CN113493768A - 神经类器官及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够在体外模拟黑质‑纹状体通路的包含多模块结构的神经类器官，以及制备所述神经类器官的方法。本发明进一步提供了所述神经类器官用于疾病研究、药物筛选、脑内移植等用途。

Description

神经类器官及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明提供了能够在体外模拟黑质-纹状体通路的包含多模块结构的神经类器官，以及制备所述神经类器官的方法。本发明进一步提供了所述神经类器官用于疾病研究、药物筛选、脑内移植等用途。
背景技术
人类大脑发育的研究由于缺乏组织样本和合适的体外模型而受到限制。类脑器官是一种体外模拟人类大脑发育和疾病发病机理的细胞3D培养组织，为体外研究类器官提供了一个很好的平台。自从2013年Lancaster第一次获得了人脑类器官之后，科学家们已经在体外获得了前脑、皮层中脑，丘脑以及脊髓等部位的类器官。这些类器官可以用作研究神经的发育机制以及研究神经疾病的发病机制，并进一步用于神经疾病的药物筛选。目前获得的类器官大都是只具有单一功能单元，而人类大脑是包含多模块功能单元，且各个模块之间会产生交互连接。已有研究者通过融合或者是包埋形态发生素的方法获得不同模块的类器官来研究神经元之间的相互投射和迁移。但是通过融合获得的类器官不能捕捉人类大脑所包含的区域多样性的完整连续体。当前大脑类器官的研究趋势是跨脑区多系统类器官的建立，模拟脑功能模块，体现复杂神经元间相互作用。
发明内容
由于大脑不同功能单元的神经元所适合的诱导条件不尽相同，某一类型神经元可能无法耐受其他类型神经元的调控因子，这导致目前通过常规多能干细胞分化方法获得的类器官通常仅具有单一功能单元（例如多巴胺神经细胞）。本申请的发明人通过调节多能干细胞内的WNT信号通路和SHH信号通路成功获得了同时含有黑质-纹状体等多种细胞类型的完整连续体类器官，其可在体外模拟黑质-纹状体通路，为帕金森的发病机制研究以及治疗提供基础，也为体外构建更高级的多器官系统提供技术支持。
由多能干细胞获得神经类器官
在一个方面，本发明提供了获得神经类器官的方法，该方法包括：
(1) 在分化培养基中对多能干细胞进行培养，所述分化培养基包含下述基础组分：添加有N2和B27的基础培养基以及TGF-β信号通路抑制剂；并且，在培养的第1-5天（例如第1-4天，第1-3天，第1-2天，第2-4天，第2-3天，第3-5天，第3-4天或第4-5天，例如第1天，第2天，第3天，第4天或第5天）的任意时间将多能干细胞与(i)GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂和(ii)SHH信号通路激活剂同时或以任何次序接触，以诱导神经外胚层分化；
(2) 在允许细胞成熟为神经元的条件下培养步骤(1)的培养物，以获得神经类器官。
本申请的发明人发现通过调控GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂以及SHH信号通路激活剂的作用时间，能够获得同时表达前脑标记物（例如FOXG1、SOX2）和中脑标记物（例如FOXA2、LMX1A），以及背侧标记物（例如PAX6）和腹侧标记物（例如NKX2.1、FOXA2）的前期类器官。随后通过在神经元成熟条件下的继续培养，进一步形成成熟的同时含有黑质-纹状体细胞类型且能模拟体内分布的完整连续体类器官。
步骤(1)
I. GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂
在某些实施方案中，与所述GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂接触的时间选自12小时到5天的范围，例如12小时到4天，12小时到3天，12小时到2天，12小时到36小时，12小时到24小时，24小时到36小时，24小时到48小时，20小时到30小时，20小时到25小时，25小时到30小时，例如12小时，24小时，36小时，48小时或72小时。
在某些实施方案中，所述GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂选自CHIR99021、BIO、BIO-Acetoxime和Kenpaullone中的一种或多种。在某些实施方案中，所述GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂选自CHIR99021、BIO或Kenpaullone。在某些实施方案中，所述GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂的含量为10nM-10mM，例如100nM-1µM，例如0.5µM-1µM，例如0.5µM或1µM。
II. SHH（Sonic Hedgehog）信号通路激活剂
在某些实施方案中，与所述SHH信号通路激活剂接触的时间选自1天到8天的范围，例如 1天到7天，1天到6天，1天到5天，1天到4天，1天到3天，2天到7天，2天到6天，2天到5天，2天到4天，2天到3天，36小时到7天，36小时到6天，36小时到5天，36小时到4天，36小时到3天，例如1天，36小时，2天，3天或4天。
在某些实施方案中，所述SHH信号通路激活剂选自SAG、GSA 10、Cyclopamine和Purmorphamine中的一种或多种。在某些实施方案中，所述SHH信号通路激活剂选自SAG或Purmorphamine。在某些实施方案中，所述SHH信号通路激活剂的含量为10nM-10mM，例如10nM-1µM，100nM-1µM，例如10nM，0.1µM或1µM。
与上述GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂以及SHH信号通路激活剂接触后，本发明的方法进一步包括将培养物与FGF信号通路激活剂接触。因此，在某些实施方案中，步骤(1)还包括在培养的第7-10天（例如第8-9天，例如第7天，第8天，第9天或第10天）的任意时间将多能干细胞与FGF信号通路激活剂接触。
在某些实施方案中，与所述FGF信号通路激活剂接触的时间选自1天到6天的范围，例如2天到6天，2天到5天，2天到4天，3天到6天，3天到5天，3天到4天，例如1天，2天，3天，4天，5天或6天。
在某些实施方案中，所述FGF信号通路激活剂选自FGF1, FGF2, FGF3, FGF4,FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14,FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23中的一种或多种。在某些实施方案中，所述FGF信号通路激活剂是FGF8。在某些实施方案中，所述FGF信号通路激活剂的含量为1ng/mL -1mg/mL，例如10ng/mL -500ng/mL，50ng/mL -500ng/mL，50ng/mL-400ng/mL，50ng/mL -300ng/mL，50ng/mL -200ng/mL，50ng/mL -150ng/mL，80ng/mL -120ng/mL，例如100ng/mL。
在某些实施方案中，在与所述试剂（例如GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂、SHH信号通路激活剂、FGF信号通路激活剂）接触的时间内，所述方法可以包括更换包含所述试剂的新鲜培养基以维持所述试剂的作用浓度，例如每隔12小时、每隔24小时、每隔36小时或每隔48小时换液。
