JP2019013243A - ヒト網膜前駆細胞の表現型プロファイル - Google Patents
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Abstract
Description
外傷、年齢、または疾患のいずれかの結果としてのヒト網膜の変性は、永久的な視力喪失を結果として生じ得、世界中の何百万人もの人々がこれに冒されている可能性がある。変性状態は、例えば、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、および糖尿病性網膜症を含む。これらの状態は、網膜の、光を感知する光受容細胞の進行性の死を特徴とし、西欧諸国における不治の盲目の主要な原因である。ヒト網膜の内因性再生能力は極度に限定されたものであるため、光受容細胞の喪失を患う人々にとっての唯一の有望な処置選択肢は、細胞の置換である。
[本発明1001]
同定可能な陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、およびPSA-NCAM、CD24を有するヒト網膜前駆細胞の、実質的に均一な、精製された集団。
[本発明1002]
網膜前駆細胞が、リカバリン、Sox2、およびPax6を、同定可能な陽性マーカーとして含む、本発明1001の精製された細胞集団。
[本発明1003]
網膜前駆細胞が、陰性神経幹細胞表面マーカーであるCD15およびCD133を欠いている、本発明1001または1002の精製された細胞集団。
[本発明1004]
網膜前駆細胞が、陰性グリア前駆体表面マーカーであるA2B5およびCD38を欠いている、本発明1001〜1003のいずれかの精製された細胞集団。
[本発明1005]
少なくとも約50%の網膜前駆細胞を含む、前記本発明のいずれかの精製された細胞集団。
[本発明1006]
少なくとも約80%の網膜前駆細胞を含む、本発明1001〜1004のいずれかの精製された細胞集団。
[本発明1007]
前記本発明のいずれかの集団および担体を含む、組成物。
[本発明1008]
担体が薬学的に許容される担体である、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
細胞の混合集団においてヒト網膜前駆細胞を同定する方法であって、陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、およびPSA-NCAMを有する細胞について該混合細胞集団をスクリーニングする段階を含む、前記方法。
[本発明1010]
単離または精製されたヒト網膜前駆細胞を提供するために、混合集団からヒト網膜前駆細胞を単離または精製する段階をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
陰性神経幹細胞表面マーカーであるCD15およびCD133の欠如について細胞の集団をスクリーニングする段階をさらに含む、本発明1009または1010の方法。
[本発明1012]
陰性グリア前駆体表面マーカーであるA2B5およびCD38の欠如について細胞の集団をスクリーニングする段階をさらに含む、本発明1009〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
混合細胞集団が、少なくとも1種のヒト組織源から取得される、本発明1009〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
組織源がヒト網膜組織である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
組織源が、ヒト骨髄、または、胚性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞の多能性細胞、または臍帯血細胞である、本発明1009〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
スクリーニングする段階が、フローサイトメトリーを用いる細胞選別を含む、本発明1009〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
スクリーニングする段階が、蛍光活性化細胞選別と陽性細胞表面マーカーを認識して結合する抗体とを用いる細胞選別を含む、本発明1009〜1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
本発明1010〜1017のいずれかの方法により調製されるかまたは取得可能な、精製された細胞。
[本発明1019]
本発明1010〜1017のいずれかの方法により調製される、ヒト網膜前駆細胞の実質的に精製された集団。
[本発明1020]
本発明1018の精製もしくは単離された細胞または本発明1019の集団と担体とを含む、組成物。
[本発明1021]
担体が薬学的に許容される担体である、本発明1020の組成物。
[本発明1022]
精製されたヒト網膜前駆細胞集団を調製する方法であって、同定可能な陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、およびPSA-NCAMを用いて、ヒト網膜前駆細胞を含有するヒト組織源由来の単離された細胞試料から取得されたヒト網膜前駆細胞を選別する段階、ならびに
該分離されたヒト網膜前駆細胞を回収して、精製されたヒト網膜前駆細胞集団を調製する段階
を含む、前記方法。
[本発明1023]
細胞を選別する段階の前に、単離された細胞試料から不純物および混入物を除去する段階をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
