CN107206028A - 使用祖细胞治疗眼部病症 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了使用祖细胞诸如产后衍生的细胞和来自所述细胞的条件培养基治疗眼科疾病、促进功能性神经元突触形成并加快神经元增生的方法和组合物。还公开了由促进突触形成和神经元生长的细胞分泌的营养因子和其他试剂。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月5日提交的美国临时申请序列号62/088,429、2015年2月27日提交的美国临时申请序列号62/126,370和2015年9月18日提交的美国临时申请序列号62/220,873的权益,各申请的全部内容以引用方式全文并入本文。
技术领域
本发明涉及眼科疾病和障碍特别是诸如视网膜退行性病症的眼部病症的基于细胞或再生疗法的领域。本发明提供用于使用祖细胞诸如脐带组织衍生的细胞、胎盘组织衍生的细胞和由这些细胞制备的条件培养基再生或修复眼部细胞和组织的方法和组合物。
背景技术
眼部作为人体复杂又敏感的器官,可遭受许多疾病和其他有害的病症,从而影响其正常运作的能力。许多这些病症都与特定的眼部细胞和由这些细胞组成的组织的损伤或变性有关。例如,在全世界范围内视神经和视网膜的疾病和退行性病症是导致失明的主要原因。角膜、晶状体和相关的眼部组织的损伤和变性代表了世界范围内视力丧失的另一重要原因。
视网膜包含七层交替细胞和突起,该细胞和突起能够将光信号转换成神经信号。视网膜感光细胞和邻近的视网膜色素上皮细胞(RPE)形成一个功能单元,其在许多疾病中由于基因突变或环境状况(包括年龄)变得失衡。这导致感光细胞因细胞凋亡或继发性变性而丢失,进而导致了进行性视力减退以及在一些情况下导致失明(相关综述,请参见例如Lund,R.D.等人,Progress in Retinal and Eye Research,2001,20:415-449)。属于这种模式的两类眼部疾病为年龄相关性黄斑变性(AMD)和色素性视网膜炎(RP)。
AMD是导致美国50岁及以上人群视力丧失的最常见的原因,并且其发病率随年龄增加。AMD的原发性疾病可能是由于RPE功能障碍和布鲁赫氏膜的改变,其特征在于,除了别的以外,脂质沉积、蛋白质交联和对营养物质渗透性降低(参见Lund等人,2001,出处同上)。许多因素可导致黄斑变性,包括基因构成、年龄、营养、吸烟和暴露于阳光。非渗出性或“干性”形式的AMD占AMD病例的90%,其余10%为渗出性新生血管形式(“湿性”AMD)。在干性AMD患者中,视网膜色素上皮细胞(RPE)逐渐消失,导致外接区域的萎缩。由于继RPE消失之后感光细胞丢失,受影响的视网膜区域只有很少的或没有视觉功能。
AMD的目前疗法涉及例如激光治疗和药物干预的规程。激光束通过传递热能破坏黄斑下的渗漏血管,减缓视力丧失的速度。激光治疗的一个缺点是激光束传递的高热能也会破坏邻近的健康组织。Neuroscience第4版(Purves,D等人,2008)声明:“目前对于干性AMD尚无治疗方法。”
在人体中进行RPE移植并未成功。例如,2003年Zarbin,M宣称:“人体布鲁赫氏膜,特别是在黄斑区,随着正常的老化将经历各种变化(例如厚度增加、ECM和脂质沉积、蛋白质交联、晚期糖基化终产物的非酶促形成)。这些改变和由AMD引起的另外的改变会降低ECM配体(例如层粘连蛋白、纤连蛋白和IV型胶原蛋白)的生物利用率并且导致AMD患者眼睛中RPE细胞的存活率极低。因此,尽管人体RPE细胞表达了附着到这些ECM分子的所需的整联蛋白,但老化的黄斑下人体布鲁赫氏膜上存活的RPE细胞是受损的。”(Zarbin,MA,Trans AmOphthalmol Soc,2003;101:493-514)。
色素性视网膜炎主要被认为是遗传性疾病,有超过100种与感光细胞丢失有关的突变(参见Lund等人,2001,出处同上)。尽管大多数突变靶向感光细胞,但有些直接影响RPE细胞。同时,这些突变影响诸如感光细胞和RPE细胞之间的分子运输以及光传导的过程。
其他的较少见,但尽管如此衰竭性视网膜病也可涉及导致视力丧失和失明的进行性细胞变性。它们包括例如糖尿病性视网膜病和脉络膜新生血管膜(CNVM)。
用于细胞和组织修复和再生的基于干细胞的治疗的出现提供了对许多前述的细胞退行性病变和其他视网膜病症的有希望的治疗。干细胞能够自我更新和分化生成各种成熟细胞谱系。这类细胞的移植可用作重构靶组织从而恢复生理和结构功能的临床工具。干细胞技术的应用非常广泛,包括组织工程、基因治疗递送和细胞疗法,即,生物治疗剂经由产生或包含这些药剂的外源提供的活细胞或细胞组分递送至靶位置。(相关综述,参见例如Tresco,P.A.等人,Advanced Drug Delivery Reviews,2000,42:2-37)。
细胞疗法展现了治疗神经障碍的巨大潜能。移植细胞被认为通过代替受损细胞或通过提供增强神经健康和再生的营养因子而促进恢复和神经保护。(Doeppner TR,HermannDM,Frontiers in Cellular Neuroscience,.2014;8:357;Atala A,Lancet,2014/2015;385(9967):487-488;Popovich PG,Cell,2012;150:1105-1106;Lindvall O等人,Journalof Clinical Investigation,2010,120:29-40;Rao MS,Mechanisms of AgingDevelopment,2001;122:713-734)。神经元突起的萎缩是许多神经障碍的普遍事件,因此,提供可触发神经突增生的因子可在这些疾病中提供治疗效果。具体地,人脐带组织衍生的细胞(hUTC)可有望治疗神经元缺失。可以从产后脐带收获人脐带,而不会引起伦理问题,人脐带在体外培养期间显示出具有染色体核型稳定性并可以进行扩增(Lund等人,StemCells,2007,25(3):602-61)。hUTC给药的治疗潜力已经在各种动物疾病模型中得到了证明。例如,将hUTC递送到中风动物模型中(Moore等人,Somatosensory and MotorResearch,2013,30:185-196;Zhang L等人,Brain Research,2012,1489:104-112;Zhang L等人,Cell transplantation,2013,22:1569-1576;Jiang Q等人,PloS One,2012,7(8):e42845;Zhang L等人,Stroke,2011,42:1437-1444);视网膜变性(Lund等人,Stem Cells,2007,出处同上)表明这些细胞增强了功能恢复并保护神经元免于进行性变性和细胞死亡。
最近有研究表明产后衍生的细胞改善了视网膜变性(US 2010/0272803)。皇家外科医学院(RCS)大鼠呈现出影响外节段吞噬作用的酪氨酸受体激酶(Mertk)缺陷,导致感光细胞死亡。(Feng W等人,J Biol Chem.,2002,10:277(19):17016-17022)。据发现视网膜色素上皮(RPE)细胞移植到RCS大鼠视网膜下腔中限制了感光细胞丢失的进行并保护了视觉功能。还已证实,产后衍生的细胞可用于促进感光细胞营救并因此保护了RCS模型中的感光细胞。(US 2010/0272803)。人脐带组织衍生的细胞(hUTC)经视网膜下注入到RCS大鼠眼中提高了视敏度并改善了视网膜变性。此外,用衍生自hUTC的条件培养基(CM)治疗恢复了体外营养不良RPE细胞中ROS的吞噬作用。(US2010/0272803)。在此进一步研究hUTC改善视力的机制。
发明内容
本发明提供适用于眼科疾病和障碍的基于细胞或再生疗法的组合物和方法。具体地讲,本发明的特征在于如下方法和组合物,包括用于治疗眼科疾病或病症的药物组合物,包括用祖细胞诸如产后衍生的细胞和由这些细胞生成的条件培养基再生或修复眼部细胞和组织。产后衍生的细胞可以是脐带组织衍生的细胞或胎盘组织衍生的细胞。
本发明的一个方面是一种通过诱导神经元细胞中的突触发生来治疗眼科疾病的方法,该方法包括施用祖细胞群或由祖细胞群制备的条件培养基。在本发明的一个实施方案中,神经元细胞或神经元是视网膜神经元诸如视网膜神经节细胞、感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)、视网膜无长突细胞、水平细胞或双极细胞。在本发明的具体实施方案中,祖细胞是产后衍生的细胞。在本发明的实施方案中,产后衍生的细胞从基本上不含血液的人脐带组织或胎盘组织分离。在另一个实施方案中,祖细胞分泌营养因子。在一个实施方案中,条件培养基包含由祖细胞群分泌的营养因子。在实施方案中,由祖细胞诸如产后衍生的细胞分泌的营养因子诱导突触发生。在实施方案中,营养因子选自血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4。
在本发明的一个方面中,通过诱导神经元细胞中的神经突增生来治疗眼科疾病的方法,该方法包括施用祖细胞群或由祖细胞群制备的条件培养基。在本发明的一个实施方案中,神经元细胞或神经元是视网膜神经元诸如视网膜神经节细胞、感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)、视网膜无长突细胞、水平细胞或双极细胞。在本发明的具体实施方案中,祖细胞是产后衍生的细胞。在本发明的实施方案中,产后衍生的细胞从基本上不含血液的人脐带组织或胎盘组织分离。在另一个实施方案中,祖细胞分泌营养因子。在一个实施方案中,条件培养基包含由祖细胞群分泌的营养因子。在实施方案中,由祖细胞诸如产后衍生的细胞分泌的营养因子诱导突触发生。在实施方案中,营养因子选自血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4。
本发明的又一个方面是一种诱导神经突增生的方法,该方法包括施用祖细胞群或由祖细胞群制备的条件培养基。在本发明的一个实施方案中,神经元细胞(神经元)是视网膜神经元诸如视网膜神经节细胞、感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)、视网膜无长突细胞、水平细胞或双极细胞。在本发明的实施方案中,祖细胞是产后衍生的细胞。在实施方案中,产后衍生的细胞从基本上不含血液的人脐带组织或胎盘组织分离。在另一个实施方案中,祖细胞分泌营养因子。在一个实施方案中,条件培养基包含由祖细胞群分泌的营养因子。在实施方案中,由祖细胞诸如产后衍生的细胞分泌的营养因子诱导神经突增生。在另一个实施方案中,由祖细胞分泌的营养因子选自血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4。
本发明的另一个实施方案是使视网膜神经元中功能性突触发育的方法,该方法包括施用祖细胞群或由祖细胞群制备的条件培养基。在本发明的实施方案中,视网膜神经元是视网膜神经节细胞、感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)、视网膜无长突细胞、水平细胞或双极细胞,并且祖细胞是产后衍生的细胞。在实施方案中,产后衍生的细胞从基本上不含血液的人脐带组织或胎盘组织分离。在另一个实施方案中,祖细胞分泌营养因子。在一个实施方案中,条件培养基包含由祖细胞群分泌的营养因子。在实施方案中,由祖细胞诸如产后衍生的细胞分泌的营养因子诱导神经突增生。在另一个实施方案中,由祖细胞分泌的营养因子选自血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4。
在本文中本发明的实施方案中,由祖细胞群例如产后衍生的细胞制备的条件培养基包含由所述细胞群分泌的营养因子。由所述细胞分泌的此类营养因子选自血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4。产后衍生的细胞是脐带组织衍生的细胞(UTC)或胎盘组织衍生的细胞(PDC)。
在一个实施方案中,祖细胞促进视网膜神经元中功能性突触的发育。在另一个实施方案中,由祖细胞分泌的营养因子促进神经元中功能性突触的发育。在具体的实施方案中,营养因子选自血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4。在又一个实施方案中,祖细胞群支持神经元细胞的生长。
在另一个实施方案中,由祖细胞群制备的条件培养基支持神经元细胞的生长。在本发明的实施方案中,上述由祖细胞群制备的条件培养基包含由所述细胞群分泌的营养因子。在具体的实施方案中,营养因子选自血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4。
本发明的另一方面特征在于用于促进视网膜变性中突触的发育的方法,所述方法包括以有效促进突触发育的量向受试者施用条件培养基。在本发明的一个实施方案中,条件培养基由产后衍生的细胞群制备。在具体的实施方案中,产后衍生的细胞从基本上不含血液的人脐带组织或胎盘组织分离。如在其他实施方案中,条件培养基包含由细胞群分泌的营养因子。由所述细胞分泌的此类营养因子选自血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4。
在本发明的实施方案中,产后衍生的细胞衍生自基本上不含血液的人脐带组织或胎盘组织。在实施方案中,细胞能够在培养中扩增,并且具有分化成神经表型细胞的潜力,其中所述细胞需要L-缬氨酸用于生长并且能够在至少约5%的氧气中生长。该细胞还具有下述特征中的一种或多种:(a)在培养中至少约40次倍增的潜能;(b)在涂布或未涂布的组织培养容器上贴壁和扩增,其中涂布的组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的涂层;(c)产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少一种;(d)产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A,B,C中的至少一种;(e)不产生CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR,DP,DQ中的至少一种,如通过流式细胞术检测;(f)相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,基因表达对于编码以下因子的至少一种基因是提高的:白介素8;浆膜蛋白1;趋化因子(C--X--C基序)配体1(黑色素瘤生长刺激活性,α);趋化因子(C--X--C基序)配体6(粒细胞趋化蛋白2);趋化因子(C--X--C基序)配体3;肿瘤坏死因子、α-诱导蛋白3;C-型凝集素超家族成员2;Wilms瘤1;醛脱氢酶1家族成员A2;肾素;氧化的低密度脂蛋白受体1;智人(Homo sapiens)克隆IMAGE:4179671;蛋白激酶Cζ;假定蛋白DKFZp564F013;卵巢癌中下调的1;以及来自克隆DKFZp547k1113的智人基因;(g)相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,基因表达对于编码以下因子的至少一种基因是降低的:矮小同源盒2;热休克27kDa蛋白2;趋化因子(C--X--C基序)配体12(基质细胞衍生因子1);弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄,威廉斯-博伊伦综合征);智人mRNA;cDNA DKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022);间充质同源盒2(生长终止特异性同源盒);sine oculis同源盒同源物1(果蝇属);晶体蛋白,αB;形态发生紊乱关联激活因子2;DKFZP586B2420蛋白;类似于neuralin1;四连接素(纤溶酶原结合蛋白);src同源3(SH3)和富含半胱氨酸的结构域;胆固醇25-羟化酶;runt相关转录因子3;白介素11受体,α;前胶原C-内肽酶增强子;卷曲同源物7(果蝇属);假定基因BC008967;胶原,VIII型,α1;腱生蛋白C(六臂蛋白);易洛魁族同源盒蛋白5;膜铁转运辅助蛋白;整联蛋白,β8;突触小泡糖蛋白2;成神经细胞瘤,抑制瘤变蛋白1;胰岛素样生长因子结合蛋白2,36kDa;智人cDNA FLJ12280fis,克隆MAMMA1001744;细胞因子受体样因子1;钾中间/小电导钙活化通道,亚家族N,成员4;整联蛋白,β7;具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ);sine oculis同源盒同源物2(果蝇属);KIAAI034蛋白;囊泡相关膜蛋白5(肌短蛋白);含EGF腓骨蛋白样细胞外基质蛋白1;早期生长反应因子3;远端缺失同源盒5;假定蛋白FLJ20373;醛酮还原酶家族1,成员C3(3-α羟基类固醇脱氢酶,II型);双糖链蛋白聚糖;具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ);纤连蛋白1;前脑啡肽;整联蛋白,β样1(具有EGF样重复结构域);智人mRNA全长插入cDNA克隆EUROIMAGE1968422;EphA3;KIAA0367蛋白;尿钠排泄肽受体C/鸟苷酸环化酶C(利尿钠排泄肽受体C);假定蛋白FLJ14054;智人mRNA;cDNA DKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222);BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3样;AE结合蛋白1;细胞色素c氧化酶VIIa亚基多肽1(肌肉);类似于neuralin1;B细胞易位基因1;假定蛋白FLJ23191和DKFZp586L151;以及(h)不表达hTERT或端粒酶。在一个实施方案中,脐带组织衍生的细胞还具有以下特征:(i)分泌MCP-l、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIPlb、I309、MDC、RANTES和TIMP1中的至少一种;(j)不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb和VEGF中的至少一种,如通过ELISA检测。在另一个实施方案中,胎盘组织衍生的细胞还具有以下特征:(i)分泌MCP-l、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1中的至少一种;(j)不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、FGF和VEGF中的至少一种,如通过ELISA检测。
在具体的实施方案中,产后衍生的细胞具有细胞类型UMB 022803(P7)(ATCC登录号PTA-6067);细胞类型UMB 022803(P17)(ATCC登录号PTA-6068)、细胞类型PLA 071003(P8)(ATCC登录号PTA-6074);细胞类型PLA 071003(P11)(ATCC登录号PTA-6075);或细胞类型PLA 071003(P16)(ATCC登录号PTA-6079)的所有识别性特征。在一个实施方案中,衍生自脐组织的产后衍生的细胞具有细胞类型UMB 022803(P7)(ATCC登录号PTA-6067)或细胞类型UMB 022803(P17)(ATCC登录号PTA-6068)的所有识别性特征。在另一个实施方案中,衍生自胎盘组织的产后衍生的细胞具有细胞类型PLA 071003(P8)(ATCC登录号PTA-6074)、细胞类型PLA071003(P11)(ATCC登录号PTA-6075)或细胞类型PLA 071003(P16)(ATCC登录号PTA-6079)的所有识别性特征。
在某些实施方案中,产后衍生的细胞在一种或多种酶活性存在下分离,所述一种或多种酶活性包括金属蛋白酶活性、粘液溶解活性和中性蛋白酶活性。优选地,这些细胞具有细胞在培养中传代时保持的正常核型。在优选的实施方案中,产后衍生的细胞包括CD10、CD13、CD44、CD73、CD90中的每一者。在一些实施方案中,产后衍生的细胞包括CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A,B,C中的每一者。在优选的实施方案中,产后衍生的细胞不包括CD31、CD34、CD45、CD117中的任何一者。在一些实施方案中,产后衍生的细胞不包括CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR,DP,DQ中的任何一者,如通过流式细胞术所检测。在实施方案中,这些细胞不表达hTERT或端粒酶。
在本发明的实施方案中,该细胞群是产后衍生的细胞的基本上同质的群体。在具体的实施方案中,该群体是产后衍生的细胞的同质群体。在本发明的实施方案中,产后衍生的细胞衍生自基本上不含血液的人脐带组织或胎盘组织。
在某些实施方案中,产后衍生的细胞群或由如上所述产后衍生的细胞群生成的条件培养基与至少一种其他细胞类型一起施用,所述至少一种其他细胞类型诸如为星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、神经祖细胞、神经干细胞、视网膜上皮干细胞、角膜上皮干细胞或其他多潜能或多能干细胞。在这些实施方案中,所述其他细胞类型可与该细胞群或条件培养基同时施用、或在该细胞群或条件培养基之前或之后施用。
同样,在这些和其他实施方案中,产后衍生的细胞群或由如上所述的细胞群制备的条件培养基与至少一种其他试剂一起施用,所述至少一种其他试剂诸如为眼部治疗用药物,或另一种有益辅助剂诸如抗炎剂、抗细胞凋亡剂、抗氧化剂或生长因子。在这些实施方案中,所述其他试剂可与该细胞群或条件培养基同时施用、在该细胞群或条件培养基之前或之后施用。
在各种实施方案中,产后衍生的细胞群或由产后衍生的细胞(脐带或胎盘)生成的条件培养基施用到眼睛的表面,或施用到眼睛的内部或眼睛附近的位置(例如,眼睛后面)。产后衍生的细胞群或条件培养基可通过插管施用,或从植入患者身体的眼睛之内或附近的装置施用,或可通过植入含产后衍生的细胞群或条件培养基的基质或支架来施用。
本发明的另一方面的特征在于用于促进视网膜退行性病症中功能性突触发育的组合物,该组合物包含以有效促进功能性突触发育的量的产后衍生的细胞群或由细胞群制备的条件培养基。优选地,条件培养基由如上所述产后衍生的细胞制备。更优选地,产后衍生的细胞从基本上不含血液的产后脐带或胎盘分离。退行性病症可为急性、慢性或进行性病症。
在某些实施方案中,该组合物包含至少一种其他细胞类型,诸如星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、神经祖细胞、神经干细胞、视网膜上皮干细胞、角膜上皮干细胞或其他多潜能或多能干细胞。在这些或其他实施方案中,该组合物包含至少一种其他试剂,诸如用于治疗眼部退行性疾病的药物或其他有益辅助剂,例如抗炎剂、抗细胞凋亡剂、抗氧化剂或生长因子。
在一些实施方案中,该组合物是还包含药学上可接受的载体的药物组合物。
在某些实施方案中,该药物组合物被配制用于施用到眼睛的表面。另选地,它们可被配制用于施用到眼睛的内部或眼睛附近(例如,眼睛后面)。这些组合物还可被配制为含有产后衍生的细胞或条件培养基的基质或支架。
根据本发明的又一方面,提供了用于治疗患有眼部退行性病症的患者的试剂盒。该试剂盒包括药学上可接受的载体、产后衍生的细胞群或由产后衍生的细胞(优选地上述产后衍生的细胞)群生成的条件培养基以及在治疗患者的方法中使用该试剂盒的说明书。该试剂盒还可含有一种或多种附加组分,诸如用于生成条件培养基的试剂和说明书,或至少一种其他细胞类型的群体,或可用于治疗眼部退行性病症的一种或多种试剂。
在一个实施方案中,本发明是用于在视网膜变性中诱导突触形成的方法,该方法包括以有效诱导突触形成的量向受试者施用产后衍生的细胞群或由产后衍生的细胞群制备的条件培养基,其中产后衍生的细胞衍生自基本上不含血液的人脐带组织或胎盘组织,并且其中该细胞群能够在培养中扩增,具有分化成至少神经表型的细胞的潜能,在传代时保持正常核型,并且具有以下特征:
a)在培养中40次群体倍增的潜能;
b)产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90;以及
c)不产生CD31、CD34、CD45、CD117和CD141,并且
其中产后衍生的细胞群分泌营养因子,或由产后衍生的细胞群制备的条件培养基含有由该细胞群所分泌的营养因子。在一个实施方案中,由该细胞群分泌的营养因子选自血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4。在一些实施方案中,该细胞群为基本上同质的群体。在特定实施方案中,该细胞群为同质的。产后衍生的细胞是脐带组织衍生的细胞或胎盘组织衍生的细胞。在实施方案中,脐带组织衍生的细胞群分泌MCP-l、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIPlb、I309、MDC、RANTES和TIMP1。另外,脐带组织衍生的细胞群不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb和VEGF,如通过ELISA所检测。在另一个实施方案中,胎盘组织衍生的细胞群分泌MCP-l、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1。在实施方案中,胎盘组织衍生的细胞群不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、FGF和VEGF,如通过ELISA所检测。另外,该细胞群不表达hTERT或端粒酶。在实施方案中,相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞而言,脐带组织衍生的细胞群具有编码白介素8和浆膜蛋白1的基因的提高的表达。在实施方案中,该细胞群产生波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。
在另一个实施方案中,本发明是用于在视网膜变性中诱导突触形成的方法,该方法包括以有效诱导突触形成的量向受试者施用脐带组织衍生的细胞群或由人脐带组织衍生的细胞群制备的条件培养基,其中这些细胞衍生自基本上不含血液的人脐带组织,并且其中该细胞群能够在培养中扩增,具有分化成至少神经表型的细胞的潜能,在传代时保持正常核型,并且具有以下特征:
a)在培养中40次群体倍增的潜能;
b)产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90;以及
c)不产生CD31、CD34、CD45、CD117和CD141,并且
其中脐带组织衍生的细胞群分泌营养因子,或由人脐带组织衍生的细胞群制备的条件培养基含有由该细胞群分泌的营养因子。在一个实施方案中,由该细胞群分泌的营养因子选自血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4。在一个实施方案中,该细胞群分泌MCP-l、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIPlb、I309、MDC、RANTES和TIMP1。在实施方案中,该细胞群不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb和VEGF,如通过ELISA所检测。在一些实施方案中,该细胞群为基本上同质的群体。在特定实施方案中,该细胞群为同质的。另外,该细胞群不表达hTERT或端粒酶。在实施方案中,相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞而言,该细胞群具有编码白介素8和浆膜蛋白1的基因的提高的表达。在实施方案中,该细胞群产生波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。
在上述实施方案中,脐衍生的细胞或胎盘衍生的细胞具有下述特征中的一种或多种:HLA-A,B,C呈阳性;CD10、CD13、CD44、CD73、CD90呈阳性;HLA-DR,DP,DQ呈阴性;CD31、CD34、CD45、CD117和CD141不产生或呈阴性。在实施方案中,这些细胞产生波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。
在上述另外的实施方案中,相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞而言,脐衍生的细胞具有编码白介素8和浆膜蛋白1的基因的提高的表达。在实施方案中,脐衍生的细胞不表达hTERT或端粒酶。
在上述本发明的实施方案中,视网膜变性、视网膜病或视网膜/黄斑疾病是年龄相关性黄斑变性。在另选实施方案中,视网膜变性、视网膜病或视网膜/黄斑疾病是干性年龄相关性黄斑变性。
附图说明
图1A至图1M.hUTC在培养的RGC之间诱导功能性突触形成。(图1A)实验设计的示意性表示。将经纯化的RGC在单层细胞小室(transwell insert)中单独培养或者与hUTC、NHDF或大鼠ASC共培养6天。分别通过基于免疫细胞化学的测定法和基于电生理学的测定法来测定突触的数量和功能。(图1B)使用对突触前(Bassoon,红色)和突触后(Homer,绿色)蛋白质具有特异性的抗体染色的RGC的代表性图像。底部:入口(白框)以更高的放大倍率示出,并且共定位的突触斑(合并,黄色)用白色箭头标记。比例尺:20μm。(图1C)共定位的突触斑数的倍数增加值(n=59-161个细胞/条件)及(图1D)突触密度(每单位树突长度的突触数,n=30个细胞/条件)的定量揭示了与ASC一样,hUTC也在培养的RGC之间诱导兴奋性突触形成。(通过使用单独RGC条件下每个细胞的突触数将每个细胞的突触数归一化,来计算倍数增加值)。图1E至图1I示出了诱导的突触有电生理学功能。(图1E)全细胞膜片钳记录得出的示出mEPSC的示例性迹线。(图1F)事件间隔的累积概率图及(图1G)mEPSC平均频率的定量揭示了与hUTC或ASC共培养诱导了突触事件数的增加。(图1H)mEPSC幅值的累积概率图展示了当与单独培养的RGC相比时,与hUTC或ASC共培养的RGC中的大幅值事件出现增加。(图1I)mEPSC幅值的平均值在各条件之间并无差异。(对于电生理学实验,n=15个细胞/条件。所有数据表示为平均值±SEM,并且显著性展示为***p<0.0001,**p<0.001以及*p<0.05,n.s.无显著性。)图1J至图1M示出了hUTC与ASC共培养诱导的突触的电生理波形特性。与CTR(单独的RGC)相比,从与ASC或hUTC共培养的RGC所记录的mEPSC展示了(图1J、图1K)上升tau和衰减tau(图1L、图1M)两者的增加。n=15个细胞/条件。所有数据表示为平均值±SEM,并且显著性展示为***p<0.0001,**p<0.001以及*p<0.05。
图2A至图2N.hUTC条件培养基(UCM)在培养的RGC之间诱导功能性突触形成。(图2A)实验设计的示意性表示。将经纯化的RGC用UCM(各种浓度)或ACM处理6天。分别通过基于免疫细胞化学的测定法和基于电生理学的测定法来测定突触的数量和功能。(图2B)使用对突触前(Bassoon,红色)和突触后(Homer,绿色)蛋白质具有特异性的抗体染色的RGC的代表性图像。底部:入口(白框)以更高的放大倍率示出,并且共定位的突触斑(合并,黄色)用白色箭头标记。比例尺:20μm。(图2C)突触数的倍数增加值(n=65-157个细胞/条件)及(图2D)突触密度(每单位树突长度的突触数,n=30个细胞/条件)的定量揭示了与ACM一样,UCM也在培养的RGC之间诱导兴奋性突触形成。(通过使用单独RGC条件下的突触数将每个细胞的共定位的突触斑数归一化,来计算突触数的倍数增加值。(图2E)全细胞膜片钳记录得出的示出单独培养的或用ACM(80μg/mL)或UCM(80μg/mL)处理的RGC的mEPSC的示例性迹线。(图2F)事件间隔的累积概率图及(图2G)mEPSC平均频率的定量揭示了用UCM或ACM处理诱导了突触事件数的增加。(图2H)mEPSC幅值的累积概率图展示了与单独培养的RGC相比,在用UCM或ACM处理RGC时大幅值事件出现增加。(图2I)mEPSC幅值的平均值在各条件之间并无显著差异。(对于电生理学实验,n=15个细胞/条件。所有数据表示为平均值±SEM,并且显著性展示为***p<0.0001,**p<0.001以及*p<0.05。)图2J至图2N UCM诱导的突触数和电生理特性的变化。(图2J)用各种浓度的ACM和UCM处理的RGC中的突触数的定量。结果表示为突触数(归一化为单独RGC条件下共定位的突触斑数,n=29-157个细胞/条件)的倍数增加值。从用ACM或UCM处理的RGC所记录的mEPSC展示了(图2K、图2L)上升tau和(图2M、图2N)衰减tau两者的增加(与单独培养的RGC相比,n=15个细胞/条件)。所有数据表示为平均值±SEM,并且显著性展示为***p<0.0001,**p<0.001以及*p<0.05。
