CN102458425A - 损伤后神经组织的再生和修复 - Google Patents

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CN102458425A CN2009801570086A CN200980157008A CN102458425A CN 102458425 A CN102458425 A CN 102458425A CN 2009801570086 A CN2009801570086 A CN 2009801570086A CN 200980157008 A CN200980157008 A CN 200980157008A CN 102458425 A CN102458425 A CN 102458425A
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Abstract

公开了用于在损伤后再生或修复神经组织、减少凋亡和改进神经学功能的方法、药物组合物和试剂盒。

Description

损伤后神经组织的再生和修复
与相关申请的交叉参考
本申请要求于2008年12月19日提交的美国临时专利申请号61/139,305的利益，其内容在此整体引入作为参考。
发明领域
本发明涉及用于神经学损伤的基于细胞的治疗或再生治疗领域。具体而言，本发明提供使用细胞再生或修复神经组织的药物组合物、试剂盒和方法。
发明背景
各种专利和其它出版物在整个本说明书提及。这些出版物中的每一个都在此整体引入作为参考。
神经学疾病以及中枢和外周神经系统的其它障碍是个体可以遭受的最使人虚弱的情况之一，这不仅是因为它们的身体影响，而且是因为它们的持久性。在过去，患有脑或脊髓损伤、或中枢或外周神经系统的神经变性状况诸如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或多发性硬化（仅举几个例子）的患者恢复或治愈的希望很小。
神经学损害和神经变性疾病被长期认为是不可逆的，这是因为神经元和神经系统的其它细胞不能在成体中生长。然而，成体哺乳动物脑保留一些能力用于可塑性和损伤后的神经元再生。(参见，Kolb, B,Can J Exp Psycho, 1999; 53:62-76; Stroemer, RP, 等人,Stroke, 1998; 29:2381-93; Walter, DH, 等人,Circulation, 2002; 105(25):3017-24; Plate, KH, J Neuropathol Exp Neurol, 1999; 58(4):313-20; Szpak, GM, 等人,Folia Neuropathol,1999; 37(4):264-8; Jin, K, 等人,Proc Natl Acad Sci U S A,2001; 98(8):4710-5; Parent, JM, 等人,Ann Neurol,2002; 52(6):802-13; Stroemer, RP, 等人,Stroke, 1995; 26(11):2135-44; Keyvani, K, 等人,J Neuropathol Exp Neurol,2002; 61(10):831-40; Lois, C, 等人,Science,1996; 271(5251):978-81; 和Dutton, R, 等人,Dev Neurosci,2000; 22(1-2):96-105)。例如，室下区(SVZ)包含能够经历分化成为各种细胞类型，包括神经元的细胞群(参见，Chen, J, 等人,Stroke, 2001; 32:1005-1011; Evers, BM, 等人,J Am Coll Surg, 2003; 197:458-478; Seyfried, D, 等人,J Neurosurg, 2006; 104:313-318)并且缺血性损伤和外伤性脑损伤(TBI)的实验提示该区域中的细胞参与恢复过程。临床研究和动物模型都提示有几个机制与颅内出血(ICH)后的细胞损伤有关。这些包括外伤或机械组分、缺血组分和血凝块的直接毒性作用。(参见，Gong, C, 等人,Neurosurgery, 2001; 48:875-883; Gong, C, 等人,Brain Res, 2000; 871:57-65; Hua, Y, 等人,J Cereb Blood Flow Metab, 2002; 22:55-61; Matsushita, K, 等人,J Cereb Blood Flow Metab, 2000; 20:396-404; Xi, G, 等人,Stroke, 2001; 32:2932-2938; 和Seyfried, D, 等人,J Neurosurg, 2004; 101:104-107)。在临床上，ICH紧密接近室系统发生，且因此，ICH后的损伤恢复可牵涉SVZ。
另外，用于组织修复和再生的基于干细胞的疗法的最近出现提供了用于许多神经变性病理学和其它神经学障碍的有希望的治疗。干细胞能够自我更新并分化以产生多种成熟的神经细胞谱系。可以将这种细胞的移植用作临床工具用于重构靶组织，从而恢复生理学和解剖学功能性。干细胞技术的应用是广泛的，包括组织工程改造、基因治疗递送、和细胞治疗，即，通过外源提供的产生或包含这些试剂的活细胞或细胞组分将生物治疗剂递送到靶位置。
已从成体组织中分离了具有神经潜能的干细胞。例如，神经干细胞在发育中的脑和在成体神经系统中存在。这些细胞可以经历扩增并且可以分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。然而，成体神经干细胞是稀有的，以及仅可通过侵入性程序得到，并且可具有比胚胎干细胞更有限的在培养中扩增的能力。
其它成体组织也可产生用于基于细胞的神经治疗的祖细胞。例如，最近已报道，来源于骨髓和皮肤的成体干细胞可以在培养中扩增并且产生多个谱系，包括一些神经谱系。
