CN104736160A - 肺及肺部疾病和病症的促炎介质的hUTC调节 - Google Patents

Abstract

本发明涵盖用于调节（例如减少）涉及患有肺疾病、病症和/或损伤的患者中的肺疾病、病症和/或损伤病理的促炎介质的产生的方法、药物组合物和药盒，所述方法、药物组合物和药盒利用脐带组织衍生的细胞。本发明还涵盖利用脐带组织衍生的细胞用于抑制涉及患有肺疾病、病症和/或损伤的患者中的肺疾病、病症和/或损伤病理的促炎介质的产生的方法、药物组合物和药盒，所述方法、药物组合物和药盒利用脐带组织衍生的细胞。在一个实施例中，脐带组织衍生的细胞从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117或CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。

Description

肺及肺部疾病和病症的促炎介质的hUTC调节

技术领域

本发明涉及用于调节肺及肺部疾病和病症的促炎介质的基于细胞的疗法。

背景技术

肺疾病(慢性和急性两种)、病症和/或损伤依然是遍及全世界的发病率和死亡率的显著原因。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全世界第四大死亡主因(Spurzem和Rennard，Semin Respir Crit Care Med《呼吸与危重症医学研讨会》，2005；26：142-153)，并且可以通过气道的解剖狭窄或带有干扰正常呼吸的粘液的气道阻塞引起。另外，间质性肺病，也称为肺纤维化，分类为包括多种慢性肺病症的限制性疾病。慢性肺疾病的管理包括药物疗法、氧疗法、手术和肺康复。

虽然90％的COPD患者是吸烟者，但仅10％的吸烟者发展该疾病，提示遗传素质可能是重要的预后因素(Siafakas和Tzortzaki，Respir Med《呼吸病学》，2002；96：615-24)。吸烟者的肺疾病的特征在于慢性活动性炎症、气道粘液分泌过多和肺气肿(MacNee，Proc Am Thorac Soc.《美国胸科学会论文集》2005；2：258-66)，并且在戒烟后仅是部分可逆的(Spurzem和Rennard，Semin Respir Crit Care Med《呼吸与危重症医学研讨会》，2005；26：142-153)。气道炎症和肺实质在COPD的发病中起重要作用。吸烟已显示诱导肺炎症，并且即使香烟烟雾暴露停止也最终导致COPD。

肺气肿是决定COPD的发病率和死亡率的主要因素之一。肺气肿定义为肺(包括呼吸性细支气管和肺泡)中的周围空气间隙扩大，其伴随肺泡壁结构的破坏，并且特征在于例如来自支持肺组织的结构诸如例如肺泡破坏和供给肺泡的毛细血管破坏的肺组织弹性丧失。炎性酶诸如例如弹性蛋白可引起该破坏。由于增加的环境污染物、香烟烟雾及其他对有毒物质的暴露，肺气肿的发生率已增加。目前，用于严重肺气肿的唯一补救是肺移植。因此，仍存在关于治疗、修复和/或改善具有肺气肿(诸如弹性蛋白酶诱导的肺气肿)的患者中的肺损害的足够和有用的方法的极大需要。

急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是重症监护背景下的发病率和死亡率的重要原因，并且特征在于响应直接损伤(例如溺水、肺炎、吸入的有毒气体和肺挫伤)或间接损伤(例如严重败血症、输血、休克和胰腺炎)的低氧血症的突然发作，伴随弥漫性肺水肿。机械通气和支持性护理是目前用于ALI和ARDS的治疗。

限制性肺疾病是发病率和死亡率的最常见原因之一，并且具有三种主要病因学：肺癌、肺炎和肺纤维化。特发性肺纤维化(IPF)是特征在于进行性呼吸困难的致残疾病，并且与高死亡率进行性固定组织纤维化、体系结构扭曲和功能丧失相关(Ortiz L.A.等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.《美国国家科学院院刊》，2003；100：8407-11)。目前，无法获得逆转或延缓IPF原因的有效疗法。大多数治疗诸如皮质类固醇、免疫抑制剂、免疫调节剂或抗纤维化剂寻求抑制炎症，但无一已证明改变疾病进程。因此，存在旨在减慢或停止纤维化同时增强内源肺修复和再生的新型疗法的显著需要。

众多促炎介质已牵涉肺疾病、病症和/或损伤诸如例如呼吸性疾病的病理。例如在肺纤维化中，慢性形式的纤维化间质性肺炎、促纤维化细胞因子的过量或抗纤维化细胞因子的缺乏已牵涉该疾病的病理过程。(Zhao F.等人，Transplant Proceedings《移植进展》，2008；40(5)：1700-1705)。

像这样，这些细胞因子和促炎介质的产生减少和/或抑制可减少肺疾病、病症和/或损伤的症状和/或病理。因此，目前存在减少或抑制这些促炎介质的产生的治疗的极大需要。肺疾病、病症和/或损伤诸如例如COPD的目前治疗包括吸入或口服皮质类固醇、支气管扩张剂和抗胆碱能剂。此外，白介素拮抗剂和针对白介素抗体的使用已得到研究，包括在用于例如哮喘的临床试验中。然而，这些治疗无一提供了涉及肺疾病、病症和/或损伤的症状和/或病理的促炎介质的产生减少和/或抑制。

干细胞移植可用作重构靶组织从而恢复生理和结构功能的临床工具。在肺疾病(慢性和急性两种)、病症和/或损伤的治疗中，焦点已主要集中于使用干细胞技术以再生或修复通过肺疾病、病症和/或损伤损害的肺组织。

因此，存在通过调节与肺疾病、病症和/或损伤的病理相关的介质来治疗肺疾病、病症和/或损伤的方法的需要。特别需要的是持续调节与肺疾病、病症和/或损伤的病理相关的促炎介质的方法。

发明内容

本发明的一个方面的特征在于调节(例如减少)涉及患有肺疾病、病症和/或损伤的患者中的肺疾病、病症和/或损伤病理的促炎介质的产生的方法。此类疾病、病症和/或损伤包括但不限于慢性阻塞性肺疾病(COPD)(例如慢性支气管炎、肺气肿)、肺纤维化、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及与之相关的损害。

本发明的一个实施例是调节涉及患有肺疾病、病症和/或损伤的患者中的肺疾病、病症和/或损伤病理的一种或多种促炎介质的产生的方法，所述方法包括给患者施用有效量的脐带组织衍生的细胞。另一个实施例是减少涉及患有肺疾病、病症和/或损伤的患者中的肺疾病、病症和/或损伤病理的一种或多种促炎介质的产生的方法，所述方法包括给患者施用有效量的脐带组织衍生的细胞(例如有效减少一种或多种促炎介质的产生的量)。

该方法利用从基本上不含血液的人脐带组织中分离的细胞，所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117或CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。在一个实施例中，该细胞不含CD117和CD45的产生，并且任选地也不表达hTERT和端粒酶。在另一个实施例中，该细胞不表达hTERT和端粒酶。在另一个实施例中，该细胞从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117或CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶以及一种或多种下述特征：表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90；不表达CD31或CD34；相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；并且具有分化成至少肺组织的细胞的潜能。

该方法适合于调节(例如减少)肺疾病、病症和/或损伤的促炎介质中的多种的产生。在一个实施例中，促炎介质是TNF-α、RANTES、MCP-1、IL-1β以及它们的组合。促炎介质可涉及肺疾病、病症和/或损伤的进程。

在一个实施例中，该细胞与至少一种其他细胞类型和/或至少一种其他试剂一起施用。其他细胞类型可以是肺细胞诸如例如祖细胞、血管平滑肌细胞、血管平滑肌祖细胞、周细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、或者其他多潜能或多能干细胞。该试剂可选自抗血栓形成剂、抗炎剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、促血管生成剂或抗细胞凋亡剂。

本发明的另一个方面是调节(例如减少)患有慢性阻塞性肺疾病的患者中的慢性阻塞性肺疾病(诸如例如肺气肿或慢性支气管炎)的一种或多种促炎介质的产生的方法，所述方法包括有效量的脐带组织衍生的细胞，其中所述促炎介质介导慢性阻塞性肺疾病的进程，并且其中所述细胞从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。一个实施例是减少患有慢性阻塞性肺疾病的患者中的慢性阻塞性肺疾病(诸如例如肺气肿或慢性支气管炎)的一种或多种促炎介质的产生的方法，所述方法包括有效量的脐带组织衍生的细胞，其中所述促炎介质介导慢性阻塞性肺疾病的进程，并且其中所述细胞从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。所述一种或多种促炎介质可以是TNF-α、RANTES、MCP-1、IL-1β以及它们的组合。

在另一个实施例中，该细胞还可具有下述特征中的一种或多种：表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90；不表达CD31或CD34；相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；并且具有分化成至少肺组织的细胞的潜能。

在一些实施例中，脐带组织衍生的细胞在包含药学上可接受的载体的药物组合物中配制。另选地，该细胞在含有药学上可接受的载体的药盒中配制。该方法可抑制一种或多种促炎介质的产生。

本发明的另一个方面是抑制患有慢性阻塞性肺疾病的患者中的慢性阻塞性肺疾病的一种或多种促炎介质的产生的方法，所述方法包括有效量的脐带组织衍生的细胞。所述一种或多种促炎介质可选自TNF-α、RANTES、MCP-1、IL-1β以及它们的组合。在一个实施例中，COPD是慢性支气管炎或肺气肿。

脐带组织衍生的细胞从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。任选地，该细胞还具有下述特征中的一种或多种：表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90；不表达CD31或CD34；相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；并且具有分化成至少肺组织的细胞的潜能。

在一个实施例中，该细胞在慢性阻塞性肺疾病的部位处施用。

在某些实施例中，在施用之前在体外诱导该细胞分化成肺组织细胞，诸如例如血管平滑肌、周细胞或血管内皮谱系细胞。在其他实施例中，将该细胞遗传改造为产生促进肺疾病、病症和/或损伤治疗的基因产物。

在该方法的一些实施例中，该细胞与至少一种其他细胞类型一起施用，所述其他细胞类型包括肺组织细胞诸如例如肺祖细胞、血管平滑肌细胞、血管平滑肌祖细胞、周细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、或其他多潜能或多能干细胞。其他细胞类型可与脐带组织衍生的细胞同时、在脐带组织衍生的细胞之前或之后施用。

在其他实施例中，所述细胞与至少一种其他试剂一起施用，所述其他试剂可为例如抗血栓形成剂、抗炎剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、促血管生成或抗细胞凋亡剂。其他试剂可与脐带组织衍生的细胞同时、在脐带组织衍生的细胞之前或之后施用。

该细胞优选在肺疾病、病症和/或损伤部位处或附近施用，但也可在远离此类部位的位置处施用。它们可通过注射、输注、在患者体内植入的装置，或通过植入含有所述细胞的基质或支架来施用。该细胞可对患者的肺组织发挥营养作用诸如增殖。该细胞可诱导肺组织细胞诸如例如血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、肺祖细胞、周细胞、血管平滑肌祖细胞或血管内皮祖细胞迁移至肺疾病、病症和/或损伤的一个或多个部位。

本发明的另一个方面是用于调节涉及肺疾病、病症和/或损伤病理的一种或多种促炎介质的产生的药物组合物，所述药物组合物包含脐带组织衍生的细胞，其中所述细胞从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。在一个实施例中，包含脐带组织衍生的细胞的药物组合物减少涉及肺疾病、病症和/或损伤病理的一种或多种促炎介质的产生。在另一个实施例中，包含脐带组织衍生的细胞的药物组合物抑制涉及肺疾病、病症和/或损伤病理的一种或多种促炎介质的产生。本发明的其他方面的特征在于用包含脐带组织衍生的细胞的产物的药物组合物和药盒的治疗。

所述药物组合物可包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或缓冲剂。所述肺疾病可以是慢性阻塞性肺疾病诸如例如慢性支气管炎或肺气肿。

本发明的另外一个实施例是用于调节涉及肺疾病、病症和/或损伤病理的一种或多种促炎介质的产生的药盒，所述药盒包含药学上可接受的载体和脐带组织衍生的细胞。另一个实施例是用于减少涉及肺疾病、病症和/或损伤病理的一种或多种促炎介质的产生的药盒，所述药盒包含药学上可接受的载体和脐带组织衍生的细胞。在一个实施例中，脐带组织衍生的细胞从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。所述肺疾病可以是慢性阻塞性肺疾病诸如例如慢性支气管炎或肺气肿。

通过参考下面的具体实施方式和实例将会理解本发明的其他特征和优点。

附图说明

在结合附图阅读上述发明内容以及以下对本发明的详细说明时能够更好地进行理解。出于说明本发明的目的，附图展示了本发明的实施例。然而应当理解，本发明不局限于示出的精确布置方式、实例和工具。

图1示出了BALF总蛋白质浓度。总蛋白质使用Pierce BCA蛋白质测定法进行测量。每个数据点代表得自单只动物的测量。水平线代表所有测量的平均值。进行T检验分析。该数据以列表形式示出于下表1.2中。

图2示出了细胞因子/趋化因子分析的结果。图2A示出了肺匀浆物的细胞因子/趋化因子分析：遵循制造商的方案，使用小鼠22多路小珠药盒(Millipore)，对于肺匀浆物测定二十二种不同细胞因子/趋化因子的浓度，并且使用BioRad Bioplex机器进行分析。数据条代表六个样品的平均值。该数据以列表形式示出于表1-3和1-4中。图2B示出了BALF的细胞因子/趋化因子分析。遵循制造商的方案，使用小鼠22多路小珠药盒(Millipore)，对于BALF(支气管肺泡灌洗液)测定二十二种不同细胞因子/趋化因子的浓度，并且使用BioRad Bioplex机器进行分析。数据条代表六个样品的平均值。该数据以列表形式示出于表1-5和1-6中。

图3示出了在人脐带组织衍生的细胞(hUTC)施用后1、6、10和14天时，hUTC输注和/或猪胰弹性蛋白酶(PPE)处理对支气管肺泡灌洗(BAL)液组成的作用。图3A示出了关于NSG小鼠的结果，并且图3B示出了关于BALB/c小鼠的结果。阴性对照是用盐水溶液和/或媒介物假感染/致敏的。针对总细胞数目检查BAL液。在每种情况下，评估五(5)只动物。结果表示为细胞数目的平均值±S.E.M.。(*，p＜0.05，***，p＜0.001)。

图4示出了在hUTC施用后1、6、10和14天时，hUTC输注和/或猪胰弹性蛋白酶(PPE)处理对BAL液组成的作用。阴性对照是用盐水溶液和/或媒介物假致敏的。针对嗜中性粒细胞和巨噬细胞的存在检查BAL液。在每种情况下，评估五(5)只动物。结果表示为细胞数目的平均值±S.E.M.。(*，p＜0.05，***，p＜0.001)。

图5示出了在hUTC施用于NOD/SCIDγ小鼠后1、6、10和14天时，hUTC输注和/或猪胰弹性蛋白酶(PPE)处理在BAL上清液细胞因子组成中的作用。图5A示出了关于MCP-1的细胞因子应答。图5B示出了关于TNF-α的细胞因子应答。图5C示出了关于TNF-α的应答，并且图5D示出了关于IL-1β的应答。所述应答由五只小鼠/组独立地进行测定，并且表示为平均值±S.E.M.(*，p＜0.05)。

图6示出了在BALB/c小鼠中的hUTC施用后1、6、10和14天时，hUTC输注和/或猪胰弹性蛋白酶(PPE)处理在BAL上清液组成中的作用。示出了关于MCP-1(参见图6A)、TNF-α(参见图6B)、RANTES(参见图6C)和IL-1β(参见图6D)的细胞因子应答。应答由五(5)只小鼠/组独立地进行测定，并且表示为平均值±S.E.M.(*，p＜0.05)。

图7示出了来自五(5)只动物/组和时间段的在×100的放大率下测量并表示为平均值±SD的平均线性截距(A)和肺泡数目(B)。符号指示统计分析的结果：与弹性蛋白酶组相比较，*p＜0.01，**p，0.005，***p，0.001。

图8示出了使用来自对照小鼠(PBS)或者接受弹性蛋白酶(El)、弹性蛋白酶+hUTC疗法(El+hUTC)或单独的hUTC的小鼠的固定肺切片(n＝5/组)的苏木精和伊红(H&E)染色，肺气肿损害的检测。对于每个样品显示了三(3)个代表性载玻片。原始放大率×100。

图9示出了在第1、6、10和14天时，hUTC减少免疫妥协(NOD/SCIDγ)小鼠中弹性蛋白酶诱导的肺气肿程度。肺气肿损害使用固定肺切片(n＝5/组)的苏木精和伊红(H&E)染色进行检测。原始放大率x100。

图10示出了在第1、6、10和14天时，hUTC减少免疫活性(BALB/c)小鼠中弹性蛋白酶诱导的肺气肿程度。肺气肿损害使用固定肺切片(n＝5/组)的苏木精和伊红(H&E)染色进行检测。原始放大率×100。

图11示出了在NOD/SCIDγ小鼠(参见图11A)和BALB/c小鼠(参见图11B)中的hUTC施用后1、6、10和14天时，hUTC输注和/或猪胰弹性蛋白酶(PPE)处理对肺功能的作用。阴性对照是用盐水溶液和/或媒介物假处理的。

具体实施方式

在例示性实施例的下述详述中，参考构成其一部分的附图。这些实施例充分详细地进行描述，以允许本领域技术人员实践本发明，并且应当理解可利用其他实施例，并且可作出逻辑结构、机械、电和化学变化，而不背离本发明的实质或范围。为了避免对于允许本领域技术人员实践本文描述的实施例不必要的细节，描述可省略本领域技术人员已知的某些信息。下述详述因此不应视为具有限制意义。

本专利申请基于下述发现：在体内背景下的人脐带组织衍生的细胞调节(例如减少)涉及肺疾病、病症和/或损伤(诸如例如COPD)病理的促炎介质的产生。特别地，申请人已发现人脐带组织衍生的细胞的施用导致呼吸性疾病(例如肺疾病、病症和/或损伤)的促炎介质(诸如例如TNF-α、RANTES、MCP-1和IL-1β)产生的减少或甚至抑制。

因此，本发明提供了在调节(例如减少)涉及患有肺疾病的患者中的病理学肺疾病(诸如例如COPD)的促炎介质的产生中使用脐带组织衍生的细胞的方法。在一个实施例中，本发明提供了涉及肺疾病病理的促炎介质的减少或甚至抑制，并且因此引起疾病症状的减少。最佳地，特别与常规药物疗法、氧疗法、手术和肺康复相比较，本发明提供了涉及肺疾病、病症和/或损伤的症状和/或病理的促炎介质的产生的持续调节(例如减少)和/或抑制。

I.定义

整个说明书和权利要求书中使用了多个术语。除非另外指明，否则此类术语被赋予本领域的普通含义。其他具体定义的术语应按照与本文所提供的定义相符的方式理解。

“肺组织”可包括但不限于所有肺组织结构和相关组织，包括但不限于静脉、动脉、血管、毛细血管以及其为此类结构的一部分或与此类结构相关的类型的细胞；肺和胸膜组织；以及血管平滑肌、周细胞和血管内皮谱系和/或表型。

如本文所用，“呼吸性或肺疾病、病症和损伤”包括但不限于阻塞性肺疾病、限制性肺疾病、呼吸道感染(上呼吸道和下呼吸道)、呼吸系统肿瘤、胸膜腔疾病和肺血管疾病。通过这些疾病、病症和/或损伤引起的对肺组织的损害可表征为在本发明的范围内的肺损害。此外，由本发明涵盖的受损的肺组织包括所有肺组织结构和相关组织，包括静脉、动脉、血管、毛细血管以及其为此类结构的一部分或与此类结构相关的类型的细胞。

