CN117616276A - 提供富含神经元及其前体的细胞群体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及提供富含神经元和/或其前体的细胞群体的方法，其包括以下步骤：获得包含神经元前体的细胞群体，以及选择对指示细胞是否具有发育成神经元的高倾向呈阳性的细胞。
Description
技术领域
本发明总体上涉及干细胞领域，如人类多能干细胞(hPSC)领域。具体地，提供了使细胞群体富含干细胞衍生的神经元及其前体的方法。
背景技术
人类多能干细胞具有使人体各种难治性疾病和病症的治疗发生革命性变革的潜力。治疗包括对诸如帕金森病等神经病状的细胞替代疗法。然而，为了使此类治疗变得可行，需要开发体外方法来人工产生干细胞衍生产品，以便将其递送到中枢神经系统(CNS)。
hPSC向特定细胞类型的分化是一个难以控制的过程；在许多情况下，从特定方案产生的后代是异质的并且包含细胞类型的混合物。目前，描述了几种将hPSC分化成神经干细胞并随后分化成神经元的方法。然而，所有方案都产生异质群体，即，并非所有细胞都必然是神经元祖细胞，并且可能特化为不同的细胞类型，或者体外分化和体内发育的异步性质导致同时存在不同的细胞阶段。对于研究感兴趣的单一/特定细胞类型的疾病和正常生物学，或者当需要移植单一/特定细胞类型时，例如在细胞替代疗法的背景下，特别是在神经元是预期的治疗细胞类型的情况下，异质培养物并不是最佳选择。混合细胞群体的移植降低了细胞疗法的安全性和有效性概况，并且增加了不需要的细胞类型产生不良副作用的风险。WO 2021/042027中已经描述了分离细胞群体以获得更高纯度的神经元及其前体的方法。然而，仍然需要进一步的方法来获得富集的细胞群体，所述细胞群体包含具有增加的发育成神经元的倾向的神经细胞。
因此，本发明的目的是朝着确定会发育成神经元及其前体如腹侧中脑神经元的细胞类型，改善包含神经细胞的细胞群体的同质性。
发明内容
如上概述的目的通过本发明的方面来实现。另外，本发明还可以解决其他问题，这从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出。
本发明的第一方面涉及提供富含神经元和/或其前体如中间前体细胞的细胞群体的方法，其包括以下步骤：获得包含神经元前体的细胞群体，选择对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞，并且/或者排除对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞。
本发明人已发现，可以通过分离特定细胞来增加细胞群体中具有发育成神经元的倾向的细胞的比例，其中通过对某些表面标志物进行正选择和/或负选择来分离特定细胞。此外，本发明人已发现，选择和/或排除细胞的时机可以改善结局，特别是当应用于细胞群体分化成神经细胞如神经元时。具体来说，细胞发育成神经元，例如在体外分化过程中，会经历不同的阶段；最初，细胞变成神经干细胞，然后进一步分化成中间前体细胞，然后变成神经元。本发明人发现，表明神经干细胞是否具有神经元命运的特定表面标志物仅在神经干细胞进一步发育时才可靠地表达。在经历向神经元身份分化的细胞群体中，各个细胞将处于不同的发育阶段，并且细胞群体可包含细胞亚群，如多能干细胞、神经干细胞、中间前体细胞和神经元。此外，从一个阶段向另一阶段过渡的各个细胞可以表达指示这两个阶段的标志物。本发明人发现，细胞的选择和/或排除优选地应用于细胞群体，其中至少部分细胞已从神经干细胞进一步发育。表达标志物SOX2是神经干细胞身份的特征。随着神经干细胞进一步发育，细胞在某个时刻不再表达SOX2。这与特定表面标志物在具有神经元命运的细胞上表达或沉默相符。因此，细胞群体中SOX2表达的降低表明神经干细胞进一步发育，并且可用来确定用于分离具有发育成神经元的倾向的细胞的机会窗口。
因此，本发明的一方面涉及从细胞群体中分离神经元和/或其前体的方法，其包括以下步骤：获得包含表达标志物SOX2的神经干细胞的细胞群体，进一步培养该细胞群体直到该细胞群体中SOX2的表达降低，选择对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞，并且/或者排除对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞。
或者，选择和/或排除细胞的时机还可以基于指示部分神经干细胞已进一步发育成中间前体细胞和/或神经元的标志物来确定。在一实施方案中，所述细胞群体如下获得：首先使多能干细胞(PSC)向神经干细胞分化，并且当细胞已经进展到某个分化阶段时可以进行细胞的选择，在该阶段，培养物包含单能和/或专能细胞，如中间前体细胞，和/或终末分化细胞，如神经元。因此，在一实施方案中，当选择和/或排除细胞时，所述细胞群体中的至少5％表达中间前体身份的标志物。在一实施方案中，当选择和/或排除细胞时，所述细胞群体中的至少5％对标志物ASCL1、NEUROD1、NEUROD2、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、EOMES、CHX10、ISL1、SOX4、SOX11、NKX2.1、NFE2L2和NHLH1中的一种或多种呈阳性。本发明人已将这些标志物的表达确定为细胞群体成熟至某个阶段的强烈指示，在该阶段，可基于所鉴定的表面标志物对具有强烈神经元发育倾向的细胞进行正选择和/或负选择。在发育成中间前体细胞之前的细胞可能无法充分表达或沉默所鉴定的表面标志物来进行细胞分离。
本发明人发现，基于所鉴定的表面标志物来选择和/或排除细胞以增加细胞群体中的神经元可以应用于大脑的所有区域。特别地，发现排除表达表面标志物CD47的细胞增加了定向成为腹侧中脑神经细胞的细胞群体中神经元的比例。此外，还发现排除表达表面标志物CD99的细胞增加了定向至前脑、后脑或脊髓的细胞群体中神经元的比例。
在本发明的另一方面，提供了神经元和/或其前体的细胞群体，其中至少50％的细胞对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性，并且/或者少于50％的细胞对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性。根据以上所述的细胞群体以发育成神经元的倾向增加为特征。
另一方面涉及包含根据本发明的细胞群体的组合物。在进一步的方面，公开了根据本发明的细胞群体或组合物，其用作药物，例如用于治疗神经系统病状。同质细胞群体的移植被认为提高了细胞疗法的安全性和有效性概况，并且降低了不需要的细胞类型产生不良副作用的风险。采用根据本发明的细胞群体或组合物进行的治疗导致具有神经元和/或其前体的细胞的比例增加，从而使其非常适合于预防或治疗需要施用此类细胞的病状。
附图说明
图1显示了简化的示意图，说明了从hPSC(A)到早期NSC(B)、到异质中间阶段培养物(C)、最后到终末分化细胞类型(D)的分化阶段。进行scRNA-seq分析的时间窗口用方框(E)标记。
图2A显示了通过hESC的scRNA-seq分析获得的维恩图。该图展示了表达标志物POU5F1、SOX2、ASCL1和INA中的一种或多种的细胞的百分比。
图2B显示了通过hESC的scRNA-seq分析获得的t-SNE图。该图显示了基因POU5F1、SOX2、ASCL1和INA的表达谱。表达水平以每个转录物的UMI(UTP)来表示，并使用从无表达(极浅灰色)到高表达(深灰色)的颜色梯度来显示。
图3A显示了通过DIV16腹侧中脑NSC的scRNA-seq分析获得的维恩图。该图展示了表达标志物POU5F1、SOX2、ASCL1和INA中的一种或多种的细胞的百分比。
图3B显示了通过DIV16腹侧中脑NSC的scRNA-seq分析获得的t-SNE图。该图显示了基因POU5F1、SOX2、ASCL1和INA的表达谱。表达水平以每个转录物的UMI(UTP)来表示，并使用从无表达(极浅灰色)到高表达(深灰色)的颜色梯度来显示。
图4A显示了通过DIV24腹侧中脑神经细胞的scRNA-seq分析获得的维恩图。该图展示了表达标志物POU5F1、SOX2、ASCL1和INA中的一种或多种的细胞的百分比。
图4B显示了通过DIV24腹侧中脑神经细胞的scRNA-seq分析获得的t-SNE图。该图显示了基因POU5F1、SOX2、ASCL1和INA的表达谱。表达水平以每个转录物的UMI(UTP)来表示，并使用从无表达(极浅灰色)到高表达(深灰色)的颜色梯度来显示。
图5显示了通过DIV22、24和26腹侧中脑神经细胞的scRNA-seq分析获得的整合UMAP图。该图显示了基因LMX1A、SOX2、ASCL1和INA的表达谱。LMX1A阴性细胞用圆圈标记。表达水平以每个转录物的UMI(UTP)来表示，并使用从无表达(极浅灰色)到高表达(深灰色)的颜色梯度来显示。
图6显示了通过DIV22、24和26腹侧中脑神经细胞的scRNA-seq分析获得的整合UMAP图。该图显示了基因ADGRG1、EPHB2、GAP43、ADCYAP1、C1QL1和NRXN1的表达谱。表达水平以每个转录物的UMI(UTP)来表示，并使用从无表达(极浅灰色)到高表达(深灰色)的颜色梯度来显示。
图7显示了通过DIV22、24和26腹侧中脑神经细胞的scRNA-seq分析获得的整合UMAP图。该图显示了基因FZD1、CACNA2D1、DDC、GPR85和LRRC4C的表达谱。表达水平以每个转录物的UMI(UTP)来表示，并使用从无表达(极浅灰色)到高表达(深灰色)的颜色梯度来显示。
图8显示了通过DIV22、24和26腹侧中脑神经细胞的scRNA-seq分析获得的整合UMAP图。该图显示了基因TNFRSF21、TRPM8、FREM2、DLL3、DLL1、CHRNA5和CLDN5的表达谱。表达水平以每个转录物的UMI(UTP)来表示，并使用从无表达(极浅灰色)到高表达(深灰色)的颜色梯度来显示。
图9显示了通过DIV22、24和26腹侧中脑神经细胞的scRNA-seq分析获得的整合UMAP图。该图显示了基因SLIT2、NTN1、CMTM7、CMTM8、CD36和CD47的表达谱。表达水平以每个转录物的UMI(UTP)来表示，并使用从无表达(极浅灰色)到高表达(深灰色)的颜色梯度来显示。
图10显示了通过DIV22、24和26腹侧中脑神经细胞的scRNA-seq分析获得的整合UMAP图。该图显示了基因CD99、NFRSF1A、TMEM123、LRP10、HLA-A和RAMP1的表达谱。表达水平以每个转录物的UMI(UTP)来表示，并使用从无表达(极浅灰色)到高表达(深灰色)的颜色梯度来显示。
图11显示了通过DIV22、24和26腹侧中脑神经细胞的scRNA-seq分析获得的整合UMAP图。该图显示了基因CMTM6、TNFRSF12A、CRLF1、ITGB8和CD83的表达谱。表达水平以每个转录物的UMI(UTP)来表示，并使用从无表达(极浅灰色)到高表达(深灰色)的颜色梯度来显示。
图12概述了用于获得富含CD47阳性或CD99阴性细胞的群体的荧光激活细胞分选(FACS)策略。该图显示了分层门，首先，(A)选择代表细胞的事件并排除碎片，其次，(B)选择单细胞并排除双联体(doublet)，第三，(C)选择活细胞并排除死细胞，并且最后，(D)选择CD47阳性或CD47阴性群体。
图13显示了FACS后立即获得的分选后纯度。通过在流式细胞仪上重新分析样品来评估CD47阳性(A)和CD47阴性(B)细胞的纯度。
图14显示了在分选的CD47阳性(A)和CD47阴性(B)样品中表达CD47的细胞的百分比，所述样品在FACS后立即通过细胞内流式细胞术进行分析。
图15显示了在分选的CD47阳性(A)和阴性(B)样品中表达神经干细胞标志物SOX2的细胞的百分比，所述样品在FACS后立即通过细胞内流式细胞术进行分析。
图16显示了在分选的CD47阳性(A)和阴性(B)样品中表达增殖标志物Ki67的细胞的百分比，所述样品在FACS后立即通过细胞内流式细胞术进行分析。
图17显示了在分选的CD47阳性(A)和阴性(B)样品中表达中脑底板标志物FOXA2的细胞的百分比，所述样品在FACS后立即通过细胞内流式细胞术进行分析。
图18显示了总结在CD47阳性和阴性细胞的FACS之后立即通过细胞内流式细胞术获得的流式细胞术结果的柱状图。
图19显示了分选的CD47阳性细胞(A、Ai)、CD47阴性细胞(B、Bi)和“通过”对照细胞(C、Ci)在FACS后24小时获得的低(A、B、C)和高(Ai、Bi、Ci)放大倍数相差图像(phase-contrast images)中的细胞形态。比例尺：50μm。
图20显示了分选的CD47阳性细胞(A、Ai)、CD47阴性细胞(B、Bi)和“通过”对照(pass through"control)细胞(C、Ci)在FACS后5天获得的低(A、B、C)和高(Ai、Bi、Ci)放大倍数相差图像中的细胞形态。比例尺：50μm。
图21显示了在FACS后5天针对Ki67和DAPI染色的分选的CD47阳性(A)、CD47阴性(B)和“通过”对照(C)细胞的代表性免疫荧光图像。比例尺：50μm。
图22显示了在FACS后5天针对FOXA2和DAPI染色的分选的CD47阳性(A)、CD47阴性(B)和“通过”对照(C)细胞的代表性免疫荧光图像。比例尺：50μm。
