KR20140144680A - 인간의 망막 전구세포의 표현형 프로필 - Google Patents

인간의 망막 전구세포의 표현형 프로필 Download PDF

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KR20140144680A
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마이클 제이. 영
페트르 와이. 바라노브
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더 셰펜스 아이 리써치 인스티튜트
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Abstract

본 발명은 양성 표면 마커인 SSEA4, CD73, PTK7 및 PSA-NCAM를 포함하는 인간 망막 전구세포의 실질적으로 균일한 세포군에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포 분류 기술을 이용하여 인간 망막으로부터 실질적으로 균일한 세포군을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

인간의 망막 전구세포의 표현형 프로필{PHENOTYPE PROFILE OF HUMAN RETINAL PROGENITOR CELLS}
본 발명은 정제된 인간 망막 전구세포 및/또는 인간 망막 전구세포의 실질적으로 균일한 개체군 및 상기 세포 및/또는 실질적으로 균일한 세포군을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다.
정신적 외상, 노화 또는 질병의 결과로서의 인간 망막의 퇴화는 영구적 시각 손실을 유발할 수 있고, 전세게 수백만 명의 사람들이 영향을 받을 수 있다. 퇴행성 질환은, 예를 들어, 색소성 망막염(retinitis pigmentosa), 연령관련 황반 변성(age-related macular degeneration) 및 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy)을 포함할 수 있다. 이러한 질환은 망막의 광 감지 광수용체(photoreceptor) 세포의 점진적인 사멸에 의해 특징지어지며, 서양에서 불치의 실명의 주요 원인이다. 인간 망막 고유의 재생력은 극히 제한적이며, 광수용체 세포의 손실로 고통 받는 사람들에 대해 유일한 실행 가능한 치료 방법은 세포 대체이다.
망막 퇴행성 질환을 위한 세포 치료 수단으로서 몇 가지 세포 유형이 제안되었다. 이러한 세포 유형은 인간 망막 전구세포(human retinal progenitor cell, hRPC), 망막 색소 상피 세포, 신경교 전구세포, 신경 줄기세포, 골수 및 제대혈 유래 세포를 포함한다. 다분화능(multipotent) 줄기세포(시원 세포, 미숙 세포, 전구 세포, 미분화 세포, 또는 증식 세포라도 다양하게 불림)는 이식과 분화를 위한 활성 초점이다.
인간 망막 전구세포는 퇴행성 또는 발병한 망막의 주인에게 이식하는 것과 같은 임상 응용에서 사용하기 위한 큰 가능성을 갖는다. 이러한 세포는 일반적으로 오염을 제거하기 위해 섬모의 가장자리 구역과 시신경을 제거하여 출산 전후의 조직 내의 태아 망각에서 분리된다. 예를 들어, 이의 개시가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제 7,514,259호를 참조하라. 이러한 세포는 시험관 내에서 확장될 수 있고 망막으로 이동하여 다시 거주함으로써 새로운 기능의 광수용체를 형성할 수 있다.
이식용과 같은 임상 응용에서 약품으로서의 살아있는 세포의 사용은 숙주 개체군을 확대하는 동안 그리고 인간 수용자에게 세포를 주입하기 전에 세포군의 포괄적인 특성분석을 필요로 한다. 이러한 특성분석은 일반적으로 세포의 표면에서 발현하는 특정 마커의 식별에 의해 달성된다. 특정 마커, 즉, 특정 세포주에 특이한 마커의 식별은 또한 숙주 개체군의 농축이나 제거에 유용하다.
다양한 세포 유형에 특이적인 특정 마커를 식별하기 위해 과거에 다양한 시도가 이루어졌다. 이러한 방식으로 성공적으로 특징지어지고 식별된 세포군은 조혈 줄기세포, 배아 줄기세포, 신경 줄기세포 및 신경교 전구세포를 포함한다.
Carter 등은 문헌(BMC Ophthalmology, 9: 1, 2009)에서 성인 망막 세포를 정제하기 위한 마커 CD133의 사용을 개시하고 있다. 망막 세포 현탁액은 성인의 사후 조직에서 수득하였고 자기식 자동화 세포 분리(magnetic automated cell sorting)로 농축하였다. 대략 95%의 세포 정제를 보여주었다.
미국 특허 제 6,468,794호는 세포 표면 마커에 결합하는 단클론 항체를 이용한 신경 줄기세포와 전구세포군의 농축을 개시하고 있다. 미국 특허 제 7,015,037호는 마커 CD44, CD45, HLA Class I 및 HLA Class II에 대해 표면 음성인 분리된 다분화능 줄기세포를 개시하고 있다. 또한, 각각의 개시가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제 6,908,763호, 미국 특허 제 7,749,754호 및 미국 특허 제 7,781,179호를 참조하라.
Yuan 등은 문헌(Plos One, 6(3), el7540, March 2011)에서 만능 줄기세포에서 유래한 신경교 및 신경세포인 신경 줄기세포의 고순도 개체군을 생성하는 개선된 분화 및 농축 절차를 개시하고 있다. 세포 표면 서명 또는 마커는 세포에서 식별되어, 이질적으로 분화하는 세포군으로부터 형광 활성화 세포 분류(fluorescent activated cell sorting, FACS)에 의한 세포의 분리를 가능하게 한다. 특히, 참조 문헌은 신경 줄기세포의 개체군이 형광 활성화 세포 분류 및 마커 CD184+, CD271-, CD44- 및 CD24+를 이용하여 성공적으로 분리된 것을 기술하고 있다. 이 공개의 개시는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
세포-특이적 마커를 이용하여 다양한 유형의 줄기세포를 특성화하려는 다양한 시도에도 불구하고, 인간 망막 전구세포에 특이적인 표면 마커는 아직 식별되지 않았다. 이러한 마커의 성공적인 식별은, 세포군의 농축, 배양액으로부터 신경교 세포, 신경 세포 및 망막 색소 상피 세포와 같이 덜 바람직한 세포의 제거, 및 관심 있는 마커를 고도로 발현하는 망막 전구세포의 궁극적인 선택을 허용함으로써 기술을 진전시킬 것이다. 고도로 정제된 세포군은 이후, 2011년 6월 4일 출원된 미국 특허 출원 제 13/160,002호에 개시된 것과 같은 기술을 사용하여 배양될 수 있으며, 망막의 퇴행성 질환의 치료를 위한 인간 이식에서 사용될 수 있는 세포를 유도하기 위한 목적으로 세포 은행에서 제조될 수 있다. 세포 표면 마커는, 세포 생성물의 품질을 정의하기 위한 정부 규제 기관의 요건에 대한 부분적인 이행에 있어서, 환자에게 전달될 세포 생성물의 특성분석을 가능하게 하는 마커를 나타낼 수 있다.
상기의 관점에서 그리고 임상적 평가와 사용에 대한 인간 망막 전구 세포의 중요성의 관점에서, 이식 및 질환 치료를 위해 인간 망막 전구세포의 특성분석, 식별 및 정제를 향상시킬 필요성이 존재한다는 것을 쉽게 알 것이다. 본 발명의 이들 그리고 다른 목적은 다음의 설명으로부터 명백할 것이다.