在某些实施方案中，步骤(1)中所述“在培养的第1-5天的任意时间将多能干细胞与(i)GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂和(ii)SHH信号通路激活剂同时或以任何次序接触”是指，在包含上述基础组分的分化培养基中同时或以任何次序添加(i)和(ii)。
在某些实施方案中，所述TGF-β信号通路抑制剂选自LDN193189、SB431542中的一种或多种。在某些实施方案中，所述TGF-β信号通路抑制剂包含LDN193189和SB431542。在某些实施方案中，所述TGF-β信号通路抑制剂的含量为50nM-20μM，例如100nM-20μM，100nM-15μM，100nM-10μM。在某些实施方案中，所述分化培养基包含50nM-200nM（例如100nM）LDN193189以及5μM-20μM（例如10μM） SB431542。
在某些实施方案中，所述基础培养基选自KnockOut DMEM、KnockOut DMEM/F12、DMEM、DMEM/F12、neurobasal培养基及其任意组合。在某些实施方案中，所述基础培养基包含、KnockOut DMEM/F12和neurobasal培养基。
在某些实施方案中，N2的含量为0.5-2%(v/v)，例如0.5-1%(v/v)，如约1%(v/v)。在某些实施方案中，B27的含量为1-5%(v/v)，例如1-2%(v/v)，如约2%(v/v)。
在某些实施方案中，所述分化培养基包含的基础组分还包括L-谷氨酰胺或其衍生物（例如GlutaMAX）。在某些实施方案中，L-谷氨酰胺或其衍生物的含量为0.5-2%(v/v)，例如0.5-1%(v/v)，如约1%(v/v)。
在某些实施方案中，在与(i)GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂和(ii)SHH信号通路激活剂接触之后以及与FGF信号通路激活剂接触之前，步骤(1)还包括在缺乏GSK-3抑制剂和SHH信号通路激活剂的条件下培养多能干细胞，例如持续1天到6天，1天到5天，1天到4天，1天到3天，1天到2天，2天到3天，2天到4天，例如1天、2天、3天、4天、5天或6天。在某些实施方案中，所述缺乏GSK-3抑制剂和SHH信号通路激活剂的条件可以包括更换不包含上述组分的分化培养基。
在某些实施方案中，在与FGF信号通路激活剂接触之后，步骤(1)还包括在缺乏GSK-3抑制剂、SHH信号通路激活剂以及FGF信号通路激活剂的条件下培养多能干细胞，例如持续1天到10天，2天到10天，3天到10天，4天到10天，5天到10天，6天到10天，7天到10天，8天到10天，例如8天，9天或10天。在某些实施方案中，所述缺乏GSK-3抑制剂、SHH信号通路激活剂以及FGF信号通路激活剂的条件可以包括更换不包含上述组分的分化培养基。
在某些实施方案中，步骤(1)中所述的多能干细胞经在用于维持多能干细胞的生长和扩增的维持培养基中培养，例如培养1-2天。在某些实施方案中，所述维持培养基包含E8培养基。在某些实施方案中，所述维持培养基进一步包含ROCK抑制剂，例如Y-27632。
步骤(2)
在某些实施方案中，步骤(2)所述的允许细胞成熟为神经元的条件包括在成熟培养基中对步骤(1)的培养物进行培养，所述成熟培养基包含下述基础组分：添加有B27的基础培养基。在某些实施方案中，所述成熟培养基还包括选自脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、TGFβ3、抗坏血酸（AA）、cAMP、DAPT中的一种或多种。在某些实施方案中，所述成熟培养基包括抗坏血酸（AA）。在某些实施方案中，所述成熟培养基包括脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、TGFβ3、抗坏血酸（AA）、cAMP、DAPT。
在某些实施方案中，在所述成熟培养基中培养至少5天，至少10天，至少15天，至少20天，至少25天，至少30天，至少35天，至少40天，至少45天或至少50天。本领域技术人员完全有能力根据实际需要选择合适的在成熟培养基中的培养时间。
在某些实施方案中，所述基础培养基选自KnockOut DMEM、KnockOut DMEM/F12、DMEM、DMEM/F12、neurobasal培养基及其任意组合，例如neurobasal培养基。
在某些实施方案中，B27的含量为1-5%(v/v)，例如1-2%(v/v)，如约2%(v/v)。在某些实施方案中，BDNF的含量为：0-100ng/mL，例如10-100ng/mL，20-100ng/mL，例如20ng/mL或100ng/mL。在某些实施方案中，GDNF的含量为：0-100ng/mL，例如10-100ng/mL，20-100ng/mL，例如20ng/mL或100ng/mL。在某些实施方案中，TGFβ3的含量为：0-50ng/mL，例如0.5-50ng/mL，1-50ng/mL，例如1ng/mL或50ng/mL。在某些实施方案中，抗坏血酸AA的含量为：1nM-100mM，例如10nM-100mM，100nM-100mM，1μM-100mM，10μM-100mM，100μM-100mM，200μM-100mM，例如200μM、1mM或100mM。在某些实施方案中，cAMP的含量为：0-100mM，0.1mM-100mM，0.5mM-100mM，例如0.5mM或100mM。在某些实施方案中，DAPT的含量为：0-1mM，例如1μM-1mM，10μM-1mM，例如10μM或1mM。
在某些实施方案中，所述成熟培养基包含的基础组分还包括L-谷氨酰胺或其衍生物（例如GlutaMAX）。在某些实施方案中，L-谷氨酰胺或其衍生物的含量为0.5-2%(v/v)，例如0.5-1%(v/v)，如约1%(v/v)。
在某些实施方案中，步骤(1)和步骤(2)中所述的培养在低吸附细胞培养皿中进行。
在某些实施方案中，步骤(2)中所述的培养在震荡条件下进行。
在某些实施方案中，所述多能干细胞具备神经外胚层分化能力，例如分化形成MSN神经元以及多巴胺神经元的能力。在某些实施方案中，所述多能干细胞是胚胎干细胞（例如人胚胎干细胞）或诱导多能干细胞。在某些实施方案中，所述多能干细胞的内源性LMX1A基因座和EN1基因座分别包含第一报告基因和第二报告基因，其中所述第一报告基因与所述第二报告基因是可检测地不同。在某些实施方案中，所述第一报告基因编码第一荧光蛋白，并且所述第二报告基因编码第二荧光蛋白，其中所述第一荧光蛋白和第二荧光蛋白是可检测地不同。在某些实施方案中，所述第一报告基因和第二报告基因选自编码mCherry或sfGFP的基因。
在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：
(1) 在分化培养基中对多能干细胞进行培养，所述分化培养基包含下述基础组分：添加有N2和B27的基础培养基以及TGF-β信号通路抑制剂；其中：
在培养的第1-5天（例如第1-4天，第1-3天，第1-2天，第2-4天，第2-3天，第3-5天，第3-4天或第4-5天，例如第1天，第2天，第3天，第4天或第5天）的任意时间将多能干细胞与(i)GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂和(ii)SHH信号通路激活剂同时或以任何次序接触，与(i)接触时间选自1天到5天（例如，1天到3天，1天到2天，1天到36小时）的范围，与(ii)的接触时间选自1天到8天（例如，1天到4天，36小时到4天，2天到4天，36小时到2天）的范围；
