KR101690759B1

KR101690759B1 - 전능성 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법

Info

Publication number: KR101690759B1
Application number: KR1020150026626A
Authority: KR
Inventors: 김동욱; 이동진
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-02-25
Filing date: 2015-02-25
Publication date: 2016-12-30
Also published as: KR20160104169A

Abstract

본 발명은 전능성 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법 및 이를 이용하여 수득된 중간엽 줄기세포에 관한 것이다.
본 발명은 종래에 골수, 지방, 제대혈, 말초혈, 태반 등의 다양한 인간 조직으로부터 분리되어 오던 중간엽 줄기세포를 전능성 줄기세포로부터 수득함으로써 침습적인 절차를 거치지 않고, 이에 공여자가 겪을 수 있는 위험이 제거되면서도, 치료적 유효량의 세포 수를 용이하게 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 재생의학에서의 중요한 치료용 세포 자원인 중간엽 줄기세포를 효율적으로 확보하는 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

전능성 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법{A Method for Obtaining Mesenchymal Stem Cells from Pluripotent Stem Cells}

본 발명은 PSA-NCAM 음성 분리를 통해 전능성 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 관한 것이다.

인 비보 상에서 1차 신경화를 모방하는 과정에서 전분화능 세포(pluripotent stem cell, PSC)로부터 신경전구세포(neural precursor cell, NPC)를 분화시키는 연구가 기초연구 및 바이오 의약 개발에 있어 주목받고 있다(1). 폐쇄 및 개방 신경관의 신경상피세포를 대표하는 hPSC-유래 신경 로제트 세포로부터 분화된 NPC는 장기간 확장, 고순도 배양, 장기간의 신경재생 능력 및 저온보관시의 생존능력 등의 장점으로 인하여 바이오 의약에의 적용을 위한 이상적인 세포자원이 되고 있다(2-4). 그러나, 불행하게도 많은 연구결과들이 세포 이식 후 미분화 전능성 세포가 없음에도 종양이 형성됨을 반복적으로 보고하고 있다. 보고된 연구결과 중 종양의 형태는 신경 과성장(neural overgrowth) 및 중간엽 종양(mesodermal tumors)의 두 가지 구분되는 형태로 나타난다. 이전의 연구에서 신경 로제트 세포(초기 NPC)는 자가 재생의 다분화능 특성으로 인해 인 비보에서 이식될 경우 신경 과성장의 형성이 관찰되었다(2). 이러한 종양형성 가능성은 최근 원시 NPC를 특정 세포형태로 유도하고 분화 효율을 증대시킴으로서 극복되었다(5-7). 전분화능 세포의 오염 및 NPC-신경 과성장을 막기 위한 노력에도 불구하고, 중추신경계 질환 동물모델에서 인간 배아줄기세포-유래 NPC 또는 신경전구세포의 이식 후 연골세포, 근섬유(8), 중간엽 유래 성숙 연골(9) 및 색소 세포(pigmented cell)(10) 등에서 종양이 형성됨을 보고하는 연구결과가 이어지고 있다.

한편, hPSC의 신경 분화에 대한 인 비트로 연구를 통해 신경 로제트(초기 NPC)로 불리는 방사형 배열의 원주 신경상피 세포가 말초신경계로 분화할 수 있으며(3, 11), 신경 로제트 배양액 내에서 신경능선-유사세포(neural crest-like cell)로 유도된다는 증거가 보고된 바 있다(2, 12, 13). 배아발달 동안에, 일시적이고 이동성이 높은 신경능선 줄기세포(neural crest stem cell, NCSC)가 말초신경계의 멜라닌세포, 뉴런 및 아교세포; 그리고 두개안면 복합체(craniofacial complex)의 연결조직 세포, 연골세포, 골세포 및 지방세포로 유도된다(14). 신경능선세포는 신경 외배엽처럼 낭배 외배엽과 발달 유래가 동일하고, 말초 신경계를 포함하는 외배엽 계열 뿐 아니라 중간엽 계열로도 분화할 수 있는 다분화능을 유지하므로(15), 본 발명자들은 전분화능 줄기세포로부터 분화된 신경 로제트 배양액을 이용하여 중간엽 줄기세포를 수득할 수 있다고 예상하였다.

골수에서 처음 확인된 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells; MSC)는 재생 의학에서 큰 잠재성을 가지는 전능성 세포이다. MSC는 골세포, 연골세포, 지방세포, 근육세포 및 섬유아세포 등의 여러 유형의 중간엽 계통으로 분화될 수 있으며, 면역억제 활성을 나타내어 이식 촉진제, 태아 이식(fatal graft) 및 숙주 질환의 억제제로 사용될 수 있다(Le Blanc K et al., Lancet, 363(9419):1439-1441, 2004; El-Badri N.S et al., Exp Hematol, 26(2):110-116, 1998). MSC는 골수, 지방 조직, 제대혈(cord blood), 말초혈, 신생아 조직(neonatal tissues), 태반 등의 다양한 인체 조직으로부터 분리될 수 있으나, 성인 조직에서 수득할 수 있는 MSC의 개수에는 한계가 있고, 공여자로부터 MSC를 분리하기 위해서는 침습적인 절차가 요구되어, 공여자에게 예상하지 못한 위험을 끼칠 수 있다. 이에, 본 발명자들은 전능성 줄기세포 유래의 MSC를 이용함으로써 재생의학에서의 치료용 줄기세포 세포 확보를 위한 대안을 제시하고자 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 재생의학에서의 세포 치료제로서 높은 잠재성을 가지는 중간엽 줄기세포를 효율적으로 생산하는 방법을 연구하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 전분화능 만능줄기세포에서 분화된 신경 로제트(neural rosette)에 대해 PSA-NCAM 음성 분리를 실시한 뒤 이를 중간엽 줄기세포로 분화시킬 경우, 공여자로부터 중간엽 줄기세포를 분리하기 위한 침습적 절차 없이도 높은 수율로 중간엽 줄기세포를 다량으로 제공할 수 있다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 전분화능 만능줄기세포(pluripotent stem cell)로부터 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 수득하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법을 이용하여 수득한 중간엽 줄기세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 전분화능 만능줄기세포(pluripotent stem cell)로부터 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 수득하는 방법을 제공한다:

(a) 전분화능 만능줄기세포를 신경 로제트(neural rosette)로 분화시키는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 분화된 세포 파퓰레이션에 PSA-NCAM(poly-sialated neural cell adhesion molecule) 항체를 접촉시키는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 세포 파퓰레이션에서 상기 PSA-NCAM 항체와 결합하지 않은 세포를 분리하는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 분리된 세포를 중간엽 줄기세포로 분화시키는 단계.

본 발명자들은 재생의학에서의 세포 치료제로서 높은 잠재성을 가지는 중간엽 줄기세포를 효율적으로 생산하는 방법을 연구하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 전분화능 만능줄기세포에서 분화된 신경 로제트(neural rosette)에 대해 PSA-NCAM 음성 분리를 실시한 뒤 이를 중간엽 줄기세포로 분화시킬 경우, 공여자로부터 중간엽 줄기세포를 분리하기 위한 침습적 절차 없이도 높은 수율로 중간엽 줄기세포를 다량으로 제공할 수 있다는 사실을 발견하였다.

본 명세서에서 용어“줄기세포(stem cell)”는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 미분화 세포들을 지칭한다. 줄기세포는 발달 가능한 만능성 또는 다능성 세포이며, 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래[전이(transit)] 세포로 분열될 수 있고, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.

본 명세서에서 용어“중간엽 줄기세포”는 지방세포, 골세포, 연골 세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 줄기세포를 의미한다. 중간엽 줄기세포는 소용돌이 모양의 형태와 기본적인 세포표면 표식자 CD73(+), CD105(+), CD34(-), CD45(-) 등의 발현 정도를 통하여 식별된다.

본 명세서에서 용어“전분화능 만능줄기세포(pluripotent stem cell)”는 수정란보다 발생이 진행된 상태의 세포로서 내배엽, 중간엽 및 외배엽을 구성하는 세포로 모두 분화할 수 있는 줄기세포를 의미한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 전분화능 만능줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)이며, 보다 구체적으로는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포이다.