본 발명은 정제된 인간 망막 전구세포 및/또는 인간 망막 전구세포의 실질적으로 균일한 개체군 및 상기 세포 및/또는 실질적으로 균일한 세포군을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 인간 망막 전구세포는 다음의 세포 표면 마커들 각각의 존재에 의해 독특하게 특징지어진다: SSEA4, CD73, PTK7 및 PSA-NCAM. 추가의 양태에서, 세포는 리커버린(recoverin), Sox2 및 Pax6의 발현에 의해 특징지어진다. 세포 및/또는 세포군을 포함하는 조성물이 본원에 더 개시된다.
일 양태에서, 본 발명의 인간 망막 전구세포는 다음의 표면 마커의 결여로 특징지어진다: CD15, CD133, A2B5 및 CD38(본 기술분야에서 CD15-, CD133-, A2B5- 및 CD38-로도 확인됨). CD15 및 CD133은 신경 줄기세포 표면 마커이다. A2B5 및 CD38은 신경교 전구세포 표면 마커이다. 추가의 양태에서, 본 발명의 정제된 세포군은 적어도 대략 50%, 바람직하게 적어도 대략 60%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 대략 80%의 표시된 세포 표면 마커로 특이적으로 식별된 인간 망막 전구세포를 포함한다. 세포 및/또는 세포군을 포함하는 조성물이 본원에서 더 개시된다.
본 발명의 방법은 인간 조직으로부터 분리된 세포 샘플을 획득하고 식별한 후 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 상기 식별된 마커의 사용에 의해 전구세포를 분리 또는 정제하는 방법을 포함한다. 일 양태에서, 상기 방법은 상기 세포 샘플에 일반적으로 존재하는 다양한 불순물과 오염물질을 제거하는 단계, 상기 세포를 분리하여 상기 식별된 표면 마커를 갖는 인건 전구세포를 분리하고 정제하는 단계, 및 임상 또는 실험 용도로 정제된 세포를 수집하는 단계를 포함하거나, 또는 본질적으로 상기 단계로 이루어진, 또는 상기 단계로 이루어진다. 상기 세포는 이후, 이의 개시가 본원에 참고로 포함된 2011년 6월 14일 출원된 미국 특허 출원 제 13/160,002호에 개시된 바와 같이, 조직 배양으로 배치되고 치료용으로 생성될 수 있는 실질적인 세포수로 성장할 수 있다. 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 세포 분류 기술은 일반적으로 알려져 있고, 예를 들어, 유세포 분석, 및 구체적으로 세포 표면 마커를 인식하고 이에 결합하는 항체 및 단편을 이용하는 형광 활성화 세포 분류 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은, 바람직한 조직 공급원은 성인 또는 태아 망막 조직이지만, 골수, 제대혈, 인간 배아 줄기세포 또는 이의 분화된 자손, 인간 유도만능 줄기세포 또는 이의 분화된 자손과 같은 다양한 인간의 조직 공급원으로부터 망막 전구세포의 선택을 가능하게 한다.
본 발명의 인간 망막 전구세포는 발병한 눈으로 이식할 때 망막 질환의 치료와 같은 다양한 치료 용도를 가지며, 세포는 숙주 환자 또는 수용자의 자가 조직이거나 동종일 수 있다. 본 발명의 세포는 또한 세포를 적절한 분석 형식으로 약학적 물질에 접촉시킴으로써 시험관 내 약물 개발 및 독성 시험에 사용될 수 있다. 망막 전구세포는 광수용체 세포로 분화할 수 있기 때문에, 이들 세포는 환자의 광수용체 조직을 대체하거나 또는 수리하기 위해 그리고, 예를 들어, 색소성 망막염, 연령관련 황반 변성 및 당뇨병성 망막증과 같은 안구의 퇴행성 질환의 치료에 유용하다. 따라서, 본 개시는 또한 세포의 광수용체 세포로의 분화를 유도하거나 지원하기 위해 적절한 조건 하에서 세포 또는 식별된 세포군을 배양함으로써 광수용체 세포의 정제된 배양을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 이후 다양한 물질을 세포의 생존능력, 특성 또는 분화에 대한 효과를 결정하기 위해 세포에(세포 또는 세포군이 분화하는 동안 한 번 이상) 접촉시킬 수 있다.
본 발명의 상기한 실시형태 및 양태는 단지 예시적이며 청구된 발명의 사상 및 범위를 제한하지 않는다.
본 발명의 상기 및 다른 장점과 특징은 첨부한 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명을 읽을 때 명백해질 것이다.
도 1은 인간 망막 전구세포의 유세포 분석을 기반으로 나타낸 스터니스/아이 필드 마커(sternness/eye field marker)의 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
도 2는 인간 망막 전구세포의 유세포 분석을 기반으로 나타낸 증식/세포 주기 마커의 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
도 3은 인간 망막 전구세포의 유세포 분석을 기반으로 나타낸 신경/신경교 마커의 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 인간 망막 전구세포의 면역세포화학 분석을 기반으로 나타낸 sternness/eye field 마커의 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
도 5는 인간 망막 전구세포의 면역세포화학 분석을 기반으로 나타낸 증식/세포 주기 마커의 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
도 6은 인간 망막 전구세포의 면역세포화학 분석을 기반으로 나타낸 신경/신경교 마커의 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 동등한 모든 방법 및 물질은 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치, 및 물질이 이제 개시된다. 본원에 인용된 모든 기술 및 특허 공보는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원에 포함된 그 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시에 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 본 기술분야의 기술 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA, 유세포 분석 및 세포 분류의 종래 기술을 사용할 것이다. 예를 들어, 다음 문헌들을 참고하라(Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gaited. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); 및 Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology. 또한 Yuan 등의 문헌(Plos One, 6(3), el7540, March 2011)을 참고하라.
예를 들어, 범위를 포함하는 pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량과 같은 모든 수치 지정은, 적절하게 1.0 또는 0.1씩의 증가에 의해 (+) 또는 (-)로 변경될 수 있는 근사치이다. 항상 명시적으로 언급되지는 않지만, 모든 수치 지정에는 용어 "약"이 선행된다는 것을 이해해야 한다. 항상 명시적으로 언급되지는 않지만, 본원에 개시된 시약은 단지 예시적이고 이의 등가물이 본 기술분야에 공지되어 있다는 것을 또한 이해해야 한다.