在培养的第7-10天（例如第8-9天，例如第7天，第8天，第9天或第10天）的任意时间将多能干细胞与FGF信号通路激活剂接触，并持续1天到6天，例如2天到6天，2天到5天，2天到4天，3天到6天，3天到5天，3天到4天，例如1天，2天，3天，4天，5天或6天；
(2) 在允许细胞成熟为神经元的条件下培养步骤(1)的培养物，例如在含有基础培养基、B27、抗坏血酸（AA）的成熟培养基中对步骤(1)的培养物进行培养，例如培养至少5天，至少10天，至少15天，至少20天，至少25天，至少30天，至少35天，至少40天，至少45天或至少50天，以获得神经类器官。
在某些实施方案中，任选地步骤(1)之前还包括将多能干细胞在用于维持多能干细胞的生长和扩增的维持培养基中培养，例如培养1-2天；所述维持培养基包含E8培养基以及ROCK抑制剂，例如Y-27632。
在某些实施方案中，步骤(2)所述的成熟培养基还包括选自脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、TGFβ3、cAMP、DAPT中的一种或多种。
在另一方面，本发明还涉及通过上述方法产生的神经类器官。
神经类器官
在一个方面，本发明提供了一种神经类器官，其包含表达前脑纹状体标志物的第一区域以及表达中脑黑质细胞标志物的第二区域，所述第一区域包含表达中等棘突神经元（MSN神经元）标记物的第一细胞类型，所述第二区域包含表达中脑多巴胺神经元标记物的第二细胞类型，所述第一细胞类型与第二细胞类型之间存在突触连接（Synapticconnection）。
在某些实施方案中，所述表达是蛋白表达。在某些实施方案中，所述表达通过免疫学方法测定，例如通过免疫组化或免疫荧光测定。
在某些实施方案中，所述前脑纹状体标志物选自FOXG1，SOX2，CTIP2，DARPP32和GABA中的一种或多种；和/或，所述中脑黑质细胞标志物选自FOXA2，LMX1A，EN1，TH，DAT中的一种或多种。在某些实施方案中，所述第一区域表达FOXG1、SOX2和CTIP2，所述第二区域表达FOXA2、LMX1A和EN1。
在某些实施方案中，所述MSN神经元标记物选自DARPP32和GABA中的一种或两种；和/或，所述中脑多巴胺神经元标记物选自TH和DAT中的一种或多种。在某些实施方案中，所述第一细胞类型表达DARPP32和GABA，所述第二细胞类型表达EN1、TH和DAT。在某些实施方案中，所述第一细胞类型是MSN神经元，所述第二细胞类型是中脑多巴胺神经元。
在某些实施方案中，所述突触连接是指所述第一细胞类型的突触包围着所述第二细胞类型的胞体。在某些实施方案中，所述突触连接通过突触前标志物（例如，SYN）和突触后标志物（例如，PSD95）共染来确定。
在某些实施方案中，所述第二细胞类型（例如EN1阳性细胞）能检测到钠离子、钾离子电流和/或动作电位，例如通过电生理测定。
在某些实施方案中，所述神经类器官由多能干细胞（例如胚胎干细胞）经体外诱导分化获得。
在某些实施方案中，所述神经类器官由上文中所描述的方法制备。
在某些实施方案中，所述神经类器官是类脑器官。
在另一方面，本发明提供了移植物，其包含本发明的神经类器官。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的神经类器官或上述移植物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液（例如，平衡盐溶液或生理盐水）、分散液、悬浮液或乳液。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以以悬浮液、凝胶、胶体、浆液或混合物的形式进行移植。
神经类器官的应用
在另一方面，本发明提供了如上文中所述的神经类器官、移植物、或药物组合物用于选自下列的一种或多种用途：
(i) 在受试者（例如哺乳动物，例如人）中预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征（例如，静止性震颤、运动迟缓、肌强直和/或姿势平衡障碍）的用途，或者在制备用于在受试者（例如哺乳动物，例如人）中预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征（例如，静止性震颤、运动迟缓、肌强直和/或姿势平衡障碍）的药物中的用途；
(ii) 用于体内移植（例如脑内移植）的用途，或者在制备用于体内移植（例如脑内移植）的药物中的用途，例如所述体内移植用于预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征。
在另一方面，本发明提供了如上文中所述的神经类器官用于选自下列的一种或多种用途：
(i) 用于疾病建模的用途，例如用于制备帕金森病体外模型的用途；
(ii) 用于机理研究的用途，例如用于帕金森病发病机理或致病因素研究的用途；
(iii) 用于药物毒性研究中的用途，例如用于药物神经毒性研究中的用途；
(iv) 用于药物筛选应用中的用途，例如在制备用于筛选预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征（例如，静止性震颤、运动迟缓、肌强直和/或姿势平衡障碍）的药剂的制品中的用途。
在另一方面，本发明还涉及一种体外筛选具有神经毒性的试剂的方法，其包括：
提供如上文中所述的神经类器官；
使所述神经类器官与测试试剂接触；
测定所述神经类器官中神经元（例如多巴胺神经元）的凋亡；
将所述测定结果与不存在所述测试试剂时测定的神经元凋亡进行比较；
其中，如果存在所述测试试剂时的神经元凋亡与不存在所述测试试剂时的神经元凋亡相比增加，表明所述测试试剂具有神经毒性。
在另一方面，本发明还涉及一种制备帕金森病体外模型的方法，其包括：
提供如上文中所述的神经类器官；
在神经毒素存在的条件下培养所述神经类器官，以获得帕金森病体外模型。
在某些实施方案中，所述神经毒素能够导致神经元（例如多巴胺神经元）的凋亡。
在某些实施方案中，所述培养包括在允许细胞成熟为神经元的条件下培养，所述允许细胞成熟为神经元的条件如上文中定义。
在某些实施方案中，所述培养持续12小时到2天，例如12小时到36小时，12小时到24小时，24小时到36小时，1天到2天。
在某些实施方案中，所述神经毒素选自MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)。
在另一方面，本发明提供了通过上述方法产生的帕金森病体外模型。
在另一方面，本发明提供了上述帕金森病体外模型用于选自下列的一种或多种用途：
(i) 用于机理研究的用途，例如用于帕金森病发病机理或致病因素研究的用途；
(ii) 用于药物毒性研究中的用途，例如用于药物神经毒性研究中的用途；
(iii) 用于药物筛选应用中的用途，例如用于筛选预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征（例如，静止性震颤、运动迟缓、肌强直和/或姿势平衡障碍）的药剂的用途。
在另一方面，本发明提供了一种体外筛选用于预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征（例如，静止性震颤、运动迟缓、肌强直和/或姿势平衡障碍）的药剂的方法，该方法包括：
提供上述帕金森病体外模型；
使所述帕金森病体外模型与测试药剂接触；