본 명세서에서 용어“유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)”는 비-전분화능 세포(예를 들면, 체세포)로부터 특정 유전자를 삽입하여 인공적으로 유래된 전분화능 줄기세포의 하나이다. 유도만능중기세포는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현, 염색체 메틸화, 배가시간(doubling time), 배아체 형성, 테라토마 형성, 생존성 키메라 형성, 교잡성 및 분화성을 가지는 면에서 전분화능 줄기세포(예를 들면, 배아줄기세포)와 동일한 것으로 당업계에서 간주되고 있다.

본 발명의 장점 중 하나는 하기의 실시 예에서 입증한 바와 같이, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포 등 모든 전능성 줄기세포에 적용 가능한 분화 프로토콜을 제공한다는 것이다.

본 명세서에서, 용어“줄기세포의 분화”는 줄기세포에서 특정세포로 완전히 분화가 유도된 경우뿐만 아니라 줄기세포에서 특정세포로의 완전 분화되기 전 중간 단계에서 형성되는 전구체(precursor)의 형성도 포함하는 것이다.

본 명세서의 용어“신경 로제트(neural rosette)”는 인간 배아줄기세포의 신경분화 과정의 초기단계의 신경줄기세포를 말하며, 신경 로제트는 원주형의 방사상 형태를 갖는다. 상기 신경 로제트는 Pax6 및 Sox1 같은 초기 신경외배엽(neuroectodermal)마커를 발현하는 세포로 구성되며, 다양한 뉴런 세포 및 신경교세포로 분화할 수 있다. 상기“신경 분화 자극”은 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 무혈청 배지(Tropepe V et al., Neuron. 30:6578(2001)), FGFs(fibroblast growth factors), Wnt 및 RA(retinoic acid)와 같은 모르포겐(morphogens)의 처리(Ying QL et al. Nat Biotechnol. 21:183186(2003)), BMP 신호경로 억제제 또는 액티빈 노달 신호경로 억제제의 처리 등을 통해 가해질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 전능성 줄기세포를 신경 로제트로 분화시키는 단계는 전능성 줄기세포를 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP) 신호 경로 억제제 및 액티빈/노달(Activin/Nodal) 신호 경로 억제제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 이루어진다.

본 명세서 용어“BMP 신호 경로 억제제”는 BMP 단백질 자체의 발현 또는 활성을 억제하거나 또는 BMP와 그 수용체 간의 결합을 억제하는 물질을 의미한다. 본 발명에서 이용되는 BMP 신호 경로 억제제는, 예를 들어 도소모르핀(dorsomorphin), Smad6, Smad7, 노긴(Noggin), 코르딘(Chordin), 그렘린(Gremlin). Sog (short gastrulation), 폴리스타틴(Follistatin), DAN(differential screening-selected gene aberrant in neuroblastoma), 세프베루스(Cerberus), 단테(Dante) 및 PRDC(Protein Related to DAN and Cerberus)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에 BMP 신호 경로를 억제하는 것으로 알려진 모든 물질을 포함한다. 구체적으로는 상기 BMP 신호 경로 억제제는 도소모르핀, 노긴, 코르딘 또는 그렘린이며, 보다 구체적으로는 도소모르핀 또는 노긴이고, 가장 구체적으로는 도소모르핀이다.

본 명세서 용어 “액티빈/노달 신호 경로”는 액티빈 신호 경로 및/또는 노달 신호 경로를 의미하며, 용어“액티빈/노달 신호 경로 억제제”는 액티빈/노달 자체의 발현 또는 활성을 억제하거나 또는 액티빈/노달이 그의 수용체에 결합하는 것을 억제하는 물질을 의미한다.

본 발명에서 이용되는 액티빈/노달 신호 경로 억제제는, 예를 들어 4-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2일)-벤즈아미드, Smad6, Smad7 및 폴리스타틴(Follistatin)을 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에 액티빈/노달 신호 경로를 억제하는 것으로 알려진 모든 물질을 포함한다. 구체적으로는 상기 억제제는 4-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2일)-벤즈아미드 또는 Smad7이며, 보다 구체적으로는 4-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2일)-벤즈아미드이다. 이 화합물은 당업계에서 SB431542로 알려져 있으며, 아래와 같은 화학식을 가진다:

본 명세서에서 사용되는 용어 “배지”는 당업계에서 통상적으로 이용되는 동물세포용 배지를 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM(Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Waymouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명은 전능성 줄기세포에서 분화된 신경 로제트에 대하여 PSA-NCAM-음성 분리를 수행하며, PSA-NCAM-음성 세포는 항-PSA-NCAM-항체를 이용하여 분리될 수 있다.

본 명세서에서, PSA-NCAM을 언급하면서 사용되는 용어“항체”는 PSA-NCAM에 대한 특이 항체로서, PSA-NCAM 단백질에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. 완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있으며, 항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편으로서 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv을 포함한다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

PSA-NCAM에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 PSA-NCAM 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 항체를 이용한 PSA-NCAM-음성 세포 분리는 형광-활성세포분류기(fluorescence-activating cell sorters: FACS), 자성활성세포분류기(magnetic activated cell sorter: MACS) 및 보체 매개성 용해(complement-mediated lysis) 방법을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 MACS(magnetic activated cell sorter)를 이용하여 수행한다.

본 발명에 따르면, 상기 (c) 단계에서 분리된 세포, 즉 PSA-NCAM^- 세포의 특성인 다분화 능력을 이용하여 중간엽 줄기세포로 분화시킬 수 있다. PSA-NCAM^- 세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화는 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어 상기 (c) 단계에서 분리된 세포에 대해 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition, EMT)을 수행함으로써 이루어질 수 있다.

요약하면, PSA-NCAM^- 세포의 EMT는 배양액에 TGF-β(transforming growth factor beta) 단백질들이 다량으로 포함된 10%의 FBS(fetal bovine serum)을 첨가함으로써 유도한다. PSA-NCAM^- 세포를 배양접시에 cm²당 6 x 10⁵세포를 유지하며, DMEM GlutaMAX 배양액을 기초로 하여 항생제(5μg/ml 겐타마이신)와 10% FBS가 포함된 배양액을 48시간에 한번씩 배양액을 교체하며 최소 30일 분화 유도한다. 이렇게 분화된 중간엽 줄기세포는 중간엽 줄기세포의 표면마커에 양성인 반면 상피간엽이행 전 PSA-NCAM^- 세포가 갖는 특성인 p75 표면마커에는 음성을 보인다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법으로 수득된 중간엽 줄기세포는 CD44, CD29, CD73, CD105 및 CD90으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 마커에 대해 양성이고, p75에 대하여 음성이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 수득한 중간엽 줄기세포를 제공한다.

본 발명에서 사용된 방법 및 이를 이용하여 수득되는 중간엽 줄기세포에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 전능성 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법 및 이를 이용하여 수득된 중간엽 줄기세포를 제공한다.

(b) 본 발명은 종래에 골수, 지방, 제대혈, 말초혈, 태반 등의 다양한 인간 조직으로부터 분리되어 오던 중간엽 줄기세포를 전능성 줄기세포로부터 수득함으로써 침습적인 절차를 거치지 않고, 이에 공여자가 겪을 수 있는 위험이 제거되면서도, 치료적 유효량의 세포 수를 용이하게 생산할 수 있다.