产后组织诸如脐带已作为干细胞的可选来源引起兴趣。例如，已描述了用于通过灌注胎盘或从脐带血或组织收集而回收干细胞的方法。从这些方法获得干细胞的限制一直是得到的脐带血体积或细胞量不足，以及从那些来源得到的细胞群的异质性或缺乏表征。
另外，脑缺血后间充质干细胞(MSC)引起的神经再生与生长因子诸如定位于损伤区域的血管内皮生长因子(VEGF)和脑衍生神经营养因子(BDNF)升高的水平相关。在围绕实验性梗死的脑区域中，已显示存在增加的微血管(microvessel)形成和细胞沿微血管迁移的证据，尤其是来自SVZ的细胞。(参见， Evers, BM, 等人,J Am Coll Surg, 2003; 197:458-478)。另外，已显示出，MSC与增加的突触发生相关，因而新形成的或恢复中的细胞展现更多的连接，这与改进的功能恢复的观察一致。(参见， Seyfried, D, 等人,J Neurosurg, 2006; 104:313-318)。细胞恢复过程可受到碎片去除和/或生长因子分泌的帮助，从而产生可诱导神经元细胞再生的环境。已知神经学损伤的虚弱性质，需要开发细胞再生疗法来帮助恢复。
发明概述
本发明提供可应用于针对神经学损伤的基于细胞的再生治疗的组合物、试剂盒和方法。具体而言，本发明的特征在于使用产后组织来源的细胞再生或修复神经组织的药物组合物、设备和方法。
本发明的一方面的特征在于治疗患有神经学损伤的患者的方法，所述方法包括以有效治疗神经变性状况的量给患者施用脐带组织-来源的细胞(UTC)。在某些实施方案中，神经学损伤是脑缺血、急性缺血后再灌注、围产期缺氧-缺血性损伤、心跳停止、颅内出血、颅内损害、颈椎挫伤或惊吓婴儿综合征(whiplash or shaken infant syndrome)。
本发明的另一方面特征在于刺激患者SVZ再生能力的方法，所述方法包括以有效增加SVZ中神经发生、血管发生或突触发生的量给患者施用脐带组织-来源的细胞。
本发明的另一方面特征在于减少患者脑的损害或损伤部分中的凋亡的方法，所述方法包括以有效减少患者脑的损害或损伤部分中的凋亡细胞数目的量给患者施用脐带组织-来源的细胞。
本发明的另一方面特征在于改进患有神经学损伤的患者的神经学功能的方法，所述方法包括以有效改进神经学功能的量给患者施用脐带组织-来源的细胞。
本发明的另一方面特征在于用于治疗患有神经学损伤的患者的药物组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体和脐带组织-来源的细胞。待治疗的神经学损伤可为脑缺血、急性缺血后再灌注、围产期缺氧-缺血性损伤、心跳停止、颅内出血、颅内损害、颈椎挫伤或惊吓婴儿综合征。
在某些实施方案中，药物组合物包含在组合物配制前已被体外诱导以分化成神经细胞或其它谱系的细胞，或已被基因工程改造以产生促进神经学损伤治疗的基因产物的细胞。
在某些实施方案中，药物组合物包含至少一种其它细胞类型，诸如星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、神经祖先、神经干细胞或其它多能(multipotent)或多潜能(pluripotent)干细胞。在这些或其它实施方案中，药物组合物包含至少一种其它试剂，诸如用于神经治疗的药物，或另一有益的附加试剂，诸如抗炎药、抗凋亡剂、抗氧化剂或生长因子。
在某些实施方案中，药物组合物被配制用于通过注射或输注施用。可选地，其可包含其中被囊化有细胞的可植入设备、或含有细胞的基质或支架。
根据本发明的再另一方面，提供了用于治疗患有神经学损伤的患者的试剂盒。该试剂盒包含药学上可接受的载体、脐带组织-来源的细胞群和在治疗患者的方法中使用试剂盒的说明书。该试剂盒可进一步包含至少一种试剂和用于培养脐带组织-来源的细胞的说明书。其也可包含至少一种其它细胞类型的群体、或用于治疗神经学损伤的至少一种其它试剂。
根据本发明的另一方面，提供了用于治疗患有神经学损伤的患者的方法，所述方法包括给患者施用由脐带组织-来源的细胞制成的制剂。这种制剂可包括脐带组织-来源的细胞的细胞裂解物(或其级分)、脐带组织-来源的细胞的细胞外基质、或脐带组织-来源的细胞在其中生长的条件培养基。在另一方面，本发明特征在于包含药学上可接受的载体和由脐带组织-来源的细胞制成的制剂的药物组合物，所述制剂可为脐带组织-来源的细胞的细胞裂解物(或其级分)、脐带组织-来源的细胞的细胞外基质、或脐带组织-来源的细胞在其中生长的条件培养基。也提供用于实施本发明该方面的试剂盒。它们可包含药学上可接受的载体或其它剂或试剂中的一种或多种，来自脐带组织-来源的细胞的细胞裂解物或其级分、细胞外基质或条件培养基中的一种或多种，以及试剂盒组分的使用说明书。
在各种实施方案中，脐带组织-来源的细胞在施用前被体外诱导以分化成神经细胞或其它谱系。在一些实施方案中，细胞被基因工程改造以产生促进神经学损伤治疗、改进神经学功能和/或促进再生能力的基因产物。
在本发明的各种实施方案中，将脐带组织-来源的细胞连同至少一种其它细胞类型施用，诸如星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、神经祖先、神经干细胞或其它多能或多潜能干细胞。在这些实施方案中，其它细胞类型可以与脐带组织-来源的细胞同时、在脐带组织-来源的细胞之前或在脐带组织-来源的细胞之后施用。同样地，在这些或其它实施方案中，将细胞连同至少一种其它试剂，诸如用于神经治疗的药物，或另一有益的附加试剂诸如抗炎药、抗凋亡剂、抗氧化剂或生长因子施用。在这些实施方案中，其它试剂可以与脐带组织-来源的细胞同时、在脐带组织-来源的细胞之前或在脐带组织-来源的细胞之后施用。
在一些实施方案中，将细胞施用在患者的中枢或外周神经系统中的预定位点。可以将它们通过注射或输注、或被囊化在可植入设备中、或通过植入含有细胞的基质或支架而施用。
在某些实施方案中，将细胞在神经学损伤后不同的时间点施用。例如，可在范围为损伤后约24 小时至约168 小时(约1 天至约7 天)的时间施用细胞。