图3A至图3J.hUTC分泌的因子促进RGC存活和神经突增生。(图3A)用存活测定试剂(用于活细胞的钙黄绿素AM(绿色)和用于死细胞的乙啡啶同型二聚体-1(红色))处理的RGC的代表性图像。比例尺:100μm。(图3B)与在基本培养基中培养的RGC(CTR)相比,在各种浓度的ACM和UCM存在下RGC存活率的定量。(n=9-10个显微镜视野/条件)(图3C)UCM介导的存活效应在所测试的所有UCM浓度下均是毛喉素依赖性的(n=9-18个显微镜视野/条件)。UCM(40μg/mL)的存活效应对(图3D)BDNF和(图3E)CNTF的存活效应有累加性。(n=18-20个显微镜视野/条件)(图3F)单独培养的或用ACM或UCM处理的RGC的代表性骨架化迹线。比例尺:100μm。(图3G)神经突复杂性的Sholl分析展示了与单独培养的RGC相比,用条件培养基处理的RGC具有增加的细化(n=20-24个细胞/条件)。(图3H)总神经突增生、(图3I)突起数和(图3J)分支数的定量展示了与单独培养的RGC相比在用UCM或ACM处理RGC时的增加值(n=25-36个细胞/条件)。图形表示为归一化为单独RGC条件的值的倍数增加值。所有数据表示为平均值±SEM,并且显著性展示为***p<0.0001,**p<0.001以及*p<0.05,n.s.无显著性。
图4A至图4E.UCM中的突触发生因子的表征。(图4A)实验设计的示意性表示。将经纯化的RGC用UCM处理6天,并使用离心浓缩机以不同截留分子量进行分级分离。然后如此前所述那样对突触数进行定量。(图4B)示出共定位的突触斑的代表性RGC图像(突触前:Bassoon(红色),突触后:Homer(绿色))。底部:白框以更高的放大倍率示出。白色箭头指示共定位的突触斑。比例尺:20μm。(图4C)突触数的倍数增加值的定量。通过将共定位的突触斑数/细胞归一化为在单独RGC条件下获得的值,来计算倍数增加值(n=30-44个细胞/条件)。(图4D)示出在加巴喷丁(GBP,32μM)存在或不存在下用UCM处理的RGC中共定位的突触斑(白色箭头,突触前:Bassoon(红色)和突触后:Homer(绿色))的代表性RGC图像。比例尺:20μm。(图4E)归一化为单独RGC条件的突触数的倍数增加值的定量(n=24-25个细胞/条件)。UCM诱导的突触发生受到GBP的抑制。所有数据表示为平均值±SEM,并且显著性展示为***p<0.0001,**p<0.001以及*p<0.05。
图5A至图5K.hUTC诱导的突触发生需要TSP1、TSP2和TSP4。(图5A)TSP敲低实验(图5至图7)的实验设计的示意性图示。通过hUTC的慢病毒shRNA转导来沉默TSP1、TSP2和TSP4表达,并收获敲低(KD)UCM。用KD UCM处理RGC 6天。测定UCM对突触形成(突触测定法)、突触功能(电生理学)、神经元存活(存活测定法)和神经突增生(增生测定法)的效应。(图5B)使用慢病毒shRNA转导实现的TSP1、TS2P和TSP4敲低的蛋白质印迹确认。无关hUTC分泌的蛋白质(称为HEVIN)用作上样对照。(图5C)归一化为单独RGC条件的经RGC处理的混杂对照UCM(SCR-CTR)和TSP-KD UCM中突触数的倍数增加值(n=30个细胞/条件)。(图5D)归一化为单独RGC条件的用各种TSP-KD UCM处理的RGC中突触数的倍数增加值(n=76-81个细胞/条件)。(图5E)归一化为单独RGC条件的在经纯化的TSP存在下用TSP1+2+4-KD UCM处理的RGC的突触数的倍数增加值(n=30个细胞/条件)。添加所有三种TSP(TSP1、2和4)营救了TSP1+2+4-KD UCM的突触发生效应。来自每一种不同处理的RGC的代表性图像可见于图5H至图5J。图5F和图5G展示慢病毒感染的hUTC的嘌呤霉素选择。(图5F)在第3天和第5天在各种嘌呤霉素浓度存在下未经慢病毒转导的hUTC的杀伤曲线(n=3个显微镜视野/每种条件)。(图5G)在第3天和第5天在嘌呤霉素(0.9μg/mL)存在下受到和未受到慢病毒感染的hUTC的代表性图像。比例尺:50μm。图5H至图5L示出了hUTC分泌的TSP在RGC之间诱导突触形成。(图5H至图5J)示出共定位的突触斑的RGC的代表性图像(突触前:Bassoon(红色),突触后:Homer(绿色))展示了在使用TSP1+2+4-KD UCM时损失了UCM的突触发生活性。可通过将经纯化的TSP1或TSP2或TSP4(150ng/ml)添加到KD UCM中而部分地营救该损失。添加所有三种TSP营救了UCM的完整突触发生效应。底部:白框以更高的放大倍率示出。白色箭头指示共定位的突触斑。比例尺:20μm。(图5K)在用各种TSP-KD UCM处理之后突触密度(共定位的突触斑数/神经突长度)的变化的定量。(图5L)在经纯化的TSP存在下在单独培养的RGC(阴性对照)或用KDCTR UCM处理的RGC之间形成的突触的定量(n=30个细胞/条件)。将经纯化的TSP添加到KDCTR UCM并未引起突触数的进一步增加。所有数据表示为平均值±SEM,并且显著性展示为***p<0.0001,**p<0.001以及*p<0.05,n.s.无显著性。
图6A至图6I.hUTC诱导的突触功能增强需要TSP1、TSP2和TSP4。(图6A)全细胞膜片钳记录得出的示出用AMC(阳性对照)、SCR-CTR、TSP1+2+4-KD UCM处理的RGC或单独培养的RGC(阴性对照)的mEPSC的示例性迹线。UCM(TSP1+2+4-KD)中TSP的沉默消除了SCR-CTR所实现的(图6B、图6C)频率和(图6D、图6E)幅值增加值两者。定量数据展示为累积概率图(图6B、图6D)和平均值的条形图(图6C、图6E)。n=15个细胞/条件。(图6F)全细胞膜片钳记录得出的示出用AMC(阳性对照)、SCR-CTR或TSP1+2+4-KD UCM处理的RGC或单独培养的RGC(阴性对照)的mEPSC的示例性迹线。UCM(TSP1+2+4-KD)中TSP的沉默消除了SCR-CTR所实现的频率(图6G至图6H)和幅值(图6I至图6J)增加值两者。定量数据展示为累积概率图(图6G、图6I)和平均值的条形图(图6H、图6J)。n=15个细胞/条件。图6K至图6N展示了TSP敲低对经UCM处理的RGC的波形特性的效应。(图6K、图6L)上升tau或(图6M、图6N)衰减tau未受到hUTC中TSP表达的沉默的显著影响,如经KD-CTR和TSP1+2+4-KD UCM处理的RGC记录之间的相似值所展示(n=15个细胞/条件)。所有数据表示为平均值±SEM,并且显著性展示为***p<0.0001,**p<0.001以及*p<0.05。
图7A至图7O.TSP是UCM诱导的神经突增生所需的,但不是细胞存活所需的。(图7A)与单独RGC(阴性对照)相比用SCR-CTR、KD-CTR或TSP1+2+4-KD UCM处理的RGC的代表性骨架化迹线。比例尺:100μm。与对照SCR-CTR和KD-CTR两者相比,TSP沉默的hUTC UCM(TSP1+2+4-KD UCM)导致总神经突增生的(图7B)长度、(图7C)突起和(图7D)分支的减少(n=40-48个细胞/条件)。hUTC中TSP的沉默导致UCM减少了总神经突增生(图7E)长度(n=120-169个细胞/条件)并降低了Sholl分析所示的(图7F)复杂性(n=25个细胞/条件)。#指示与单独RGC条件相比总增生的显著减少(p<0.05)。(图7G)在经纯化的TSP存在下用KD-CTR或TSP1+2+4-KDUCM处理的RGC的代表性骨架化迹线。比例尺:100μm。将经纯化的TSP添加到TSP1+2+4-KDUCM中恢复了UCM增强(图7H)总神经突生长(n=29-33个细胞/条件)和(图7I)复杂性(n=30个细胞/条件)的功能。#指示与单独RGC条件相比总增生的显著减少(p<0.05)。(图7J)用存活测定试剂(用于活细胞的钙黄绿素AM(绿色)和用于死细胞的乙啡啶同型二聚体-1(红色))处理的RGC的代表性图像。比例尺:100μm。(图7K)用各种TSP-KD UCM条件处理的RGC的存活百分比的定量(n=30个显微镜视野/条件)。TSP2或TSP4或所有三种TSP的沉默导致UCM的存活促进效应的降低。(图7L)将纯TSP添加到TSP1+2+4-KD UCM中并未恢复KD-UCM的全部存活效应(n=20个显微镜视野/条件)。图7M至图7O示出了TSP参与RGC中UCM诱导的神经突增生。(图7M)与单独RGC(阴性对照)相比用SCR-CTR、KD-CTR和TSP-KD UCM处理的RGC的代表性骨架化迹线。比例尺:100μm。hUTC中TSP的敲低导致(图7N)突起和(图7O)分支的数量减少(n=120-169个细胞/条件)。突起和分支数的倍数变化被归一化为单独RGC对照。图7P至图7R示出了经纯化的TSP的添加营救了TSP1+2+4-KD UCM的神经突增生功能。(图7P)在经纯化的TSP存在下用KD-CTR或TSP1+2+4-KD UCM处理的RGC的代表性骨架化迹线。比例尺:100μm。将经纯化的TSP添加回TSP1+2+4-KD UCM(图7Q)对突起数具有轻微效应,但(图7R)恢复了分支数的倍数变化(n=29-33个细胞/条件)。所有数据表示为平均值±SEM,归一化为单独的RGC,并且显著性展示为***p<0.0001,**p<0.001以及*p<0.05。
图8A至图8J.hUTC分泌的TSP在CSPG、Nogo-A或MBP存在下诱导神经突增生。图8A.涂布有递增浓度的CSPG(n=45-79个细胞/条件)或图8B.Nogo-A(n=30-37个细胞/条件)的盖玻片上的总神经突增生的定量。图形表示为倍数增加值,其归一化为接种在不含有CSPG或Nogo-A的盖玻片上的RGC的增生值。图8C.接种到CSPG(0.05μg/cm2)或图8D.Nogo-A(1μg/cm2)涂布的盖玻片上的、用SCR-CTR、TSPs KD UCM和经纯化的TSP处理的RGC的代表性骨架化迹线。比例尺:100μm。图8E至图8F.接种到图8E.CSPG(0.05μg/cm2,n=62-103个细胞/条件)或图8F.Nogo-A(1μg/cm2,n=25-29个细胞/条件)涂布的盖玻片上的RGC的总神经突增生的定量。图形表示为倍数增加值,其归一化为在每种培养条件下仅用生长培养基培养的RGC(单独的RGC)的值。图8G.在MBP(10μg/mL)存在下用单独的或补充有经纯化的TSP的SCR-CTR或TSP1+2+4-KD UCM进行处理的RGC的代表性骨架化迹线。比例尺:100μm。图8H.在生长抑制物质存在下用经纯化的TSP处理的RGC的代表性骨架化迹线。比例尺:100μm。图8I.总神经突增生的定量展示了在MBP存在下UCM分泌的TSP2的神经突增生活性的增强。(n=40-54个细胞/条件)。图形表示为归一化为单独RGC条件的值的倍数增加值。图8J.在CSPG、Nogo-A或MBP存在下用经纯化的TSP处理RGC能够诱导显著的增生(n=41-54个细胞/条件)。所有数据表示为平均值±SEM,并且显著性展示为***p<0.0001,**p<0.001以及*p<0.05,n.s.无显著性。#指示与单独RGC条件相比总增生的显著减少(p<0.05)。
本发明的其他特征和优点由下述具体实施方式和实施例将是显而易见的。
具体实施方式
在本说明书通篇引用了各种专利和其他出版物。这些出版物各自全文以引用方式并入本文。在例示性实施方案的下述详述中,参考构成其一部分的附图。这些实施方案充分详细地进行描述,以允许本领域技术人员实践本发明,并且应当理解可利用其他实施方案,并且可作出逻辑结构、机械、电和化学变化,而不背离本发明的实质或范围。为了避免对于允许本领域技术人员实践本文描述的实施方案不必要的细节,描述可省略本领域技术人员已知的某些信息。因此,以下的详细说明不应被理解为限制性意义的,并且示例性实施方案的范围由所附权利要求书限定。
定义
本说明书和权利要求书通篇使用的各种术语如下所述那样定义,且旨在阐明本发明。
干细胞是由单细胞自我更新和分化以产生后代细胞的能力定义的未分化细胞,包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞以及终末分化的细胞。干细胞还由它们的以下能力来表征:从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成多种细胞谱系的功能细胞的能力,以及在移植后产生多个胚层的组织的能力和在注射到胚泡中后基本上促成大多数组织(如果不是所有的组织的话)的能力。
根据干细胞的发育潜能,将它们分类为:(1)全能;(2)多能;(3)多潜能;(4)寡能;和(5)单能。全能细胞能够产生所有胚胎和胚胎外细胞类型。多能细胞能够产生所有胚胎细胞类型。多潜能细胞包括能够产生细胞谱系的子类,但均处于特定组织、器官或生理系统内的细胞(例如造血干细胞(HSC)可产生的后代包括HSC(自我更新)、局限于血细胞的寡能祖细胞、以及作为正常血液组分的所有细胞类型和成分(例如血小板))。寡能细胞可产生比多潜能干细胞更为局限的细胞谱系子类;并且单能细胞能够产生单种细胞谱系(例如,精原干细胞)。
也基于可获取干细胞的来源而将它们分类。成体干细胞一般为在包含多个分化细胞类型的组织中发现的多潜能未分化细胞。成体干细胞可自我更新。在正常情况下,它也可分化产生特化的组织细胞类型(其起源于该组织),并且可能产生其他组织类型。诱导多能干细胞(iPS细胞)是被转化成多能干细胞的成体细胞。(Takahashi等人,Cell,2006,126(4):663-676);Takahashi等人,Cell,2007,131:1-12)。胚胎干细胞是来自胚泡期胚胎的内细胞团的多能细胞。胎儿干细胞是源于胎儿组织或膜的干细胞。产后干细胞是基本上起源于可在分娩后得到的胚胎外组织(亦即胎盘和脐带)的多潜能或多能细胞。已发现这些细胞具有多能干细胞的特征特性,包括快速增殖和分化成许多细胞谱系的潜能。产后干细胞可为血液来源的(如,从脐带血液获得的那些)或非血液来源的(如,从脐带和胎盘的非血液组织获得的)。
胚胎组织通常定义为起源于胚胎(在人中是指受精至发育约六周的时期)的组织。胎儿组织是指起源于胎儿(在人中是指发育约六周至分娩的时期)的组织。胚胎外组织为与胚胎或胎儿相关但不起源于它们的组织。胚胎外组织包括胚外膜(绒毛膜、羊膜、卵黄囊和尿膜)、脐带和胎盘(其自身由绒毛膜和母体的底蜕膜形成)。
分化是非特化的(“未定向的”)或较少特化的细胞获得特化的细胞(诸如神经细胞或肌肉细胞)特征的过程。分化细胞是已在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”,当应用到分化的过程时,是指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞:在正常情况下,它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子类,并且在正常情况下不能分化成不同细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。“去分化”指细胞通过其回复到在细胞谱系内特化(或定向)程度较低的位置的过程。如本文所用,细胞谱系定义细胞的遗传性,即源于何种细胞以及会产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传方案内。
在广义上,祖细胞是具有产生比其自身分化程度更高的后代的能力,然而保持补充祖细胞数目能力的细胞。根据此定义,因为干细胞是终末分化细胞的更直接前体,故其本身也是祖细胞。在提及本发明的细胞(如下文更详细地描述)时,可使用该祖细胞的广义定义。在狭义上,祖细胞通常定义为在分化途径中间(即,其起于干细胞)并且在成熟细胞类型或细胞类型子类生产中间的细胞。该祖细胞类型一般不能够自我更新。因此,如果本文涉及该细胞类型,其将被称为非更新的祖细胞或中间祖细胞或前体细胞。
如本文所用,短语“分化成眼部谱系或表型”是指细胞部分或完全定向分化为特异性眼部表型,包括但不限于视网膜和角膜干细胞、视网膜和虹膜的色素上皮细胞、感光细胞、视网膜神经节及其他视神经谱系(例如,视网膜胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、米勒细胞)、形成晶状体的细胞以及巩膜、角膜、角膜缘和结膜的上皮细胞。短语“分化成神经谱系或表型”是指细胞部分或完全定向分化为CNS或PNS的特异性神经表型,即神经元或胶质细胞,后一类别包括但不限于星形胶质细胞、少突胶质细胞、施旺细胞和小胶质细胞。
本文列举且优选用于本发明的细胞一般称为产后衍生的细胞(或PPDC)。这些细胞有时也更具体地称为脐衍生的细胞或胎盘衍生的细胞(UDC或PDC)。此外,所述细胞可被描述为干细胞或祖细胞,后面的术语在广义中使用。术语“衍生的”用于表明所述细胞已从它们的生物来源获得且生长,或换句话讲,体外操作(如,在生长培养基中培养以扩增所述群体和/或产生细胞系)。脐干细胞和胎盘干细胞的体外操作及本发明的脐衍生的细胞和胎盘衍生的细胞的独特特征于下文详细地描述。通过其他方式从产后胎盘和脐分离的细胞也被视为适用于本发明。这些其他细胞在本文称为产后细胞(而非产后衍生的细胞)。
多个术语用于描述培养中的细胞。“细胞培养物”一般指从活生物体取得并在受控条件下生长(“在培养中”或“培养的”)的细胞。原代细胞培养是在第一继代培养之前培养从生物体直接取得的细胞、组织或器官。当在有利于细胞生长和/或分裂的条件下将它们放置在生长培养基中时,细胞会在培养中扩增,从而产生更大的细胞群。当细胞在培养中扩增时,有时通过细胞数目翻倍所需的时间量来测量细胞增殖率。这被称为倍增时间。
细胞系是由原代细胞培养物的一个或多个继代培养形成的细胞群。每一轮继代培养都被称为传代。当继代培养细胞时,它们被称为已传代的。细胞的特定群体或细胞系,有时由它已被传代的次数来指称或表征。例如,一个已传代了十次的培养细胞群可以被称为P10培养物。首次培养物(即,在将细胞从组织分离后的第一次培养物)被指定为P0。在第一次继代培养后,细胞被描述为次代培养物(P1或第1代)。在第二次继代培养后,细胞成为三代培养物(P2或第2代),以此类推。本领域技术人员会理解,在传代期间可能有许多次群体倍增;因此培养物的群体倍增数目大于传代数目。细胞在传代之间的期间中的扩增(即群体倍增数目)取决于许多因素,包括但不限于接种密度、基底、培养基、生长条件和传代之间的时间。
术语“生长培养基”一般指足以培养PPDC的培养基。具体地讲,用于培养本发明的细胞的一个目前优选的培养基包括达尔贝科改良必需培养基(Dulbecco’s ModifiedEssential Media,本文也简称DMEM)。特别优选的是低葡萄糖DMEM(本文也称DMEM-LG)(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。低葡萄糖DMEM优选地补充有15%(v/v)胎牛血清(例如,限定胎牛血清(Hyclone,Logan Utah))、抗生素/抗真菌剂(优选地50-100单位/毫升青霉素、50-100微克/毫升链霉素和0-0.25微克/毫升两性霉素B(Invitrogen,Carlsbad,Calif.))以及0.001%(v/v)2-巯基乙醇(Sigma,St.Louis Mo.)。如以下实施例中所用,生长培养基是指含15%胎牛血清和抗生素/抗真菌剂的低葡萄糖DMEM(当包含青霉素/链霉素时,优选地分别为50U/ml和50微克/毫升;当使用青霉素/链霉素/两性霉素时,优选地分别为100U/ml、100微克/毫升和0.25微克/毫升)。在一些情况下,使用不同的生长培养基,或提供不同的补充物,并且这在文中通常表明向生长培养基添加补充物。
条件培养基是已在其中培养特定的细胞或细胞群,然后被去除的培养基。当在培养基中培养细胞时,它们可分泌细胞因子,所述细胞因子可向其他细胞提供营养支持。此类营养因子包括但不限于激素、细胞因子、胞外基质(ECM)、蛋白质、囊泡、抗体和颗粒。包含所述细胞因子的培养基是条件培养基。
一般来讲,营养因子定义为促进细胞存活、生长、分化、增殖和/或成熟,或刺激细胞活性提高的物质。细胞之间经由营养因子的相互作用可在不同类型的细胞之间发生。经由营养因子的细胞相互作用存在于基本上所有细胞类型中,并且是各神经细胞类型间特别重要的通信方式。营养因子也可以自分泌方式发挥作用,即,细胞可产生能影响其自身存活、生长、分化、增殖和/或成熟的营养因子。
当提及培养的脊椎动物细胞时,术语衰老(也称复制性衰老或细胞衰老)是指可归因于有限细胞培养的特性;即,这些细胞无法生长超过有限的群体倍增数(有时称为海弗利克极限)。尽管首先使用成纤维细胞样细胞来描述细胞衰老,可在培养中连续生长的大多数正常人细胞类型经历细胞衰老。不同细胞类型在体外的生命周期不同,但最大生命周期通常少于100次群体倍增(这是针对培养物中所有细胞变衰老且因此不能分离培养物的倍增数)。衰老不取决于时序时间,而是由培养物已经历的细胞分裂、或群体倍增数来衡量。
术语“眼部的”、“眼科的”和“视觉的”在本文中可互换使用,用来定义“属于眼睛的、或关于眼睛的、或与眼睛有关的”。
术语“眼部退行性病症(或障碍)”是包容性术语,涵盖牵涉细胞损伤、变性或损失的眼睛的急性和慢性病症、障碍或疾病,包括眼睛与脑之间的神经连接。眼部退行性病症可为年龄相关的,或其可由损伤或创伤引起,或其可与具体疾病或障碍有关。急性眼部退行性病症包括但不限于与累及眼睛的细胞死亡或损害相关联的病症,包括由脑血管功能不全、局灶性或弥漫性脑创伤、弥漫性脑损伤、眼睛感染或炎性病症、视网膜裂孔或脱离、眼内病变(挫伤、穿透、压迫、裂伤)或其他物理性损伤(例如,物理或化学灼伤)引发的病症。慢性眼部退行性病症(包括进行性病症)包括但不限于视网膜病及其他视网膜/黄斑疾病诸如色素性视网膜炎(RP)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管膜(CNVM);视网膜病诸如糖尿病性视网膜病、闭塞性视网膜病、镰状红细胞视网膜病和高血压性视网膜病、视网膜中央静脉阻塞、颈动脉狭窄、视神经病诸如青光眼及相关综合征;晶状体和外眼疾病,例如角膜缘干细胞缺乏症(LSCD),也称为角膜缘上皮细胞缺乏症(LECD),诸如发生于化学或热损伤、Steven-Johnson综合征、接触镜片引发的角膜病、眼部瘢痕性类天庖疮、无虹膜或外胚层发育不良的先天性疾病以及多发性内分泌缺陷相关角膜炎。
术语“治疗眼部退行性病症(或眼部退行性病症的治疗)”是指减轻如本文所定义的眼部退行性病症的影响,或延迟、停止或逆转如本文所定义的眼部退行性病症的过程,或延迟或预防如本文所定义的眼部退行性病症的发作。
术语“有效量”是指有效产生预期结果的浓度或量的试剂或药物组合物,诸如生长因子、分化剂、营养因子、细胞群或其他试剂,所述预期结果包括体外或体内的细胞生长和/或分化,或眼部退行性病症的治疗,如本文所述。对于生长因子而言,有效量可在约1纳克/毫升至约1微克/毫升的范围内。对于向患者体内施用的PPDC而言,有效量可在少至几百或更少至多达几百万或更多的范围内。在具体的实施方案中,有效量可在103至1111的范围内,更具体地,至少约104个细胞。应当理解,施用的细胞数量将根椐将要治疗的障碍的特性而改变,在医学生物学家熟悉的其他因素中,所述特性包括但不限于将要治疗的范围或总体积/表面积以及施用至将要治疗的区域的位置部位近侧。
术语“有效期(或时间)”和“有效条件”是指对于试剂或药物组合物必要的或优选的一段时间或其他可控条件(如针对体外方法的温度、湿度)以实现其预期结果。
术语“患者”或“受试者”是指用药物组合物或根据本文所述方法治疗的动物,包括哺乳动物,优选人。
术语“药学上可接受的载体或介质”可与术语“生物相容性载体或介质”互换使用,是指试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型,它们不仅与将要治疗施用的细胞和其他试剂相容,而且适于在合理医学判断范围内以与合理效/险比相当量与人和动物的组织接触使用时无过度毒性、刺激、过敏反应或其他并发症。
关于细胞替代疗法,本文使用了几个术语。术语“自体转移”、“自体移植”、“自体移接”等是指其中细胞供体也是细胞替代疗法的受体的治疗。术语“同种异体转移”、“同种异体移植”、“同种异体移接”等是指其中细胞供体属于与细胞替代疗法的受体相同的物种但不是相同个体的治疗。在其中供体细胞已与受体组织相容性匹配的细胞转移有时被称为同基因转移。术语“异种转移”、“异种移植”、“异种移接”等是指其中细胞供体属于与细胞替代疗法的受体不同的物种的治疗。如本文所用,移植是指向受体中引入自体或同种异体供体细胞替代疗法。
如本文所用,术语“约”在涉及可测量值诸如量、时距等等时,意指涵盖偏离指定值±20%与±0.1%之间,优选地±20%或±10%,更优选地±5%,甚至更优选地±1%,还更优选地±0.1%的变化,因为此类变化适合执行本发明所公开的方法。
说明
涵盖具有不同病因的急性、慢性和进行性障碍和疾病的眼部退行性病症,具有眼部细胞的特异性或易感群体的功能障碍或损失作为共同特征。该共性允许开发修复或再生易感、损伤或损失的眼部组织或细胞的相似治疗方法,其中之一是基于细胞的疗法。眼部退行性病症的细胞疗法的开发受限于相对较少类型的干细胞或祖细胞,包括眼部衍生的干细胞自身(例如,视网膜和角膜干细胞)、胚胎干细胞及一些类型的成体干细胞或祖细胞(例如,神经干细胞、粘膜上皮干细胞和骨髓干细胞)。从产后脐带和胎盘分离的细胞已被鉴定为适合该用途的祖细胞的重要新来源。(US 2005-0037491和US2010-0272803)。此外,由从产后胎盘和脐带组织分离的细胞生成的条件培养基提供了另一种用于治疗眼部退行性病症的新来源。因此,在本文所述的其各种实施方案中,本发明的特征在于用于(修复和再生眼部组织)的方法和药物组合物,这些方法和药物组合物使用来自祖细胞(诸如从产后脐带或胎盘分离的细胞)的条件培养基。本发明适用于眼部退行性病症,但预期特别适合难以做到或无法获得治疗或治愈的多种眼部疾病。这些疾病包括但不限于年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病及其他视网膜病。
根据本领域已知的任何方法,衍生自祖细胞(诸如从产后脐带或胎盘分离的细胞)的条件培养基预期适用于本发明。然而,在一个实施方案中,本发明使用衍生自如上所定义的脐带组织衍生的细胞(hUTC)或胎盘组织衍生的细胞(PDC)的条件培养基,这些细胞衍生自呈现基本上不含血液的脐带组织或胎盘,优选地根据下文所述的方法进行。hUTC或PDC能够在培养中扩增,并且具有分化成其他表型的细胞的潜能。某些实施方案的特征在于由此类祖细胞制备的条件培养基、包含该条件培养基的药物组合物以及使用该药物组合物治疗患有急性或慢性眼部退行性病症的患者的方法。本发明的产后衍生的细胞已通过下列进行表征:其在培养中的生长特性、其细胞表面标记物、其基因表达、其产生某些生化营养因子的能力以及其免疫学特性。衍生自产后衍生的细胞的条件培养基已通过由这些细胞分泌的营养因子进行表征。
细胞的制备
在本发明的组合物和方法中使用的细胞、细胞群和制剂(包含细胞裂解液、条件培养基等等)在本文描述且在美国专利No.7,524,489和No.7,510,873以及美国公布申请No.2005/0058634中详细描述,所述专利各自以引用方式并入本文。根据使用产后细胞的方法,哺乳动物脐带或胎盘是在足月或者早产妊娠结束时或不久之后(例如,胎衣排出之后)回收的。产后组织可在无菌容器(诸如烧瓶、烧杯、培养皿或袋)中从分娩地点运输到实验室。该容器可具有溶液或培养基,包括但不限于盐溶液,诸如达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)或磷酸盐缓冲盐水(PBS),或用于运输用于移植的器官的任何溶液,诸如威斯康星大学溶液(University of Wisconsin solution)或全氟化合物溶液。可将一种或多种抗生素和/或抗真菌剂(诸如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素)添加到培养基或缓冲液中。可用抗凝剂溶液诸如含肝素溶液冲洗产后组织。优选在提取PPDC之前将组织保持在约4-10℃下。甚至更优选在提取UTC之前,组织不进行冷冻。
PPDC的分离优选在无菌环境中发生。脐带可通过本领域已知的方法从胎盘分离。另选地,在不分离的情况下使用脐带和胎盘。血液和碎片优选在PPDC分离前从产后组织中去除。例如,可用缓冲液溶液(诸如但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液)洗涤产后组织。洗涤缓冲液也可包含一种或多种抗真菌剂和/或抗生素,诸如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。
通过机械力(切断力或剪切力)分解包含完整胎盘或脐带或其片段或区段的产后组织。在目前优选的实施方案中,分离工序也利用酶消化过程。许多酶是本领域已知的可用于从复合组织基质分离个体细胞以有利于在培养物中生长。这些酶涵盖了弱消化的(例如脱氧核糖核酸酶和中性蛋白酶、分散酶)至强消化的范围(例如木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)并且是可商购获得的。与本文相容的酶的不详尽列表包括溶解粘液的酶活性材料、金属蛋白酶、中性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶)和脱氧核糖核酸酶。目前优选的是选自金属蛋白酶、中性蛋白酶和溶解粘液的活性材料的酶活性材料。例如,已知胶原酶可用于从组织分离多种细胞。脱氧核糖核酸酶可消化单链DNA并且可在分离期间使细胞凝聚降到最低。优选的方法涉及采用例如胶原酶和分散酶,或胶原酶、分散酶和透明质酸酶的酶处理,并且提供此类方法,其中在某些优选的实施方案中,在解离步骤中使用胶原酶与中性蛋白酶分散酶的混合物。更优选的是这些方法,该方法采用在来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的至少一种胶原酶,以及蛋白酶活性、分散酶和嗜热菌蛋白酶中的任一种的存在下的消化。还更优选的是这样的方法,该方法采用利用胶原酶和分散酶的酶活性两者的消化。还优选的是这样的方法,该方法包括利用除了胶原酶和分散酶活性之外的透明质酸酶活性的消化。技术人员将认识到,本领域已知用于从多种组织来源分离细胞的多种此类酶处理。例如,LIBERASETM Blendzyme 3(Roche)系列酶组合适用于本发明方法。酶的其他来源是已知的,并且技术人员还可从它们的天然来源直接获得此类酶。技术人员也拥有齐全的设备,可评价新的或附加的酶或酶组合在分离本发明细胞方面的用途。优选的酶处理为0.5、1、1.5或2小时长或更长。在其他优选的实施方案中,在解离步骤的酶处理期间在37℃下温育组织。
在本发明的一些实施方案中,将产后组织分成包含组织的多个部分(例如诸如新生儿、新生儿/母体、以及胎盘的母体部分)的区段。然后,根据本文所述的方法通过机械和/或酶解离来解离分离的部分。新生儿或母体谱系细胞可通过本领域已知的任何方法(例如,通过针对Y染色体的核型分析或原位杂交)来鉴定。
分离的细胞或从中生长出PPDC的产后组织可用于引发或接种细胞培养物。将分离的细胞转移到无菌组织培养瓶中,所述无菌组织培养瓶未涂布或涂布有细胞外基质或配体,诸如层粘连蛋白、胶原(天然、变性或交联)、明胶、纤连蛋白和其他细胞外基质蛋白。将PPDC培养于能够维持细胞生长的任何培养基中,所述培养基诸如但不限于DMEM(高或低葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB 201、伊格尔基本培养基(Eagle's basal medium)、Ham’s F10培养基(F10)、Ham’s F-12培养基(F12)、伊思考夫改良达尔贝科培养基(Iscove'smodified Dulbecco's medium)、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和cellgro FREETM。培养基可补充有单独或组合的一种或多种组分,包括例如胎牛血清(FBS),优选地约2-15%(v/v);马血清(ES);人血清(HS);β-巯基乙醇(BME或2-ME),优选地约0.001%(v/v);一种或多种生长因子,例如血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白细胞抑制因子(LIF)和促红细胞生成素;氨基酸,包括L-缬氨酸;以及一种或多种控制微生物污染的抗生素和/或抗真菌剂,诸如,青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。培养基优选包含生长培养基(低葡萄糖DMEM、血清、BME和抗生素)。