“阻塞性肺疾病”可包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)(例如慢性支气管炎和肺气肿)、囊性纤维化、支气管扩张、细支气管炎和变应性支气管肺曲霉病。COPD例如通过有毒颗粒或气体(最通常来自吸烟)引起，所述有毒颗粒或气体触发肺中的异常炎症应答。较大气道中的炎症应答被称为慢性支气管炎，当人经常咳出痰时，临床上诊断所述慢性支气管炎。在肺泡中，炎症应答引起肺组织的破坏，称为肺气肿的过程。应认识到这些组织是与COPD相关的组织，因为它涉及本发明。COPD的病原学包括但不限于吸烟、对工作场所粉尘的职业暴露(例如在采煤、采金、棉纺织行业和化工行业中)、空气污染和遗传学。

如本文所用，“限制性肺疾病”也称为间质性肺病(ILD)。这些中的许多是特发性的。例子包括特发性肺纤维化、特发性间质性肺炎(其中存在若干类型)、肉样瘤病、嗜酸性粒细胞性肺炎、淋巴管平滑肌瘤病、肺朗格罕氏细胞组织细胞增多症和肺泡蛋白沉积症。ILD影响肺的间质：肺泡上皮、肺毛细血管内皮、基膜、血管周和外淋巴组织。大多数类型的ILD涉及纤维化。

呼吸系统肿瘤包括恶性和良性肿瘤两者。恶性肿瘤包括例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌(腺癌、鳞状上皮细胞癌和大细胞未分化癌)、淋巴瘤以及其他癌症。良性肿瘤是罕见的，但可包括例如肺错构瘤和先天性畸形。

如本文所用，“急性肺损伤”(ALI)是特征在于低氧血症、非心源性肺水肿、低肺顺应性和泛发的毛细血管渗漏的弥漫性异质性肺损伤。ALI通过局部或全身炎症的任何刺激引起。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)比ALI更严重。如本文所用，ALI和ARDS的特征可在于响应直接损伤或间接损伤的低氧血症的突然发作，伴随弥散性肺水肿。如本文所用，“直接损伤”包括但不限于起于溺水事件、肺炎、吸入的有毒气体和肺挫伤的肺损伤。如本文所用，“间接损伤”可来自例如严重败血症、输血、休克和胰腺炎。导致ALI和ARDS的这些损伤导致肺泡-毛细血管界面的破坏、富含蛋白质的流体泄漏到间质和肺泡腔内、细胞因子的广泛释放和嗜中性粒细胞的迁移。

由本发明的方法涵盖的肺疾病、病症和损伤是本领域已知的。本领域技术人员已知各自的特征包括相关并发症、病因学和治疗。这包括本文未具体讨论的肺疾病、病症和损伤，因为它们将适用于阻塞性和限制性肺疾病、病症和损伤。

本发明中使用的细胞一般被称为产后细胞或产后衍生的细胞(PPDC)。该细胞更具体而言是“脐衍生的细胞”或“脐带衍生的细胞”(UDC)、或“脐带组织衍生的细胞”(UTC)。此外，所述细胞可被描述为干细胞或祖细胞，后面的术语在广义中使用。术语“衍生的”用于指示细胞已从其生物来源获得并且在体外生长或以其他方式处理(例如，在生长培养基中培养以扩增群体和/或产生细胞系)。脐干细胞的体外操作和本发明的脐衍生的细胞的独特特征于下文详细地描述。

干细胞是由单细胞自我更新和分化以产生后代细胞的能力定义的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞以及终末分化的细胞。干细胞还由它们的以下能力来表征：从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成多种细胞谱系的功能细胞的能力，以及在移植后产生多个胚层的组织的能力和在注射到胚泡后基本上促成大多数组织(如果不是所有的组织的话)的能力。

根据干细胞的发育潜能，将它们分类为：(1)全能的；(2)多能的；(3)多潜能的；(4)寡能的；和(5)单能的。全能细胞能够产生所有胚胎和胚胎外细胞类型。多能细胞能够产生所有胚胎细胞类型。多潜能细胞包括能够产生细胞谱系子类的那些细胞，但是所有这些细胞在特定组织、器官或生理系统内。例如，造血干细胞(HSC)可产生包括HSC(自我更新)、限制血细胞的寡能祖细胞、以及为血液正常组分的所有细胞类型和元件(如，血小板)的后代。寡能细胞可产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子类。单能细胞能够产生单细胞谱系(例如生精干细胞)。

也基于干细胞获得的来源而将它们分类。成体干细胞一般为在包含多个分化细胞类型的组织中发现的多潜能未分化细胞。成体干细胞可自我更新。在正常情况下，它也可分化产生特化的组织细胞类型(其起源于该组织)，并且可能产生其他组织类型。胚胎干细胞是来自胚泡期胚胎的内细胞团的多能细胞。胎儿干细胞是源于胎儿组织或膜的干细胞。产后干细胞是基本上源于可在分娩后获得的胚胎外组织(即脐带)的多潜能或多能细胞。已发现这些细胞具有多能干细胞的特征特性，包括快速增殖和分化成许多细胞谱系的潜能。产后干细胞可以是血液衍生的(例如，如得自脐带血液的干细胞)或非血液衍生的(例如，如得自脐带的非血液组织)。

多个术语用于描述培养中的细胞。“细胞培养物”一般指取自活生物体且在“培养条件”下生长或“培养”的细胞。原代细胞培养物是在第一次传代培养之前，直接取自生物体的细胞、组织或器官的培养物。当在有利于细胞生长和/或分裂的条件下，将细胞放置在生长培养基中时，它们在培养中扩增，从而产生更大的细胞群。当细胞在培养中扩增时，有时通过细胞数目翻倍所需的时间量来测量细胞增殖率。这被称为“倍增时间”。

术语“细胞系”一般指通过原代细胞培养的一次或多次传代培养形成的细胞群。每一轮传代培养都被称为传代。当对细胞进行传代培养时，所述细胞称为被“传代”。有时特定的细胞群或细胞系指被传代的次数或以被传代的次数为特征。例如，已被传代十次的培养细胞群可称为P10培养物。原代培养物(即，在将细胞从组织分离之后的第一培养物)被指定为P0。在第一次传代培养后，细胞被描述为次代培养物(P1或第1代)。在第二次传代培养后，细胞变成三代培养物(P2或第2代)，依此类推。本领域的技术人员应当理解，在传代期间，可以有多次群体倍增；因此，培养物的群体倍增数大于传代数。细胞在传代之间的期间中的扩增(即群体倍增数目)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、基底、培养基、生长条件和传代之间的时间。

“分化”是非特化的“未定向的”或较少特化的细胞通过其获得特化的细胞(诸如神经细胞或肌肉细胞)特征的过程。“分化”细胞是已在细胞谱系内占据更特化的“定向的”位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子类，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。“去分化”指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。如本文所用，细胞的“谱系”限定细胞的遗传性，即它来自哪些细胞和它可产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。

在广义上，“祖细胞”是具有产生比其自身分化程度更高的后代的能力，然而保持补充祖细胞库能力的细胞。根据此定义，因为干细胞是终末分化细胞的更直接前体，故其本身也是祖细胞。在提及本发明的细胞(如下文更详细地描述)时，可使用该祖细胞的广义定义。在狭义上，祖细胞通常定义为在分化途径中间(即，其起于干细胞)并且在成熟细胞类型或细胞类型子类生产中间的细胞。该祖细胞类型一般不能够自我更新。因此，如果本文提及该细胞类型，则它将被称为“非更新的祖细胞”或“中间祖细胞或前体细胞”。

几个术语在本文中就细胞或组织移植或者细胞替代疗法而言使用。术语“自体转移”、“自体移植”、“自体移接”等等指其中移植供体也是移植受体的细胞的治疗。术语“同种异体转移”、“同种异体移植”、“同种异体移接”等等指其中移植供体与移植受体的物种相同，但供体不是受体的移植。在其中供体细胞已与受体组织相容性匹配的细胞移植有时被称为同基因转移。术语异种转移、异种移植、异种移接等等指其中移植供体与移植受体的物种不同的移植。

术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的媒介物”可与术语“生物相容性载体”或“生物相容性介质”互换使用，一般指这样的试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型，它们不仅与待治疗施用的细胞及其他试剂相容，还适用于与人类和动物的组织接触使用，而无与合理效/险比相称的过度毒性、刺激、变应性应答或其他并发症。

“条件培养基”是特定的细胞或细胞群已在其中培养并随后去除的培养基。当在培养基中培养细胞时，它们可分泌细胞的因子，所述细胞的因子可向其他细胞提供营养支持。此类营养因子包括但不限于激素、细胞因子、细胞外基质(ECM)、蛋白质、囊泡、抗体和颗粒。包含所述细胞的因子的培养基是条件培养基。

一般来讲，“营养因子”定义为促进细胞存活、生长、增殖和/或成熟，或刺激细胞活性增加的物质。

如本文所用，术语“生长培养基”一般指足以培养产后衍生的细胞的培养基。具体地，用于培养本发明的细胞的一个目前优选的培养基包括改良达尔贝科改良必需培养基(Dulbecco’s Modified Essential Media，DMEM)。特别优选的是低葡萄糖DMEM(DMEM-LG)(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。优选地，DMEM-LG补充有血清，最优选地，胎牛血清或人血清。通常，添加15％(v/v)胎牛血清(例如限定胎牛血清(Hyclone，Logan Utah))连同抗生素/抗真菌剂(优选地100单位/毫升青霉素、100毫克/毫升链霉素和0.25微克/毫升两性霉素B；(Invitrogen，Carlsbad，Calif.))和0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma，St.Louis Mo)。在一些情况下，使用不同的生长培养基，或提供不同的补充物，并且这些在正文中通常指示为对生长培养基的补充。在某些限定化学成分的培养基中，所述细胞可在根本不存在血清的条件下生长。在此情况下，所述细胞可能需要某些生长因子，所述生长因子可被添加到培养基中以支持和维持细胞。为了在无血清培养基生长而添加的目前优选的因子包括bFGF、EGF、IGF-I和PDGF中的一种或多种。在更优选的实施例中，将两种、三种或所有四种因子添加到无血清或化学成分确定的培养基中。在其他实施例中，将LIF添加到无血清培养基中以支持或改善细胞的生长。

如本文所用，术语“标准生长条件”指在37℃下、在包含5％CO₂的标准大气和维持在约100％的相对湿度中的细胞培养。虽然前述条件可用于培养，应当理解，此条件能够由本领域中将认识到可用选项的技术人员针对培养细胞改变。

如本文所用，术语“约”在涉及可测量值诸如量、时距等等时，意指涵盖与指定值±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，还更优选地±0.1％的变化，因为此类变化适合执行本发明所公开的方法。

如本文所述，术语“有效量”指有效实现特定生物结果的化合物、材料或组合物的浓度或量。此类结果包括但不限于具有来自在本发明的范围内的这些疾病、病症和损伤的肺损害的患者中的骨骼组织的再生、修复或改善，血流的改善和/或血管生成的刺激和/或支持。此类有效活性可例如通过给具有如本文所述的肺损害的患者施用本发明的细胞和/或组合物来实现。关于UTC对患者的体内施用，有效量可在少至几百或更少至多达几百万或更多的范围内。在具体的实施例中，有效量可在约10³至约10¹¹的范围内，更具体地，至少约10⁴个细胞。应当理解待施用的细胞数目将根据下述而改变：在医学生物学家熟悉的其他因子中，涉及待调节的肺疾病、病症或损伤病理的促炎介质的特异性(包括但不限于待治疗的尺寸或总体积/表面积)，以及施用部位与待治疗区域位置的接近。

术语“治疗”、“医治”或“诊治”指在减轻或改善损伤、病变或病症方面取得的任何成功或成功指示，包括任何客观或主观参数诸如症状减轻、缓解、削弱或使患者更能耐受损伤、病变或病症，减缓退化或衰退速率，使退化终点衰竭程度降低，改善受试者的身体或心理健康，或延长存活持续时间。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数；包括体格检查或神经学检查的结果。

术语“有效期”、“有效时间段”或“有效条件”一般指试剂或药物组合物实现其预期结果必要的或优选的一段时间或其他可控条件(例如关于体外方法的温度、湿度)。

术语“个体”、“患者”或“受试者”在本文中可互换使用，并且指用药物或治疗组合物或根据本文所述方法治疗的动物，优选哺乳动物，并且更优选人。

如本文所用的术语“基质”一般指与细胞一起施用于患者的生物可降解和/或生物吸收性的材料。基质可充当临时支架直至被新生长的细胞例如骨骼肌、周细胞、血管平滑肌或血管内皮组织替换。在一些实施例中，该基质可提供与细胞结合使用的营养特征或其他试剂的持续释放，并且可提供用于使患者中生长的组织发育的结构。在其他实施例中，基质仅仅提供用于发育组织的临时支架。基质可采取颗粒形式(直径大于10微米的大粒子或直径小于10微米的微粒)，或可采取结构稳定的三维植入物(例如支架)的形式。基质可以是浆液、水凝胶或三维结构，诸如立方体、圆柱体、管、块、薄膜、片或适当的解剖形式。

如本文所用的术语“支架”一般指提供用于细胞生长的模板的三维多孔结构。支架由随着时间推移在体内降解的生物可降解和/或生物吸收性的材料制成。支架降解花费的时间长度可取决于材料的分子量。因此，较高分子量的材料可导致聚合物支架，所述聚合物支架使其结构完整性保留更长时间段；而较低分子量导致更缓慢的释放和更短的支架寿命。支架可通过本领域已知的任何方法进行制备。可用于形成支架的聚合物的例子包括天然聚合物和合成聚合物。

如本文所用的术语“分离物”一般指已与其天然环境分开的细胞。该术语包括与其天然环境的肉眼可见的物理分开，例如从供体动物中取出。在优选实施例中，分离的细胞不存在于组织中，即细胞和它通常与之接触的相邻细胞分开或离解。优选地，细胞作为细胞悬浮液施用。如本文所用，短语“细胞悬浮液”包括与培养基接触并且已例如通过对组织片实施轻轻研磨而离解的细胞。

如本文所用的术语“调节”一般意指调整或调控涉及肺疾病、病症和/或损伤病理(例如疾病的表现，例如肺组织变化)的促炎介质的产生、活性和/或量。在一个实施例中，术语调节涵盖减少促炎介质的产生。在另一个实施例中，术语调节涵盖抑制促炎介质的产生。

在本文描述的其多个实施例中，本发明的特征在于用于调节(例如减少或抑制)涉及肺疾病、病症和/或损伤病理的促炎介质的产生的方法和药物组合物，所述方法和药物组合物利用源于产后组织，特别是脐组织的祖细胞和细胞群。这些方法和药物组合物设计为调节(减少和/或抑制)此类促炎介质的产生。此外，它们可任选设计为刺激并支持血管生成，改善血流，再生、修复和改善通过肺疾病、病症和/或损伤损害的肺组织，和/或使肺组织免于此类疾病、病症和/或损伤。

在本发明的药物制剂和方法中使用的细胞、细胞群和制剂(包含细胞裂解液、条件培养基等等)在美国专利7,524,489和7,510,873以及美国公布申请2005/0058634以及本文中详细描述。

II.脐带组织衍生的细胞的分离和生长

根据本文所述的方法，在足月或者早产妊娠时或不久之后(例如，分娩后或出生后)回收哺乳动物脐带。产后组织可在无菌容器(诸如烧瓶、烧杯、培养皿或袋)中从分娩地点运输到实验室。所述容器可含有溶液或培养基，包括但不限于盐溶液，诸如达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(也称为达尔贝科基本必需培养基)或磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)，或用于运输用于移植器官的任何溶液，诸如威斯康星大学溶液(University ofWisconsin solution)或全氟化合物溶液。可将一种或多种抗生素和/或抗真菌剂(诸如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素)添加到培养基或缓冲液中。可用抗凝剂溶液诸如含肝素溶液冲洗产后组织。优选在提取UTC之前将组织保持在约4℃至约10℃下。甚至更优选在提取UTC之前，组织不进行冷冻。

UTC的分离优选在无菌环境中发生。脐带可通过本领域已知的方法从胎盘分离。血液和碎片优选在UTC分离前从产后组织中去除。例如，可用缓冲液溶液(包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液)洗涤产后组织。洗涤缓冲液也可包含一种或多种抗真菌剂和/或抗生素，包括但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。

优选通过机械力(切断力或剪切力)分解包含脐带或其片段或区段的产后组织。在目前优选的实施例中，分离工序也利用酶消化过程。许多酶是本领域已知的用于从复合组织基质分离个体细胞以有利于在培养物中生长。消化酶涵盖了弱消化的(例如脱氧核糖核酸酶和中性蛋白酶、分散酶)至强消化的范围(例如木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)并且是可商购获得的。此类酶的不完全列表包括粘液溶解酶活性、金属蛋白酶、中性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶)和脱氧核糖核酸酶。目前优选的是选自金属蛋白酶、中性蛋白酶和溶解粘液的活性材料的酶活性材料。例如，已知胶原酶用于从组织分离多种细胞。脱氧核糖核酸酶可消化单链DNA并且可在分离期间使细胞团聚减到最少。优选的方法涉及用胶原酶和分散酶，或胶原酶、分散酶和透明质酸酶的酶促处理。技术人员将会知道许多此类酶处理是本领域已知用于从多个组织来源分离细胞的，并且充分配备以就其在分离本发明的细胞中的效用评估新的或另外的酶或酶组合。优选的酶处理可长约0.5至2小时或更久。在一些实施例中，组织在解离步骤的酶处理期间在约37℃下温育。在本发明的一些实施例中，将产后组织分成包含组织的多个部分(例如诸如新生儿、新生儿/母体、以及胎盘的母体部分)的区段。然后，根据本文所述的方法通过机械和/或酶离解来离解分离的部分。新生儿或母体谱系细胞可通过本领域已知的任何方法(例如，通过针对Y染色体的核型分析或原位杂交)来鉴定。

分离的细胞可用于起始或接种、细胞培养。将分离的细胞转移到无菌组织培养瓶中，所述无菌组织培养瓶未涂布或涂布有细胞外基质或配体，诸如层粘连蛋白、胶原(天然、变性或交联)、明胶、纤粘蛋白和其他细胞外基质蛋白。在能够支持细胞生长的任何培养基中培养细胞，所述培养基诸如但不限于DMEM(高或低葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB201、伊格尔基础培养基(Eagle's basal medium)、Ham's F10培养基(F10)、Ham's F-12培养基(F12)、伊思考夫改良达尔贝科培养基(Iscove's modifiedDulbecco's medium)、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和以商品名CELL-GRO-FREE销售的不含血清/介质的培养基(Mediatch，Inc.，Herndon，Va)。培养基可补充有一种或多种组分，包括例如胎牛血清(FBS)，优选约2-15％(v/v)；马血清(ES)；人血清(HS)；β-巯基乙醇(BME或2-ME)，优选约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白细胞抑制因子(LIF)和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸，包括L-缬氨酸；以及控制微生物污染的单独或者组合的一种或多种抗生素和/或抗真菌剂，诸如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。培养基优选包含生长介质(例如DMF-M低葡萄糖、血清、BME和抗生素)。

将细胞以允许细胞生长的密度接种在培养容器中。在一个实施例中，细胞在占空气约0至约5体积％的CO₂下培养。在一些其他实施例中，细胞在占空气约2至约25％的O₂下，优选占空气约5至约20％的O₂下培养。细胞优选在约25至约40℃的温度下培养，并且更优选在37℃下培养。细胞优选地在培养箱中培养。培养瓶中的介质可以是静止的，也可以例如用生物反应器搅拌。UTC优选在低氧化应激下生长(例如，伴随谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸的添加)。如本文所用，“低氧化应激应”指对培养的细胞没有或有较小自由基损伤的条件。

用于选择最适当的培养基、培养基制剂和细胞培养技术的方法是本领域为人们所熟知的，并且在多种来源中描述，包括Doyle等人(编辑)，1995，Cell&Tissue Culture：Laboratory Procedures《细胞与组织培养：实验室操作》奇切斯特的约翰威立公司，(John Wiley＆Sons，Chichester)；以及Ho和Wang(编辑)，1991，Animal Cell Bioreactors《动物细胞生物反应器》，波士顿的巴特沃斯海涅曼公司(Butterworth-Heinemann，Boston)，所述参考文献以引用的方式并入本文。