(c) 본 발명은 재생의학에서의 중요한 치료용 세포 자원인 중간엽 줄기세포를 효율적으로 확보하는 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 PSA-NCAM을 타겟으로 한 세포 선별을 이용하여 비균질 신경 로제트 배양물로부터 신경능선-유사 세포를 분리할 수 있음을 보여주는 그림이다. 도 1a는 신경 로제트 생성방법의 타임라인을 나타낸 모식도이다. 도 1b는 확장된 신경 로제트 컬쳐에서 Sox2⁺/Nestin⁺및 Sox1⁺/Pax6⁺신경상피 세포를 관찰한 결과를 나타낸 그림이다. 도 1c는 신경 로제트의 Sox1/Zo-1 및 PLZF/Zo-1 공발현을 보여주는 그림이다. 신경 로제트 컬쳐는 주로 PSA-NCAM⁺이나, PSA-NCAM^-퍼퓰레이션도 존재하였다(도 1d). 도 1e는 Pax6⁺신경 로제트 코어, Pax6^-세포 및 p75⁺세포 주변을 관찰한 결과를 보여주는 그림이다. 도 1f는 단일세포 수준에서 AP2⁺세포를 동정한 결과를 나타낸다. PSA-NCAM⁺세포가 신경 로제트 형태를 보이는 반면, 음성세포는 신경능선과 유사한 물리적 특성을 보였다(도 1g). 도 1h는 신경 로제트 컬쳐 중 PSA-NCAM^+/-비율을 보여주는 그래프로서, PSA-NCAM⁺ 및 PSA-NCAM^-는 각각 79% 및 21%를 나타냈다(n=3). 신경 분화를 위한 다른 공지된 방법은 약 30%의 PSA-NCAM^-세포 수율을 보였다.
도 2는 PSA-NCAM^-세포의 분자적 특성과, PSA-NCAM^+/-및 p75⁺/Hnk1⁺세포의 global 유전자 발현패턴 분석결과를 나타낸 그림이다. 도 2a는 PSA-NCAM^-세포에서 p75 및 Hnk1를 타겟으로 한 유세포 분석결과를 보여주는 그림이다. PSA-NCAM^-세포에서 SSEA4⁺세포는 관찰되지 않았다(도 2b). PSA-NCAM^-컬쳐 내에서 0계대 세포(P0)의 86.9%는 AP2⁺였으며, 계대가 증가함에 따라(P2) 양성세포의 비율은 92.3%까지 증가하였고, AP2⁺PSA-NCAM^-세포의 88.9%는 Ki67⁺이다(도 2c). 도 2d는 PSA-NCAM^-세포가 p75, Hnk1 및 AP2를 강하게 발현하면서 Ki67 활성을 가짐을 보여주는 면역세포화학 분석결과이다. 도 2e 및 2f는 2단계-MACS로 분리된 p75⁺/Hnk1⁺세포를 유세포분석(도 2e) 및 면역세포화학 분석(도 2f)으로 확인한 결과를 보여준다. 도 2g는 각 군에 대해 세 개의 생물학적 복제물의 평균 신호강도를 이용하여 상이하게 발현되는 1178개 유전자의 계층적 클러스터링을 수행한 결과를 나타낸다(|fc|≥2 & lpe.adj.pval<0.05 & fail.count<6). 도 2h는 상이하게 또는 유사하게 발현되는 1178개 유전자를 벤 다이아그램을 이용하여 교차시킨 결과를 나타낸다. 각 비교의 r-제곱값을 산포도(scatter plots)를 통해 도출하였다(도 2i).
도 3은 PSA-NCAM^-세포가 NCSC의 다중계열로 분화가 유도될 수 있음을 보여주는 그림이다. 도 3a는 PSA-NCAM^-에서 분화된 중간엽 전구세포(mesenchymal progenitors, MPs)(D4 및 D14)의 밝은 상(Bright-field) 이미지를 보여주는 그림이다. PSA-NCAM^-세포-유래 MPs에서 p75⁺발현이 상실됨이 관찰되었으며, 중간엽 세포 마커인 CD44, CD29, CD73, CD105 및 CD90의 강한 발현이 관찰되었다(도 3b). 생성된 MPs는 알시안 블루-염색된 연골세포, 알리자린 레드-염색된 골세포 및 Oil 레드 O-염색된 지방세포와 같은 중간엽 계열세포로 추가적으로 분화됨으로써(도 3c), PSA-NCAM^-세포-유래 MPs가 인 비트로에서 기능을 가짐을 보여주었다. 도 3d는 PSA-NCAM^-세포가 peripherin⁺뉴런세포로의 분화가 유도됨을 보여주는 그림이다. Nestin⁺PSA-NCAM^-세포가 서서히 소멸하면서 TuJ1- 및 peripherin- 양성이 획득되었다. SMAα⁺및 칼포닌⁺평활근 세포도 수득되었다(도 3e).
도 4는 PSA-NCAM^-세포에서 유래된 중간엽 계열 및 peripherin⁺이식물의 종양 형성을 분석한 결과를 보여준다. 도 4a는 H&E-염색된 신경 로제트 이식물이 신경 과성장(neural overgrowth)을 하였음을 보여준다. 도 4b는 Runx2⁺이식물과 같이 비-신경외배엽성 유래 조직의 구조를 보여준다. 신경 로제트 이식물에서 신경 과성장 및 종양 형성 이 각각 100% 및 88%로 관찰되었다(도 4c). 도 4d는 각 군에서의 종양 검출 빈도를 백분율로 계산한 결과이다. 도 4e는 PSA-NCAM+/-이식으로부터 유래된 종양 형성 및 세포 계열을 요약한 그림이다. 종양형성 여부와 무관하게, 계열은 명확한 외형을 기준으로 동정하였다. 도 4f는 peripherin⁺, 색소 이식물 검출 및 낭포 형성의 빈도를 요약한 그림이다. 도 4g는 PSA-NCAM^-세포 이식부위에서 HNA⁺/peripherin⁺가 관찰되었음을 보여주는 그림이다. H&E 염색에서와 마찬가지로, 면역형광 조직화학 분석에서도 PSA-NCAM^-이식부위에서 Runx2⁺/HNA⁺뼈조직이 동정되었다(도 4h). 도 4i는 PSA-NCAM^-이식 내에서 SMAα⁺평활근 조직이 검출됨을 보여주는 그림이다. 도 4j는 H&E-염색된 관상면 이미지를 통해 100% PSA-NCAM⁺이식의 경우와 달리 PSA-NCAM^-이식부위에서 중간엽 계열의 종양이 발생함을 보여주는 그림이다.
도 5는 hESC-유래 신경 로제트가 로제트-특이적 유전자를 발현하고 확창하는 동안 로제트-특성을 유지함을 보여주는 그림이다. 반정량적 RT-PCR 분석을 수행하여“로제트-특이적”인 것으로 알려진 유전자의 발현을 관찰하였다. hESCs (H9)에서는 유전자 발현이 검출되지 않은 반면, hESC-유래 신경 로제트는 로제트-특이적 유전자를 발현하였고, 발현은 7일 간 확장하는 동안 유지되었다.
도 6은 확장된 선별(sorting) 이전의 신경 로제트는 전분화능을 보이지 않음을 보여주는 그림이다. 6a는 hESCs(H9) 및 신경 로제트에서 SSEA4, Nanog, Tra-1-81 및 Oct4를 포함하는 전분화능 마커를 타겟팅한 면역세포화학 분석결과이다. hESCs는 모든 전분화능 마커를 발현하였으나, 신경 로제트는 NCAM 및 Nestin의 양성 발현에도 불구하고 상기 4개의 전분화능 마커를 발현하지 않았다. 6b는 신경 로제트, PSA-NCAM⁺세포 및 PSA-NCAM^-세포에서는 hESC에서와 달리 전분화능 마커 유전자인 Oct4, Nanog 및 Rex1가 발현되지 않음을 다시한번 보여주는 반정량적 RT-PCR 분석결과이다. 하단의 GAPDH는 각 레인의 로딩 대조군으로 사용되었다.
도 7은 WT-iPSCEpi3-유래 PSA-NCAM^-세포가 신경능선 마커를 발현하며, NCSC 퍼퓰레이션이 hESC-유래 PSA-NCAM^-세포와 호환될 수 있음을 보여주는 그림이다. 도 7a는 NCSC 마커인 AP2(좌측) 및 p75(우측)를 타겟으로 한 iPSC-유래 PSA-NCAM^-세포의 면역세포화학 분석결과이다. 도 7b는 PSA-NCAM^-세포(P1)의 p75 및 Hnk1에 대한 유세포 분석 결과이다.
도 8은 PSA-NCAM^-세포 및 PSA-NCAM⁺세포의 신경능선 특성과 관련된 핵심 전사체에 대한 실시간 RT-PCR 분석결과이다. 도 8a는 신경 로제트 및 PSA-NCAM⁺세포에 비하여 PSA-NCAM^-세포(P2 및 P4)에서 p75 및 AP2 발현이 증가함을 보여주는 RT-PCR 결과를 나타낸다. PSA-NCAM⁺세포를 제외한 모든 세포가 cMyc를 발현하였다(도 8b). Twist1, Slug 및 Snail를 포함하는 EMT 조절인자는 PSA-NCAM^-세포(P4)에서 고발현되었다(도 8c). 신경능선 전구체 표지자인 Sox8 및 Sox9도 신경 로제트 및 PSA-NCAM⁺세포에 비하여 PSA-NCAM^-세포에서 높게 발현되었다(*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001)(도 8d).
도 9는 PSA-NCAM⁺세포에서 PSA-NCAM 및 p75 간에 반대의 상관관계가 있음을 EndoN에 대한 노출을 통해 확인한 결과이다. PSA-NCAM⁺세포(PN⁺)를 글리세롤(Gly)로 24시간 처리한 결과 p75는 발현되지 않았으나 NCAM 및 PSA-NCAM 발현은 유지되었다(도 9a). 반대로, 엔도뉴라미니데이즈-N(EndoN)를 24시간 동안 처리하자 PN⁺세포에서 p75가 발현되고 PSA-NCAM는 발현되지 않았다(도 9b). Gly 또는 EndoN의 처리는 PSA-NCAM^-세포(PN^-)의 p75 및 PSA-NCAM 발현에 영향을 미치지 못했다(도 9c). 도 9d는 PN^-세포와 달리, PN⁺세포에 EndoN를 24시간 동안 처리하자 p75 발현이 증가함을 관찰한 실시간 RT-PCR 결과이다. PN⁺및 PN^-세포 모두에서 Gly 및 EndoN 처리에도 불구하고 ST8SIA2 및 ST8SIA4는 발현 변화가 나타나지 않았다(도 9e).
도 10은 신경외배엽 계열 특성을 보여주는 그림이다. 이중-Smad 억제와 bFGF 및 인슐린을 통해 신경외배엽으로 유도된 hESC는 내배엽-또는 중간엽 마커의 양성을 보이지 않은 반면, 신경상피 마커(Nestin, Sox2, Sox1 및 Pax6)의 강한 발현이 검출되었다(도 10a). 반면, 자발적으로 분화된 EB 형태의 hESC는 Nestin, Sox2, 및 Sox1-양성 신경외배엽, Brachury-양성 중간엽 및 Sox17-양성 내배엽을 포함하였다(도 10b).
도 11은 WT-iPSCEpi3에서 유래한 PSA-NCAM^-세포도 NCSC의 다중계열 분화능력을 가짐을 보여주는 그림이다. 도 11a는 WT-iPSCEpi3-유래 PSA-NCAM^-세포가 CD44, CD29, CD73, CD105 및 CD90을 발현하는 반면 p75 발현을 상실하는 MP로 분화가 유도됨을 보여주는 그림이다. 도 11b는 iPSC-유래 PSA-NCAM^-세포가 SMAα⁺및 칼포닌⁺세포로도 분화할 수 있음을 보여주는 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