图23显示了在FACS后5天针对TH和DAPI染色的分选的CD47阳性(A)、CD47阴性(B)和“通过”对照(C)细胞的代表性免疫荧光图像。比例尺：50μm。
图24概述了用于获得富含CD99阳性或CD99阴性细胞的群体的荧光激活细胞分选(FACS)策略。该图显示了分层门，首先，(A)选择代表细胞的事件并排除碎片，其次，(B)选择单细胞并排除双联体，第三，(C)选择活细胞并排除死细胞，并且最后，(D)选择CD99阳性或CD99阴性群体。
图25显示了FACS后立即获得的分选后纯度。通过在流式细胞仪上重新分析样品来评估CD99阳性(A)和CD47阴性(B)细胞的纯度。
图26显示了基于CD99表达分选的细胞的FACS后活力。
图27显示了分选的CD99阳性细胞(A、Ai)、CD99阴性细胞(B、Bi)和“通过”对照细胞(C、Ci)在FACS后24小时获得的低(A、B、C)和高(Ai、Bi、Ci)放大倍数相差图像中的细胞形态。比例尺：50μm。
图28显示了分选的CD99阳性细胞(A、Ai)、CD99阴性细胞(B、Bi)和“通过”对照细胞(C、Ci)在FACS后48小时获得的低(A、B、C)和高(Ai、Bi、Ci)放大倍数相差图像中的细胞形态。比例尺：50μm。
图29显示了分选的CD99阳性细胞(A、Ai)和CD99阴性细胞(B、Bi)在FACS后5天获得的低(A、B)和高(Ai、Bi)放大倍数相差图像中的细胞形态。比例尺：50μm。
图30显示了在FACS后48小时针对Ki67和DAPI染色的分选的CD99阳性(A)、CD99阴性(B)和“通过”对照(C)细胞的代表性免疫荧光图像。比例尺：50μm。
图31显示了在FACS后12天针对Ki67和DAPI染色的分选的CD99阳性(A)和CD99阴性(B)细胞的代表性免疫荧光图像。比例尺：50μm。
图32显示了在FACS后48小时针对FOXA2和DAPI染色的分选的CD99阳性(A)、CD99阴性(B)和“通过”对照(C)细胞的代表性免疫荧光图像。比例尺：50μm。
图33显示了在FACS后48小时针对TH和DAPI染色的分选的CD99阳性(A)、CD99阴性(B)和“通过”对照(C)细胞的代表性免疫荧光图像。比例尺：50μm。
图34显示了仅表达CD47(Q3)或CD99(Q1)或既表达CD47又表达CD99(Q2)的DIV25hPSC衍生的中脑细胞的百分比。
图35显示了FACS后通过免疫荧光对Ki67+细胞的定量。该图展示了在未分选的样品以及CD47阴性和CD47阳性分选的样品中通过DAPI鉴定的Ki67+细胞占总细胞的百分比。
图36显示了FACS后通过免疫荧光对SOX2+细胞的定量。该图展示了在未分选的样品以及CD47阴性和CD47阳性分选的样品中通过DAPI鉴定的SOX2+细胞占总细胞的百分比。
图37显示了FACS后立即进行的细胞内流式细胞术分析的结果的柱状图。该图展示了未分选的样品以及基于CD47分选的样品(CD47-和CD47+)和基于CD47与CD99组合分选的样品(CD47+CD99+和CD47-CD99-)中CD47+细胞占活细胞总数的百分比。
图38显示了FACS后立即进行的细胞内流式细胞术分析的结果的柱状图。该图展示了未分选的样品以及基于CD47分选的样品(CD47-和CD47+)和基于CD47与CD99组合分选的样品(CD47+CD99+和CD47-CD99-)中CD99+细胞占活细胞总数的百分比。
图39显示了FACS后立即进行的细胞内流式细胞术分析的结果的柱状图。该图展示了未分选的样品以及基于CD47分选的样品(CD47-和CD47+)和基于CD47与CD99组合分选的样品(CD47+CD99+和CD47-CD99-)中SOX2+细胞占活细胞总数的百分比。
图40显示了FACS后立即进行的细胞内流式细胞术分析的结果的柱状图。该图展示了未分选的样品以及基于CD47分选的样品(CD47-和CD47+)和基于CD47与CD99组合分选的样品(CD47+CD99+和CD47-CD99-)中Ki67+细胞占活细胞总数的百分比。
图41显示了FACS后立即进行的细胞内流式细胞术分析的结果的柱状图。该图展示了未分选的样品以及基于CD47分选的样品(CD47-和CD47+)和基于CD47与CD99组合分选的样品(CD47+CD99+和CD47-CD99-)中INA+细胞占活细胞总数的百分比。
图42显示了分选的CD47阴性细胞(A)和未分选的对照细胞(B)在MACS后48小时获得的相差图像中的细胞形态。
图43显示了MACS后立即获得的分选后纯度。通过流式细胞术分析来评估CD47阳性(A)和CD47阴性(B)细胞的纯度。
图44显示了总结在未分选的细胞(黑色条)和CD47阴性细胞(白色条)的MACS之后立即通过细胞内流式细胞术获得的流式细胞术结果的柱状图。
图45显示了直方图，其展示通过流式细胞术测得的表达CD99(A)和CD47(B)的DIV35 hPSC衍生的前脑细胞的百分比。
图46显示了通过流式细胞术测得的，DIV35前脑细胞中SOX2与Ki67(A)和INA(B)的共表达的百分比。
图47显示了通过流式细胞术测得的，DIV35前脑细胞中SOX2与CD47(A)和CD99(B)的共表达的百分比。
图48显示了通过流式细胞术测得的，DIV35前脑细胞中Ki67与CD47(A)和CD99(B)的共表达的百分比。
图49显示了直方图，其展示通过流式细胞术测得的表达CD99(A)和CD47(B)的DIV22 hPSC衍生的后脑/脊髓细胞的百分比。
图50显示了通过流式细胞术测得的，DIV22后脑/脊髓细胞中SOX2与Ki67(A)和INA(B)的共表达的百分比。
图51显示了通过流式细胞术测得的，DIV22后脑/脊髓细胞中SOX2与CD47(A)和CD99(B)的共表达的百分比。
图52显示了通过流式细胞术测得的，DIV22后脑/脊髓细胞中Ki67与CD47(A)和CD99(B)的共表达的百分比。
图53显示了在MACS后10天针对TH和DAPI染色的未分选的对照(A)和分选的CD47阴性(B)细胞的代表性免疫荧光图像。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，否则本发明的实践中采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、生物物理学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。
需要注意的是，本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。
除非另有声明，否则任何和全部实例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明范围的限制。
在下文中，通过非限制性实施方案和实例更详细地描述了本发明的方法。
定义
一般定义
如本文所用的，“一个”或“一种”或“该”可表示一个或多于一个。除非在本说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。
如本文所用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以选择方式(“或”)解释时，指缺少组合。此外，本发明还设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。
干细胞
“干细胞”应被理解为具有分化潜能和增殖能力(特别是自我更新能力)但保持分化潜能的未分化细胞。根据其分化潜力，干细胞包括诸如多能干细胞、专能(multipotent)干细胞、单能干细胞等类别。
如本文所用的，术语“多能干细胞”(PSC)是指能够在体外培养并具有分化成属于三种胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的任何细胞谱系的能力的干细胞。
多能干细胞可以从受精卵、体细胞核移植胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导或分离。多能干细胞(PSC)的实例包括胚胎干细胞(ESC)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、诱导多能干细胞(iPSC)等。
如本文所用的，术语“诱导多能干细胞”(也称为iPS细胞或iPSC)意指一种类型的多能干细胞，其可以直接从并非PSC并且具有细胞核的细胞生成。通过引入特定组的多能性相关基因的产物，可以将非多能细胞转化为多能干细胞。
如本文所用的，术语“胚胎干细胞”意指来源于胚泡的内细胞团的多能干细胞。多能胚胎干细胞还可以来源于孤雌生殖体(parthenotes)，如在例如WO 2003/046141中所述。另外，胚胎干细胞可以从单个卵裂球产生或通过培养在不破坏胚胎的情况下获得的内细胞团来产生。胚胎干细胞可从给定的组织机构获得，也可以商购获得。优选地，本发明的方法和产品基于人PSC，即从人类诱导多能干细胞或人胚胎干细胞(包括孤雌生殖体)衍生的干细胞。
如本文所用的，术语“专能干细胞”意指具有分化成多种类型的组织或细胞(但不是所有种类)的能力的干细胞，并且通常局限于一个胚层。神经干细胞是局限于神经谱系的专能干细胞的实例。
如本文所用的，术语“单能干细胞”意指具有仅分化成一种特定细胞类型的能力的干细胞。
如本文所用的，术语“体外”意指在人体或动物体外部提供并维持细胞，例如在诸如烧瓶、多孔或培养器皿的容器中。由此可见，细胞在细胞培养基中培养。
如本文所用的，术语“非天然”意指细胞尽管衍生自可能具有人类来源的多能干细胞，却是在自然界中并不存在的人工构建体。一般来说，提供尽可能与人体细胞相似的细胞是干细胞治疗领域内的目标。然而，可能永远无法将多能干细胞在胚胎和胎儿阶段所经历的发育模拟到成熟细胞与人体天然细胞无法区分的程度。本质上，在本发明的实施方案中，细胞是人工的。
如本文所用的，关于细胞的术语“人工”可包括自然界中天然存在的但被修饰为非天然存在的构建体的材料。这包括人类干细胞，它们分化成模仿人体细胞的非天然存在的细胞。
当提及细胞群体的一定百分比时，例如细胞群体中的X％表达某种标志物时，意指该细胞群体中细胞的百分比，即，该细胞群体中X％的细胞。
方案
在整个本申请中，当涉及细胞培养或分化过程时，术语“方法”和“方案”可互换使用。
如本文所用的，关于方案的术语“天”和类似的术语体外天(DIV)是指在分化程序期间执行某些步骤的特定时间。
一般而言，除非另有说明，否则“第0天”是指方案的起始，这是通过例如但不限于将干细胞涂布或将干细胞转移到培养器，或在转移干细胞之前使干细胞在其当前的细胞培养基中与化合物接触来进行的。通常，方案的起始是通过将未分化的干细胞转移到不同的细胞培养基和/或容器，例如但不限于通过涂布或孵育，和/或首先以启动分化过程的方式使未分化的干细胞与影响未分化干细胞的一种或多种化合物接触。
当在方法中提及“细胞”时，意指细胞群体的所有细胞，无论细胞类型如何。
当提及“第X天”，如第1天、第2天等时，它是相对于第0天的方案起始而言的。本领域普通技术人员将会认识到，除非另有指定，否则执行该步骤的当天的确切时间可能会有所不同。因此，“第X天”旨在涵盖诸如+/-10小时、+/-8小时、+/-6小时、+/-4小时、+/-2小时或+/-1小时的时间跨度。
培养干细胞
如本文所用的，术语“培养”是指连续的程序，在整个方法中采用该程序以保持细胞在其各个阶段的活力。在从例如但不限于活组织或胚胎中分离出目的细胞后，将它们维持在仔细控制的条件下。这些条件因每种细胞类型而异，但通常由合适的容器组成，该容器具有提供必需营养成分(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体(CO2、O2)以及调节理化环境(pH缓冲液、渗透压、温度)的基底和/或培养基。
如本文所用的，术语“细胞培养基”是指设计成支持细胞生长的液体或凝胶。细胞培养基通常包含适当的能量源和调节细胞周期的化合物。
如本文所用的，术语“培养器”是指可以支持细胞培养物的任何合适的培养器。非限制性实例包括培养皿、培养平皿和板(6孔、24孔、48孔、96孔、384孔、9600孔等的微量滴定板、微孔板、深孔板等)、烧瓶、区室载片、管、细胞工厂(Cell Factory)系统、滚瓶、转瓶、中空纤维、微载体或珠子。
如本文所用的，术语“提供干细胞”当在方案中提及时意指通过诸如以上所述的方法获得一批细胞，并且任选地将细胞转移到不同的环境中，例如通过接种到新的基底上。本领域普通技术人员将会容易地认识到，干细胞对于这样的转移是脆弱的，因而该程序需要谨慎，并且在将细胞培养基替换为另一种更适合进一步分化过程的细胞培养基之前将干细胞维持在原细胞培养基中可以促进更可持续的细胞转移。
分化干细胞
如本文所用的，与基因或蛋白质相关的术语“表达”是指存在RNA分子，其可以使用诸如逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、RNA测序等测定来检测，和/或存在蛋白质，其可以例如使用基于抗体的测定如流式细胞术、免疫细胞化学/免疫荧光等来检测。根据测定的灵敏度和特异性，当检测到最少一个分子(例如在RNA测序中)时，可以认为基因或蛋白质已表达，或者可以相对于对照样品定义高于背景/噪声水平的检测限，例如在流式细胞术中。细胞或细胞群体中标志物的表达可以通过如实施例9中描述的方法来测定。