将细胞以允许细胞生长的密度接种在培养容器中。在优选的实施方案中,细胞在占空气约0至约5体积%的CO2下培养。在一些优选的实施方案中,细胞在占空气约2至约25%的O2下,优选占空气约5至约20%的O2下培养。细胞优选在约25至约40℃下培养,更优选在37℃下培养。细胞优选在培养箱中培养。培养容器中的培养基可以是静止的,也可以例如用生物反应器搅动。PPDC优选在低氧化应激下生长(例如,伴随谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸的添加)。如本文所用,“低氧化应激”指对培养的细胞没有或有较小自由基损伤的条件。
用于选择最适当的培养基、培养基制剂和细胞培养技术的方法是本领域为人们所熟知的,并且在多种来源中描述,包括Doyle等人(编辑),1995,CELL&TISSUE CULTURE:LABORATORY PROCEDURES,John Wiley&Sons,Chichester;以及Ho和Wang(编辑),1991,ANIMAL CELL BIOREACTORS,Butterworth-Heinemann,Boston),所述参考文献以引用的方式并入本文。
培养分离的细胞或组织片段一段足够的时间之后,PPDC将生长出来,这是由于从产后组织迁移或细胞分裂,或者两者均有。在本发明的一些实施方案中,将PPDC传代或取出至分开的培养容器中,所述培养容器含有与初始使用的培养基相同或不同类型的新鲜培养基,细胞群可在所述培养容器中以有丝分裂方式扩增。本发明的细胞可在0代和衰老之间的任何时间点使用。细胞优选传代约3至约25次,更优选传代约4至约12次,并且优选传代10或11次。可进行克隆和/或亚克隆以确认已分离出无性细胞群。
在本发明的一些方面,将存在于产后组织中的不同细胞类型分级成可从其中分离PPDC的亚群。这可使用用于细胞分离的标准技术完成,包括但不限于使用酶处理将产后组织解离为其组分细胞,然后克隆和选择特定细胞类型,例如但不限于基于形态标记物和/或生化标记物进行选择;使所需细胞进行选择性生长(正选择),选择性破坏不需要的细胞(负选择);例如用大豆凝集素根据混合群中不同的细胞凝集性进行分离;冻融方法;利用混合群中的不同的细胞粘附性;过滤;常规离心和区带离心;离心淘析(逆流离心淘析);单位重力分离;逆流分布;电泳;以及荧光激活细胞分选(FACS)。关于克隆选择和细胞分离技术的综述,参见Freshney,1994,CULTURE OF ANIMAL CELLS:A Manual of Basic Techniques,第3版,Wiley-Liss,Inc.,New York,所述参考文献以引用方式并入本文。
更换培养基是必要的,例如,通过小心地从培养皿中抽出培养基(例如用移液器)并且补充新鲜培养基。继续温育直至培养皿中积聚足够数量或密度的细胞。可去除原始外植入组织部分,并且剩余细胞使用标准技术或使用细胞刮刀进行胰蛋白酶化。胰蛋白酶化之后,收集细胞,移至新鲜培养基中并如上温育。在一些实施方案中,胰蛋白酶化后约24小时将培养基更换至少一次以去除任何漂浮的细胞。培养物中剩余的细胞视为PPDC。
可将PPDC冷冻保存。因此,在下文更详细地描述的优选实施方案中,用于自体转移(用于母亲或孩子)的PPDC可源于孩子出生后的适当产后组织,然后冷冻保存以便可在它们以后需要移植的情况下可用。
细胞的特征
本发明的祖细胞诸如PPDC可例如通过下列进行表征:生长特征(例如,群体倍增能力、倍增时间、到衰老的传代数)、核型分析(例如,正常核型、母源谱系或新生儿谱系)、流式细胞术(例如,FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如,用于检测表位)、基因表达谱(例如,基因芯片阵列、聚合酶链反应(例如,逆转录酶PCR、实时PCR和常规PCR))、蛋白质阵列、蛋白质分泌(例如,通过血浆凝固测定法或PDC条件培养基的分析,例如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA))、混合淋巴细胞反应(例如,作为PBMC的刺激的量度),和/或本领域已知的其他方法。
衍生自脐组织的PPDC的示例于2004年6月10日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC,10801University Boulevard,Manassas,VA,20110)并且被指定为如下ATCC登录号:(1)株系名称UMB 022803(P7)被指定为登录号PTA-6067;并且(2)株系名称UMB 022803(P17)被指定为登录号PTA-6068。衍生自胎盘组织的PPDC的示例保藏在ATCC(Manassas,Va.)并且被指定为如下ATCC登录号:(1)株系名称PLA 071003(P8)于2004年6月15日保藏并被指定为登录号PTA-6074;(2)株系名称PLA 071003(P11)于2004年6月15日保藏并被指定为登录号PTA-6075;并且(3)株系名称PLA 071003(P16)于2004年6月16日保藏并被指定为登录号PTA-6079。
在各种实施方案中,PPDC具有下列生长特征中的一种或多种:(1)它们在培养中需要L-缬氨酸用于生长;(2)它们能够在含约5%到至少约20%的氧的气氛中生长;(3)它们在达到衰老之前具有在培养中至少约40次倍增的潜能;以及(4)它们在涂布或未涂布的组织培养容器上贴壁和扩增,其中涂布的组织培养容器包含明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的涂层。
在某些实施方案中,PPDC具有在细胞传代时维持的正常核型。染色体核型分析特别可用于从衍生自胎盘的母体细胞鉴定和区分新生儿细胞。染色体核型分析的方法是本领域技术人员可利用且已知的。
在其他实施方案中,PPDC可通过某些蛋白质的产生进行表征,包括:(1)产生波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少一种;以及(2)产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A,B,C细胞表面标记物中的至少一种,如通过流式细胞术检测的。在其他实施方案中,PPDC可通过下述进行表征:不产生CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR,DP,DQ细胞表面标记物中的至少一种,如通过流式细胞术检测的。特别优选的是产生波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的细胞。
在其他实施方案中,PPDC可通过基因表达进行表征,相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,所述基因表达对于编码以下中的至少一者的基因是提高的:白介素8;浆膜蛋白1;趋化因子(C--X--C基序)配体1(黑色素瘤生长刺激活性,α);趋化因子(C--X--C基序)配体6(粒细胞趋化蛋白2);趋化因子(C--X--C基序)配体3;肿瘤坏死因子、α-诱导蛋白3;C-型凝集素超家族成员2;Wilms瘤1;醛脱氢酶1家族成员A2;肾素;氧化的低密度脂蛋白受体1;智人(Homo sapiens)克隆IMAGE:4179671;蛋白激酶Cζ;假定蛋白DKFZp564F013;卵巢癌中下调的1;以及来自克隆DKFZp547k1113的智人基因。在一个实施方案中,衍生自脐带组织的PPDC可通过基因表达进行表征,相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,所述基因表达对于编码以下中的至少一者的基因是提高的:白介素8;浆膜蛋白1;或趋化因子(C--X--C基序)配体3。在另一个实施方案中,衍生自胎盘组织的PPDC可通过基因表达进行表征,相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,所述基因表达对于编码肾素或氧化的低密度脂蛋白受体1中的至少一者的基因是提高的。
在其他实施方案中,PPDC可通过基因表达进行表征,相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞,所述基因表达对于编码以下中的至少一者的基因是降低的:矮小同源盒2;热休克27kDa蛋白2;趋化因子(C--X--C基序)配体12(基质细胞衍生因子1);弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄,威廉斯-博伊伦综合征);智人mRNA;cDNA DKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022);间充质同源盒2(生长终止特异性同源盒);sine oculis同源盒同源物1(果蝇属);晶体蛋白,αB;形态发生紊乱关联激活因子2;DKFZP586B2420蛋白;类似于neuralin 1;四连接素(纤溶酶原结合蛋白);src同源3(SH3)和富含半胱氨酸的结构域;胆固醇25-羟化酶;runt相关转录因子3;白介素11受体,α;前胶原C-内肽酶增强子;卷曲同源物7(果蝇属);假定基因BC008967;胶原,VIII型,α1;腱生蛋白C(六臂蛋白);易洛魁族同源盒蛋白5;膜铁转运辅助蛋白;整联蛋白,β8;突触小泡糖蛋白2;成神经细胞瘤,抑制瘤变蛋白1;胰岛素样生长因子结合蛋白2,36kDa;智人cDNA FLJ12280fis,克隆MAMMA1001744;细胞因子受体样因子1;钾中间/小电导钙活化通道,亚家族N,成员4;整联蛋白,β7;具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ);sine oculis同源盒同源物2(果蝇属);KIAAI034蛋白;囊泡相关膜蛋白5(肌短蛋白);含EGF腓骨蛋白样细胞外基质蛋白1;早期生长反应因子3;远端缺失同源盒5;假定蛋白FLJ20373;醛酮还原酶家族1,成员C3(3-α羟基类固醇脱氢酶,II型);双糖链蛋白聚糖;具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ);纤连蛋白1;前脑啡肽;整联蛋白,β样1(具有EGF样重复结构域);智人mRNA全长插入cDNA克隆EUROIMAGE 1968422;EphA3;KIAA0367蛋白;尿钠排泄肽受体C/鸟苷酸环化酶C(利尿钠排泄肽受体C);假定蛋白FLJ14054;智人mRNA;cDNA DKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222);BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3样;AE结合蛋白1;以及细胞色素c氧化酶VIIa亚基多肽1(肌肉)。
在其他实施方案中,衍生自脐带组织的PPDC可通过如下进行表征:分泌选自血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4的营养因子。在实施方案中,PPDC可通过如下进行表征:分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、I309、RANTES、MDC和TIMP1中的至少一种。在一些实施方案中,衍生自脐带组织的PPDC可通过如下进行表征:不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1a和VEGF中的至少一种,如通过ELISA检测。在另选的实施方案中,衍生自胎盘组织的PPDC可通过如下进行表征:分泌MCP-l、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1中的至少一种,以及不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、FGF和VEGF中的至少一种,如通过ELISA检测。在另外的实施方案中,PPDC不表达hTERT或端粒酶。
在优选的实施方案中,细胞具有上文列出的生长、蛋白质/表面标记物产生、基因表达或物质分泌特征中的两种或更多种。更优选的是具有这些特征中的三种、四种或五种或更多种的那些细胞。还更优选的是具有这些特征中的六种、七种或八种或更多种的PPDC。目前还更优选的是具有所有上述特征的那些细胞。
在特别优选的实施方案中,这些细胞从基本上不含血液的人脐带组织分离,能够在培养中扩增,不产生CD117或CD45,并且不表达hTERT或端粒酶。在一个实施方案中,该细胞不产生CD117和CD45,并且任选地也不表达hTERT和端粒酶。在另一个实施方案中,该细胞不表达hTERT和端粒酶。在又一个实施方案中,这些细胞从基本上不含血液的人脐带组织分离,能够在培养中扩增,不产生CD117或CD45,并且不表达hTERT或端粒酶,并具有下述特征中的一种或多种:表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90;不表达CD31或CD34;相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞,表达升高水平的白介素8或浆膜蛋白1;以及具有分化的潜能。
在目前优选与本发明多个方面一起使用的细胞中有具有上述特征的产后细胞,并且更具体地是这样的细胞:其中细胞具有正常核型并随传代进行,保持正常核型,并且进一步地,其中细胞表达标记物CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A,B,C中的每一种,其中细胞产生免疫学可检测的对应于所列标记物的蛋白质。还更优选的是这样的细胞:其除了前述之外,不产生对应于标记物CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR,DP,DQ中的任何一种的蛋白,如通过流式细胞术检测。在进一步优选的实施方案中,这些细胞不表达hTERT或端粒酶。
某些具有沿产生各种表型的细胞谱系方向分化的潜能的细胞是不稳定的,并且因此可自发分化。目前优选与本发明一起使用的是不会例如沿神经谱系方向自发分化的细胞。当在生长培养基中生长时,就在其表面上产生的细胞标记物而言,并且就各种基因的表达模式而言,优选的细胞是基本上稳定的,例如,如使用Affymetrix GENECHIP测定的。细胞在传代时,经历多次群体倍增后,例如在它们表面标记物特性方面仍然保持基本恒定。
然而,PPDC的一个特征在于可通过使这些细胞处于诱导分化的细胞培养条件来刻意诱导这些细胞,使之分化成各种谱系表型。在治疗某些眼部退行性病症方面有用的是,可使用本领域已知的一种或多种方法诱导PPDC,使之分化成神经表型。例如,如本文所列举,可将PPDC接种在涂布有层粘连蛋白的烧瓶上,该培养瓶中装有含B27(B27补充物,Invitrogen)、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的Neurobasal-A培养基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.),它们的组合在本文称为神经祖细胞扩增(NPE)培养基。NPE培养基还可补充有bFGF和/或EGF。另选地,可通过以下方式诱导PPDC体外分化:(1)将PPDC与神经祖细胞共培养;或(2)使PPDC在神经祖细胞条件培养基中生长。
PPDC分化成神经表型可由突起延长的双极细胞形态证实。经诱导的细胞群针对巢蛋白的存在的染色可呈阳性。分化的PPDC可通过检测巢蛋白、TuJ1(BIII微管蛋白)、GFAP、酪氨酸羟化酶、GABA,04和/或MBP来评估。在一些实施方案中,PPDC表现出在神经元干细胞形成神经球时能够形成特有的三维体。
细胞群
本发明的另一方面的特征在于祖细胞(诸如产后衍生的细胞或其他祖细胞)的群体。产后衍生的细胞可从胎盘或脐带组织分离。在优选的实施方案中,这些细胞群包含上述PPDC,并且这些细胞群在下面部分中描述。
在一些实施方案中,细胞群是异质的。本发明的异质细胞群可包含至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的细胞。本发明的异质细胞群还可包含祖细胞(产后衍生的细胞),或其他祖细胞,诸如上皮祖细胞或神经祖细胞,或者其还可包含完全分化的细胞。
在一些实施方案中,该群体是基本上同质的,即基本上仅包含PPDC(优选至少约96%、97%、98%、99%或更多细胞)。在一些实施方案中,该细胞群是同质的。在实施方案中,本发明的同质细胞群可包含脐或胎盘衍生的细胞。脐衍生的细胞的同质群体优选地不含母体谱系的细胞。胎盘衍生的细胞的同质群体可为新生儿或母体谱系。同质细胞群可通过本领域已知的任何方法实现,例如通过细胞分选(例如流式细胞术)或通过根据已知的方法的无性扩增。因此,优选的同质PPDC群体可包含产后衍生的细胞的克隆细胞系。当分离具有高度期望功能的细胞克隆时,此类群体是特别有用的。
本文还提供了在一种或多种因子的存在下,或在刺激干细胞沿所需途径(例如,神经、上皮)分化的条件下温育的细胞群。此类因子是本领域已知的,并且技术人员将认识到合适的分化条件的确定可用常规实验实现。此类条件优化可通过统计实验设计和分析来实现,例如响应面分析法允许同时优化例如在生物培养中的多个变量。目前优选的因子包括但不限于诸如以下的因子:生长或营养因子、去甲基化试剂、与神经或上皮谱系细胞的共培养或在神经或上皮谱系细胞条件培养基中的培养,以及本领域已知的其他刺激干细胞沿这些途径分化的条件(有关可用于神经分化的因子,参见例如Lang,K.J.D.等人,2004,J.Neurosci.Res.76:184-192;Johe,K.K.等人,1996,Genes Devel.10:3129-3140;Gottleib,D.,2002,Ann.Rev.Neurosci.25:381-407)。
在本发明的实施方案中,与RGC共培养的hUTC对RGC中的突触形成及神经元存活和增生具有正效应。hUTC与RGC的共培养表现出突触斑数的增加,并且与星形胶质细胞(阳性对照)相当。(图1B至图1D)。
微小兴奋性突触后电流(mEPSC)的测量值表明hUTC影响突触形成。RGC单独地或在hUTC或ASC存在下培养(图1A)。与星形胶质细胞相似,RGC与hUTC的共培养引起了突触事件频率的增加(图1E至图1G,图1F,Kruskal-Wallis检验,p<0.0001,图1G,单因素方差分析,p<0.0001),这与所观察到的突触数的增加(图1B至图1D)相符。hUTC还提高了突触后电流的幅值。与星形胶质细胞一样,hUTC加强了突触活动(图1H、图1I)。mEPSC峰值的波形揭示了在hUTC处理的情况下上升和衰减tau均增加(图1J至图1M)。hUTC诱导了兴奋性突触形成并增强了所培养的RGC中的突触功能。
条件培养基
在一个方面,本发明提供了来自培养的祖细胞诸如产后衍生的细胞或其他祖细胞的条件培养基,以便供如下所述体外和体内使用。使用此类条件培养基允许在患者体内同种异体地使用由细胞分泌的有益营养因子,而不引入可引发排斥或其他不良免疫学应答的完整细胞。可通过在培养基中培养细胞(诸如细胞群),然后从培养基中去除细胞来制备条件培养基。在某些实施方案中,产后细胞是UTC或PDC,更优选hUTC。
由如上所述细胞群制备的条件培养基可按原样、进一步浓缩(通过例如超滤或冻干)或甚至干燥、部分纯化、与本领域已知的药学上可接受的载体或稀释剂组合、或与其他化合物(诸如生物制品,例如药学上有用的蛋白组合物)组合来使用。条件培养基可单独地或例如与自体或同基因活细胞一起在体外或体内使用。如果体内引入条件培养基,可局部地引入到治疗部位处,或引入到治疗部位远侧以向患者提供例如所需的细胞生长因子或营养因子。
此前已证实,人脐带组织衍生的细胞增强了视觉功能并改善了视网膜变性(US2010/0272803)。还已证实,产后衍生的细胞可用于促进感光细胞营救并因此保护了RCS模型中的感光细胞。(US 2010/0272803)。hUTC经视网膜下注入到RCS大鼠眼中提高了视敏度并改善了视网膜变性。此外,用衍生自hUTC的条件培养基(CM)治疗恢复了体外营养不良RPE细胞中ROS的吞噬作用。(US 2010/0272803)。在此,本发明的实施方案公开了此前未知的hUTC促进神经突增生和突触发生的正效应,特别是对于视网膜神经元而言,所述视网膜神经元包括视网膜神经节细胞、感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)、视网膜无长突细胞、水平细胞和双极细胞。
如本文所提供的,制备hUTC条件培养基(UCM)并评价其对视网膜神经节细胞的突触形成、神经元存活和神经突增生的效应。用各种浓度的hUCM培养RGC。突触分析表明,hUCM以浓度依赖性方式诱导了RGC的突触形成,这与星形胶质细胞条件培养基(ACM)相似。(图2B)。UCM对Homer和Bassoon斑数两者都具有正效应。(图2B至图2D、图2J)。
已表明星形胶质细胞能调节突触形成。突触形成的诱导被认为是通过分泌的突触发生分子,诸如血小板反应蛋白、hevin、富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(SPARC)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖、BDNF、TGFβ-1、胆固醇和肝配蛋白。(Clarke,Nature ReviewsNeuroscience,2013;14:311-321;Bolton和Eroglu,Current Opinion in Neurobiology,2009;19:491-497)。在表征本发明的hUCM时,星形胶质细胞和由星形胶质细胞制备的条件培养基有时用作阳性对照。
hUCM还加强了功能性突触,如mEPSC的幅值和频率增加所表明。(图2E至图2N)。除了在hUTC移植之后观察到的功能恢复之外,此前在动物疾病模型中的研究还揭示了这些细胞对神经结构的保护有一定效应(Lund等人,2007,出处同上;Moore等人,Somatosensoryand motor research,2013,30:185-196;Zhang L等人,Brain Research,2012,1489:104-112;Jiang Q等人,PloS One,2012,7:e42845;Zhang L等人,Stroke,2011,42:1437-1444)。使用RGC培养系统时,UCM显示出对突触发生和神经突增生的效应。除了其对突触形成的效应以外,hUCM还在不存在任何其他生长因子(例如BDNF和CTNF)时促进了RGC存活。(图3A至图3E)。
hUCM还增强了RGC神经突增生,如总突起长度、突起数和分支数的增加所证实。(图3F至图3J)。
在本发明的实施方案中,hUTC分泌促进经纯化的RGC之间功能性突触的体外发育的因子。此外,hUTC还支持神经元生长和功能。
细胞修饰、组分和产物
祖细胞(诸如产后细胞,优选PPDC)还可经基因修饰而产生治疗上有用的基因产物,或产生用于治疗肿瘤的抗肿瘤剂。基因修饰可使用多种载体中的任一种实现,所述载体包括但不限于整合型病毒载体,例如逆转录病毒载体或腺相关病毒载体;非整合型复制载体,例如乳头状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体;或复制缺陷型病毒载体。将DNA引入细胞中的其他方法包括使用脂质体、电穿孔、粒子枪或通过直接DNA注射。
优选地使用由一种或多种适当表达控制元件和选择性标记物控制的或与其有效连接的DNA转化或转染宿主细胞,所述一种或多种适当表达控制元件例如启动子或增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等等。可使用任何启动子驱动插入基因的表达。例如,病毒启动子包括但不限于CMV启动子/增强子、SV40、乳头状瘤病毒、EB病毒或弹性蛋白基因启动子。在一些实施方案中,用于控制感兴趣的基因的表达的控制元件能够允许基因的调控表达,使得仅在体内需要时才合成产物。如果瞬时表达是所需的,则优选地在非整合型和/或复制缺陷型载体中使用组成型启动子。另选地,在必要时可使用诱导型启动子来驱动插入基因的表达。诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白和热休克蛋白相关的启动子。
外来DNA引入之后,可允许工程化的细胞在富集培养基中生长,然后转换到选择培养基。外来DNA中选择性标记物赋予选择抗性,并且允许细胞将例如质粒上的外来DNA稳定整合到其染色体中并长成集落,继而可克隆和扩增成细胞系。该方法可有利地用于使表达基因产物的细胞系工程化。
细胞可经基因工程化而“敲除”或“敲低”促使植入位点发炎或排斥的因子的表达。下文将讨论用于降低靶基因表达水平或靶基因产物活性水平的负调节技术。如本文所用,“负调节”指相对于不进行调节处理时的靶基因产物的水平和/或活性,靶基因产物的水平和/或活性降低。来自神经元或胶质细胞的基因的表达可使用多种技术(包括例如通过使用同源重组技术使基因失活的表达抑制)来降低或敲除。通常,在编码蛋白质重要区域的外显子(或该区域5’的外显子)中插入阳性选择性标记物(例如neo),从而防止由靶基因产生正常mRNA并导致基因失活。还可通过在基因的一部分引入缺失,或通过删除整个基因,而使基因失活。通过使用具有在基因组中相距很远的与靶基因同源的两个区域的构建体,可将介于两个区域之间的序列删除(Mombaerts等人,1991,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88:3084-3087)。反义DNA酶、核糖酶、小干扰RNA(siRNA)、以及抑制靶基因表达的其他此类分子也可用于降低靶基因活性水平。例如,已证实抑制主要组织相容性基因复合物(HLA)的表达的反义RNA分子对于免疫应答而言是最通用的。另外,可使用三螺旋分子降低靶基因活性水平。这些技术由以下文献详述:L.G.Davis等人(编辑),1994,BASIC METHODS IN MOLECULARBIOLOGY,第2版,Appleton&Lange,Norwalk,CT。
在其他方面,本发明提供由下述制备的细胞裂解液和细胞可溶性级分:产后干细胞(优选PPDC)、或者包含PPDC的异质或同质细胞群、以及已经基因修饰或已被刺激沿神经源性途径分化的PPDC或其群体。此类细胞裂解液及其级分具有许多效用。例如,在体内使用细胞裂解液可溶性级分(即,基本上不含膜)有益于在患者体内同种异体地使用胞内环境而不引入大量最易引发排斥或其他不良免疫学应答的细胞表面蛋白。裂解细胞的方法是本领域熟知的,包括机械破碎、酶分解或化学分解或它们的组合等多种手段。此类细胞溶解物可直接由在其生长培养基中的细胞制备(因此包含分泌的生长因子等),或可由在例如PBS或其它溶液中洗涤的不含培养基的细胞制备。如果优选的,可将洗涤的细胞以大于初始群体密度的浓度重悬。
在一个实施方案中,如通过破碎细胞而不进行随后的细胞级分的分离来制备全细胞裂解液。在另一个实施方案中,细胞膜级分通过本领域已知的常规方法(例如离心、过滤或类似方法)分离自细胞的可溶性级分。
由祖细胞(诸如产后衍生的细胞)群制备的细胞裂解液或细胞可溶性级分可按原样、进一步浓缩(通过例如超滤或冻干、或甚至干燥)、部分纯化、与本领域已知的药学上可接受的载体或稀释剂组合、或与其他化合物(诸如生物制品,例如药学上有用的蛋白组合物)组合来使用。细胞裂解液或其级分可单独在体外或体内,或例如与自体或同基因活细胞一起使用。如果在体内引入,可将裂解液局部地引入到治疗部位处,或引入到治疗部位远侧以向患者提供例如需要的细胞生长因子。
在另一个实施方案中,可在体外培养产后细胞(优选PPDC)以产生高收率的生物产物。例如,天然产生所关注的特定生物产物(例如营养因子),或者已经基因工程化以产生生物产物的此类细胞可使用本文所述的培养技术来无性扩增。另选地,细胞可在诱导分化成所需谱系的培养基中扩增。在每种情况下,通过细胞产生并分泌到培养基中的生物产物可使用标准分离技术(如诸如举例来说差异蛋白沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、电泳和HPLC)容易地从条件培养基分离。为了利用流动进料方法(例如,体外三维培养),可使用“生物反应器”。实质上,使新鲜培养基通过三维培养,从培养物中洗出且然后可如上所述从流出物分离生物产物。
作为另外一种选择,所关注的生物产物可保持在细胞内,因此,其收集可能需要如上所述的溶解细胞。然后可使用上文所列技术中的任何一种或多种来纯化生物产物。
在另一个实施方案中,制备、收集和利用胞外基质(ECM)作为将活细胞植入到需要组织修复或替换的受试者中的替代方案,该ECM通过在液体、固体或半固体基底上培养产后细胞(优选PPDC)产生。在使得期望量的ECM分泌到框架上的条件下,将这些细胞在如本文其他地方描述的三维框架上体外培养。去除这些细胞及框架,并且处理ECM以用于进一步使用,例如作为可注射的制剂。为了实现这个目的,要将框架上细胞杀死并且从框架上去除任何细胞碎片。这个过程可以许多不同方式进行。例如,可将活组织在液氮中快速冷冻而不低温保存,或可将组织浸入无菌蒸馏水中,使得细胞由于渗透压而破裂。
一旦杀死细胞,细胞膜可能破碎,并且通过用温和去垢剂(诸如EDTA、CHAPS或两性离子去垢剂)冲洗进行处理来去除细胞碎片。作为另外一种选择,组织可经酶消化和/或用分解细胞膜的试剂提取并去除细胞内容物。此类酶的示例包括但不限于透明质酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶。去垢剂的示例包括非离子去垢剂,诸如,烷芳基聚醚醇(TRITON X-100)、辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇(Rohm and Haas Philadelphia,Pa.)、BRIJ-35、聚乙氧基乙醇月桂基醚(Atlas Chemical Co.,San Diego,Calif.)、聚山梨醇酯20(TWEEN 20)、聚乙氧基乙醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Rohm and Haas)、聚乙烯月桂基醚(Rohm and Haas);以及离子去垢剂,诸如十二烷基硫酸钠、硫酸化高级脂肪醇、在支链或非支链上包含7至22个碳原子的磺化烷烃和磺化烷基芳烃。
可以多种方式实现ECM的收集,具体取决于例如是否已经在三维框架上形成新组织,所述三维框架是可生物降解的或不可生物降解的。例如,如果框架是不可生物降解的,ECM可通过使框架经受超声、高压水射、机械刮擦或用去垢剂或酶温和处理、或上述方法的任何组合去除。
如果框架是可生物降解的,ECM可例如通过使框架降解或溶解在溶液中收集。作为另外一种选择,如果可生物降解的框架由其自身可与ECM一起注射的材料构成,则框架和ECM可针对随后的注射一起处理。作为另外一种选择,针对从不可生物降解的框架收集ECM,可通过上文所述的任何方法将ECM从可生物降解的框架去除。优选地设计所有收集过程以免使ECM变性。
在收集ECM之后,可将它进一步处理。例如,可使用本领域熟知的技术(诸如通过超声)将ECM匀化成细粒,使得其可通过外科针。如果需要,也可通过γ照射交联ECM的组分。优选地,可在0.25至2兆拉德之间照射ECM以灭菌和交联ECM。使用试剂(其是有毒的,诸如戊二醛)的化学交联是可以的,但一般不是优选的。
可通过将由本发明细胞产生的ECM与一种或多种其它细胞类型的ECM混合来调节蛋白质(诸如存在于ECM中的多种胶原类型)的量和/或比率。此外,生物活性物质诸如蛋白质、生长因子和/或药物可结合到ECM中。示例性生物活性物质包括组织生长因子诸如TGF-β等,其促进注射部位处的治愈和组织修复。此类添加剂可用于上文所述的任何实施方案中,如由这些细胞产生的全细胞裂解液、可溶性细胞级分、或进一步纯化的组分和产物。
药物组合物
在另一方面,本发明在用于治疗眼部退行性病症的各种方法中提供了药物组合物,所述药物组合物使用非胚胎性干细胞诸如产后细胞(优选PPDC)、其细胞群、由此类细胞产生的条件培养基以及由此类细胞产生的细胞组分和产物。某些实施方案涵盖包含活细胞(单独或与其他细胞类型混合的PPDC)的药物组合物。其他实施方案涵盖包含PPDC条件培养基的药物组合物。另外的实施方案可使用PPDC的细胞组分(例如细胞裂解液、可溶性细胞级分、ECM或前述任何的组分)或产物(例如由这些细胞天然产生或通过基因修饰产生的营养因子和其他生物因子、培养这些细胞所得到的条件培养基)。在任一种情况下,药物组合物还可包含其他活性剂,诸如本领域已知的抗炎剂、抗细胞凋亡剂、抗氧化剂、生长因子、神经营养因子或神经再生、神经保护或眼用药物。