在本发明的一些实施例中，将UTC传代或取出至分开的培养容器中，所述培养容器含有与初始使用的培养基相同或不同类型的新鲜培养基，细胞群可在所述培养容器中以有丝分裂方式扩增。本发明的细胞可在0代和衰老之间的任何时间点使用。细胞优选传代约3至约25次，更优选传代约4至约12次，并且优选传代10或11次。可进行克隆和/或亚克隆以确认已分离出无性细胞群。

在本发明的一些方面，将存在于产后组织中的不同细胞类型分级成可从其中分离UTC的亚群。可使用标准细胞分离技术完成分级或选择，所述技术包括但不限于酶促处理以将产后组织解离成其组分细胞，随后为特定细胞类型的克隆和选择，包括但不限于基于形态标记物和/或生物化学标记物的选择；所需细胞的选择性生长(阳性选择)；不需要的细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于如例如使用大豆凝集素得出的混合群体中细胞凝集性差异进行分离；冻-融工序；混合群体中的细胞的附着性差异；过滤；常规和区带离心；离心淘洗(逆流离心)；单位重力分离；逆流分配；电泳；以及荧光激活细胞分选(FACS)来实现分级或选择。

培养基根据需要进行更换，例如，通过例如用移液器小心地从培养皿中抽吸培养基并且补充新鲜培养基。继续温育直至培养皿中积聚足够数量或密度的细胞。然后，可去除存在的任何原始外植组织切片，并且使用标准技术或使用细胞刮棒使剩余细胞与培养皿胰蛋白酶化分开。胰蛋白酶化之后，收集细胞，移至新鲜培养基中并如上温育。在一些实施例中，胰蛋白酶化后约24小时将培养基更换至少一次以去除任何漂浮的细胞。培养物中剩余的细胞视为UTC。

UTC可进行冷冻保存。因此，在下文更详细地描述的优选实施例中，用于自体转移(用于母亲或孩子)的UTC可源于孩子出生后的适当产后组织，然后冷冻保存以便可在它们以后需要移植的情况下可用。

III.脐带组织衍生的细胞的特征

适用于受权利要求书保护的方法、用途、药物组合物和药盒的源于脐组织的UTC的例子于2004年6月10日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801University Blvd.，Manassas，VA 20110)，并且指定如下ATCC登录号：(1)菌株名称UMB 022803(P7)被指定为登录号PTA-6067；并且(2)菌株名称UMB 022803(P17)被指定为登录号PTA-6068。

UTC可通过例如下述进行表征：生长特征(例如群体倍增能力、倍增时间、至衰老的传代次数)、核型分析(例如正常核型；母体或新生儿谱系)、流式细胞术(例如FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如用于检测表位)、基因表达谱(例如基因芯片阵列；聚合酶链反应(例如，逆转录酶PCR、实时PCR和常规PCR))、蛋白质阵列、蛋白质分泌(例如通过PDC条件培养基的血浆凝固测定或分析，例如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA))、混合淋巴细胞反应(例如作为PBMC刺激的量度)和/或本领域已知的其他方法。

像这样，适用于本发明的UTC通过下述特征中的一种或多种的组合进行限定：(1)生长特征；(2)某些蛋白质的产生；(3)相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，基因表达对于某些基因是增加的；(4)特征在于相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，基因表达对于某些基因是减少的；(5)营养因子的分泌或分泌的缺乏；(6)hTERT或端粒酶表达的缺乏。

在本发明的一个实施例中，UCT可通过具有下述特征中的一种或多种进行表征：它们需要L-缬氨酸用于在培养中生长；它们能够在含有约5％至约20％氧气的大气中生长；它们具有在达到衰老之前在培养中经历至少约40次倍增的潜能；并且它们在组织培养容器上附着并扩增，所述组织培养容器是未涂布的，或者涂布有明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟苷酸、玻连蛋白或纤粘蛋白。在某些实施例中，UTC还可具有当细胞传代时得到维持的正常核型。染色体核型分析的方法是本领域技术人员可利用且已知的。

在其他实施例中，UTC可通过产生某些蛋白质来表征，所述蛋白质包括(1)产生组织因子、波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白中的至少一种；以及(2)产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A，B，C细胞表面标记物中的至少一种，如通过流式细胞术检测的。在其他实施例中，UTC可通过下述进行表征：不含CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR，DP，DQ细胞表面标记物中的至少一种的产生，如通过流式细胞术检测的。在一个实施例中，该细胞的特征在于不含CD45和CD117的产生。在一些实施例中，该细胞产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中的至少两种。在其他实施例中，该细胞产生蛋白组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中所有三种。

在其他实施例中，UTC可通过基因表达来表征，相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，所述基因表达对于编码下述中的至少一种的基因是增加的：白介素8；浆膜蛋白1；趋化因子(C-X-C基序)配体1(黑素瘤生长刺激活性，α)；趋化因子(C-X-C基序)配体6(粒细胞趋化蛋白2)；趋化因子(C-X-C基序)配体3；肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白3。在一个实施例中，UTC可通过基因表达来表征，相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，所述基因表达对于编码下述中的至少一种的基因是增加的：白介素8、浆膜蛋白1和趋化因子(C-X-C基序)配体3；肿瘤坏死因子。

在另一个实施例中，UTC还可通过基因表达来表征：相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，所述基因表达对于编码下述中的至少一种的基因是减少的：矮小同源盒2；热休克27kDa蛋白2；趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞衍生因子1)；弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄，威廉斯-博伊伦综合征)；智人(Homo sapiens)，mRNA；cDNA DKFZp586M2022(来自克隆DKFZp586M2022)；间充质同源盒2(生长终止特异性同源盒)；sine oculis同源盒同源物1(果蝇属(Drosophila))；晶状体蛋白，αB；形态发生紊乱关联激活因子2；DKFZP586B2420蛋白；类似于neuralin 1；四连接素(纤溶酶原结合蛋白)；src同源三(SH3)和富含半胱氨酸的结构域；胆固醇25-羟化酶；runt相关转录因子3；白介素11受体，α；前胶原C-肽链内切酶增强子；卷曲同源物7(果蝇属(Drosophila))；假设基因BC008967；胶原，VIII型，α1；腱生蛋白C(hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白5；膜铁转运辅助蛋白；整联蛋白，β8；突触小泡糖蛋白2；成神经细胞瘤，抑制瘤变蛋白1；胰岛素样生长因子结合蛋白2，36kDa；智人cDNA FLJ12280fis，克隆MAMMA1001744；细胞因子受体样因子1；钾中间/小电导钙活化通道，亚族N，成员4；整联蛋白，β7；具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)；sine oculis同源盒同源物2(果蝇属(Drosophila))；KIAA1034蛋白；囊泡相关膜蛋白5(肌短蛋白)；含EGF腓骨蛋白样细胞外基质蛋白1；早期生长反应因子3；远端缺失同源盒5；假定蛋白FLJ20373；醛酮还原酶家族1，成员C3(3-α羟基类固醇脱氢酶，II型)；双糖链蛋白聚糖；具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)；纤粘蛋白1；前脑啡肽；整联蛋白，β样1(具有EGF样重复结构域)；智人mRNA全长插入cDNA克隆EUROIMAGE 1968422；EphA3；KIAA0367蛋白；尿钠排泄肽受体C/鸟苷酸环化酶C(利尿钠排泄肽受体C)；假定蛋白FLJ14054；智人mRNA；cDNA DKFZp564B222(来自克隆DKFZp564B222)；BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白质3样；AE结合蛋白1；以及细胞色素c氧化酶VIIa亚基多肽1(肌肉)。

在其他实施例中，UTC可通过下述中的至少一种的分泌来表征：MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1β、I309、MDC、RANTES和TIMP，如当细胞在体外在培养物中进行培养时检测到的。在一些实施例中，UTC可通过下述中的至少一种的分泌缺乏来表征：TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1α和VEGF，如当细胞在体外在培养物中进行培养时，通过例如ELISA检测到的。

在优选实施例中，所述细胞不表达hTERT或端粒酶。因此，本发明的一个实施例是不表达hTERT或端粒酶(hTert)并且具有本文所公开特征中的一种或多种的脐衍生的细胞。

在优选实施例中，所述细胞包括上文列出的特征中的两种或更多种。更优选的是包括特征中的三种、四种、五种或更多种的细胞。还更优选的是包括六种、七种、八种、九种、十种、十一种或更多种特征的UTC。还更优选的是包括上述特征中的所有的细胞。

在一个实施例中，UTC源于基本上不含血液的脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，需要L-缬氨酸用于生长，可在至少约5％的氧中生长，并且包括下述特征中的至少一种：(1)在培养物中至少约40次倍增的潜能；(2)在未涂布的组织培养容器或涂布有下述物质的组织培养容器的上附着并扩增的能力：明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟苷酸、玻连蛋白或纤粘蛋白；(3)产生波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白；(4)产生CD10、CD13、CD44、CD73和CD90；以及(5)相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，基因表达对于编码白介素8和浆膜蛋白1的基因是增加的。在一些实施例中，此类UTC不产生CD45和CD 117。

在一个实施例中，UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。UTC任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)不表达CD31、CD34或CD45；和/或(iii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或(iv)具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；和/或(v)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。

在另一个实施例中，UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117或CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。这些UTC任选地表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或不表达CD31或CD34；和/或相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；和/或表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。

在本发明的另一个实施例中，UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。这些UTC任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)不表达CD31或CD34；和/或(iii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或(iv)具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；和/或(v)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。

在另选实施例中，UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT和端粒酶。这些UTC任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)不表达CD31或CD34；和/或(iii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或(iv)具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；和/或(v)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。

在另一个实施例中，所述细胞从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117、CD34、CD31的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。这些UTC任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)不表达CD45；和/或(iii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或(iv)具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；和/或(v)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。

在另外一个实施例中，UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117、CD45、CD34、CD31的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。UTC任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或(iii)具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；和/或(iv)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。

在另选实施例中，UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117、CD45、CD34、CD31的产生，并且不表达hTERT和端粒酶。UTC任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或(iii)具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；和/或(iv)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。

在另一个实施例中，UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，并且具有下述特征：不含CD117和CD45的产生；不含hTERT或端粒酶的表达；表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3；相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；并且表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。在另一个实施例中，UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，并且具有下述特征：不含CD117和CD45的产生；不含hTERT或端粒酶的表达；相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；并且表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。在另一个实施例中，UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，并且具有下述特征：不含CD117和CD45的产生；不含hTERT或端粒酶的表达；相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；并且表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。

在另一个实施例中，UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，并且具有下述特征：在培养中至少40次倍增的潜能；产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A，B，C；不含CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR，DP，DQ的产生，如通过流式细胞术检测到的；相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，白介素8、浆膜蛋白1和趋化因子(C-X-C基序)配体3的表达增加；并且不表达hTERT或端粒酶。

上文描述的UTC可用于调节(例如减少和/或抑制)患有肺疾病的患者中的肺疾病的促炎介质的产生的方法中。它们还可用于调节(例如减少和/或抑制)患有肺疾病的患者中的肺疾病的促炎介质的产生的药物组合物中，例如其中此类组合物包含具有这些特征的细胞和药学上可接受的载体，并且可用于制备、使用和实践如本文描述并例示的此类方法和药物组合物的药盒中。此外，如上文描述的UTC可用于制备制剂诸如细胞提取物和亚细胞级分，它们可用于制备、使用和实践如本文所述并例示的此类方法和药物组合物。

某些具有沿产生各种表型的细胞谱系方向分化的潜能的细胞是不稳定的，并且因此可自发分化。与本发明一起使用的目前优选的是不沿下列细胞谱系自发进行分化的UTC，例如成肌细胞、骨骼肌、血管平滑肌、周细胞、成血管(hemangiogenic)、血管生成、血管形成或血管内皮谱系。当在生长培养基中生长时，就在其表面上产生的细胞标记物而言，并且就多种基因的表达模式而言，优选的细胞是基本上稳定的，例如，如使用以商品名GENECHIP(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，Calif.)销售的医学诊断检验测定的。在传代期间和通过多次群体倍增时，细胞例如在其表面标记物特征方面保持基本上恒定。

IV.脐带组织衍生的细胞群

本发明的另一个方面的特征在于上文描述的UTC群体在减少患有肺疾病的患者中的促炎介质的产生(或甚至抑制促炎介质的产生)中的用途。在一些实施例中，所述细胞群可以是异质的。本发明的异质细胞群可包含至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％本发明的UTC。本发明的异质细胞群还可包含干细胞或其他祖细胞，例如成肌细胞或其他肌肉祖细胞、成血管细胞或血管前体细胞；或它还可包含完全分化的骨骼肌细胞、平滑肌细胞、周细胞或血管内皮细胞。在一些实施例中，所述群体是基本上同质的，即基本上仅包含UTC(优选至少约96％、97％、98％、99％或更多UTC)。本发明的同质细胞群由脐衍生的细胞组成。脐衍生的细胞的同质群体优选地不含母体谱系的细胞。同质细胞群可通过本领域已知的任何方法实现，例如通过细胞分选(例如流式细胞术)或通过根据已知的方法的无性扩增。同质UTC群体可包含产后衍生的细胞的克隆细胞系。当分离具有高度期望功能的细胞克隆时，此类群体是特别有用的。

在本发明的一个实施例中，使用基本上同质的UTC群体。在一个实施例中，所述基本上同质的群体包含UTC，所述UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。UTC任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)不表达CD31、CD34或CD45；和/或(iii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或(iv)具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；和/或(v)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。在另一个实施例中，所述群体包含UTC，所述UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。UTC任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)不表达CD31或CD34；和/或(iii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或(iv)具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；和/或(v)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。在本发明的另一个实施例中，所述群体包含UTC，所述UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117、CD34和CD31的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。在另外一个实施例中，所述群体包含UTC，所述UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，并且不含CD117、CD45、CD34、CD31和/或端粒酶的产生。在另选实施例中，所述基本上同质的脐衍生的细胞群从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，并且具有下述特征：在培养中至少40次倍增的潜能；产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A，B，C；不含CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR，DP，DQ的产生；相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，白介素8、浆膜蛋白1和趋化因子(C-X-C基序)配体3的表达增加；并且不表达hTERT或端粒酶。

在本发明的另一个实施例中，使用UTC的同质群体。在一个实施例中，该同质群体包含UTC，所述UTC从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。所述群体任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)不表达CD31、CD34或CD45；和/或(iii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或(iv)具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；和/或(v)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。在另一个实施例中，所述同质UTC群体从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。所述群体任选地(i)表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白；和/或(ii)不表达CD31或CD34；和/或(iii)相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；和/或(iv)具有分化成至少肺组织的细胞的潜能；和/或(v)表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90。在另选实施例中，所述同质UTC群体从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，并且不含CD117、CD34、CD31和/或端粒酶的产生。在另一个实施例中，所述同质群体从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117、CD45、CD34和CD31的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。在另选实施例中，所述基本上同质的脐衍生的细胞群从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，并且具有下述特征：在培养中至少40次倍增的潜能；产生CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A，B，C；不含CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR，DP，DQ的产生；相对于其为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，白介素8、浆膜蛋白1和趋化因子(C-X-C基序)配体3的表达增加；并且不表达hTERT或端粒酶。

本文还提供了在一种或多种因子的存在下，或在刺激干细胞沿血管平滑肌、血管内皮或周细胞途径分化的条件下温育的细胞群的用途。此类因子是本领域已知的，并且技术人员将认识到合适的分化条件的确定可用常规实验实现。此类条件的优化可通过统计实验设计和分析来实现，例如响应曲面法(response surface methodology)允许同时优化在生物培养中的多个变量。目前优选的因子包括但不限于生长或营养因子、趋化因子、细胞因子、细胞产物、去甲基化剂、以及目前已知或以后确定刺激分化(例如干细胞沿血管生成、成血管、血管形成、骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮途径或谱系分化)的其他剌激物。

V.脐带组织衍生的细胞的遗传修饰

UTC也可经基因修饰以产生治疗学上有用的基因产物，诸如例如从而产生血管生成剂以促进或支持另外的血管形成或生长，或从而产生因子以使内皮祖细胞召募至肺损伤区域。内皮祖细胞促进血管发生和血流，特别是在局部缺血性事件之后(Urbich C和Dimmeler S，Circ.Res.《循环研究》，2004；95：343-53)。在内皮细胞召募中起作用的因子包括但不限于VEGF、基质衍生因子-1(SDF-1)、促红细胞生成素(EPO)、G-CSF、斯达汀、雌激素、PPAR-γ、CXCR4、FGF和HGF。基因修饰可使用多种载体中的任一种来实现，所述载体包括但不限于：整合型病毒载体，如逆转录病毒载体或腺相关病毒载体；非整合型复制载体，例如乳头状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体或复制缺陷型病毒载体。将DNA引入细胞中的其他方法包括使用脂质体、电穿孔、粒子枪或通过直接DNA注射。

优选地使用由一种或多种适当表达控制元件(诸如启动子或增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记物控制的或与其有效连接的DNA来转化或转染宿主细胞。可使用任何启动子来驱动插入基因的表达。例如，病毒启动子包括但不限于CMV启动子/增强子、SV40、乳头状瘤病毒、EB病毒或弹性蛋白基因启动子。在一些实施例中，用于控制感兴趣的基因的表达的控制元件能够允许基因的调控表达，使得仅在体内需要时才合成产物。如果瞬时表达是所需的，则优选地在非整合型和/或复制缺陷型载体中使用组成型启动子。另选地，在必要时可使用诱导型启动子来驱动插入基因的表达。诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白和热休克蛋白相关的启动子。

外来DNA引入之后，可允许工程化的细胞在富集培养基中生长，然后转换到选择培养基。外来DNA中选择性标记物赋予选择抗性，并且允许细胞将例如质粒上的外来DNA稳定整合到其染色体中并长成集落，继而可克隆和扩增成细胞系。该方法可有利地用于使表达基因产物的细胞系工程化。

本发明的细胞可经基因工程化而“敲除”或“敲掉”促使植入部位发炎或排斥的因子的表达。下文将讨论用于降低靶基因表达水平或靶基因产物活性水平的负调节技术。如本文所用，“负调节”指相对于不进行调节处理时的靶基因产物的水平和/或活性，靶基因产物的水平和/或靶基因产物的活性降低。来自骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、周细胞、血管内皮细胞或其祖细胞的基因的表达可使用多种技术(包括例如通过使用同源重组技术使基因失活的表达抑制)来降低或敲除。通常，在编码蛋白质重要区域的外显子(或该区域5’的外显子)中插入阳性选择性标记物(例如neo)，从而防止由靶基因产生正常mRNA并导致基因失活。还可通过在基因的一部分引入缺失，或通过删除整个基因，而使基因失活。通过使用具有在基因组中相距很远的与靶基因同源的两个区域的构建体，可将介于两个区域之间的序列删除(Mombaerts等人，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.《美国国家科学院院刊》，1991；88：3084-87)。反义DNA酶、核糖酶、小干扰RNA(siRNA)、以及抑制靶基因表达的其他此类分子也可用于降低靶基因活性水平。例如，已证实抑制主要组织相容性基因复合物(HLA)的表达的反义RNA分子对于免疫应答而言是最通用的。另外，可利用三螺旋分子降低靶基因活性水平。

VI.由脐带组织衍生的细胞制备的细胞裂解液和细胞可溶性级分。

在其他方面，本发明利用由下述制备的细胞裂解液和细胞可溶性级分：UTC、或者包含UTC的异质或同质细胞群、以及已经基因修饰或已被刺激沿骨骼肌、血管平滑肌、周细胞或血管内皮途径分化的UTC或其群体。此类裂解液及其级分具有许多效用。例如，在体内使用UTC溶胞产物可溶性级分(即，基本上不含膜)允许在患者内同种异体地使用有益的细胞内环境，而不引入大量最可能触发排斥或其他不利免疫学应答的细胞表面蛋白。裂解细胞的方法是本领域熟知的，包括机械破碎、酶分解或化学分解或它们的组合等多种手段。此类细胞裂解液可由细胞直接在其生长培养基中制备，并且因此含有分泌的生长因子等等，或它们可在例如PBS或其他溶液中由不含培养基的经洗涤的细胞制备。可将洗涤的细胞以大于初始群体密度的浓度重悬。