본 기술분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 및 모든 목적을 위해, 특히 서면 설명을 제공하는 점에서, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 부분범위 및 이들의 부분범위의 조합을 포함한다. 임의의 나열되는 범위는 적어도 이등분, 삼등분, 사등분, 오등분, 십등분될 수 있는 동일한 범위를 충분히 설명하고 가능하게 할 수 있는 것으로 쉽게 인식할 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 개시된 각각의 범위는 상부 삼분점, 중앙 삼분점, 하부 삼분점 등으로 쉽게 세분될 수 있다. 또한 본 기술분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, "최대", "적어도", "이상", "이하" 등과 같은 용어는 인용된 숫자를 포함하며, 상기한 바와 같이, 이후 부분범위로 세분될 수 있는 범위를 말한다.
명세서 및 청구항에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수의 언급을 포함한다. 예를 들어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는 이들의 혼합물을 포함하여 다수의 약학적으로 허용 가능한 담체들을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "포함하는"은 조합물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 것들은 배제하지 않는다는 것을 의미한다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때 "본질적으로 ~로 구성된"은 사용 목적을 위한 조합에 필수적인 다른 요소들을 배제하는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같이, 본질적으로 요소들로 이루어진 조성물은 인산완충식염수, 방부제 등과 같이 분리 및 정제 방법으로부터의 소량의 불순물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 배제하지 않을 것이다. "~로 구성된"은 다른 성분의 소량의 요소 및 본 발명의 조성물의 투여를 위한 실질적인 방법 단계 이상을 제외하는 것을 의미할 수 있다. 이러한 각각의 전이 용어에 의해 정의된 실시형태는 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 "숙주" 또는 "환자"는 포유동물과 같은 동물 또는 인간이다. 진단 또는 치료의 대상인 비인간 동물은, 예를 들어, 유인원, 쥐, 생쥐 같은 쥣과 동물, 개 같은 갯과 동물, 토끼 같은 토끼과 동물, 가축, 스포츠 동물, 및 애완동물과 같이 치료를 필요로 하는 동물이다.
"정제된(purified)" 또는 "분리된(isolated)"이란 용어는, 일반적으로 자연에서 결합되는 세포, 조직, 폴리뉴클레오티드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 이의 단편(들)과 같이 구성성분, 세포 등으로부터의 분리를 의미한다. 예를 들어, 분리된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 염색체 상에서, 일반적으로 태생적인 또는 자연적인 환경에서 결합되는 3' 및 5'의 인접하는 뉴클레오티드로부터 분리된다. 정제된 또는 분리된 세포는 일반적으로 자연에서 결합하는 조직으로부터 분리된다. 분리된 또는 정제된 세포는 서로 다른 표현형 또는 유전형의 조직 또는 세포로부터 분리된 세포이다. 본 기술분야의 숙련자에게 명백한 바와 같이, 비자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 이의 단편(들)은 이의 자연적으로 발생하는 상대와 구별하기 위해 "분리(isolation)"를 필요로 하지 않는다.
본원에서 사용되는 "줄기세포"는 배양시 무기한으로 분열하여 분화된 세포를 생성할 수 있는 능력을 보유한 세포를 정의한다. 이 때 그리고 편리상, 줄기세포는 신체(성체) 줄기세포 또는 배아 줄기세포로 분류된다. 성체 줄기세포는 분화된 조직에서 발견되는 미분화 세포이며, 이 분화된 조직은 자체가 재생(복제)될 수 있고 (특정 제한을 가지고) 분화되어 원래 조직의 모든 분화된 세포 유형을 생성한다. 배아 줄기세포는 다양한 분화된 세포 유형(전분화능(pluripotent))이 될 수 있는 배아로부터의 원시(미분화) 세포이다. 최근에는, 섬유아세포와 같이 완전히 분화된 성체 세포를 포함하는 체세포가 다음과 같은 인자의 일부 또는 전부의 도입에 의해 배아 줄기세포와 같이 전분화능이 될 수 있다: Oct- 3/4, SOX2, c-Myc, Nanog 및 Klf4. 이들 세포를 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, IPSC)라 한다. 배아 또는 유도만능 줄기세포는 수 개월 내지 수 년 동안 분화하지 않고 증식할 수 있게 하는 시험관 조건에서 배양된 것이다. 전분화능 줄기세포는, 이에 제한되지 않으나, Oct-4, 알칼리 포스파타아제, CD30, TDGF-1, GCTM-2, 제네시스(Genesis), 생식 세포 핵 인자(Germ cell nuclear factor), SSEA1, SSEA3, 및 SSEA4를 포함하는 적절한 마커의 사용에 의해 다른 유형의 세포와 구별될 수 있다.
"줄기세포"란 용어는 또한 "탈분화된(dedifferentiated)" 줄기세포를 포함하며, 이의 예는 직접 줄기세포로 변환된, 즉, 재프로그래밍된 체세포이다. 클론은 원래의 세포와 유전적으로 동일한 세포주이며, 이 경우, 줄기세포이다.
"번식하다(propagate)" 또는 "증식하다(proliferate)"라는 용어는 세포 또는 세포군의 표현형을 성장시키거나 변경하는 것을 의미한다. "성장하는(growing)" 또는 "확장하는(expanding)"이란 용어는 지지 배지, 영양분, 성장 인자, 지지 세포, 또는 원하는 수의 세포 또는 세포 유형을 수득하기 위해 필요한 임의의 화학적 또는 생물학적 화합물의 존재 하에 세포를 증식시키는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 세포의 성장은 조직의 재생을 유발한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 조직은 심장근육세포로 구성된다.
"배양하는"이란 용어는 다양한 종류의 배지에서 세포 또는 유기체의 기내 번식(in vitro propagation)을 말한다. 배양시 세포 성장의 자손은 모세포와 완전히 (즉, 형태적으로, 유전적으로, 또는 표현형적으로) 동일하지 않을 수 있다는 것을 알 것이다. "확장된"은 세포의 모든 증식 또는 분열을 의미한다.
"클론 증식(clonal proliferation)" 또는 "클론 확장(clonal expansion)"은 단일 세포에서 두 가지의 동일한 낭세포 및/또는 동일한 세포군으로의 연속적인 분열에 의한 세포군의 성장을 말한다.