可被添加到药物组合物中的其它组分的示例包括但不限于:(1)其他神经保护或神经有益药物;(2)选择的胞外基质组分,诸如本领域已知的一种或多种胶原类型、和/或生长因子、富血小板血浆、以及药物(另选地,PPDC可经基因工程化以表达和产生生长因子);(3)抗细胞凋亡剂(例如,促红细胞生成素(EPO)、EPO模拟体、促血小板生成素、胰岛素样生长因子(IGF)-I、IGF-II、肝细胞生长因子、半胱天冬酶抑制剂);(4)抗炎化合物(例如,p38MAP激酶抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类、IL-6和IL-1抑制剂、吡嘧司特、曲尼司特、瑞米凯德、西罗莫司和非甾体抗炎药(NSAIDS)(诸如替泊沙林、托美汀和舒洛芬);(5)免疫抑制或免疫调节剂,诸如钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗增殖剂、皮质类固醇和各种抗体;(6)抗氧化剂,诸如普罗布考、维生素C和E、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸;以及(6)局部麻醉剂,仅举几例。
本发明的药物组合物包含用药学上可接受的载体或培养基配制的祖细胞,诸如产后细胞(优选PPDC)、由这些细胞生成的条件培养基或它们的组分或产物。合适的药学上可接受的载体包括水、盐溶液(诸如林格氏溶液(Ringer’s solution))、醇、油、明胶、和碳水化合物(诸如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯基吡咯烷。可将此类制剂灭菌,并且如果需要,将其与辅助剂(诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂和着色剂)混合。通常,但非排他性地,将包含细胞组分或产物但不包含活细胞的药物组合物配制为液体。通常将包含PPDC活细胞的药物组合物配制为液体、半固体(例如凝胶)或固体(例如,如对于眼组织工程化适当的基质、支架等等)。
药物组合物可包含药物化学家或生物学家所熟悉的辅助组分。例如,它们可包含根据所使用的抗氧化剂种类而变化的范围内的抗氧化剂。常用抗氧化剂的合理范围为约0.01%至约0.15%容重的EDTA、约0.01%至约2.0%容重的亚硫酸钠以及约0.01%至约2.0%容重的焦亚硫酸钠。本领域技术人员可使用上述每一者的约0.1%容重的浓度。其他代表性化合物包括巯丙酰甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸、β-巯基乙胺、谷胱甘肽和类似物质,但也可采用适用于眼部施用的其他抗氧化剂,例如抗坏血酸及其盐或亚硫酸盐或焦亚硫酸钠。
缓冲剂可用于将滴眼剂制剂的pH保持在约4.0至约8.0的范围内;以便最大程度减轻对眼睛的刺激。对于直接玻璃体内或眼内注射,制剂应处于pH 7.2至7.5,优选地处于pH7.3-7.4。眼用组合物还可包含适于向眼睛施用的张度剂。合适的张度剂包括使制剂大致与0.9%盐水溶液等渗的氯化钠。
在某些实施方案中,用增粘剂配制药物组合物。示例性增粘剂是羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。药物组合物可具有根据需要添加的助溶剂。合适的助溶剂可包括甘油、聚乙二醇(PEG)、聚山梨醇酯、丙二醇和聚乙烯醇。还可包含防腐剂,例如苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、乙酸苯汞或硝酸苯汞、硫柳汞、或对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
注射用制剂优选地被设计成一次性施用,并且不含有防腐剂。注射溶液应具有相当于0.9%氯化钠溶液的等渗性(290-300毫渗摩尔的渗透压度)。这可通过添加氯化钠或上列的其他助溶剂、或上列的赋形剂诸如缓冲剂和抗氧化剂来实现。
眼睛的前房组织浸没于房水中,而视网膜持续暴露于玻璃体。这些液体/凝胶以一种高度还原的氧化还原态存在,因为其包含抗氧化剂化合物和酶。因此,在眼用组合物中包含还原剂可能是有利的。合适的还原剂包括N-乙酰半胱氨酸、抗坏血酸或盐形式,以及亚硫酸钠或焦亚硫酸钠,其中抗坏血酸和/或N-乙酰半胱氨酸或谷胱甘肽特别适用于可注射溶液。
可采用本领域已知的若干递送方式中的一种或多种,将包含细胞或条件培养基、或者细胞组分或细胞产物的药物组合物递送到患者的眼睛。在可适用于一些情况的一个实施方案中,可采用滴眼剂或洗液的方式将所述组合物局部地递送到眼睛。在另一个实施方案中,可通过定期眼内注射或通过灌洗溶液诸如BSS或BSS PLUS(Alcon USA,Fort Worth,Tex.)的输注,将所述组合物递送到眼内的各个位置。另选地,可将所述组合物以本领域内技术人员已知的其他眼科剂型施用,诸如预形成或原位形成的凝胶或脂质体,例如如授予Herrero-Vanrell的美国专利No.5,718,922中所公开的那样。在另一个实施方案中,可通过接触镜片(例如Lidofilcon B、Bausch&Lomb CW79或DELTACON(Deltafilcon A))或暂时停留在眼睛表面上的其他物体,将所述组合物递送到或透过需要治疗的眼睛的晶状体。在其他实施方案中,可采用诸如胶原角膜防护物(例如,BIO-COR可溶解的角膜防护物,SummitTechnology,Watertown,Mass.)的支持物。还可通过来自渗透泵(ALZET,Alza Corp.,PaloAlto,Calif.)的插管或通过定时释放的胶囊(OCCUSENT)或可生物降解片(OCULEX,OCUSERT)的植入,从而以输注方式将所述组合物施用到眼球中。这些施用途径的优点在于为眼睛提供了连续的药物组合物供给。这可有利于对角膜的局部递送。
包含在半固体或固体载体中的活细胞的药物组合物通常配制用于在眼部损伤或损坏的部位处的外科植入。应当理解,液体组合物也可通过外科手术施用,例如条件培养基。在特定的实施方案中,半固体或固体药物组合物可包含半渗透性凝胶、晶格、细胞支架等,它们可以是不可生物降解的或可生物降解的。例如,在某些实施方案中,可能期望或合适的是将外源细胞与它们的周围环境隔离,仍允许细胞将生物分子分泌和递送到周围细胞。在这些实施方案中,可将细胞配制为自主植入物,所述自主植入物包含由不可降解的、可选择性渗透的阻隔包围的活PPDC或含有PPDC的细胞群,所述阻隔可使移植细胞与宿主组织物理分离。有时将此类植入物称为“免疫保护的”,因为在不存在药物诱导的免疫抑制的情况下,它们具有防止免疫细胞和大分子受到移植细胞杀伤的能力(关于此类装置和方法的综述参见如P.A.Tresco等人,2000,Adv.Drug Delivery Rev.42:3-27)。
在其它实施方案中,本发明的药物组合物利用了不同种类可降解的凝胶和网状物。例如,特别适于持续释放制剂的可降解的材料包括生物相容性聚合物,诸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原等等。可降解的聚合物的结构、选择和在药物递送媒介物中的用途已在多个公布中综述,包括A.Domb等人,1992,Polymers forAdvanced Technologies 3:279-291。授予Wong等人的美国专利No.5,869,079公开了在可生物降解的缓释眼科植入物中亲水和疏水实体的组合。此外,授予Guo等人的美国专利No.6,375,972、授予Chen等人的美国专利No.5,902,598、授予Wong等人的美国专利No.6,331,313、授予Ogura等人的美国专利No.5,707,643、授予Weiner等人的美国专利No.5,466,233和授予Avery等人的美国专利No.6,251,090各自描述了可用来递送药物组合物的眼内植入装置和系统。
在其他实施方案中,例如,为了修复神经损伤,诸如受损或切断的视神经,可能期望或合适的是将细胞递送在可生物降解的,优选地生物吸收性或可生物吸收的支架或基质上或其中。通常,这些三维生物材料包含附着到支架、分散于支架内、或结合在细胞外基质中的活细胞,所述细胞外基质夹带在支架中。一旦植入身体的靶区域内,这些植入物就与宿主组织整合,其中所述移植细胞逐渐建立(参见例如,P.A.Tresco等人,2000,出处同上;另参见D.W.Hutmacher,2001,J.Biomater.Sci.Polymer Edn.12:107-174)。
可用于本发明的支架或基质(有时统称为“框架”)材料的示例包括非织造垫、多孔泡沫或自组装肽。例如,可使用由以商品名VICRYL(Ethicon,Inc.,Somerville,N.J)销售的合成的可吸收的乙醇酸和乳酸共聚物(PGA/PLA)构成的纤维来形成非织造垫。还可利用由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物构成的泡沫,其通过如美国专利No.6,355,699中讨论的方法诸如冷冻干燥法或冻干法形成。也可使用水凝胶诸如自组装肽(例如RAD16)。原位形成的可降解网络也适用于本发明(参见例如,Anseth,K.S.等人,2002,J.Controlled Release 78:199-209;Wang,D.等人,2003,Biomaterials 24:3969-3980;授予He等人的美国专利公布2002/0022676)。这些材料可配制成适于注射的流体,然后可通过多种方式(如,改变温度、pH、暴露于光)诱导其原位形成或体内形成可降解的水凝胶网络。
在另一个实施方案中,所述框架是毡,其可由可生物吸收的材料(例如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物、或透明质酸)所制成的复丝纱线构成。使用由卷曲、切割、梳理和针刺组成的标准纺织加工技术,将所述纱线制成毡。在另一个实施方案中,将细胞接种到泡沫支架,所述泡沫支架可以是复合结构。
在多个上述实施方案中,可将框架模制成有用的形状。此外,应当理解,例如以对应于用于制备含成纤维细胞的GDC血管内线圈的方式,可在预成形的、不可降解的外科的或植入式的装置上培养PPDC,例如(Marx,W.F.等人,2001,Am.J.Neuroradiol.22:323-333)。
为了加强细胞附着,可在接种细胞之前处理基质、支架或装置。例如,在接种之前,可用0.1摩尔乙酸处理尼龙基质,并且在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中温育以涂布尼龙。可类似地使用硫酸处理聚苯乙烯。还可对框架的外表面进行改性以改善细胞的附着性或生长和组织分化,例如通过等离子涂布框架或添加一种或多种蛋白质(如,胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(如,硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素)、细胞基质和/或其他材料,例如但不限于明胶、海藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物树胶等等。
根据本领域已知的方法制备包含活细胞的框架。例如,可使细胞在培养瓶中自由生长至亚汇合或汇合状态,然后将其与培养物分离并接种到框架上。如果需要,可在接种细胞之前、期间或之后向培养基添加生长因子以触发分化和组织形成。另选地,可修饰框架本身,使得增强在其上的细胞生长,或使得降低植入物的排斥风险。因此,一种或多种生物学活性化合物(包括但不限于抗炎剂、免疫抑制剂或生长因子)可加入框架中用于局部释放。
使用方法
可以多种方式使用祖细胞,诸如产后细胞(优选hUTC或PDC)、或其细胞群、或由此类细胞产生的条件培养基或其他组分或产物,以支持和促进眼部细胞和组织的修复和再生。此类用途包括体外、离体和体内方法。下文所述的方法涉及PPDC,但其他祖细胞也可适用于这些方法。
体外和离体方法
在一个实施方案中,可在体外使用祖细胞诸如产后细胞(优选hUTC或PDC)及由其生成的条件培养基,针对药物制剂、生长因子、调节因子等等的有效性和细胞毒性来筛选多种多样的化合物。例如,可对PPDC的基本上同质的群体进行该筛选,以评估在治疗眼部病症时要与PPDC一起配制或共同施用的候选化合物的功效或毒性。另选地,可对已被刺激分化成眼睛中所存在的细胞类型或其祖细胞的PPDC进行该筛选,以便评价新候选药物的功效。在该实施方案中,体外维持PPDC,并使其暴露于待测试的化合物。潜在细胞毒性化合物的活性可通过其损伤或杀伤培养中的细胞的能力来测量。这可易于通过活体染色技术来评估。
如上所述,可在体外培养PPDC来产生生物产物,所述生物产物由细胞天然产生、或由细胞在被诱导分化成其他谱系时产生,或者由细胞经由基因修饰产生。例如,已发现从生长于生长培养基中的脐衍生的细胞分泌TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8。脐衍生的细胞还分泌血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2和血小板反应蛋白-4。已发现,从培养于生长培养基中的胎盘衍生的PPDC分泌TIMP1、TPO、KGF、HGF、HBEGF、BDNF、MIP1a、MCP-1、RANTES、TARC、嗜酸细胞活化趋化因子和IL-8(参见实施例)。
就这一点而言,本发明的实施方案的特征在于使用PPDC产生条件培养基。由PPDC产生条件培养基可以来自未分化的PPDC,或来自在刺激分化的条件下温育的PPDC。例如,设想此类条件培养基用于在体外或离体培养上皮或神经前体细胞,或用于在体内支持移植的细胞,所述移植的细胞包含PPDC的同质群体或含PPDC和其他祖细胞的异质群体。
来自PPDC的细胞裂解液、可溶性细胞级分或组分、或者ECM或其组分可用于多种目的。如上所述,这些组分中的一些可在药物组合物中使用。在其他实施方案中,细胞裂解液或ECM在此类治疗过程中用于涂布(或换句话讲处理)将要用于外科、或用于植入、或用于离体目的的物质或装置,以促进所接触细胞或组织的治愈或存活。
如实施例12和14中所述,当在与成体神经祖细胞的共培养中生长时,PPDC展示出能够支持这些成体神经祖细胞的存活、生长和分化。同样,此前的研究表明,PPDC可经由营养机制发挥作用,以支持视网膜的细胞。(US2010-0272803)。因此,PPDC有利地用于体外共培养中,以向其他细胞,特别是神经细胞及神经和眼部祖细胞(例如,神经干细胞及视网膜或角膜上皮干细胞)提供营养支持。对于共培养,可能期望的是PPDC和期望的其他细胞能够在此两种细胞类型接触的条件下共培养。这可例如通过将细胞以异质细胞群接种到培养基中或接种到合适培养基底上来实现。另选地,首先可使PPDC生长至汇合状态,然后其在培养中将对第二期望的细胞类型起到基底作用。在这后一实施方案中,细胞还可如通过膜或类似装置经物理分离,使得其它细胞类型可被去除和独立使用,然后是共培养时期。共培养中使用PPDC来促进神经或眼部细胞类型的扩增和分化,可适用于科研和临床/治疗领域。例如,PPDC共培养可用于在培养中有利于此类细胞的生长和分化,例如用于基础科研目的或用于药物筛选试验。PPDC共培养还可用于神经或眼部祖细胞的离体扩增以供后续施用,从而达到治疗目的。例如,可从个体收获神经或眼部祖细胞,将它们在与PPDC共培养中离体扩增,然后转到该个体(自体转移)或另一个个体(同基因或同种异体转移)。在这些实施方案中,应当理解,离体扩增之后,可将包含PPDC和祖细胞的混合细胞群施用到需要治疗的患者。另选地,自体转移是合适或期望的情况下,可在培养中物理地分离共培养的细胞群,使得能够取出自体祖细胞以向患者施用。
体内方法
如实施例中所述,祖细胞(PPDC)或由此类细胞生成的条件培养基可有效地用于治疗眼部退化性病症。一旦植入眼睛中的靶位置内,祖细胞(诸如PPDC)或来自祖细胞的条件培养基就为眼部细胞(包括神经元细胞)原位提供营养支持。
祖细胞(PPDC)、来自祖细胞的条件培养基可与以下物质一起施用:本领域已知的其他有益药物,生物分子诸如生长因子、营养因子、条件培养基(来自祖细胞或分化的细胞培养物),或其他活性剂诸如抗炎剂、抗细胞凋亡剂、抗氧化剂、生长因子、神经营养因子或者神经再生或神经保护药物。当将条件培养基与其他试剂一起施用时,它们可与其他试剂在单个药物组合物中一起,或在分离的药物组合物中同时或顺序(在其他试剂施用之前或之后)施用。
可与祖细胞(诸如PPDC)和条件培养基产物一起施用的其他组分的示例包括但不限于:(1)其他神经保护或神经有益药物;(2)选择的胞外基质组分,诸如本领域已知的一种或多种胶原类型、和/或生长因子、富血小板血浆、以及药物(另选地,这些细胞可经基因工程化以表达和产生生长因子);(3)抗细胞凋亡剂(例如,促红细胞生成素(EPO)、EPO模拟体、促血小板生成素、胰岛素样生长因子(IGF)-I、IGF-II、肝细胞生长因子、半胱天冬酶抑制剂);(4)抗炎化合物(例如,p38MAP激酶抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类、IL-6和IL-I抑制剂、吡嘧司特、曲尼司特、瑞米凯德、西罗莫司和非甾体抗炎药(NSAIDS)(诸如替泊沙林、托美汀和舒洛芬);(5)免疫抑制或免疫调节剂,诸如钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗增殖剂、皮质类固醇和各种抗体;(6)抗氧化剂,诸如普罗布考、维生素C和E、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸;以及(6)局部麻醉剂,仅举几例。
可将液体或流体药物组合物施用到眼睛中更普遍的位置(例如,局部或眼内)。
其他实施方案涵盖通过施用药物组合物来治疗眼部退行性病症的方法,所述药物组合物包含来自祖细胞(诸如PPDC)的条件培养基、或这些细胞天然产生的或通过这些细胞的基因修饰产生的营养因子和其他生物因子。同样,这些方法还可包括施用其他活性剂,诸如本领域已知的生长因子、神经营养因子或者神经再生或神经保护药物。
根据良好的医疗实践,考虑到各个患者的条件(例如眼部退行性病症的性质和程度、年龄、性别、体重和一般医疗条件、以及执业医生已知的其他因素),开发了施用来自祖细胞(诸如PPDC)的条件培养基或本文所述其他药物组合物中任一种的剂型和剂量方案。因此,通过这些本领域已知的考虑因素确定向患者施用的药物组合物的有效量。
可能期望或合适的是在开始细胞疗法之前药理上抑制患者的免疫反应。如上所述,这可通过使用全身或局部免疫抑制剂实现,或其可通过在胶囊包封装置中递送细胞实现。用于降低或消除对移植的细胞的免疫应答的这些和其他方法是本领域已知的。作为替代形式,条件培养基可由经基因修饰而减少其免疫原性的PPDC制备,如上所述。
可通过使用多种扫描技术(例如计算机轴向断层摄影术(CAT或CT)扫描、磁性共振成像(MRI)或正电子发射断层摄影术(PET)扫描),来测定移植的细胞在活患者内的存活。移植物存活的测定也可在死后通过取出组织且用肉眼检查或通过显微镜检查来完成。另选地,可使用对神经或眼部细胞或其产物(例如神经递质)具有特异性的染料来处理细胞。也可通过先前的示踪染料(诸如若丹明或荧光素标记的微球体、固蓝、铁微粒、双苯甲酰胺或基因引入报道基因产物,诸如β-半乳糖苷酶或β-葡糖苷酸酶)的结合来鉴定移植的细胞。
可通过检查受损或病变的眼部功能的恢复,来评估移植的细胞或条件培养基向受试者眼部组织的功能整合。例如,可通过视敏度的改善和对异常的评价及立体彩色眼底照相的分级,来确定在治疗黄斑病变或其他视网膜病时的有效性。(年龄相关眼病研究科研小组(Age-Related Eye Disease Study Research Group)、NEI、NIH,AREDS Report No.8,2001,Arch.Ophthalmol.119:1417-1436)。
试剂盒和储库
在另一方面,本发明在如上所述用于眼部再生和修复的各种方法中提供了试剂盒,所述试剂盒利用祖细胞诸如PPDC和细胞群、由这些细胞(优选地由PPDC)制备的条件培养基,以及其组分和产物。在用于眼部退行性病症的治疗或其他计划的治疗的情况下,试剂盒可包含一种或多种细胞群或条件培养基,包括至少产后细胞或衍生自产后细胞的条件培养基,及药学上可接受的载体(液体、半固体或固体)。试剂盒也可任选地包括施用细胞和条件培养基的方式,例如通过注射。试剂盒还可包括细胞和条件培养基的使用说明。针对野战医院用途(诸如军事用途)制备的试剂盒可包括整个手术的供应(包括组织支架、外科缝合线等),其中可使用细胞或条件培养基辅助修复急性损伤。用于如本文所述的测定和体外方法的试剂盒可含有例如下述中的一种或多种:(1)PPDC或其组分,或者PPDC的条件培养基或其他产物;(2)用于实践体外方法的试剂;(3)视情况而定的其他细胞或细胞群;以及(4)用于执行体外方法的说明书。
在又一方面,本发明还提供了本发明的组织、细胞、细胞群、条件培养基和细胞组分的入库。如上所述,这些细胞和条件培养基易于冷冻保存。因此本发明提供了将细胞冷冻保存在储库中的方法,在储库中这些细胞被冷冻保存,并且与基于细胞的免疫学、生化和遗传特性的细胞的完全表征相关联。可将冷冻的细胞解冻并扩增或直接用于自体、同基因或同种异体疗法,具体取决于该程序的要求和患者的需求。优选地,将有关每种冷冻保存的样品的信息存储在计算机中,然后可基于外科医生、程序和患者的要求来搜索该信息,其中合适的匹配是依据这些细胞或群体的表征进行的。优选地,使本发明的细胞生长和扩增到所需的细胞数量,并且在基质或支持物存在或不存在下单独地或以共培养方式制备治疗性细胞组合物。虽然对于一些应用而言,可能优选的是使用新鲜制备的细胞,但其余细胞可冷冻保存并通过以下方式入库:将细胞冷冻,并且在计算机中输入信息以使计算机登记项与样品相关联。即使对于免疫学目的而言不需要此类细胞的来源或供体与受体相匹配,储库系统也会使得例如入库的细胞的所需生化或遗传特性与治疗需求相匹配变得容易。在所需特性与入库的样品相匹配时,样品被取回并制备用于治疗用途。如本文所述制备的细胞裂解液、ECM或细胞组分也可冷冻保存或以其他方式保存(例如,通过冻干)并可根据本发明进行入库。
提供以下实施例来更详细描述本发明。这些实施例旨在说明而非限制本发明。
以下缩写可出现于实施例中及本说明书和权利要求书的其他地方:ANG2(或Ang2),促血管生成素2;APC,抗原递呈细胞;BDNF,脑衍生神经营养因子;bFGF,碱性成纤维细胞生长因子;bid(BID),“bis in die”(每日两次);CK18,细胞角蛋白18;CNS,中枢神经系统;CNTF,睫状神经营养因子;CXC配体3,趋化因子受体配体3;DMEM,达尔贝科基本必需培养基;DMEM:lg(或DMEM:Lg、DMEM:LG),低葡萄糖DMEM;EDTA,乙二胺四乙酸;EGF(或E),表皮生长因子;FACS,荧光激活细胞分选;FBS,胎牛血清;FGF(或F),成纤维细胞生长因子;GBP,加巴喷丁;GCP-2,粒细胞趋化蛋白-2;GDNF,胶质细胞源性神经营养因子;GF AP,胶质原纤维酸性蛋白;HB-EGF,肝素结合表皮生长因子;HCAEC,人冠状动脉内皮细胞;HGF,肝细胞生长因子;hMSC,人间充质干细胞;HNF-1α,肝细胞特异性转录因子;HVVEC,人脐静脉内皮细胞;I309,趋化因子及CCR8受体的配体;IGF-l,胰岛素样生长因子1;IL-6,白介素-6;IL-8,白介素8;K19,角蛋白19;K8,角蛋白8;KGF,角质细胞生长因子;LIF,白血病抑制因子;MBP,髓鞘碱性蛋白;MCP-l,单核细胞趋化蛋白1;MDC,巨噬细胞衍生趋化因子;MIPlα,巨噬细胞炎性蛋白1α;MIP1β,巨噬细胞炎性蛋白1β;MMP,基质金属蛋白酶(MMP);MSC,间充质干细胞;NHDF,正常人真皮成纤维细胞;NPE,神经祖细胞扩增培养基;NT3,神经营养因子3;04,少突胶质细胞或胶质细胞分化标记物04;PBMC,外周血单核细胞;PBS,磷酸盐缓冲盐水;PDGF-CC,血小板衍生生长因子C;PDGF-DD,血小板衍生生长因子D;PDGFbb,血小板衍生生长因子bb;PO,“per os”(口服);PNS,周围神经系统;Rantes(或RANTES),受激活调节正常T细胞表达和分泌因子;rhGDF-5,重组人生长分化因子5;SC,皮下;SDF-1α,基质细胞衍生因子1α;SHH,音猬因子;SOP,标准操作程序;TARC,胸腺活化调节趋化因子;TCP,组织培养塑料;TCPS,组织培养聚苯乙烯;TGFβ1,转化生长因子β1;TGFβ2,转化生长因子β2;TGFβ-3,转化生长因子β-3;TIMP1,基质金属蛋白酶组织抑制因子1;TPO,促血小板生成素;TSP,血小板反应蛋白;TUJ1,BIII微管蛋白;VEGF,血管内皮生长因子;vWF,血管性血友病因子;以及αFP,甲胎蛋白。
本发明通过但不限于以下实施例进一步进行说明。
实施例1
祖细胞对神经突增生和突触发生的效应
突触发生是在神经元之间,特别是在突触前神经元(Bassoon)与突触后神经元(Homer)之间形成突触。该突触形成过程受到星形胶质细胞的调节,这些星形胶质细胞除了促进突触形成以外,还为神经元存活和生长提供支持,它们包括视网膜神经节细胞。已证实,离体人脐带组织衍生的细胞(hUTC)向视网膜变性模型的视网膜下施用保留了感光细胞和视觉功能。(US2010/0272803)。在此,检查了hUTC的治疗方面,并表征了衍生的hUTC对功能性突触形成(突触发生)、神经元存活和增生的效应。
材料和方法
人脐带组织衍生的细胞(hUTC)由以下实施例4–16中描述的以及美国专利No.7,524,489和No.7,510,873及美国公布申请No.2005/0058634中详述的方法获得,这些专利以引用方式并入本文。简而言之,在活产后,在征得捐赠者同意的情况下获得人脐带。将组织切碎并酶促消化。在用含有0.5U/mL胶原酶(Serva Elecrtrophoresis,Heidelberg,Germany)、5U/mL中性蛋白酶(Serva Elecrtrophoresis,Heidelberg,Germany)和2U/mL透明质酸酶(Cumulase;Origio a/s,Denmark)的混合物的达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)-低葡萄糖(Lg)(SAFC Biosciences,Lenexa,KS)进行几乎完全消化之后,通过70μm滤膜过滤细胞悬浮液,并且在250x g下离心上清液。将分离的细胞在DMEM-Lg中洗涤若干次,然后以5,000个细胞/cm2的密度接种到含有15%(体积/体积)胎牛血清(FBS;SAFCBiosciences)的DMEM-Lg中(5%(体积/体积)二氧化碳,37℃)。当细胞达到大约70%汇合度(约3-4天)时,使用TrypLE(Gibco,Grand Island,NY)将细胞传代。使细胞扩增若干次并入库。使用冷冻保存的hUTC(16-20次群体倍增)。
视网膜神经节细胞:通过从任一性别的P7(产后第7天)Sprague-Dawley大鼠视网膜(Charles River,Wilmington,MA)的顺序免疫淘选来纯化视网膜神经节细胞(RGC),如此前所述(Winzeler A,Wang JT.,Cold Spring Harbor Protocols,2013;643-652)。简而言之,将视网膜切下并用木瓜蛋白酶(6U/mL,Worthington,Burlingame,CA)解离。首先使用西非单叶豆凝集素I(BSL,Vector laboratories,Burlingame,CA)涂布的培养皿淘选解离的细胞,以去除免疫细胞、细胞碎片和成纤维细胞。将未结合的细胞转移到涂布有抗Thy1(克隆T11D7)抗体的培养皿,以便对RGC进行特异性分离。对经纯化的RGC进行温和胰蛋白酶化,并重新接种到24孔板中聚-D-赖氨酸(PDL)和层粘连蛋白涂布的盖玻片上(35,000个细胞/盖玻片)。将RGC培养在含有B27(Invitrogen,Grand Island,NY)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、胰岛素和毛喉素的无血清生长培养基中(培养基的完整配方可见于Winzeler和Wang,Cold Spring Harbor Protocols,出处同上)。
使用McCarthy KD,de Vellis J.,J.Cell Biology,1980;85:890-902中所述的标准方法从任一性别的P1Sprague-Dawley大鼠幼仔分离皮质星形胶质细胞(ASC)。对于星形胶质细胞共培养,通过以每个小室125,000个皮质星形胶质细胞接种于星形胶质细胞生长培养基(AGM,描述于McCarthy KD,de Vellis J.,J.Cell Biology,1980;85:890-902)中来制备单层细胞小室(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)。第二天,用RGC生长培养基更换AGM,并将单层细胞小室转移到盖玻片上含有4DIV(体外天数)RGC的24孔板中。
正常人真皮成纤维细胞(NHDF)购自(Lonza(Walkersville,MD))。根据制造商的方案将细胞扩增并在第4代时冷冻保存。
将RGC与hUTC、作为阳性对照的ASC或作为阴性对照的NHDF细胞系共培养六天。以10K、20K、30K、100K和200K接种DIV3时的hUTC和NHDF。以130K接种星形胶质细胞。使用25K、50K和100K的hUTC、130K的星形胶质细胞以及100K、150K和200K的NHDF计算对突触形成的效应。
对于共培养实验,在与RGC共培养前一天,将25,000个hUTC接种到单层细胞小室的hUTC生长培养基中。在共培养的当天,用RGC生长培养基更换hUTC生长培养基,并且将单层细胞小室转移到盖玻片上生长有4DIV RGC的24孔板中。
使用制造商的建议,将NHDF培养在成纤维细胞基本培养基(FBM,Lonza)中。对于与RGC共培养,在与RGC共培养前一天,将150,000个NHDF接种到单层细胞小室的FBM培养基中。第二天,用RGC生长培养基更换FBM,并将单层细胞小室转移到盖玻片上含有4DIV RGC的24孔板中。
免疫细胞化学对突触数的定量(突触测定法):通过突触前(Bassoon)和突触后(Homer)标记物共定位的免疫细胞学分析及电生理学来评估突触形成。将35,000个RGC在盖玻片上单独培养4DIV,并且在4DIV时添加单层细胞小室或条件培养基。为了阻断TSP诱导的突触形成,将32μM加巴喷丁(GBP)连同条件培养基一起添加,如Eroglu C等人,Cell,2009,139:380-392中所述。共培养的细胞在7DIV时接受新鲜生长培养基。当使用条件培养基时,在7DIV时提供补充有条件培养基的生长培养基。在10DIV时,用4%PFA(重量/体积)固定RGC,并且针对突触前和突触后标记物bassoon(小鼠抗bassoon,1:1000,RRID:AB_2038857,Enzo,Farmingdale,NY)和homer-1(兔抗homer,1:500,RRID:AB_1966438,SynapticSystems,Goettngen,Germany)进行染色。Alexa偶联的二抗(Invitrogen,山羊抗兔AF-488(1:1000,RRID:AB_10563748)和山羊抗小鼠AF-594(1:500,RRID:AB_10561507))用于检测。采用Vectashield含DAPI的封片剂(Vector Laboratories)将盖玻片封装在载玻片(VWRScientific,Radnor,PA)上。在使用63倍物镜的Zeiss Axioimager M1落射荧光显微镜(Carl Zeiss,Thornwood,NY)上对RGC进行成像。通过DAPI荧光随机地鉴定离其最近邻者至少两个细胞直径的形态健康的单细胞。每次实验对每种条件的至少15-20个细胞进行成像和分析,所给出的结果是2-3次独立实验的平均值。使用NIH图像处理软件包ImageJ的自定义插件(由Barry Wark编写,可向Duke University的Cagla Eroglu索取),分析捕获图像的共定位的突触斑。染色方案和定量方法的细节详述于Ippolito DM,Eroglu C.,J VisExp,.2010;16(45):2270。通过对每100μm树突的共定位的突触斑数进行计数,来测定突触密度(单位神经突长度的突触数)。对于该分析,每张图像随机选择一个近端树突/细胞。所给出的突触密度结果来自采用30个细胞/条件的一个实验。