在一个实施例中，如通过破碎细胞而不进行随后的细胞级分的分离来制备全细胞裂解液。在另一个实施例中，细胞膜级分通过本领域已知的常规方法(例如离心、过滤或类似方法)分离自细胞的可溶性级分。

由产后衍生的细胞群制备的细胞裂解液或细胞可溶性级分可按原样使用，通过例如超滤或冻干进一步浓缩，或甚至干燥，部分纯化，与如本领域已知的药学上可接受的载体或稀释剂组合，或与其他化合物(诸如生物制品，例如药学上有用的蛋白质组合物)组合。细胞裂解液或其级分可单独在体外或体内，或者例如与自体或同基因活细胞一起使用。如果在体内引入，则可将裂解液局部地引入到治疗部位处，或引入到治疗部位远侧以向患者提供例如所需的细胞生长因子。细胞裂解液在体内的使用是本领域已知的，并且本领域技术人员将知道在本发明的范围内使用裂解液的必要步骤。

VII.包含脐带组织衍生的细胞的药物组合物和基质

在另一个方面，本发明提供了在用于调节涉及肺疾病、病症和/或损伤病理的促炎介质的多种方法中，利用UTC、UTC群体、UTC组分和产物的药物组合物。某些实施例涵盖包含活细胞(单独或与其他细胞类型混合的UTC)的药物组合物。其他实施例涵盖药物组合物，所述药物组合物包含UTC细胞组分(例如细胞裂解液、可溶性细胞级分、条件培养基、ECM或前述任何的组分)或产物(例如由UTC天然产生或通过基因修饰产生的营养和其他生物因子、来自UTC培养的条件培养基)。可用于本发明中的UTC组分和产物在美国专利7,524,489和7,510,873以及美国公开申请2005/0058634中有所描述，并且以引用的方式并入本文。在任一种情况下，所述药物组合物还可包含其他活性剂，诸如本领域已知的抗炎剂、抗细胞凋亡剂、抗氧化剂、生长因子、肌营养因子或者肌再生或肌保护药物。

在本发明的一个实施例中，所述药物组合物包含hUTC和药学上可接受的载体。适用于本发明的药学上可接受的载体包括液体、半固体(例如凝胶)和固体材料(例如细胞支架和基质、管材以及如本领域已知和本文更详细地描述的其他此类材料)。可将这些半固体和固体材料设计成抵抗身体内的降解(不能够生物降解的)，或可将它们设计成在身体内降解(生物可降解、生物可消化)。生物可降解的材料还可以是生物吸收性或可生物吸收的，即它可被溶解和吸收到体液中(一个例子是水溶性植入物)、或降解且最终从身体中消除，或通过转化成其他材料、或分解且通过天然途径消除。生物降解速率可根据植入身体后期望的释放速率而变化。

通常将包含UTC活细胞的药物组合物配制为液体、半固体(例如凝胶)或固体(例如，如对于血管或肺组织工程化适当的基质、支架等等)。通过本领域已知的任何可接受的途径配制液体组合物用于施用，以实现活细胞向靶血管或肺组织的递送。通常，这些包括通过施用途径以扩散方式或者靶向肺损伤、损害或窘迫的部位的注射或输注，所述施用途径包括但不限于肌内、静脉内或动脉内递送(经由带针注射器和/或带有或不带泵装置的导管)。

包含在半固体或固体载体中的活细胞的药物组合物通常配制用于在肺损伤、损害或窘迫的部位处的外科植入。应当理解，液体组合物也可通过外科手术施用。在特定的实施例中，半固体或固体药物组合物可包含半渗透性凝胶、晶格、细胞支架等，它们可以是不能够生物降解的或生物可降解的。例如，在某些实施例中，可能期望或合适的是将外源细胞与它们的周围环境隔离，仍允许细胞将生物分子(例如肌营养因子、血管营养因子或内皮祖细胞召募因子)分泌和递送到周围肺组织或血管细胞。在这些实施例中，可将细胞配制为自主植入物，所述自主植入物包含由不可降解的、可选择性渗透的阻隔包围的活UTC或含有UTC的细胞群，所述阻隔可使移植细胞与宿主组织物理分离。此类植入物有时被称为“免疫保护的”，因为在不存在药物诱导的免疫抑制的情况下，它们具有防止免疫细胞和大分子杀死移植细胞的能力。

在其他实施例中，药物组合物可利用多种不同种类的可降解凝胶和网络。例如，特别适合于持续释放制剂的可降解的材料包括生物相容性聚合物，诸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原等等。

在其他实施例中，可能期望或合适的是将细胞递送在生物可降解的，优选地生物吸收性或可生物吸收的支架或基质上或其中。通常，这些三维生物材料包含附着到支架上、分散于支架内、或结合在细胞外基质中的活细胞，所述细胞外基质夹带在支架中。一旦植入身体的靶区域内，这些植入物就与宿主组织整合，其中所述移植细胞逐渐建立(参见例如，Tresco，PA，等人Adv.Drug Delivery Rev.《先进药物输送评论》，2000；42：3-27；还参见Hutmacher，D.W.，J.Biomater.Sci.Polymer Edn《生物材料科学杂志：聚合物版》，2001；12：107-174)。

生物相容性基质可由天然的生物可降解的聚合物、改性的天然的生物可降解的聚合物或合成的生物可降解的聚合物组成，所述聚合物包括均聚物、共聚物和嵌段聚合物以及它们的组合。需要注意的是，聚合物一般基于合成它的单体来命名。

合适的生物可降解聚合物或聚合物类别的例子包括血纤维蛋白、胶原、弹性蛋白、明胶、玻连蛋白、纤粘蛋白、层粘连蛋白、凝血酶、聚(氨基酸)、氧化纤维素、原弹性蛋白、丝、核糖核酸、脱氧核糖核酸、蛋白质、多核苷酸、重组基底膜基质、淀粉、葡聚糖类、海藻酸盐、透明质酸酶(hyaluron)、甲壳质、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、多糖、透明质酸、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乙二醇、去细胞的组织、自组装肽、多肽、糖胺聚糖、它们的衍生物及它们的混合物。对于乙醇酸和乳酸两者，通常在聚合之前制备中间环状二聚体，并且纯化。这些中间二聚体分别称为乙交酯和丙交酯。其他有用的生物可降解的聚合物或聚合物类包括但不限于：脂族聚酯、聚(亚烃草酸酯)、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚原酸酯、聚含氧酸酯、聚酰氨基酯、包含胺基团的聚含氧酸酯、聚(亚丙基延胡索酸酯)、聚二氧杂环己酮、聚碳酸酯、聚草酸酯、聚(α-羟基酸)、聚(酯)、聚氨酯、聚酯型聚氨酯、聚醚型聚氨酯、聚酸酐、聚乙酸酯、聚己内酯、聚(原酸酯)、聚氨基酸、聚酰胺、以及它们的共混物和共聚物。另外有用的生物可降解的聚合物包括但不限于：L-和D-乳酸的立体聚合物、双(对羧基苯氧基)丙烷和癸二酸的共聚物、癸二酸共聚物、己内酯的共聚物、聚(乳酸)/聚(乙醇酸)/聚乙二醇共聚物、聚氨酯和聚(乳酸)的共聚物、α-氨基酸的共聚物、α-氨基酸和己酸的共聚物、α-苄基谷氨酸和聚乙二醇的共聚物、琥珀酸和聚(二醇)的共聚物、聚磷腈、聚(羟基链烷酸酯)、以及它们的混合物。另外设想了二元和三元体系。

一般来讲，用作基质的合适的生物可降解的聚合物希望有利地配置，使得它：具有适用于预期应用的机械性能；充分保持完整直至组织已内生长并愈合；不引发炎症应答或毒性应答；在实现其目的后在体内代谢；容易加工成待形成的所需最终产品；证实可接受的储存寿命；并且容易灭菌。

在本发明的一个方面，用于形成基质的生物相容性聚合物是水凝胶的形式。一般来讲，水凝胶为交联聚合物材料，其可吸收超过其重量20％的水，同时保持独特的三维结构。该定义包括会在含水环境中溶胀的干燥交联聚合物以及水-溶胀材料。许多亲水聚合物可交联产生水凝胶，而不论该聚合物是生物源的、半合成的或是全合成的。水凝胶可由合成聚合物材料制得。此类合成聚合物可按照一系列性质和可预测的批与批一致性专门设计，并代表一般无免疫原性担忧的可靠材料衍生的。基质可包括由自组装肽形成的水凝胶，如美国专利5,670,483和5,955,343、美国专利公开申请2002/0160471和PCT公开申请WO 02/062969中讨论的那些，所述专利的公开内容以引用的方式并入，因为它们涉及形成自组装肽的水凝胶。

使水凝胶具备作为药物递送应用的性质包括平衡溶胀度、吸附动力学、溶质渗透性以及它们的体内性能特征。对化合物的渗透性部分地取决于溶胀度或含水量和生物降解率。由于凝胶的机械强度与溶胀度成正比下降，同样也在本发明设想范围内的是水凝胶可附着于基底，使得复合系统增强了机械强度。在一些实施例中，可将水凝胶浸渍到多孔基底内，以获得基底的机械强度连同水凝胶的可用递送性质。

可用于本发明的支架或基质的非限制性例子(有时共同被称为“框架”)包括纺织结构(诸如编织、针织、编结、啮合、非织造和经编针织)、多孔泡沫、半多孔泡沫、打孔的膜或片、微粒、小珠和球体、以及作为上述结构的组合的复合结构。非织造垫例如可使用由以商品名VICRYL缝合线(Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.)销售的合成的可吸收的乙醇酸和乳酸共聚物(PGA/PLA)组成的纤维形成。还可利用由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物组成的泡沫，其通过如美国专利6,355,699中讨论的方法诸如冷冻干燥法或冻干法形成。也可使用水凝胶诸如自组装肽(例如RAD16)。原位形成的可降解网络也适用于本发明(参见例如，Anseth，K S等人，J.Controlled Release《控释杂志》，2002；78：199-209；Wang，D.等人，Biomaterials《生物材料》，2003；24：3969-3980；美国公开申请2002/0022676)。将这些原位形成材料配制为适用于注射的流体，然后可通过多种方式(诸如改变温度、pH和暴露于光)原位或体内诱导形成水凝胶。

在另一个实施例中，所述框架是毡，其可由可生物吸收的材料(例如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物、或透明质酸)制成的复丝纱线构成。使用包括卷曲、切割、梳理和针刺的标准纺织加工技术，将所述纱线制成毡。在另一个实施例中，将细胞接种到泡沫支架，所述泡沫支架可以是复合结构。

在多个上述实施例中，可将框架模塑成可用的形状，诸如血管的形状。此外，应当理解，例如以对应于用于制备含成纤维细胞的GDC血管内线图的方式，可在预成形的、不可降解的外科的或植入式的装置上培养UTC，例如(Marx，W.F.等人，Am.J. Neuroradiol《(神经放射学杂志》.，2001；22：323-333)。

为了加强细胞附着，可在接种细胞之前处理基质、支架或装置。例如，在接种之前，可用0.1摩尔乙酸处理尼龙基质，并且在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中温育以涂覆尼龙。可类似地使用硫酸处理聚苯乙烯。还可对框架的外表面进行修饰以改善细胞的附着或生长和组织分化，诸如通过等离子涂布框架或添加一种或多种蛋白质(例如胶原、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素)、遗传物质(诸如细胞因子和生长因子)、细胞基质和/或其他材料，在影响细胞存活和分化的其他因子中，所述其他材料包括但不限于明胶、海藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物树胶。

根据本领域已知的方法制备包含UTC的框架。例如，可使细胞在培养瓶中自由生长至亚汇合或汇合状态，然后将其与培养物分离并接种到框架上。如果需要，可在接种细胞之前、期间或之后向培养基添加生长因子以触发分化和组织形成。另选地，可修饰框架本身，使得增强在其上的细胞生长，或使得降低植入物的排斥风险。因此，一种或多种生物学活性化合物(包括但不限于抗炎化合物、免疫抑制剂或生长因子)可加入框架中用于局部释放。

UTC、UTC的一部分、或包含UTC的细胞群、或者通过UTC产生的组分或产物，可以多种方式用于支持并促进肺细胞和肺组织的修复、再生和改善，改善血液流动，并且刺激和/或支持血管生成，尤其是在肺疾病患者中。此类用途包括体外、离体和体内方法。

本发明的具体的实施例涉及血管的直接修复、再生或替换，或者支持血管的修复、再生或替换以用于治疗肺损伤或损害。

UTC可单独施用(例如作为基本上同质群体)或作为含其他细胞的混合物施用。如上所述，UTC可如在药物制剂中与基质或支架，或与常规的药学上可接受的载体一起配制施用。当UTC与其他细胞一起施用时，它们可与其他细胞同时或顺序(在其他细胞之前或之后)施用。可与UTC结合施用的细胞包括但不限于肌细胞、肺组织细胞、骨骼肌祖细胞、血管平滑肌细胞、血管平滑肌祖细胞、周细胞、血管内皮细胞或血管内皮祖细胞、和/或其他多潜能或多能干细胞。可在施用之前立即或不久将不同类型的细胞与UTC混合，或可在施用之前将它们一起共培养一段时间。

UTC可与其他有益药物或生物分子、或其他活性剂(诸如，如本领域已知的抗炎剂、抗细胞凋亡剂、抗氧化剂、生长因子、血管生成因子或肌再生或肌保护药物)一起施用。当将UTC与其他试剂一起施用时，它们可与其他试剂在单个药物组合物中一起，或在分离的药物组合物中，同时或顺序(在其他试剂施用之前或之后)施用。如本领域的医师应当理解的，其他试剂可为在移植之前以及随后整个恢复过程开始，或者可在移植时或甚至移植之后引发的治疗方案的一部分。

在一个实施例中，UTC作为未分化的细胞(即在生长培养基中培养的)施用。另选地，UTC可在培养中暴露于朝向所需肺组织表型例如血管平滑肌、周细胞或血管内皮表型的刺激分化的条件后施用。

本发明的细胞可外科植入、注射、递送(例如通过导管、注射器、分流器、支架、微导管或泵)，或以其他方式直接或间接施用于肺损伤、损害或窘迫的部位。本发明的细胞或其组合物的施用途径包括但不限于静脉内、肌内、皮下、鼻内、鞘内、脑池内、或经由带针注射器或带有或不带泵装置的导管。

当以半固体或固体装置施用细胞时，外科植入到身体内精确位置通常是合适的施用方法。然而，可将液体或流体药物组合物通过血液施用或直接施用到受累肺组织(例如整个扩散受累区域，诸如弥漫性ALI或ARDS的情况)。可通过化学信号、生长因子或钙激活中性蛋白酶指导UTC迁移。

可经由微导管、内导管插入术，或经由微型泵将脐带组织衍生的细胞或组合物和/或基质(包含脐带组织衍生的细胞)递送到部位。媒介物赋形剂或载体可为用于向患者施用的已知药学上可接受的那些中的任一种，特别是局部地施用到被诱导细胞分化的部位。例子包括液体培养基，例如达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、无菌盐水溶液、无菌磷酸盐缓冲盐水溶液、Leibovitz’s培养基(L15，Invitrogen，Carlsbad，Calif.)、无菌水中的右旋糖、以及任何其他生理学可接受的液体。

其他实施例包括通过施用治疗组合物来调节涉及肺损伤或损害病理的促炎介质的方法，所述治疗组合物包含药学上可接受的载体和UTC细胞组分(例如其细胞裂解液或组分)或产物(例如由UTC天然或通过基因修饰产生的营养因子和其他生物因子，来自UTC培养的条件培养基)，或UTC生长培养基或从生长培养基中经纯化的产物。在一些实施例中，生物因子为FGF和HGF。这些方法还可包括施用其他活性剂，例如如本领域已知的生长因子、血管生成因子、或者肌再生或肌保护药物。

根据良好的医疗实践，考虑到各个患者的条件(例如体质和来自肺损害事件的损伤或损害程度、年龄、性别、体重和一般医疗条件、以及执业医生已知的其他因素)，开发了施用UTC或本文所述其他治疗剂或药物组合物中任一种的剂型和剂量方案。因此，通过这些本领域已知的考虑因素确定向患者施用的药物组合物的有效量。

UTC已显示在混合的淋巴细胞反应中不刺激同种异体PBMC。因此，UTC的同种异体或甚至异种移植在一些情况下可以是耐受的。在一些实施例中，UTC自身提供了免疫抑制效应，从而预防移植的UTC的宿主排斥。在此类情况下，细胞治疗期间的药理免疫抑制可能不是必要的。

然而，在其他情况下，可能期望或合适的是开始细胞疗法之前药理上抑制患者的免疫反应。如上所述，这可通过使用全身或局部免疫抑制剂实现，或其可通过在胶囊包封装置中递送细胞实现。用于降低或消除对移植的细胞的免疫应答的这些和其他方法是本领域已知的。如上所述，作为替代形式，UTC可经基因修饰以减少其免疫原性。

可通过使用多种扫描技术(例如计算机轴向断层摄影术(CAT或CT)扫描、磁性共振成像(MRI)或正电子发射断层摄影术(PET)扫描)，来测定移植的UTC在活患者内的存活。移植物存活的测定也可在死后通过取出肺组织或血管组织且在视觉上或通过显微镜检查来完成。另选地，可用对肺组织细胞例如血管平滑肌细胞、周细胞或血管内皮细胞特异性的染色剂处理细胞。也可通过先前的示踪染料(诸如若丹明或荧光素标记的微粒、固蓝、铁微粒、双苯甲酰胺或基因引入报道基因产物，诸如β-半乳糖苷酶或β-葡糖苷酸酶)的结合来鉴定移植的细胞。

在另一个方面，本发明提供了在如上所述用于刺激和/或支持血管生成，用于改善血液流动，用于再生、修复和改善通过肺损害事件损伤或损害的肺组织的多种方法中，利用UTC、UTC群体、UTC组分和产物的药盒。当用于由肺疾病、病症和/或损伤引起的损害或损伤治疗或者其他计划治疗时，药盒可包括一种或多种细胞群，包括至少UTC和药学上可接受的载体(液体、半固体或固体)。药盒也可任选地包括施用细胞的方式，例如通过注射。药盒还可包括细胞的使用说明。针对野战医院用途(诸如军事用途)制备的药盒可包括整个手术的供应(包括组织支架、外科缝合线等)，其中可使用细胞辅助修复急性损伤。如本文描述的用于测定和体外方法的药盒可含有下述中的一种或多种：(1)UTC或者UTC的组分或产物；(2)用于实践体外方法的试剂；(3)适当时，其他细胞或细胞群；和(4)用于进行体外方法的说明书。

另外如以下实例和本说明书其他地方所用的，根据美国专利7,524,489和7,510,873以及美国公开申请2005/0058634的公开内容，可分离并表征可用于本发明的装置和方法中的UTC，所述专利全文以引用的方式并入，因为它们涉及hUTC的描述、分离和表征。

无需进一步描述，相信本领域的普通技术人员能够利用前述说明和以下例示性实例制造和利用本发明并实践受权利要求书保护的方法。因此，以下工作实例具体指出本发明的优选实施例，且不应被视为以任何方式限制本公开的其余内容。

实例1

在高氧诱导的急性肺损伤的小鼠模型中的肺保护功效

该实例示出了人UTC(hUTC的分离和表征可在实例6至16处找到)增强高氧诱导的肺损伤模型中的肺修复和再生。

脐细胞培养和分离

脐衍生的细胞(UDC，hUTC)如美国专利7,524,489和7,510,873以及美国公开申请2005/0058634中所述进行制备。将细胞培养至所需传代并且随后冷冻保存。

动物模型

雌性C57BL/6小鼠(七周龄)得自Ace Animals(Boyertown，PA)。紧随注射前，使hUTC在37℃下(水浴)解冻，并且在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中洗涤两次，并且重悬于1mL PBS中。细胞使用血球计进行计数。细胞活力通过台盼蓝染料排除进行测定。细胞以1×10⁶细胞的浓度在200μl PBS中重构。