본원에서 사용되는 세포의 "혈통"은 세포의 유전, 즉 세포의 전임자와 자손을 정의한다. 세포의 혈통은 세포를 발달과 분화의 유전 방식 내에 배치한다.
"분화(differentiation)"는 분화되지 않은(unspecialized) 세포가 심장, 간, 또는 근육 세포와 같은 분화된 세포의 특징을 수득해가는 과정을 나타낸다. "유도 분화(directed differentiation)"는 특정 세포 유형 또는 표현형으로의 분화를 유도하기 위한 줄기 세포 배양 조건의 조작을 말한다. "탈분화된(dedifferentiated)"이란 세포의 혈통 내에서 덜 헌신적인 위치로 되돌아간 세포를 정의한다. 본원에서 사용되는 용어 "분화하다 또는 분화된"은 세포의 혈통 내에서 더욱 헌신적인(분화된) 위치를 맡는 세포를 정의한다.
본원에서 사용되는 "항체"는 전체 항체 및 항원 결합 단편 또는 이의 단일 사슬을 포함한다. 따라서, "항체"란 용어는 적어도 일부의 면역글로불린 분자를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩타이드 함유 분자를 포함한다. 이러한 항체의 예는, 이에 제한되지 않으나, 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 또는 이의 리간드 결합 부위, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역(variable region), 중쇄 또는 경쇄 불변 영역(constant region), 골격 영역(framework region, FR), 또는 이들의 임의의 영역, 또는 일부가 본 발명의 항체에 도입될 수 있는 결합 단백질의 적어도 일부를 포함한다.
항체는 다클론 또는 단클론일 수 있으며, 예를 들어, 쥣과 동물, 쥐, 양 또는 갯과 동물과 같은 임의의 적절한 생물학적 원천으로부터 분리될 수 있다.
"항체"란 용어는 단일 사슬 항체 및 이의 단편을 포함하여, 항체 모방체 또는 항체의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부위 또는 지정된 단편 또는 부위를 포함하는 단클론 항체, 소화 단편, 지정된 부위, 이의 유도체 및 변종을 포함하도록 더 의도된다. 항체의 "항원 결합 부위"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; 경첩 부위(hinge region)에서 이황화물 다리(disulfide bridge)에 의해 결합된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; VH 및 CH 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 한팔(single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al. (1989) Nature 341:544-546); 및 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여 합성 링커에 의해 결합될 수 있고, 이 합성 링크는 상기 VL 및 VH 영역을 이들이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로 알려짐)를 형성하는 단일 단백질 사슬로 형성될 수 있게 한다(Bird et al. (1988) Science 242:423-426 and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883). 단일 사슬 항체는 또한 "항체의 단편"이란 용어에 포함되도록 의도된다. 상기한 모든 항체 단편은 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 종래의 기술을 이용하여 수득될 수 있으며, 단편은 온전한 항체와 마찬가지 방식으로 결합 특이성 및 중화 활성에 대해 선별된다.
"에피토프(epitope)"란 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되고 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 하전 특징을 갖는다. 입체적(conformational) 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 손실되지 않는다는 점에서 구별된다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제조를 말한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "망막 전구세포" 또는 "신경망막 유래 망막 줄기세포" 또는 "망막 줄기세포"는 동의어이며 신경망막 조직으로부터 유도될 수 있는 분리 가능한 줄기세포를 의미한다. 이들 세포의 발생 지점은 망막 색소 상피, 섬포체 또는 홍채의 착색된 세포와 같은 비-신경 망막 세포로부터 이들을 구별할 수 있는 한 가지 요인이다. 본 발명의 세포는 성장 인자의 부재 하에 증식할 수 없는 것에 의해 더 구별된다. 세포는 정상적인 세포 배양에서는 상당한 양의 광수용체 마커를 발현하지 않지만, 성장 인자 부재 하에 그리고 특히 특정 기질 물질(PLC 특허 출원) 상에 도말될 때, 세포는 광수용체 마커에 양성인 세포로 신속하게 분화된다.
본 발명의 세포는 본원에서 더 설명되는 고유한 일련의 세포 표면 마커에 의해 더 특징지어진다. 본 발명의 세포는 출산 전 또는 출산 후의 공급원으로부터 유래할 수 있고 다분화능이며, 이는 자가 재생(self-renewal)할 수 있고 광수용체로 망막 특이적 분화할 수 있음을 의미한다. 이러한 세포는 또는 미국 특허 제 7,514,259호에 더 설명되어 있으며, 이의 개시는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 망막 전구세포와 함께 본원에서 사용되는 용어 "다분화능(multipotency)"은 망막 전구세포가 증식하여 성숙한 망막 세포 유형, 특히 광수용체 세포를 형성할 수 있는 능력을 의미한다.
"실질적으로 균일한" 세포군은 대략 50%, 또는 대안적으로 대략 60 % 이상, 또는 대안적으로 대략 70 % 이상, 또는 대안적으로 75 % 이상, 또는 대안적으로 80% 이상, 또는 대안적으로 85 % 이상, 또는 대안적으로 90% 이상, 또는 대안적으로 95% 이상의 세포가 동일하거나 유사한 표현형인 세포군을 말한다. 표현형은 본원에서 더욱 상세하게 설명되는 세포 표면 마커에 의해 결정된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는", "치료" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 상기 효과는 장애 또는 이의 징후 또는 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서 예방적일 수 있고, 및/또는 장애 및/또는 상기 장애로 인한 역효과에 대한 부분적인 또는 완전한 치유의 측면에서 치료적일 수 있다. "치료"의 예는, 이에 제한되지 않으나, 장애에 취약할 수 있지만 아직 장애를 가진 것으로 진단되지 않은 대상에서 발생할 수 있는 장애의 예방; 장애의 억제, 즉, 이의 발병의 저지; 및/또는 예를 들어, 황반 변성과 같은 장애의 증상 완화 또는 개선을 포함한다. 본 기술분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, "치료"는 병적 이상과 관련된 증상의 전신적 개선 및/또는 가슴 통증과 같은 증상의 발병 지연을 포함한다. "치료"의 임상적 및 준임상적 증거는 병리, 개인 및 치료에 따라 달라질 수 있다.