如本文所用的，术语“标志物”是指由细胞进行的天然存在的可识别的表达，其可以与该细胞的某些性质相关。在优选的实施方案中，标志物是遗传表达或蛋白质组表达，其可以被检测并与细胞的身份相关联。这些标志物可以通过基因来指代。这可以容易地翻译成相应mRNA和蛋白质的表达。
如本文所用的，当与本文公开的任何标志物如表面蛋白质或转录因子结合使用时，术语“阴性”或“-”是指该标志物在细胞或细胞群体中不表达，而术语“弱”或“低”是指与细胞群体中该标志物的平均表达相比或与参考样品相比，该标志物在细胞中以降低的水平表达。
如本文所用的，当与本文公开的任何标志物如表面蛋白质或转录因子结合使用时，术语“阳性”或“+”是指该标志物在细胞或细胞群体中表达，而术语“高”或“强”是指与细胞群体中该标志物的平均表达相比或与参考样品相比，该标志物在细胞中以增加的水平表达。
如本文所用的，术语“分化”泛指细胞从未分化状态或不同于预期分化状态的状态进展到特定分化状态的过程，例如从未成熟状态进展到较成熟状态或从未成熟状态进展到成熟状态的过程，这可以在执行该方法时连续发生。关于多能干细胞的术语“分化”是指细胞从未分化状态进展到特定分化状态的过程，即从未成熟状态进展到较成熟状态或终末状态的过程。当细胞失去未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和细胞成熟的变化。单个标志物的丢失或获得可以表明细胞已经“完全分化”或“终末分化”。“终末分化的”细胞是发育谱系的最后阶段，而不能进一步分化。
如本文所用的，关于培养或分化细胞的术语“接触”是指通过将例如特定化合物放置在允许其触及细胞的位置而使细胞暴露于特定化合物，以便产生“接触的”细胞。接触可以使用任何合适的手段来完成。接触的非限制性实例是通过将化合物添加到细胞的细胞培养基中。只要细胞和特定化合物接近，例如，化合物以合适的浓度存在于细胞培养基中，就假定发生细胞的接触。
如本文所用的，术语“抑制剂”是指减少或抑制或下调某过程的化合物，该过程例如是可促进细胞分化的信号通路。
如本文所用的，术语“激活剂”是指诱导或刺激或上调某过程的化合物，该过程例如是可促进细胞分化的信号通路。
如本文所用的，当描述方案的步骤时，细胞可被称为“细胞”、“分化细胞”，或者在一些情况下，可被称为PSC或“PSC衍生细胞”。技术人员将会认识到，在将PSC分化成特化细胞的方案期间，细胞在某个时刻失去其多能性。因此，当在例如使细胞与化合物接触的步骤中提及“细胞”或“PSC”时，意指最初是多能干细胞的细胞。
干细胞产物
如本文所用的，术语“分化的细胞”是指已从未分化状态进展至较成熟状态的细胞，如多能干细胞。分化的细胞可以是例如较成熟的特化细胞，如祖细胞，或完全成熟为特化/终末细胞类型。
如本文所用的，术语“细胞群体”是指同一培养物中的多个细胞。细胞群体可以是例如不同类型的细胞或处于不同发育阶段的细胞(例如处于通往相同或相似特化特征的不同成熟阶段的细胞)的混合物，或者它可以是具有共同标志物的更均质的细胞组合物。如本文所用的，提及细胞群体或细胞的比例，如“细胞群体中的X％”和“X％的细胞”，可互换使用。
如本文所用的，术语“神经细胞群体”是指包含神经细胞的细胞群体。
如本文所用的，关于细胞的术语“遗传修饰的”是指已经经历基因编辑并且不再被认为是天然存在的细胞的细胞。对于遗传修饰的干细胞，即使干细胞进一步分化成特化细胞，基因编辑产生的性状仍然存在，因此使得该特化细胞成为遗传修饰的和人工的，即非天然存在的。遗传修饰的干细胞的一个实例是HLA缺陷型干细胞，其也被称为通用供体细胞，并且旨在克服移植排斥问题。WO/2020/260563中公开了一种获得HLA缺陷型干细胞的方法。
神经外胚层细胞
如本文所用的，术语“神经的”是指神经系统。
如本文所用的，术语“神经细胞”是指非天然细胞，其中天然对应物自然构成外胚层、更具体地神经外胚层的一部分，并且旨在涵盖该胚层内处于任何发育阶段的细胞，如神经干细胞一直到神经元和其他终末分化细胞类型(例如神经胶质细胞)，即细胞阶段，如神经干细胞阶段和成神经细胞阶段。因此，神经元及其前体被认为是特定类型的神经细胞。
如本文所用的，术语“神经元”和“神经细胞”可互换使用，是指有丝分裂后的并最终分化成特化细胞的神经细胞。神经元身份的特征在于标志物INA、STMN2、TUBB3、MAP2和RBFOX3中的一种或多种的表达。
如本文所用的，术语“成神经细胞”是指中间前体细胞，其通常是专能的或仅仅是单能的并且只能在有限的程度上自我更新。成神经细胞最终产生终末分化的细胞类型，如神经元或星形胶质细胞。术语“成神经细胞”和“中间前体细胞”和“中间祖细胞”可互换使用。中间前体细胞身份的特征在于标志物ASCL1、NEUROD1、NEUROD2、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、EOMES、CHX10、ISL1、SOX4、SOX11、NKX2.1、NFE2L2和NHLH1中的一种或多种的表达。
如本文所用的，术语“神经元祖细胞”、“神经元的前体”和“神经元前体”可互换使用，并且是指具有进一步特化为神经元的潜力或倾向的神经细胞。术语“神经元前体”和“非天然神经元前体”可互换使用。
根据本发明的神经细胞可具有特定的区域身份，如前脑、中脑、后脑、脊髓等特定的细胞。
如本文所用的，术语“前脑”是指神经管和CNS的喙区，其产生包括大脑皮层和纹状体在内的结构。
如本文所用的，术语“中脑”是指神经管和CNS的中间区域(在头尾轴上)，其产生包括黑质在内的结构。
如本文所用的，术语“后脑”和“脊髓”是指神经管的尾区，其位于峡组织体的尾侧。
如本文所用的，术语“多巴胺能(DA)细胞”或“多巴胺能神经元”或“多巴胺神经元”是指能够合成神经递质多巴胺的细胞。
使细胞群体富含神经元和/或其前体的方法
本发明的一方面涉及提供富含神经元和/或其前体的细胞群体的方法，其包括以下步骤：获得包含神经元前体的细胞群体，选择对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞，并且/或者排除对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞。
本发明的另一方面涉及用于使细胞群体富含神经元和/或其前体的方法，其包括以下步骤：获得包含神经元前体的细胞群体，选择对一种或多种阳性标志物呈阳性的细胞，并且/或者排除对一种或多种阴性标志物呈阳性的细胞。
如本文所用的，关于细胞群体的术语“富集”意指增加细胞群体中所需类型的细胞的比例。具体地，如本文所用的，术语“使细胞群体富含神经元和/或其前体”意指增加细胞群体中神经元和/或其前体的比例。由此可见，“富集的”细胞群体意指与未经历富集所述所需类型细胞的方法的参考细胞群体相比，该细胞群体具有比例增加的所需类型的细胞。在优选的实施方案中，通过分离所需类型的细胞来富集细胞群体。如本文所用的，关于细胞群体的术语“分离”意指通过从细胞群体中除去不需要的细胞或通过从细胞群体中回收所需类型的细胞来将所需类型的细胞与不需要的细胞分离。因此，用于使细胞群体富含神经元和/或其前体的方法可以替代地表述为用于从细胞群体中分离神经元和/或其前体的方法，并且本文描述的实施方案同等地适用于两者。
因此，本发明涉及从细胞群体中分离神经元和/或其前体的方法，其包括以下步骤：获得包含神经干细胞的细胞群体，以及选择对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞，并且/或者排除对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞。
在一实施方案中，所述神经干细胞是前脑、中脑、后脑或脊髓区域的神经干细胞。在一实施方案中，所述神经干细胞是腹侧中脑神经干细胞。
如本文所用的，关于包含神经干细胞和/或神经元前体的细胞群体的术语“获得”意指获得可根据用于诱导细胞如PSC的分化的任何方法获得的一批细胞，其中所述细胞分化成包含神经干细胞和/或神经元前体的神经细胞。
如本文所用的，关于包含表达某种标志物的细胞的细胞群体的术语“选择”意指执行旨在产生细胞群体的步骤，与执行该步骤之前的初始细胞群体相比，该细胞群体中表达该标志物的细胞的分数与不表达该标志物的细胞的分数相比增加。可以使用任何合适的方法来选择表达某种标志物的细胞，例如分离表达该标志物的细胞或分开所述细胞。
如本文所用的，关于表达某种标志物的细胞的术语“排除”意指执行旨在产生细胞群体的步骤，与执行该步骤之前的初始细胞群体相比，该细胞群体中表达该标志物的细胞的分数与不表达该标志物的细胞的分数相比降低。可以使用任何合适的方法来排除表达某种标志物的细胞，例如消耗表达该标志物的细胞或分离所述细胞。用于选择和/或排除表达某种标志物的细胞的方法的非限制性实例是抗体介导的分选，如荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)或免疫淘选。由此可见，在优选的实施方案中，阳性标志物和阴性标志物是表面标志物。
如本文所用的，术语“阳性标志物”是指可用于选择细胞的标志物，并且包括标志物PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85。
如本文所用的，术语“阴性标志物”是指可用于排除细胞的标志物，并且包括标志物SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1。
在一实施方案中，所述方法包括获得包含神经元前体的细胞群体。包含神经元前体的细胞群体可以如下获得：首先获得包含表达标志物SOX2的神经干细胞的细胞群体，其中进一步培养该细胞群体直到该细胞群体中SOX2的表达降低，从而指示所述神经干细胞已经进一步分化成中间前体细胞，其中一些是神经元前体。在该阶段，根据该方法的表面标志物适合于选择和/或排除细胞以分离具有神经元命运的细胞。因此，在一实施方案中，所述包含神经元前体的细胞群体通过以下步骤获得：获得包含表达标志物SOX2的神经干细胞的细胞群体，以及培养所述包含神经干细胞的细胞群体，直到在所述包含神经干细胞的细胞群体中SOX2的表达已降低。在一实施方案中，所获得的包含神经干细胞的细胞群体中的至少80％，如至少85％、90％或95％，优选至少95％表达SOX2。在一实施方案中，培养所述包含神经干细胞的细胞群体，直到该细胞群体中SOX2的表达已降低至少5％，例如降低10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％，优选降低至少20％。在一实施方案中，所获得的包含神经干细胞的细胞群体中的至少90％表达SOX2，并且进一步培养所述细胞，直到至少少于90％表达标志物SOX2，优选地直到少于80％表达标志物SOX2，更优选地直到少于70％表达标志物SOX2。
在一实施方案中，步骤c)中的选择和/或排除在所述包含神经干细胞的细胞群体中的少于80％表达标志物SOX2之后的5天内，如4天、3天或2天内进行。
在另一实施方案中，选择和/或排除细胞的时机基于CD99而不是SOX2的表达来确定。因此，在一实施方案中，在步骤a)中获得的所述包含神经干细胞的细胞群体中的至少80％表达CD99。在一实施方案中，在步骤b)中进一步培养所述细胞群体，至少直到所述包含神经干细胞的细胞群体中CD99的表达已降低5％，例如降低10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％。在一实施方案中，在步骤a)中获得的所述包含神经干细胞的细胞群体中的至少90％表达CD99，并且其中在步骤b)中进一步培养所述细胞，直到至少少于90％表达标志物CD99，优选地直到少于80％表达标志物CD99，更优选地直到少于70％表达标志物CD99。并且在一实施方案中，步骤c)中的选择和/或排除在所述包含神经干细胞的细胞群体中的少于80％表达标志物CD99之后的5天内，如4天、3天或2天内进行。
在优选的实施方案中，当基于阳性和阴性标志物选择和/或排除细胞时，所述细胞群体包含中间前体细胞和/或神经元。在一实施方案中，当执行选择和/或排除细胞的步骤时，所述细胞群体中的至少5％，如至少10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％表达中间前体身份或神经元身份。在一实施方案中，培养所述细胞群体，直到标志物ASCL1、NEUROD1、NEUROD2、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、EOMES、CHX10、ISL1、SOX4、SOX11、NKX2.1、NFE2L2和NHLH1中的一种或多种的表达为至少5％，如至少10％、至少15％或至少20％。在一实施方案中，培养所述细胞群体，直到标志物INA、STMN2、TUBB3、MAP2和RBFOX3中的一种或多种的表达为至少5％，如至少10％、至少15％或至少20％。
在一实施方案中，当执行选择和/或排除细胞的步骤时，细胞群体中的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％对标志物ASCL1、NEUROD1、NEUROD2、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、EOMES、CHX10、ISL1、SOX4、SOX11、NKX2.1、NFE2L2、NHLH1、INA、STMN2、TUBB3、MAP2和RBFOX3中的一种或多种呈阳性。