줄기세포 배양 및 분화.

미분화 인간 배아줄기 세포(ESCs) [H9(WA09; WiCell Inc.)]를 마우스 STO 섬유아세포(ATCC) 상에서 종래 보고된 성장 환경 하에서 배양하였다(30). 신경 로제트를 유도하기 위하여, 배아체(EBs)를 bFGF(basic fibroblast growth factor)가 제외되고 5μM 도소모르핀(dorsomorphin, DM)(Calbiochem) 및 510μM SB431542(SB, Sigma)가 보충된 hESC 배지에서 4일간 부유환경에서 배양하였다. 4일 째에, EB를 20 ng/ml bFGF(R&D Systems)와 함께 DMEM/F12 N2 보충 배양액(N2 media)에서 마트리젤-코팅된 배양접시(BD Biosciences) 상에서 배양하고, 1921μg/ml 인간 인슐린 용액 (Sigma-Aldrich)과 함께 5일간 더 배양하였다. 생성된 로제트 구조를 EB 콜로니 내에서 풀링 글래스 피펫을 이용하여 기계적으로 분리하고, 분리된 신경 로제트 덩어리를 마트리젤-코팅된 접시에 리플레이팅하였다. 리플레이팅된 신경 로제트를 90% 컨플루언스에서 6-7일간 더 팽창시켰다.

PSA-NCAM-양성 및 -음성 세포를 종래에 보고된 방법으로 MACS(magnetic- activated cell sorting, Miltenyi Biotech)를 통해 분리하였다(13). 분리된 세포를 양성세포 11.55 × 10⁵세포/cm²및 음성세포 11.25×10⁵세포/cm²의 밀도로 마트리젤-코팅된 접시에 플레이팅하였다. 음성세포가 인슐린, 20 ng/ml bFGF 및 10 ng/ml EGF (epidermal growth factor, Peprotech)가 보충된 N2 배양액에서 유지되었음에도, 양성세포는 비타민 A 보충 배지(N2B27 media)가 없는 DMEM/F12 N2 & B27에서 20 ng/ml bFGF와 함께 유지되었다. 배양액은 배일 교체하였다. 증식된 신경 로제트 퍼퓰레이션으로부터 신경능선 줄기세포(NCSCs)를 분리하기 위하여, 추가적인 2단계 MACS(CD271; CD57 MicroBeads, Miltenyi Biotec)를 수행하였다. 분리된 CD271⁺세포를 칼슘, 마그네슘 및 페놀이 없는 레드 HBSS(Gibco, Life Technologies)로 두 번 세척하였다. 양성세포는 이후 1X TrypLE Express(Gibco, Life Technologies)로 용리하고 TrypLE Express에서 3-5분간 교반하였다(31). 반응을 종료시키기 위하여, 세포를 2% BSA(bovine serum albumin)-PBS 용액으로 세척한 뒤 CD57 마이크로비드에 부착시키기 전에 1X cold PBS로 다시 세척하였다. 말초 뉴런 분화를 위하여, PSA-NCAM^-세포(6-8 계대)를 뇌-유래 신경영양인자(10 ng/mL), 아교세포주-유래 신경영양인자(10 ng/mL), 신경성장인자(10 ng/mL), 뉴로트로핀-3(10 ng/mL)(이상 Peprotech), 아스코르빈산(200 μM; Sigma-Aldrich) 및 DAPT(2.5 μM; Calbiochem)(25)과 함께 N2B27 배지에서 피브로넥틴- 또는 폴리-L-오르니틴/라미닌-코팅된 4-웰 디쉬에 씨딩하였다. 분화는 면역세포화학 분석 20일 전에 유도하였다. 중간엽 분화를 위하여, PSA-NCAM^-세포를 N2 배지에서 24시간 동안 배양하고 10% FBS(fetal bovine serum) 및 5 μg/ml 겐타마이신이 보충된 DMEM GlutaMAX에 스위칭하였다. StemProDifferentiation Kits(Invitrogen)를 이용하여 제조자의 설명서에 따라 지방세포, 연골세포 및 골세포 분화를 수행하였다. 표면에서 PSA를 제거하기 위하여 엔도뉴라미니데이즈-N(EndoN; Abc Scientific)을 PSA-NCAM^+/-세포에 12시간(데이터 미공개) 및 24시간 동안 도입하였다. EndoN는 선형의 α-2,8-결합 PSA를 특이적으로 분해하는 것으로 알려졌다.

면역세포화학 및 유세포 분석.