"조성물"은 활성제, 세포 또는 세포군 및 불활성(예컨대, 검출제 또는 표지) 또는 활성인 다른 화합물 또는 조성물의 조합을 의미하도록 의도된다.
"약학적 조성물"은 조성물을 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에서의 진단 또는 치료 용도에 적합하도록 만드는, 생체적합성 지지체 또는 기질과 같은, 불활성 또는 활성인 담체와 활성제의 조합을 포함할 수 있다.
생리학적으로 적합한 담체 또는 매체라는 용어와 통용되는 "약학적으로 허용 가능한 담체"(또는 매체)라는 용어는, 치료적으로 투여되는 세포 및 다른 물질에 적합할 뿐만 아니라, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 기타 합병증 없이, 현명한 의학적 판단의 범위 내에서, 인간 및 동물의 조직과 접촉해서 사용하기에 적합한 시약, 세포, 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 제형을 말한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체는 액체, 반-고체(예컨대, 겔) 및 고체 물질(예컨대, 세포 지지체 및 기질, 튜브, 시트 및 본 기술분야에 공지되고 본원에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같은 물질)을 포함한다. 이러한 반-고체 및 고체 물질은 신체 내에서 분해에 내성을 갖도록(비-생체적합성) 설계될 수 있거나 또는 신체 내에서 분해되도록(생체적합성, 생체부식성) 설계될 수 있다. 생체적합성 물질은 또한 생체재흡수성(bioresorbable) 또는 생흡수성(bioabsorbable)일 수 있다, 즉, 생체적합성 물질은 분해되고 체액으로 흡수되거나(수용성 임플란트가 일례임) 또는 다른 재료로의 변환 또는 자연적인 경로를 통한 분해 및 제거에 의해서 분해되고 궁극적으로 신체에서 제거될 수 있다.
"유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 얻기에 충분한 양이다. 유효량은 한 번 이상의 투여, 도포 또는 복용으로 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는, 생체 및 생체 외 목적으로 "투여하는"이란 용어는 방법의 원하는 목적을 달성하기에 효과적인 유효량의 조성물, 세포 또는 세포군을 대상에 제공하는 것을 의미한다, 본원에 개시된 것과 같은 조성물을 투여하는 방법은 본 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 이에 제한되지 않으나, 비경구, 국소, 또는 경구 투여뿐만 아니라, 정맥 내, 피하 또는 근육 내 투여를 포함한다. 투여는 치료 과정 전체에 걸쳐 지속적으로 또는 간헐적으로 이루어질 수 있다. 투여의 가장 효과적인 수단과 복용량을 결정하는 방법은 본 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며 치료를 위해 사용되는 세포, 치료를 위해 사용되는 조성물, 치료의 목적, 및 치료 받는 대상에 따라 달라질 수 있다. 치료 의사에 의해 선택되는 투여량 및 패턴으로 단일 또는 다중 투여가 수행될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 치료가 의도되는 질병 또는 질환을 이미 앓고 있는 대상에 미리 또는 대안적으로 투여될 수 있다.
망막 전구세포 표면 마커
본 발명은 다음과 같은 각각의 세포 표면 마커의 존재로 특징지어지는 정제된 또는 분리된 세포 및/또는 망막 전구세포의 실질적으로 균일한 세포군에 관한 것이다.
양성 표면 마커가 존재하며, 이는 각각의 마커가 세포의 표면 상에 존재하고 이의 존재가 상기 표면 마커에 결합하는 항체 또는 다른 관련된 리간드에 의해 검출될 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 망막 세포는 또한 음성 세포 마커에 의해 특징지어지며, 이는 상기 마커의 존재가 마커에 대한 항체에 의해 검출될 수 없다(또는 마커의 부재가 관찰된다)는 것을 의미한다. 다음은 본 발명의 망막 전구세포에 대한 음성 세포 마커이다: CD15- (신경 줄기세포), CD 133- (신경 줄기세포), A2B5- (신경교 전구세포), 및 CD38- (신경교 전구세포).
본 발명의 세포군은 일반적으로 적어도 대략 50%, 바람직하게 적어도 대략 60%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 대략 80%의 인간 망막 전구세포를 포함한다. 망막 전구세포에 대한 인간의 공급원은 다양한 기관으로부터의 조직 또는 출산 전 망막 조직, 태아 조직, 성인 기관 및 골수와 같은 조직, 및 망막 신경구(neurosphere)를 포함한다. 인간 망막 조직은 이러한 세포의 바람직한 공급원이다. 세포는 살아있는 생존 가능한 숙주 또는 사체로부터 수득될 수 있다.
간단히, 인간 망막 전구세포는 윤리적으로 그리고, 예를 들어 ABR사(Alameda, California)와 같은 GTP 준수 조직 은행으로부터 입수된 임신 16 주령의 인간 신경 망막의 다양한 기증으로부터 분리된다. 분리되고 해리된 세포는 보충물(20 ng/ml rhEGF, 10 ng/ml bFGF)을 포함하는 Ultraculture™ 배지에서 피브로넥틴 코팅 표면에서 확장되고, 예를 들어 P8 및 P13까지 계대 배양된 후 냉동되어 약물질(Drug Substance, DS)의 스톡을 제공한다. 이러한 약물질은 임상 응용을 위한 GMP로 제조될 수 있다. 세포 제조를 위해, 약물질을 해동하고 20,000 세포/cm2의 밀도로 도말하였다. 이틀 후, 세포를 수확하고 표준 절차에 따라 제조하여 약품(Drug Product, DP)을 생성하였다. 인간 망막 전구세포의 제조된 배치(batch)각각에 대해 세포 농도(mL당 실제 세포의 수) 및 세포 생존력을 기록하였다.
특성분석을 위해, 인간 망막 전구세포를 mL당 5천만 마리의 세포 농도로 HBSS-NAC와 같은 비독성 부형제에서 망막 세포의 신선한 현탁액으로 제조한다. 세포를 이식을 위한 표준 절차에 따라 확장하고 준비한다. 일반적으로, 이의 개시가 본원에 참고로 포함된 2011년 6월 14일 출원된 미국 특허 출원 제 13/160,002호에 개시된 방법을 참조하라.
세포는 아래의 실시예에서 설명되는 바와 같이 유세포 분석 및 면역세포화학 분석을 이용하여 특징지어질 수 있다.
치료적 용도