在一实施方案中，在选择和/或排除细胞时，细胞群体中的10-90％如10-80％、10-70％、10-60％或10-50％对SOX2呈阳性，细胞群体中的5-50％如5-40％、5-30％、5-20％对标志物ASCL1、NEUROD1、NEUROD2、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、EOMES、CHX10、ISL1、SOX4、SOX11、NKX2.1、NFE2L2和NHLH1中的一种或多种呈阳性，并且细胞群体中的5-20％如5-15％或5-10％对标志物INA、TUBB3、STMN2、MAP2和RBFOX3中的一种或多种呈阳性。
在其中神经细胞具有腹侧中脑身份的实施方案中，当执行选择和/或排除细胞的步骤时，细胞群体中的至少5％，如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％对标志物ASCL1和INA之一或两者呈阳性。
在一实施方案中，排除对标志物CD47呈阳性的细胞。在一实施方案中，排除对标志物CD99呈阳性的细胞。
在一实施方案中，所述方法包括在选择和/或排除步骤之后使神经元和/或其前体成熟的进一步步骤。
在一实施方案中，所述方法包括在选择和/或排除步骤之后，以及任选地在使神经元和/或其前体成熟的进一步步骤之后，回收富含神经元和/或其前体的神经细胞群体的进一步步骤。
在一实施方案中，所回收的细胞对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阴性。
在一实施方案中，所述细胞群体是神经细胞群体。在一实施方案中，该细胞群体中的至少50％，更优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，或更优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％是神经细胞。
在一实施方案中，所富集的细胞群体具有增加的发育成神经元的倾向。如本文所用的，关于细胞特化的术语“倾向”是指细胞发育成某种细胞类型的可能性。因此，增加细胞群体发育成某种细胞类型的倾向意指增加可能发育成该细胞类型的细胞的比例。
在一实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的神经元和/或其前体属于腹侧中脑、腹侧脊髓、背侧前脑或腹侧前脑区域。
在特定实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的神经元和/或其前体属于腹侧中脑区域。
在某个实施方案中，一次排除腹侧中脑区域的细胞群体和对标志物CD47呈阳性的细胞，其中该细胞群体中的至少5％，如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％表达标志物ASCL1和INA之一。在进一步的实施方案中，排除对标志物CD47和CD99中的任一种呈阳性的细胞。
在另一实施方案中，排除腹侧脊髓、背侧前脑或腹侧前脑的细胞群体以及对标志物CD99呈阳性的细胞。
在某个实施方案中，细胞的选择和/或排除通过抗体介导的细胞分选来进行。在进一步的实施方案中，细胞的选择和/或排除使用荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)或免疫淘选来进行，或者与参考样品相比，优选地使用MACS来进行选择和/或排除。
在一实施方案中，所述神经细胞群体是体外细胞培养物。在一实施方案中，所述神经细胞群体的细胞是非天然的。
本领域技术人员将会认识到，指示细胞阶段的某些标志物的表达可以在细胞内部表达并且将通过例如单细胞RNA-seq来分析，而其他标志物在细胞表面表达并且可以使用抗体介导的分析，如FACS。基于表面标志物的细胞选择和/或排除的时机可以通过分析样品的例如SOX2表达来确立。通常，在用于获得例如神经干细胞的方案的设计过程中，分析该方案期间的细胞表达，使得可以确定该方案中选择和/或排除的时机，而不再需要在生产设置期间监测标志物的表达。
获得包含神经元前体的神经细胞的方法
在一实施方案中，包含神经元前体的细胞群体来源于PSC，优选hPSC。在某个实施方案中，所述hPSC是人胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞。
在所述方法的实施方案中，获得包含神经元前体的细胞群体包括使PSC向包含神经元前体的神经细胞分化的步骤。在某个实施方案中，使PSC与SMAD信号通路的至少一种抑制剂接触。
如本文所用的，术语“SMAD信号通路”是指Small Mothers AgainstDecapentaplegic(SMAD)蛋白信号通路。在一实施方案中，SMAD信号通路的至少一种抑制剂选自头蛋白(Noggin)、LY364947、SB431542和LDN-193189。在一实施方案中，使PSC与SMAD信号通路的两种或更多种抑制剂接触。本领域技术人员将会认识到，使PSC与SMAD信号通路的一种或多种抑制剂接触是一种将细胞分化成神经谱系的可靠技术。
在一实施方案中，在第0天使PSC与SMAD信号通路的一种或多种抑制剂接触。在进一步的实施方案中，使PSC与SMAD信号通路的一种或多种抑制剂接触至少5天，如至少7天、至少8天、至少9天或至少10天。
在所述方法的实施方案中，获得包含神经元前体的细胞群体包括使PSC向前脑、中脑、后脑或脊髓区域的神经细胞分化的步骤。在其中细胞向中脑、后脑或脊髓区域分化的实施方案中，使细胞与WNT通路的至少一种激活剂接触。在一实施方案中，在第0天至第5天内，优选地在第0天，使细胞与WNT信号通路的至少一种激活剂接触。在一实施方案中，使细胞与WNT信号通路的至少一种激活剂接触至少5天，如至少6天、至少7天、至少8天、至少9天。在一实施方案中，在使细胞与SMAD信号通路的一种或多种抑制剂接触的同时，使细胞与WNT信号通路的至少一种激活剂接触。
如本文所用的，术语“WNT通路”是指WNT信号通路。在一实施方案中，WNT通路的至少一种激活剂是GSK3抑制剂，如CHIR99021。因此，在一实施方案中，使PSC与CHIR99021接触。
在所述方法的实施方案中，获得包含神经元前体的细胞群体包括使PSC向神经管的腹侧区域的神经细胞分化的步骤。在这样的实施方案中，细胞可以与SHH信号通路的激活剂接触。如本文所用的，术语“SHH”是指音猬因子(Sonic hedgehog)。在一实施方案中，使细胞与选自音猬因子C24II、嘌吗啡胺(Purmorphamine)和SAG(平滑受体(smoothened)激动剂)的化合物接触。在一实施方案中，从至少第7天，如至少第6天、至少第5天、至少第4天、至少第3天、至少第2天、至少第1天或第0天起，使细胞与SHH信号通路的激活剂接触。在优选的实施方案中，在使细胞与SMAD信号通路的一种或多种抑制剂接触的同时，使细胞与SHH信号通路的激活剂接触。
在所述方法的实施方案中，获得包含神经元前体的细胞群体包括使PSC向中脑或后脑区域的神经细胞分化的步骤。在这样的实施方案中，细胞可以与FGF8、优选FGF8b接触。如本文所用的，术语“FGF”是指成纤维细胞生长因子。在一实施方案中，在第5天至第15天之间，优选地在第8天至第10天之间，例如在第9天，使细胞与FGF8接触。在一实施方案中，使细胞与FGF8接触至少2天，如至少5天或6天。在一实施方案中，当细胞暴露于SMAD信号通路的一种或多种抑制剂结束时，使细胞与FGF8接触。
在所述方法的实施方案中，获得包含神经元前体的细胞群体包括使PSC向腹侧中脑区域的神经细胞分化的步骤。
在神经细胞向腹侧中脑区域分化的实施方案中，使细胞与抗坏血酸如L-抗坏血酸接触。在一实施方案中，在细胞暴露于SMAD信号通路的一种或多种抑制剂结束之后，使细胞与抗坏血酸接触。在一实施方案中，从第9天、第10天、第11天、第12天或第13天，优选地从第11天起，使细胞与抗坏血酸接触。在优选的实施方案中，使细胞与抗坏血酸接触，直到回收神经细胞的步骤。
在神经细胞向腹侧中脑区域分化的实施方案中，使细胞与BDNF接触。如本文所用的，术语“BDNF”是指脑源性神经营养因子。在一实施方案中，在细胞暴露于SMAD信号通路的一种或多种抑制剂结束之后，使细胞与BDNF接触。在一实施方案中，从第9天、第10天、第11天、第12天或第13天，优选地从第11天起，使细胞与BDNF接触。在优选的实施方案中，使细胞与BDNF接触，直到回收神经细胞的步骤。在一实施方案中，使细胞同时与抗坏血酸和BDNF接触。
在神经细胞向腹侧中脑区域分化的实施方案中，使细胞与GDNF接触。如本文所用的，术语“GDNF”是指神经胶质源性神经营养因子。在一实施方案中，在细胞暴露于SMAD信号通路的一种或多种抑制剂结束之后，使细胞与GDNF接触。在一实施方案中，从第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天或第18天，优选地从第16天起，使细胞与GDNF接触。在优选的实施方案中，使细胞与GDNF接触，直到回收神经细胞的步骤。
在神经细胞向腹侧中脑区域分化的实施方案中，使细胞与DAPT或Notch通路的其他抑制剂接触。如本文所用的，术语“DAPT”是指(2S)-N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸1,1-二甲基乙基酯。在一实施方案中，在细胞暴露于SMAD信号通路的一种或多种抑制剂结束之后，使细胞与DAPT接触。在一实施方案中，从第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天或第18天，优选地从第16天起，使细胞与DAPT接触。在优选的实施方案中，使细胞与DAPT接触，直到回收神经细胞的步骤。在一实施方案中，使细胞同时与GDNF和DAPT接触。
在一实施方案中，PSC在包含诸如聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、iMatrix和/或胶原蛋白和/或其片段的细胞外基质的基底上培养并分化。在一实施方案中，该基底包含层粘连蛋白或其片段，如层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-521和/或层粘连蛋白-511。
在一实施方案中，在选择和/或排除细胞的步骤之前，使PSC向包含神经元前体的神经细胞分化至少10天，如至少15天、至少18天、至少20天、至少22天、至少25天或至少30天，优选至少20天。
在一实施方案中，在选择和/或排除细胞的步骤之前，使PSC向包含神经元前体的神经细胞分化15天至50天，优选18天至40天，更优选20天至40天，更优选20天至30天。在一实施方案中，在选择和/或排除细胞的步骤之后，使剩余的神经元和/或其前体进一步分化/成熟。
在一实施方案中，选择和/或排除细胞的步骤在从开始PSC向包含神经元前体的神经细胞分化起的第15天至第40天之间进行。
在一实施方案中，神经细胞向腹侧中脑神经细胞分化，并且选择和/或排除细胞的步骤在第22天至第25天进行。
富含神经元和/或其前体的细胞群体
本发明的另一方面涉及神经元及其前体的细胞群体，其中至少50％的细胞对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性，并且/或者少于50％的细胞对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性。
在一实施方案中，至少50％，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，或甚至更优选至少99％的细胞对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性。
在一实施方案中，少于50％，优选少于45％，更优选少于40％，更优选少于35％，更优选少于30％，更优选少于25％，更优选少于20％，更优选少于15％，更优选少于10％，更优选少于5％，或甚至更优选少于1％的细胞对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性。
在一实施方案中，少于50％，优选少于45％，更优选少于40％，更优选少于35％，更优选少于30％，更优选少于25％，更优选少于20％，更优选少于15％，更优选少于10％，更优选少于5％，或甚至更优选少于1％的细胞对标志物CD47呈阳性。
在一实施方案中，少于50％，优选少于45％，更优选少于40％，更优选少于35％，更优选少于30％，更优选少于25％，更优选少于20％，更优选少于15％，更优选少于10％，更优选少于5％，或甚至更优选少于1％的细胞对标志物CD99呈阳性。
在一实施方案中，少于50％，优选少于45％，更优选少于40％，更优选少于35％，更优选少于30％，更优选少于25％，更优选少于20％，更优选少于15％，更优选少于10％，更优选少于5％，或甚至更优选少于1％的细胞对标志物CD47和CD99呈阳性。
在一实施方案中，至少50％，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，或甚至更优选至少99％的细胞选自腹侧中脑神经元和/或其前体、腹侧脊髓神经元和/或其前体、背侧前脑神经元和/或其前体其以及腹侧前脑神经元和/或其前体。