测定在存在所述测试药剂和不存在所述测试药剂的情况下神经元（例如多巴胺神经元）的凋亡，并且如果神经元凋亡在存在所述药剂的情况下少于不存在所述药剂的情况，则鉴定为具有预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征的药剂。
本申请还包含以下示例性实施方案：
1. 一种神经类器官，其包含表达前脑纹状体标志物的第一区域以及表达中脑黑质细胞标志物的第二区域，所述第一区域包含表达中等棘突神经元（MSN神经元）标记物的第一细胞类型，所述第二区域包含表达中脑多巴胺神经元标记物的第二细胞类型，所述第一细胞类型与第二细胞类型之间存在突触连接（Synaptic connection）。
2. 项目1所述的神经类器官，其中，所述第一区域表达FOXG1，SOX2，CTIP2，DARPP32和GABA中的一种或多种；和/或，所述第二区域表达FOXA2，LMX1A，EN1，TH，DAT中的一种或多种。
3. 项目1或2所述的神经类器官，其中，所述第一细胞类型表达DARPP32和GABA中的一种或多种；和/或，所述第二细胞类型表达EN1、TH和DAT中的一种或多种。
4. 项目1-3任一项所述的神经类器官，其中，所述突触连接是指所述第一细胞类型的突触包围着所述第二细胞类型的胞体。
5. 项目1-4任一项所述的神经类器官，其中，所述神经类器官由多能干细胞（例如胚胎干细胞）经体外诱导分化获得。
6. 移植物，其包含项目1-5任一项所述的神经类器官。
7. 药物组合物，其包含项目1-5任一项所述的神经类器官或项目6所述的移植物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
8. 获得项目1-5任一项所述的神经类器官的方法，该方法包括：
(1) 在分化培养基中对多能干细胞进行培养，所述分化培养基包含下述基础组分：添加有N2和B27的基础培养基以及TGF-β信号通路抑制剂；其中，在培养的第1-5天（例如第1-4天，第1-3天，第1-2天，第2-4天，第2-3天，第3-5天，第3-4天或第4-5天，例如第1天，第2天，第3天，第4天或第5天）的任意时间将多能干细胞与(i)GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂和(ii)SHH信号通路激活剂同时或以任何次序接触，以诱导神经外胚层分化；
(2) 在允许细胞成熟为神经元的条件下培养步骤(1)的培养物，以获得神经类器官。
9. 项目8所述的方法，其中，与所述GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂接触的时间选自12小时到5天的范围，例如12小时到4天，12小时到3天，12小时到2天，12小时到36小时，12小时到24小时，24小时到36小时，24小时到48小时，20小时到30小时，20小时到25小时，25小时到30小时，例如12小时，24小时，36小时，48小时或72小时。
10. 项目8或9所述的方法，其中，与所述SHH信号通路激活剂接触的时间选自1天到8天的范围，例如 1天到7天，1天到6天，1天到5天，1天到4天，1天到3天，2天到7天，2天到6天，2天到5天，2天到4天，2天到3天，36小时到7天，36小时到6天，36小时到5天，36小时到4天，36小时到3天，例如1天，36小时，2天，3天或4天。
11. 项目8-10任一项所述的方法，其中，所述GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂选自CHIR99021、BIO、BIO-Acetoxime和Kenpaullone中的一种或多种；和/或，所述SHH信号通路激活剂选自SAG、GSA 10、Cyclopamine和Purmorphamine中的一种或多种。
12. 项目8-11任一项所述的方法，其中，在与(i)GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂和(ii)SHH信号通路激活剂接触后，步骤(1)进一步包括将多能干细胞与FGF信号通路激活剂接触。
13. 项目12所述的方法，其中，在培养的第7-10天（例如第8-9天，例如第7天，第8天，第9天或第10天）的任意时间将多能干细胞与FGF信号通路激活剂接触。
14. 项目12或13所述的方法，其中，与所述FGF信号通路激活剂接触的时间选自1天到6天的范围，例如2天到6天，2天到5天，2天到4天，3天到6天，3天到5天，3天到4天，例如1天，2天，3天，4天，5天或6天。
15. 项目12-14任一项所述的方法，其中，所述FGF信号通路激活剂选自FGF1,FGF2, FGF3, FGF4, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11,FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22,FGF23中的一种或多种。
16. 项目8-15任一项所述的方法，其中，所述TGF-β信号通路抑制剂选自LDN193189、SB431542中的一种或多种。
17. 项目12-15任一项所述的方法，其中：
在与(i)GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂和(ii)SHH信号通路激活剂接触之后以及与FGF信号通路激活剂接触之前，步骤(1)还包括在缺乏GSK-3抑制剂和SHH信号通路激活剂的条件下培养多能干细胞，例如持续1天到6天，1天到5天，1天到4天，1天到3天，1天到2天，2天到3天，2天到4天，例如1天、2天、3天、4天、5天或6天；和/或，
在与FGF信号通路激活剂接触之后，步骤(1)还包括在缺乏GSK-3抑制剂、SHH信号通路激活剂以及FGF信号通路激活剂的条件下培养多能干细胞，例如持续1天到10天，2天到10天，3天到10天，4天到10天，5天到10天，6天到10天，7天到10天，8天到10天，例如8天，9天或10天。
18. 项目8-17任一项所述的方法，其中，步骤(2)所述的允许细胞成熟为神经元的条件包括在成熟培养基中对步骤(1)的培养物进行培养，所述成熟培养基包含下述基础组分：添加有B27的基础培养基。
19. 项目18所述的方法，其中，所述成熟培养基还包括选自脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、TGFβ3、抗坏血酸（AA）、cAMP、DAPT中的一种或多种。
20. 项目18或19所述的方法，其中，在所述成熟培养基中培养至少5天，至少10天，至少15天，至少20天，至少25天，至少30天，至少35天，至少40天，至少45天或至少50天。
21. 项目8-20任一项所述的方法，其中，步骤(1)和步骤(2)中所述的培养在低吸附细胞培养皿中进行。
22. 项目8-21任一项所述的方法，其中，步骤(2)中所述的培养在震荡条件下进行。
23. 项目8-22任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞是胚胎干细胞（例如人胚胎干细胞）或诱导多能干细胞。
24. 项目1-5任一项所述的神经类器官、项目6所述的移植物、或项目7所述的药物组合物用于选自下列的一种或多种用途：
(i) 在受试者（例如哺乳动物，例如人）中预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征（例如，静止性震颤、运动迟缓、肌强直和/或姿势平衡障碍）的用途，或者在制备用于在受试者（例如哺乳动物，例如人）中预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征（例如，静止性震颤、运动迟缓、肌强直和/或姿势平衡障碍）的药物中的用途；