来自RGC的电生理记录:通过在-70mV的保持电位下的全细胞膜片钳来记录微小兴奋性突触后电流(mEPSC)。在23℃-24℃下以0.2mL/min流量的细胞外溶液持续灌注来维持这些细胞。细胞外溶液含有:124mM NaCl、2.5mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、26mM NaHCO3、1.2mM NaH2PO4、10mM D-葡萄糖(pH 7.4)。在记录期间在细胞外溶液中加入河豚毒素(TTX,Abcam,1μM,Abcam,Cambridge,MA)。膜片吸管中的内部溶液(2.5MΩ至5MΩ)含有:120mM甲磺酸铯、5mM NaCl、10mM四乙基氯化铵、10mM HEPES、4mM利多卡因N-乙基溴、1.1mM EGTA、4mM三磷酸腺苷镁和0.3mM三磷酸鸟苷钠,用CsOH将pH调至7.2,并用蔗糖将渗透压度设定为300mOsm。通过MultiClamp 700B放大器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)记录信号,在10kHz下滤波,并用Digidata 1440A数字转换器(Molecular Devices)在20kHz下数字化。在全细胞构型中,仅当串联电阻<20MΩ时才接受记录。所有数据使用pCLAMP10(MolecularDevices)中的峰值检测软件来分析。所给出的数据是从在3次独立实验内记录的15个细胞/条件获取的。
神经突增生测定法:将RGC以低密度(1,500个细胞/盖玻片)接种到聚-D-赖氨酸(PDL)和小鼠层粘连蛋白(20ng/ml)涂布的盖玻片上并持续24小时,然后用4%PFA(重量/体积)固定,并且依次用兔抗β微管蛋白抗体(LI-COR,RRID:AB_1850029,Lincoln,NE)、山羊抗兔AF-488进行免疫染色以使神经突显色。24小时后,通过以下方式使神经突显色:与CellTracker Red CMPTX染料(Inivtirogen)一起温育15分钟,然后用4%PFA(重量/体积)固定。使用Zeiss Axioimager M1落射荧光显微镜(Carl Zeiss)上的20倍物镜捕获具有其神经突的单一RGC的图像。每次实验对每种条件的至少30个细胞进行成像和分析,所给出的结果是2-3次独立实验的平均值。使用Metamorph软件(Molecular Devices)中的神经突增生应用模块来分析神经元形态。使用Fiji的插件执行Sholl分析,如Ferreira TA等人,Nature Methods,2014;11:982-984中所述。
依次使用单因素方差分析(ANOVA)和两两比较Student t(Fisher’s LSD)事后检验进行定量数据的统计分析。对于神经突增生测定法的Sholl分析,执行协方差分析(ANCOVA)。对于mEPSC的累积概率分析,依次使用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较事后检验。使用内嵌SAS 9.2软件(SAS)的JMP Genomics 5进行数据的所有统计分析。所有数据表示为平均值±SEM,并且显著性展示为***p<0.0001,**p<0.001以及*p<0.05。
结果
发现经纯化的RGC与hUTC共培养于单层细胞小室中时这些经纯化的RGC之间产生的突触发生了数量和功能的变化。与原代大鼠星形胶质细胞培养物(ASC)共培养的RGC提供了阳性对照,因为星形胶质细胞显示出能大幅增加突触数并增强突触活动(Pfrieger FW,Barres BA,Science,1997;277:1684-1687;Ullian EM等人,Science,2001,291:657-661)。用NHDF处理的RGC提供了阴性对照,这是由于它们未在视网膜变性模型中诱导显著的功能或结构恢复(Lund等人,2007,出处同上)。hUTC与RGC的共培养表现出突触斑数的增加,并且与星形胶质细胞(阳性对照)相当。(图1B至图1D)。4DIV后,再将RGC与hUTC、ASC或NHDF共培养6天,并且用一对突触前和突触后蛋白(分别为bassoon和homer)免疫染色来评估突触数(图1A)。使用此前所述的方法将突触确定为突触前和突触后标记物的共定位(IppolitoDM、Eroglu C.,J Vis Exp,.2010,出处同上)(图1B,箭头)。当与单独培养的RGC相比时,hUTC在RGC之间诱导了兴奋性突触的形成(图1B、图1C)。而与NHDF共培养并未诱导突触数的显著增加(图1B、图1C、图1D)。每单位神经突长度的突触数的定量揭示了hUTC主要通过提高突触密度来增大突触数(图1D,单因素方差分析,p<0.0001)。
全细胞膜片钳记录测量了微小兴奋性突触后电流(mEPSC)。RGC单独地或在hUTC或ASC存在下培养(图1A)。与星形胶质细胞相似,RGC与hUTC的共培养引起了突触事件频率的增加(图1E至图1G,图1F,Kruskal-Wallis检验,p<0.0001,图1G,单因素方差分析,p<0.0001),这与所观察到的突触数的明显增加(图1B至图1D)相符。hUTC还提高了突触后电流的幅值。与星形胶质细胞一样,hUTC加强了突触活动(图1H、图1I,Kruskal-Wallis检验,p<0.0001)。mEPSC峰值的波形揭示了在hUTC处理的情况下上升和衰减tau均增加(图1J至图1M)。hUTC诱导了兴奋性突触形成并增强了所培养的RGC中的突触功能,这与ASC相似。
实施例2
条件培养基对神经突增生和突触发生的效应
评估了hUTC条件培养基在与RGC一起培养中的效应。
如上文在实施例1中所述那样获得hUTC、RGC和星形胶质细胞。
条件培养基的制备:使纯星形胶质细胞培养物或hUTC在10cm组织培养皿(Corning,Corning,NY)的其自身生长培养基中生长,直至其达到70%汇合度。然后用温热DPBS(Gibco)洗涤细胞两次,并且向每个培养皿中加入10mL的条件培养基,该条件培养基由补充有L-谷氨酰胺(2mM,Gibco)、丙酮酸钠(1mM,Gibco)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL,Gibco)的(Gibco)构成。由细胞对培养基调理5天。通过使用5kDa截留分子量Vivaspin 20离心浓缩机(Sartorius,Bohemia,NY)对无细胞条件培养基进行收集并浓缩10倍。按照制造商的建议,通过Bradford测定法(Thermo Scientific,Grand Island,NY)测量每种条件培养基的蛋白质浓度。将低蛋白结合管(Eppendorf,Hamburg,Germany)中的星形胶质细胞条件培养基(Astrocyte-Conditioned-Media,ACM)和hUTC条件培养基(hUTC-Conditioned Media,UCM)的等分试样在液氮中快速冷冻,并且在-80℃下保存直至使用。为了以不同截留分子量分级分离UCM,使用30kDa和100kDa Vivaspin 20离心浓缩机。为了收集5-100kDa UCM级分,用5kDa Vivaspin 20浓缩机浓缩100kDa Vivaspin 20的流穿液。为了收集5–100kDa UCM级分,用5kDa Vivispan浓缩机浓缩100kDa Vivaspin 20的流穿液。为了进行处理,让冷冻的等分试样在冰上缓慢融化,并且将条件培养基以所需浓度添加到冰冷RGC生长培养基(突触和增生测定法)或基本培养基(存活测定法)中。
条件培养基的蛋白质印迹分析:在含有5%β-巯基乙醇(体积/体积)的5x Laemmli上样缓冲液(Thermo Scientific)中制备10-20μg的条件培养基以用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。将蛋白质在95℃下变性15分钟。将蛋白质在10%SDS-PAGE凝胶(BioRad,Hercules,CA)中分离,然后转移到PVDF膜(Millipore)上。为了检测TSP,使用山羊抗人TSP1(1:250,RRID:AB_2201958)、TSP2(1:250,RRID:AB_220268)、TSP4(1:200,RRID:AB_2202087)(R&D Systems)。为了进行上样对照,使用山羊抗Hevin抗体(1:250,RRID:AB_2195103,R&D systems)检测另一种hUTC分泌的蛋白,称为Hevin/SPARCL1。辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗山羊抗体(R&D,1:5000)用作二抗。按照制造商的建议,使用AmershamTMECL蛋白质印迹分析系统试剂盒(GE Healthcare,Winterville,NC)或West Femto最高灵敏度底物(Thermo Scientific)进行检测。
突触测定法、电生理记录和神经突增生测定法在实施例1中描述。
细胞存活率测定法:将RGC直接接种到24孔组织培养板上(7,500个细胞/孔)。用PDL和层粘连蛋白涂布各个孔。将细胞培养于含有(Invitrogen)、SATO补充物(100μg/ml转铁蛋白、100μg/ml牛血清白蛋白、60ng/ml孕酮、16μg/ml腐胺、40ng/ml亚硒酸钠)、N-乙酰半胱氨酸(5μg/ml)、三碘甲状腺原氨酸(4μg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、丙酮酸钠(1mM)和毛喉素(5μM)的基本培养基中。为了测试UCM和ACM对存活的效应,为基本培养基补充各种浓度的条件培养基且不存在/存在毛喉素、BDNF(200ng/mL)或CNTF(40ng/mL)。根据制造商的说明,使用哺乳动物细胞的活力试剂盒(Invitrogen)评估3DIV时的细胞活力。在施加试剂盒试剂后15分钟执行活力计数,并且以使用20倍物镜的Zeiss Axio Observer A1落射荧光显微镜(Carl Zeiss)捕获代表性图像。每次实验对每次处理的至少10个视野进行计数,所给出的结果是2-3次实验的平均值。将存活百分比计算为:活细胞数除以死细胞和活细胞的总数并乘以100。
如实施例1中所述那样执行定量数据的统计分析。
结果
向RGC提供各种浓度的hUTC条件培养基(hUCM)。单独培养hUTC,并收集hUTC条件培养基(UCM)(图2A)。用UCM处理RGC,并使用与实施例1中相同的测定法评估条件培养基对突触数量和功能的效应。突触分析表明,hUCM足以诱导RGC的突触形成,并且以浓度依赖性方式增强与单层细胞小室中的hUTC相似的突触功能(图2B至图2N),这与星形胶质细胞条件培养基(ACM)相似。(图2B至图2D和图2J)。UCM在20-80μg总蛋白/mL培养基之间的浓度下显示出完全突触发生活性。UCM可代替hUTC共培养。hUCM还加强了功能性突触,如mEPSC的幅值和频率增加所表明。(图2E至图2I)。
这些结果证实hUTC诱导了突触形成并增强了突触功能。hUTC的突触发生效应有助于功能恢复,可通过将这些细胞递送到动物疾病模型而发生该功能恢复。
除了其对突触形成的效应以外,hUCM还在不存在任何其他生长因子(例如BDNF和CTNF)时促进了RGC存活。(图3A、图3D和图3E)。将RGC在基本培养基中培养3DIV,该基本培养基不含培养基补充物B27及生长因子BDNF、CNTF和胰岛素,但含有毛喉素(称为基本培养基对照条件的CTR)。在这些基本培养基条件下,在3DIV结束时少于5%的RGC存活(图3A左分图和图3B)。仅在毛喉素存在下添加生长因子诸如BDNF或CNTF,增加了RGC存活率(Meyer-Franke A等人,Neuron,1995,15:805-819)。培养基中的毛喉素提高了神经元中的cAMP水平,从而模拟正在进行的神经元活动,这对于CNS神经元的存活至关重要(Meyer-Franke等人,1995)。向基本培养基中添加UCM以浓度依赖性方式刺激了RGC存活(图3A右分图和图3B);而ACM并未在相同浓度下促进RGC存活(图3B)。
UCM的存活促进活性可在基本培养基中毛喉素的存在下发挥作用(图3C)。这些结果证实UCM刺激了RGC存活。在较低浓度(40μg/ml)下,UCM的存活效应似乎对BDNF或CNTF的存活效应有累加性(图3D、图3E)。
UCM还增强了RGC神经突增生,如总突起长度、突起数和分支数的增加所证实。(图3F至图3J)。含UCM的RGC生长培养基在接种时显示出UCM含有促进神经突增生和细化的因子(图3F至图3J)。ACM也促进了神经突增生(图3F至图3J);UCM一般在诱导总体细化和分支方面更有效(图3F和图3J)。Sholl分析表明,当与单独培养的RGC相比时,UCM增加了神经元复杂性(图3G)。
总之,hUTC分泌促进经纯化的RGC之间功能性突触的体外发育的因子。此外,hUTC还支持神经元存活和生长。
实施例3
由祖细胞分泌突触发生因子
已表明,来自hUTC的分泌蛋白质组能正面影响功能性突触的发育及神经元存活和增生。在该实施例中,鉴定了hUTC所分泌的突触发生因子。
免疫细胞化学测定法:如上文在实施例1中所述那样获得hUTC和RGC。如实施例2中那样制备hUTC条件培养基(UCM)。
按约5kDa至约100kDa内的截留分子量(MWCO)分离UCM中的蛋白质。80μg/mL UCM用于培养RGC,并通过免疫细胞化学突触测定法进行分析。将>5kDa、>30kDA和>100kDa的分离的蛋白质与单独的RGC和UCM5-100kDa进行比较。(图4A)。
突触发生阻断剂加巴喷丁(GBP)用于进一步对hUTC所分泌的突触发生因子进行鉴定。
神经突增生测定法:为了测试病理(即生长抑制)培养条件下的神经突增生,将RGC(1,500个细胞/盖玻片)接种到涂布有各种浓度的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG,EMDMillipore,Billerica,MA)、Nogo-A(R&D Systems,Minneapolis,MN)或存在可溶性髓鞘碱性蛋白(MBP,10ug/mL,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的盖玻片上。24小时后,通过以下方式使神经突显色:与CellTracker Red CMPTX染料(Inivtirogen)一起温育15分钟,然后用4%PFA(重量/体积)固定。使用Zeiss Axioimager M1落射荧光显微镜(Carl Zeiss)上的20倍物镜捕获具有其神经突的单一RGC的图像。每次实验对每种条件的至少30个细胞进行成像和分析,所给出的结果是2-3次独立实验的平均值。使用Metamorph软件(MolecularDevices)中的神经突增生应用模块来分析神经元形态。使用Fiji的插件执行Sholl分析,如Ferreira TA等人,Nature Methods,2014;11:982-984中所述。
敲低测定法:将hUTC与慢病毒shRNA一起培养,以制备敲低(KD)UCM。然后将RGC培养于KD UCM中,并对突触形成、电生理学及神经元存活和增生进行测定。(图5A)。克隆到靶向人THBS1、THBS2或THBS4mRNA(分别翻译为TSP1、TSP2和TSP4)的pLKO.1-puro载体中的shRNA构建体库购自Thermo Scientific公司。空pLKO.1puro载体购自Addgene公司(质粒8453,Cambridge,MA)并用作敲低对照。通过向hUTC中的转染来测定单独构建体的敲低效率。展示出最有效敲低的每种TSP的shRNA构建体被选择用于后续的慢病毒产生。
为了制备慢病毒,在转染前一天,以8×106个细胞/T75烧瓶的密度接种293T慢病毒包装细胞。第二天,将含有Thbs1(克隆编号TRCN00224)、Thbs2(克隆编号TRCN53972)、Thbs4(克隆编号TRCN54048)的shRNA的pLKO.1-puro慢病毒质粒或敲低对照(Addgene质粒8453)转染到293T细胞中。对于混杂shRNA对照,使用含有Thbs1(5’-ATAACTCCGATCGTTCAATAT-3’)、Thbs2(5’-GTTACATCTCGATACGATACA-3’)和Thbs4(5’-ATATAAGACGCTAGATCCACA-3’)shRNA的相同正义和反义混杂序列的寡核苷酸。将混杂shRNA寡核苷酸退火并克隆到pLKO.1-puro中,并且用于产生慢病毒。按照制造商的建议,使用X-tremeGENE转染试剂(Roche,Basel,Switzerland)共转染包装质粒delta R8.2和VSV-G。在转染后48和72小时收集慢病毒上清液两次,并且通过0.45μm滤膜(Millipore)进行过滤。使用Lenti-XTMGoStixTM(Clontech,Mountain View,CA)检测病毒颗粒。经过滤的上清液用于在补充凝聚胺(2μg/ml,Sigma)之后感染hUTC。通过以下方式进一步选择经转导的hUTC:在调理RGC实验用培养基之前,将嘌呤霉素(900ng/mL)添加到hUTC培养基中并持续5天。
重组TSP的产生和纯化:经纯化的重组人TSP1购自R&D Systems公司。为了进行TSP2纯化,使用表达小鼠TSP2的CHO细胞系产生条件培养基。使用亲和色谱程序和HiTRAP肝素HP(GE Healthcare),按此前所述的方法(Oganesian A等人,Molecular Biology ofCell,2008;19:563-571)从培养基纯化所分泌的重组TSP2。对于TSP4,按照制造商的说明,使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将带6-组氨酸标签的大鼠TSP4构建体(pcDNA3-TSP4,如Kim DS等人,J Neurosci,2012;32:8977-8987中所述)转染到HEK293细胞中。按照制造商的说明,使用Ni-NTA树脂(Qiagen,Venlo,Netherlands),通过Ni螯合色谱法从培养基纯化所分泌的重组TSP4。使用30kDa截留分子量Vivaspin 20(Sartorius)将经纯化的重组TSP浓缩到1mg/mL,并且将等分试样在液氮中快速冷冻并保存在-80℃下直至使用。
突触测定法、电生理记录和神经突增生测定法在实施例1中描述。如实施例1中所述那样执行定量数据的统计分析。条件培养基的蛋白质印迹分析在实施例2中描述。
结果
在UCM中使用不同截留分子量的尺寸排阻色谱柱对hUTC所分泌的突触发生因子进行分级分离(图4A),得出UCM的突触发生效应集中于大于100kDa的级分内(图4B、图4C)。含RGC的UCM培养物的免疫细胞化学表明,5–100kDa范围内的突触发生因子极少,大于100kDa的因子的效应最高。(图4B、图4C)。与TSP在UCM诱导的突触形成方面的作用一致,添加GBP阻断了突触发生因子。(图4D、图4E)。加巴喷丁是突触发生血小板反应蛋白家族的已知阻断剂,指示TSP家族蛋白是hUTC所分泌的主要突触发生因子。
同种型特异性shRNA单独地或与慢病毒介导的方法联合地用于敲低TSP1、2和4。(图5A),从而确认TSP为hUTC CM中的突触发生因子。通过蛋白质印迹确认对应shRNA对每种TSP的特异性敲低(图5B)。由不含shRNA的相同亲本质粒载体的慢病毒转导产生的UCM(KD-CTR)或用含有混杂TSP1、2和4shRNA的慢病毒三重感染的UCM(SCR-CTR)用作对照。由慢病毒感染的hUTC产生UCM,并将UCM施加到RGC以鉴定TSP敲低的效应(图5A)。TSP-1、TSP-2和TSP-4的shRNA构建体递送到hUTC导致每种TSP的表达都敲低。(图5B和图5D)。RGC中的突触数和突触密度的定量揭示了所有三种TSP(TSP1、TSP2和TSP4)都有助于UCM的突触发生功能(图5C、图5D、图5H至图5J)。与KD-CTR UCM相比,各TSP的单独敲低减少了突触数(图5C、图5D、图5H至图5J)。敲低所有三种TSP(TSP1+2+4-KD)消除了UCM的突触发生效应(图5C、图5D、图5J)。
为TSP1+2+4-KD UCM补充纯TSP1、TSP2和TSP4(各150ng/ml)恢复了TSP1+2+4-KDUCM的突触发生效应(图5C、图5E、图5I)。将各种纯TSP加入KD-CTR UCM中并未进一步增加突触数(图5K)。
mEPSC电生理学记录表明,使TSP的表达沉默降低了hUTC的突触发生效应,且mEPSC的幅值和频率减小。用ACM(阳性对照)、SCR-CTR或TSP1+2+4-KD UCM处理的RGC显示,TSP表达的沉默削弱了UCM诱导的突触事件频率的增加(图6F、图6G、图6H)。这与以下结论一致:TSP 1、2和4是UCM诱导突触发生必不可少的(图5)。TSP敲低对mEPSC峰值特性诸如幅值(图6I、图6J)和上升tau(图6K、图6L)具有较温和的效应。此外,TSP敲低不影响UCM增加衰减tau的能力(图6M、图6N)。hUTC中的TSP 1、2和4的沉默消除了这些细胞诱导突触数增加的能力。TSP的损失并未完全削弱UCM对突触电流的幅值和mEPSC峰值的波形的效应。
另外,使TSP表达沉默消除了UCM的神经突增生效应(图7A、图7B、图7C、图7D、图7E)。TSP1、2或4的单一敲低消除了UCM的神经突增生促进效应(图7E),包括对突起数和分支数的效应(图7N至图7O)。TSP2或TSP4或者所有三种TSP(而非单独的TSP1)的敲低降低了UCM的存活促进活性(图7K)。为TSP1+2+4-KD UCM补充单独的或所有的纯TSP并未营救UCM的存活促进功能(图7L)。为TSP1+2+4-KD UCM补充各种纯TSP(TSP1、TSP2和TSP4)(各150ng/ml)恢复了UCM的神经突增生刺激功能(图7H、图7i、图7Q、图7R)。
在CNS损伤后,从退化神经元释放出反应性胶质细胞所产生的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)以及髓鞘蛋白诸如Nogo A。这些蛋白质抑制轴突再生(Niederost等人,2002;Silver和Miller,2004;Usher等人,2010;Walker等人,2012),阻碍了神经元修复并出现损伤。改进的RGC神经突增生测定法示出了hUTC在抑制生长的条件下促进神经突增生。在使用CSPG或Nogo-A的改进的RGC神经突增生测定法中(图8A和图8B),CSPG从0.05μg/cm2开始阻碍神经突增生,并且在0.2μg/cm2或更高的浓度下完全阻断生长(图8A)。Nogo-A从1μg/cm2开始阻断RGC中的神经突增生,且在2μg/cm2下抑制超过50%的神经突生长(图8B)。用编码混杂shRNA的慢病毒转导的UCM(SCR-CTR UCM)诱导了RGC中的神经突增生,这些RGC接种到含0.05μg/cm2CSPG或1μg/cm2Nogo-A的盖玻片上(图8A和图8B)。即使在生长抑制条件下,hUCM也诱导了神经突增生。SCR-CTR UCM无法在高CSPG(>0.2μg/cm2)和Nogo-A(2μg/cm2)浓度下引发神经突增生(图8A和图8B)。
与SCR-CTR UCM不同,TSP1+2+4-KD UCM并未在存在0.05μg/cm2CSPG(图8C和图8E)或1μg/cm2Nogo-A(图8D和图8F)时引发神经突增生,这指示TSP对于生长抑制条件下hUCM的神经突增生促进效应很重要。添加单独的经纯化的TSP2或TSP4或所有三种TSP,营救了TSP1+2+4-KD UCM在CSPG或Nogo-A存在下诱导神经突增生的能力(图8C至图8F)。这些结果表明,TSP,特别是TSP2和4,引起了在CSPG或Nogo-A存在下hUCM的生长刺激效应。
由CNS损伤所生成的髓鞘碎片还会脱落高水平的髓鞘蛋白MBP(Liu等人,2006;Stapulionis等人,2008)。在10μg/ml可溶性MBP存在下的RGC增生测定法表明,MBP对CNS神经元具有神经突增生抑制效应。此前的研究表明,MBP在高于10μg/ml的浓度下会诱导神经毒性(Zhang等人,2014)。在此,10μg/ml的MBP导致RGC中神经突增生损失(图8J,与在正常生长培养基条件下的RGC培养物相比,增生降低14±0.07%)。SCR-CTR UCM在MBP存在下诱导了神经突增生,并且在TSP被沉默时,UCM的该效应丧失(即,TSP1+2+4-KD UCM,图8G和图8I)。仅当将纯TSP2添加回TSP1+2+4-KD UCM中时,才营救了增生促进效应。这些结果表明,在MBP存在下,TSP2可介导神经突增生,并且在生长抑制条件下,hUTC分泌的TSP(TSP2和TSP4)介导神经突增生。将纯TSP添加到生长培养基中,也在CSPG、Nogo-A或MBP存在下诱导了RGC神经突增生(图8H和图8J)。
实施例4
从产后组织衍生细胞
本实施例描述了从胎盘和脐带组织制备产后衍生的细胞。产后脐带和胎盘是在足月生产或早产时获得的。从五个独立的脐和胎盘组织供体获取细胞。对不同细胞分离方法进行测试,以测定其产生具有如下潜能的细胞的能力:1)分化成具有不同表型的细胞(这是干细胞常见的特征)的潜能;或2)为其他细胞和组织提供有用的营养因子的潜能。
方法和材料
脐细胞分离:脐带得自国家疾病研究交流会(NDR1,Philadelphia,Pa.)。在正常分娩后获得所述组织。在层流罩中无菌地进行细胞分离方案。为了去除血液和碎片,将脐带在抗真菌剂和抗生素(100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、0.25微克/毫升两性霉素B)存在下的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS;Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中洗涤。然后将该组织在50毫升培养基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖;Invitrogen)存在下的150cm2组织培养板中进行机械解离,直至将组织切成细浆。将切碎的组织转移到50毫升锥形管(约每管5克组织)。
然后在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基(每种均含有如上所述的抗真菌剂和抗生素)中消化组织。在一些实验中,使用胶原酶和分散酶的酶混合物(“C:D”)(在DMEM-低葡萄糖培养基中的胶原酶(Sigma,St Louis,Mo.),500单位/毫升;和分散酶(Invitrogen),50单位/毫升)。在其他实验中,使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶的混合物(“C:D:H”)(在DMEM-低葡萄糖中的胶原酶,500单位/毫升;分散酶,50单位/毫升;和透明质酸酶(Sigma),5单位/毫升)。包含组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃、225rpm的轨道式震荡器(Environ,Brooklyn,N.Y.)中温育2小时。
消化后,将组织在150×g下离心5分钟,并吸出上清液。将沉淀物重悬于20毫升生长培养基(DMEM:低葡萄糖(Invitrogen)、15%(v/v)胎牛血清(FBS;成分确定的牛血清;Lot#AND18475;Hyclone,Logan,Utah)、0.001%(v/v)2-巯基乙醇(Sigma),每100毫升加入1毫升如上所述抗生素/抗真菌剂。使细胞悬液通过70微米尼龙细胞滤网(BD生物科学事业部(BD Biosciences))过滤。使另外5毫升包含生长培养基的冲洗液通过滤网。然后使细胞悬液通过40微米尼龙细胞滤网(BD生物科学事业部),随后使另外5毫升生长培养基的冲洗液通过。
将滤液重悬于生长培养基(总体积为50毫升)中,并在150×g下离心5分钟。吸出上清液,并将细胞重悬于50毫升新鲜生长培养基中。再重复该过程两次。
在最后一次离心后,吸出上清液,并将细胞沉淀物重悬于5毫升新鲜生长培养基中。使用台盼蓝染色确定活细胞数量。然后在标准条件下培养细胞。
将从脐带分离的细胞以5000个细胞/cm2接种到明胶涂布的T-75cm2烧瓶(CorningInc.,Corning,N.Y.)上的含如上所述抗生素/抗真菌剂的生长培养基中。2天后(在各实验中,细胞温育2-4天),从烧瓶中吸出消耗培养基。用PBS洗涤细胞三次,以去除碎片和血源性细胞。然后为细胞补充生长培养基,使细胞生长至汇合(从0代至1代需约10天)。在后续的传代中(从1代至2代,以此类推),细胞在4-5天内达到近汇合(75-85%汇合)。对于这些后续的传代,细胞以5000细胞/cm2接种。将细胞在5%二氧化碳和大气氧、37℃下生长于加湿培养箱中。
胎盘细胞分离:胎盘组织得自NDRI(Philadelphia,Pa.)。该组织来自孕期,并在正常外科分娩时获得。如针对分离脐带细胞所述的那样分离胎盘细胞。
以下实施例适用于从胎盘组织分离母体衍生的和新生儿衍生的不同细胞群。
在层流罩中无菌地进行细胞分离方案。将胎盘组织在抗真菌剂和抗生素(如上所述)存在下的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS;Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中洗涤,以去除血液和碎片。然后将胎盘组织分为三个部分:顶线(新生儿侧或方向),中线(新生儿和母体混合细胞分离)和底线(母体侧或方向)。
将分离的部分在含有抗生素/抗真菌剂的PBS中分别洗涤数次,以进一步去除血液和碎片。然后将每个部分在50毫升DMEM-低葡萄糖存在下的150cm2组织培养板中进行机械解离得到细浆。将该浆液转移至50毫升锥形管。每根管含有约5克的组织。将组织在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基中消化,这两种培养基含有抗真菌剂和抗生素(100单位/毫升的青霉素、100毫克/毫升的链霉素、0.25微克/毫升的两性霉素B)和消化酶。在一些实验中,使用胶原酶和分散酶的酶混合物(“C:D”),其包含DMEM-低葡萄糖培养基中的胶原酶(Sigma,St Louis,Mo.),500单位/毫升;和分散酶(Invitrogen),50单位/毫升。在其他实验中,使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶的混合物(C:D:H)(在DMEM-低葡萄糖中的胶原酶,500单位/毫升;分散酶,50单位/毫升;和透明质酸酶(Sigma),5单位/毫升)。包含组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃、225rpm的轨道式震荡器(Environ,Brooklyn,N.Y.)中温育2h。
消化后,将组织在150xg下离心5分钟,吸出所得的上清液。将沉淀物重悬于含有青霉素/链霉素/两性霉素B的20毫升生长培养基中。使细胞悬浮液通过70微米尼龙细胞滤网(BD Biosciences)过滤,并且追加另外5毫升生长培养基进行冲洗。使所有细胞悬浮液通过40微米尼龙细胞滤网(BD Biosciences),随后用另外5毫升生长培养基进行冲洗。
将滤液重悬于生长培养基(总体积为50毫升)中,并在150×g下离心5分钟。吸出上清液,并将细胞沉淀物重悬于50毫升新鲜生长培养基中。再重复该过程两次。在最后一次离心后,吸出上清液,并将细胞沉淀物重悬于5毫升新鲜生长培养基中。使用台盼蓝排除测试确定细胞数。然后在标准条件下培养细胞。
LIBERASE细胞分离:使用LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.)(2.5毫克/毫升,Blendzyme 3;Roche Applied Sciences,Indianapolis,Ind.)和透明质酸酶(5单位/毫升,Sigma)将细胞从DMEM-低葡萄糖培养基中的脐组织分离。如上文针对其他蛋白酶消化所述的那样进行组织消化和细胞分离,但使用LIBERASE/透明质酸酶混合物代替C:D或C:D:H酶混合物。用LIBERASE的组织消化导致从产后组织分离容易扩增的细胞群。
使用其他酶组合进行细胞分离:比较使用不同酶组合从脐带分离细胞的操作。针对消化而进行比较的酶包括:i)胶原酶;ii)分散酶;iii)透明质酸酶;iv)胶原酶和分散酶的混合物(C:D);v)胶原酶和透明质酸酶的混合物(C:H);vi)分散酶和透明质酸酶的混合物(D:H),以及vii)胶原酶、分散酶和透明质酸酶的混合物(C:D:H)。观察到利用这些不同的酶消化条件在细胞分离中的差异(表4-1)。
从脐带内的残余血液分离细胞:作出通过不同方法从脐带分离细胞库的其他尝试。在一个例子中,将脐带切片并用生长培养基洗涤,以去除血块和凝胶状材料。收集血液、凝胶状材料和生长培养基的混合物,并且以150x g离心。将沉淀物重悬并接种到明胶涂布的烧瓶上的生长培养基中。根据这些实验,分离容易扩增的细胞群。