そのような処置を必要とする患者において光受容細胞を置換または修復するための方法であって、該患者に、有効量の1つまたは複数の本発明1001〜1006のいずれかの集団または本発明1007、1008、1020、もしくは1021の組成物を投与し、それにより該患者において光受容細胞を置換または修復する段階を含む、前記方法。
[本発明1025]
網膜色素変性症の症候の処置を必要とする患者において網膜色素変性症の症候を処置または緩和するための方法であって、該患者に、有効量の1つまたは複数の本発明1001〜1006のいずれかの集団または本発明1007、1008、1020、もしくは1021の組成物を投与し、それにより該患者において網膜色素変性症の症候を処置または緩和する段階を含む、前記方法。
[本発明1026]
加齢性黄斑変性症の症候の処置を必要とする患者において加齢性黄斑変性症の症候を処置または緩和する方法であって、該患者に、有効量の1つまたは複数の本発明1001〜1006のいずれかの集団の細胞集団または本発明1007、1008、1020、もしくは1021の組成物を投与し、それにより該患者において加齢性黄斑変性症の症候を処置または緩和する段階を含む、方法。
[本発明1027]
1つまたは複数の本発明1001〜1006のいずれかの集団または本発明1007、1008、1020、または1021の組成物と、使用説明書とを含む、本発明1024〜1026のいずれかの方法における使用のためのキット。
[本発明1028]
本発明1001〜1005のいずれかの集団または本発明1007、1008、1020、または1021の組成物の単離のための説明書と、使用説明書と、任意で、適当な組織源から細胞または細胞の集団を単離または精製するための試薬とを含む、本発明1024〜1026のいずれかの方法における使用のためのキット。
別の方法で定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、装置、および材料が次に記載される。本明細書において引用されるすべての技術刊行物および特許刊行物は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明によるそのような開示に先立つ権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
本発明は、細胞表面マーカーであるSSEA4+、CD73+、PTK7+、およびPSA-NCAM+の各々の存在を特徴とする網膜前駆細胞の、精製または単離された細胞および/または実質的に均一な集団に関する。
本発明はまた、上記のヒト網膜前駆細胞を、罹患または変性したヒト網膜の網膜下腔に移植する段階を含む、この処置を必要とする患者において光受容細胞を置換または防御するための方法も提供する。1つの局面において、当該細胞は、処置を必要とする患者において網膜色素変性症の症候を処置または緩和することができる。別の局面において、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、2012年1月23日に出願された米国特許出願第13/356,073号に記載されたものなどの適切な生体適合性足場に、当該細胞を播種することができ、この処置を必要とする患者において加齢性黄斑変性症の症候を処置または緩和するためにこの細胞-足場の組み合わせ製品を移植することができる。これらの処置のすべてについて、網膜前駆細胞は、患者にとって同種異系である。さらなる局面において、本発明の細胞は、他の処置との組み合わせで投与することができる。
本発明は、網膜前駆細胞の分化を調節する種々の作用物質をスクリーニングするための方法を提供する。これはまた、網膜前駆細胞から培養中に生成される成熟光受容体を支持および/またはレスキューする治療用作用物質を発見するためにも使用することができる。本発明の目的に関して、「作用物質」とは、生物学的または化学的化合物、例えば、単純もしくは複雑な有機もしくは無機の分子、ペプチド、タンパク質(例えば抗体)、ポリヌクレオチド(例えばアンチセンス)、またはリボザイムを含むが、これらに限定されないことが意図される。数多くのいろいろな化合物、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどのポリマー、ならびに種々のコア構造に基づく合成有機化合物を合成することができ、これらもまた、「作用物質」という用語に含まれる。加えて、植物または動物の抽出物などのような種々の天然供給源が、スクリーニングのための化合物を提供することができる。常に明確に述べられるわけではないが、作用物質は、単独で、または本発明のスクリーニングにより同定された作用物質と同じかまたは異なる生物学的活性を有する別の作用物質との組み合わせで使用されることが、理解されるべきである。
本開示はまた、1つまたは複数の本発明の集団、細胞、または組成物、および使用説明書を含有する、本明細書において記載される方法における使用のためのキットも提供する。任意で、キットは、方法における使用のための試薬を含むことができる。
本発明の主題である神経網膜の形態は、その完全な開示が参照により本明細書に組み入れられる、2011年6月14日に出願された同一出願人による同時係属中の米国特許出願第13/160,002号においてさらに記載されている。