在一实施方案中，至少50％，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，或甚至更优选至少99％的细胞对标志物FOXA2呈阳性。
在一实施方案中，至少50％，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，或甚至更优选至少99％的细胞是腹侧中脑神经元和/或其前体。
在某个实施方案中，至少50％，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，或甚至更优选至少99％的细胞是成神经细胞和/或神经元。
在一实施方案中，至少50％，优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，或甚至更优选至少99％的细胞对标志物ASCL1和INA之一或两者呈阳性。
在一实施方案中，所述细胞群体具有增加的发育成神经元的倾向。
在一实施方案中，所述细胞群体是体外的。
在一实施方案中，所述细胞群体是神经细胞群体。
在一实施方案中，所述细胞群体富含神经元和/或其前体。
在一实施方案中，所述细胞群体的细胞是体外分化的细胞。
在一实施方案中，所述细胞群体的细胞是非天然细胞。
在一实施方案中，所述细胞群体的细胞衍生自hPSC。
在一实施方案中，所述细胞群体的细胞是遗传修饰的。在进一步的实施方案中，所述遗传修饰的细胞是HLA缺陷的。
在一实施方案中，所述细胞群体包含至少1,000个细胞，如至少100,000个细胞、至少1,000,000个细胞或至少10,000,000个细胞。
在一实施方案中，所述细胞群体通过如上所述的任何方法获得。药物组合物以及作为药物的用途
本发明的一方面涉及包含如本文所述的富集细胞群体的组合物。该组合物可包含药理学上可接受的任何合适的添加剂，如冷冻保护剂和/或生物材料，如细胞外基质。
另一方面涉及用作药物的根据本发明的组合物或细胞群体。因此，在一实施方案中，所述组合物或细胞群体用于预防或治疗需要施用神经元和/或其前体的病状。
在一实施方案中，所述组合物或细胞群体用于治疗神经系统病状，如帕金森病、卒中、创伤性脑损伤、脊髓损伤、亨廷顿病、痴呆、癫痫、失明、阿尔茨海默症和其中神经元丢失或功能障碍的其他神经系统病状。
在具体的实施方案中，所述细胞群体包含用于治疗帕金森病的腹侧中脑神经元和/或其前体。
在具体的实施方案中，所述细胞群体包含用于治疗卒中损伤的皮层神经元和/或其前体。
在另一方面，提供了治疗或预防神经系统病状的方法，其包括向患者施用有效量的根据本发明的细胞群体或组合物。
具体实施方案
现在通过以下非限制性实施方案进一步描述本发明的方面：
1.从细胞群体中分离神经元和/或其前体的方法，其包括以下步骤：
a)获得包含表达SOX2的神经干细胞的细胞群体，
b)进一步培养所述包含神经干细胞的细胞群体，
c)选择对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞，并且/或者排除对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞。
2.根据前述实施方案所述的方法，其中在步骤a)中获得的所述包含神经干细胞的细胞群体中的至少80％表达SOX2。
3.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤b)中进一步培养所述细胞群体，至少直到所述包含神经干细胞的细胞群体中SOX2的表达已降低5％，例如降低10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％。
4.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤a)中获得的所述包含神经干细胞的细胞群体中的至少90％表达SOX2，并且其中在步骤b)中进一步培养所述细胞群体，直到至少少于90％表达标志物SOX2，优选地直到少于80％表达标志物SOX2，更优选地直到少于70％表达标志物SOX2。
5.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤c)中的选择和/或排除在所述包含神经干细胞的细胞群体中的少于80％表达标志物SOX2之后的5天内，如4天、3天或2天内进行。
6.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤a)中获得的所述包含神经干细胞的细胞群体中的至少80％表达CD99。
7.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤b)中进一步培养所述细胞群体，至少直到所述包含神经干细胞的细胞群体中CD99的表达已降低5％，例如降低10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％。
8.根据前述实施方案所述的方法，其中在步骤a)中获得的所述包含神经干细胞的细胞群体中的至少90％表达CD99，并且其中在步骤b)中进一步培养所述细胞群体，直到至少少于90％表达标志物CD99，优选地直到少于80％表达标志物CD99，更优选地直到少于70％表达标志物CD99。
9.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤c)中的选择和/或排除在所述包含神经干细胞的细胞群体中的少于80％表达标志物CD99之后的5天内，如4天、3天或2天内进行。
10.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤b)中进一步培养所述细胞群体，直到标志物ASCL1、NEUROD1、NEUROD2、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、EOMES、CHX10、ISL1、SOX4、SOX11、NKX2.1、NFE2L2和NHLH1中的一种或多种的表达为至少5％，如10％、15％或20％。
11.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤b)中进一步培养所述细胞群体，直到标志物INA、STMN2、TUBB3、MAP2和RBFOX3中的一种或多种的表达为至少5％，如10％、15％或20％。
12.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤c)中选择和/或排除细胞时，所述细胞群体中的10-90％对SOX2呈阳性，所述细胞群体中的5-50％对标志物ASCL1、NEUROD1、NEUROD2、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、EOMES、CHX10、ISL1、SOX4、SOX11、NKX2.1、NFE2L2和NHLH1中的一种或多种呈阳性，并且所述细胞群体中的5-20％对标志物INA、TUBB3、STMN2、MAP2和RBFOX3中的一种或多种呈阳性。
13.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体是神经细胞群体。
14.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述包含神经干细胞的细胞群体是通过PSC的至少14天神经诱导获得的。
15.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述神经干细胞是前脑、中脑、后脑或脊髓区域的神经干细胞。
16.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述神经干细胞是腹侧中脑神经干细胞。
17.提供富含神经元和/或其前体的细胞群体的方法，该方法包括以下步骤：
-获得包含神经元前体的细胞群体，
-选择对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞，以及/或者
-排除对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞。
18.根据实施方案17所述的方法，其中所述包含神经元前体的细胞群体通过以下步骤获得：获得包含表达标志物SOX2的神经干细胞的细胞群体，以及培养所述包含神经干细胞的细胞群体，直到在所述包含神经干细胞的细胞群体中标志物SOX2的表达降低。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所获得的包含神经干细胞的细胞群体中的至少80％表达标志物SOX2。
20.根据实施方案19所述的方法，其中进一步培养所述细胞群体，至少直到所述包含神经干细胞的细胞群体中SOX2的表达已降低5％，例如降低10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％。
21.根据实施方案18和19中任一项所述的方法，其中所述包含神经干细胞的细胞群体中的至少80％对SOX2呈阳性，并且其中培养所述包含神经干细胞的细胞群体，直到SOX2的表达低于80％。
22.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中排除对标志物CD47呈阳性的细胞。
23.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中排除对标志物CD99呈阳性的细胞。
24.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中排除对标志物CD99和CD47中的任一种呈阳性的细胞。
25.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体中的至少80％是神经细胞。
26.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中当选择和/或排除细胞时，所述细胞群体中的至少5％表达中间前体身份或神经元身份。
27.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中当选择和/或排除细胞时，所述细胞群体中的至少5％对标志物ASCL1、NEUROD1、NEUROD2、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、EOMES、CHX10、ISL1、SOX4、SOX11、NKX2.1、NFE2L2和NHLH1中的一种或多种呈阳性。
28.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中当选择和/或排除细胞时，所述细胞群体中的至少5％对标志物INA、TUBB3、STMN2、MAP2和RBFOX3中的一种或多种呈阳性。
29.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体衍生自PSC，优选hPSC。
30.根据实施方案29所述的方法，其中获得所述细胞群体包括使PSC向包含神经元前体的神经细胞分化的步骤。
31.根据实施方案30所述的方法，其中所述PSC向前脑、中脑、后脑或脊髓区域的神经细胞分化。
32.根据实施方案30和31中任一项所述的方法，其中使所述PSC向神经细胞分化15天至50天。
33.根据实施方案30和31中任一项所述的方法，其中使所述PSC向神经细胞分化至少20天。
34.根据实施方案30至33中任一项所述的方法，其中使所述PSC与SMAD信号通路的至少一种抑制剂接触。
35.根据实施方案30至34中任一项所述的方法，其中使所述细胞与WNT信号通路的至少一种激活剂接触。
36.根据实施方案30至35中任一项所述的方法，其中使所述细胞与SHH信号通路的激活剂接触。
37.根据实施方案30至36中任一项所述的方法，其中使所述细胞与FGF8接触。
38.根据实施方案30至37中任一项所述的方法，其中所述细胞在用层粘连蛋白或其片段、优选层粘连蛋白-521和/或层粘连蛋白-511和/或层粘连蛋白-111包被的基底上培养。
39.根据实施方案30至38中任一项所述的方法，其中使所述细胞与抗坏血酸接触。
40.根据实施方案30至39中任一项所述的方法，其中使所述细胞与BDNF和/或GDNF接触。
41.根据实施方案30至40中任一项所述的方法，其中使所述细胞与DAPT接触。
42.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其包括在选择和/或排除步骤之后使神经元和/或其前体成熟的进一步步骤。
43.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其包括在选择和/或排除步骤之后，以及任选地在使神经元和/或其前体成熟的进一步步骤之后，回收富含神经元和/或其前体的细胞群体的步骤。
44.根据实施方案43所述的方法，其中冷冻保存所回收的富含神经元和/或其前体的细胞群体。
45.根据实施方案43和44中任一项所述的方法，其中所回收的细胞对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阴性。