根据下面的详述和实施例，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。
附图简述
图1示出在损伤后24小时或72小时用PBS或3×106UTC治疗大鼠(n=8)中的损伤后1天、4天、7天、14天、21天和28天的改良的神经学严重性分数，如在0至18的评分等级上通过运动、感觉、平衡和反射测试所测定的，0是正常分数，并且18是最大缺陷。
图2 示出在损伤后24小时或72小时用PBS或3×106UTC治疗大鼠(n=8)中的损伤后1天、4天、7天、14天、21天和28天的墙角测试分数。
图3 示出在损伤并随后在损伤后72小时用PBS治疗(图3A)、在损伤后72小时用3×106UTC治疗(图3B)、在损伤后24小时用PBS治疗(图3C)、和在损伤后24小时用3×106UTC治疗(图3D)之后，大鼠中SVZ的细胞中的BrdU掺入；图3E示出在损伤并随后在损伤后72小时用PBS或3×106UTC治疗之后，大鼠SVZ中BrdU阳性细胞的平均数目(n=8)，以及图3F示出在损伤后24小时应用PBS或3×106UTC的平均数目(n=8)。
图4 示出在损伤并随后在损伤后24小时用PBS治疗(图4A)、在损伤后24小时用3×106UTC治疗(图4B)、在损伤后72小时用PBS治疗(图4C)、和在损伤后72小时用3×106UTC治疗(图4D)之后，大鼠脑损害区域中血管中的VWF表达；图4E示出在损伤并随后在损伤后24小时用PBS或3×106UTC治疗之后，大鼠脑损害区域中血管的平均直径(μm)(n=8)；以及图4F示出在损伤后72小时应用PBS或3×106UTC的平均直径(μm)(n=8)。
图5A示出在损伤之后，大鼠脑损害区域中的血管内皮细胞中的BrdU掺入。图5B示出在损伤之后，大鼠脑损害区域中的血管中的VWF表达。图5C示出在损伤之后，在大鼠脑损害区域中的血管中，与VWF表达组织共定位的内皮细胞中的BrdU掺入。
图6 示出在损伤并随后在损伤后24小时用PBS治疗(图6A)、在损伤后24小时用3×106UTC治疗(图6B)、在损伤后72小时用PBS治疗(图6C)、在损伤后72小时用3×106UTC治疗(图6D)之后，大鼠脑的SVZ中的双皮层蛋白(DCX) 表达；图6E示出在损伤并随后在损伤后24小时用PBS或3×106UTC治疗之后，对双皮层蛋白(DCX)表达呈阳性的大鼠脑SVZ的平均面积百分比(n=8)，并且图6F示出在损伤后72小时应用PBS或3×106UTC，对双皮层蛋白(DCX)表达呈阳性的平均面积百分比(n=8)。
图7示出在损伤并随后在损伤后24小时用PBS治疗(图7A)、在损伤后24小时用3×106UTC治疗(图7B)、在损伤后72小时用PBS治疗(图7C)、和在损伤后72小时用3×106UTC治疗(图7D)之后，大鼠脑的SVZ中的TUJ1表达；图7E示出在损伤并随后在损伤后24小时用PBS或3×106UTC治疗之后，对TUJ1表达呈阳性的大鼠脑SVZ的平均面积百分比(n=8)，并且图7F示出在损伤后72小时应用PBS或3×106UTC，对TUJ1表达呈阳性的平均面积百分比(n=8)。
图8 示出在损伤并随后在损伤后24小时用PBS治疗(图8A)、在损伤后24小时用3×106UTC治疗(图8B)、在损伤后72小时用PBS治疗(图8C)、和在损伤后72小时用3×106UTC治疗(图8D)之后，大鼠脑的血肿界面区中的突触小泡蛋白表达；图8E示出在损伤并随后在损伤后24小时用PBS或3×106UTC治疗之后，对突触小泡蛋白表达呈阳性的大鼠脑的血肿界面区的平均面积百分比(n=8)，并且图8F示出在损伤后72小时应用PBS或3×106UTC，对突触小泡蛋白表达呈阳性的平均面积百分比(n=8)。
图9示出在损伤并随后在损伤后24小时用PBS治疗(图9A)、在损伤后24小时用3×106UTC治疗(图9B)、在损伤后72小时用PBS治疗(图9C)、和在损伤后72小时用3×106UTC治疗(图9D)之后，大鼠脑的损害区域中凋亡细胞的TUNEL染色；图9E示出在损伤并随后在损伤后24小时用PBS或3×106UTC治疗之后，大鼠脑的损害区域中每个载玻片的凋亡细胞平均数目(n=8)，并且图9F示出在损伤后72小时应用PBS或3×106UTC的平均数目(n=8)。
图10示出在损伤并随后在损伤后24小时应用PBS或3×106UTC治疗(n=8)(图10A)、和在损害后72小时应用PBS或3×106UTC治疗(n=8)(图10B)之后，大鼠脑中纹状体丢失的平均百分比。
图11示出在损伤后7天应用PBS或3×106UTC治疗(n=10)(图11A)、以及在损伤后3天应用PBS或3×106UTC治疗(n=10)(图11B)大鼠中的损伤后1 天、4 天、7 天、14 天、21 天、28 天、31 天和35 天的mNSS。
图12 示出在损伤后7天应用PBS或3×106UTC治疗(n=10)(图12A)、以及在损伤后3天应用PBS或3×106UTC治疗(n=10)(图12B)大鼠中的损伤后1 天、4 天、7 天、14 天、21 天、28 天、31 天和35 天的墙角测试分数。
图13 示出在损伤后7天应用PBS或3×106UTC治疗(n=10)(图13A)、以及在损伤后3天应用PBS或3×106UTC治疗(n=10)(图13B)大鼠中的损伤后1 天、4 天、7 天、14 天、21 天、28 天、31 天和35 天的圆筒测试分数。
图14 示出在损伤后7天应用PBS或3×106UTC治疗(n=10)(图14A)、以及在损伤后3天应用PBS或3×106UTC治疗(n=10)(图14B)大鼠中的损伤后1 天、4 天、7 天、14 天、21 天、28 天、31 天和35 天的粘合剂测试分数。