从脐血分离细胞:细胞还已从得自NDR1的脐血样品分离。使用的分离方案是Ho等人的国际专利申请WO 2003/025149(Ho,T.W等人,“Cell Populations Which Co-ExpressCD49C and CD90”,申请No.PCT/US02/29971)中的分离方案。将脐带血液样品(分别为50毫升和10.5毫升)(NDRl,Philadelphia Pa.)与裂解缓冲液(过滤灭菌的155mM氯化铵、10毫摩尔碳酸氢钾、0.1毫摩尔EDTA缓冲至pH7.2(所有组分均来自Sigma,St.Louis,Mo.)混合。细胞以1:20脐带血与裂解缓冲液的比率进行裂解。将所得的细胞悬浮液涡旋5秒,并且在环境温度下温育2分钟。将裂解产物离心(以200xg 10分钟)。将细胞沉淀物重悬于完全基本必需培养基(Gibco,Carlsbad,Calif.),所述培养基含有10%胎牛血清(Hyclone,Logan Utah)、4毫摩尔谷氨酰胺(Mediatech,Herndon,Va.)、100单位青霉素/100毫升和100微克链霉素/100毫升(Gibco,Carlsbad,Calif.)。将重悬的细胞离心(以200xg 10分钟),抽吸上清液,并且在完全培养基中洗涤细胞沉淀物。将细胞直接接种到T75烧瓶(Corning,N.Y.)、T75层粘连蛋白涂布的烧瓶或T175纤连蛋白涂布的烧瓶(两者均来自BD公司(Becton Dickinson,Bedford,Mass.))内。
使用不同酶组合和生长条件分离细胞:为了测定细胞群是否可在不同条件下分离并在分离后立即在多种条件下扩增,根据上文提供的操作,使用C:D:H的酶组合,将细胞在含有或不含0.001%(v/v)2-巯基乙醇(Sigma,St.Louis,Mo.)的生长培养基中消化。将就此分离的胎盘衍生的细胞在各种条件下接种。所有细胞均在青霉素/链霉素的存在下生长。(表4-2)。
使用不同酶组合和生长条件分离细胞:在所有条件下,细胞在第0代和第1代之间均良好贴壁并扩增(表4-2)。在条件5-8和13-16中的细胞证实在接种后良好增殖最多至4次传代,在这时对它们进行冷冻保存并储存。
结果
使用不同的酶组合进行细胞分离:C:D:H的组合提供在分离后的最佳细胞收率,并且生成在培养中比其他条件扩增更多代的细胞(表4-1)。可扩增的细胞群无法使用单独的胶原酶或透明质酸酶获得。未尝试测定该结果是否特定于所测试的胶原。
表4-1:使用多种酶组合从脐带组织分离细胞
酶消化 | 分离的细胞 | 细胞扩增 |
胶原酶 | X | X |
分散酶 | +(>10h) | + |
透明质酸酶 | X | X |
胶原酶:分散酶 | ++(<3h) | ++ |
胶原酶:透明质酸酶 | ++(<3h) | + |
分散酶:透明质酸酶 | +(>10h) | + |
胶原酶:分散酶:透明质酸酶 | +++(<3h) | +++ |
关键:+=良好;++=非常良好,+++=优异,X=未成功
使用不同酶组合和生长条件分离细胞:细胞在对于酶消化和生长的测试的所有条件下在第0代和第1代之间均良好贴壁并扩增(表4-2)。在实验条件5-8和13-16中的细胞在接种后良好增殖最多至4次传代,在这时它们进行冷冻保存。所有细胞均冷冻保存用于进一步研究。
表4-2:在多种条件下的产后细胞的分离和培养扩增:
从脐带内的残余血液分离细胞:有核细胞快速贴壁并生长。这些细胞通过流式细胞术进行分析,并且类似于通过酶消化获得的细胞。
从脐血分离细胞:所述制剂含有红血细胞和血小板。在前3周过程中有核细胞未贴壁并分裂。在接种后3周更换培养基,并且未观察到细胞贴壁并生长。
总结:细胞群可使用酶组合胶原酶(基质金属蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)和透明质酸酶(分解透明质酸的粘液溶解酶)有效地从脐带和胎盘组织中得到。也可使用LIBERASE,其为一种Blendzyme。具体地讲,为胶原酶(4Wunsch单位/g)和嗜热菌蛋白酶(1714酪蛋白单位/g)的Blendzyme3也连同透明质酸酶一起用于分离细胞。当在明胶涂布的塑料上的生长培养基中培养时,这些细胞容易地经过多次传代扩增。
细胞还从脐带中的残留血液而不是脐带血分离。从组织洗涤的血块中存在的细胞可能是由于存在解剖过程期间释放的细胞,所述血块中的细胞在使用的条件下贴壁并生长。
实施例5
产后衍生的细胞的核型分析
在细胞疗法中使用的细胞系优选是同质的并且不含任何污染细胞类型。在细胞疗法中使用的细胞应具有正常的染色体数目(46)和结构。为了鉴定胎盘衍生和脐衍生的细胞系是同质的并且不含非产后组织起源的细胞,分析细胞样品的核型。
方法和材料
来自男性新生儿的产后组织的PPDC在含有青霉素/链霉素的生长培养基中进行培养。选择来自男性新生儿(X,Y)的产后组织,以允许区别新生儿衍生的细胞和母体衍生的细胞(X,X)。细胞以5,000细胞/平方厘米接种到T25烧瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)中的生长培养基中,并且扩增至80%汇合度。含有细胞的T25烧瓶用生长培养基填充至颈部。通过快递将样品递送至临床细胞遗传学实验室(估计的实验室至实验室运输时间为一小时)。细胞在中期过程中进行分析,在所述中期时染色体是最佳显现的。在计数的处于中期的二十个细胞中,五个就正常同质核型数目(二)进行分析。如果观察到两个核型,则细胞样品表征为同质的。如果观察到超过两个核型,则细胞样品表征为异质的。当鉴定异质核型数目(四)时,计数并分析另外的中期细胞。
结果
送往染色体分析的所有细胞样品均被解释为显示出正常外观。分析的16种细胞系中的三种显示出异质表型(XX和XY),指示来源于新生儿和母体起源两者的细胞的存在(表5-1)。将衍生自胎盘-N组织的细胞从胎盘的新生儿方向分离。在第零代,该细胞系呈现同质的XY。然而,在第九代,细胞系是异质的(XX/XY),表明先前未检测到母体来源的细胞存在。
表5-1PPDC的核型结果。
关键:N-新生儿侧;V-绒毛区域;M-母体侧;C-克隆
总结:染色体分析鉴定胎盘衍生和脐衍生的细胞,如由临床细胞遗传学实验室解释的,所述细胞的核型看起来是正常的。核型分析还鉴定不含母体细胞的细胞系,如由同质核型测定的。
实施例6
通过流式细胞术评估人产后衍生的细胞表面标记物
通过流式细胞术表征细胞表面蛋白或“标记物”可用于测定细胞系的身份。表达的一致性可由多个供体以及在暴露于不同处理和培养条件的细胞中进行测定。从胎盘和脐分离的产后衍生的细胞(PPDC)系通过流式细胞术来表征,提供用于鉴定这些细胞系的特征图。
方法和材料
培养基和培养容器:将细胞培养于含青霉素/链霉素的生长培养基(GibcoCarlsbad,Calif.)中。将细胞培养于等离子处理的T75、T150和T225组织培养瓶(CorningInc.,Corning,N.Y.)直至汇合。通过在室温下温育2%(w/v)明胶(Sigma,St.Louis,Mo.)20分钟,使烧瓶的生长表面涂布有明胶。
抗体染色和流式细胞术分析:在PBS中洗涤烧瓶中的贴壁细胞,并用胰蛋白酶/EDTA分离。将细胞收获、离心并以每毫升1x107个的细胞浓度重悬于PBS中的3%(v/v)FBS中。根据制造商说明书,将所关注的细胞表面标记物的抗体(参见下文)添加到一百微升细胞悬液中,并将混合物在4℃下、于黑暗中温育30分钟。温育后,将细胞用PBS洗涤,并离心去除未结合抗体。将细胞重悬于500微升PBS中,并通过流式细胞术进行分析。用FACScaliburTM仪器(Becton Dickinson,San Jose,Calif.)进行流式细胞术分析。表6-1列出了所使用的针对细胞表面标记物的抗体。
表6-1:用于表征细胞表面标记物的抗体。
抗体 | 制备商 | 产品目录号 |
CD10 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555375 |
CD13 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555394 |
CD31 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555446 |
CD34 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555821 |
CD44 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555478 |
CD45RA | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555489 |
CD73 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 550257 |
CD90 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555596 |
CD117 | BD Biosciences(San Jose,CA) | 340529 |
CD141 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 559781 |
PDGFr-α | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 556002 |
HLA-A、B、C | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555553 |
HLA-DR、DP、DQ | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555558 |
IgG-FITC | Sigma(St.Louis,MO) | F-6522 |
IgG-PE | Sigma(St.Louis,MO) | P-4685 |
胎盘与脐的比较:第8代时,将胎盘衍生的细胞与脐衍生的细胞进行比较。
代际比较:胎盘衍生和脐衍生的细胞在第8、15和20代时进行分析。
供体与供体的比较:为了比较供体之间的差异,将来自不同供体的胎盘衍生的细胞相互比较,并将来自不同供体的脐衍生的细胞相互比较。
表面涂布比较:将明胶涂布的烧瓶上所培养的胎盘衍生的细胞与未涂布的烧瓶上所培养的胎盘衍生的细胞进行比较。将明胶涂布的烧瓶上所培养的脐衍生的细胞与未涂布的烧瓶上所培养的脐衍生的细胞进行比较。
消化酶比较:比较了用于细胞分离和制备的四种处理。将采用下述物质进行处理的从胎盘分离的细胞进行比较:1)胶原酶;2)胶原酶/分散酶;3)胶原酶/透明质酸酶;4)胶原酶/透明质酸酶/分散酶。
胎盘层比较:将衍生自胎盘组织的母体方向的细胞与衍生自胎盘组织的绒毛区域的细胞以及衍生自胎盘的新生胎儿方向的细胞进行比较。
结果
胎盘与脐的比较结果:通过流式细胞术所分析的胎盘衍生和脐衍生的细胞显示出CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的阳性表达,如相对于IgG对照而言荧光值增加所指示的那样。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的可检测表达是阴性的,如与IgG对照相当的荧光值所指示。考虑了阳性曲线的荧光值的变化。阳性曲线的平均值(即CD13)和范围(即CD90)显示出一些变化,但该曲线呈正态,证明是同质群体。两种曲线各自显示大于IgG对照的值。
代际比较结果——胎盘衍生的细胞:通过流式细胞术所分析的第8、15和20代胎盘衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的表达均是阳性的,这反映在相对于IgG对照而言荧光值增加。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,其中荧光值与IgG对照一致。
代际比较结果——脐衍生的细胞:通过流式细胞术所分析的第8、15和20代脐衍生的细胞均会表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C,如相对于IgG对照而言荧光增强所指示的那样。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的,如与IgG对照一致的荧光值所指示。
供体与供体的比较结果——胎盘衍生的细胞:通过流式细胞术所分析的从独立供体分离的胎盘衍生的细胞均会表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A,B,C,并且相对于IgG对照而言荧光值增加。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,如与IgG对照一致的荧光值所指示的那样。
供体与供体的比较结果——脐衍生的细胞:通过流式细胞术所分析的从独立供体分离的脐衍生的细胞均显示出CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A,B,C的阳性表达,这反映在相对于IgG对照而言荧光值增加。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,其中荧光值与IgG对照一致。
采用明胶进行表面涂布对胎盘衍生的细胞的影响:通过流式细胞术所分析的明胶涂布的烧瓶或未涂布的烧瓶上所扩增的胎盘衍生的细胞均会表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-alpha和HLA-A,B,C,这反映在相对于IgG对照而言荧光值增加。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,如与IgG对照一致的荧光值所指示。
采用明胶进行表面涂布对脐衍生的细胞的影响:通过流式细胞术所分析的明胶涂布的烧瓶和未涂布的烧瓶上所扩增的脐衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的表达均是阳性的,并且相对于IgG对照而言荧光值增加。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,其中荧光值与IgG对照一致。
用于制备细胞的酶消化过程对细胞表面标记物分布的影响:通过流式细胞术所分析的使用各种消化酶所分离的胎盘衍生的细胞均会表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A,B,C,如相对于IgG对照而言荧光值增加所指示的那样。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,如与IgG对照一致的荧光值所指示的那样。
胎盘层比较结果:通过流式细胞术分别进行分析的从胎盘的母体层、绒毛层和新生儿层分离的细胞显示出CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A,B,C的阳性表达,如相对于IgG对照而言荧光值增加所指示的那样。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的表达是阴性的,如与IgG对照一致的荧光值所指示的那样。
总结:通过流式细胞术分析胎盘衍生和脐衍生的细胞,已确定了这些细胞系的身份。胎盘衍生和脐衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、HLA-A,B,C是阳性的,对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR,DP,DQ是阴性的。该身份与变量中的变化一致,所述变化包括供体、传代、培养容器表面涂层、消化酶和胎盘层。观察到单独荧光值直方曲线平均值和范围中的一些变化,但在所测试的所有条件下的所有阳性曲线均为正态的并且显示荧光值大于IgG对照,由此证实了细胞包含具有标记物的阳性表达的同质群体。
实施例7
产后组织表型的免疫组织化学表征
通过免疫组织化学分析在人产后组织即脐带和胎盘内发现的细胞的表型。
方法和材料
组织制备:收集人脐带和胎盘组织,将其浸没在4%(w/v)多聚甲醛中在4℃下固定过夜。使用针对下列表位的抗体进行免疫细胞组织化学分析:波形蛋白(1:500;Sigma,St.Louis,Mo.)、结蛋白(1:150,针对兔而产生;Sigma;或者1:300,针对小鼠而产生;Chemicon,Temecula,Calif.)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA;1:400;Sigma)、细胞角蛋白18(CK18;1:400;Sigma)、血管性血友病因子(vWF;1:200;Sigma)以及CD34(人CD34III类;1:100;DAKOCytomation,Carpinteria,Calif)。此外,测试了以下标记物:抗人GROα-PE(1:100;Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J)、抗人GCP-2(1:100;Santa Cruz Biotech,SantaCruz,Calif)、抗人氧化LDL受体1(ox-LDL R1;1:100;Santa Cruz Biotech)以及抗人NOGO-A(1:100;Santa Cruz Biotech)。用手术刀修整固定后的标本,置于OCT包埋化合物内(组织-Tek OCT;Sakura,Torrance,Calif),并将其放在含有乙醇的干冰浴上。然后使用标准冰冻切片机(徕卡显微系统(Leica Microsystems))对冰冻块进行切片(10μm厚),并安装于载玻片上进行染色。
免疫组织化学免疫组织化学分析按照与以前研究类似的方式进行(例如Messina等人,2003,Exper.Neurol.184:816-829)。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤组织切片,使其暴露于含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif)和0.3%(v/v)Triton(TritonX-100;Sigma)的蛋白质阻断溶液1小时,以使该溶液进入细胞内抗原。在所关注表位位于细胞表面上(CD34、ox-LDL R1)的情况下,在流程的所有步骤中省略Triton以防止表位丢失。此外,在第一抗体针对山羊产生(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况下,在整个流程中使用3%(v/v)驴血清替代山羊血清。第一抗体在阻断溶液中稀释,然后被施加到切片并在室温下保持4小时的时间段。去除第一抗体溶液,并在施加含阻断剂连同山羊抗小鼠IgG德克萨斯红(1:250;Molecular Probes,Eugene,Oreg.)和/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1:250;Molecular Probes)或驴抗山羊IgG-FITC(1:150;Santa Cruz Biotech)的第二抗体溶液(在室温下1小时)之前用PBS洗涤培养物。洗涤培养物,并且施加10微摩尔DAPI(MolecularProbes)10分钟,使细胞核显色。
经过免疫染色后,使用奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,N.Y.)上的适当的荧光滤光片使荧光可视化。阳性染色表示为超过对照染色的荧光信号。使用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif.)捕获代表性图像。对于三染样品,每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。使用Adobe Photoshop软件(Adobe,SanJose,Calif.)制作分层剪辑。
结果
脐带表征波形蛋白、结蛋白、SMA、CK18、vWF和CD34标记物在脐带内存在的细胞亚群中表达。具体地讲,vWF和CD34表达局限于脐带内所含的血管。CD34+细胞位于最内层(内腔侧)。在脐带的所有基质和血管中存在波形蛋白表达。SMA限制于基质以及动脉和静脉的外壁上,但不包含在血管自身内。CK18和结蛋白仅在血管中观察到,结蛋白局限于中层和外层。
胎盘表征:波形蛋白、结蛋白、SMA、CKI8、vWF和CD34均在胎盘中观察到并具有区域特异性。
GROα、GCP-2、ox-LDL RI和NOGO-A组织表达:这些标记物无一在脐带或胎盘组织内观察到。
总结:波形蛋白、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、细胞角蛋白18、血管性血友病因子和CD34在人脐带和胎盘内的细胞中表达。
实施例8
使用寡核苷酸阵列分析产后组织衍生的细胞
使用Affymetrix GENECHIP阵列,对脐和胎盘衍生的细胞的基因表达谱与成纤维细胞、人间充质干细胞和衍生自人骨髓的另一种细胞系的基因表达谱进行比较。该分析提供了产后衍生的细胞和这些细胞经鉴定的独特分子标记物的表征。
方法和材料
细胞的分离和培养经患者同意在正常足月分娩后从国家疾病研究交流会(NDRI,Philadelphia,PA)获得人脐带和胎盘。收到组织后,按照实施例6所述的那样分离细胞。将细胞培养于明胶涂布的组织培养塑料瓶上的生长培养基(使用DMEM-LG)中。在37℃和5%CO2下温育培养物。
人真皮成纤维细胞购自Cambrex Incorporated(Walkersville,Md.;批次9F0844)和ATCC CRL-1501(CCD39SK)。两种细胞系均在具有10%(v/v)胎牛血清(Hyclone)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中培养。细胞生长于标准组织处理的塑料制品上。
人间充质干细胞(hMSC)购自Cambrex Incorporated(Walkersville,Md.;批次2F1655、2F1656和2F1657),并按照制造商的说明书在MSCGM培养基(Cambrex)中培养。细胞在37℃和5%CO2下生长于标准组织培养的塑料制品上。
经患者同意,从NDRI接收人髂嵴骨髓。骨髓根据Ho等人(W003/025149)概述的方法进行处理。以1份骨髓对20份裂解缓冲液的比率,将骨髓与裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mMKHCO3和0.1mM EDTA,pH7.2)混合。对细胞悬浮液进行涡旋,在环境温度下温育2分钟,并在500xg下离心10分钟。弃去上清液,将细胞沉淀物重悬于补充有10%(v/v)胎牛血清和4mM谷氨酰胺的基本必需培养基α(Invitrogen)中。再次离心细胞,并将细胞团块重悬浮于新鲜培养基中。使用台盼蓝染色排除法(Minimal Essential Medium)计算活的单核细胞。将单核细胞以5×104个细胞/cm2接种于组织培养的塑料瓶中。在标准大气O2或5%O2下,并于37℃和5%CO2下温育细胞。将细胞培养5天而不更换培养基。在培养5天后,去除培养基和非贴壁细胞。在培养中维持贴壁细胞。
mRNA的分离和GENECHIP分析:使用细胞刮刀将活跃生长的细胞培养物从烧瓶移除到冷PBS中。以300xg将细胞离心5分钟。去除上清液,并将细胞重悬浮于新鲜PBS中,再次离心。去除上清液,并将细胞沉淀物立即冻存于–80℃。提取细胞mRNA,将其转录成cDNA,再转录成cRNA并用生物素标记。将生物素标记的cRNA与HG-U133A GENECHIP寡核苷酸阵列(Affymetrix,Santa Clara Calif.)杂交。根据制造商说明书进行杂交和数据收集。使用“微阵列显著性分析”(SAM)1.21版计算机软件进行分析(Stanford University;Tusher、V.G.等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5116-5121)。
结果
分析十四个不同细胞群。细胞连同传代信息、培养基底和培养基一起列于表8-1中。
表8-1.由微阵列研究分析的细胞。细胞系通过其识别码连同在分析时的传代、细 胞生长基底和生长培养基一起列出。
细胞群 | 传代数 | 基底 | 培养基 |
脐(022803) | 2 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
脐(042103) | 3 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
脐(071003) | 4 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
胎盘(042203) | 12 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
胎盘(042903) | 4 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
胎盘(071003) | 3 | 明胶 | DMEM,15%FBS,2-ME |
ICBM(070203)(5%O2) | 3 | 塑料 | MEM 10%FBS |
ICBM(062703)(标准O2) | 5 | 塑料 | MEM 10%FBS |
ICBM(062703)(5%O2) | 5 | 塑料 | MEM 10%FBS |
hMSC(批次2F1655) | 3 | 塑料 | MSCGM |
hMSC(批次2F1656) | 3 | 塑料 | MSCGM |
hMSC(批次2F1657) | 3 | 塑料 | MSCGM |
人成纤维细胞(9F0844) | 9 | 塑料 | DMEM-F12,10%FBS |
人成纤维细胞(CCD39SK) | 4 | 塑料 | DMEM-F12,10%FBS |
通过主成分分析对细胞中差异表达的290个基因进行分析,从而评估数据。该分析可以对群体间相似性进行相对比较。
表8-2示出了计算用于比较细胞对的欧氏距离。欧氏距离基于按照不同细胞类型间差异表达的290个基因得出的细胞比较结果。欧氏距离与290个基因的表达间的相似性成反比(即,距离越大,存在越小的相似性)。
表8-2:细胞对的欧氏距离。
表8-3、8-4和8-5示出了在胎盘衍生的细胞中增加的基因表达(表8-3)、在脐衍生的细胞中增加的基因表达(表8-4)、以及在脐和胎盘衍生的细胞中减少的基因表达(表8-5)。名称为“探针组ID”的一列是指位于芯片上的特定位点上的若干寡核苷酸探针的组的制造商识别码,这些探针杂交于指定的基因(“基因名称”列),所述基因包含可以指定登录号(“NCBI登录号”列)在NCBI(基因库)数据库中找到的序列。
表8-3:显示出与测定的其他细胞系相比在胎盘衍生的细胞中具有特定增加的表
达量的基因
表8-4.显示出与测定的其他细胞系相比在脐衍生的细胞中具有特定增加的表达
量的基因
表8-5.显示出与测定的其他细胞系相比在脐和胎盘衍生的细胞中具有减小的表 达量的基因。
表8-6、8-7和8-8示出了在人成纤维细胞(表8-6)、ICBM细胞(表8-7)和MSC(表8-8)中增加的基因表达。
表8-6.显示出与测定的其他细胞系相比在成纤维细胞中具有增加的表达量的基 因。
在成纤维细胞中增加的基因 |
双特异性磷酸酶2 |
KIAA0527蛋白 |
智人cDNA:FLJ23224fis,克隆ADSU02206 |
动力蛋白,细胞质,中间多肽1 |
锚蛋白3,郎飞氏结(锚蛋白G) |
抑制素,βA(激活素A,激活素ABα多肽) |
胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶4(推定功能) |
KIAA1053蛋白 |
微管相关蛋白1A |
锌指蛋白41 |
HSPC019蛋白 |
智人cDNA:FLJ23564fis,克隆LNG10773 |
智人mRNA;cDNA DKFZp564A072(来自克隆DKFZp761J1324) |
LIM蛋白(类似于大鼠蛋白激酶C结合enigma) |
B细胞中κ轻链多肽基因增强子的抑制剂,激酶复合物相关蛋白 |
假定蛋白FLJ22004 |
人(克隆CTG-A4)mRNA序列 |
EST,较类似于细胞因子受体样因子2;细胞因子受体CRL2前体[智人] |
转化生长因子,β2 |
假定蛋白MGC29643 |
由单克隆抗体MRC OX-2识别的抗原 |
推定的X连锁视网膜病蛋白 |
表8-7.显示出与测定的其他细胞系相比在ICBM来源细胞中具有增加的表达量的 基因。
表8-8.显示出与测定的其他细胞系相比在MSC细胞中具有增加的表达量的基因。
总结:进行该研究以提供衍生自脐带和胎盘的产后细胞的分子表征。该分析包括衍生自三个不同脐带和三个不同胎盘的细胞。该研究还包括两个不同的真皮成纤维细胞系、三种间充质干细胞系和三种髂嵴骨髓细胞系。使用包含22,000个基因的探针的寡核苷酸阵列分析由这些细胞表达的mRNA。结果表明290个基因在这五个不同细胞类型中差异表达。这些基因包括在胎盘衍生的细胞中特定增加的十种基因和在脐带衍生的细胞中特定增加的七种基因。发现五十四种基因与其他细胞类型相比在胎盘和脐带中具有特定降低的表达水平。所选基因的表达已通过PCR加以证实(参见下文的实施例)。这些结果表明,例如与骨髓衍生的细胞和成纤维细胞相比,产后衍生的细胞具有独特基因表达谱。
实施例9
产后衍生的细胞中的细胞标记物
在前述实施例中,通过(使用寡核苷酸阵列)比较衍生自人胎盘和人脐带的细胞的基因表达谱与衍生自其他来源的细胞的基因表达谱,来评估衍生自人胎盘和人脐带的细胞的相似性和差异。鉴定出六种“标签”基因:氧化LDL受体1、白介素-8、肾素、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3(CXC配体3)和粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)。这些“标签”基因在产后衍生的细胞中以相对较高的水平表达。
进行该实施例中所述的程序以验证微阵列数据并寻找基因和蛋白表达之间的一致/不一致,以及建立一系列可靠测定法,用于检测脐胎盘衍生和脐衍生的细胞的唯一识别符。
方法和材料
细胞:胎盘衍生的细胞(三个分离物,如通过核型分析鉴定包括一个主要新生儿分离物)、脐衍生的细胞(四个分离物)和正常人真皮成纤维细胞(NHDF;新生儿和成人)生长于明胶涂布的T75烧瓶中的含有青霉素/链霉素的生长培养基中。间充质干细胞(MSCS)生长于间充质干细胞生长培养基试剂盒中(MSCGM;Cambrex,Walkerville,Md.)。
IL-8方案如下:将液氮中的细胞解冻,并以5,000个细胞/cm2接种于明胶涂布的烧瓶中,在生长培养基中生长48小时,然后再在10毫升血清饥饿培养基(DMEM—低葡萄糖(Gibco,Carlsbad,Calif.),青霉素/链霉素(Gibco,Carlsbad,Calif.)和0.1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA;Sigma,St.Louis,Mo.)中生长8小时。该处理之后,提取RNA并将上清液以150×g离心5分钟以去除细胞碎片。然后将上清液在-80℃下冷冻,以进行ELISA分析。
用于ELISA测定的细胞培养物:将衍生自胎盘和脐的产后细胞以及衍生自人新生儿包皮的人成纤维细胞培养于明胶涂布的T75烧瓶中的生长培养基中。在液氮中冷冻11代的细胞。将细胞解冻并转移到15毫升离心管中。在150×g下离心5分钟后,弃去上清液。将细胞重悬于4毫升培养基中并计数。使细胞以375,000个细胞/烧瓶在含有15毫升生长培养基的75cm2烧瓶中生长24小时。将培养基更换为血清饥饿培养基并培养8小时。在温育结束时收集血清饥饿培养基,以14,000×g离心5分钟(并保存于-20℃下)。
为了估算每个烧瓶中细胞的数量,向每个烧瓶中加入2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Calif)。将细胞从烧瓶分离后,用8毫升生长培养基中和胰蛋白酶活性。将细胞转移到15毫升离心管中并以150×g离心5分钟。去除上清液,并将1毫升生长培养基添加至每管中以重悬细胞。使用血球计估算细胞数量。
ELISA测定法:使用ELISA测定法(R&D Systems,Minneapolis,Minn.)分析由细胞分泌到血清饥饿培养基中的IL-8的量。根据制造商提供的使用说明,测试所有测定法。
总RNA的分离从汇合的产后衍生的细胞和成纤维细胞中提取RNA,或测定如上所述那样处理的细胞的IL-8表达量。根据制造商的说明书(小量提取试剂盒;Qiagen,Valencia,Calif),用350微升含有β-巯基乙醇的缓冲液RLT(Sigma,St.Louis,Mo.)使细胞裂解。根据制造商的说明书(小量提取试剂盒;Qiagen,Valencia,Calif)提取RNA,并使其经受脱氧核糖核酸酶(Sigma St.Louis,Mo.)处理(2.7U/样品)。用50微升经DEPC处理的水洗脱RNA并在-80℃下保存。