본 발명은 또한 발병한 또는 퇴화된 인간 망각의 망막하(sub-retinal) 공간에 상기한 인간 망막 전구세포를 이식하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자의 광수용체 세포를 대체 또는 보호하기 위한 방법을 제공한다. 일 양태에서, 상기 세포는 치료를 필요로 하는 환자의 색소성 망막염(retinitis pigmentosa)의 증상을 치료하거나 완화할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 세포는, 이의 개시가 본원에 참고로 포함된 2012년 1월 23일 출원된 미국 특허 출원 제 13/356,073호에 개시된 것과 같은 적절한 생체적합성 지지체 상에 접종될 수 있고, 세포-지지체 조합 생성물은 치료를 필요로 하는 환자의 연령관련 황반 변성의 증상을 치료하거나 완화하기 위해 이식될 수 있다. 이러한 모든 치료를 위해, 망막 전구세포는 환자에게 동종이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 세포는 다른 치료와 병행해서 투여될 수 있다.
선별 분석
본 발명은 망막 전구세포의 분화를 조절하는 다양한 물질을 선별하기 위한 방법을 제공한다. 이는 또한 망막 전구세포로부터 배양으로 생성될 수 있는 성숙한 광수용체를 지지하고 및/또는 구제하는 치료제를 발견하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, "물질"은, 이에 제한되지 않으나, 단순하거나 또는 복잡한 유기 또는 무기 분자, 펩타이드, 단백질(예컨대, 항체), 폴리뉴클레오티드(예컨대, 안티-센스) 또는 리보자임과 같은 생물학적 또는 화학적 화합물을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오티드와 같은 고분자 및 다양한 코어 구조를 기반으로 하는 합성 유기 화합물과 같은 매우 다양한 화합물이 합성될 수 있으며, 이들은 또한 용어 "물질"에 포함된다. 또한, 식물 또는 동물 추출물 등과 같은 다양한 천연 공급원이 선별을 위한 화합물을 제공할 수 있다. 항상 명시적으로 언급되지는 않지만, 상기 물질은 본 발명의 선별에 의해 확인되는 물질과 동일하거나 다른 생물학적 활성을 갖고 단독으로 또는 다른 물질과 함께 사용된다는 것을 이해해야 한다.
시험관에서 선별 방법을 수행하기 위해, 분리된 세포군을 상기와 같이 수득할 수 있다. 물질이 상기한 저분자와 같은 DNA 또는 RNA 이외의 조성물인 경우, 물질은 세포에 직접 첨가되거나 첨가를 위해 배양 배지에 첨가될 수 있다. 본 기술분야의 숙련자에게 명백하듯이, 경험적으로 결정될 수 있는 "유효량"이 첨가되어야 한다. 물질이 폴리뉴클레오티드인 경우, 이는 유전자총(gene gun) 또는 전기천공법(electroporation)을 이용하여 직접 첨가될 수 있다.
대안적으로, 상기 물질은 유전자 전달체 또는 상기한 다른 방법을 이용하여 세포에 삽입될 수 있다. 약물 또는 다른 물질의 알려진 활성을 확인하기 위해 양성 및 음성 대조군이 분석될 수 있다.
키트
본 개시는 또한 본 발명의 하나 이상의 세포, 세포군 또는 조성물 및 사용 설명서를 포함하는, 본원에 개시된 방법에서의 사용을 위한 키트를 제공한다. 선택적으로, 상기 키트는 방법에서 사용하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 본 개시는 세포 또는 세포군의 분리 또는 정제를 위한 설명서와 사용 설명서 및 본원에 개시된 적절한 조직 공급원으로부터 세포 또는 세포군을 분리 또는 정제하기 위한 시약을 포함하는, 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 다음의 실시예에서 더 설명되고 예시되며, 이 실시예는 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
망막 형태
본 발명의 대상이 되는 신경 망막의 형태는, 일반적으로 양도되고 공동 계류중인 이의 전체 개시가 본원에 참고로 포함된 2011년 6월 14일 출원된 미국 특허 출원 제 13/160,002호에서 더 설명된다.
세포 분리
약간의 변경과 함께, 다음의 참조문헌에 개시된 바와 같이, 태아 망막으로부터 인간 망막 전구세포(hRPC)를 분리하였다: Klassen, H.J. et al., Multipotent Retinal Progenitors Express Developmental Markers, Differentiate into Retinal Neurons, and Preserve Light-Mediated Behavior, Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 2004, 45 ( 11), pages 4167-4173; Klassen, H. et al., Isolation of Retinal Progenitor Cells from Post-Mortem Human Tissue and Comparison with Autologous Brain Progenitors, J. Neuroscience Research, 2004, 77(3), pages 334-343; Klassen, H. et al., Progenitor Cells from the Porcine Neural Retina Express Photoreceptor Markers after Transplantation to the Subretinal Space of Allorecipients; Stem Cells, 2007, 25(5); pages 1222-1230.
간단히, 인간 태아 안구(임신 14-18 주령)로부터 전체 신경망막을 절개하고, 0.1% 콜라겐분해효소 I(Sigma사)에서 4 사이클(총 1.5 시간의 발효) 동안 분리한 후, 수정 Ultraculture 배지(10 ng/ml rhEGF, 20 ng/ml rhbFGF, Pen/strep, 니스타틴 및 L-글루타민)에 도말하거나 냉동하였다.
유세포 분석
인간 망막 전구세포를 다음과 같은 일반적인 프로토콜에 따라 처리한다:
1. 고정: 30 분 동안 4℃에서 모든 항원(세포 주기 분석 및 PCNA 제외)에 대해 차가운 완충액 내의 4% 파라포름알데히드 (pH 7.4) 사용. 30 분 동안 4℃에서 세포 주기 분석과 PCNA를 위해 100% 에탄올 사용.
2. 세척: PBS를 첨가하고 1500 rpm에서 5 분 동안 교반
3. 투과화 및 차단: 차단 완충액(0.1% 트리톤-X, 10% 염소 혈청 용액, PBS 내 5% BSA에서 제조)에 펠렛을 재현탁하고 상온에서 30 분 동안 배양
4. 세척
5. X(첨가될 항체의 수) 100 fll의 염색 완충액(10% 염소 혈청 용액, PBS 내 5% BSA에서 제조)에서 펠렛을 재현탁. 5 mL 튜브에 100111 분주
6. 아래의 표 1에 따른 1차 항체 첨가. 모든 항체 용액은 염색 완충액에서 제조됨. 상온에서 45 분 동안 배양
7. 세척
8. 표 1에 따른 100 fll의 2차 항체(염색 완충액 내) 첨가. 상온에서 30 분 동안 배양
9. 세척
10. 500 fll의 PBS에서 재현탁
11. 게이트 내에서 적어도 10,000 개의 세포에 대해 4 시간 동안 분석(예컨대, BD LSR II 사용)
프로피디움 요오드화물 염색(세포 주기 분석용)
1. 세포 펠릿을 20 flg/mL의 PI 및 l00 fIg/mL의 DNase-free RNase A를 함유한 1 mL PCB에 재현탁
2. 세척
3. 500 f..tl의 PBS에 재현탁하고 분석
DAPI 염색(생존율 분석용)
1. 고정 전에, 세포를 PBS 내의 200 ng/ml DAPI에 재현탁
2. 상온에서 5 분 동안 배양
3. 세척
4. 30 분 동안 차가운 4% PFA에서 고정
5. 세척
6. 500 f..tl의 PBS에 재현탁하고 분석
항원 숙주 회사 참조번호 희석, 1:
Eye field