研究概述在下表1-1中汇总。在第0天时，使用1mL注射器和26号针，通过静脉内尾静脉注射，将细胞(在200μl PBS中的1×10⁶hUTC)或PBS媒介物缓慢施用于小鼠，并且随后使动物暴露于室内空气或90％O₂。对90％O₂的暴露通过将动物置于BioSpherix室BioSpherix，LTD，Lacona，NY)内来实现，所述BioSpherix室已进行预处理并平衡至90％O₂1小时。对于这些动物每天提供支持护理(热支持和NutriCal)。每天两次记录每个槽的动物观察、死亡率、存活和氧浓度百分比。在处理后第四天时，使用50mg/mL Nembutal(戊巴比妥)给动物实施安乐死。

支气管肺泡灌洗液(BALF)总蛋白质分析

为了测定每种样品中的总蛋白质，使用BCA蛋白质测定法(Pierce)分析无细胞BALF。使用Softmax 4.0程序完成分析，并且使用Graph PadPrism软件给数据作图。

BALF和肺匀浆物细胞因子/趋化因子分析

为了制备BALF，给六(6)只动物/处理组实施安乐死，并且将肺用1.0mL无菌PBS(Invitrogen)灌洗一次，并且将管置于湿冰上。将BALF以1000rpm离心5分钟，并且将上清液流体取出并用于进一步分析。

为了制备肺匀浆物，给六(6)只动物/组实施安乐死，用PBS实施全身灌注，并且将左肺解剖并置于冰上的裂解基质(Lysing Matrix)D管中，并且随后以4.0的速度在仪器中离心40秒。

遵循制造商的方案，使用小鼠22多路小珠药盒(Millipore)，测定BALF和肺匀浆物上清液两者中的细胞因子/趋化因子水平，并且使用BioRad Bioplex机器进行分析。将结果作图并使用GraphPad Prism软件进行分析。

人细胞检测

根据Asuragen有限公司(Asuragen，Inc.)的标准操作程序，通过该公司从小鼠组织中分离总RNA。使用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计，通过在260和280nm处的吸光度读数来测定总RNA样品的纯度和数量。使用安捷伦生物分析仪(Agilent Bioanalyzer)来评估RNA完整性。

针对GAPDH mRNA(Hs99999905_m1_GAPDH)的人特异性测定法用于评估小鼠肺组织内的hUTC数目。根据Asuragen有限公司(Asuragen，Inc.)的标准操作程序，通过该公司使用单管测定法(Applied Biosystems)加工用于定量RT-PCR(qRT-PCR)分析的样品。使用高容量cDNA合成药盒(Applied Biosystems)，根据制造商的说明书并在20微升/稀释物的总反应体积中，使总RNA的稀释物逆转录。随后通过PCR分析50ng输入cDNA。所有扩增均一式三份地在验证的ABI 7500实时热循环仪上进行。在95℃下温育10分钟后，将样品在95℃下15秒随后60℃下1分钟的共40个循环中进行扩增。基于通过分析已知量的经纯化的hUTC总RNA生成的标准曲线来评估小鼠肺内的hUTC总数目。

BALF总蛋白质

与室内空气对照动物相比较，暴露于90％O₂4天导致BALF的总蛋白质含量中的增加(p＜0.01，图1，表1-2)。此外，与90％O₂PBS处理组相比较，在90％O₂hUTC处理组中的总BALF蛋白质中存在统计上显著的降低(p＜0.05)。

BALF和肺匀浆物细胞因子分析

表1-3至1-6示出了肺匀浆物的趋化因子/细胞因子分析(表1-3和1-4)和BALF(支气管肺泡灌洗液)(表1-5和1-6)。该数据还示出为图(图2A和2B)。与用PBS媒介物处理并暴露于90％O₂的动物相比较，在用hUTC处理并暴露于90％O₂的动物中观察到BALF角质细胞因子(KC)、γ干扰素诱导性细胞因子(IP-10)、白介素1α(IL-1α)和肺匀浆物单核细胞趋化因子-1(MCP-1)中的统计上显著的降低(p＜0.02)。(图2A和2B，表1-3和1-4)。(nd＝未检出)。

人细胞移植入

在处理后第四天时，将动物处死，收获肺并分离总RNA用于人细胞检测。结果示出在hUTC处理的动物肺内的hUTC的存在，但在PBS处理的动物的肺中不存在(表1-3)。

表1-7示出人细胞检测的结果。通过使用实时PCR测量人特异性GAPDH mRNA转录物来测定在处理后第四天时在小鼠肺内的hUTC的存在。循环阈值(CT)小于34指示hUTC存在于小鼠肺组织内。在小鼠肺组织内未检测到hUTC mRNA转录物(不存在)。在小鼠肺组织内检测到hUTC mRNA转录物(存在)。

评估hUTC的预防性静脉内施用对小鼠中高氧诱导的急性肺损伤发展的作用。在暴露于90％O₂的小鼠中的hUTC施用后，BALF中的总蛋白质的水平减少提示hUTC能够减少肺中高氧诱导的血管渗漏/水肿。此外，数据示出hUTC引起三种重要的趋化因子水平中的减少，提示肺中的炎症减少。这些数据提供了hUTC可能是用于治疗肺疾病的重要治疗剂的证据。

实例2

在弹性蛋白酶诱导的肺气肿的新型人源化鼠模型中评估人脐组织衍生的细胞(hUTC)的保护功效

该实例评估人脐组织衍生的细胞(hUTC)在新型和经典COPD(肺气肿)模型两者中的功效。这些模型基于弹性蛋白酶对气道的递送，导致肺气肿破坏。经典模型使用BALB/c小鼠；新型模型使用NOD/SCID/细胞因子受体γ链裸鼠(NOD/SCIDγ)(下文“NSG”)，其已开发为用于测试人细胞疗法的测试台。

研究设计

通过吸入异氟烷使小鼠麻醉，并且经过十四天过程(1×30μg，每周3次)给予猪胰弹性蛋白酶(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)的六次鼻内施用。对照小鼠接受单独的盐水溶液的鼻内施用。在第一次弹性蛋白酶处理后两小时，0.5×10⁶人脐组织细胞(hUTC)经由尾静脉注射进行施用。hUTC作为在100μl总体积中的单次剂量施用。单独的媒介物以与hUTC处理组相似的方式进行施用。

该研究包含生物化学/蛋白质分析(部分1)以及(2)组织学和肺功能测试(体积描记法)(部分2)。

对于该研究，小鼠在第0天时鼻内(i.n.)注射猪胰弹性蛋白酶(PPE)和静脉内(i.v.)注射hUTC。在第2、5、7、9和11天时，小鼠接受PPE的进一步注射。在第1、6、10和14天时，收获小鼠用于进一步分析。320只6至8周龄雌性小鼠用于染色/物种：NOD/SCIDγ(160)或野生型(BALB/C)小家鼠(Mus muscularis)(160)。表2-1汇总了实验设计。

脐细胞培养和分离

脐衍生的细胞(“UDC”或“hUTC”)如美国专利7,524,489和7,510,873以及美国公开申请2005/0058634中所述进行制备。将细胞培养至所需传代并且随后冷冻保存。

剂量制备

紧随注射前，使hUTC在37℃下(水浴)解冻。细胞使用血球计进行计数。细胞活力通过台盼蓝染料排除进行测定。细胞在注射时需要具有80％或更多的活力。如果活力小于80％，则将细胞弃去。用媒介物将细胞调整至适当浓度至100μl。使用注射器泵、合适的小体积注射器和28号针，经由尾静脉注射施用在媒介物中悬浮的细胞。细胞经过8至9分钟缓慢施用，以递送约0.33mL/分钟/kg的细胞，带有递送时间的记录。细胞施用在80分钟的制备内发生。细胞在施用前保持在湿冰上并记录施用时间。

程序

如上所述，在研究的部分1中的动物专用于生物化学/蛋白质分析，而部分2中的动物专用于组织学和肺功能测试(体积描记法)。

对于生物化学/蛋白质分析(部分1)，在媒介物或hUTC注射后第1、6、10和14天时，将来自每组的四只或五只动物处死。由每只动物获得支气管肺泡灌洗液(BALF)，并且保存于-70℃直至分析BALF中存在的细胞因子时。将肺、肝和脾快速冷冻并保存于(Life Technologies，Grand Island，NY)中在-70℃下用于后续RNA提取。将肝和脾的等分试样保存于中用于另外的转录分析。

在BALF中的营养因子的分析

遵循制造商的方案，使用小鼠多路珠阵列药盒(Becton Dickinson)，测定BALF和肺匀浆物上清液两者中的细胞结构和细胞因子/趋化因子水平(鼠MCP-1、IL-1β、TNF-α、RANTES)，并且使用珠阵列流式细胞术进行分析。选择作为焦点的鼠靶标在于病理机制的减少。候选的人效应物靶标包括人HGF、人IL-1RA和VEGF。人因子在一个时间点在合并的材料中仅对于可行性进行分析。使用BCA^TM蛋白质测定法(Pierce，Rockford，I11.)定量BALF中的总蛋白质，以允许样品组内的标准化。

在肺匀浆物中的营养因子的分析

来自肺匀浆物的细胞样品通过定量RT-PCR就鼠MCP-1、IL-1β、TNF-α、RANTES以及人HGF、人IL-IRA和VEGF进行评估，以评估病变的标记物(MCP-1、TNF-α、IL-1β和RANTES)或用于治疗活性的指示剂(人HGF、IL-1RA或VEGF)。用于肺组织匀浆物中的人IL-1RA和VEGF的RT-PCR未显示在任何时间点的任一细胞因子的检测。

部分2重复部分1，但利用的读出与部分1中的程序不兼容。在媒介物或hUTC注射后第1、6、10和14天时，对来自每组的动物进行限制性体积描记法。此外，在每个时间点将四只或五只小鼠处死，并且如下所述取样肺。

体积描记法

在每个时间点和实验结束时对小鼠进行体积描记法。简而言之，通过限制方法测量肺功能，以测定呼吸频率、潮气量、弛豫时间、峰值吸气和呼气流量、EF50和肺容积变化。这指示细胞疗法在不同时间对肺功能的影响。

组织病理学

肺得自在每个时间点的每个处理组。将肺用10％甲醛中性缓冲溶液固定，在分级乙醇系列中脱水，在石蜡中包埋，并以4μm切片。将石蜡切片用苏木精-伊红(H&E)染色用于组织病理学分析。组织学切片就损伤进行评估。使用可由美国国立卫生研究院(National Institute of Health)在线获得的Image J软件分析的组织学图像来测定肺泡表面积。对于每个肺切片，测量在五个随机视野内的肺泡表面积并计算平均表面积。众所周知受损肺中的肺泡腔尺寸的减少与改善的肺泡弹性和顺应性关联，并且这指示细胞疗法对这些参数的影响。

结果

用于注射的细胞的重构

在该实验中使用的10个hUTC小瓶中，无一因质量标准弃去。活力在每种情况下均＞80％。细胞的回收细节示出于下表2-2和2-3中。回收很高并且略微超过预期值的100％(可能是由于回收比由小瓶预期的略微更大的体积)。

动物报告&观察结果

一些小鼠尾示出在静脉内注射期间的白色斑片。这与细胞疗法无关，而是在递送期间施用针的误放。当这发生时，取出针并正确插入静脉内，并且继续细胞/媒介物的施用。没有动物由于弹性蛋白酶处理或细胞递送而死亡。在任何动物中未观察到由于hUTC递送的可检测的不利作用。

支气管肺泡灌洗液(BALF)的分析

在每个时间点，通过戊巴比妥钠的致命注射处死小鼠，并且收集BALF。对细胞沉淀物进行总白细胞(图3)和差异细胞计数(图4)。收回所得的上清液用于细胞因子活性(图5&6)和总蛋白质水平(表2.4至2.7)的进一步分析。

BALF中的总白细胞。

对照小鼠示出支气管肺泡灌洗中的最低限度的细胞浸润，而弹性蛋白酶施用导致显著的细胞浸润。总细胞浸润在两个小鼠品系中接受hUTC的弹性蛋白酶处理的小鼠中降低。

BALF的差异细胞染色。

对BALF进行细胞离心涂片(Cytospin)，并且使用经修饰的吉母萨染色方案进行染色。样品就淋巴细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞的存在进行分析。计数一百个细胞/细胞离心涂片，并且计数就BALF体积进行校正。结果表示为平均值±标准误。通过ANOVA作出在三组或更多组之间的比较。差异在p＜0.05时视为显著的。

差异染色分析的汇总。在NSG小鼠中，当与未接受hUTC的弹性蛋白酶处理的小鼠相比较时，hUTC疗法导致在弹性蛋白酶处理的小鼠中在第10天时显著降低的巨噬细胞。类似地，在接受hUTC的弹性蛋白酶处理的小鼠中，在第6和10天时观察到嗜中性粒细胞的显著减少。相比之下，在任何时间点，在接受hUTC的弹性蛋白酶处理的野生型小鼠中，未观察到巨噬细胞或嗜中性粒细胞的显著降低。

细胞因子分析。

通过多路珠阵列就炎症介质MCP-1、TNF-α、RANTES和IL-1β对BALF和肺组织匀浆物进行提取并分析，因为这些在与COPD相关的粘液分泌过多、气道薄壁组织破坏、纤维化、组织损害和炎症中起充分确定的作用。

hUTC在弹性蛋白酶处理的NSG(NOD/SCIDγ)小鼠中的支气管肺泡灌洗液(BALF)上清液中调节细胞因子应答(图5)。非弹性蛋白酶处理的对照小鼠显示出很少的或无MCP-1、TNF-α、RANTES和IL-1β，而弹性蛋白酶处理的小鼠显示出在每个时间点在所有靶细胞因子中的典型增加。然而，在接受hUTC的小鼠的BALF中观察到炎症介质的显著减少(*p＜0.05)(参见图5)，对于RANTES第1/10天；IL-1β第1天；TNF-α第(d)1、6、10天；MCP-1第1天、第10天。

对于弹性蛋白酶处理的野生型BALB/c品系小鼠，测定支气管肺泡灌洗液(BALF)上清液中的hUTC和细胞因子应答(图6)。示出了在hUTC施用后1、6、10和14天时，hUTC输注和/或猪胰弹性蛋白酶(PPE)处理对BAL上清液组成的作用。简而言之，应答在该品系中更可变并且未观察到一致或显著差异。

总蛋白质浓度。

使用Bradford测定法(Bio-Rad，Hercules，CA)测定回收的BALF和肺组织匀浆物中的总蛋白质浓度，其使用牛血清白蛋白(BSA)进行标准化(参见下表2-4至2.7)。

表2-4 NSG小鼠的BALF中的蛋白质浓度

表2-5 BALB/c小鼠的BALF中的蛋白质浓度

表2-6 NSG小鼠的肺组织匀浆物中的蛋白质浓度

表2-7 BALB/c小鼠的肺组织匀浆物中的蛋白质浓度

在任一品系中的处理组间未检测到总蛋白质中的显著差异。

组织学

定量分析。取出来自非灌洗小鼠的肺并在10％(v/v)福尔马林/PBS中固定，在石蜡中包埋，切片并用苏木精/伊红(H&E)染色(参见图7)。定量空气间隙扩大。测量肺泡的线性截距，并且平均线性截距(Lm)用作肺气肿的形态测定参数。对于每个肺样品，选择三(3)个代表性的不重叠视野。将随机分布的栅格覆盖到H&E染色切片的图像上。计算下述定量测量：平均线性截距(Lm)；和肺泡数目。Lm代表肺泡的平均尺寸。从测量中排除支气管和血管。

组织病理学

取出来自非灌洗小鼠的肺并在10％(v/v)福尔马林/PBS中固定，在石蜡中包埋，切片并用苏木精/伊红(H&E)染色。图8示出了在第1天时来自每个处理组的代表性的显微照片。当与在相同时间点接受盐水的弹性蛋白酶处理的小鼠相比较时，随后接受hUTC的弹性蛋白酶处理的小鼠示出显著减少的病变。由于弹性蛋白酶处理空气间隙扩大通过hUTC施用而减弱(图8和相关图例p17)。图9示出了在第1、6、10和14天时，hUTC减少免疫缺陷(NOD/SCIDγ)小鼠中弹性蛋白酶诱导的肺气肿程度。图10示出了在1、6、10和14天时，hUTC减少免疫活性(BALB/c)小鼠中弹性蛋白酶诱导的肺气肿程度。

肺功能

如先前研究中所述，在每个时间点和实验结束时对每只小鼠进行体积描记法。通过限制方法评估肺功能，以测定呼吸频率、潮气量、弛豫时间、峰值吸气和呼气流量、EF50和肺容积变化。在组间未检测到显著差异(通过单因素方差分析统计分析)。所有参数均在图11A和11B中呈现。

肺匀浆物中的营养因子的分析

来自肺匀浆物的细胞样品通过定量RT-PCR进行评估，以测量针对人HGF、IL-1RA和VEGF的mRNA，以评估治疗剂活性的指示剂。使用此处描述的方法在肺匀浆物中未检测到人HGF、VEGF或IL-1RA。

结论

该研究评估了hUTC在肺气肿(一类慢性肺疾病)的标准或新型鼠模型中的功效。将弹性蛋白酶灌注到两种小鼠品系的肺内，产生人和实验性肺气肿特征性的变化：由于肺泡壁的破坏，更大但更少的肺泡以及减少的肺泡表面积；增加的炎症介质产生；炎症细胞类型流入支气管肺泡灌洗液内。用hUTC的处理抑制该模型中的这些效应，预防或修复肺气肿(即COPD)并提示在人中的相似效应的可能性。

这些数据具有多种意义。首先，hUTC有效预防新型小鼠中的人模型(human-in-mouse model)中的COPD的关键肺气肿特征。hUTC抑制通常与NSG模型中的病变相关的促炎介质(TNF-α、RANTES、MCP-1和IL-1β)的产生。更重要的是，hUTC显著减少了鼠肺中的弹性蛋白酶诱导的肺气肿程度，并且hUTC处理的COPD小鼠(两种模型)显示在肺泡间比未处理的肺气肿对照显著更短的平均线性截距(Lm)(即更少破坏)。同样，在COPD的人源化NSG模型中，hUTC处理保存增加数目的肺泡并减少BAL液中的炎症细胞浸润。因此，hUTC有效破坏病变的关键特征。

NSG模型也是用于检查人细胞治疗剂的可用的测试台，并且提供了进行支持hUTC作为有效细胞疗法的未来工作的机会。该模型还允许治疗作用机制以及实际上关于施用时机和频率的问题的更基础检查的机会。

总之，在单次hUTC施用后在病变中的差异和炎症介质中的减少强烈支持在新型模型中的hUTC功效。

因此，该实验的关键发现如下：

hUTC抑制“人源化”(NSG)COPD模型中的促炎介质(TNF-α、RANTES、MCP-1和IL-1β)产生，并且不调节免疫活性鼠模型中的这些细胞因子应答。

hUTC显著减少两种模型中的鼠肺中弹性蛋白酶诱导的肺气肿程度。

hUTC处理的COPD小鼠(两种模型)示出在肺泡间比未处理的肺气肿对照显著更短的平均线性截距(Lm)(即更少破坏)。同样，hUTC处理保存增加数目的肺泡。

hUTC减少人源化(NSG)COPD模型中的BAL液中的细胞浸润。

实例3

细胞的分离

脐细胞分离。脐带得自National Disease Research Interchange(NDRI，Philadelphia，PA)。在正常分娩后获得所述组织。在层流罩中无菌地进行细胞分离方案。为了去除血液和碎片，在100单位/毫升的青霉素和100毫克/毫升的链霉素，以及0.25微克/毫升的两性霉素B(Invitrogen Carlsbad，CA)的存在下，将脐带在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS；Invitrogen，Carlsbad，CA)中洗涤。然后将组织在50毫升培养基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖；Invitrogen)存在下的150cm²组织培养皿中进行机械离解，直至将组织切成细浆。将切碎的组织转移到50毫升锥形管(约每管5克组织)。