세포를 4% 파라포름알데하이드-PBS(phosphate-buffered saline) 용액에 고정하였다. 세포 내 마커를 시각화하기 위하여, 세포를 Triton X-100-PBS 용액으로 우선 투과화시키고 2% BSA-PBS 용액으로 한시간 동안 상온에서 브로킹한 후 표 1에 나열된 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양하였다. 적절한 형광으로 표지된 2차 항체(Molecular Probes and Vector Laboratories)를 이용하여 시각화하였다. 세포를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 마운팅 배지(Vector Laboratories)에 마운팅하고, Olympus IX71 현미경 및 DP71 디지털 카메라 또는 Olympus FSX100 시스템을 이용하여 이미지를 수득하였다. 각 세 번의 독립된 실험에서 얻은 이미지 중 최종 배율 x 200의 7-10개의 무작위 선정된 이미지를 통해 MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis 소프트웨어 (Molecular Devices)를 사용하여 양성 표지된 세포의 수를 측정하였다. 유세포 분석을 위하여, GibcoCell Dissociation Buffer(Invitrogen)를 이용하여 세포를 단일세포로 분리하고 표 1에 나열된 적절한 항체와 함께 1% BSA-PBS 용액에서 배양하였다. 비접합 1차 항체를 위하여, 세포를 Alexa-Flour 488-접합 항-마우스 IgG/IgM(Molecular Probe)항체와 함께 배양하였다. 유세포 분석은 FACSCalibur(BD Biosciences)을 이용하여 수행하였으며, 결과 분석은 WinMDI 2.8 또는 FACSVerse(BD Biosciences) 및 FlowJo 소프트웨어를 통해 수행하였다.

본 발명에서 사용한 항체

명칭	구입처	명칭	구입처
AFP	Santa Cruz	Oct4	Santa Cruz
AP2	DSHB	p75	Advance Targeting Systems
Brachyury	R&D Systems	p75-AF647	BD Biosciences
Calponin	Sigma	p75-Microbead	Miltenyi Biotec
CD105-FITC	Accurate Chemical	Pax6	DSHB
CD29-PE	Accurate Chemical	Peripherin	Millipore
CD44-PE	Accurate Chemical	PLZF	Millipore
CD73-PE	BD Biosciences	PSA-NCAM	Millipore
CD90-FITC	Immunotech	PSA-NCAM Microbead	Miltenyi Biotec
FoxA2	Santa Cruz	Runx2	R&D Systems
HNA	Millipore	SMAα	Sigma
Hnk1	Sigma	Sox1	Millipore
Hnk1-FITC	BD Biosciences	Sox17	R&D Systems
Hnk1-Microbead	Miltenyi Biotec	Sox2	Millipore
Ki67	Vision Biosystems	SSEA4	Millipore
Nanog	Abcam	Tra-1-81	Millipore
NCAM	Millipore	TuJ1	Covance
Nestin	Millipore	Zo-1	BD Biosciences Invitrogen

유전자 발현 분석 및 전사프로파일링

Easy-SpinTotal RNA Extraction Kit(iNtRON)을 이용하여 총 RNA를 분리하고, PrimeScript^TMRT Master Mix (Takara Bio Inc.)를 이용하여 1μg 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. mRNA 수준은 SYBR Premix ExTaq^TM(Takara Bio Inc.) 및 CFX96 RealTime System(Bio-Rad)을 이용하여 정량화하였다. 각 타겟 유전자의 Ct 값은 β-actin을 통해 표준화하고, 표준화된 타겟 유전자의 발현 수준은 비교 Ct 방법에 근거하여 분류/미분류 시료 및 대조군 시료와 비교하였다. 데이터는 세 번의 독립적 실험에 대한 평균 상대 발현값 ± 표준오차로 나타내었다. EmeraldAMP GT PCR master mix (Takara Bio Inc.)를 이용하여 GeneAmp PCR System 2720(Applied Biosystems)에서 반정량적 PCR을 수행하였다. H9, 신경 로제트 및 PSA-NCAM^+/-세포를 식별하기 위한 각 프라이머를 표 2에 나열하였다. 마이크로어레이 분석을 위하여, 각 시료의 10μg 총 RNA를 Macrogen Inc.(Seoul, Korea)에서 분석하였으며, 각 시료를 Human HT-12 발현 v.4.0 비드 어레이에 혼성화시켰다.

본 발명에서 사용한 프라이머

명칭	Tm (℃)	크기	서열
반정량적 PCR 프라이머
FAM70A	59.3	238	CCA GGA CCC AGA ATG TGA CT
FAM70A	57.3	238	ACA TAA TGG CAC CGG TTA GC
EVI1	57.3	206	CAC ATT CGC TCT CAG CAT GT
EVI1	55.3	206	ATT TGG GTT CTG CAA TCA GC
ZNF312	59.3	228	GCC TTC CAC CAG GTC TAC AA
ZNF312	61.4	228	GGT ACA GGG AGG GAA GGA AG
LIX1	59.3	217	ATG AGT CAC TGC CAG CTC CT
LIX1	61.4	217	GTG GAG GCT ACT GCT TCC TG
RSPO3	57.3	184	GGC ATG AAG CAG ATT GGA GT
RSPO3	55.3	184	GGC AAT TGT CAA GGC ACT TT
PLZF	61.4	152	CTA TGG GCG AGA GGA GAG TG
PLZF	57.3	152	TCA ATA CAG CGT CAG CCT TG
DACH1	57.6	208	gtg gaa aac acc cct cag aa
DACH1	57.9	208	ctt gtt cca cat tgc aca cc
PLAGL1	59.1	234	gcc tca gtc acc tca aaa gc
PLAGL1	57.7	234	ctt aac ctg tgg ggc aaa ga
MMRN1	59.3	224	CAG GGA GCA TCA CTC AGA CA
MMRN1	55.3	224	TTG AGG CCA TCT TCC ATT TC
NR2F1	59.4	194	aca gga act gtc cca tcg ac
NR2F1	60.0	194	gat gta gcc gga cag gta gc
DMRT3	59.3	182	CTA CCC CAT CTC GTC TTC CA
DMRT3	57.3	182	ACT GGC TTC TCG CCA AAG TA
OCT4	58.4	311	CGT TCT CTT TGG AAA GGT GTT C
OCT4	59.3	311	ACA CTC GGA CCA CGT CTT TC
NANOG	55.3	158	CAA AGG CAA ACA ACC CAC TT
NANOG	59.3	158	TCT GCT GGA GGC TGA GGT AT
REX1	59.8	145	TCA CAG TCC AGC AGG TGT TTG
REX1	55.3	145	TCT TGT CTT TGC CCG TTT CT
GAPDH	57.4	452	ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC
GAPDH	57.4	452	TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA
실시간 PCR 프라이머
p75	57.9		TCA TCC CTG TCT ATT GCT CCA
p75	57.3		TGT TCT GCT TGC AGC TGT TC
AP2	57.3		TAA AGC TGC CAA CGT TAC CC
AP2	58.8		AAG TCC CTG GCT AGG TGG A
cMyc	63.7		CCT GGT GCT CCA TGA GGA GAC
cMyc	62.1		CAG ACT CTG ACC TTT TGC CAG G
Twist1	62.1		GCC AGG TAC ATC GAC TTC CTC T
Twist1	64.0		TCC ATC CTC CAG ACC GAG AAG G
Slug	55.2		TGG TTG CTT CAA GGA CAC AT
Slug	56.7		GTT GCA GTG AGG GCA AGA A
Snail	59.8		GAG CTG CAG GAC TCT AAT CCA
Snail	58.2		CGG TGG GGT TGA GGA TCT
Sox8	64.0		ACA ACG CCG AGC TCA GCA AGA C
Sox8	62.1		TCC TTC TTG TGC TGC ACG CGA A
Sox9	56.0		AAC GCC TTC ATG GTG TGG
Sox9	59.8		TCT CGC TCT CGT TCA GAA GTC
ST8SIA2	57.3		TAT CCT GAA GCA CCA CGT CA
ST8SIA2	57.9		TTT GTT GGT CAG CCA GTA TCC
ST8SIA4	59.3		AGA ACT GAG GAG CAC CAG GA
ST8SIA4	60.6		GCT ATT GAC AAG TGA CCG ACT CA
βActin	57.3		GCT CTT TTC CAG CCT TCC TT
βActin	57.3		CTT CTG CAT CCT GTC AGC AA

인 비보 이식 및 면역조직화학.