图15示出在损伤并随后在损伤后72小时用PBS治疗(图15A)、在损伤后72小时用3×106UTC治疗(图15B)、在损伤后7天用PBS治疗(图15C)、和在损伤后7天用3×106UTC治疗(图15D)之后，大鼠SVZ的细胞中的BrdU掺入；图15E示出在损伤并随后在损伤后72小时用PBS或3×106UTC治疗之后，大鼠SVZ中BrdU阳性细胞的平均数目(n=8)，并且图15F示出在损伤后7天应用PBS或3×106UTC的平均数目(n=8)。
图16 示出在损伤并随后在损伤后7天用PBS治疗(图16A)、在损伤后7天用3×106UTC治疗(图16B)、在损伤后72小时用PBS治疗(图16C)、和在损伤后72小时用3×106UTC治疗(图16D)之后，大鼠脑的损害区域中的血管中VWF表达；图16E示出在损伤并随后在损伤后7天用PBS或3×106UTC治疗之后，大鼠脑的损害区域中的血管平均直径(μm)(n=10)，以及图16F示出在损伤后72小时应用PBS或3×106UTC的平均直径(μm)(n=10)。
图17A示出在损伤并随后在损伤后3 天用3×106UTC治疗之后，大鼠脑的损害区域中血管内皮细胞中的BrdU掺入(n=10)，并且图17B 示出在损伤后7 天应用3×106UTC的内皮细胞中的BrdU掺入(n=10)。图17C示出在损伤并随后在损伤后3 天用3×106UTC治疗之后，大鼠脑的损害区域中的血管中VWF表达(n=10)，并且图17D示出在损伤后3 天应用3×106UTC的血管中VWF表达(n=10)。图17E示出在损伤并随后在损伤后3 天用3×106UTC治疗之后，大鼠脑的损害区域中与血管中的VWF表达组织共定位的内皮细胞中的BrdU掺入(n=10)，并且图17F 示出在损伤后7 天应用3×106UTC的内皮细胞中的BrdU掺入(n=10)。
图18 示出在损伤并随后在损伤后7 天用PBS治疗(图18A)、在损伤后7 天用3×106UTC 治疗(图18B)、在损伤后3天用PBS治疗(图18C)、在损伤后3天用3×106UTC治疗(图18D)之后，大鼠脑的SVZ中的TUJ1 表达；图18E示出在损伤并随后在损伤后7 天用 PBS或3×106UTC治疗之后，对TUJ1表达呈阳性的大鼠脑的SVZ的平均面积百分比(n=10)，并且图18F示出在损伤后72小时应用PBS或3×106UTC，对TUJ1表达呈阳性的平均面积百分比(n=10)。
图19 示出在损伤并随后在损伤后72小时用PBS治疗(图19A)、在损伤后72小时用3×106UTC 治疗(图19B)、在损伤后7天用PBS治疗(图19C)、在损伤后7天用3×106UTC治疗(图19D)之后，大鼠脑的血肿界面区中的突触小泡蛋白表达；图19E示出在损伤并随后在损伤后72小时用PBS或3×106UTC治疗之后，对突触小泡蛋白表达呈阳性的大鼠脑的血肿界面区的平均面积百分比(n=10)，并且图19F示出在损伤后7天应用PBS或3×106UTC，对突触小泡蛋白表达呈阳性的平均面积百分比。
图20 示出在损伤并随后在损伤后7 天用PBS治疗(图20A)、在损伤后7 天用3×106UTC 治疗(图20B)、在损伤后72小时用PBS治疗(图20C)、在损伤后72小时用3×106UTC治疗(图20D)之后，大鼠脑的损害区域中凋亡细胞的TUNEL染色；图20E 示出在损伤并随后在损伤后7 天用PBS或3×106UTC治疗之后，大鼠脑的损害区域中每个载玻片的凋亡细胞平均数目(n=10)，并且图20F示出在损伤后72小时应用PBS或3×106UTC的平均数目(n=10)。
图21A示出在损伤并随后在损伤后7 天用PBS或3×106UTC治疗之后，大鼠脑中纹状体丢失的平均百分比(n=10)，并且图21B示出在损伤后72小时应用PBS或3×106UTC的平均百分比(n=10)。
图22示出在损伤后24 小时用PBS或4×106UTC或MSC治疗大鼠中的损伤后1天、4天、7天、14天、21天、28天和35天的改良的神经学严重性分数(n=8)。
图23示出在损伤后24 小时用PBS或4×106UTC或MSC治疗大鼠中(n=8)的损伤后31天、32天、33天、34天和35天的Morris水迷宫分数。
图24示出在损伤后24 小时用PBS或4×106UTC或MSC治疗大鼠中(n=8)的损伤后作为脑半球的百分比的损害体积。
图25A示出在损伤后24 小时用PBS或4×106UTC或MSC治疗大鼠中(n=8)的损伤后35 天的E5204抗体染色以鉴定UTC。利用PBS对照没有发现阳性染色的细胞。图25B示出在损伤后24 小时用PBS或4×106UTC或MSC治疗大鼠中(n=8)的损伤后35 天的E5204 抗体染色以鉴定MSC。
图26A 示出在损伤后24 小时用PBS或4×106UTC或MSC治疗大鼠中的损伤后35 天的BrdU 阳性UTC细胞。
图26B 示出在损伤后24 小时用PBS或4×106UTC或MSC治疗大鼠中的损伤后35 天的BrdU 阳性MSC细胞。
图27 示出在损伤后24 小时用PBS或4×106UTC或MSC治疗大鼠中(n=8)的损伤后35 天损害界面区中每mm2BrdU阳性细胞的数目。
图28 示出在损伤后24 小时用PBS或4×106UTC或MSC治疗大鼠中(n=8)的损伤后35 天齿状回中每mm2BrdU阳性细胞的数目。
图29A 示出在损伤后24 小时用4×106UTC治疗大鼠中的损伤后35 天的vWF 染色血管。
图29B 示出在损伤后24 小时用4×106MSC治疗大鼠中的损伤后35 天的vWF 染色血管。
图30 示出在损伤后24 小时用PBS或4×106UTC或MSC治疗大鼠中(n=8)的损伤后35 天损害界面区中vWF阳性血管的数目。
图31 示出在损伤后24 小时用PBS或4×106UTC或MSC治疗大鼠中(n=8)的损伤后35 天齿状回中vWF阳性血管的数目。
图32A示出损害界面区中BrdU和Map-2阳性双重染色的细胞和仅BrdU阳性染色的细胞。图32B示出齿状回中BrdU和Map-2 阳性双重染色的细胞以及仅BrdU阳性染色的细胞。
发明详述