(ii) 用于体内移植（例如脑内移植）的用途，或者在制备用于体内移植（例如脑内移植）的药物中的用途，例如所述体内移植用于预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征。
25. 项目1-5任一项所述的神经类器官用于选自下列的一种或多种用途：
(i) 用于疾病建模的用途，例如用于制备帕金森病体外模型的用途；
(ii) 用于机理研究的用途，例如用于帕金森病发病机理或致病因素研究的用途；
(iii) 用于药物毒性研究中的用途，例如用于药物神经毒性研究中的用途；
(iv) 用于药物筛选应用中的用途，例如用于筛选（例如体外筛选）预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征（例如，静止性震颤、运动迟缓、肌强直和/或姿势平衡障碍）的药剂的用途。
26. 一种体外筛选具有神经毒性的试剂的方法，其包括：
提供项目1-5任一项所述的神经类器官；
使所述神经类器官与测试试剂接触；
测定所述神经类器官中神经元（例如多巴胺神经元）的凋亡；
将所述测定结果与不存在所述测试试剂时测定的神经元凋亡进行比较；
其中，如果存在所述测试试剂时的神经元凋亡与不存在所述测试试剂时的神经元凋亡相比增加，表明所述测试试剂具有神经毒性。
27. 一种制备帕金森病体外模型的方法，其包括：
提供项目1-5任一项所述的神经类器官；
在神经毒素存在的条件下培养所述神经类器官，以获得帕金森病体外模型。
28. 项目27所述的方法，其中，所述神经毒素选自MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)。
29. 通过项目27或28所述的方法产生的帕金森病体外模型。
30. 项目29所述的帕金森病体外模型用于选自下列的一种或多种用途：
(i) 用于机理研究的用途，例如用于帕金森病发病机理或致病因素研究的用途；
(ii) 用于药物毒性研究中的用途，例如用于药物神经毒性研究中的用途；
(iii) 用于药物筛选应用中的用途，例如用于筛选（例如体外筛选）预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征（例如，静止性震颤、运动迟缓、肌强直和/或姿势平衡障碍）的药剂的用途。
31. 一种体外筛选用于预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征（例如，静止性震颤、运动迟缓、肌强直和/或姿势平衡障碍）的药剂的方法，该方法包括：
提供项目29所述的帕金森病体外模型；
使所述帕金森病体外模型与测试药剂接触；
测定在存在所述测试药剂和不存在所述测试药剂的情况下神经元（例如多巴胺神经元）的凋亡，并且如果神经元凋亡在存在所述药剂的情况下少于不存在所述药剂的情况，则鉴定为具有预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征的药剂。
发明的有益效果
由于大脑不同功能单元的神经元所适合的诱导条件不尽相同，某一类型神经元可能无法耐受其他类型神经元的调控因子，这导致目前通过常规多能干细胞分化方法获得的类器官通常仅具有单一功能单元（例如多巴胺神经细胞）。本申请的发明人通过调节多能干细胞内的WNT信号通路和SHH信号通路成功获得了同时含有黑质-纹状体等多种细胞类型的完整连续体类器官，其可在体外模拟黑质-纹状体通路，为帕金森的发病机制研究以及治疗提供基础，也为体外构建更高级的多器官系统提供技术支持。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了实施例2中类器官分化光镜（A）和免疫荧光染色（B, C）结果。
图2显示了实施例2中D74类器官的免疫荧光染色结果。
图3显示了实施例2中D45类器官的膜片钳电生理检测结果。
图4显示了实施例3中D70类器官模拟PD发病过程的结果。A: organoid D70 产生了神经束；B：organoid 加入MPTP模拟PD发病过程，多巴胺神经元（GFP和GFP/MCHERRY）特异性凋亡，而其他神经元（只表达MCHERRY）没有明显变化；C：免疫荧光染色检测TH+细胞和DARPP32+的凋亡情况；D：对C中的细胞凋亡比例进行统计。
图5A显示了实施例4中活细胞工作站观察环境毒素作用D60类器官的效果。图5B显示了qPCR检测加入环境毒素后的结果。
图6显示了实施例5中使用实施例1的方法分化GMEB1敲除胚胎干细胞的结果。
图7显示了实施例6中类器官脑内移植2个月后移植细胞的存活情况。
图8-图9显示了实施例7中D18类器官的实时细胞荧光动态监测结果，图中各小图代表同一个实验组的重复。
图10显示了实施例7中D60类器官的组织切片染色多巴胺神经元的标志物TH和MSN神经元的标志物GAD1+和DARPP32+以及神经元的标志物TUJ1的结果。
图11显示了实施例7中使用WNT信号通路激活剂Kenpaullone替代CHIR的分化效果，图中各小图代表同一个实验组的重复。
图12显示了实施例7中使用WNT信号通路激活剂BIO替代CHIR的分化效果，图中各小图代表同一个实验组的重复。
图13显示了实施例7中使用SHH信号通路激活剂Purmorphamine替代SAG的分化效果，图中各小图代表同一个实验组的重复。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J. Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F. M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley & Sons, Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：类器官的制备
前期类器官的分化
D0：将长满的人胚胎干细胞消化酶消化成单细胞，以104/well 的密度接种到v形96well板中，每孔加入维持培养基进行培养，所述维持培养基为添加有10μM Y-27632的E8培养基，放入incucyteS3中实时荧光观察拍照；
D1：每孔加入包含100nM LDN193189和10μM SB431542的N2B27培养基；所述N2B27培养基包含：48%(v/v) CTS-KnockOut DMEM/F-12、48%(v/v) CTS-Neurobasal Medium、1%(v/v) N2-CTS、2%(v/v) B27-CTS、1%(v/v) CTS-GlutaMAX；
D3：弃去D1培养基，每孔加入包含100nM LDN193189+10μM SB431542+0.5μMCHIR99021+0.1μM SAG的N2B27培养基；
D4：弃去D3培养基，每孔加入包含100nM LDN193189+10μM SB431542+0.1μM SAG的N2B27培养基；
D6：弃去D4培养基，每孔加入包含100nM LDN193189+10μM SB431542的N2B27培养基；
D8：弃去D6培养基，每孔加入包含100nM LDN193189+10μM SB431542的N2B27培养基；
D9：弃去D8培养基，每孔加入包含100nM LDN193189+10μM SB431542 +100ng/mLFGF8的N2B27培养基;