46.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述富含神经元和/或其前体的细胞群体具有增加的发育成神经元的倾向。
47.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中至少50％的所述神经元和/或其前体是前脑、中脑、后脑或脊髓区域的神经元和/或其前体。
48.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中至少50％的所述神经元和/或其前体是腹侧中脑区域的神经元和/或其前体。
49.根据实施方案31至47中任一项所述的方法，其中至少50％的所述神经元和/或其前体是前脑区域的神经元和/或其前体，并且其中所述选择和/或排除步骤在第30天至第70天之间进行，优选地在第30天至第40天之间进行。
50.根据实施方案31至47中任一项所述的方法，其中至少50％的所述神经元和/或其前体是脊髓区域的神经元和/或其前体，并且其中所述选择和/或排除步骤在第20天至第40天之间进行，优选地在第20天至第30天之间进行。
51.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞的选择和/或排除通过抗体介导的细胞分选来进行。
52.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞的选择和/或排除使用荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)或免疫淘选来进行。
53.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述标志物是表面标志物。
54.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体是体外的。
55.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体的细胞是非天然的。
56.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体是神经细胞群体。
57.通过根据前述实施方案中任一项所述的方法获得的细胞群体。
58.神经元和/或其前体的细胞群体，其中所述细胞群体中的至少50％对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性，并且/或者少于50％的细胞对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性。
59.根据实施方案58所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的至少50％对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性，并且对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD83、CD99、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阴性。
60.根据实施方案58和59中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的至少50％选自腹侧中脑神经元和/或其前体、腹侧脊髓神经元和/或其前体、背侧前脑神经元和/或其前体以及腹侧前脑神经元和/或其前体。
61.根据实施方案58至60中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的超过80％对标志物CD47呈阴性。
62.根据实施方案58至61中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的超过80％对标志物CD99呈阴性。
63.根据实施方案58至62中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的超过80％对标志物CD47和CD99呈阴性。
64.根据实施方案58至63中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的至少60％对标志物FOXA2呈阳性。
65.根据实施方案58至64中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的至少50％是腹侧中脑神经元和/或其前体。
66.根据实施方案58至65中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的至少80％对标志物ASCL1和INA之一或两者呈阳性。
67.根据实施方案58至66中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体具有增加的发育成神经元的倾向。
68.根据实施方案58至67中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体的细胞是体外分化的细胞。
69.根据实施方案58至68中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体是体外的。
70.根据实施方案58至69中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体的细胞是非天然细胞。
71.根据实施方案58至70中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体的细胞衍生自hPSC。
72.根据实施方案58至71中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体的细胞是遗传修饰的。
73.根据实施方案72所述的细胞群体，其中所述遗传修饰的细胞是HLA缺陷的。
74.根据实施方案58至73中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体包含至少1,000个细胞。
75.根据实施方案58至74中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体富含神经元和/或其前体。
76.根据实施方案58至75中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体是神经细胞群体。
77.根据实施方案58至76中任一项所述的细胞群体，其通过根据实施方案1至56中任一项所述的方法获得。
78.组合物，其包含根据实施方案57至77中任一项所述的细胞群体。
79.根据实施方案57至77中任一项所述的细胞群体或根据实施方案78所述的组合物，其用作药物。
80.根据实施方案79所述的细胞群体或组合物，其用于预防或治疗需要施用神经元和/或其前体的病状。
81.根据实施方案57至77中任一项所述的细胞群体或根据实施方案78所述的组合物，其用于治疗选自帕金森病、卒中、创伤性脑损伤、脊髓损伤、亨廷顿病、痴呆、癫痫、失明、阿尔茨海默症和其中神经元丢失或功能障碍的其他神经系统病状的神经系统病状。
82.治疗或预防神经系统病状的方法，其包括向患者施用有效量的根据实施方案79所述的细胞群体或组合物。
实施例
以下是用于实施本发明的非限制性实施例。
实施例1：人类多能干细胞向神经元的分化
人类胚胎干细胞(hESC)系RC17(Roslin CT)和3053(Novo Nordisk A/S)在人层粘连蛋白-521基质(0.7-1.2μg/cm2；Biolamina)包被的培养器皿上在补充有60U/mL青霉素-链霉素(P-S；Thermo Fisher Scientific)的iPS Brew XF培养基(Miltenyi Biotec)中培养。每天更换培养基，每4-6天用EDTA 0.5mM(Thermo Fisher Scientific)进行细胞传代。将培养物维持在37℃、湿度95％和5％ CO2水平下。
根据确立的方案(Nolbrant等人，2017；Kirkeby等人，2017)，使hESC向腹侧中脑神经元分化。简言之，使hESC生长至70-90％汇合，然后用0.5mM EDTA解离。将细胞以104个细胞/cm2接种在用人层粘连蛋白-111(1.2μg/cm2；BioLamina)包被的细胞培养瓶或培养板中，并立即与分化培养基接触。在第0-8体外天(DIV)，将细胞暴露于基于N2的培养基：50％DMEM/F12+Glutamax(Gibco)、50％ Neurobasal(Gibco)、1％N2补充剂CTS(Thermo FisherScientific)、5％GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific)、0.2％ P-S(Thermo FisherScientific)并补充SMAD抑制剂SB431542(10μM；Miltenyi Biotec)、用于神经诱导的头蛋白(Noggin)(100ng/mL；Miltenyi Biotec)、用于腹侧命运的音猬因子(Sonic hedgehog)C24II(SHH；500ng/mL；Miltenyi Biotec)、用来促进尾化(caudalisation)的GSK3β抑制剂CHIR99021(CHIR；0.5-0.6μM；Miltenyi Biotec)。在DIV9-11，向基于N2的培养基补充成纤维细胞生长因子8b(FGF8b；100ng/mL；Miltenyi Biotec)。在DIV11时，用accutase(ThermoFisher Scientific)解离细胞，并以0.8×106个细胞/m2接种在用人层粘连蛋白-111(1.2μg/cm2)包被的细胞培养瓶或培养板中补充有10μM的Y-27632(Miltenyi Biotec)的DIV11-16培养基(Neurobasal、2％不含维生素A的B27补充剂CTS(Thermo Fisher Scientific)、5％ GlutaMAX、0.2％ P-S，并补充有FGF8b(100ng/mL)、L-抗坏血酸(AA；200μM；Sigma)、人脑源性神经营养因子(BDNF；20ng/mL；Miltenyi Biotec))中。在第16体外天(DIV)，用accutase解离细胞，并冷冻保存，或重新接种在用聚-L-鸟氨酸(0.002％)和层粘连蛋白-521(1.5μg/cm2)包被的细胞培养瓶/板中补充有BDNF(20ng/mL)、GDNF(20ng/mL)、L-抗坏血酸(200μM)、dcAMP(500μM)、DAPT(10μM)和Y-27632(10μM)的B27培养基中用于延长的体外培养，从而允许腹侧中脑神经干细胞进一步分化并成熟为神经元。
参考文献：
·Nolbrant S,Heuer A,Parmar M,Kirkeby A.Generation of high-purity
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maturation and intracerebral transplantation.Nat Protoc.2017年9月；12(9):1962-1979.doi:10.1038/nprot.2017.078.Epub 2017年8月31日.PMID:28858290.
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实施例2：用于鉴定新型选择候选物的scRNA测序实验设计和技术方法
为了进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，用accutase将细胞培养物解离成单细胞悬液，并且使用10X Genomics Chromium Platform处理3000-10000个细胞，并在NextSeq550上进行测序。整理数据以过滤掉凋亡的和应激的以及多联体(multiplet)。
按照确立的方案使人类多能干细胞(hPSC)分化成腹侧中脑多巴胺神经元导致细胞经历几个主要细胞发育阶段。首先，hPSC转变为神经干细胞(NSC)(图1A-B)，然后是中间前体细胞(IP)(图1C)，最后是终末分化的细胞类型(图1D)。然而，该过程并不精确，在NSC阶段后培养物失去其同质性，并且通常开始分化成多种细胞类型并形成混合细胞培养物(图1C)。这种混合培养组合物持续存在，直到分化完成并且细胞获得最终命运(图1D)。使用基因的不同表达组合(通常是指示细胞命运的转录因子蛋白质)来鉴定这些变化的细胞类型，并且在图1A-D中示出。
在分化过程中的数个时间点应用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析，从而允许观察并监测从同质培养物到异质混合培养物的转变。从转录组图谱可以看出，用于分化的hPSC及其形成的NSC是高度同质的。hPSC高水平地表达其多能身份的标志物，所分析的99.5％的hPSC表达多能性标志物POU5F1和多能性/NSC标志物SOX2，并且这些基因以高水平表达(图2A、2B)。此外，hPSC表达最低水平或低水平的指示分化细胞命运的其他基因，如中间前体(IP)标志物ASCL1或神经元标志物INA(图2A、2B)。类似地，NSC是高度同质的，表达NSC标志物SOX2，但不表达多能性标志物POU5F1，并且具有IP标志物ASCL1和神经元标志物INA的最低表达和低表达(图3A、3B)。