hRPC(ヒト網膜前駆細胞)を、小さな改変を伴い、以下の参照文献において記載されているように、胎児網膜から単離した:Klassen, H.J. et al., Multipotent Retinal Progenitors Express Developmental Markers, Differentiate into Retinal Neurons, and Preserve Light-Mediated Behavior, Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 2004,45(11), 4167-4173ページ;Klassen, H. et al., Isolation of Retinal Progenitor Cells from Post-Mortem Human Tissue and Comparison with Autologous Brain Progenitors, J. Neuroscience Research, 2004, 77(3), 334-343ページ;Klassen, H. et al., Progenitor Cells from the Porcine Neural Retina Express Photoreceptor Markers after Transplantation to the Subretinal Space of Allorecipients; Stem Cells, 2007, 25(5); 1222-1230ページ。
ヒト網膜前駆細胞を、以下の一般的なプロトコルに従って加工処理する:
1.固定:(細胞周期解析およびPCNA以外の)すべての抗原について、冷たい新鮮な緩衝4%パラホルムアルデヒド、pH 7.4を30分間、4℃で使用する。細胞周期解析およびPCNAについては、100%エタノールを30分間、4℃で使用する。
2.洗浄:PBSを添加し、1500 rpmで5分間回転させる。
3.透過処理およびブロッキング:沈殿をブロッキング緩衝液(PBS中5% BSAにおいて調製した0.1% Triton-X、10%ヤギ血清溶液)に再懸濁し、30分間、室温でインキュベーションする。
4.洗浄
5.沈殿をX(添加される抗体の数)の染色緩衝液(PBS中5% BSAにおいて調製した10%ヤギ血清溶液)100fllに再懸濁する。100111ずつ5mlチューブに等分する。
6.下記の表1に従って一次抗体を添加する。すべての抗体溶液を、染色緩衝液中で調製した。45分間、室温でインキュベーションする。
7.洗浄
8.表1に従って100fllの二次抗体(染色緩衝液中)を添加する。30分間、室温でインキュベーションする。
9.洗浄
10.500fllのPBSに再懸濁する。
11.4時間以内に(例えば、BD LSR IIを用いて)ゲート内の少なくとも10,000イベントを解析する。
1.細胞沈殿を、20flg/mLのPIおよび100flg/mLのDNアーゼ非含有RNアーゼAを含有する1mL PBSに懸濁する。
2.洗浄
3.500f..tlのPBSに再懸濁して解析する。
1.固定前に、細胞をPBS中の200ng/ml DAPIに再懸濁する。
2.5分間、室温でインキュベーションする。
3.洗浄
4.4%の冷たいPFA中で30分間、固定する。
5.洗浄
6.500f..llのPBSに再懸濁して解析する。
陽性細胞の比を、抗体についてのアイソタイプ対照に基づいて決定する。実験を3回繰り返し、各マーカーについて陽性細胞の平均パーセンテージを標準偏差と共に計算する。また、高発現/低発現細胞の比を、適用可能な場合は計算する。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー解析の結果(3ラン、各々10,000イベント)を、以下の表2に示す。表中の数字は、適切なアイソタイプ対照との比較に基づく、製剤内の陽性(発現)細胞の比を示す。アイソタイプの発現の98%のレベルを、閾値レベルとして選択した。
ヒト網膜前駆細胞を、以下の一般的なプロトコルに従って加工処理する:
1.プレーティング:細胞を、新しくフィブロネクチンでコーティングされた16ウェルNuncスライド上に4k細胞/sq.em.の密度で、ヒト網膜前駆細胞培地(200fll/ウェル)においてプレーティングする。
2.インキュベーション:37℃、5% CO2、3% O2、100%湿度で6時間。
3.洗浄:培地を吸引し、PBSを添加する。
4.固定:冷たい緩衝4% PFAで10分間、室温。
5.洗浄
6.透過処理およびブロッキング:ブロッキング緩衝液(PBS中5% BSAにおいて調製した0.1% Triton-X、10%ヤギ血清溶液)中で1時間、室温でインキュベーションする。
7.洗浄
8.表3に従って一次抗体を添加する(50fll/ウェル)。すべての抗体溶液を、染色緩衝液(PBS中5% BSAにおいて調製した10%ヤギ血清溶液)中で調製する。一晩4℃で、加湿チャンバーにおいてインキュベーションする。
9.洗浄2回、各々5分。
10.表3に従って50fllの二次抗体(染色緩衝液中)を添加する。1時間、室温でインキュベーションする。
11.洗浄3回、各々5分。
12.DAPIを含むマウント培地中でマウントする。
13.一晩乾燥する。
14.画像化して解析する。
免疫細胞化学
免疫細胞化学解析の結果(5ラン、各々>100イベント)を、図4、図5、および図6に示す。顕微鏡/カメラについての蛍光および露光の設定を、適切なアイソタイプ対照を用いて調整した。図4、図5、および図6は、上記の結果の平均および標準偏差(M+/−SEM)を例証する棒グラフである。免疫細胞化学解析由来の結果は、フローサイトメトリーを用いて確立されたプロファイルを支持しかつ助長する。
Claims (28)
- 同定可能な陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、およびPSA-NCAM、CD24を有するヒト網膜前駆細胞の、実質的に均一な、精製された集団。
- 網膜前駆細胞が、リカバリン、Sox2、およびPax6を、同定可能な陽性マーカーとして含む、請求項1に記載の精製された細胞集団。