随后将组织在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基中消化，所述培养基各自含有100单位/毫升的青霉素、100毫克/毫升的链霉素、0.25微克/毫升的两性霉素B和消化酶。在一些实验中，使用胶原酶和分散酶的酶混合物(“C∶D”)(在DMEM-低葡萄糖培养基中的胶原酶(Sigma，St Louis，MO)，500单位/毫升；和分散酶(Invitrogen)，50单位/毫升)。在其他实验中，使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶的混合物(“C∶D∶H”)(C∶D∶H＝在DMEM-低葡萄糖中的胶原酶，500单位/毫升；分散酶，50单位/毫升；和透明质酸酶(Sigma)，5单位/毫升)。包含组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃、225rpm的轨道式震荡器(Environ，Brooklyn，NY)中温育2小时。

消化后，将组织在150×g下离心5分钟，吸出上清液。将沉淀物重悬于20毫升生长培养基(DMEM：低葡萄糖(Invitrogen)、15％(v/v)胎牛血清(FBS；限定胎牛血清；批次#AND18475；Hyclone，Logan，UT)、0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma)、100单位/毫升的青霉素、100微克/毫升的链霉素和以0.25微克/毫升的两性霉素B；(每个均来自Invitrogen，Carlsbad，CA)。通过70微米尼龙BD FALCON的细胞滤网(BD Biosciences，San Jose，CA)过滤细胞悬浮液。使另外5毫升包含生长培养基的漂洗液通过滤网。然后使细胞悬浮液通过40微米尼龙细胞滤网(BD Biosciences，San Jose，CA)，并且追加另外5毫升生长培养基的冲洗。

将滤液重悬于生长培养基(总体积为50毫升)中，并在150×g下离心5分钟。吸出上清液，并将细胞重悬于50毫升新鲜生长培养基中。该过程再重复两次。

在最后一次离心后，吸出上清液，并将细胞沉淀物重悬于5毫升新鲜生长培养基中。使用台盼蓝染色确定活细胞数量。然后在标准条件下培养细胞。

将从脐带组织中分离的细胞以5,000细胞/cm²接种到明胶涂布的T-75cm烧瓶(Corning Inc.，Corning，NY)上的生长培养基中。两天后，从烧瓶中抽吸耗尽的培养基和非贴壁细胞。用PBS洗涤贴壁细胞三次，以去除碎片和血液衍生的细胞。然后为细胞补充生长培养基，使细胞生长至汇合(从0代至1代需约10天)。在后续的传代中(从第1代到第2代等)，细胞在4-5天内达到亚汇合(75-85％汇合)。对于这些后续的传代，细胞以5,000细胞/cm²接种。细胞在具有5％二氧化碳的加湿培养箱中在37℃下生长。

在一些实验中，在用LIBERASE(2.5毫克/毫升，Blendzyme 3；RocheApplied Sciences，Indianapolis，IN)和透明质酸酶(5单位/毫升，Sigma)消化后，从在DMEM-低葡萄糖培养基中的产后组织中分离细胞。组织消化和细胞分离如上文对于其他蛋白酶消化描述的，然而，使用LIBERASE/透明质酸酶混合物代替C∶D或C∶D∶H酶混合物。用LIBERASE的组织消化导致从产后组织中分离容易扩增的细胞群。

比较使用不同酶组合从脐带中分离细胞的操作。对于消化进行比较的酶包括：胶原酶；分散酶；透明质酸酶；胶原酶∶分散酶混合物(C∶D)；胶原酶∶透明质酸酶混合物(C∶H)；分散酶∶透明质酸酶混合物(D∶H)；和胶原酶∶分散酶∶透明质酸酶混合物(C∶D∶H)。观察到利用这些不同的酶消化条件在细胞分离中的差异(表3-1)。

作出通过不同方法从脐带中分离细胞库的其他尝试。在一个例子中，将脐带切片并用生长培养基洗涤，以去除血块和凝胶状材料。收集血液、凝胶状材料和生长培养基的混合物，并且以150×g离心。将沉淀物重悬并接种到明胶涂布的烧瓶上的生长培养基中。根据这些实验，分离容易扩增的细胞群。

细胞还已从得自NDRI的脐带血液样品中分离。使用的分离方案是由Ho等人的国际专利申请PCT/US2002/029971的分离方案。将脐带血液样品(分别为50毫升和10.5毫升)(NDRI，Philadelphia PA)与裂解缓冲液(过滤灭菌的155毫摩尔每升氯化铵、10毫摩尔每升碳酸氢钾、0.1毫摩尔每升EDTA缓冲至pH7.2(所有组分均来自Sigma(St.Louis，MO))混合。细胞以1∶20脐带血与裂解缓冲液的比率进行裂解。将所得的细胞悬浮液涡旋5秒，并且在环境温度下温育2分钟。将裂解产物离心(以200xg 10分钟)。将细胞沉淀物重悬于完全基本必需培养基(Gibco，Carlsbad CA)，所述培养基含有10％胎牛血清(Hyclone，Logan UT)、4毫摩尔每升谷氨酰胺(Mediatech Hemdon，VA)、100单位/毫升的青霉素和100微克/毫升的链霉素(Gibco，Carlsbad，CA)。将重悬的细胞离心(以200xg 10分钟)，抽吸上清液，并且在完全培养基中洗涤细胞沉淀物。将细胞直接接种到T75烧瓶(Corning，NY)、T75层粘连蛋白涂布的烧瓶、或T175纤粘蛋白涂布的烧瓶(两者均来自BD公司(Becton Dickinson，Bedford，MA))内。

为了测定细胞群是否可在不同条件下分离并在分离后立即在多种条件下扩增，根据上文提供的操作，使用C∶D∶H的酶组合，将细胞在含有或不含0.001％(v/v)2-巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)的生长培养基中消化。所有细胞均在100单位/毫升的青霉素和100微克/毫升的链霉素的存在下生长。在所有测试的条件下，细胞在第0代和第1代之间均良好贴壁并扩增(表2-2)。在条件5-8和13-16中的细胞证实在接种后良好增殖最多至4次传代，在这时它们进行冷冻保存。

C∶D∶H的组合提供在分离后的最佳细胞收率，并且生成在培养中比其他条件扩增更多代的细胞(表3-1)。可扩增的细胞群无法使用单独的胶原酶或透明质酸酶获得。不作出测定该结果是否特定于测试的胶原酶的尝试。

细胞在对于酶消化和生长的测试的所有条件下在第0代和第1代之间均良好贴壁并扩增(表3-2)。在实验条件5-8和13-16中的细胞在接种后良好增殖最多至4次传代，在这时它们进行冷冻保存。所有细胞均冷冻保存用于进一步分析。

有核细胞快速贴壁并生长。这些细胞通过流式细胞术进行分析，并且类似于通过酶消化获得的细胞。

所述制剂含有红血细胞和血小板。在前3周过程中有核细胞未贴壁并分裂。在接种后3周更换培养基，并且未观察到细胞贴壁并生长。

细胞群可使用酶组合胶原酶(金属蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)和透明质酸酶(分解透明质酸的粘液溶解酶)有效地从脐组织中分离。还可使用其为胶原酶和中性蛋白酶的共混物的LIBERASE。其为胶原酶(4Wunsch单位/克)和嗜热菌蛋白酶(1714酪蛋白单位/克)的Blendzyme 3也连同透明质酸酶一起用于分离细胞。当在明胶涂布的塑料上的生长扩增培养基中培养时，这些细胞容易地经过多次传代扩增。

细胞还从脐带中的残留血液而不是脐带血中分离。从组织中洗涤的血块中的细胞的存在可能是由于在解剖过程期间释放的细胞，所述血块中的细胞在使用的条件下贴壁并生长。

实例4

细胞的生长特征

脐衍生的细胞的细胞扩增潜能与分离的干细胞的其他群体相比较。细胞扩增至衰老的过程被称为海弗利克极限(Hayflick's limit)(Hayflick L.，J.Am.Geriatr.Soc.《(美国老年医学会杂志》，1974；22(1)：1-12；Hayflick L.，Gerontologist《(老年病学》，1974；14(1)：37-45)。

通过在室温下将20毫升2％(w/v)明胶(B型：225Bloom；Sigma，StLouis，MO)加入T75烧瓶(Corning Inc.，Coming，NY)，将组织培养塑料烧瓶涂布20分钟。在去除明胶溶液后，加入10毫升磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)并随后抽吸。

对于生长扩增潜能的比较，利用下述细胞群；i)间充质干细胞(MSC；Cambrex，Walkersville，MD)；ii)脂肪衍生的细胞(美国专利6,555,374；美国公开申请2004/0058412)；iii)正常真皮皮肤成纤维细胞(cc-2509批次#9F0844；Cambrex，Walkersville，MD)；以及iv)脐衍生的细胞。细胞初始以5,000细胞/cm²接种到明胶涂布的T75烧瓶中的生长培养基中。对于后续传代，细胞培养物如下处理。在胰蛋白酶消化后，在台盼蓝染色后计数活细胞。将细胞悬浮液(50微升)与台盼蓝(50微升，Sigma，St.LouisMO)合并。使用血球计估计活细胞数目。

在计数后，细胞以5,000细胞/cm²接种到明胶涂布的T 75烧瓶中的25毫升新鲜生长培养基中。细胞在标准大气(5％二氧化碳(v/v))中在37℃下生长。生长培养基每周更换两次。当细胞达到约85％汇合时，将它们传代；该过程重复直至细胞达到衰老。

在每次传代时，使细胞受胰蛋白酶作用并计数。计算活细胞收率、群体倍增[ln(最终细胞/起始细胞)/ln21和倍增时间(培养时间/群体倍增)。为了测定最佳细胞扩增的目的，通过将先前传代的总收率乘以每次传代的扩增因子(即扩增因子＝最终细胞/起始细胞)，测定总细胞收率/传代。

还测试在第10代时存入库的细胞的扩增潜能。使用不同组的条件。正常真皮皮肤成纤维细胞(cc-2509批次#9F0844；Cambrex，Walkersville，MD)并测试脐衍生的细胞。这些细胞群先前已在第10代时存入库，在每次传代时已以5,000细胞/cm²培养至该点。测定在第10代时细胞解冻后，细胞密度对细胞群的作用。细胞在标准条件下解冻，并且使用台盼蓝染色进行计数。解冻的细胞随后以1,000细胞/cm²接种到生长培养基中。细胞在标准大气条件下在37℃下生长。生长培养基每周更换两次。当细胞达到约85％汇合时，将它们传代。细胞随后传代直至衰老时，即直至它们不能再进一步扩增时。在每次传代时，使细胞受胰蛋白酶作用并计数。计算细胞收率、群体倍增(1n(最终细胞/起始细胞)/ln2)和倍增时间(培养时间)/群体倍增)。通过将先前传代的总收率乘以每次传代的扩增因子(即扩增因子＝最终细胞/起始细胞)，测定总细胞收率/传代。

在另一个实验中测试在低细胞接种条件下新鲜分离的脐衍生的细胞培养物的扩增潜能。脐衍生的细胞如先前实例中所述进行分离。细胞如上所述以1,000细胞/cm²接种并传代直至衰老时。细胞在标准大气条件下在37℃下生长。生长培养基每周更换两次。当细胞达到约85％汇合时，将它们传代。在每次传代时，使细胞受胰蛋白酶作用并通过台盼蓝染色进行计数。对于每次传代，计算细胞收率、群体倍增(ln(最终细胞/起始细胞)/ln2)和倍增时间(培养时间/群体倍增)。通过将先前传代的总收率乘以每次传代的扩增因子(即扩增因子＝最终细胞/起始细胞)，测定总细胞收率/传代。细胞在明胶涂布的烧瓶和非明胶涂布的烧瓶上生长。

已证实低O₂细胞培养条件可改善某些环境中的细胞扩增(美国公开申请2004/0005704)。为了测定脐衍生的细胞的细胞扩增是否可通过改变细胞培养条件得到改善，使脐衍生的细胞的培养物在低氧条件下生长。细胞以5,000细胞/cm²接种到明胶涂布的烧瓶上的生长培养基中。细胞初始在标准大气条件下生长通过第5代，在这时将它们转移至低氧(5％O₂)培养条件。

在其他实验中，使细胞在无涂布的平板、胶原涂布的平板、纤粘蛋白涂布的平板、层粘连蛋白涂布的平板和基质胶涂布的平板上扩增。已证实培养物在这些不同基质上良好扩增。

脐衍生的细胞扩增超过40代，在60天内生成＞1E17细胞的细胞收率。相比之下，MSC和成纤维细胞分别在＜25天和＜60天后衰老。尽管脂肪衍生的细胞和网膜细胞两者均扩增几乎60天，但它们分别生成4.5E12和4.24E13的总细胞收率。因此，当在利用的实验条件下以5,000细胞/cm²接种时，脐衍生的细胞比在相同条件下生长的其他细胞类型更好地扩增(表4-1)。

脐衍生的细胞和成纤维细胞扩增超过10代，在60天内生成＞1E11的细胞的细胞收率(表4-2)。在这些条件下，成纤维细胞和脐衍生的细胞群两者均在80天后衰老，分别完成＞50和＞40次群体倍增。

细胞在氧减少条件下良好扩增；然而，在低氧条件下培养看起来对产后衍生的细胞的细胞扩增没有显著作用。这些结果在下述意义上是初步的：关于氧减少的效应作出的任何最终结论由来自初始分离在低氧中生长细胞的实验最佳得出。标准大气条件已经证明成功用于生长足够数目的细胞，并且低氧培养不是产后衍生的细胞生长所需的。

在标准大气氧下，在明胶涂布的烧瓶或未涂布的烧瓶上的生长培养基中，以约5,000细胞/cm²的密度生长分离的脐衍生的细胞的目前细胞扩增条件足以在第11代时生成大量细胞。此外，数据提示细胞可使用低密度培养条件(例如1,000细胞/cm²)容易地扩增。在低氧条件下的脐衍生的细胞扩增还促进细胞扩增，尽管当利用这些生长条件时，仍未观察到在细胞扩增潜能中的增加改善。目前，在标准大气条件下培养脐衍生的细胞对于生成大细胞库是优选的。然而，当培养条件改变时，脐衍生的细胞扩增可同样地改变。该策略可用于增强这些细胞群的增殖和分化能力。

在利用的条件下，虽然MSC和脂肪衍生的细胞的扩增潜能是有限的，但脐衍生的细胞容易扩增至大数目。

实例5

在含有D-缬氨酸的培养基中的细胞生长

已报告含有D-缬氨酸代替正常L-缬氨酸同种型的培养基可用于选择性地抑制成纤维细胞样细胞在培养中的生长(Hongpaisan，J.Cell Biol.Int.《(国际细胞生物学杂志》，2000；24：1-7；Sordillo等人，Cell Biol.Int.Rep.《(细胞生物学：国际报道)》，1988；12：355-64)。进行实验以测定脐衍生的细胞是否可在含有D-缬氨酸的培养基中生长。

脐衍生的细胞(P5)和成纤维细胞(P9)以5,000细胞/cm²接种到明胶涂布的T75烧瓶(Corning，Corning，NY)中。在24小时后，去除培养基，并且将细胞用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(Gibco，Carlsbad，CA)洗涤，以去除残留的培养基。将培养基替换为改良生长培养基(具有D-缬氨酸的DMEM(特别订购Gibco)、15％(v/v)透析的胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、0.001％(v/v)β巯基乙醇(Sigma)、50单位/毫升的青霉素和50毫克/毫升的链霉素(Gibco))。

不同于在含有透析血清的生长培养基中接种的细胞，在含有D-缬氨酸的培养基中接种的脐衍生的细胞和成纤维细胞不增殖。成纤维细胞在形态上改变，尺寸增加并改变形状。在四周后所有细胞均死亡并且最终与烧瓶表面脱离。因此，可得出结论脐带组织衍生的细胞需要L-缬氨酸用于细胞生长并维持长期活力。对于脐带组织衍生的细胞，L-缬氨酸优选不从生长培养基中去除。

实例6

细胞的核型分析

在细胞疗法中使用的细胞系优选是同质的并且不含任何污染细胞类型。在细胞疗法中使用的人细胞应具有含正常结构的正常数目(46)的染色体。为了鉴定脐衍生的细胞系是同质的并且不含非脐组织起源的细胞，分析细胞样品的核型。

来自男性新生儿的产后组织的UTC在生长培养基中进行培养。选择来自男性新生儿(X，Y)的产后组织，以允许区别新生儿衍生的细胞和母体衍生的细胞(X，X)。细胞以5,000细胞/平方厘米接种到T25烧瓶(Corning，Corning，NY)中的生长培养基中，并且扩增至80％汇合。含有细胞的T25烧瓶用生长培养基填充至颈部。通过快递将样品递送至临床细胞遗传学实验室(估计的实验室至实验室运输时间为一小时)。染色体分析由New JerseyMedical School，Newark，NJ的人类和分子遗传学中心(Center forHuman&Molecular Genetics)进行。细胞在中期过程中进行分析，在所述中期时染色体是最佳显现的。在计数的处于中期的二十个细胞中，五个就正常同质核型数目(二)进行分析。如果观察到两个核型，则细胞样品表征为同质的。如果观察到超过两个核型，则细胞样品表征为异质的。当鉴定异质核型数目(四)时，计数并分析另外的中期细胞。

送往染色体分析的所有细胞样品均由细胞遗传学实验室人员解释为显示出正常外观。分析的十六种细胞系中的三种显示出异质表型(XX和XY)，指示源于新生儿和母体起源的细胞的存在(表6-1)。细胞样品各自表征为同质的(表6-1)。

染色体分析鉴定脐衍生的UTC，如由临床细胞遗传学实验室解释的，所述UTC的核型看起来是正常的。核型分析还鉴定不含母体细胞的细胞系，如由同质核型测定的。

实例7

细胞表面标记物的流式细胞术评估

通过流式细胞术表征细胞表面蛋白或“标记物”可用于测定细胞系的身份。表达的一致性可由多个供体以及在暴露于不同处理和培养条件的细胞中进行测定。从脐中分离的产后细胞系通过流式细胞术来表征，提供用于鉴定这些细胞系的特征图。

细胞在等离子处理的T75、T150和T225组织培养瓶(Corning，Corning，NY)中的生长培养基中培养直至汇合。通过在室温下温育2％(w/v)明胶(Sigma，St.Louis，MO)20分钟，使烧瓶的生长表面涂布有明胶。

烧瓶中的贴壁细胞在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)；(Gibco，Carlsbad，MO)中进行洗涤，并且用胰蛋白酶/EDTA(Gibco)脱离。将细胞收获、离心并以每毫升1×10⁷个的细胞浓度重悬于PBS中的3％(体积比)FBS中。根据制造商说明书，将针对目的细胞表面标记物的抗体(参见下文)添加到100微升细胞悬浮液中，并将混合物在4℃下在黑暗中温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤，并离心去除未结合抗体。将细胞重悬于500微升PBS中，并通过流式细胞术进行分析。用FACScalibur仪器(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞术分析。使用针对细胞表面标记物的下述抗体(参见表7-1)。

脐衍生的细胞在第8、15和20代时进行分析。为了比较在供体中的差异，来自不同供体的脐彼此进行比较。在明胶涂布的烧瓶上培养的脐衍生的细胞也与在未涂布的烧瓶上培养的脐进行比较。

比较了用于细胞分离和制备的四种处理。比较了通过用下述酶处理源于产后组织的细胞：1)胶原酶；2)胶原酶/分散酶；3)胶原酶/透明质酸酶；和4)胶原酶/透明质酸酶/分散酶。

通过流式细胞术分析的在第8、15和20代时的脐带衍生的细胞均表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C，通过相对于IgG对照增加的荧光指示的。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的，如与IgG对照一致的荧光值所指示。

通过流式细胞术分析的从独立供体分离的脐带衍生的细胞各自显示对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的产生是阳性的，反映相对于IgG对照增加的荧光值。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的产生是阴性的，其中荧光值与IgG对照一致。