NSC阶段后在培养物中出现的异质性在转录水平上很明显，并且以DIV24的scRNA-seq分析为例来显示(图4A、4B)。在该时间点，细胞群体表达各种细胞类型和阶段的标志物，例如20.4％的NSC(POU5F1-/SOX2+/ASCL1-/INA-细胞；图4A)以及48.2％的中间前体细胞(POU5F1-/SOX2+或-/ASCL1+/INA+或-；图4A)和16.3％的神经元(POU5F1-/SOX2-/ASCL1+或-/INA+或-；图4A)。多能干细胞在该阶段不存在，因为它们分化成NSC、IP和神经元(POU5F1+/SOX2+/ASCL1-/INA-；图4A、4B)。
实施例3：混合培养阶段的scRNA测序以及细胞群体和纯化候选物的鉴定
进行了scRNA-seq时间过程研究，从细胞为同质的时间点(DIV16NSC)到它们已发育成混合培养物时(DIV26混合培养物；图1E)，每48小时采样一次。在该窗口内每48小时(DIV16、18、22、24、26)采样确保了获得连续的数据，从而能够观察细胞分化和多样化为不同细胞阶段和类型的轨迹，并挖掘可用于采用局限于这些群体的表面抗原来分离感兴趣或不感兴趣的群体的标志物。
我们鉴定了DIV22-26之间的混合培养物，并比对了这些数据集以搜索亚型限制的表面抗原(图5)。在其中，可以看到每个细胞(由单个点表示)都表达与不同细胞阶段相对应的基因，例如主要存在于t-SNE图的下半部分的NSC和脱靶(SOX2+；图5)、位于t-SNE图的中部的IP(ASCL1+；图5)和位于t-SNE图的顶部的神经元(INA+；图5)。与胚胎的腹侧中脑底板区域相对应的标志物(LMX1A)并非在所有细胞中都表达，而选择性地在t-SNE图底部的两个簇中不存在(图5，圈出)，从而进一步表明了这些培养物的异质性。通过比较与这些不同细胞类型和阶段相对应的簇，我们能够鉴定其表达局限于这些身份的基因。
实施例4：用于NSC、IP和神经元分离的候选基因的表达谱
神经元簇中评分最高的差异表达的表面标志物基因被证实在整个t-SNE图上的分布与神经元标志物INA类似(图6-图7)，并且这些基因被认为适合于从混合培养物中分离神经元。这包括基因ADGRG1、EPFHB2、GAP43、ADCYAP1、C1QL1和NRXN1(图6)以及FZD1、CACNA2D1、DCC、GPR85和LRRC4C。
IP细胞簇中评分最高的差异表达的表面标志物基因被证实在整个t-SNE图上的分布与多巴胺神经元谱系ASCL1的IP细胞标志物类似(图8)，并且这些基因被认为适合于从混合培养物中分离神经元。这包括基因TNFRSF21、TRPM8、FREM2、DLL3、DLL1、CHRNA5和CLDN5。
NSC/脱靶簇中评分最高的差异表达的表面标志物基因被证实在整个t-SNE图上的分布与NSC/脱靶标志物SOX2类似(图9-图11)，并且这些基因被认为适合于从混合培养物中分离NSC/脱靶细胞。这包括基因SLIT2、NTN1、CMTM7、CMTM8、CD36、CD47、CD99、TNFRSF1A、TMEM123、LRP10、HLA-A、RAMP1、CMTM6、TNFRSF12A、CRLF1、ITGB8和CD83。
实施例5：使用针对CD47和CD99的抗体对中脑神经细胞进行的荧光激活细胞分选
(FACS)
如实施例1所述，在2D体外培养中由hESC生成腹侧中脑多巴胺能(vmDA)祖细胞。开始分化后25天，使用accutase将细胞培养物解离成单细胞悬液，并收集在N2培养基(补充有1％ CTSTMN-2补充剂的CTSTMNeurobasalTM培养基)中。使用LIVE/DEADTM可固定近红外死细胞染色试剂盒标记死细胞。然后将细胞重悬于B27培养基(CTSTMNeurobasalTM培养基，补充有1％不含维生素A的B-27TM补充剂、2mM GlutaMAXTM、60U/mL青霉素-链霉素、10μM ROCK抑制剂)中，并以1:2500的浓度使用APC缀合的抗CD47抗体进行染色。使用BD FACSAriaTMFusion仪器通过荧光激活细胞分选(FACS)纯化CD47阳性和阴性细胞(图12)。通过对总活细胞群体进行分选获得“通过”对照样品(图12C)。FACS后，CD47阳性和阴性细胞级分的纯度分别被确认为>87％和>91％(图13)。FACS后立即将分选的细胞以450,000个细胞/cm2的密度重新接种到用聚-L-鸟氨酸(0.002％)和层粘连蛋白-521(1.5μg/cm2)包被的96孔板中补充有BDNF(20ng/mL)、GDNF(20ng/mL)、L-抗坏血酸(200μM)、dcAMP(500μM)、DAPT(10μM)和Y-27632(10μM)的B27培养基中。24小时(图19)和5天(图20)后获得的相差图像显示了分选的细胞的高活力以及CD47阳性和阴性细胞之间形态上的明显差异；CD47阳性细胞看起来具有大的、低对比度的细胞体，没有或几乎没有突起(图19A-Ai、20A-Ai)，而CD47阴性细胞则表现出典型的神经元形态，其特征是小的、高对比度、圆形/椭圆形细胞体，具有界限清楚的突起，看到其数目和长度在五天培养期内增加(图19B-Bi、20B-Bi)。正如预期的那样，“通过”对照样品包含具有这两种不同形态的细胞的混合物(图19C-Ci、20C-Ci)。此外，在细胞分选后立即使用BD转录因子缓冲液组对分选细胞的样品进行针对细胞内流式细胞术的处理，并用抗SOX2抗体(1:30)、抗Ki-67抗体(1:100)和抗FOXA2抗体(1:320)进行染色，使用BD FACSymphonyTM流式细胞仪进行记录，并使用FlowJo 10.7.2软件进行分析。首先，确认分选的样品的纯度>91％(图14、图18)。发现CD47阳性分选级分富含表达神经干细胞标志物SOX2(71.1％；图15A、18)以及增殖标志物Ki-67(26.3％；图16A、图18)的细胞，而CD47阴性分选级分显示明显较低水平的SOX2(16.2％；图15B、图18)和Ki-67(2.67％；图16B、图18)，对应于表达SOX2和Ki67的细胞的百分比分别为77.2％和89.8％的差异。这些结果支持以下假设：基于CD47抗体的选择可用于富集神经元并消耗增殖性神经干细胞及其衍生物，而不消耗感兴趣的谱系，如表达FOXA2(发育底板的标志物)的细胞的百分比所示(图17、18)。这些结果得到了在体外重新接种的细胞的免疫荧光(IF)染色的支持。分选后5天，将细胞在4％低聚甲醛中固定，并用抗Ki-67第一抗体(1:250)、抗FOXA2第一抗体(1:100)和抗酪氨酸羟化酶第一抗体(TH；1:500)，随后用荧光标记的第二抗体进行染色。使用CellSens软件在Olympus Ix81显微镜上获取图像。IF染色证实了流式细胞术结果，表明CD47阴性细胞的富集减少了Ki67+增殖性细胞的数目(图21、图35)和SOX2+细胞的数目(图36)，而不消耗感兴趣的细胞，如FOXA2和多巴胺神经元特异性标志物TH所示(图22、23)。
在类似的实验中，将第25天的vmDA培养物解离成单细胞悬液，并以1:500的浓度使用PE缀合的抗CD99抗体进行染色。使用BD FACSAriaTMFusion仪器通过荧光激活细胞分选(FACS)纯化CD99阳性和阴性细胞(图24)。通过对总活细胞群体进行分选获得“通过”对照样品(图24C)。FACS后，CD99阳性和阴性细胞级分的纯度分别被确认为79％和100％(图25)，并且在所有分选的级分中观察到高活力(>85％)(图26)。将分选的细胞以450,000个细胞/cm2的密度重新接种到用聚-L-鸟氨酸(0.002％)和层粘连蛋白-521(1.5μg/cm2)包被的96孔板中补充有BDNF(20ng/mL)、GDNF(20ng/mL)、L-抗坏血酸(200μM)、dcAMP(500μM)、DAPT(10μM)和Y-27632(10μM)的B27培养基中。24小时(图27)、48小时(图28)和5天(图29)后获得的相差图像显示了分选细胞良好的回收以及CD99阳性和阴性细胞之间形态上的明显差异；发现CD99阴性级分含有非神经元细胞，其特征是大的、低对比度的细胞体，并且没有或几乎没有突起(图27A-Ai、图28A-Ai、图29A-Ai)。这些非神经元细胞在CD99阴性分选级分中不存在，相反其中细胞表现出典型的神经元形态，其特征是小的、高对比度、圆形/椭圆形细胞体，具有界限清楚的突起，看到其数目和长度在五天培养期内增加(图27B-Bi、图28B-Bi、图29B-Bi)。正如预期的那样，“通过”对照样品包含具有这两种不同形态的细胞的混合物(图27C-Ci、图28C-Ci)。
分选后48小时和12天，使用针对Ki-67、FOXA2和TH的抗体通过IF对细胞进行定性评估。IF染色显示，与CD99阳性和“通过”对照细胞相比，CD99阴性分选级分含有数目减少的表达Ki-67的细胞(图30、31)，同时仍然表现出大量表达多巴胺神经元谱系特异性标志物FOXA2和TH的细胞(图32、33)。总之，这些结果支持以下假设：基于CD99抗体的选择可用于富集神经元并消耗增殖性神经干细胞及其非神经元衍生物。
虽然CD47阴性或CD99阴性细胞的FACS富集允许富集神经元细胞并大幅减少增殖性NSC/非神经元细胞类型的数目，但单独使用CD47或CD99都不允许完全耗尽这些不需要的增殖性细胞类型。令人感兴趣的是，对第25体外天(DIV)的vmDA培养物的流式细胞术分析表明，虽然高比例(34.5％)的细胞在该阶段既表达CD47又表达CD99(图34Q2)，但也存在只表达CD47的细胞群体(8.28％，图34Q3)或只表达CD99的细胞群体(6.42％，图34Q1)，提示这些标志物的组合用于富集将比它们单独使用时产生更纯的神经元群体。在一个实验中，将第25天的vmDA培养物解离成单细胞悬液，用抗CD47抗体单独或与抗CD99抗体组合染色，通过FACS分别纯化阳性(CD47+)和阴性(CD47-)或双阳性(CD47+CD99+)和双阴性(CD47-CD99-)细胞群体，并如前所述通过细胞内流式细胞术进行分析。首先，测定分离的级分中表达CD47和/或CD99的细胞的百分比。未分选的对照样品显示约60％的细胞表达CD47和CD99(图37、38)。正如预期的那样，表达CD47的细胞的百分比在CD47+和CD47+CD99+样品中增加(>94％，图37)，而在CD47-和CD47-CD99-样品中几乎完全耗尽(<2.5％，图37)，确认了群体的成功分离。类似地，表达CD99的细胞的百分比在CD47+和CD47+CD99+样品中均增加(>83％，图38)，而在CD47-和CD47-CD99-样品中几乎完全耗尽(<3.5％，图38)，表明通过基于CD47抗体的FACS富集CD47-细胞导致CD99+细胞的耗尽。CD47-和CD47-CD99-级分均显示表达SOX2(图39)和Ki67(图40)的细胞的比例显著降低，而如INA所标记的神经元水平增加(图41)。
表1：用于FACS实验的试剂列表
实施例6：使用抗CD47抗体磁分选对中脑神经细胞进行的磁激活细胞分选(MACS)
如实施例1所述，在2D体外培养中由hESC生成腹侧中脑多巴胺能(vmDA)祖细胞。开始分化后24天，使用accutase将细胞培养物解离成单细胞悬液，并收集在B27培养基(补充有1％不含维生素A的B-27TM补充剂、2mM GlutaMAXTM、60U/mL青霉素-链霉素、10μM ROCK抑制剂的CTSTMNeurobasalTM培养基)中。然后将细胞重悬于含有0.5％BSA的Hank平衡盐溶液中，以1:50的浓度使用APC缀合的抗CD47抗体进行染色，随后用抗APC微珠进行标记。使用LSMACS柱通过磁激活细胞分选(MACS)纯化CD47阳性和阴性细胞。收集含有未标记的细胞的通过级分。洗脱磁力保留的细胞并作为正选择的级分来收集。MACS后，CD47阴性和阳性细胞级分的存活率均被确认为>90％。MACS后立即将分选的细胞以200,000个细胞/cm2的密度重新接种到用聚-L-鸟氨酸(0.002％)和层粘连蛋白-521(1.5μg/cm2)包被的96孔板中补充有BDNF(20ng/mL)、GDNF(20ng/mL)、L-抗坏血酸(200μM)、dcAMP(500μM)、DAPT(10μM)和Y-27632(10μM)的B27培养基中。未分选的细胞用作对照。48小时后获得的相差图像(图42)显示了分选的细胞的高活力以及未分选细胞和CD47阴性细胞之间形态上的明显差异；CD47阴性细胞表现出典型的神经元形态，其特征是小的、高对比度、圆形/椭圆形细胞体，具有界限清楚的突起(图42A)，而未分选的细胞看起来像神经元细胞和具有大的、低对比度细胞体且没有或几乎没有突起的细胞的混合物(图42B)。此外，在细胞分选后立即使用BD转录因子缓冲液组对分选细胞的样品进行针对细胞内流式细胞术的处理，并用抗SOX2抗体(1:130)、抗Ki-67抗体(1:2500)、抗FOXA2抗体(1:320)、抗LMX1A抗体(1:2500)、抗ASCL1抗体(1:2500)和抗INA抗体(1:3000)进行染色，使用CytoFLEXTM流式细胞仪进行记录，并使用FlowJo10.7.2软件进行分析。首先，确认分选的样品的纯度>68％(图43)。发现CD47阴性级分表达较低水平的神经干细胞标志物SOX2(52.7％；图44)以及增殖标志物Ki-67(7.9％；图44)，而未分选的对照则显示较高水平的SOX2(78.6％；图44)和Ki-67(23.1％；图44)，对应于表达SOX2和Ki67的细胞的百分比分别为33％和65.8％的差异。此外，发现与未分选的对照相比，CD47阴性级分维持相同数目的表达FOXA2(发育底板的标志物)的细胞(76％；图44)。还发现CD47阴性级分富含表达早期腹侧中脑标志物LMX1A(78％；图44)、中间祖细胞标志物ASCL1(51.2％；图44)和神经元标志物INA(59.8％；图44)的细胞，而未分选的对照则显示较低水平的所有三种标志物(LMX1A 61％；ASCL1 28.8％；INA 23.3％；图44)，对应于表达LMX1A、ASCL1和INA的细胞的百分比分别为21.8％、43.8％和61％的差异。这些结果表明，基于CD47抗体的选择可用于富集神经元并消耗增殖性神经干细胞及其衍生物。这些结果得到了在体外重新接种的细胞的免疫荧光(IF)染色的支持。分选后10天，将细胞在4％低聚甲醛中固定，并用针对多巴胺能神经元标志物酪氨酸羟化酶的第一抗体(TH；1:500)，随后用荧光标记的第二抗体进行染色。使用ZEN 3.2Pro软件在Zeiss Axio Observer显微镜上获取图像。IF染色证实了CD47阴性细胞的富集产生富含多巴胺能神经元的细胞群体(图53)。