 Nrl ms Santa Cruz sc-166087 50
SSEA4 ms Chemicon MAB4304 100
Klf4 rbt Santa Cruz sc-20691 50
Sox2 rbt Santa Cruz sc-20088 50
Nestin ms BD Bio. 611658 100
Pax6 ms 융합세포 bk 100
Otx2 rbt Chemicon AB9566 100
증식

 CyclinD1 rbt Neomarkers RBOlOPlabx 100
PCNA ms Dako M0879 100
Ki67 rbt Chemicon AB9260 100
광수용체




 Nr2e3(PNR) rbt Chemicon AB9469 200
Recoverin rbt Chemicon AB5585 200
Rhodopsin ms Chemicon MABN15 100
Opsin Blue rbt Chemicon AB5407 100
Opsin Red/Gr rbt Chemicon AB5405 100
S-opsin rbt Abeam ab81017 100
신경/신경교

 NF200 rbt Chemicon AB1982 100
GFAP ms Chemicon MAB360 100
B3tubulin ms Sigma T8669 100
표면 마커





 CD15/SSEA1 ms BD Bio. 5590945 100
CD24 PE MACS 100
CD73 PE MACS 50
CD133 PE MACS 50
PSA-NCAM PE MACS 50
CD38 PE MACS 50
SSEA4 ms Chemicon MAB4304 100
동형 대조군

 Iso IgG rbt Invitrogen
Iso IgG1 ms Invitrogen
Iso IgG2 ms Invitrogen
통계 방법
양성 세포의 비율을 항체에 대한 동형 대조군(isotype control)을 근거로 결정된다. 실험은 3 회 반복되며 표준 편차를 갖는 양성 세포의 평균 비율이 각각의 마커에 대해 계산된다. 또한, 고발현/저발현 세포 비율이 적용되는 경우 계산된다.
결과
유세포 분석
유세포 분석 (3 회, 각각 10,000 개의 세포) 결과를 다음의 표 2에 나타내었다. 표에서의 수는 적절한 동형 대조군에 대한 비교를 근거로 약품 내의 양성(발현) 세포의 비율을 나타낸다. 동위원소의 98% 발현량을 한계 레벨로 선택하였다.
Figure pct00001
도 1, 도 2 및 도 3은 상기 결과의 평균 및 표준 편차(M+/-SEM)를 나타낸 막대 그래프이다. 약품 내의 세포는 조사된 스터니스(sternness) 마커를 대부분 발현하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 모세포군의 절반만이 Pax6, Crx 및 Nrl에 양성이며, 이는 이 세포군이 실제로 여러 개의 부분 개체군으로 구성되어 있음을 시사한다. 마커는 9에서 14로 증가하는 계대배양 두 개의 별도의 태아 기증물에 걸쳐 안정적이다.
면역세포화학 분석
인간 망막 전구세포를 다음과 같은 일반적인 프로토콜에 따라 처리한다:
1. 도말: 인간 망막 전구세포 배지(200 fll/웰)에서 4,000 세포/㎠의 밀도로 피브로넥틴으로 갓 코팅된 16-웰 Nunc 슬라이드 상에 세포를 도말한다.
2. 배양: 37℃, 5% CO2, 3% O2, 100% 습도에서 6 시간
3. 세척: 배지를 흡입하고 PBS를 첨가
4. 고정: 상온에서 4 분 동안 차가운 완충액 내의 4% PFA
5. 세척
6. 투과화 및 차단: 차단 완충액(0.1% 트리톤-X, 10% 염소 혈청 용액, PBS 내 5% BSA에서 제조)에서 1 시간 동안 상온에서 배양
7. 세척
8. 표 3에 따른 1차 항체 첨가(50 fll/웰). 모든 항체 용액은 염색 완충액에서 제조됨(10% 염소 혈청 용액, PBS 내 5% BSA에서 제조). 4℃의 가습실에서 밤새 배양
9. 각각 5 분 동안 2 회 세척
10. 표 3에 따른 50 fll의 2차 항체(염색 완충액 내) 첨가. 상온에서 1 시간 동안 배양
11. 각각 5 분 동안 3 회 세척
12. DAPI를 포함하는 봉입제에서 봉입
13. 밤새 건조
14. 영상화 및 분석
항원 숙주 회사 참조번호 희석, 1:
Eye field







 Nrl ms Santa Cruz sc-166087 50
SSEA4 ms Chemicon MAB4304 200
Klf4 rbt Santa Cruz sc-20691 50
Sox2 rbt Santa Cruz sc-20088 50
Nestin ms BD Bio. 611658 200
Pax6 ms 융합세포 200
Otx2 rbt Chemicon AB9566 200
ChxlO Gt Santa Cruz sc-21692 200
CD15/SSEA ms BD Bio. 559045 200
증식

 CyclinDl rbt Neomarkers RBOlOPlab 200
PCNA ms Dako M0879 200
Ki67 rbt Chemicon AB9260 200
광수용체




 Nr2e3(PNR) rbt Chemicon AB9469 200
Recoverin rbt Chemicon AB5585 200
Rhodopsin ms Chemicon MABN15 100
Opsin Blue rbt Chemicon AB5407 200
Opsin rbt Chemicon AB5405 200
S-opsin rbt ab81017 200
신경/신경교


 NF200 rbt Chemicon AB1982 200
GFAP ms Chemicon MAB360 200
Vimentin ms Sigma T8660 200
B3tubulin ms Sigma V22558 200
동형 대조군