D11：弃去D9培养基，每孔加入包含100nM LDN193189+10μM SB431542 +100ng/mLFGF8的N2B27培养基；
D12：弃去D11培养基，每孔加入包含100nM LDN193189+10μM SB431542的N2B27培养基;
重复D12培养基换液到D20，隔天换液。
类器官的成熟
D20：弃去D18培养基，每孔加入成熟诱导培养基，成熟诱导培养基为包含20 ng/mLBDNF + 20 ng/mL GDNF + 1 ng/mL TGFβ3+ 0.2 mM AA + 0.5mM db-cAMP + 10 μM DAPT的NDM培养基，NDM培养基包含97%(v/v) CTS- Neurobasal Medium，2%(v/v) B27-CTS和1%(v/v) CTS- GlutaMAX。
D21：将类器官转移到24孔低贴附培养板中，每孔一个类器官，放在PS-3D摇床上培养；接下来每隔两天更换一次成熟诱导培养基。
本实施例所使用的人胚胎干细胞的内源性LMX1A基因座包含mCherry报告基因并且内源性EN1基因座包含sfGFP报告基因，其通过对人胚胎干细胞系H9进行基因组编辑获得。在上述内源性基因座中引入报告基因的目的在于：可通过检测mCherry和sfGFP的荧光信号而确定相应基因的表达情况，以方便研究。可通过本领域已知的基因组编辑技术将mCherry报告基因和sfGFP报告基因分别敲入细胞的内源性LMX1A基因座和EN1基因座。示例性基因组编辑技术包括CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)/Cas、ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)以及其他位点特异性核酸酶技术。通过将对于LMX1A和EN1而言特异性的CRISPR、ZFN和/或TALEN以及包含报告基因的同源供体DNA引入细胞，可在LMX1A和EN1中生成双链断裂，同时同源供体DNA通过同源重组实现报告基因的敲入。在示例性实施方案中，通过CRISPR/Cas9系统实现mCherry报告基因和sfGFP报告基因的插入。本领域技术人员理解引入上述报告基因仅是为了方便监测LMX1A和EN1的表达情况，其未对细胞本身的性能（例如分化性能）产生任何影响，因此不会对本申请所提供的技术方案产生任何影响。本领域技术人员完全理解其他人胚胎干细胞以及具备神经外胚层分化能力的任何多能干细胞也完全能够用于本申请所提供的技术方案中。
上述步骤中涉及的试剂来源如下所示：
Figure 327435DEST_PATH_IMAGE001
实施例2：类器官的鉴定
用包含4%多聚甲醛(4P)磷酸盐缓冲盐水(Phosphate Buffered Saline, PBS)在室温(RT)下固定类器官30分钟。用PBS洗涤3次，然后在30%蔗糖溶液中脱水过夜。将类器官包埋在OCT介质中，冷冻在液态LN2表面，用徕卡SM2010R切片机进行切片。免疫染色，切片用PBS冲洗3次，每次10分钟。在渗透阻断液(TBS: 3% TX-100 + 1% BSA with PBS)中RT孵育2h，与TBS稀释的第一株Ab在4℃孵育过夜。用PBS冲洗3次，每次10分钟。RT条件下用TBS稀释的2ab试剂孵育2h, PBS冲洗3次，每次10min。最后用hoechst33342染色。所有图像均由共聚焦显微镜(Zeiss LSM 780/880)拍摄。
抗体及其信息如下：
chicken anti-GFP (Abcam, ab13970, 1:1000), rat anti- mCherry (Thermo,M112117, 1:500), rabbit anti-LMX1A (Millipore ab10533, 1:1000), mouse anti-EN1 (DSHB, 4G11, 1:30), goat anti-FOXA2 (R&D Systems, AF2400, 1:500), mouseanti-NKX2-1 (Thermo, MA5-13961, 1:500), mouse anti-PAX6 (DSHB, PAX6-b, 1:30),rabbit anti-SOX2 (BioLegend, 630802, 1:200), rat anti-CTIP2 (Abcam, ab18465,1:500), mouse anti-Tyrosine hydroxylase (TH) (Immunostar Systems, 22941, 1:2000), rabbit anti-TH (Millipore, ab152, 1:1000), rabbit anti-Homer 1(Synaptic Systems, 160003, 1:100), rabbit anti-Psd95 (Abcam, ab18258, 1:500),mouse anti-human-synaptophysin (EP10) (Thermo Fisher Scientific, 14–6525–80,1:200), mouse anti-TUBB3 (BioLegend, 801202, 1:500), mouse anti-GFAP (Thermo,A21282, 1:200), mouse anti-DARPP32(Santa Cruz , sc-271111, 1:300), rabbitanti-GABA (Sigma, A2052, 1:50), rabbit anti- caspase-3 (cell signaling,9661S, 1:400),rat anti-DAT (Millipore, MAB369, 1:400), rabbit anti-RYK(Abcam, ab5518, 1:100), FFN206(Abcam, ab144554, 2µM).
分化获得的前期类器官的免疫染色结果如图1所示，使用实时细胞形态观察发现分化过程中，红色荧光（LMX1A/mCherry）先出先出现，12天左右出现绿色荧光（EN1/GFP）（图1A）。进行免疫荧光染色发现分化15天左右的类器官能够同时表达前脑标记物FOXG1和SOX2和中脑标记物FOXA2和LMX1A，以及背侧标记物PAX6和腹侧标记物NKX2.1和FOXA2（图1B、图1C），说明获得了跨区域的类器官。
分化74天后的类器官的免疫染色结果如图2所示，分化74天后的类器官中包含MSN神经元（能够同时表达标记物DARPP32和GABA）和中脑多巴胺神经元（能够同时表达标记物TH和DAT）（图2A），MSN神经元的突触包围着多巴胺神经元的胞体（图2B），突触前标志物（SYN）和突触后标志物（PSD95）共染确定两种类型的神经元突触连接（图2C），即MSN神经元和多巴胺神经元有建立了连接，能够通过突触进行神经递质的传递，说明我们获得的跨区域的类器官，能用来模拟体内中脑多巴胺神经元和纹状体MSN神经元的投射和连接。
对分化45天后的类器官进行电生理检测，步骤如下：organoid 培养至D60以后，将其经1%低熔点琼脂糖包埋后经LEICA1200T振动切片机切片，厚度300-500µM。之后将其转移至脑片电生理试验台的记录槽后，用自制脑片压网轻轻固定脑片，记录所用电极参数。背景灌流95%O2和5%CO2且37℃加热的人工脑脊液以保持organoid的细胞活性，灌流速度约每分钟2mL。放置40倍正置显微镜下，施加正压，接近目标细胞，待电阻上升0.2-0.3MΩ后，释放正压使电极尖端于细胞膜形成高阻封接，吸破细胞膜，形成全细胞记录模式。结果如图3所示，GFP+细胞（即，EN1阳性细胞）能检测到钠离子、钾离子电流和动作电位，说明我们获得的跨区域的类器官已经逐步成熟。