表2：用于MACS实验的试剂列表
实施例7：人类多能干细胞向前脑神经细胞的分化以及这些细胞中CD47和CD99表
达的测量
根据确立的方案(Shi等人,2012(a)；Shi等人,2012(b))使hESC分化。将hESC接种并培养在层粘连蛋白-521(1.2μg/cm2；BioLamina)包被的培养器皿上，并且一旦形成95-100％汇合的单层，就将其暴露于分化培养基。在DlV0-10，将细胞在基于N2/B27的培养基中培养：50％DMEM/F12+Glutamax(Gibco)、50％ Neurobasal(Gibco)、2％含维生素A的B27补充剂CTS(Thermo Fisher)、1％ N2补充剂CTS(Thermo Fisher)、5％ GlutaMAX(ThermoFisher)、0.2％青霉素链霉素(P/S；Thermo Fisher)、1％ NEAA(Gibco)、0.089％β-巯基乙醇(Gibco)，补充有BMP通路抑制剂LDN-193189(100nM；Miltenyi Biotec)和用于神经诱导的头蛋白(Noggin)(100ng/mL；Miltenyi Biotec)。在DIV11，用0.5mM EDTA解离细胞并以1:2的比率传代。在DIV11-18，向基于N2/B27的培养基补充成纤维细胞生长因子b(20ng/mL；R&D)。在DIV18，用0.5mM EDTA解离细胞，并冷冻保存或以1:2的比率传代。从DIV20起，细胞在不含补充剂的基于N2/B27的培养基中培养，并在DIV32传代。在DIV35，使用accutase将前脑神经细胞解离成单细胞悬液，用荧光团缀合的抗CD47和CD99抗体染色，并如实施例5所述通过流式细胞术进行分析。在该分化阶段，大约50％的细胞表达神经干细胞标志物SOX2(图46)，而大约20％的细胞表达增殖标志物Ki67(图46A)，表明这些细胞仍然是有丝分裂的神经干细胞，并且大约60％表达神经元标志物INA(图46B)，表明它们已经分化或正在分化为神经元。分析显示，63％的细胞表达CD99(图45A)，而78％表达CD47(图45B)。此外，发现绝大多数表达CD99和CD47的细胞共表达SOX2(图47)和Ki67(图48)两者。这些结果有力地支持了以下假设：CD99和CD47可作为抗体靶标用于通过FACS或MACS富集前脑神经元并消耗增殖性细胞。
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实施例8：人类多能干细胞向后脑/脊髓神经细胞的分化以及这些细胞中CD47和
CD99表达的测量
将80-90％汇合的未分化hESC用EDTA 0.5mM(Thermo Fisher)在室温下解离5-7分钟，以从培养瓶中脱壁以供重新接种。将hESC聚集体接种到层粘连蛋白-521(1.2μg/cm2)预包被的24孔板上或T25瓶(Sarstedt)中并均匀分布。前24小时，将细胞维持在iPS Brew XF(Miltenyi Biotec)中，并补充10μM Y27632(ROCKi；Miltenyi Biotec)以增强细胞存活率。每24小时更换一次培养基，使细胞生长至90-100％汇合，此时开始分化。在前6天分化中，将细胞维持在由45％ Neurobasal(Gibco)、45％ DMEM/F12+GlutaMAX(Gibco)、5％ B27补充剂(Thermo Fisher)、1％ N2补充剂(Thermo Fisher)、1％ MEM非必需氨基酸(NEAA；Gibco)、0.5％ GlutaMAX(Gibco)、0.2％青霉素/链霉素(P/S；Thermo Fisher)组成的泛神经元基础培养基(Pan-Neuronal Base Media)中，其中补充有BMP通路抑制剂LDN-193189(100nM；Miltenyi Biotec)和用于神经诱导的头蛋白(Noggin)(100ng/mL；MiltenyiBiotec)。添加3μM CHIR99021(CHIR；Miltenyi Biotec)以进行尾化，并且每天更换培养基。第6天，使用accutase解离细胞并以1:6的比率传代。在DIV6-12，细胞在补充有BMP通路抑制剂LDN-193189(100nM；Miltenyi Biotec)和头蛋白(Noggin)(100ng/mL；Miltenyi Biotec)加上1μM CHIR、100nM嘌吗啡胺(Purmorphamine，PM；Tocris)和500nM视黄酸(RA；Sigma)的泛神经元基础培养基中生长。从第12天至第18天，细胞在补充有100nM PM和500nM RA的泛神经元基础培养基(不含维生素A)中生长。在DIV15，使用accutase解离细胞并以1:6的比率传代。从DIV18起，将培养物维持在泛神经元基础培养基(-VitA)中用于成熟并促进神经元形成。每天更换培养基，并在更换培养基之前用DPBS-/-洗涤细胞以去除死亡细胞。在DIV24，使用accutase将后脑/脊髓神经细胞解离成单细胞悬液，用荧光团缀合的抗CD47和CD99抗体染色，并如实施例5所述通过流式细胞术进行分析。在该分化阶段，大约37％的细胞表达神经干细胞标志物SOX2(图50)，而大约15％的细胞表达增殖标志物Ki67(图50A)，表明这些细胞仍然是有丝分裂的神经干细胞，并且大约60％表达神经元标志物INA(图50B)，表明它们已经分化或正在分化为神经元。分析显示，39％的细胞表达CD99(图49A)，而92％表达CD47(图49B)。此外，发现绝大多数表达CD99和CD47的细胞共表达SOX2(图51)和Ki67(图52)两者。这些结果有力地支持了以下假设：CD99和CD47可作为抗体靶标用于通过FACS或MACS富集后脑/脊髓神经元并消耗增殖性细胞。
实施例9：鉴定用于富集或消耗的标志物的RNA测序方法和实验设计
以单细胞RNA测序对hPSC衍生的腹侧中脑神经细胞的体外时间序列进行采样，以便探询异质hPSC衍生的腹侧中脑细胞培养物的转录组特征(图1和实施例2)，目的是以无偏的方式鉴定所需细胞群体(即由ASCL1标记的腹侧中脑中间前体/成神经细胞)和不需要的群体(即非腹侧中脑底板身份的细胞、非神经元前体、非神经元细胞类型)所特有的或在其中上调的基因。
根据已知基因的基因表达谱，在测序数据集(即图5所示的tSNE图)中鉴定所需的和不需要的群体(或在单细胞RNA测序和转录组学领域中描述的簇)。对这些簇进行比较，以鉴定所需的或不需要的群体的新型基因/标志物。
为了进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，用accutase、tryple select或其他此类试剂将未分化PSC的细胞簇以及分化细胞的细胞簇解离成单细胞悬液，并且使用10XGenomics Chromium Platform处理3000-10000个细胞，并在NextSeq550上进行测序。使用10X cellranger和R编程语言的Seurat分析包处理数据。对样品进行分析，过滤低质量或多联体细胞，并针对每个单独的实验分别进行分析，然后将选定的分化细胞谱系的细胞以及hPSC组合成一个数据集，然后使用如针对Seurat版本3所概述的标准Seurat工作流程进行分析，即使用SCTransform进行归一化，最后对统一的tSNE图使用前29个主成分(如图5中所示的那些)进行分析。
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和改变。
Claims (15)
1.提供富含神经元和/或其前体的细胞群体的方法，该方法包括以下步骤：
-获得包含神经元前体的细胞群体，
-选择对选自PTPRO、ADGRG1、EPHB2、DCC、DLL3、DLL1、ADCYAP1、GPM6A、GAP43、C1QL1、NRXN1、LRRC4C、TNFRSF21、FZD1、FREM2、TRPM8、CACNA2D1、CLDN5、CHRNA5和GPR85的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞，并且/或者排除对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD99、CD83、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性的细胞。
2.根据前述权利要求所述的方法，其中所述包含神经元前体的细胞群体通过以下步骤获得：获得包含神经干细胞的细胞群体，其中所述包含神经干细胞的细胞群体中的至少80％表达标志物SOX2，以及培养所述包含神经干细胞的细胞群体，直到SOX2的表达已降低至少5％。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含腹侧中脑区域的神经干细胞，并且其中排除对标志物CD47呈阳性的细胞。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含前脑、中脑、后脑或脊髓区域的神经干细胞，并且其中排除对标志物CD99和CD47之一或两者呈阳性的细胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当选择和/或排除细胞时，所述细胞群体中的10-90％对标志物SOX2呈阳性，所述细胞群体中的5-50％对标志物ASCL1、NEUROD1、NEUROD2、NEUROD4、NEUROD6、NEUROG1、NEUROG2、NEUROG3、EOMES、CHX10、ISL1、SOX4、SOX11、NKX2.1、NFE2L2和NHLH1中的一种或多种呈阳性，并且所述细胞群体中的5-20％对标志物INA、TUBB3、STMN2、MAP2和RBFOX3中的一种或多种呈阳性。
6.根据权利要求3所述的方法，其中当选择和/或排除细胞时，所述细胞群体中的10-90％对标志物SOX2呈阳性，所述细胞群体中的5-50％对标志物ASCL1中的一种或多种呈阳性，并且所述细胞群体中的5-20％对标志物INA中的一种或多种呈阳性。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中获得所述包含神经元前体的细胞群体包括使PSC向神经干细胞分化的步骤。
8.根据权利要求6所述的方法，其中在选择和/或排除细胞的步骤之前，使所述PSC向神经干细胞分化至少20天。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择和/或排除细胞的步骤是通过使用MACS分离细胞来进行的。
10.神经元和/或其前体的体外细胞群体，其通过根据权利要求1至9中任一项所述的方法获得。
11.神经元和/或其前体的体外细胞群体，其中所述细胞群体中的少于5％对选自SLIT2、NTN1、CMTM6、CMTM8、CMTM7、CRLF1、CD36、CD47、CD99、CD83、TNFRSF1A/CD120a、TNFRSF12a/CD266、TMEM123、LRP10、ITGB8、HLA-A和RAMP1的标志物中的一种或多种呈阳性。
12.根据权利要求11所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的少于5％对标志物CD99呈阳性。
13.根据权利要求11所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的少于5％对标志物CD47呈阳性，并且所述细胞群体中的至少80％对标志物FOXA2呈阳性。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的至少80％是腹侧中脑神经元和/或其前体。
15.根据权利要求12所述的细胞群体，其中所述细胞群体中的至少80％是前脑、后脑或脊髓神经元和/或其前体。
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