在下面的说明性实施方案详述中，对构成其一部分的附图进行参考。这些实施方案被足够详细地描述，以使本领域技术人员能够实践本发明，并且理解的是，可以利用其它实施方案并且可以在不背离本发明的精神或范围的情况下进行合理的结构、机械、电和化学改变。为了避免使本领域技术人员能够实践本文描述的实施方案所不需要的细节，该描述可省略本领域技术人员已知的某些信息。因此，下面的详述不以限制性意义采用。
对贯穿说明书和权利要求书中应用的各种术语进行定义，如下文所列出。
如本文使用的术语 "个体"、"患者"或"受试者"通常指任何形式的动物，包括哺乳动物，诸如人和猴，其用药物或治疗组合物或根据所描述的方法进行治疗。
"干细胞"是未分化的细胞，其由单细胞自我更新和分化以产生后代细胞的能力所限定，包括自我更新祖先、非更新祖先和终末分化细胞。干细胞的特征也在于它们的下列能力：在体外分化成来自多胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的各种细胞谱系的功能细胞，以及在移植后产生多胚层的组织，和在注射到胚泡中之后基本上有助于大多数组织，如果不是所有组织的话。
干细胞根据它们的发育潜能被分类为：(1) 全能的；(2) 多潜能的(pluripotent)；(3) 多能的(multipotent)；(4) 寡能的；和(5) 单能的。“全能”细胞能够产生全部胚胎和胚外细胞类型。“多潜能”细胞能够产生全部胚胎细胞类型。“多能”细胞包括能够产生细胞谱系亚群，但全部在特定组织、器官或生理学系统中的那些（例如，造血干细胞(HSC)可以产生包括HSC (自我更新)、血细胞-限制性寡能祖先及为血液正常组分的全部细胞类型和元件(例如，血小板)的后代）。“寡能”细胞可以产生比多能干细胞更加受限的细胞谱系亚群，且“单能”细胞能够产生单细胞谱系(例如，生精干细胞)。
干细胞也基于可获得它们的来源进行分类。"成体干细胞"通常是在包含多个分化的细胞类型的组织中发现的多能的未分化细胞。成体干细胞可以自我更新。在正常情况下，其也可以分化以产生其从中起源的组织并且有可能地其它组织类型的特化的细胞类型。"胚胎干细胞"是来自胚泡期胚胎的内细胞团的多潜能细胞。“胎儿”干细胞是起源自胎儿组织或胎膜的干细胞。"产后干细胞"是基本上起源于出生后可得的胚外组织，即脐带和胎盘的多能或多潜能细胞。已发现这些细胞拥有多潜能干细胞特有的特征，包括快速增殖和分化成许多细胞谱系的潜能。产后干细胞可为血液来源的(例如，如得自脐带血的那些)或非血液来源的(例如，如得自脐带和胎盘的非血液组织)。
各种术语用于描述培养中的细胞。"细胞培养"通常指细胞从活生物取得并在受控条件下生长("在培养中"或"被培养的")。"原代细胞培养"是在第一传代培养之前从生物(一个或多个)直接取得的细胞、组织或器官的培养。当在促进细胞生长和/或分裂的条件下将细胞置于生长培养基中时，细胞在培养中"扩增"，从而导致产生较大的细胞群。当细胞在培养中扩增时，细胞增殖速度有时通过细胞数目加倍所需的时间量测量。这被称为"倍增时间"。
术语“间充质干细胞”(MSCs)指来自未成熟的胚胎结缔组织的细胞。许多细胞类型来自间充质干细胞，包括产生软骨的软骨细胞。
术语“室下区”(SVZ)指位于整个侧室侧壁的成对脑结构。侧室是脑的室系统的部分。侧室被分类为端脑的部分，它们是室中最大的。侧室通过Monro的室间孔与中央第三脑室连接。室下区连同齿状回的颗粒下区(subgranular zone)充当成体神经发生过程中神经干细胞的来源。
如本文使用的术语"标准生长条件"指在37℃、在包含5% CO2的标准气氛和维持在约100%的相对湿度中培养细胞。虽然前述条件对于培养是有用的，但要理解的是，将认识到本领域中可用于培养细胞的选项的技术人员能够改变该条件。
本发明中使用的细胞通常被称为"产后细胞"或"产后-来源的细胞" (PPDC)"。该细胞更具体地为"脐-来源的细胞"或"脐带-来源的细胞"(UDC)，或"脐带组织来源的细胞"(UTC)。此外，该细胞可被描述为干细胞或祖细胞，后一术语被广义地使用。术语"来源的"用于指示，细胞已得自它们的生物学来源并生长或另外地在体外操作(例如，在生长培养基中培养以扩增群体和/或产生细胞系)。本发明脐干细胞的体外操作和脐-来源的细胞的独特特征在下文详细描述。
"分化"是下列过程，通过该过程，非特化的 ("未定型的")或特化较差的细胞获得特化细胞的特征，例如，诸如神经细胞或肌细胞。"分化的"细胞是已占据细胞谱系中更加特化的("定型的")位置的细胞。当用于分化过程时，术语"定型的"指已在分化途径中行进到一点的细胞，在该点，在正常情况下，其将继续分化成特定细胞类型或细胞类型亚型，并且在正常情况下不能分化成不同细胞类型或回复成分化较差的细胞类型。"去分化"指下列过程，通过该过程，细胞回复到细胞谱系中特化(或定型)较差的位置。如本文所用的，细胞的"谱系"限定细胞的遗传，即，其来自哪些细胞和其可以产生什么细胞。细胞谱系将细胞置于发育和分化的遗传安排中。
广义地，"祖细胞"是具有产生比其本身更加分化的后代的能力、并且仍然保持补充祖先库的能力的细胞。通过该定义，干细胞本身也是祖细胞，终末分化细胞的更直接前体也如此。当提及本发明的细胞时，如下文更详细地描述的，祖细胞的该宽泛定义可被使用。较狭义地，祖细胞常常被限定为在分化途径中间的细胞，即，其起自干细胞并在成熟细胞类型或细胞类型亚型产生的中间。该类型的祖细胞通常不能自我更新。因此，如果该类型的细胞在本文中提及，其将被称为"非更新祖细胞"或称为"中间祖细胞或前体细胞"。
如本文所用的，短语“分化成神经谱系或表型”指变得部分或完全定型到CNS或PNS的特定神经表型的细胞，即，神经元或神经胶质细胞，神经胶质细胞种类非限制性地包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、施旺细胞和小胶质细胞。