实施例3：类器官模拟PD发病机理
对培养到70天左右的organoid进行组织切片观察，结果如图4A所示，类器官产生了类似于体内成熟神经元的神经束，为研究神经元投射提供了基础。随后，将培养到70天左右的organoid培养基中加入1mM MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶，Sigma D048），MPTP是一种神经毒素，能够通过破坏黑质中产生多巴胺的神经细胞而导致类似于帕金森氏症的症状以模拟PD发病过程。随后对组织切片进行caspase-3（rabbit anti- caspase-3(cell signaling, 9661S, 1:400)）、TH（mouse anti-Tyrosine hydroxylase (TH)(Immunostar Systems, 22941, 1:2000)）和DARPP32（mouse anti-DARPP32(Santa Cruz ,sc-271111, 1:300)）染色，结果如图4B-4D所示，MPTP处理后多巴胺神经元（GFP和GFP/MCHERRY）特异性凋亡，而其他神经元（只表达MCHERRY）没有明显变化。上述结果表明获得的organoid能作为一个模型来模拟帕金森发病过程，用于机理研究。
实施例4：类器官能用于环境毒素的筛选
将培养的organoid 中加入环境毒素Chlopyrifos（sigma, 45395）、Zoxa（MCE，HY-B1307）、Mitotane（MCE，HY-13690）、AverB1（MCE，HY-15311），通过活细胞观察整个过程（图5A），提取细胞RNA，使用反转录试剂盒进行单链cDNA的合成，使用TOYOBO Realtime PCR试剂盒进行qPCR，反应程序：95℃预变性1 min；95℃变性15 s，60℃退火并延伸45 s，循环40次；溶解曲线分析。通过通过qPCR检测特定基因的表达情况（图5B），发现0.5mMChlopyrifos，0.5mM Zoxa ，5mM mitotane 和1mM AverB1能使多巴胺神经元（GFP+神经元）凋亡，说明类器官可以为PD的致病因素和治疗药物的筛选提供了一个较好的体外模型。
实施例5：类器官用于研究基因在发育中的功能
为研究特定基因在发育中的功能，可以通过实施例1所述的类器官制备方法从敲除该基因的多能干细胞制备类器官，通过观察该类器官的发育过程从而研究该基因的功能。本实施例研究了GMEB1基因在神经发育过程中的作用。首先，在实施例1所用的胚胎干细胞基础上通过CRISPR-Cas9系统敲除GMEB1基因，获得H9-EN1-LMX1A-KOGMEB1细胞，具体敲除设计方案是在ATG起始密码子后面通过定点敲除造成移码突变，由于Gmeb1起始密码子在ATG在第二个外显子，所以在第二个外显子上设计了两条sgRNA，共敲除68bp后造成移码突变从而使该细胞系不能正常表达Gmeb1蛋白。随后通过实施例1的步骤对该细胞进行类器官分化诱导，结果如图6所示，发现敲除GMEB1这个基因后，分化的类器官成熟时期缺乏GFP荧光的表达，揭示了在发育过程中GMEB1突变或者是缺失会导致多巴胺神经元的分化受阻，为进一步研究基因的功能提供了模型。
实施例6：类器官用于脑内移植
目前，体外分化的多巴胺细胞是一种有前景的治疗帕金森病的方法，但是分化细胞移植到脑内后只有10%的细胞能够存活，本实施例考察类器官移植对神经元存活的影响。
类器官分化至D30-D45，将类器官机械切成直径为0.5 mm左右的小块，一部分直接注射作为实验组，另一部分消化成单细胞注射作为对照组，注射液为生理盐水+10 μm Y-27632，注射部位为纹状体，每组注射5只鼠，每只鼠接受移植的细胞量约为2x105。注射1m后心脏灌流取材;冰冻切片：25µm/片，10片、series;免疫组化染色HUNU，检测细胞存活。结果如图7所示，通过将类器官移植到体内后能够明显的提高移植神经元细胞的存活，也为细胞治疗提供更好的选择依据。
实施例7：不同诱导条件对类器官制备的影响
D0-D1 培养基E8+10μM Y-27632, D2-D20 基础培养基：N2B27培养基 + 100nMLDN193189 + 10μM SB431542，第72h加入1μM CHIR99021 + 1μM SAG并继续培养至108h，D10加入100ng/mL FGF8并持续培养至D15，隔天更换培养基；之后更换为实施例1中所述成熟诱导培养基继续培养。上述诱导条件培养到D18的实时细胞荧光动态监测结果如图8所示，所有的organoid（同一个实验组的重复）都出现了红绿色荧光的细胞（LMX1A/EN1双阳性），同时有非荧光的细胞（前脑纹状体部分），结合图1的免疫荧光染色结果说明我们获得了跨区域类器官，同时包含前脑纹状体和中脑黑质细胞命运，其中中脑部分（红绿色荧光表达）的细胞比例较高。
D0-D1 培养基E8+10μM Y-27632, D2-D20 基础培养基：N2B27 + 100nMLDN193189 + 10μM SB431542，第48h加入10nM CHIR99021 + 10nM SAG并继续培养至56h，D7加入100ng/mL FGF8并持续培养至D9，隔天更换培养基；之后更换为实施例1中所述成熟诱导培养基继续培养。上述条件培养到D18的实时细胞荧光动态监测结果如图9所示，所有的organoid（同一个实验组的重复）都出现了红绿色荧光的细胞（LMX1A/EN1双阳性），同时有非荧光的细胞（前脑纹状体部分），结合图1的免疫荧光染色结果说明我们获得了跨区域类器官，同时包含前脑纹状体和中脑黑质细胞命运，其中中脑部分（红绿色荧光表达）的细胞比例较低。
使用不同组分的成熟诱导培养基对实施例1所述实验步骤获得的前期类器官进行继续培养，不同组分的成熟诱导培养基分组如下A：NDM培养基+DPBS；B：NDM培养基+1mM AA；C：NDM培养基+100ng/mL BDNF + 100ng/mL GDNF + 50ng/mL TGFβ3 + 100mM AA + 100mMcAMP + 1mM DAPT。培养至D60进行组织切片染色多巴胺神经元的标志物TH和MSN神经元的标志物GAD1+和DARPP32+以及神经元的标志物TUJ1，统计各个标志物表达的细胞的数量，再计算其占DAPI阳性细胞（所有的细胞）比例。结果如图10所示，结果表明通过配方B和C能够使前期类器官继续成熟为成熟类器官。
在实施例1的方法中，将CHIR替换为Kenpaullone，其余条件不变，培养到D18的实时细胞荧光动态监测结果如图11所示；在实施例1的方法中，将CHIR替换为BIO，其余条件不变，培养到D18的实时细胞荧光动态监测结果如图12所示；在实施例1的方法中，将SAG替换为Purmorphamine，其余条件不变，培养到D18的实时细胞荧光动态监测结果如图13所示。结果显示，图11-13中所有的organoid（同一个实验组的重复）都出现了红绿色荧光的细胞（LMX1A/EN1双阳性），同时有非荧光的细胞（前脑纹状体部分），说明上述条件均能够获得跨区域类器官，同时包含前脑纹状体和中脑黑质细胞命运。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (31)

1.一种神经类器官，其包含表达前脑纹状体标志物的第一区域以及表达中脑黑质细胞标志物的第二区域，所述第一区域包含表达中等棘突神经元标记物的第一细胞类型，所述第二区域包含表达中脑多巴胺神经元标记物的第二细胞类型，所述第一细胞类型与第二细胞类型之间存在突触连接。