通过流式细胞术分析的在明胶涂布的烧瓶和未涂布的烧瓶上扩增的脐带衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C的产生都是阳性的，具有相对于IgG对照增加的荧光值。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ的产生是阴性的，其中荧光值与IgG对照一致。

通过流式细胞术分析脐带衍生的细胞已确定这些细胞系的身份。脐带衍生的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、HLA-A、B、C是阳性的，并且对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的。该身份与变量中的变化一致，所述变化包括供体、传代、培养容器表面涂层、消化酶和胎盘层。观察到单独荧光值柱状图曲线平均值和范围中的一些变化，但在测试的所有条件下的所有阳性曲线均为正态的，并且表达大于IgG对照的荧光值，从而证实了细胞包含具有标记物的阳性表达的同质群体。

实例8

通过寡核苷酸阵列分析细胞

寡核苷酸阵列用于比较脐衍生的细胞和胎盘衍生的细胞与成纤维细胞、人间充质干细胞和源自人骨髓的另一种细胞系的基因表达谱。该分析提供了产后衍生的细胞和这些细胞经鉴定的独特分子标记物的表征。

产后组织衍生的细胞。经患者同意在正常足月分娩后从国家疾病研究交流会(NDRI，Philadelphia，PA)获得人脐带和胎盘。接受组织，并且在用C∶D∶H混合物消化后，如实例6中所述分离细胞。细胞在明胶涂布的塑料组织培养瓶上的生长培养基中进行培养。将培养物在37℃和5％CO₂下温育。

成纤维细胞。人表皮成纤维细胞购自Cambrex Incorporated(Walkersville，MD；批号9F0844)和ATCC CRL-1501(CCD39SK)。两种细胞系均在具有10％(v/v)胎牛血清(Hyclone)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养。细胞生长于标准组织处理的塑料制品上。

人间充质干细胞(hMSC)。hMSC购自Cambrex Incorporated(Walkersville，MD；批号2F1655、2F1656和2F1657)并根据制造商说明书培养于MSCGM培养基(Cambrex)中。细胞在37℃和5％CO₂下生长于标准组织培养的塑料制品上。

人髂嵴骨髓细胞(ICBM)。经患者同意，从NDRI接收人髂嵴骨髓。骨髓根据Ho等人(WO 03/025149)所述的方法处理。以1份骨髓对20份裂解缓冲液的比率，将骨髓与裂解缓冲液(155mM NH₄Cl、10mM KHCO₃和0.1mM EDTA，pH7.2)混合。对细胞悬浮液进行涡旋，在环境温度下温育2分钟，并在500×g下离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀物重悬于补充有10％(v/v)胎牛血清和4mM谷氨酰胺的基本必需培养基α(Invitrogen)中。再次离心细胞，并将细胞沉淀物重悬于新鲜培养基中。使用台盼蓝染色排除法(Minimal Essential Medium)计算活的单核细胞。将单核细胞以5×10⁴细胞/cm²接种到塑料组织培养瓶中。在标准大气O₂或5％O₂下，并于37℃和5％CO₂下温育细胞。将细胞培养5天而不更换培养基。在培养5天后，去除培养基和非贴壁细胞。在培养中维持贴壁细胞。

用细胞刮刀将活跃生长的细胞培养物从烧瓶取出到冷磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中。以300×g将细胞离心5分钟。除去上清液，并将细胞重悬于新鲜PBS中，再次离心。除去上清液，并将细胞沉淀物立即冷冻并保存于-80℃。提取细胞mRNA并转录成cDNA。随后将cDNA转录成cRNA并进行生物素标记。将生物素标记的cRNA与Affymetrix AffymetrixGENECHIP HG-U133A寡核苷酸阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA)杂交。杂交和数据收集根据制造商的说明书进行。数据分析使用“微阵列显著性分析(Significance Analysis of Microarrays)”(SAM)版本1.21计算机软件(Tusher，V.G.等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA《美国国家科学院院刊》98：5116-5121)进行。分析软件的授权可通过斯坦福大学的技术授权办公室(Office of Technology Licensing，Stanford University)获得，并且更多信息可在万维网上的斯坦福大学统计系的Tibshirani教授网站处(www-stat.stanford.edu/～tibs/SAM/)获得。

在该研究中分析了十四个不同的细胞群。细胞连同传代信息、培养基底和培养基一起列于表8-1中。细胞系通过其识别码连同在分析时的传代、细胞生长基底和生长培养基一起列出。

数据通过用如上所述的SAM软件的主成分分析进行评估。所述分析显示出在测试的细胞中以相对不同的量表达的290种基因。该分析提供了在群体之间的相对比较。

表8-2示出了计算用于比较细胞对的欧氏距离。欧氏距离基于按照不同细胞类型间差异表达的290个基因得出的细胞比较结果。欧氏距离与290种基因的表达之间的相似性成反比例。使用在细胞类型之间差异表达的290种基因，对于细胞类型计算欧氏距离。细胞之间的相似性与欧氏距离成反比例。

表8-3、8-4和8-5示出了在胎盘衍生的细胞中增加的基因表达(表8-3)、在脐带衍生的细胞中增加的基因表达(表8-4)、以及在脐带和胎盘衍生的细胞中减少的基因表达(表8-5)。

表8-6、8-7和8-8示出了在人成纤维细胞(表8-6)、ICBM细胞(表8-7)和MSC(表8-8)中增加的基因表达。

进行该实例以提供源于脐带和胎盘的细胞的分子表征。该分析包括源于三个不同脐带和三个不同胎盘的细胞。该研究还包括两个不同的表皮成纤维细胞系、三种间充质干细胞系和三种髂嵴骨髓细胞系。由这些细胞表达的mRNA在GENECHIP寡核苷酸阵列上进行分析，所述GENECHIP寡核苷酸阵列含有关于22,000种基因的寡核苷酸探针。

该分析显示出290种基因的转录物在这五种不同细胞类型中以不同量存在。这些基因包括在胎盘衍生的细胞中特异性增加的十种基因和在脐带衍生的细胞中特异性增加的七种基因。发现五十四种基因在胎盘衍生的细胞和脐带组织衍生的细胞中具有特异性更低的表达水平。

所选基因的表达已通过PCR加以证实，如实例9中所示。例如，与其他人细胞诸如此处测试的骨髓衍生的细胞和成纤维细胞相比较，一般地产后衍生的细胞和特别地脐衍生的细胞具有独特的基因表达谱。

实例9

细胞标记物

使用Affymetrix GENECHIP，使源于人脐带和人胎盘的细胞的基因表达谱与源于其他来源的细胞的基因表达谱相比较。鉴定了六种“标签”基因：氧化LDL受体1、白介素-8(IL-8)、肾素、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3(CXC配体3)和粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)。这些“标签”基因在脐衍生的细胞中以相对高的水平表达。

进行该实例中所述的程序以验证微阵列数据并比较基因和蛋白质表达的数据，以及建立一系列可靠测定法，用于检测脐衍生的细胞的唯一识别符。

脐衍生的细胞(四种分离物)、胎盘衍生的细胞(三种分离物，包括占优势地新生儿的一种分离物，如通过染色体核型分析鉴定的)和正常人表皮成纤维细胞(NHDF；新生儿和成人)在明胶涂布的T75烧瓶中的生长培养基中生长。间充质干细胞(MSC)生长于间充质干细胞生长培养基套装(MSCGM；Cambrex，Walkersville，MD)中。

对于IL-8实验，将细胞从液氮解冻，并以5,000个细胞/cm²铺平板于明胶涂布的烧瓶中，在生长培养基中生长48小时，并随后在10毫升血清饥饿培养基[DMEM-低葡萄糖(Gibco，Carlsbad，CA)，青霉素(50单位/毫升)、链霉素(50微克/毫升)(Gibco)和0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma，St.Louis，MO)]中进一步生长8小时。随后提取RNA并将上清液以150×g离心5分钟以去除细胞碎片。上清液在-80℃下冷冻直至ELISA分析时。

脐带组织衍生的细胞、胎盘组织衍生的细胞以及源于人新生儿包皮的人成纤维细胞在明胶涂布的T75烧瓶中的生长培养基中进行培养。在液氮中冷冻在第11代时的细胞。将细胞解冻并转移到15毫升离心管。在150×g下离心5分钟后，弃去上清液。将细胞重悬于4毫升培养基中并计数。将细胞以375,000个细胞/培养瓶在含有15毫升生长培养基的75cm²烧瓶中培养24小时。将培养基更换为血清饥饿培养基并培养8小时。在温育结束时收集血清饥饿培养基，以14,000×g离心5分钟(并保存于-20℃下)。

为了估计每个烧瓶中的细胞数目，每个烧瓶添加2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Carlsbad，CA)。将细胞从培养瓶中脱离后，用8毫升生长培养基中和胰蛋白酶活性。将细胞转移至15毫升离心管并以150×g离心5分钟。去除上清液，并将1毫升生长培养基添加至每管中以重悬细胞。用血球计测定细胞数目。

使用ELISA测定法(R&D Systems，Minneapolis，MN)分析由细胞分泌到血清饥饿培养基中的IL-8的量。根据制造商提供的说明书，进行所有测定。

从汇合的脐带衍生的细胞和成纤维细胞提取RNA，或对于IL-8表达，由如上所述处理的细胞提取RNA。根据制造商的说明书(小量提取药盒；Qiagen，Valencia，CA)，用含有β-巯基乙醇的350微升缓冲液RLT(Sigma，St.Louis，MO)裂解细胞。根据制造商的说明书(RNeasy小量提取药盒；Qiagen，Valencia，CA)提取RNA，并实施DNA酶处理(2.7单位/样品)(Sigma St.Louis，MO)。用50微升经DEPC处理的水洗脱RNA并在-80℃下保存。还从人脐带中提取RNA。将组织(30毫克)悬浮于700微升含有β-巯基乙醇的缓冲液RLT中。将样品进行机械匀浆，并根据制造商说明书进行RNA提取。用50微升经DEPC处理的水提取RNA并保存于-80℃下。

使用随机六聚体引物和逆转录试剂(Applied Biosystems，FosterCity，CA)，将RNA逆转录，在25℃下10分钟，在37℃下60分钟并且在95℃下10分钟。将样品保存于-20℃下。

使用实时和常规PCR进一步研究通过cDNA微阵列鉴定为在脐带细胞和胎盘细胞中独特调控的基因(标签基因-包括氧化LDL受体、白介素-8、肾素和浆膜蛋白)。

使用以商品名ASSAYS-ON-DEMAND(Applied Biosystems)基因表达产物销售的基因表达产品，对cDNA样品进行PCR。根据制造商的说明书(Applied Biosystems)，使用具有ABI Prism 7000SDS软件的7000序列检测系统(Applied Biosystems)，使氧化LDL受体(Hs00234028)；肾素(Hs00166915)；浆膜蛋白(Hs00382515)；CXC配体3(Hs00171061)；GCP-2(Hs00605742)；IL-8(Hs00174103)；和GAPDH与cDNA和UniversalPCR主混合物混合。热循环条件为初始50℃共2分钟和95℃共10分钟，随后为95℃共15秒和60℃共1分钟的40个循环。根据制造商的说明书(得自Applied Biosystems公司的关于ABI Prism 7700序列检测系统的用户公告#2)分析PCR数据。

使用ABI PRISM 7700(Perkin Elmer Applied Biosystems，Boston，MA)进行常规PCR，以证实来自实时PCR的结果。使用2微升的cDNA溶液(1×Taq聚合酶(商品名AMPLITAQ GOLD)通用混合物PCR反应缓冲液(Applied Biosystems)和在94℃下5分钟的初始变性进行PCR。针对每个引物对优化扩增。对于IL-8、CXC配体3和浆膜蛋白(94℃共15秒、55℃共15秒和72℃共30秒的30个循环)；对于肾素(94℃共15秒、53℃共15秒和72℃共30秒的38个循环)；对于氧化LDL受体和GAPDH(94℃共15秒、55℃共15秒和72℃共30秒的33个循环)。用于扩增的引物列于表9-1中。最终PCR反应中的引物浓度为1微摩尔每升，除了其为0.5微摩尔每升的GAPDH之外。GAPDH引物与用于实时PCR的相同，不同的是未将制造商的探针添加到最终PCR反应中。将样品在2％(w/v)琼脂糖凝胶上分离，并用溴化乙锭(Sigma，St.Louis，MO)染色。使用固定焦距POLAROID相机(VWR International，South Plainfield，NJ)，在667胶片(Universal Twinpack，VWR International，South Plainfield，NJ)上采集图像。

表9-1：使用的引物

脐带衍生的细胞和胎盘组织衍生的细胞在冷4％(w/v)多聚甲醛(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中在室温下固定10分钟。使用脐带衍生的细胞在第0代(P0)(在分离后直接)和第11代(P11)各一个分离物(脐带衍生的细胞的两个分离物)和成纤维细胞(P11)。使用靶向下述表位的抗体进行免疫细胞化学反应：波形蛋白(1∶500，Sigma，St.Louis，MO)、结蛋白(1∶150；Sigma-针对兔子产生；或1∶300；Chemicon，Temecula，CA-针对小鼠产生)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA；1∶400；Sigma)、细胞角蛋白18(CK18；1∶400；Sigma)、血管性血友病因子(vWF；1∶200；Sigma)和CD34(人CD34 III类；1∶100；DAKOCytomation，Carpinteria，CA)。此外，下述标记物在第11代的脐带衍生的细胞上进行测试：抗-人GROα-PE(1∶100；Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)、抗-人GCP-2(1∶100；Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)、抗人氧化LDL受体1(ox-LDL R1；1∶100；Santa Cruz Biotech)以及抗-人NOGA-A(1∶100；Santa CruzBiotech)。

用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)洗涤培养物，将其暴露于含PBS、4％(v/v)山羊血清(Chemicon，Temecula，CA)和0.3％(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma，St.Louis，MO)的蛋白质阻断溶液30分钟以进入细胞内抗原。在所关注表位位于细胞表面上(CD34、ox-LDL R1)的情况下，在流程的所有步骤中省略Triton X-100以防止表位丢失。此外，在其中第一抗体针对山羊产生(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况下，在整个过程中使用3％(v/v)驴血清代替山羊血清。第一抗体在阻断溶液中稀释后，施加到培养物上在室温下保持1小时的时间段。除去第一抗体溶液，在施加含阻断剂和山羊抗-小鼠IgG-德克萨斯红(1∶250；Molecular Probes，Eugene，OR)和/或山羊抗-兔IgG-Alexa 488(1∶250；Molecular Probes)或驴抗-山羊IgG-FITC(1∶150，Santa Cruz Biotech)的第二抗体溶液(在室温下1小时)之前，用PBS洗涤培养物。然后洗涤培养物，并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟，使细胞核显色。

经过免疫染色后，使用适当的奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus，Melville，NY)观察荧光。在所有情况下，阳性染色表示上文对照染色的荧光信号，其中除了施用第一抗体溶液(编号1°对照)之外，遵循上文概述的整个程序。使用彩色数码摄相机和Image-Pro软件(Media Cybernetics，Carlsbad，CA)采集代表性图像。对于三染样品，每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。使用Adobe Photoshop软件(Adobe，San Jose，CA)制作分层剪辑。

在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(Gibco，Carlsbad，CA)中洗涤培养瓶中的贴壁细胞，并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Carlsbad，CA)脱离。收获细胞，离心并以1×10⁷/毫升的细胞浓度重悬浮于PBS中的3％(v/v)FBS中。将一百微升等分试样递送至锥形管中。使用Perm/Wash缓冲液(BD Pharmingen，SanDiego，CA)对已对细胞内抗原染色的细胞进行透化处理。根据制造商的说明书，将抗体添加到等分试样中，并使细胞在黑暗中在4℃下温育30分钟。温育后，用PBS洗涤细胞，并离心去除多余抗体。将需要第二抗体的细胞重悬于100微升的3％FBS中。根据制造商的说明书，添加第二抗体并使细胞在黑暗中在4℃下温育30分钟。温育后，用PBS洗涤细胞，并离心去除多余的第二抗体。将经洗涤的细胞重悬于0.5毫升PBS中，并通过流式细胞术进行分析。使用下述抗体：氧化LDL受体1(sc-5813；Santa Cruz，Biotech)、GROa(555042；BD Pharmingen，Bedford，MA)、小鼠IgG1κ(P-4685和M-5284；Sigma)和驴抗山羊IgG(sc-3743；Santa Cruz，Biotech.)。用FACScalibur(Becton Dickinson San Jose，CA)进行流式细胞术分析。

对来自源于人脐带、人胎盘组织、成人和新生儿成纤维细胞以及间充质干细胞(MSC)的细胞的cDNA进行的用于所选“标签”基因的实时PCR结果指示，与其他细胞相比较，浆膜蛋白表达在脐衍生的细胞中更高。通过ΔΔCT方法分析得自实时PCR的数据并以对数尺度表示。在产后细胞与对照之间未发现CXC配体3与GCP-2的表达水平中的显著差异。通过常规PCR验证实时PCR的结果。PCR产物的测序进一步验证了这些观察结果。使用表9-1中列出的常规PCR CXC配体3引物，在产后细胞与对照之间未发现CXC配体3的表达水平中的显著差异。

细胞因子IL-8在脐带细胞中的表达在生长培养基培养和血清饥饿的脐带衍生的细胞中均为升高的。所有实时PCR数据用常规PCR并通过测序PCR产物进行验证。

在无血清培养基中生长后，条件培养基就IL-8的存在进行检查。表9-2示出了对胎盘和脐带衍生的细胞以及人皮肤成纤维细胞进行的针对白介素-8(IL-8)的ELISA测定法结果。值在此处呈现为皮克/百万细胞，n＝2，sem。ND：未检出。

脐细胞已在其中生长的培养基中检测到最大量的IL-8(表9-2)。人表皮成纤维细胞已在其中生长的培养基中未检出IL-8。

通过免疫细胞化学分析，针对所选蛋白质的产生探测在第0代时源于人脐带的细胞。紧随分离后(0代)，将细胞用4％多聚甲醛固定并暴露于如下六种蛋白的抗体：血管性血友病因子、CD34、细胞角蛋白18、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。脐带衍生的细胞对于α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白是阳性的，其中染色模式直到第11代是一致的。

通过免疫细胞化学研究在第11代时在脐带衍生的细胞中的GROα、GCP-2、氧化LDL受体1和浆膜蛋白(NOGO-A)产生。脐带衍生的细胞是GCP-2阳性的，但GROα产生通过该方法未检出。此外，所述细胞是NOGO-A阳性的。

对于四种基因已确定通过微阵列和PCR(实时和常规两种)测量的基因表达水平之间的一致性：氧化LDL受体1、肾素、浆膜蛋白和IL-8。这些基因的表达在脐带衍生的细胞的mRNA水平上受到差异调控，其中IL-8在蛋白质水平上也受到差异调控。GCP-2和CXC配体3的差异表达在mRNA水平上未得到证实。尽管该结果不支持最初得自微阵列实验的数据，但这可能是由于方法灵敏度中的差异。

针对α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的表达，探测在第0代时源于人脐带的细胞，并且该细胞对于α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白均是阳性的。染色模式在整个11代均得以保持。

总之，完整mRNA数据至少部分验证得自微阵列实验的数据。

实例10

细胞表型的免疫组织化学表征

通过免疫组织化学分析在人脐带组织内发现的细胞的表型。

收获人脐带组织并在4℃下在4％(w/v)多聚甲醛中浸泡固定过夜。免疫组织化学使用针对下述表位的抗体进行(参见表10-1)：波形蛋白(1∶500；Sigma，St.Louis，MO)、结蛋白(1∶150，针对兔子产生；Sigma；或1∶300，针对小鼠产生；Chemicon，Temecula，CA)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA；1∶400；Sigma)、细胞角蛋白18(CK18；1∶400；Sigma)、血管性血友病因子(vWF；1∶200；Sigma)和CD34(人CD34III类；1∶100；DAKOCytomation，Carpinteria，CA)。此外，测试了下述标记物：抗-人GROα-PE(1∶100；Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)、抗-人GCP-2(1∶100；Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)、抗-人氧化LDL受体1(ox-LDL R1；1∶100；Santa Cruz Biotech)和抗-人NOGO-A(1∶100；Santa Cruz Biotech。用外科手术刀修剪固定的样品，然后放置于含乙醇的干冰浴上的OCT包埋化合物(Tissue-Tek OCT；Sakura，Torrance，CA)内。随后使用标准冰冻切片机(Leica Microsystems)对冰冻块进行切片(10μm厚)，并固定在载玻片上进行染色。

