点琼脂糖包埋后经LEICA1200T振动切片机切片,厚度300-500µM。之后将其转移至脑片电生理试验台的记录槽后,用自制脑片压网轻轻固定脑片,记录所用电极参数。背景灌流95%O 2 和5%CO 2且37℃加热的人工脑脊液以保持神经类器官的细胞活性,灌流速度约每分钟2mL。放置40倍正置显微镜下,施加正压,接近目标细胞,待电阻上升0.2-0.3MΩ后,释放正压使电极尖端于细胞膜形成高阻封接,吸破细胞膜,形成全细胞记录模式。如GFP+细胞(即,EN1阳性细胞)能检测到钠离子、钾离子电流和动作电位,说明我们获得的跨区域的类器官已经逐步成熟。
应用例2 神经类器官模拟PD发病机理
对培养成熟神经类器官进行组织切片观察,类器官产生了类似于体内成熟神经元的神经束,为研究神经元投射提供了基础。随后,将培养到成熟神经类器官培养基中加入1mM MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶,Sigma D048),MPTP是一种神经毒素,能够通过破坏黑质中产生多巴胺的神经细胞而导致类似于帕金森氏症的症状以模拟PD发病过程。随后对组织切片进行caspase-3(rabbit anti- caspase-3(cell signaling, 9661S, 1:400))、TH(mouse anti-Tyrosine hydroxylase (TH)(Immunostar Systems, 22941, 1:2000))和DARPP32(mouse anti-DARPP32(Santa Cruz ,sc-271111, 1:300))染色,结果显示,MPTP处理后多巴胺神经元(GFP和GFP/MCHERRY)特异性凋亡,而其他神经元(只表达MCHERRY)没有明显变化。上述结果表明获得的神经类器官能作为一个模型来模拟帕金森发病过程,用于机理研究。
需要说明的是,在本文中,诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性地包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式,使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其他实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (6)
1.一种神经类器官的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
步骤(1),对人脂肪间充质干细胞进行分化培养;其中,所述分化培养依次包括:成球培养、神经诱导培养;
所述成球培养,包括在成球培养基中对人脂肪间充质干细胞进行培养,所述成球培养基包含:LG-DMEM培养基、碱性成纤维生长因子、转化生长因子-β、维生素C、透明质酸钠;
其中,碱性成纤维生长因子在所述成球培养基的浓度为8-10ng/ml,转化生长因子-β的浓度为0.8-1ng/ml、维生素C的浓度为45-50ug/ml、透明质酸钠的浓度为0.8-1ug/ml;
步骤(2),在允许细胞成熟为神经元的条件下培养步骤(1)的培养物,以获得所述神经类器官。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述神经诱导培养包括在含核糖核酸和脱氧核糖核酸的神经诱导培养基中进行培养,所述神经诱导培养基包含:二甲基亚砜、丁基羟基茴香醚和透明质酸钠;其中,二甲基亚砜在所述神经诱导培养基中的质量浓度为0.8%-1%;丁基羟基茴香醚的质量浓度为90-100μM ;透明质酸钠的质量浓度为0.8-1μg/ml。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)培养包括在含Neurobasal基础培养基中进行培养,所述Neurobasal基础培养基还包含:表皮细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、脑源性神经营养因子、B27细胞添加剂、透明质酸钠和Y27632二盐酸盐;
其中,表皮细胞生长因子在所述Neurobasal基础培养基中的质量浓度为8-10ng/ml;碱性成纤维生长因子的质量浓度为8-10ng/ml;脑源性神经营养因子的质量浓度为45-50ng/ml;透明质酸钠的质量浓度为0.8-1μg/ml;Y27632二盐酸盐的质量浓度为0.08-0.1ng/ml。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,
所述成球培养的时间为20-24h;和/或,
所述神经诱导培养的时间为40-48h;和/或,
所述步骤(2)培养的时间为4-5天。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,
步骤(1)和步骤(2)中所述的培养在低吸附细胞培养皿中进行;或,
所述步骤(1)和步骤(2)中所述的培养分别独立的非贴壁细胞培养皿中进行;和/或,
步骤(2)中所述的培养在震荡条件下进行。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述成球培养还包括,将容纳有人脂肪间充质干细胞培养基置于37℃、5%CO2 的细胞培养箱培养。
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