术语"细胞系"通常指由原代细胞培养物的一次或多次转种形成的细胞群。每轮传代培养被称为传代。当细胞被传代培养时，它们被称为已被"传代"。具体的细胞群或细胞系有时通过其被传代的次数进行提及或表征。例如，已传代10次的培养的细胞群可被称为P10培养物。原代培养物，即，细胞从组织分离后的第一培养物被指定为P0。第一传代培养后，细胞被描述为第二培养物(P1或传代1)。第二传代培养后，细胞变为第三培养物(P2或传代2)等等。本领域的技术人员将理解，在传代时间段期间可有许多群体倍增；因此，培养物的群体倍增数目大于传代数目。在传代之间的时间段期间，细胞的扩增(即，群体倍增数目)取决于许多因素，包括但不限于，接种密度、基质、培养基、生长条件和传代之间的时间。
如本文使用的，术语"生长培养基"通常指足以培养脐带组织来源的细胞的培养基。具体地，用于培养本发明的细胞的一种培养基包括Dulbecco's改良必需培养基 (DMEM)。特别优选的是DMEM-低葡萄糖(DMEM-LG) (Invitrogen, Carlsbad, Ca.)。DMEM-LG优选地补加有血清，最优选地胎牛血清或人血清。一般地，加入15% (v/v)胎牛血清(例如，确定成分胎牛血清，Hyclone, Logan UT)连同抗生素/抗真菌剂(优选地100单位/毫升青霉素，100毫克/毫升链霉素和0.25微克/毫升两性霉素B; Invitrogen, Carlsbad, Ca.)和0.001% (v/v) 2-巯基乙醇(Sigma, St. Louis Mo.)。在一些情况下，使用不同的生长培养基或提供不同的补充，并且这些正常在文中指示为生长培养基的补充。在某些化学成分确知培养基中，细胞可在根本不存在血清的情况下生长。在这种情况下，细胞可需要某些生长因子，其可以加入培养基以支持和维持细胞。待加入用于在无血清培养基中生长的目前优选的因子包括bFGF、EGF、IGF-I和PDGF中的一种或多种。在更优选的实施方案中，将因子中的两种、三种或全部四种加入无血清或化学成分确知培养基中。在其它实施方案中，将LIF加入无血清培养基以支持或改进细胞的生长。
"条件培养基"是其中特定细胞或细胞群已被培养并且然后被取出的培养基。当细胞在培养基中培养时，它们可分泌可以对其它细胞提供营养支持的细胞因子。这种营养因子包括但不限于激素、细胞因子、细胞外基质(ECM)、蛋白质、小泡、抗体和颗粒(granule)。包含该细胞因子的培养基是条件培养基。
通常地，“营养因子”被定义为促进细胞存活、生长、增殖和/或成熟，或刺激细胞的增加的活性的物质。
当提及培养的脊椎动物细胞时，术语“衰老”(也称“复制衰老”或“细胞衰老”)指可归因于有限细胞培养的性质，即，它们不能生长超过有限的群体倍增数目(有时称为Hayflick ’ s 极限)。尽管细胞衰老首先使用成纤维细胞-样细胞进行描述，但可以在培养中成功生长的大多数正常人细胞类型经历细胞衰老。不同细胞类型的体外寿命不同，但最大寿命一般少于100次群体倍增(这是所有细胞在培养中变得衰老并且因而使得培养物不能分裂的倍增数目)。衰老不取决于按时间发生顺序的时间，而是通过培养物已经历的细胞分裂或群体倍增的数目来测量。因而，通过去除必需生长因子而休眠的细胞在重新引入生长因子时能够恢复生长和分裂，并在之后完成与连续生长的等价细胞相同的倍增数目。类似地，当将细胞在各种数目的群体倍增之后在液氮中冷冻并随后解冻和培养时，它们经历与在培养物中维持未冷冻的细胞基本上相同的倍增数目。衰老细胞不是死亡或垂死的细胞，它们实际上抵抗程序性细胞死亡(凋亡)并已维持在其不分裂状态长达3年。这些细胞非常活跃并且是代谢上有活性的，但它们不分裂。尚未发现衰老细胞的不分裂状态可通过任何生物学、化学或病毒试剂逆转。
术语“神经学损伤”是包含性术语，其包括与神经元细胞死亡或损害有关的状况，包括脑血管机能不全、局灶性或弥散性脑外伤、弥散性脑损害和外伤性神经病(包括但不限于压迫、压榨、撕裂和节段神经病)。神经学损伤的实例是：脑缺血或梗死，包括栓塞性阻塞和血栓性阻塞；急性缺血后再灌注；围产期缺氧-缺血性损伤；心跳停止；任何类型的颅内出血(诸如硬膜外、硬膜下、蛛网膜下和大脑内)；颅内和脊椎内损害(诸如挫伤、穿透、剪切、压迫和撕裂)；颈椎挫伤或惊吓婴儿综合征(whiplash and shaken infant syndrome)。
其它神经学损伤包括肿瘤和侵袭CNS和PNS的其它瘤形成状况。尽管基础疾病被考虑为增殖性的(而不是损伤)，但周围组织可被损害。另外，可利用细胞疗法将凋亡或其它抗瘤分子递送到肿瘤位点，例如，通过递送产生这种试剂的基因修饰细胞。
术语 “治疗神经学损伤(或神经学损伤的治疗)”指改善如本文定义的神经学损伤的影响，或延迟、停止或逆转如本文定义的神经学损伤的发展，或延迟或防止如本文定义的神经学损伤的发病。
术语刺激“SVZ的再生能力”指增加室下区再形成或重制外围组织包括神经学和内皮组织的能力。
术语改进“神经学功能”指使功能更好，所述功能诸如例如，肌肉强度、反射性反应或感觉知觉。神经学功能已得到改进的确定是通过各种行为测试以及运动、感觉、反射和平衡测试评估的。
术语 “减少患者脑的损害或损伤部分中的凋亡”指降低已遭受一些其它损伤或损害的患者脑的一部分中经历凋亡或程序性细胞死亡的细胞的数目。凋亡可以通过本领域已知的任何方法进行确定，包括但不限于基于流式细胞术的凋亡检测方法、免疫组织化学方法、DNA断裂测定、胱天蛋白酶活性测定等。凋亡也可以通过本领域已知的模拟或预测体内反应的体外测定进行确定。
术语"有效量"指如本文所描述的化合物、材料或组合物的浓度或量，其有效实现特定的生物学结果。这种结果包括但不限于体外或体内细胞生长和/或分化，以及如本文所描述的神经学损伤的治疗。关于生长因子，有效量可为约1纳克/ml至约1微克/ml的范围。关于体内施用给患者的UTC，有效量可为少至几百或更少至多至几百万或更多的范围。在具体实施方案中，有效量可为约103至约1011细胞的范围、更具体地至少约104细胞。将认识到，待施用的细胞数目将取决于待治疗的神经学损伤的细节而变化，所述细节包括但不限于待治疗的尺寸或总体积/表面积，以及施用位点对待治疗区域位置的接近度，和医学生物学家熟悉的其它因素。