이식 당시 200250g의 체중을 가지는 성체 수컷 Sprague-Dawley 랫트(Orient Bio Inc.)를 사용하였다. 증식된 신경 로제트(D7) 및 PSA-NCAM^+/-세포를 Accutase(Millipore)를 이용하여 단일 세포로 분리하고, Dulbecco's PB에 부유시켜 최종 농도가 1 x 10⁵세포/μl가 되도록 하였다. 3μl 세포 부유액을 랫트 당 다음과 같이 정위로(stereotaxically) 이식하였다: AP +0.05, ML +0.30, DV -0.40 및 -0.50. 다음으로, 30 mg/kg Zoletil(Virbac) 및 10mg/kg Rompun(Bayer)을 이용하여 마취하고, 10 mg/kg 사이클로스포린 A (Chong Kun Dang)를 이식 24시간 전부터 랫트를 희생시킬 때까지 매일 복강주사로 투여하였다. 이식 10주 후, 랫트를 혼합 마취제(Zoletil:Rompun)로 마취하고 심장에 0.9% 염 용액 및 이어서 4% 파라포름알데하이드를 주입하였다. 뇌를 제거하고 밤새 후-고정한 뒤 30% 수크로스-PBS 용액에서 냉해방지(cryoprotection)를 하였다. 냉해방지된 뇌 조직은 FSC22화합물(Leica)에 넣은 뒤 동결 절편기(cryostat, Thermo Scientific)을 이용하여 1620μm 두께의 연속적인 관상단면 슬라이스를 만들었다. 점진적 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 수행하고, 종래에 보고된 방법으로 면역조직화학 분석을 실시하였다(13). 각각의 이식 부위에서 발견되는 세포계열은 먼저 H&E 단면을 통해 분석하고, 다음으로 표 3에 기재된 적합한 항체를 타겟팅하는 면역형광 염색을 통해 이를 결정하였다.

통계적 분석

데이터는 최소 3번의 독립적인 실험에 대한 평균 ± 표준오차로 나타내었다. 둘 이상의 그룹이 포함될 경우, 데이터는 양측(two-tailed) 스튜더트 t-검정 또는 분산 분석을 통해 분석하였다.

실험결과

PSA-NCAM-타겟팅을 통한 세포 분류는 비균질의 신경 로제트 퍼퓰레이션으로부터 신경능선-유사 세포를 분리할 수 있다.

hPSC로부터 신경계로의 분화 및 신경 로제트의 분리는 본 발명자들에 의해 종래에 보고된 방법으로 수행하였다(도 1a)(11, 13). 확장된 신경 로제트 배양액은 신경외배엽 및 신경상피 마커, Sox2, Nestin, Sox1 및 Pax6을 발현하였다(도 1b-d). Zo-1 및 PLZF의 발현으로부터 신경 로제의 특성을 가짐을 확인할 수 있었으며(도 1d, e), 종래에“로제트-특이적 마커”로 정의되었던 유전자의 발현도 확장 기간동안 유지되었다(도 5)(2). 종래 알려진 대로 신경 로제트 배양액이 대부분 PSA-NCAM⁺세포인 것으로 나타났지만(13), PSA-NCAM^-세포 부위도 관찰되었다(도 1f). 이 부위에서, Pax6^-세포가 Pax6⁺로제트 코어의 바깥 경계에서 관찰되었으며(도1g), 신경능선 마커인 p75도 관찰되었다(도 1h). 개개의 세포 특성을 분석하기 위하여 신경 로제트 배양액을 단일세포로 분리하자, AP2(신경능선 계열 마커)-양성 세포가 존재하였다(도 1i). 이러한 결과는 신경 로제트 세포가 신경능선-유사적인 특성의 관점에서 비균질(heterogeneous)이며 PSA-NCAM⁺및 PSA-NCAM^-세포로 나누어질 수 있음을 의미한다.

비균질의 신경 로제트 배양액은 PSA-NCAM 항체를 이용한 MACS (magnetic activated cell sorting)를 통해 두 개의 상이한 퍼퓰레이션으로 나누었다. MACS 수행 전에, 미분화 잔여 세포가 남아있는지를 조사하였으나, 신경 로제트 퍼퓰레이션 및 분류된 세포에서 전분화성 줄기세포는 검출되지 않았다(도 6a, 6b). PSA-NCAM⁺세포는 분극화된 신경 로제트 세포의 물리적 외형을 띄었으며 신경 로제트 퍼퓰레이션의 79%를 구성하고 있었고, PSA-NCAM^- 세포는 신경능선-유사 세포의 외형을 가졌으며 신경 로제트 퍼퓰레이션의 21%를 차지했다(n=4)(도 1j-l). 이러한 비율을 통해 확장된 신경 로제트 배양액이 약 21%의 신경 로제트 외형을 가지지 않는 PSA-NCAM^-세포를 포함함을 알 수 있다.

PSA-NCAM ^- 분세포는 NCSC의 분자적 특성 및 유전자 발현특성을 보인다

PSA-NCAM^-세포는 중추신경계의 신경세포에서는 발견되지 않는 신경능선-유사 세포의 외형을 가지므로, PSA-NCAM^-세포의 조성을 더 면밀하게 조사하였다. 우선은 세 개의 신경능선 마커인 p75, Hnk1 및 AP2를 이용하여, 신경능선 계열에서 유래한 세포의 비율을 조사하였다. 유세포 분석 결과 PSA-NCAM^-퍼퓰레이션의 95.8%(n=4)가 p75⁺인 반면, 96.8%가 Hnk1⁺였다(도 2a, b). 인간 유도만능 줄기세포(iPSCs)에서 유래한 PSA-NCAM^-세포 인 WT-iPSCEpi3도 유사한 결괄 보였다(도 7a-d). 전분화능 세포 마커인 SSEA4는 유세포 분석 결과 PSA-NCAM^-세포에서 발현되지 않았다(도 2c). 또한, 최초 계대(initial passage, P0) PSA-NCAM^-세포의 86.9%가 AP2에 대해 양성을 나타냈으며, 서브컬쳐가 진행될수록(P2) 양성 정도는 92.3%까지 증가하여 신경능선 세포로 점지적으로 특성화됨을 알 수 있었다. 모든 활성 단계의 세포주기 마커인 Ki67을 발현하는 세포의 정량화 결과 AP2⁺PSA-NCAM^-세포의 88.9%가 증식 단계에 있음을 관찰하였다(도 2d). PSA-NCAM^-세포에 대한 면역세포화학 분석 결과 신경능선 특성이 확인되었다(도 2e-h). PSA-NCAM^-세포의 특성을 보다 조사하기 위하여 신경능선 특성과 관련된 핵심 전사인자들에 대한 실시간 RT-PCR 분석을 수행하였다. PSA-NCAM^-세포는 신경 로제트 세포 및 PSA-NCAM⁺세포에 비해 증가된 p75 및 AP2 수준을 보였다(도 8a). 전분화능의 주요 인자이자 가장 초기에 발현되는 신경능선 표지자인 cMyc(16)의 발현 수준은 PSA-NCAM⁺세포를 제외한 모든 세포에서 일정했다(도 8b). PSA-NCAM^-세포는 전 이동성(pre-migratory) 및 이동성(migratory) NCSC에서 나타나는 전사체 수준이 증가되어 있었으며(도 8c, d), EMT 조절인자의 수준도 계대 수가 증가함에 따라 함께 증가하였다(P2 vs P4)(도 8c)(16). 이러한 결과는 복수의 신경능선 마커 유전자가 PSA-NCAM^-세포에서 다량으로 발현되나 PSA-NCAM⁺세포에서는 그렇지 않다는 분자적 증거를 제공한다.