免疫组织化学类似于以前研究进行(例如Messina等人Exper.Neurol.《实验神经病学》，2003；184：816-829)。组织切片用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)进行洗涤，并暴露于含有PBS、4％(v/v)山羊血清(Chemicon，Temecula，CA)和0.3％(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白质阻断溶液1小时以进入细胞内抗原。在所关注表位将位于细胞表面上(CD34、ox-LDLR1)的情况下，在流程的所有步骤中省略triton以防止表位丢失。此外，在第一抗体针对山羊产生(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况下，在整个流程中使用3％(体积比)驴血清替代山羊血清。第一抗体在阻断溶液中稀释后，施加到切片上并在室温下保持4小时的时间段。去除第一抗体溶液，并且在施加含阻断剂连同山羊抗-小鼠IgG德克萨斯红(1∶250；Molecular Probes，Eugene，OR)和/或山羊抗-兔IgG-Alexa 488(1∶250；Molecular Probes)或驴抗-山羊IgGFITC(1∶150；Santa Cruz Biotech)的第二抗体溶液前(在室温下1小时)，用PBS洗涤培养物。洗涤培养物，并且施加10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟，使细胞核显色。

在免疫染色后，使用在奥林巴斯倒置表面荧光显微镜(Olympus，Melville，NY)上的适当荧光滤光器显现荧光。阳性染色表示为超过对照染色的荧光信号。使用彩色数码摄相机和ImagePro软件(Media Cybernetics，Carlsbad，CA)采集代表性图像。对于三染样品，每幅图像每次仅用一个滤光片拍摄。使用Adobe Photoshop软件(Adobe，San Jose，CA)制作分层剪辑。

表10-1：使用的第一抗体汇总

表10-1：使用的第一抗体汇总

波形蛋白、结蛋白、SMA、CK18、vWF和CD34标记物在脐带内发现的细胞子集中表达(数据未示出)。具体地讲，vWF和CD34表达局限于脐带内所含的血管。CD34+细胞位于最内层(内腔侧)。在脐带的所有基质和血管中存在波形蛋白表达。SMA局限于动脉和静脉的基质和外壁，但血管自身中不含。CK18和结蛋白仅在血管中观察到，结蛋白局限于中层和外层。

这些标记物无一在脐带内观察到(数据未示出)。

波形蛋白、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、细胞角蛋白18、血管性血友病因子和CD 34在人脐带内的细胞中表达。基于显示仅表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的体外表征研究，数据提示脐带衍生的细胞分离的目前过程收获表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的细胞亚群，或分离的细胞改变标记物的表达，以表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。

实例11

当UTC在培养中生长时营养因子的分泌

测量来自在培养中生长的脐衍生的细胞的所选营养因子分泌。选择具有血管生成活性的因子(例如肝细胞生长因子(HGF)(Rosen等人，CibaFound.Symp.1997；212：215-26)、单核细胞趋化蛋白1(也称为单核细胞化学吸引剂-1)(MCP-1)(Salcedo等人Blood《血液》，2000；96；34-40)、白介素-8(IL-8)(Li等人J. Immunol.《免疫学杂志》，2003；170：3369-76)、角质细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)(Hughes等人.Ann.Thorac.Surg.《胸外科年鉴》，200477：812-8)、基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)、促血管生成素2(ANG2)、血小板衍生生长因子(PDGFbb)、血小板生成素(TPO)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、神经营养/神经保护活性(脑衍生的神经营养因子(BDNF)(Cheng等人Dev.Biol.《发育生物学》，2003；258；319-33)、基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)、白介素-6(IL-6)、粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)、转化生长因子β2(TGFβ2))、或趋化因子活性(巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP1α(MIP1α))、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β(MIP1β))、RANTES(调节活化正常T细胞表达和分泌)、I309、胸腺和活化调节的趋化因子(TARC)、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC)。

在明胶涂布的T75烧瓶上的生长培养基中培养源于脐带的细胞以及源于人新生儿包皮的人成纤维细胞。冻存第11代的细胞并保存在液氮中。在解冻后，将生长培养基加入细胞中，随后转移至15毫升离心管，并以150×g将细胞离心5分钟。将细胞沉淀物重悬于4毫升生长培养基中，并对细胞进行计数。细胞以5,000细胞/cm²接种到各自含有15毫升生长培养基的T75烧瓶中，并且培养24小时。将培养基更换成无血清培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco)、0.1％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)、青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50微克/毫升，Gibco))共8小时。在温育结束时通过在14,000xg下离心5分钟收集条件无血清培养基，并保存于-20℃下。

为了估计每个烧瓶中的细胞数目，将细胞用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)洗涤并且使用2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco)脱离。通过添加8毫升生长培养基来抑制胰蛋白酶活性。以150×g将细胞离心5分钟。去除上清液，并将细胞重悬于1毫升生长培养基中。用血球计估计细胞数目。

在37℃下于5％二氧化碳和大气氧中培养细胞。通过ELISA(R&DSystems，Minneapolis，MN)测定由每份细胞样品产生的MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1α、GCP-2、IL-8和TGF-β2的量。所有测定均根据制造商的说明书进行。呈现的值是皮克/毫升/百万细胞(n＝2，sem)。

使用SearchLight^TM蛋白质组阵列(Pierce Biotechnology Inc.)测量趋化因子(MIP1α(MIP1α)、MIP1β(MIP1β)、MCP-1、RANTES、I309、TARC、嗜酸细胞活化趋化因子、MDC、IL-8)、BDNF和血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGFbb、TPO、HB-EGF。蛋白质组阵列是用于定量每孔的二至十六种蛋白的测量的多重夹心ELISA。通过以2×2、3×3或4×4的模式将四至十六种不同捕获抗体点样于96孔板的每孔来产生阵列。在夹心ELISA操作后，使整块板成像以捕获在板的每孔内的每个点样处生成的化学发光信号。每个点样处生成的信号与原始标准或样品中的靶蛋白的量成比例。

MCP-1和IL-6由脐衍生的PPDC和表皮成纤维细胞分泌(表11-1)。SDF-1α(SDF-1α)和GCP-2由成纤维细胞分泌。GCP-2和IL-8由脐衍生的PPDC分泌。通过ELISA，TGF-β2从任一细胞类型中均未检出。

Searchlight^TM多路ELISA测定法。当在培养中生长时，由脐衍生的PPDCs分泌TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1β、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8(参见下表11-2和11-3)。未检出Ang2、VEGF或PDGFbb。

当培养时，脐衍生的细胞分泌多种营养因子。这些营养因子中的一些诸如HGF、bFGF、MCP-1和IL-8在血管生成中起重要作用。其他营养因子诸如BDNF和IL-6在神经再生或保护方面具有重要作用。

实例12

体外免疫学

脐带细胞系在预测这些细胞在体内移植后是否引发免疫学应答的努力中针对其免疫学特征在体外进行评估。通过流式细胞术针对HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达测定产后细胞系。这些蛋白由抗原递呈细胞(APC)表达并且是初始CD4⁺T细胞的直接刺激所需的(Abbas&Lichtman，CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY《细胞与分子免疫学》第5版(2003)，Saunders，Philadelphia，第171页)。还通过流式细胞术分析细胞系是否表达HLA-G(Abbas&Lichtman，同上)、CD178(Coumans等人，(1999)Journal of Immunological Methods《免疫学方法杂志》224，185-196)和PD-L2(Abbas&Lichtman，同上；Brown等人TheJournal of Immunology《免疫学杂志》170，2003；1257-1266)。为了预测产后脐衍生的细胞系在体内引发免疫应答的程度，在单向混合淋巴细胞反应(MLR)中测试所述细胞系。

细胞在涂布有2％明胶(Sigma，St.Louis，MO)的T75烧瓶(Corning，Corning，NY)中的生长培养基中培养直至汇合。

在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(Gibco，Carlsbad，CA)中洗涤细胞，并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Carlsbad，MO)脱离。将细胞收获、离心并以每毫升1×10⁷个的细胞浓度重悬于PBS中的3％(v/v)FBS中。根据制造商的说明书，将抗体(表12-1)加入一百微升细胞悬浮液中，并在4℃下在黑暗中温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤，并离心去除未结合抗体。将细胞重悬浮于五百微升PBS中，并使用FACSCalibur仪器(Becton Dickinson，San Jose，CA)通过流式细胞术进行分析。

将标记为细胞系“A”的第10代脐衍生的PPDC的冻存小瓶在干冰上包装并送往CTBR公司(Senneville，Quebec)，以使用CTBR SOP No.CAC-031进行混合淋巴细胞反应。从多个男性和女性志愿捐献者收集外周血单核细胞(PBMC)。筛选六人志愿献血者，以鉴定出在与其他五名献血者的混合淋巴细胞反应中显示出强增殖应答的单个同种异体供体。将该供体选择为同种异体阳性对照供体。将剩余的五名献血者选择为受体。用丝裂霉素C处理刺激物(供体)同种异体PBMC、自体PBMC和产后细胞系。将自体和丝裂霉素C处理的刺激细胞添加至应答(受体)PBMC并培养4天。温育后，将[³H]胸腺嘧啶核苷添加至每种样品并培养18小时。收获细胞后，提取放射性标记的DNA并使用闪烁计数器测定[³H]-胸腺嘧啶核苷结合。使用具有三种接受者/板的两个细胞培养板，一式三份进行反应。

将同种异体供体(SIAD)的刺激指数计算为接受者加丝裂霉素C处理的同种异体供体的平均增殖再除以接受者的基线增殖。产后细胞的刺激指数计算为接受者加丝裂霉素C处理的产后细胞系的平均增殖除以接受者的基线增殖。

筛选六人志愿献血者，以鉴定出在与其他五名献血者的混合淋巴细胞反应中显示出强增殖应答的单个同种异体供体。将该供体选择为同种异体阳性对照供体。将剩余的五名献血者选择为受体。将同种异体阳性对照供体和脐带衍生的细胞系用丝裂霉素进行处理，并在具有五种单独的同种异体接受者的混合淋巴细胞反应中进行培养。使用具有三种接受者/板的两个细胞培养板，一式三份进行反应(表12-2)。平均刺激指数在6.5(板1)至9(板2)的范围内，并且同种异体供体阳性对照在42.75(板1)至70(板2)的范围内(表12-3)。

表12-2.混合淋巴细胞反应数据-细胞系A(脐)

通过流式细胞术分析的脐带衍生的细胞的柱状图示出了HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达，如通过与IgG对照一致的荧光值指明的，这指示脐带衍生的细胞系不含直接刺激同种异体PBMC(例如CD4⁺T细胞)所需的细胞表面分子。

通过流式细胞术分析的脐细胞对于PD-L2的表达是阳性的，如相对于IgG对照的荧光增加中所反映的。细胞对于CD178和HLA-G的表达是阴性的，如通过与IgG对照一致的荧光值指明的。

在用脐细胞系进行的混合淋巴细胞反应中，平均刺激指数在6.5至9的范围内，而同种异体阳性对照的平均刺激指数在42.75至70的范围内。脐细胞系不表达可检测量的刺激蛋白质HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2，如通过流式细胞术测量的。脐细胞系也不表达免疫调节蛋白质HLA-G和CD178，但PD-L2的表达通过流式细胞术检测到。同种异体供体PBMC含有表达HLA-DR、DQ、CD8、CD86和B7-H2的抗原递呈细胞，从而允许刺激同种异体淋巴细胞。脐衍生的细胞上不存在直接刺激初始CD4⁺T细胞所需的抗原递呈细胞表面分子以及存在免疫调节蛋白PD-L2，可解释相比于同种异体对照的这些细胞在MLR中显示出的低刺激指数。

实例13

用于端粒酶活性的测定

端粒酶的功能是合成端粒重复序列，端粒重复序列用于保护染色体完整性并延长细胞的复制寿命(Liu，K，等人，PNAS《美国国家科学院院刊》，1999；96：5147-5152)。端粒酶由两种组分组成：端粒酶RNA模板(hTER)和端粒酶逆转录酶(hTERT)。端粒酶的调控通过hTERT而非hTER的转录进行测定。因此hTERT mRNA的实时聚合酶链反应(PCR)为用于测定细胞的端粒酶活性的可接受方法。

细胞分离

进行实时PCR实验以测定人脐带组织衍生的细胞的端粒酶产生。人脐带组织衍生的细胞根据上文实例和美国专利7,510,873中示出的实例进行制备。一般来讲，在正常分娩后洗涤从国家疾病研究交流会(Philadelphia，Pa.)获得的脐带以去除血液和细胞碎片，并进行机械离解。然后将组织与消化酶(包括胶原酶、分散酶和透明质酸酶)一起在培养基中在37℃下温育。人脐带组织衍生的细胞根据‘012申请的实例中示出的方法进行培养。从Cambrex公司(Cambrex，Walkersville，Md)获得间充质干细胞和正常表皮成纤维细胞(cc-2509批号9F0844)。多能人睾丸胚胎癌(畸胎瘤)细胞系nTera-2细胞(NTERA-2c1.D1)(参见，Plaia等人，Stem Cells《干细胞》，2006；24(3)：531-546)购自ATCC(Manassas，Va.)，并且根据美国专利7,510,873中示出的方法进行培养。

总RNA分离

使用药盒(Qiagen，Valencia，Ca.)从细胞提取RNA。RNA用50微升经DEPC处理的水洗脱并保存于-80℃下。使用随机六聚体和逆转录试剂(Applied Biosystems，Foster City，Ca.)以25℃共10分钟、37℃共60分钟和95℃共10分钟，对RNA进行逆转录。将样品保存于-20℃下。

实时PCR

根据制造商的说明书(Applied Biosystems)，使用Applied BiosystemsAssays-On-Demand^TM(也称为Gene Expression Assays)，对cDNA样品进行PCR。这种商业药盒广泛用于测定人细胞中的端粒酶。简而言之，使用具有ABI prism 7000SDS软件(Applied Biosystems)的7000序列检测系统，将hTert(人端粒酶基因)(Hs00162669)和人GAPDH(内对照)与cDNA和Universal PCR预混液混合。热循环条件为初始50℃共2分钟和95℃共10分钟，随后为95℃共15秒和60℃共1分钟的40个循环。根据制造商的说明书分析PCR数据。

就hTert和18S RNA测定人脐带组织衍生的细胞(ATCC登录号PTA-6067)、成纤维细胞和间充质干细胞。如表13-1所示，hTert和因此的端粒酶未在人脐带组织衍生的细胞中检出。

测定人脐带组织衍生的细胞(分离物022803，ATCC登录号PTA-6067)和nTera-2细胞，并且结果显示两个批次的人脐带组织衍生的细胞中均未表达端粒酶，而畸胎瘤细胞系显示出高水平的表达(表13-2)。

因此，可得出如下结论：本发明的人脐带组织衍生的细胞不表达端粒酶。

尽管已结合各种具体材料、程序和实例描述和例示了本发明，然而应当理解，本发明并不限于所选材料和程序的特定组合。本领域的技术人员将理解，可对这些细节作出多种变型。说明书和示例应被认为仅为示例性的，本发明的真实范围和实质由随附权利要求书限定。本申请中所提到的所有参考文献、专利和专利申请均全文以引用方式并入本文中。

Claims (31)

1.脐带组织衍生的细胞，所述脐带组织衍生的细胞用于调节涉及患有肺疾病、病症和/或损伤的患者中的肺疾病、病症和/或损伤病理的一种或多种促炎介质的产生，其中所述细胞从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117或CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。

2.根据权利要求1所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述一种或多种促炎介质涉及所述肺疾病、病症和/或损伤的进程。

3.根据权利要求1所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述肺疾病、病症和/或损伤选自慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。

4.根据权利要求3所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述肺疾病、病症和/或损伤是慢性阻塞性肺疾病。

5.根据权利要求4所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述慢性阻塞性肺疾病是慢性支气管炎或肺气肿。

6.根据权利要求1所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述调节包括施用所述细胞与至少一种其他细胞类型和/或至少一种其他试剂。

7.根据权利要求6所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述其他细胞类型是选自下述的肺组织细胞：肺祖细胞、血管平滑肌细胞、血管平滑肌祖细胞、周细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、或者其他多潜能或多能干细胞。

8.根据权利要求6所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述试剂是抗血栓形成剂、抗炎剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、促血管生成剂或抗细胞凋亡剂。

9.根据权利要求1所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述细胞减少所述一种或多种促炎介质的产生。

10.根据权利要求1所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述细胞抑制所述一种或多种促炎介质的产生。

11.根据权利要求1所述的脐带组织衍生的细胞，其中调节包括通过注射、输注、在所述患者体内植入的装置，或通过植入含有所述细胞的基质或支架来施用所述细胞。

12.根据权利要求1所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述细胞对所述患者的所述肺组织、血管平滑肌或血管内皮发挥营养作用。

13.脐带组织衍生的细胞，所述脐带组织衍生的细胞用于减少患有慢性阻塞性肺疾病的患者中的慢性阻塞性肺疾病的一种或多种促炎介质的产生，其中所述细胞从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。

14.根据权利要求13所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述细胞抑制慢性阻塞性肺疾病的所述一种或多种促炎介质的产生。

15.根据权利要求13所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述慢性阻塞性肺疾病是肺气肿。

16.根据权利要求13所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述慢性阻塞性肺疾病是慢性支气管炎。

17.根据权利要求13所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述减少包括在所述慢性阻塞性肺疾病的所述部位处施用所述细胞。

18.根据权利要求1或13所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述一种或多种促炎介质选自TNF-α、RANTES、MCP-1、IL-1β以及它们的组合。

19.根据权利要求1或13所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述细胞不含CD117和CD45的产生。

20.根据权利要求1或13所述的脐带组织衍生的细胞，其中所述细胞还包括下述特征中的一种或多种：

(a) 表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90；

(b) 不表达CD31或CD34；

(c) 相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；以及

(d) 具有分化成至少肺组织的细胞的潜能。

21.用于调节涉及肺疾病、病症和/或损伤病理的一种或多种促炎介质的产生的药物组合物，所述药物组合物包含分离的人脐带组织衍生的细胞，其中所述细胞可得自基本上不含血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述肺疾病、病症和/或损伤选自慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述肺疾病、病症和/或损伤是慢性阻塞性肺疾病。

24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述慢性阻塞性肺疾病是慢性支气管炎或肺气肿。

25.用于减少患有慢性阻塞性肺疾病的患者中的慢性阻塞性肺疾病的一种或多种促炎介质的产生的药物组合物，所述药物组合物包含分离的人脐带组织衍生的细胞，其中所述细胞可得自基本上不含血液的人脐带组织，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。

26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述使用抑制慢性阻塞性肺疾病的所述一种或多种促炎介质的产生。

27.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述慢性阻塞性肺疾病是慢性支气管炎或肺气肿。

28.根据权利要求21或25所述的药物组合物，其中所述一种或多种促炎介质选自TNF-α、RANTES、MCP-1、IL-1β以及它们的组合。

29.根据权利要求21或25所述的药物组合物，其中所述细胞还包括下述特征中的一种或多种：

(a) 表达CD10、CD13、CD44、CD73和CD90；

(b) 不表达CD31或CD34；

(c) 相对于人成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞，表达增加水平的白介素8或浆膜蛋白1；以及

(d) 具有分化成至少肺组织的细胞的潜能。

30.一种用于调节涉及肺疾病、病症和/或损伤病理的一种或多种促炎介质的产生的药盒，所述药盒包括药学上可接受的载体和脐带组织衍生的细胞，其中所述细胞从基本上不含血液的人脐带组织中分离，能够在培养中自我更新和扩增，不含CD117和CD45的产生，并且不表达hTERT或端粒酶。

31.根据权利要求30所述的药盒，其中所述肺疾病是慢性阻塞性肺疾病。