逆转录:另外从人胎盘和脐中提取RNA。将组织(30毫克)悬浮于700微升含有2-巯基乙醇的缓冲液RLT中。将样品进行机械匀浆,并根据制造商说明书进行RNA提取。RNA用50微升经DEPC处理的水提取并保存于-80℃下。使用随机六聚体和逆转录试剂(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)在25℃下使RNA逆转录10分钟,在37℃下使RNA逆转录60分钟并在95℃下使RNA逆转录10分钟。样品保存于-20℃下。
使用实时和常规PCR进一步研究由cDNA微阵列鉴定为产后细胞中独特调控的基因(标签基因–包括氧化LDL受体、白介素-8、肾素和浆膜蛋白)。
实时PCR:使用基因表达产物对cDNA样品进行PCR:根据制造商的说明书(Applied Biosystems,Foster City,Calif.),使用具有ABI prism 7000SDS软件(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)的7000序列检测系统,将氧化LDL受体(Hs00234028)、肾素(Hs00166915)、浆膜蛋白(Hs003825 15)、CXC配体3(Hs00171061)、GCP-2(Hs00605742)、IL-8(Hs00174103)和GAPDH(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)与cDNA和Universal PCR预混液混合。热循环条件初始为50℃保持2min,然后在95℃下保持10min,接着在95℃下保持15秒,再在60℃下保持1min(后两步循环40次)。根据制造商的说明书(Applied Biosystems公司用于ABI Prism 7700序列检测系统的UserBulletin#2)分析PCR数据。
常规PCR:使用ABI PRISM 7700(Perkin Elmer Applied Biosystems,Boston,Mass.,USA)进行常规PCR以验证实时PCR得出的结果。使用2微升cDNA溶液、1×AmpliTaqGold通用混合物PCR反应缓冲液(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)进行PCR,最初在94℃下变性5分钟。针对每个引物组优化扩增。对于IL-8、CXC配体3和浆膜蛋白,在94℃下保持15秒,接着在55℃下保持15秒,再在72℃下保持30秒,循环30次;对于肾素,在94℃下保持15秒,接着在53℃下保持15秒,再在72℃下保持30秒,循环38次;对于氧化LDL受体和GAPDH,在94℃下保持15秒,接着55℃下保持15秒,再在72℃下保持30秒,循环33次。用于扩增的引物列于表9-1中。最终PCR反应物中引物浓度为1微摩尔,不同的是GAPDH,其为0.5微摩尔。GAPDH引物与实时PCR相同,不同的是未将制造商的探针添加于最终PCR反应物中。将样品在2%(w/v)琼脂糖凝胶上进行电泳,并用溴化乙锭(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)染色。用667Universal Twinpack胶片(VWR International,South Plainfield,N.J.)和焦距型Polaroid照相机(VWR International,South Plainfield,N.J.)采集图像。
表9-1:使用的引物
免疫荧光:使用冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)在室温下固定PPDC10分钟。使用脐衍生的细胞和胎盘衍生的细胞在第0代(PO)(在分离后直接)和第11代(P11)各一个分离物(胎盘衍生的细胞的两个分离物,脐衍生的细胞的两个分离物)和成纤维细胞(P11)。使用针对下列表位的抗体进行免疫细胞化学分析:波形蛋白(1:500,Sigma,St.Louis,Mo.)、结蛋白(1:150;Sigma,针对兔而产生;或者1:300;Chemicon,Temecula,Calif,针对小鼠而产生)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA;1:400;Sigma)、细胞角蛋白18(CK18;1:400;Sigma)、血管性血友病因子(vWF;1:200;Sigma)以及CD34(人CD34III类;1:100;DAKOCytomation,Carpinteria,Calif)。此外,在第11代产后细胞上测试下列标记物:抗人GROα-PE(1:100;Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)、抗人GCP-2(1:100;SantaCruz Biotech,Santa Cruz,Calif)、抗人氧化LDL受体1(ox-LDL R1;1:100;Santa CruzBiotech)和抗人NOGA-A(1:100;Santa Cruz,Biotech)。
用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤培养物,使其暴露于含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif)和0.3%(v/v)Triton(Triton X-100;Sigma,St.Louis,Mo.)的蛋白质阻断溶液30分钟,以使该溶液进入细胞内抗原。在所关注表位位于细胞表面上(CD34、ox-LDL R1)的情况下,在流程的所有步骤中省略Triton X-100以防止表位丢失。此外,在第一抗体通过免疫山羊制备(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况下,在整个过程中使用3%(v/v)驴血清替代山羊血清。第一抗体在阻断溶液中稀释,然后被施加到培养物在室温下保持1小时的时间段。去除第一抗体溶液,并在施加含阻断剂连同山羊抗小鼠IgG德克萨斯红(1:250;Molecular Probes,Eugene,Oreg.)和/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1:250;Molecular Probes)或驴抗山羊IgG-FITC(1:150;Santa Cruz Biotech)的第二抗体溶液(在室温下1小时)之前用PBS洗涤培养物。然后洗涤培养物,并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟,使细胞核显色。
经过免疫染色后,使用奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,N.Y.)上的适当的荧光滤光片使荧光可视化。在所有情况下,阳性染色表示超过对照染色的荧光信号,其中除了施用第一抗体溶液外遵循上述所有流程。使用彩色数码摄像机和软件(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif)捕获代表性图像。对于三染样品,每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。然后使用软件(Adobe,San Jose,Calif)制作分层剪辑。
制备用于FACS分析的细胞:在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(Gibco,Carlsbad,Calif)中洗涤烧瓶中的贴壁细胞,并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Calif)脱离。将细胞收获、离心并以每毫升1×10 7个细胞的浓度重悬于3%(v/v)FBS的PBS溶液中。将一百微升等分试样递送至锥形管中。使用Perm/Wash缓冲液(BD Pharmingen,San Diego,Calif)对已对细胞内抗原染色的细胞进行透化处理。根据制造商的说明书,将抗体加入等分试样中,并将细胞在4℃下在黑暗中温育30分钟。在温育之后,用PBS洗涤细胞并离心去除过量抗体。将需要第二抗体的细胞重悬于100微升3%FBS中。根据制造商的说明书,加入第二抗体,并将细胞在4℃下在黑暗中温育30分钟。在温育之后,用PBS洗涤细胞并离心去除过量第二抗体。将洗涤后的细胞重悬于0.5毫升PBS中并用流式细胞术进行分析。使用以下抗体:氧化LDL受体1(sc-5813;Santa Cruz,Biotech)、GROa(555042;BD Pharmingen,Bedford,Mass.)、小鼠IgG1kappa(P-4685和M-5284;Sigma)、驴抗山羊IgG(sc-3743;Santa Cruz,Biotech.)。用FACScaliburTM(Becton Dickinson San Jose,Calif.)进行流式细胞术分析。
结果
对衍生自人胎盘的细胞、成人和新生儿成纤维细胞以及间充质干细胞(MSC)中的cDNA进行的用于所选“标签”基因的实时PCR结果指示,与其他细胞相比较,氧化LDL受体和肾素均在胎盘衍生的细胞中以更高水平表达。通过AACT方法分析得自实时PCR的数据并以对数尺度表示。浆膜蛋白和氧化LDL受体表达的水平在脐衍生的细胞中比其他细胞中更高。在产后衍生的细胞与对照之间未发现CXC配体3和GCP-2的表达水平的显著差异。通过常规PCR验证实时PCR的结果。PCR产物的测序进一步验证了这些观察结果。使用上表9-1所列的常规PCR CXC配体3引物在产后衍生的细胞与对照之间未发现CXC配体3的表达水平的显著差异。
产后细胞中细胞因子IL-8的产量在生长培养基培养的和血清饥饿的产后衍生的细胞两者中升高。所有实时PCR数据用常规PCR并通过测序PCR产物进行验证。
当在无血清培养基中生长的细胞的上清液中检测IL-8的存在性时,在衍生自脐带细胞和胎盘细胞的一些分离株的培养基中检测到最高量(表9)。在衍生自人真皮成纤维细胞的培养基中未检测到IL-8。
表9-2:通过ELISA测量的IL-8蛋白质表达
ND:未检测到
通过FACS分析同样检查了胎盘衍生的细胞中是否产生氧化LDL受体、GCP-2和GROα。经测试,细胞对GCP-2是阳性的。通过本方法未检测到氧化LDL受体和GRO。
通过免疫细胞化学分析还测试了胎盘衍生的细胞中是否产生所选蛋白质。在分离之后(第0代)立即用4%多聚甲醛固定衍生自人胎盘的细胞,并使其暴露于针对六种蛋白的抗体:血管性血友病因子、CD34、细胞角蛋白18、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。细胞对α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白染色均呈阳性。这一模式在整个第11代均得以保持。仅有一些细胞(<5%)在第0代对细胞角蛋白18染色呈阳性。
通过免疫细胞化学分析,针对所选蛋白质的产生探测在第0代时衍生自人脐带的细胞。在分离之后(第0代)立即用4%多聚甲醛固定细胞,并使其暴露于针对六种蛋白的抗体:血管性血友病因子、CD34、细胞角蛋白18、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。脐衍生的细胞对于α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白是阳性的,其中染色模式在整个第11代是一致的。
总结:通过微阵列和PCR(实时和常规两种)已确定如下四种基因的基因表达水平之间的一致性:氧化LDL受体1、肾素、浆膜蛋白和IL-8。这些基因的表达在PPDC的mRNA水平受到差异调控,且IL-8在蛋白质水平也受到差异调控。通过FACS分析在衍生自胎盘的细胞中未在蛋白质水平上检测到氧化LDL受体的存在。GCP-2和CXC配体3的差异表达在mRNA水平上未得到验证,但是通过FACS分析,在胎盘衍生的细胞中在蛋白质水平上检测到了GCP-2。虽然最初从微阵列实验得到的数据并不能反映该结果,但这可能是由于方法灵敏度上的差异而造成的。
衍生自人胎盘的细胞在分离之后(第0代)立即对α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白染色均呈阳性。这一模式也在第11代细胞中观察到。波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达可在生长培养基中、在这些过程中所采用的条件下在细胞中随传代保持。针对α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的表达,探测在第0代时衍生自人脐带的细胞,并且该细胞对于α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白均是阳性的。染色模式在整个11代均得以保持。
实施例10
产后衍生的细胞的体外免疫学评价
体外评价产后衍生的细胞(PPDC)的免疫学特性,以便预测在体内移植时这些细胞是否会引发任何免疫反应。通过流式细胞术分析PPDC是否存在HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2。这些蛋白由抗原递呈细胞(APe)表达,并且是初始CD4+T细胞的直接刺激所需的(Abbas&Lichtman,CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY,第5版(2003)Saunders,Philadelphia,第171页)。还通过流式细胞术分析了细胞系是否表达HLA-G(Abbas&Lichtman,2003,同上)、CD 178(Coumans等人,(1999)Journal of ImmunologicalMethods,224,185-196)和PD-L2(Abbas&Lichtman,2003,同上;Brown等人,(2003)TheJournal of Immunology,170:1257-1266)。存在于胎盘组织中的细胞对这些蛋白的表达被认为介导子宫内胎盘组织的免疫豁免状态。为了预测胎盘衍生和脐衍生的细胞系在体内引发免疫应答的程度,在单向混合淋巴细胞反应(MLR)中测试所述细胞系。
方法和材料
细胞培养:在涂布有2%明胶(Sigma,St.Louis,Mo.)的T75培烧瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)中的含有青霉素/链霉素的生长培养基中,将细胞培养至汇合。
抗体染色:在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(Gibco,Carlsbad,Calif.)中洗涤细胞,并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Mo.)脱离。将细胞收获、离心并以每毫升1×107个细胞的浓度重悬于3%(v/v)FBS的PBS溶液中。根据制造商的说明书,将抗体(表10-1)加入一百微升细胞悬浮液中,并在4℃下在黑暗中温育30分钟。在温育之后,用PBS洗涤细胞并离心去除未结合的抗体。将细胞重悬于五百微升PBS中,并使用FACSCaliburTM仪器(BectonDickinson,San Jose,Calif.)通过流式细胞术进行分析。
表10-1.抗体
抗体 | 制造商 | 产品目录号 |
HLA-DRDPDQ | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555558 |
CD80 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 557227 |
CD86 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 555665 |
B7-H2 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 552502 |
HLA-G | Abcam(Cambridgeshire,UK) | ab 7904-100 |
CD 178 | Santa Cruz(San Cruz,CA) | sc-19681 |
PD-L2 | BD Pharmingen(San Diego,CA) | 557846 |
小鼠IgG2a | Sigma,St.Louis,MO | F-6522 |
小鼠IgG1κ | Sigma,St.Louis,MO | P-4685 |
混合淋巴细胞反应:将标记为细胞系A的第10代脐衍生的细胞和标记为细胞系B的第11代胎盘衍生的细胞的冻存小瓶放在干冰上运送至CTBR公司(Senneville,Quebec),以使用CTBR SOP No.CAC-031进行混合淋巴细胞反应。从多个男性和女性志愿捐献者收集外周血单核细胞(PBMC)。用丝裂霉素C处理刺激物(供体)同种异体PBMC、自体PBMC和产后细胞系。将自体和丝裂霉素C处理的刺激细胞添加至应答(受体)PBMC并培养4天。温育后,将[3H]-胸腺嘧啶核苷添加至每个样品并培养18小时。收获细胞后,提取放射性标记的DNA并使用闪烁计数器测定[3H]-胸腺嘧啶核苷结合。
将同种异体供体(SIAD)的刺激指数计算为接受者加丝裂霉素C处理的同种异体供体的平均增殖率再除以接受者的基线增殖率。将PPDC的刺激指数计算为接受者加丝裂霉素C处理的产后细胞系的平均增殖率再除以接受者的基线增殖率。
结果
混合淋巴细胞反应—胎盘衍生的细胞:筛选七名人志愿献血者,以鉴定出在与其他六名献血者的混合淋巴细胞反应中表现出强增殖应答的单个同种异体供体。将该供体选择为同种异体阳性对照供体。将其余六名献血者选择为受体。将同种异体阳性对照供体和胎盘衍生的细胞系用丝裂霉素C处理,并培养于混合淋巴细胞反应体系中,使其与六种单独的同种异体接受者反应。使用具有三种接受者/板的两个细胞培养板,一式三份进行反应(表10-2)。平均刺激指数在1.3(板2)至3(板1)的范围内,并且同种异体供体阳性对照在46.25(板2)至279(板1)的范围内(表10-3)。
表10-2.混合淋巴细胞反应数据—细胞系B(胎盘)
板ID:板2
表10-3.在与六种单独的同种异体接受者的混合淋巴细胞反应中胎盘细胞和同种 异体供体的平均刺激指数。
接受者 | 胎盘 | |
板1(接受者1-3) | 279 | 3 |
板2(接受者4-6) | 46.25 | 1.3 |
混合淋巴细胞反应—脐衍生的细胞:筛选六名人志愿献血者,以鉴定出在与其他五名献血者的混合淋巴细胞反应中表现出强增殖应答的单个同种异体供体。将该供体选择为同种异体阳性对照供体。将剩余的五名献血者选择为受体。将同种异体阳性对照供体和胎盘细胞系用丝裂霉素处理并培养于混合淋巴细胞反应物中使其与五种单独的同种异体接受者反应。使用具有三种接受者/板的两个细胞培养板,一式三份进行反应(表10-4)。平均刺激指数在6.5(板1)至9(板2)的范围内,并且同种异体供体阳性对照在42.75(板1)至70(板2)的范围内(表10-5)。
表10-4.混合淋巴细胞反应数据-细胞系A(脐带)
增殖测定法的DPM
板ID:板1
板ID:板2
表10-5.在与五种单独的同种异体接受者的混合淋巴细胞反应中脐带衍生的细胞 和同种异体供体的平均刺激指数。
接受者 | 脐带 | |
板1(接受者1-4) | 42.75 | 6.5 |
板2(接受者5) | 70 | 9 |
抗原递呈细胞标记物—胎盘衍生的细胞:流式细胞术分析所得的胎盘衍生的细胞的直方图说明了HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达,如与IgG对照一致的荧光值所指出的,这表明胎盘细胞系缺少直接刺激CD4+T细胞所需的细胞表面分子。
免疫调节标记物—胎盘衍生的细胞:流式细胞术分析所得的胎盘衍生的细胞的直方图说明了PD-L2的阳性表达,如相对于IgG对照荧光值增加所指出的,并说明了CD178和HLA-G的阴性表达,如与IgG对照一致的荧光值所指出的。
抗原递呈细胞标记物—脐衍生的细胞:流式细胞术分析所得的脐衍生的细胞的直方图说明了HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达,如与IgG对照一致的荧光值所指出的,这表明脐细胞系缺少直接刺激CD4+T细胞所需的细胞表面分子。
免疫调节细胞标记物—脐衍生的细胞:流式细胞术分析所得的脐衍生的细胞的直方图说明了PD-L2的阳性表达,如相对于IgG对照荧光值增加所指出的,并说明了CD178和HLA-G的阴性表达,如与IgG对照一致的荧光值所指出的。
总结:在用胎盘衍生的细胞系进行的混合淋巴细胞反应中,平均刺激指数在1.3至3的范围内,而同种异体阳性对照的平均刺激指数在46.25至279的范围内。在用脐衍生的细胞系进行的混合淋巴细胞反应中,平均刺激指数在6.5至9的范围内,而同种异体阳性对照的平均刺激指数在42.75至70的范围内。胎盘衍生的和脐衍生的细胞系对于刺激蛋白HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达是阴性的,如通过流式细胞术所测定的。胎盘衍生的和脐衍生的细胞系对于免疫调节蛋白HLA-G和CD178的表达是阴性的,并且对于PD-L2的表达是阳性的,如通过流式细胞术所测定的。同种异体供体PBMC包含表达HLA-DR、DQ、CD8、CD86和B7-H2的抗原递呈细胞,从而允许刺激初始CD4+T细胞。胎盘衍生和脐衍生的细胞上缺少初始CD4+T细胞直接刺激所需的抗原递呈细胞表面分子以及存在免疫调节蛋白PD-L2,可导致与同种异体对照相比由这些细胞在MLR中表现出低刺激指数。
实施例11
产后衍生的细胞中营养因子的分泌
测定胎盘衍生的细胞和脐组织衍生的细胞中所选营养因子的分泌量。选择用于检测的因子包括:(1)已知具有血管生成活性的那些因子,例如肝细胞生长因子(HGF)(Rosen等人,(1997)Ciba Found.Symp.212:215-26)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(Salcedo等人,(2000)Blood 96:34-40)、白介素-8(IL-8)(Li等人,(2003)J.Immunol.170:3369-76)、角质细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)(Hughes等人,(2004)Ann.Thorac.Surg.77:812-8)、基质金属蛋白酶1(TIMP1)、促血管生成素2(ANG2)、血小板衍生生长因子(PDGF-bb)、促血小板生成素(TPO)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、基质细胞衍生因子1α(SDF-1α);(2)已知具有神经营养/神经保护活性的那些因子,例如脑源性神经营养因子(BDNF)(Cheng等人,(2003)Dev.Biol.258:319-33)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)、转化生长因子β2(TGFβ2);以及(3)已知具有趋化因子活性的那些,例如巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP1a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、Rantes(调节激活正常T细胞表达和分泌)、I309、胸腺活化调节趋化因子(TARe)、嗜酸细胞活化趋化因子、巨噬细胞衍生趋化因子(MDC)、IL-8。
方法和材料
细胞培养:将来自胎盘和脐的PPDC以及衍生自人新生儿包皮的人成纤维细胞培养于明胶涂布的T75烧瓶上的含有青霉素/链霉素的生长培养基中。冻存第11代的细胞并保存在液氮中。细胞解冻后,将生长培养基添加至所述细胞,接着转移到15毫升离心管中并以150×g将细胞离心5分钟。弃去上清液。将细胞沉淀物重悬于4毫升生长培养基中,并对细胞进行计数。以375,000个细胞/75cm2含有15毫升生长培养基的烧瓶接种细胞,并培养24小时。将培养基更换为无血清培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco),0.1%(w/v)牛血清白蛋白(西格玛公司),青霉素/链霉素(Gibco))并培养8小时。在温育结束时通过在14,0000xg下离心5分钟收集无血清条件培养基,并保存于-20℃下。
为了估算每个烧瓶中的细胞数量,用PBS洗涤细胞,并使用2毫升胰蛋白酶/EDTA分离。通过添加8毫升生长培养基来抑制胰蛋白酶活性。以150×g将细胞离心5分钟。去除上清液,并将细胞重悬于1毫升生长培养基中。使用血球计估算细胞数量。
ELISA测定法:使细胞在37℃下于5%二氧化碳和大气氧中生长。也使胎盘衍生的细胞(批次101503)在5%氧气或β-巯基乙醇(BME)中生长。通过ELISA测定法(R&D Systems,Minneapolis,Minn.)测定每个细胞样品所产生的MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1α、GCP-2、IL-8和TGF-β2的量。所有测定法均根据制造商的说明书进行。
SearchLightTM多重ELISA测定法:使用SearchLightTM蛋白质组阵列(PierceBiotechnology Inc.)测定趋化因子(MIP1a、MIP1b、MCP-1、Rantes、1309、TARC、嗜酸细胞活化趋化因子、MDC、IL8)、BDNF和血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGF-bb、TPO、HB-EGF)。蛋白质组阵列为用于定量测定每孔2至16种蛋白的多重夹心ELISA。通过以2×2、3×3或4×4的模式将4至16种不同捕获抗体点样于96孔板的每孔中,来产生阵列。夹心ELISA流程后,对整块板拍照以捕获板的每孔内每个点样处产生的化学发光信号。每个点样中产生的信号量与原标准品或样品中的靶蛋白的量成比例。
结果
ELISA测定法:MCP-1和IL-6由胎盘衍生的细胞和脐衍生的细胞以及真皮成纤维细胞分泌(表11-1)。SDF-1α由在5%0 2中培养的胎盘衍生的细胞以及由成纤维细胞分泌。GCP-2和IL-8由脐衍生的细胞以及由在BME或5%02存在下所培养的胎盘衍生的细胞分泌。GCP-2也由人成纤维细胞分泌。ELISA测定法不可检出TGF-β2。
表11-1.ELISA结果:营养因子的检测
关键:ND:未检出,=/-sem
SearchLightTM多重ELISA测定法:由脐衍生的细胞分泌TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8(表11-2和11-3)。由胎盘衍生的细胞分泌TIMP1、TPO、KGF、HGF、HBEGF、BDNF、MIP1a、MCP-1、RANTES、TARC、嗜酸细胞活化趋化因子和IL-8(表11-2和11-3)。未检出Ang2、VEGF或PDGF-bb。
表11-2.SEARCHLIGHT多重ELISA测定结果
关键:hFB(人成纤维细胞)、P1(胎盘衍生的细胞(042303))、U1(脐衍生的细胞(022803))、P3(胎盘衍生的细胞(071003))、U3(脐衍生的细胞(071003))。ND:未检出
表11-3.SEARCHLIGHT多重ELISA测定结果
关键:hFB(人成纤维细胞)、P1(胎盘衍生的PPDC(042303))、U1(脐衍生的PPDC(022803))、P3(胎盘衍生的PPDC(071003))、U3(脐衍生的PPDC(071003))。ND:未检出
实施例12
产后衍生的细胞的短期神经分化
检测了胎盘衍生的细胞和脐衍生的细胞(统称为产后衍生的细胞或PPDC)分化成神经系细胞的能力。
方法和材料
产后细胞的分离和扩增如实施例4所述那样分离并扩增来自胎盘和脐组织的PPDC。
改进的Woodbury-Black方案(A):本测定法改自最初为测试骨髓基质细胞(1)的神经诱导潜能而实施的测定法。将脐衍生的细胞(022803)P4和胎盘衍生的细胞(042203)P3解冻,培养物在生长培养基中以5,000个细胞/cm2扩增直至达到半汇合(75%)。然后使细胞胰蛋白酶化并以每孔6,000个细胞接种于Titretek II玻璃载片(VWR International,Bristol,Conn.)。作为对照,另外在相同条件下接种间充质干细胞(P3;1F2155;Cambrex,Walkersville,Md.)、成骨细胞(P5;CC2538;Cambrex)、脂肪来源细胞(Artecel,美国专利No.6,555,374B1)(P6;供体2)和人新生儿真皮成纤维细胞(P6;CC2509;Cambrex)。
所有细胞起初在含有15%(v/v)胎牛血清(FBS;Hyclone,Logan,Utah)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF;20纳克/毫升;Peprotech,Rocky Hill,N.J.)、表皮生长因子(EGF;20纳克/毫升;Peprotech)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中扩增4日。四日之后,用磷酸盐缓冲盐水(PBS;Invitrogen)冲洗细胞,随后在DMEM/F12培养基+20%(v/v)FBS+青霉素/链霉素中培养24小时。24小时之后,用PBS冲洗细胞。然后将细胞在诱导培养基中培养1-6小时,该诱导培养基由DMEM/FI2(无血清)构成,DMEM/FI2含有200mM丁基羟基茴香醚、10μM氯化钾、5毫克/毫升胰岛素、10μM毛喉素、4μM丙戊酸和2μM皮质醇(所有化学物质均购自Sigma,St.Louis,Mo.)。然后在100%冰冷甲醇中固定细胞,并对其进行免疫细胞化学分析(参见下文的方法)以评估人巢蛋白表达。
改进的Woodbury-Black方案(B):将PPDC(脐(022803)P11;胎盘(042203)P11和成人真皮成纤维细胞(1F1853,P11)解冻,培养物在生长培养基中以5,000个细胞/cm2扩增直至达到半汇合(75%)。然后使细胞胰蛋白酶化并以近似于方案(A)中的密度接种,但接种到(1)24孔经组织培养物处理的板(TCP,Falcon品牌,VWR International),(2)TCP孔+2%(w/v)明胶(在室温下吸附1小时),或(3)TCP孔+20μg/mL吸附的小鼠层粘蛋白(在37℃下最少吸附2小时;Invitrogen)。
正如方案(A)中那样,起初扩增细胞,然后在上述时间段转换培养基。如前文所述,一组培养物在第5日固定6小时,而这次用冰冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)在室温下固定10分钟。在第二组培养物中,去除培养基并转换至神经祖细胞扩增培养基(NPE),神经祖细胞扩增培养基(NPE)由含有B27(B27;增补剂;Invitrogen)、左旋谷酰胺(4mM)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的神经基础A培养基(Invitrogen)组成。NPE培养基另外补充有视黄酸(RA;1μM;Sigma)。4日之后去除该培养基,在室温下用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)将培养物固定10分钟,并对其染色以确定巢蛋白、GFAP和TuJ1蛋白表达(参见表12-1)。
表12-1.使用的第一抗体汇总
两阶段分化方案:将PPDC(脐(042203)P11;胎盘(022803)P11)、成人真皮成纤维细胞(P11;1F1853;Cambrex)解冻,培养物在生长培养基中以5,000个细胞/cm2扩增直至达到半汇合(75%)。然后使细胞胰蛋白酶化并以2,000个细胞/cm2接种,但在补充有bFGF(20纳克/毫升;Peprotech,Rocky Hill,N.J.)和EGF(20纳克/毫升;Peprotech)的NPE培养基(整个培养基组成另外被称为NPE+F+E)的存在下接种到涂布有层粘连蛋白的24孔板(BDBiosciences,Franklin Lakes,N.J.)上。同时,也将从海马体分离的成年大鼠神经祖细胞(P4;(062603)在NPE+F+E培养基中接种到涂布有层粘连蛋白的24孔板上。所有培养物均在这种条件下保持6日的时间段(在此期间喂饲细胞一次),然后将培养基转换至表12-2所列出的分化条件,再保持7日的时间段。在室温下用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)将培养物固定10分钟,并对其染色以确定人或大鼠巢蛋白、GFAP和TuJ1蛋白表达。