인 비트로에서 hPSC로부터 NCSC를 분리할 때, 종래의 연구에서는 분화된 배양액에서 p75⁺또는 p75⁺/Hnk1⁺세포를 타겟팅하였다(12, 17-20). 본 발명자들은 PSA-NCAM^-세포가 NCSC임을 최초로 규명하였기 때문에, PSA-NCAM^-세포와 이미 확립된 NCSC인 p75⁺/Hnk1⁺세포를 비교하였다. 2단계-MACS 분류를 수행하여 p75⁺/Hnk1⁺세포를 수득하였으며, 유세포분석 및 면역세포화학을 통해 순도를 확인하였다(도 2i-l). 양 세포의 발현 패턴을 비교하기 위하여, 신경 로제트, PSA-NCAM⁺세포, PSA-NCAM^-세포 및 p75⁺/Hnk1⁺세포에 대해 전사체 분석을 3회 실시하였다(도 2m-s). 1,178개의 상이한 발현을 보이는 유전자에 대해 유사성의 척도로서 완전 연관 및 유클리드 거리를 이용한 계층적 군집 분석을 수행하였다(20,287 of 47,322개 프로브 중 20,287 프로브를 필터링: fail.count<6&1, 20,287 프로브 중 178개 프로브가 통계적 유의성을 보임, |fc|≥2&lpe.adj.pval<0.05). 상이하게 발현되는 전사체를 각각 신경 로제트 및 PSA-NCAM⁺세포 vs PSA-NCAM^-세포 및 p75⁺/Hnk1⁺세포로 구성된 두 개의 발현 그룹으로 나누었다(도 2m).

벤 다이어그램에서 보는 바와 같이, PSA-NCAM^-및 p75⁺/Hnk1⁺세포는 1,178 유전자 중 1,041 유전자를 공통적으로 발현함으로써, 두 그룹 간의 유사성을 알 수 있었다(도 2n). 나아가, PSA-NCAM⁺세포 및 PSA-NCAM^-세포 간에 상이하게 조절되는 754개의 유전자를 동정하였으며(도 2o), PSA-NCAM⁺세포 및 p75⁺/Hnk1⁺세포 간 상이하게 조절되는 543 개의 유전자를 동정하였다(도 2p). 각 그룹 간의 발현 수준(표준화된 값)을 추가적으로 분석하기 위하여, PSA-NCAM⁺세포, PSA-NCAM^-세포 및 p75⁺/Hnk1⁺세포를 각각 비교하는 스케터 플롯(scatter plot)을 작성하였다. 스케터 플롯 역시 PSA-NCAM^-및 p75⁺/Hnk1⁺세포가 각 그룹 중 가장 유사함을 보여주었다(도 2q-s). 요약하면, PSA-NCAM^-및 p75⁺/Hnk1⁺세포의 공통 유전자 발현 프로필을 통해 이들 두 그룹 간의 유사한 분자적 특성과 나아가 PSA-NCAN^-세포의 NCSC 특성을 확인할 수 있다.

PSA-NCAM ⁺ 세포에서 PSA를 제거하면 신경능선 마커 발현이 증가한다

본 발명의 실험데이터는 신경 로제트 배양액에서 유래한 PSA-NCAM^-세포가 신경능선 마커에 대해 높은 양성을 보임을 보여주었다. 비록 종래의 연구가 PSA-NCAM 발현을 이용하여 NPC를 증가시키거나 신경 세포를 동정하였으나, PSA-NCAM 발현과 세포의 신경능선 계열과의 상관관계를 관찰한 적은 없다. PSA-NCAM이 SVZ(subventricular zone)-유래 뉴런에서 p75 유전자 발현을 조절한다는 보고(21)에 근거하여, 본 발명자들은 PSA-NCAM와 p75⁺신경능선 세포의 생성 간의 관계를 조사하고자 하였다. 본 발명에서, p75⁺신경능선 세포는 PSA-NCAM⁺세포 퍼퓰레이션에서 검출되지 않았다(도 3a). 그러나, 글리세롤 대조군과 달리 PSA-NCAM⁺세포에 NCAM으로부터 PSA를 특이적으로 제거하는 효소인 엔도뉴라미니데이즈-N(EndoN)를 처리하자 p75⁺세포가 나타났다(도 3a-f).

반대로, PSA-NCAM^-세포를 글리세롤 또는 EndoN로 처리하여도 p75⁺세포의 수는 변하지 않았다(도 3g-l). 실시간 PCR 분석을 통해 PSA-NCAM⁺세포에 EndoN를 처리하면 p75 유전자 발현이 증가하지만, NCAM의 폴리사이알산화를 담당하는 폴리사이알산 전이효소 코딩 유전자 ST8SIA2 및 ST8SIA4의 발현은 변화가 없었다(도 3m, n). 이러한 결과로부터 PSA-NCAM 단백질의 PSA 부분이 p75 유전자를 음성 조절하여, PSA-NCAM⁺세포 퍼퓰레이션에서의 p75⁺신경능선 세포 결핍을 야기한다는 사실을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 데이터는 신경능선 계열로의 결정에 있어 PSA-NCAM과 p75가 음의 상관관계에 있음을 제시하면서, 왜 PSA-NCAM^-세포만이 p75에 대해 높은 양성을 보이는지를 설명한다.

PSA-NCAM ^- 세포는 NCSC의 다중계열 분화능력을 가진다

신경능선은 신경관 배면에서 유래한 다능성 퍼퓰레이션이다. NCSC는 다능성을 가져 외배엽 및 중간엽 조직 계열로 모두 분화할 수 있다(14). PSA-NCAM^-세포의 인 비트로 기능성을 분석하기 위하여, PSA-NCAM^-세포를 신경능선 유래를 가지는 세포로 분화를 유도하였다. PSA-NCAM^-세포의 다중계열 분화를 유도하기에 앞서, 내배엽 또는 중간엽 계열 세포로 오염되지 않았는지를 확인하였다. 신경외배엽으로 특화된 EB는 PSA-NCAM 타겟팅된 분류 전에 내배엽 및 중간엽 계열 세포의 오염이 없었다(도 10a, b). 따라서, 다중계열 분화 도중의 PSA-NCAM^--유래 중간엽 계열로의 분화는 PSA-NCAM^-세포의 특성에만 좌우된다.

PSA-NCAM^-세포가 척추동물에서의 신경능선 발달을 모방하는 중간엽 전구세포(MP)를 생산하는 능력이 있는지를 조사하기 위하여(22-24), 본 발명자들은 성장 배지에 10% FBS를 첨가함으로써 PSA-NCAM^-세포를 자발적으로 분화시켰다. 4일 째부터 형태적 변화를 관찰하였으며, MP는 14일째에 나타났다(도 4a, b). 20일 째에 수행한 유세포 분석을 통해 PSA-NCAM^-세포-유래 MP에서 중간엽 마커인 CD44, CD29, CD73, CD105 및 CD90가 검출된 반면, p75 양성은 소실되었음을 확인하였다(도 4c). PSA-NCAM^- 세포로부터 분화된 MP가 연골, 뼈 및 지방 분화 능력을 유지한다는 사실도 확인되었다(도 4d-f). NCSC의 다분화능은 PNS를 포함하는 뉴런으로의 분화도 포함된다. 후기-계대의 PSA-NCAM^-세포(P6-8)가 peripherin⁺뉴런으로 분화하도록 유도하였다(25). Nestin⁺PSA-NCAM^-세포는 서서히 뉴런 전구체의 특성을 상실하고 TuJ1⁺뉴런 세포로 분화하였다(도 4g). 14일 째에, peripherin⁺및 TuJ1⁺PNS 뉴런을 수득하였다(도 4h). 마지막으로, PSA- NCAM^-세포는 SMAα 및 칼포닌-양성 평활근 세포로 분화함으로써(도 4i, j), 인 비트로에서 PSA-NCAM^-세포의 다분화능을 추가적으로 확인할 수 있었다. iPSC-유래 PSA-NCAM^-세포에서도 중간엽 특징이 획득되었음을 관찰하였으며(도 11a), 이들 세포도 SMAα⁺및 칼포닌⁺세포로 분화할 수 있었다(도 11b). 이에, 본 발명의 실험데이터를 통해 PSA-NCAM^-세포의 다분화능을 확인할 수 있었다.