 Iso IgG rbt Invitrogen
Iso IgG1 ms Invitrogen
Iso IgG2 ms Invitrogen
결과
면역세포화학 분석
면역세포화학 분석(5 회, 각각 100 개 이상의 세포) 결과를 도 4, 도 5 및 도 6에 나타내었다. 현미경/카메라 상의 형광 및 노출 설정을 적절한 아이소타입 대조군을 이용하여 조절하였다. 도 4, 도 5 및 도 6은 상기 결과의 평균 및 표준 편차(M+/-SEM)를 나타낸 막대 그래프이다. 면역세포화학 분석으로부터의 결과는 유세포 분석을 이용하여 확립된 특성을 지지하고 추가한다.
본 발명의 인간 망막 전구세포는 망막과 안구 발병뿐만 아니라 유리한지 불리한지 그러한 발병에 영향을 주는 인자를 연구하는데 사용될 수 있다. 이러한 인간 망막 전구세포(hRPC)는 또한 눈의 기능장애로부터 고통 받는 망막에 이식하여 임상 시험에 사용될 수 있다. 이들 세포는 바람직하게 영양실조로 인한 그리고 퇴화된 안구 조직, 특히 기능이상 망막에서 다시 거주되거나 이를 구제하는데 사용될 수 있다. 망막 기능장애는, 질환, 기계적 또는 화학적 손상으로 인한 것이건 간에 정상적인 망막 기능의 결핍 또는 상실 또는 수용자의 망막에 관련된 퇴행성 또는 병리학적 과정을 포함한다. 인간 망막 전구세포는 본 기술분야의 공지된 기술에 따라 망막 부위, 망막하 공간, 유리체강, 또는 시신경에 주입되거나 또는 배치될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 인간 망막 전구세포는 광수용체 세포 기능의 결핍 또는 감소를 보상하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 망막 줄기세포군 및 방법에 의해 치료될 수 있는 망막 기능장애의 예는, 이에 제한되지 않으나, 광수용체 변성(예컨대, 색소성 망막염, 추상체 이영양증(cone dystrophies), 추체-간체 및/또는 간체-추체 이영양증, 및 황반 변성에서 발생); 망막 박리 및 막막 외상; 레이저나 햇빛에 의한 광망막 병변, 황반 원공(macular hole), 황반 부종, 야맹증 및 색맹; 당뇨병 또는혈관 폐색에 의해 발생하는 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy); 조산으로 인한 망막병증; 예를 들어, CMV 망막염 및 톡소플라즈마증(toxoplasmosis)과 같은 감염 질환; 포도막염과 같은 염증성 질환; 망막아종(retinoblastoma) 및 안구 흑색종(ocular melanoma)과 같은 종양; 및 녹내장, 외상 시신경증(retinal optic neuropathy), 분리, 및 방사선 시신경증 및 망막증을 포함하는 안구 신경병증에서 발생한 안쪽 망막 신경의 대체를 포함한다.
본원에 개시된 치료는 단독 요법 또는 다른 치료적 요법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 치료는 신경망막 유래 망막 줄기세포의 광수용체 세포 또는 다른 망막 세포 유형(예컨대, 양극 세포, 신경절 세포, 수평 세포, 아마크린(amacrine) 세포, 뮐러(Mueller) 세포)으로의 분화를 촉진하는 물질의 투여를 포함할 수 있다.
상기로부터, 본 발명의 특정 실시형태가 예시의 목적으로 본원에서 설명되었지만, 첨부한 청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본원에서 언급된 모든 공개, 특허, 및 특허 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

Claims (28)

  1. 인간 망막 전구세포의 실질적으로 균일한 정제된 세포군에 있어서, 상기 인간 망막 전구세포는 양성 식별 표면 마커인 SSEA4, CD73, PTK7 및 PSA-NCAM, CD24를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 세포군.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 망막 전구세포는 양성 식별 마커로서 리커버린(recoverin), Sox2 및 Pax6을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 세포군.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 망막 전구세포는 다음의 음성 신경 줄기세포 표면 마커인 CD15 및 CD133이 없는 것을 특징으로 하는 정제된 세포군.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 망막 전구세포는 음성 신경교 전구세포 표면 마커인 A2B5 및 CD38이 없는 것을 특징으로 하는 정제된 세포군.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 대략 50%의 망막 전구세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 세포군.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 대략 80%의 망막 전구세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 세포군.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 세포군 및 담체를 포함하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 담체는 약학적으로 허용 가능한 담체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 혼합 세포군에서 인간 망막 전구세포를 식별하는 방법에 있어서, 상기 방법은 양성 표면 마커인 SSEA4, CD73, PTK7 및 PSA-NCAM을 포함하는 세포에 대해 상기 혼합 세포군을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 혼합 세포군에서 인간 망막 전구세포를 분리 또는 정제하여 분리된 또는 정제된 인간 망막 전구세포를 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    음성 신경 줄기세포 표면 마커인 CD15 및 CD133이 없는 세포군을 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    음성 신경교 전구세포 표면 마커인 A2B5 및 CD38이 없는 세포군을 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합 세포군은 적어도 하나의 인간 조직 공급원으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 14 항에 있어서,
    상기 조직 공급원은 인간 망막 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조직 공급원은 인간 골수, 또는 배아의 다분화능 세포 또는 유도만능 줄기세포 또는 제대혈 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선별 단계는 유세포 분석(flow cytometry)을 이용하는 세포 분류 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선별 단계는 형광 활성화 세포 분류 및 양성 세포 표면 마커를 인식하고 이에 결합하는 항체를 이용하는 세포 분류 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 10 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되거나 수득될 수 있는 정제된 또는 분리된 세포.
  19. 제 10 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 인간 망막 전구세포의 실질적으로 정제된 세포군.
  20. 제 18 항의 정제된 또는 분리된 세포 또는 제 19 항의 세포군 및 담체를 포함하는 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 담체는 약학적으로 허용 가능한 담체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 정제된 인간 망막 전구세포군을 제조하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    양성 식별 표면 마커인 SSEA4, CD73, PTK7 및 PSA-NCAM을 이용하여 인간 망막 전구세포를 포함하는 인간 조직 공급원으로부터 분리된 세포 샘플로부터 수득한 세포를 분류하는 단계; 및
    상기 분리된 인간 망막 전구세포를 수집하여 정제된 인간 망막 전구세포군을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 세포를 분류하는 단계 이전에 상기 분리된 세포 샘플에서 불순물 및 오염물질을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 치료를 필요로 하는 환자의 광수용체 세포를 대체하거나 수리하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 환자에게 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포군 또는 제 7 항, 제 8 항, 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 조성물의 유효량을 투여하여 상기 환자의 광수용체 세포를 대체하거나 수리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 치료를 필요로 하는 환자의 색소성 망막염(retinitis pigmentosa) 증상을 치료하거나 완화하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 환자에게 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포군 또는 제 7 항, 제 8 항, 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 조성물의 유효량을 투여하여 상기 환자의 색소성 망막염 증상을 치료하거나 완화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 치료를 필요로 하는 환자의 연령관련 황반 변성(age-related macular degeneration) 증상을 치료하거나 완화하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 환자에게 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포군 또는 제 7 항, 제 8 항, 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 조성물의 유효량을 투여하여 상기 환자의 연령관련 황반 변성 증상을 치료하거나 완화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포군 또는 제 7 항, 제 8 항, 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  28. 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 세포군의 정제를 위한 설명서 또는 제 7 항, 제 8 항, 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 조성물과 사용 설명서 및 선택적으로 적절한 조직 공급원으로부터 세포 또는 세포군을 분리 또는 정제하기 위한 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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