术语"有效期"、"有效时间段"或"有效条件"通常指时间段或其它可控条件(例如，对于体外方法的温度、湿度)，其对于试剂或药物组合物实现其预期结果是必要的或优选的。
可与术语"生物相容性载体"或"生物相容性介质"互换使用的术语"药学上可接受的载体"或"药学上可接受的介质"指试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型，其不仅与待治疗性施用的细胞和其它试剂相容，而且也适于与人类和动物的组织接触使用，而没有过度的毒性、刺激、变态反应或与合理的利益/风险比相称的其它并发症。如本文更详细地描述的，适于在本发明中使用的药学上可接受的载体包括液体、半固体(例如，凝胶)和固体材料(例如，细胞支架和基质、管、片和如本领域已知的和本文更详细地描述的其它这种材料)。这些半固体和固体材料可进行设计以抵抗体内降解(非-生物可降解的)或它们可进行设计以在体内降解(生物可降解的，生物可侵蚀的)。生物可降解材料可进一步为生物可再吸收的或生物可吸收的，即，它可溶解和吸收到体液中(水溶性植入物是一个例子)，或降解并最终从身体消除，或是通过转化成其它材料或是通过天然途径破坏和消除。
几个术语在本文中关于细胞或组织移植或细胞置换疗法使用。术语"自体转移"、"自体移植"、"同体移植"等指其中细胞或移植供体也是细胞或移植受者的治疗。术语 "同种异体转移"、"同种异体移植"、"同种异体移植物"等指其中细胞或移植供体与受者是相同物种但不是相同个体的治疗。其中供体的细胞已与受者进行组织相容性匹配的细胞转移有时被称为"同系转移"。术语 "异种转移"、"异种移植"、"异种移植物"等指其中细胞或移植供体与受者是不同物种的治疗。
如本文使用的术语"分离"通常指已从其天然环境中分离的细胞。该术语包括从其天然环境中总的物理分离，例如，从供体动物取出。在优选的实施方案中，分离的细胞在组织中不存在，即，细胞从与其正常接触的邻近细胞中分离或解离。优选地，细胞作为细胞悬浮液施用。如本文使用的，短语"细胞悬浮液"包含与培养基接触和已例如通过使一片组织接受轻柔研磨被解离的细胞。
如本文使用的术语"基质"通常指连同细胞施用给患者的生物可降解的和/或生物可再吸收的材料。基质可充当临时支架，直至被新生长的细胞取代。在一些实施方案中，基质可提供因子或与细胞结合使用的其它试剂的持续释放，并且可提供用于发展患者中组织生长的结构。在其它实施方案中，基质仅提供用于发展组织的临时支架。基质可以是颗粒形式(直径大于10微米的大颗粒或直径小于10微米的微粒)，或其可以是结构上稳定的三维植入物形式(例如，支架)。基质可以是浆液、水凝胶或可选地三维结构诸如立方体、圆柱体、管、块、薄膜、片或适当的解剖形式。
如本文使用的术语"支架"通常指三维多孔结构，其提供用于细胞生长的模板。支架由在体内随时间过去降解的生物可降解的和/或生物可再吸收的材料制成。支架降解花费的时间长度可取决于材料的分子量。因而，较高分子量材料可产生较长时间段保持它们的结构完整性的聚合物支架；而较低分子量导致较慢的释放和较短的支架寿命。支架可由本领域已知的任何方式制成。可以用于形成支架的聚合物的例子包括天然和合成聚合物。
描述
包括与神经元细胞死亡或损害有关的状况，包括脑血管机能不全、局灶性或弥散性脑外伤、弥散性脑损害和外伤性神经病的神经学损伤具有作为共同特征的神经细胞的特定或易损组的功能障碍或丢失。该共性使得能够开发类似的治疗方法用于易损或损害的神经组织的修复和再生，其中之一是基于细胞的疗法。在本文描述的其各种实施方案中，本发明的特征在于用于神经修复和再生的方法和药物组合物，其利用来源于产后组织的祖细胞和细胞群。本发明适用于任何神经学损伤，但预期其尤其适于许多损伤，所述损害非限制性地包括，脑缺血或梗死，包括栓塞性阻塞和血栓性阻塞，急性缺血后再灌注，围产期缺氧-缺血性损伤，心跳停止，以及任何类型的颅内出血(诸如硬膜外、硬膜下、蛛网膜下和大脑内)，以及颅内和脊椎内损害(诸如挫伤、穿透、剪切、压迫和撕裂)，也包括颈椎挫伤或惊吓婴儿综合征。
如上文概述的，本发明在其一方面总的来说涉及应用分离的脐带组织-来源的细胞(UTC)治疗神经学损伤的方法，所述细胞来源于已使其基本上不含血液的脐带组织。UTC能够在培养中自我更新和扩增，并且具有分化成神经表型细胞的潜能。某些实施方案的特征在于包含这种细胞的群、包含该细胞或其组分或产物的药物组合物、和应用该药物组合物治疗患有神经学损伤的患者的方法。脐带组织-来源的细胞已通过它们在培养中的生长性质、通过它们的细胞表面标记、通过它们的基因表达、通过它们产生某些生物化学营养因子的能力和通过它们的免疫性性质进行表征。
根据本文描述的方法，对哺乳动物脐带组织进行消化并优选地在无菌环境中分离UTC。在分离UTC之前，优选地从产后组织除去血液和碎片。例如，可用缓冲溶液洗涤产后组织，例如但不限于磷酸缓冲盐水。洗涤缓冲液也可包含一种或多种抗真菌和/或抗生素试剂，例如但不限于青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。
可通过机械力(切碎或剪切力)解聚全部组织或其片段或部分。在目前优选的实施方案中，分离程序也利用酶促消化过程。已知许多酶在本领域中用于从复合组织基质分离个别细胞以促进在培养物中生长。范围为弱消化(例如，脱氧核糖核酸酶和中性蛋白酶，分散酶)至强消化(例如木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)的这种酶是可购得的。这种酶的一个非穷尽性列举包括粘液溶解酶活性、金属蛋白酶、中性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(诸如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶)和脱氧核糖核酸酶。目前优选的是选自金属蛋白酶、中性蛋白酶和粘液溶解活性的酶活性。例如，已知胶原酶对于从组织分离各种细胞是有用的。脱氧核糖核酸酶可以消化单链DNA并且可以最小化分离期间的细胞-团块化。优选的方法涉及用胶原酶和分散酶，或胶原酶、分散酶和透明质酸酶的酶促处理。技术人员将认识到，在本领域已知许多这种酶处理用于从各种组织来源分离细胞，并且被充分装备以评估新的或另外的酶或酶组合在分离本发明的细胞中的效用。优选的酶处理可以是约0.5至2小时长或更长。在其它优选的实施方案中，在解离步骤的酶处理过程中，于约37℃温育组织。