PSA-NCAM ^- 세포에서 유래한 중간엽 계열세포, 색소 세포 및 Peripherin ⁺ 이식부에서의 종양

인 비보에서 비균질의 신경 로제트의 세포적 습성을 조사하기 위하여 인 비보, 본 발명자들은 성체 랫트 뇌에서의 이식을 수행하였다. 이식 후 10주가 경과하자, 로제트가 풍부한 신경 과성장(도 5a-c) 및 Runx2⁺구조와 같은 비-신경외배엽성 구조(26)(도 5d, e)가 관찰되었다. 로제트를 형성하는 신경 과성장은 모든 개체(n=8)에서 확인된 반면, 중간엽 계열의 비-신경외배엽성 구조(본 명세서에서 종양으로 간주)는 88%(n=7/8)의 높은 비율로 형성되었다(도 5f).

종양 형성을 보고하는 종래의 연구(8-10, 13) 및 멜라닌 세포, 연골세포, 평활근 세포가 NCSC로부터 유래할 수 있다는 사실에 근거하여, 본 발명자들은 신경 로제트가 이식원으로 사용될 경우 PSA-NCAM^-세포가 종양 형성에 있어 역할을 하는지를 조사하고자 하였다. 다음과 같이 PSA-NCAM^-세포와 PSA-NCAM⁺세포를 특정 비율로 혼합하여 랫트 뇌에 이식하였다: 100% PSA-NCAM^-세포; 75% PSA-NCAM^-세포/25% PSA-NCAM⁺세포; 25% PSA-NCAM^-세포/75% PSA-NCAM⁺세포; 및 100% PSA-NCAM⁺세포. 100%, 75% 및 25% PSA-NCAM^-세포를 이식한 랫트는 전체 퍼퓰레이션의 82%, 75% 및 57%로 각각 종양을 형성하였다(도 5g, h). 반면, 100% PSA-NCAM⁺세포가 이식된 개체에서는 종양 형성이나 신경 과성장 모두 검출되지 않았다. PSA-NCAM^-세포에 의해 형성된 이식부도 peripherin⁺세포를 함유하였으며, 낭포 형성 뿐 아니라 색소침착도 나타났다(도 5i-k). 동정된 종양은 Runx2-발현 골 및 SMAα-발현 평활근 조직과 같은 중간엽 계열 조직으로 구성되어 있었다(도 5l, m, h). PSA-NCAM^-세포를 가지는 랫트 군의 뇌에 대한 대표적인 H&E 염색 결과 다양한 중간엽 계열 세포가 존재하지만 내배엽 계열은 존재하지 않음을 알 수 있다(도 5n).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

1. Conti L & Cattaneo E (2010) Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? Nature reviews. Neuroscience 11(3):176-187.

2. Elkabetz Y, et al. (2008) Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes & development 22(2):152-165.

3. Chambers SM, et al. (2009) Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature biotechnology 27(3):275-280.

4. Koch P, Opitz T, Steinbeck JA, Ladewig J, & Brustle O (2009) A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(9):3225-3230.

5. Kriks S, et al. (2011) Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature 480(7378):547-551.

6. Kirkeby A, et al. (2012) Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell reports 1(6):703-714.

7. Liu Y, et al. (2013) Medial ganglionic eminence-like cells derived from human embryonic stem cells correct learning and memory deficits. Nature biotechnology 31(5):440-447.

8. Arnhold S, Klein H, Semkova I, Addicks K, & Schraermeyer U (2004) Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Investigative ophthalmology & visual science 45(12):4251-4255.

9. Seminatore C, et al. (2010) The postischemic environment differentially impacts teratoma or tumor formation after transplantation of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Stroke; A journal of cerebral circulation 41(1):153-159.

10. Doi D, et al. (2012) Prolonged maturation culture favors a reduction in the tumorigenicity and the dopaminergic function of human ESC-derived neural cells in a primate model of Parkinson's disease. Stem cells 30(5):935-945.

11. Kim DS, et al. (2010) Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem cell reviews 6(2):270-281.

12. Lee G, et al. (2007) Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nature biotechnology 25(12):1468-1475.

13. Kim DS, et al. (2012) Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PloS one 7(7):e39715.

14. Le Douarin NM & Dupin E (2003) Multipotentiality of the neural crest. Current opinion in genetics & development 13(5):529-536.

15. Knecht AK & Bronner-Fraser M (2002) Induction of the neural crest: a multigene process. Nature reviews. Genetics 3(6):453-461.

16. Prasad MS, Sauka-Spengler T, & LaBonne C (2012) Induction of the neural crest state: control of stem cell attributes by gene regulatory, post-transcriptional and epigenetic interactions. Developmental biology 366(1):10-21.

17. Jiang X, et al. (2009) Isolation and characterization of neural crest stem cells derived from in vitro-differentiated human embryonic stem cells. Stem cells and development 18(7):1059-1070.

18. Chimge NO & Bayarsaihan D (2010) Generation of neural crest progenitors from human embryonic stem cells. Journal of experimental zoology. Part B, Molecular and developmental evolution 314(2):95-103.

19. Menendez L, Yatskievych TA, Antin PB, & Dalton S (2011) Wnt signaling and a Smad pathway blockade direct the differentiation of human pluripotent stem cells to multipotent neural crest cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(48):19240-19245.

20. Kreitzer FR, et al. (2013) A robust method to derive functional neural crest cells from human pluripotent stem cells. American journal of stem cells 2(2):119-131.

21. Gascon E, Vutskits L, Jenny B, Durbec P, & Kiss JZ (2007) PSA-NCAM in postnatally generated immature neurons of the olfactory bulb: a crucial role in regulating p75 expression and cell survival. Development 134(6):1181-1190.

22. Gammill LS & Bronner-Fraser M (2003) Neural crest specification: migrating into genomics. Nature reviews. Neuroscience 4(10):795-805.

23. Sauka-Spengler T & Bronner-Fraser M (2008) A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature reviews. Molecular cell biology 9(7):557-568.

24. Theveneau E & Mayor R (2012) Neural crest migration: interplay between chemorepellents, chemoattractants, contact inhibition, epithelial-mesenchymal transition, and collective cell migration. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology 1(3):435-445.

25. Lee G, Chambers SM, Tomishima MJ, & Studer L (2010) Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols 5(4):688-701.

26. Cocchia D, et al. (1983) Localization of S-100 protein in Muller cells of the retina-2. Electron microscopical immunocytochemistry. Investigative ophthalmology & visual science 24(7):980-984.

27. Basch ML & Bronner-Fraser M (2006) Neural crest inducing signals. Advances in experimental medicine and biology 589:24-31.

28. Tang C, et al. (2011) An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nature biotechnology 29(9):829-834.

29. Ben-David U & Benvenisty N (2014) Chemical ablation of tumor-initiating human pluripotent stem cells. Nature protocols 9(3): 729-740.

30. Jang J, et al. (2011) Induced pluripotent stem cell models from X-linked adrenoleukodystrophy patients. Annals of neurology 70(3):402-409.

31. Lee MY & Lufkin T (2012) Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. Journal of biomolecular techniques : JBT 23(2):69-77.

Claims

다음의 단계를 포함하는 전분화능 만능줄기세포(pluripotent stem cell)로부터 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 수득하는 방법:
(a) 전분화능 만능줄기세포를 신경 로제트(neural rosette)로 분화시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분화된 세포 파퓰레이션에 PSA-NCAM(poly-sialated neural cell adhesion molecule) 항체를 접촉시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 세포 파퓰레이션에서 상기 PSA-NCAM 항체와 결합하지 않은 세포를 분리하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 분리된 세포를 중간엽 줄기세포로 분화시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 전분화능 만능줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 유도만능줄기세포(iPSCs)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 전분화능 만능줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells) 또는 유도만능줄기세포(iPSCs)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계는 전분화능 만능줄기세포를 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein) 신호 경로 억제제 및 액티빈/노달(Activin/Nodal) 신호 경로 억제제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 골 형성 단백질 신호 경로 억제제는 도소모르핀(dorsomorphin)인 것을 특징으로하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 액티빈/노달 신호 경로 억제제는 4-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2일)-벤즈아미드인 것을 특징으로하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (b) 단계 및 (c) 단계는 MACS(magnetic activated cell sorter)를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 분리된 세포에 대해 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition, EMT)을 수행함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 CD44, CD29, CD73, CD105 및 CD90으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 마커에 대해 양성이고, p75에 대하여 음성인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제