表12-2.两阶段分化方案条件汇总
多种生长因子方案:将脐衍生的细胞(P11;(042203))解冻,培养物在生长培养基中以5,000个细胞/cm2扩增直至达到半汇合(75%)。然后使细胞胰蛋白酶化并以2,000个细胞/cm2接种,在NPE+F(20纳克/毫升)+E(20纳克/毫升)的存在下接种到涂布有层粘连蛋白的24孔板(BD Biosciences)上。此外,一些孔含有NPE+F+E+2%FBS或10%FBS。在“预分化”条件下保持4日之后,去除所有培养基,并将样品转换至补充有音猬因子(SHH;200纳克/毫升;Sigma,St.Louis,Mo.)、FGF8(100纳克/毫升;Peprotech)、BDNF(40纳克/毫升;Sigma)、GDNF(20纳克/毫升;Sigma)和视黄酸(1μM;Sigma)的NPE培养基中。变换培养基七日后,在室温下用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)将培养物固定10分钟,并对其染色以确定人巢蛋白、GFAP、TuJ1、结蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达。
神经祖细胞共培养方案:成年大鼠海马体祖细胞(062603)作为神经球或单细胞(10,000细胞/孔)在NPE+F(20纳克/毫升)+E(20纳克/毫升)中接种到涂布有层粘连蛋白的24孔盘(BD Biosciences)上。
分别将脐衍生的细胞(042203)P11和胎盘衍生的细胞(022803)P11解冻,培养物在NPE+F(20纳克/毫升)+E(20纳克/毫升)中以5,000个细胞/cm2扩增48小时的时间段。然后使细胞胰蛋白酶化并以2,500个细胞/孔接种到现有神经祖细胞培养物上。此时,将现有培养基调换成新鲜培养基。四日之后,在室温下用冰冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)将培养物固定10分钟,并对人核蛋白(hNuc;Chemicon)(上表12-1)染色以鉴定PPDC。
免疫细胞化学分析:使用表12-1所列出的抗体进行免疫细胞化学分析。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤培养物,将其暴露于含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif)和0.3%(v/v)Triton(Triton X-100;Sigma)的蛋白质阻断溶液30分钟,以使该溶液进入细胞内抗原。第一抗体在阻断溶液中稀释,然后被施加到培养物在室温下保持1小时的时间段。接着,去除第一抗体溶液,并在施加含阻断剂溶液连同山羊抗小鼠IgG德克萨斯红(1:250;Molecular Probes,Eugene,Oreg.)和山羊抗兔IgG-Alexa 488(1:250;MolecularProbes)的第二抗体溶液(在室温下1小时)之前用PBS洗涤培养物。然后洗涤培养物,并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟,使细胞核显色。
经过免疫染色后,使用奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,N.Y.)上的适当的荧光滤光片使荧光可视化。在所有情况下,阳性染色表示超过对照染色的荧光信号,其中除了施用第一抗体溶液外遵循上述所有流程。使用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif)捕获代表性图像。对于三染样品,每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。然后使用Adobe Photoshop软件(Adobe,San Jose,Calif)制作分层剪辑。
结果
改进的Woodbury-Black方案(A):在这种神经诱导组合物中温育后,所有类型的细胞均转换成具有双极性形态和较长突起的细胞。还观察了其他更大的非双极性形态。此外,所诱导细胞群对巢蛋白(多能神经干细胞和祖细胞的标记物)染色呈阳性。
改进的Woodbury-Black方案(B):当在组织培养塑料(TCP)盘上重复时,未观察到巢蛋白表达,除非层粘连蛋白被预先吸附至培养物表面。为了进一步评估表达巢蛋白的细胞是否可继续产生成熟的神经元,将PPDC和成纤维细胞暴露于NPE+RA(1μM)(一种已知诱导神经干细胞和祖细胞分化成这类细胞(2、3、4)的培养基组合物)中。对细胞的TuJ1(用于未成熟和成熟神经元的标记物)、GFAP(星形胶质细胞的标记物)和巢蛋白染色。在任何情况下均未检测到TuJ1,也未观察到具有神经元形态的细胞。此外,巢蛋白和GFAP不再由PPDC表达,正如通过免疫细胞化学所测定的那样。
两阶段分化:将脐和胎盘PPDC分离物(以及人成纤维细胞和啮齿动物神经祖细胞分别作为阴性和阳性对照细胞类型)接种在涂布有层粘连蛋白(神经促进)的盘中,并使其暴露于已知促进神经祖细胞分化成神经元和星形胶质细胞的13种不同的生长条件(和两种对照条件)下。此外,添加两种条件以研究GDF5和BMP7对PPDC分化的影响。一般来讲,采用两步分化方法,即,首先将细胞置于神经祖细胞扩增条件下,保持6日的时间段,然后在完全分化条件下保持7日。在形态学上讲,在此过程的整个时间段内,脐和胎盘衍生的细胞两者的细胞形态均发生了根本性变化。但是,未观察到神经元或星形胶质细胞,除非在对照、神经祖细胞接种条件下。免疫细胞化学对人巢蛋白、TuJ1和GFAP呈阴性,验证了形态学观察结果。
多种生长因子:在暴露于多种神经分化剂一周之后,对表示神经祖细胞(人巢蛋白)、神经元(TuJ1)和星形胶质细胞(GFAP)的细胞标记物染色。在不含血清的培养基中,生长在第一阶段的细胞具有与在含血清(2%或10%)培养基中的那些细胞不同的形态,这表明发生了潜在的神经分化。具体地讲,在将脐衍生的细胞暴露于EGF和bFGF中,然后暴露于SHH、FGF8、GDNF、BDNF和视黄酸中的两步工序之后,细胞显现较长突起,类似于所培养星形胶质细胞的形态。当在分化第一阶段中包括2%FBS或10%FBS时,细胞数目有所增加,并且细胞形态与高密度对照培养物相同。通过人巢蛋白、TuJ1或GFAP的免疫细胞化学分析未证实发生潜在神经分化。
神经祖细胞和PPDC共培养:将PPDC接种到两日之前在神经扩增条件(NPE+F+E)下接种有大鼠神经祖细胞的培养物上。虽然对所接种PPDC的目视确认显示这些细胞作为单细胞受到接种,但接种后4日的人特异性细胞核染色(hNuc)(总共6日)表明,这些细胞易于成团并避免与神经祖细胞接触。此外,在PPDC所附着之处,这些细胞铺展开并似乎由大鼠起源的分化神经元支配,这表明PPDC可能已经分化成肌细胞。这一观察结果是基于相差显微镜下的形态而做出的。另一观察结果为,大细胞体(比神经祖细胞大)通常具有与神经祖细胞相像的形态,其中薄突起沿多个方向生成。hNuc染色(见于一半的细胞核中)表明在一些情况下这些人细胞可能已经与大鼠祖细胞融合并呈现其表型。只含神经祖细胞的对照孔比含有脐或胎盘PPDC的共培养孔具有更少的总祖细胞和表观分化细胞,这进一步表明脐衍生的细胞和胎盘衍生的细胞或者通过释放趋化因子和细胞因子或者通过接触介导作用,均影响神经祖细胞的分化和行为。
总结:实施了多个方案来确定PPDC分化成神经系细胞的短期潜能。这些方案包括形态相差成像结合巢蛋白、TuJ1和GFAP(分别与多能神经干细胞和祖细胞、未成熟和成熟神经元以及星形胶质细胞相关的蛋白)的免疫细胞化学分析。
实施例13
产后衍生的细胞的长期神经分化
评估了脐衍生的细胞和胎盘衍生的细胞(统称为产后衍生的细胞或PPDC)发生长期分化,分化成神经系细胞的能力。
方法和材料
PPDC的分离和扩增:如前述实施例所述那样分离和扩增PPDC。
PPDC细胞解冻和接种:将此前在生长培养基中生长的PPDC冷冻等分试样(脐(022803)P11;(042203)P11;(071003)P12;胎盘(101503)P7)解冻,并在含有B27(B27增补剂,Invitrogen)、左旋谷酰胺(4mM)和青霉素/链霉素(10毫升)的神经基础A培养基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)(这些成分的组合在本文中称为神经祖细胞扩增(NPE)培养基)中以5,000个细胞/cm 2接种在涂布有层粘连蛋白的T-75烧瓶(BD,Franklin Lakes,N.J.)中。NPE培养基进一步补充有bFGF(20纳克/毫升,Peprotech,Rocky Hill,N.J.)和EGF(20纳克/毫升,Peprotech,Rocky Hill,N.J.),在本文中称为NPE+bFGF+EGF。
对照细胞接种:此外,将成人真皮成纤维细胞(P11,Cambrex,Walkersville,Md.)和间充质干细胞(P5,Cambrex)解冻,并在NPE+bFGF+EGF中以相同细胞接种密度接种在涂布层粘连蛋白的T-75烧瓶上。作为另外的对照,使成纤维细胞、脐和胎盘PPDC在生长培养基中均生长对所有培养物指定的时间段。
细胞扩增所有培养物的培养基每周用新鲜培养基替换一次,并观察细胞扩增。一般来讲,由于在NPE+bFGF+EGF中生长程度有限,每种培养物在一个月的时间段内传代一次。
免疫细胞化学分析一个月之后,在室温下用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)将所有烧瓶固定10分钟。使用针对TuJ1(BIII Tubulin;1:500;Sigma,St.Louis,Mo.)和GFAP(胶质原纤维酸性蛋白;1:2000;DakoCytomation,Carpinteria,Calif.)的抗体进行免疫细胞化学分析。简言之,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤培养物,将其暴露于含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif.)和0.3%(v/v)Triton(Triton X-100;Sigma)的蛋白质阻断溶液30分钟,以使该溶液进入细胞内抗原。初级抗体在阻断溶液中稀释,然后被施加到培养物在室温下保持1小时的时间段。接着,去除第一抗体溶液,并在施加含阻断剂连同山羊抗小鼠IgG德克萨斯红(1:250;Molecular Probes,Eugene,Oreg.)和山羊抗兔IgG-Alexa 488(1:250;Molecular Probes)的第二抗体溶液(在室温下1小时)之前用PBS洗涤培养物。然后洗涤培养物,并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟,使细胞核显色。
经过免疫染色后,使用奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,N.Y.)上的适当的荧光滤光片使荧光可视化。在所有情况下,阳性染色表示超过对照染色的荧光信号,其中除了施用第一抗体溶液外遵循上述所有流程。使用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif.)捕获代表性图像。对于三染样品,每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。使用Adobe Photoshop软件(Adobe,San Jose,Calif.)制作分层剪辑。
表13-1.使用的第一抗体汇总
结果
NPE+bFGF+EGF培养基减慢了PPDC的扩增并改变其形态。在接种之后,一部分PPDC立即附着到涂布有层粘连蛋白的培养烧瓶。这可能是由于冷冻/解冻过程的作用,或由于新的生长条件而造成的细胞死亡所导致的。附着的细胞呈现与在生长培养基中观察到的那些不同的形态。
脐衍生的细胞的克隆表达神经元蛋白:在解冻/接种后一个月时,固定培养物并对神经元蛋白TuJ1和GFAP(在星形胶质细胞中发现的中间丝状蛋白)染色。虽然发现在生长培养基中生长的所有对照培养物和人成纤维细胞以及在NPE+bFGF+EGF培养基中生长的MSC为TuJ1-/GFAP-,但在脐和胎盘PPDC中检测到TuJ1。在呈现和不呈现神经元样形态的细胞中观察到表达。在任何培养物中均未观察到GFAP的表达。表达TuJ1的呈神经元样形态的细胞百分比小于或等于总群体的1%(n=3所测试脐衍生的细胞分离物)。虽然未经量化,但在脐衍生的细胞培养过程中不呈神经元形态的TuJ1+细胞的百分比高于在胎盘衍生的细胞培养过程。这些结果似乎是特定的,因为年龄匹配的对照在生长培养基中不表达TuJ1。
总结:开发了由脐衍生的细胞产生分化神经元(基于TuJ1表达和神经元形态)的方法。虽然未在一个月之内在体外检测TuJ1的表达,但很清楚至少一小部分脐衍生的细胞群可或者通过默认分化或者在暴露于补充有左旋谷酰胺、碱性FGF和EGF的基本培养基一个月之后通过长期诱导产生神经元。
实施例14
用于支持神经祖细胞的PPDC营养因子
通过非接触式依赖(营养)机制,研究了脐衍生的细胞和胎盘衍生的细胞(统称为产后衍生的细胞或PPDC)对成体神经干细胞和祖细胞存活和分化的影响。
方法和材料
成体神经干细胞和祖细胞分离:通过CO2窒息然后颈椎脱臼来处死Fisher 344成年大鼠。使用咬骨钳完整取下整个大脑,根据运动神经后方的冠状切口解剖海马组织和大脑的躯体感觉区(Paxinos,G.&Watson,C.1997.“The Rat Brain in StereotaxicCoordinates”)。在含有B27(B27增补剂,Invitrogen)、左旋谷酰胺(4mM;Invitrogen)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的神经基础A培养基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中(这些成分的组合在本文中称为神经祖细胞扩增(NPE)培养基)洗涤组织。NPE培养基进一步补充有bFGF(20纳克/毫升,Peprotech,Rocky Hill,N.J.)和EGF(20纳克/毫升,Peprotech,RockyHill,N.J.),在本文中称为NPE+bFGF+EGF。
在洗涤之后,去除上层脑膜,并用手术刀切碎组织。收集切碎的组织,并向其中加入总体积75%的胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)。还加入脱氧核糖核酸酶(100微升/8毫升总体积,Sigma,St.Louis,Mo.)。接着,将组织/培养基顺序通过18号针、20号针,最后25号针,一次通过一根针(所有针均购自Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)。将混合物以250g离心3分钟。去除上清液,加入新鲜NPE+bFGF+EGF并重悬沉淀物。使所得细胞悬浮液通过40微米细胞滤网(Becton Dickinson),然后接种在涂布层粘连蛋白的T-75烧瓶(BectonDickinson)或24孔低簇板(Becton Dickinson)上,并在NPE+bFGF+EGF培养基中生长直至对于所述研究得到足够的细胞数目。
PPDC接种:将此前在生长培养基中生长的产后衍生的细胞(脐(022803)P12;(042103)P12;(071003)P12;胎盘(042203)P12)以5,000个细胞/细胞小室(24孔板的尺寸)接种,并在插入物中的生长培养基中生长一周的时间段以达到汇合。
成体神经祖细胞接种:将神经祖细胞(作为神经球或作为单细胞生长)在NPE+bFGF+EGF中以每孔2,000个细胞的合适密度接种到涂布层粘连蛋白的24孔板上,保持一日的时间段以促进细胞附着。一日之后,根据下面的方案加入包含产后细胞的细胞小室:
a.细胞小室(生长培养基中的脐衍生的细胞,200微升)+神经祖细胞(NPE+bFGF+EGF,1毫升)
a.细胞小室(生长培养基中的胎盘衍生的细胞,200微升)+神经祖细胞(NPE+bFGF+EGF,1毫升)
c.细胞小室(成人真皮成纤维细胞[1F 1853;Cambrex,Walkersville,Md.]生长培养基中的P12,200微升)+神经祖细胞(NPE+bFGF+EGF,1毫升)
d.对照:单独神经祖细胞(NPE+bFGF+EGF,1毫升)
e.对照:单独神经祖细胞(仅NPE,1毫升)
免疫细胞化学分析:共培养7日之后,在室温下用冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)将所有条件固定10分钟的时间段。免疫细胞化学分析使用针对表14-1中所列出表位的抗体进行。简言之,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤培养物,将其暴露于含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif.)和0.3%(v/v)Triton(Triton X-100;Sigma)的蛋白质阻断溶液30分钟,以使该溶液进入细胞内抗原。初级抗体在阻断溶液中稀释,然后被施加到培养物在室温下保持1小时的时间段。接着,去除第一抗体溶液,并在施加含阻断剂溶液连同山羊抗小鼠IgG德克萨斯红(1:250;Molecular Probes,Eugene,Oreg.)和山羊抗兔IgG-Alexa488(1:250;Molecular Probes)的第二抗体溶液(在室温下1小时)之前用PBS洗涤培养物。然后洗涤培养物,并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟,使细胞核显色。
经过免疫染色后,使用奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus,Melville,N.Y.)上的适当的荧光滤光片使荧光可视化。在所有情况下,阳性染色表示超过对照染色的荧光信号,其中除了施用第一抗体溶液外遵循上述所有流程。使用彩色数码摄像机和ImagePro软件(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif.)捕获代表性图像。对于三染样品,每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。使用Adobe Photoshop软件(Adobe,San Jose,Calif.)制作分层剪辑。
表14-1.使用的第一抗体汇总
神经祖细胞分化的定量分析定量研究了海马体神经祖细胞分化。每种条件下计数最少1000个细胞,或者如果不足1000个细胞,则计数在这种条件下观察到的细胞总数目。用阳性细胞数目除以如通过DAPI(细胞核)染色确定的细胞总数目,来评估对于给定染色呈阳性的细胞的百分比。
质谱分析及2D凝胶电泳:为了鉴定由于共培养而独特分泌的因子,将在固定培养物之前采集的条件培养基样品在-80℃下冷冻过夜。然后将样品施加到超滤旋转装置(截留MW为30kD)。将渗余物施加至免疫亲和色谱(抗Hu白蛋白;IgY)(免疫亲和不能去除样品中的白蛋白)。通过MALDI分析滤液。将滤出物施加至Cibachron Blue亲和色谱。通过SDS-PAGE和2D凝胶电泳分析样品。
结果
PPDC共培养刺激成体神经祖细胞分化:在与脐衍生的细胞或胎盘衍生的细胞培养之后,衍生自成年大鼠海马体的共培养神经祖细胞沿中枢神经系统中所有三个主要谱系表现出显著分化。在共培养五日之后明显观察到这种效果,其中多个细胞伸出精细复杂突起,并失去分裂中祖细胞所特有的相界明亮的特征。反之,在不存在bFGF和EGF的情况下,单独生长的神经祖细胞看起来不健康且存活期有限。
在该过程结束之后,对表示未分化干细胞和祖细胞(巢蛋白)、未成熟和成熟神经元(TuJ1)、星形胶质细胞(GFAP)和成熟少突胶质细胞(MBP)的培养标记物染色。虽然对照条件未表现出显著分化,但沿所有三个谱系的分化得到证实,如巢蛋白阳性染色在大多数细胞中保持所证实的那样。虽然脐衍生的细胞和胎盘衍生的细胞均引起细胞分化,但所有三个谱系的分化程度在与胎盘衍生的细胞共培养中比在与脐衍生的细胞共培养中小。
定量在与脐衍生的细胞共培养之后分化神经祖细胞的百分比(表14-2)。脐衍生的细胞显著增加了成熟少突胶质细胞(MBP)的数目(在两种对照条件下为24.0%与0%)。另外,共培养增加了培养物中GFAP+星形胶质细胞和TuJ1+神经元的数目(分别为47.2%和8.7%)。通过巢蛋白染色验证了这些结果,这表明在共培养之后失去了祖细胞状态(在对照条件4下为13.4%与71.4%)。
虽然分化似乎也受成人成纤维细胞的影响,但这类细胞不能促进成熟少突胶质细胞的分化也不能产生可观量的神经元。虽然未经定量,但成纤维细胞似乎的确延长神经祖细胞的存活期。
表14-2:对照中祖细胞分化的定量对比脐衍生的细胞在细胞小室共培养中祖细胞
分化的定量(E=EGF,F=bFGF)
鉴定独特的化合物:研究脐衍生和胎盘衍生共培养中的条件培养基连同合适对照(NPE培养基±I.7%血清,与成纤维细胞共培养中的培养基)的差异。鉴定出潜在独特的化合物并从其各自2D凝胶切下。
总结:成体神经祖细胞与脐或胎盘PPDC的共培养引起这些细胞分化。本实施例中所示结果表明,在与脐衍生的细胞共培养之后成体神经祖细胞的分化特别明显。具体地讲,在脐衍生的细胞的共培养中生成了很大百分比的成熟少突胶质细胞。
实施例15
产后衍生的细胞的移植
衍生自产后脐和胎盘的细胞可用于再生疗法。评估了由连同可生物降解的材料移植到SCID小鼠中的产后衍生的细胞(PPDC)产生的组织。所评估的材料为Vicryl非织造材料、35/65PCL/PGA泡沫和RAD 16自组装肽水凝胶。
方法和材料
细胞培养胎盘衍生的细胞和脐衍生的细胞在明胶涂布的烧瓶中的生长培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco,Carlsbad Calif.)、15%(v/v)胎牛血清(目录号SH30070.03;Hyclone,Logan,Utah)、0.001%(v/v)β巯基乙醇(Sigma,St.Louis,Mo.)、青霉素/链霉素(Gibco))中生长。
样品制备:将一百万活细胞接种在15微升生长培养基中,接种到5mm直径、2.25mm厚Vicryl非织造支架(64.33毫克/cc;批次3547-47-1)或5mm直径35/65PCL/PGA泡沫(批次3415-53)上。在添加更多生长培养基来覆盖支架之前使细胞附着两小时。使细胞在支架上生长过夜。不带细胞的支架也在培养基中温育。
RAD16自组装肽(3D Matrix,Cambridge,MA)以无菌1%(w/v)水溶液的形式获得,该溶液在使用之前才与10%(w/v)蔗糖(Sigma,St Louis,Mo.)、10mM HEPES中的1×106个细胞在达尔贝科改良培养基(DMEM;Gibco)以1:1混合。RAD 16水凝胶中细胞的最终浓度为1×106个细胞/100微升。
测试材料(N=4/Rx)
a.Vicryl非织造材料+1×106个脐衍生的细胞
b.35/65PCL/PGA泡沫+1×106个脐衍生的细胞
c.RAD 16自组装肽+1×106个脐衍生的细胞
d.Vicryl非织造材料+1×106个胎盘衍生的细胞
e.35/65PCL/PGA泡沫+1×106个胎盘衍生的细胞
f.RAD 16自组装肽+1×106个胎盘衍生的细胞
g.35/65PCL/PGA泡沫
h.Vicryl非织造材料
动物准备:根据动物福利法的现行要求处理和饲养动物。通过遵守动物福利法规(9CFR)并符合在《第7版实验动物管理和使用指南》中公布的当前标准来实现符合以上公法。
小鼠(小家鼠)/Fox Chase SCID/雄性(Harlan Sprague Dawley,Inc.,Indianapolis,Ind.),5周龄:对SCID小鼠的所有处理均在罩下进行。将小鼠单独称重,并经腹膜内注射60毫克/kg KETASET(盐酸氯胺酮,Aveco Co.,Inc.,Fort Dodge,Iowa)和10毫克/kg ROMPUN(甲苯噻嗪,Mobay Corp.,Shawnee,Kans.)和盐水的混合物而麻醉。在诱导麻醉后,通过使用电动动物剪将动物从颈背部区域到腰骶背部区域的整个背部的毛发剪光。然后用二醋酸氯己定擦洗该区域,用醇冲洗,干燥,并涂抹1%有效碘的碘伏水溶液。将眼用软膏施用到眼睛以防止麻醉期间该组织干燥。
皮下移植技术:在小鼠的背部制作每个长度约为1.0cm的四个皮肤切口。两个颅部位横向位于胸背外侧区域上方所触摸到的肩胛骨下边缘尾侧约5mm处,一个部位在脊柱的左边,另一个部位在脊柱的右边。在中线的每一侧上制作一个切口,并将这两个另外的切口横向置于臀肌区域上方尾侧骶腰水平所触摸到的髂嵴尾侧约5mm处。根据实验设计将植入物随机置于这些部位中。将皮肤与下层结缔组织分离以形成小袋,并将植入物放置在(或注射RAD16)切口的尾侧约1cm处。将合适的测试材料植入皮下间隙中。用金属夹闭合皮肤切口。
动物圈养:在整个研究过程中将小鼠单独圈养在64℉-79℉的温度范围和30%至70%的相对湿度范围内的小隔离笼子中,并保持大约12小时昼/12小时夜循环。最大程度上将温度和相对湿度保持在所述范围内。不限量喂饲由辐射处理的Pico小鼠饲料5058(Purina Co.)和水组成的饮食。
在指定时间间隔后通过吸入二氧化碳对小鼠实施安乐死。切下皮下植入部位及其上层皮肤,并将其冷冻以进行组织学分析。
组织学:用10%中性福尔马林缓冲液(Richard-Allan Kalamazoo,Mich.)固定切下的皮肤及植入物。从中心平分具有上方组织和相邻组织的样品,然后经石蜡处理并使用常规方法嵌在切割表面上。通过切片机得到五微米组织部分,然后采用常规方法用苏木精和伊红(Poly Scientific Bay Shore,N.Y.)对其染色。
结果
在30日之后,极少组织向内生长进入经皮下植入SCID小鼠中的泡沫(无细胞)中。相比之下,大量组织填入与脐衍生的细胞或胎盘衍生的细胞一起植入的泡沫中。在Vicryl非织造支架中观察到一些组织向内生长。接种有脐衍生的或胎盘衍生的细胞的非织造支架表现出增加的基质沉积和成熟的血管。
总结:将合成可吸收非织造/泡沫盘(5.0mm直径×1.0mm厚)或自组装肽水凝胶接种上来自人脐或胎盘的细胞,并经皮下植入SCID小鼠的脊柱区域两侧。结果表明,产后衍生的细胞可显著促进可生物降解支架中优质组织的形成。
实施例16
脐组织衍生的细胞中的端粒酶表达
端粒酶的功能是合成端粒重复序列,端粒重复序列用于保护染色体完整性并延长细胞的复制寿命((Liu,K等人,PNAS,1999;96:5147-5152)。端粒酶由两种组分组成:端粒酶RNA模板(hTER)和端粒酶逆转录酶(hTERT)。端粒酶的调控通过hTERT而非hTER的转录进行测定。因此hTERT mRNA的实时聚合酶链反应(PCR)为用于测定细胞的端粒酶活性的可接受方法。
细胞分离进行实时PCR实验以测定人脐带组织衍生的细胞的端粒酶产生。根据上述实施例制备人脐带组织衍生的细胞。一般来讲,在正常分娩后洗涤从国家疾病研究交流会(Philadelphia,Pa.)获得的脐带以去除血液和细胞碎片,并进行机械解离。然后将该组织与消化酶(包括胶原酶、分散酶和透明质酸酶)一起在37℃下在培养基中温育。根据在以上实施例中提出的方法培养人脐带组织衍生的细胞。从Cambrex公司(Cambrex,Walkersville,Md)获得间充质干细胞和正常真皮成纤维细胞(cc-2509批次9F0844)。多能人胚胎癌(畸胎瘤)细胞系nTera-2细胞(NTERA-2cl.Dl)(参见,Plaia等人,Stem Cells,2006;24(3):531-546)购自ATCC(Manassas,Va.)并根据上文提出的方法进行培养。
总RNA的分离。使用试剂盒(Qiagen,Valencia,Ca.)从细胞提取RNA。用50微升经DEPC处理的水洗脱RNA并在-80℃下保存。用无规六聚体引物和逆转录试剂(Applied Biosystems,Foster City,Ca.)将RNA进行逆转录,在25℃下保持10分钟,在37℃下保持60分钟,在95℃下保持10分钟。将样品保存于-20℃下。
实时PCR根据制造商的说明书(Applied Biosystems),使用Applied BiosystemsAssays-On-DemandTM(也称为Gene Expression Assays),对cDNA样品进行PCR。这种商业试剂盒广泛用于测定人细胞中的端粒酶。简言之,使用具有ABI prism 7000SDS软件(应用生物系统公司)的7000序列检测系统,将hTert(人端粒酶基因)(Hs00162669)和人GAPDH(内对照)与cDNA和通用PCR扩增预混试剂混合。热循环条件为初始50℃共2分钟和95℃共10分钟,随后为95℃共15秒和60℃共1分钟的40个循环。根据制造商的说明书分析PCR数据。
测定人脐带组织衍生的细胞(ATCC登录号PTA-6067)、成纤维细胞和间充质干细胞的hTert和18S RNA。如表16-1所示,hTert和因此的端粒酶未在人脐带组织衍生的细胞中检出。
测定人脐带组织衍生的细胞(分离物022803,ATCC登录号PTA-6067)和nTera-2细胞,并且结果显示两个批次的人脐带组织衍生的细胞中均未表达端粒酶,而畸胎瘤细胞系显示出高水平的表达(表16-2)。
因此,可得出如下结论:本发明的人脐带组织衍生的细胞不表达端粒酶。
在本说明书通篇引用了各种专利和其他出版物。这些出版物各自全文以引用方式并入本文。
尽管已通过参考实例和优选的实施方案对本发明的多个方面进行了阐述,但应当理解,本发明的范围不由前面的描述限定,而是由专利法的原理正确解释的权利要求书所限定。
Claims (10)
1.一种向患有视网膜变性的受试者的眼睛施用产后衍生的细胞群的方法,其中所述细胞群为人脐带组织衍生的细胞的同质群体,其中所述人脐带组织衍生的细胞从基本上不含血液的人脐带组织分离,其中所述细胞群分泌至少一种突触发生因子,并且其中所述突触发生因子选自TSP-1、TSP-2和TSP-4。
2.一种诱导视网膜神经元中突触发生或神经突增生的方法,包括向所述受试者的眼睛施用人脐带组织衍生的细胞的同质群体,其中所述细胞群从基本上不含血液的人脐带组织分离,其中所述人脐带组织衍生的细胞群分泌至少一种突触发生因子,并且其中所述突触发生因子选自TSP-1、TSP-2和TSP-4。
3.一种在患有视网膜变性的受试者的视网膜神经元中形成功能性突触的方法,包括向所述受试者的眼睛施用包含人脐带组织衍生的细胞的同质群体的组合物,其中所述细胞群从基本上不含血液的人脐带组织分离,其中所述人脐带组织衍生的细胞群分泌至少一种突触发生因子,并且其中所述突触发生因子选自TSP-1、TSP-2和TSP-4。
4.一种向患有视网膜变性的受试者的眼睛施用人脐带组织衍生的细胞群的方法,其中所述细胞群从基本上不含血液的人脐带组织分离,其中所述人脐带组织衍生的细胞群分泌至少一种突触发生因子,并且其中所述突触发生因子选自TSP-1、TSP-2和TSP-4。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中从基本上不含血液的人脐带组织分离的所述细胞群能够在培养中扩增,具有分化成至少一种神经表型的细胞的潜能,在传代时保持正常核型,并且具有下述特征:
a) 在培养中40次群体倍增的潜能;
b) 产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90;
c) 不产生CD31、CD34、CD45、CD117和CD141;以及
d) 相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞而言,编码白介素8和浆膜蛋白1的基因表达有所提高。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述细胞群对于HLA-A、HLA-B、HLA-C是阳性的,并且对于HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ是阴性的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述视网膜神经元选自视网膜神经节细胞、感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)、视网膜无长突细胞、水平细胞或双极细胞。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中向所述眼睛施用选自向所述眼睛内部施用或在所述眼睛后面施用。
9.根据权利要求3所述的方法,其中所述组合物为药物组合物。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
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