2.权利要求1所述的神经类器官，其中，所述第一区域表达FOXG1，SOX2，CTIP2，DARPP32和GABA中的一种或多种；和/或，所述第二区域表达FOXA2，LMX1A，EN1，TH，DAT中的一种或多种。
3.权利要求1所述的神经类器官，其中，所述第一细胞类型表达DARPP32和GABA中的一种或多种；和/或，所述第二细胞类型表达EN1、TH和DAT中的一种或多种。
4.权利要求1-3任一项所述的神经类器官，其中，所述突触连接是指所述第一细胞类型的突触包围着所述第二细胞类型的胞体。
5.权利要求1-3任一项所述的神经类器官，其中，所述神经类器官由多能干细胞经体外诱导分化获得。
6.移植物，其包含权利要求1-5任一项所述的神经类器官。
7.药物组合物，其包含权利要求1-5任一项所述的神经类器官或权利要求6所述的移植物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
8.获得权利要求1-5任一项所述的神经类器官的方法，该方法包括：
(1) 在分化培养基中对多能干细胞进行培养，所述分化培养基包含下述基础组分：添加有N2和B27的基础培养基以及TGF-β信号通路抑制剂；其中，在培养的第1-5天的任意时间将多能干细胞与(i)GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂和(ii)SHH信号通路激活剂同时或以任何次序接触，以诱导神经外胚层分化；
(2) 在允许细胞成熟为神经元的条件下培养步骤(1)的培养物，以获得神经类器官。
9.权利要求8所述的方法，其中，与所述GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂接触的时间选自12小时到5天的范围。
10.权利要求8所述的方法，其中，与所述SHH信号通路激活剂接触的时间选自1天到8天的范围。
11. 权利要求8所述的方法，其中，所述GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂选自CHIR99021、BIO、BIO-Acetoxime和Kenpaullone中的一种或多种；和/或，所述SHH信号通路激活剂选自SAG、GSA 10、Cyclopamine和Purmorphamine中的一种或多种。
12.权利要求8所述的方法，其中，在与(i)GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂和(ii)SHH信号通路激活剂接触后，步骤(1)进一步包括将多能干细胞与FGF信号通路激活剂接触。
13.权利要求12所述的方法，其中，在培养的第7-10天的任意时间将多能干细胞与FGF信号通路激活剂接触。
14.权利要求12所述的方法，其中，与所述FGF信号通路激活剂接触的时间选自1天到6天的范围。
15. 权利要求12所述的方法，其中，所述FGF信号通路激活剂选自FGF1, FGF2, FGF3,FGF4, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13,FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23中的一种或多种。
16.权利要求8所述的方法，其中，所述TGF-β信号通路抑制剂选自LDN193189、SB431542中的一种或多种。
17.权利要求12所述的方法，其中：
在与(i)GSK-3抑制剂或WNT信号通路激活剂和(ii)SHH信号通路激活剂接触之后以及与FGF信号通路激活剂接触之前，步骤(1)还包括在缺乏GSK-3抑制剂和SHH信号通路激活剂的条件下培养多能干细胞；和/或，
在与FGF信号通路激活剂接触之后，步骤(1)还包括在缺乏GSK-3抑制剂、SHH信号通路激活剂以及FGF信号通路激活剂的条件下培养多能干细胞。
18.权利要求8所述的方法，其中，步骤(2)所述的允许细胞成熟为神经元的条件包括在成熟培养基中对步骤(1)的培养物进行培养，所述成熟培养基包含下述基础组分：添加有B27的基础培养基。
19.权利要求18所述的方法，其中，所述成熟培养基还包括选自脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、TGFβ3、抗坏血酸（AA）、cAMP、DAPT中的一种或多种。
20.权利要求8所述的方法，其中，步骤(1)和步骤(2)中所述的培养在低吸附细胞培养皿中进行。
21.权利要求8所述的方法，其中，步骤(2)中所述的培养在震荡条件下进行。
22.权利要求8所述的方法，其中，所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
23.权利要求1-5任一项所述的神经类器官、权利要求6所述的移植物、或权利要求7所述的药物组合物在制备用于在受试者中预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征或用于脑内移植的药物中的用途。
24.权利要求1-5任一项所述的神经类器官用于选自下列的一种或多种用途：
(i)用于制备帕金森病体外模型的用途；
(ii)用于帕金森病发病机理或致病因素研究的用途；
(iii)用于药物神经毒性研究中的用途；
(iv)用于筛选预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征的药剂的用途。
25.一种体外筛选具有神经毒性的试剂的方法，其包括：
提供权利要求1-5任一项所述的神经类器官；
使所述神经类器官与测试试剂接触；
测定所述神经类器官中神经元的凋亡；
将所述测定结果与不存在所述测试试剂时测定的神经元凋亡进行比较；
其中，如果存在所述测试试剂时的神经元凋亡与不存在所述测试试剂时的神经元凋亡相比增加，表明所述测试试剂具有神经毒性。
26.一种制备帕金森病体外模型的方法，其包括：
提供权利要求1-5任一项所述的神经类器官；
在神经毒素存在的条件下培养所述神经类器官，以获得帕金森病体外模型。
27.权利要求26所述的方法，其中，所述神经毒素是MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)。
28.通过权利要求26或27所述的方法产生的帕金森病体外模型。
29.权利要求28所述的帕金森病体外模型用于选自下列的一种或多种用途：
(i)用于帕金森病发病机理或致病因素研究的用途；
(ii)用于药物神经毒性研究中的用途；
(iii)用于筛选预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征的药剂的用途。
30.一种体外筛选用于预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征的药剂的方法，该方法包括：
提供权利要求28所述的帕金森病体外模型；
使所述帕金森病体外模型与测试药剂接触；
测定在存在所述测试药剂和不存在所述测试药剂的情况下神经元的凋亡，并且如果神经元凋亡在存在所述药剂的情况下少于不存在所述药剂的情况，则鉴定为具有预防和/或治疗帕金森病或改善帕金森病的至少一种症状或病理表征的药剂。
31.权利要求23或24所述的用途、或权利要求29所述的用途或权利要求30所述的方法，其中，所述帕金森病的至少一种症状或病理表征选自静止性震颤、运动迟缓、肌强直和/或姿势平衡障碍。
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