- 網膜前駆細胞が、陰性神経幹細胞表面マーカーであるCD15およびCD133を欠いている、請求項1または2に記載の精製された細胞集団。
- 網膜前駆細胞が、陰性グリア前駆体表面マーカーであるA2B5およびCD38を欠いている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の精製された細胞集団。
- 少なくとも約50%の網膜前駆細胞を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の精製された細胞集団。
- 少なくとも約80%の網膜前駆細胞を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の精製された細胞集団。
- 前記請求項のいずれか一項に記載の集団および担体を含む、組成物。
- 担体が薬学的に許容される担体である、請求項7に記載の組成物。
- 細胞の混合集団においてヒト網膜前駆細胞を同定する方法であって、陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、およびPSA-NCAMを有する細胞について該混合細胞集団をスクリーニングする段階を含む、前記方法。
- 単離または精製されたヒト網膜前駆細胞を提供するために、混合集団からヒト網膜前駆細胞を単離または精製する段階をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 陰性神経幹細胞表面マーカーであるCD15およびCD133の欠如について細胞の集団をスクリーニングする段階をさらに含む、請求項9または10に記載の方法。
- 陰性グリア前駆体表面マーカーであるA2B5およびCD38の欠如について細胞の集団をスクリーニングする段階をさらに含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 混合細胞集団が、少なくとも1種のヒト組織源から取得される、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 組織源がヒト網膜組織である、請求項13に記載の方法。
- 組織源が、ヒト骨髄、または、胚性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞の多能性細胞、または臍帯血細胞である、請求項9〜14のいずれか一項に記載の方法。
- スクリーニングする段階が、フローサイトメトリーを用いる細胞選別を含む、請求項9〜15のいずれか一項に記載の方法。
- スクリーニングする段階が、蛍光活性化細胞選別と陽性細胞表面マーカーを認識して結合する抗体とを用いる細胞選別を含む、請求項9〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項10〜17のいずれか一項に記載の方法により調製されるかまたは取得可能な、精製された細胞。
- 請求項10〜17のいずれか一項に記載の方法により調製される、ヒト網膜前駆細胞の実質的に精製された集団。
- 請求項18に記載の精製もしくは単離された細胞または請求項19に記載の集団と担体とを含む、組成物。
- 担体が薬学的に許容される担体である、請求項20に記載の組成物。
- 精製されたヒト網膜前駆細胞集団を調製する方法であって、同定可能な陽性表面マーカーであるSSEA4、CD73、PTK7、およびPSA-NCAMを用いて、ヒト網膜前駆細胞を含有するヒト組織源由来の単離された細胞試料から取得されたヒト網膜前駆細胞を選別する段階、ならびに
該分離されたヒト網膜前駆細胞を回収して、精製されたヒト網膜前駆細胞集団を調製する段階
を含む、前記方法。 - 細胞を選別する段階の前に、単離された細胞試料から不純物および混入物を除去する段階をさらに含む、請求項22に記載の方法。
- そのような処置を必要とする患者において光受容細胞を置換または修復するための方法であって、該患者に、有効量の1つまたは複数の請求項1〜6のいずれか一項に記載の集団または請求項7、8、20、もしくは21に記載の組成物を投与し、それにより該患者において光受容細胞を置換または修復する段階を含む、前記方法。
- 網膜色素変性症の症候の処置を必要とする患者において網膜色素変性症の症候を処置または緩和するための方法であって、該患者に、有効量の1つまたは複数の請求項1〜6のいずれか一項に記載の集団または請求項7、8、20、もしくは21に記載の組成物を投与し、それにより該患者において網膜色素変性症の症候を処置または緩和する段階を含む、前記方法。
- 加齢性黄斑変性症の症候の処置を必要とする患者において加齢性黄斑変性症の症候を処置または緩和する方法であって、該患者に、有効量の1つまたは複数の請求項1〜6のいずれか一項に記載の集団の細胞集団または請求項7、8、20、もしくは21に記載の組成物を投与し、それにより該患者において加齢性黄斑変性症の症候を処置または緩和する段階を含む、方法。
- 1つまたは複数の請求項1〜6のいずれか一項に記載の集団または請求項7、8、20、または21に記載の組成物と、使用説明書とを含む、請求項24〜26のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の集団または請求項7、8、20、または21に記載の組成物の単離のための説明書と、使用説明書と、任意で、適当な組織源から細胞または細胞の集団を単離または精製するための試薬とを含む、請求項24〜26のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
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