分离的细胞可用于起始或接种细胞培养物。将分离的细胞转移到未包被或包被有细胞外基质或配体诸如层粘连蛋白、胶原 (天然的、变性的或交联的)、明胶、纤连蛋白和其它细胞外基质蛋白的无菌组织培养容器。细胞在能够维持细胞生长的任何培养基中培养，诸如但不限于，DMEM (高或低葡萄糖)、高级DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle's基础培养基、Ham's F10 培养基 (F10)、Ham's F-12 培养基 (F12)、Iscove's改良Dulbecco's培养基、间充质干细胞生长培养基 (MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640和CELL-GRO-FREE。培养基可补加有一种或多种组分，包括例如，胎牛血清 (FBS)，优选地约2-15% (v/v)；马血清 (ES)；人血清 (HS)；β-巯基乙醇 (BME或2-ME)，优选地约0.001% (v/v)；一种或多种生长因子，例如，血小板衍生生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，胰岛素样生长因子- 1 (IGF-1)，白细胞抑制因子(LIF)和促红细胞生成素; 氨基酸，包括L-缬氨酸；和一种或多种抗生素和/或抗真菌剂以控制微生物污染，诸如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，单独的或组合的。培养基优选地包括生长培养基(例如 DMEM-低葡萄糖、血清、BME和抗生素试剂)。
以允许细胞生长的密度将细胞接种在培养容器中。优选地，以约0至约5体积%的空气中的CO2和约2至约25体积%的空气中的O2，优选地约5%至约20%的空气中的O2培养细胞。细胞优选地在约25℃至约 40℃培养和更优选地在37℃培养。细胞优选地在培养箱中培养。培养容器中的培养基可以是静态的或搅动的，例如，使用生物反应器。UTC优选在低氧化应激(例如，添加谷胱苷肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸)下生长。如本文使用的"低氧化应激"指对培养的细胞没有或具有最小自由基损害的条件。
在本发明的一些实施方案中，可将UTC传代或移动至分开的培养容器中，所述分开的培养容器含有与最初使用的相同或不同类型的新鲜培养基，在所述分开的培养容器中细胞群可进行有丝分裂扩增。本发明的方法中使用的细胞可在介于传代0和衰老之间的任何点使用。优选将细胞传代约3至约25次，更优选传代约4至约12次，并优选传代10或11次。可进行克隆和/或亚克隆以证实已经分离到细胞克隆群。
此外，可将产后组织中存在的不同细胞类型分级分离为亚群，从所述亚群中可以分离UTC。这可使用用于细胞分离的标准技术来完成，包括，但不限于，酶促处理以将产后组织解离成其组分细胞，然后是具体细胞类型的克隆和选择，包括但不限于基于形态学和/或生物化学标记的选择；希望的细胞的选择性生长(阳性选择)；不需要的细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于在混合群中有差别的细胞可凝集性的分离，例如，采用大豆凝集素；冻融程序；在混合群中有差别的细胞粘附性质；过滤；常规的和区带离心；离心淘析(逆流(counter-streaming)离心)；单位重力分离；逆流分布；电泳；和荧光激活细胞分选术(FACS)。
按需要改变培养基。继续温育，直至足够数目或密度的细胞在皿中积累。其后，可除去存在的任何原始的外植组织部分，并且通过胰蛋白酶消化使用标准技术或通过使用细胞刮棒从皿中分离剩余的细胞。胰蛋白酶消化之后，收集细胞，移动到新鲜培养基和如上温育。在一些实施方案中，培养基在胰蛋白酶消化后大约24小时至少更换1次，以除去任何漂浮细胞。认为在培养物中剩余的细胞是UTC。
UTC可被冷藏。因此，用于自体转移(对于母亲或孩子)的UTC可来源自孩子出生后的适当的产后组织，然后进行冷藏以便在随后需要它们用于移植的情况下是可用的。
UTC可通过下列进行表征，例如，通过生长特征(例如，群体倍增能力、倍增时间、传代至衰老)、核型分析(例如，正常核型、母源谱系或新生儿谱系)、流式细胞术(例如，FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，用于检测表位)、基因表达概况(例如，基因芯片阵列、聚合酶链反应(例如，逆转录酶PCR、实时PCR和常规PCR))、蛋白质阵列、蛋白质分泌(例如，通过血浆凝固测定或UTC条件培养基的分析，例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA))、混合淋巴细胞反应(例如，作为PBMCs的刺激的测量)，和/或本领域已知的其它方法。
脐组织来源的细胞的例子于2004年6月10日保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)并指定为如下ATCC登记号：(1) 株名称 UMB 022803 (P7) 指定为登记号PTA-6067；和(2) 株名称UMB 022803 (P17) 指定为登记号PTA-6068。
本发明的方法中有用的UTC可拥有下列生长特征中的一个或更多：(1) 它们在培养物中需要L-缬氨酸用于生长；(2) 它们能够在含约5%至约20%的氧的气氛中生长；(3) 它们在达到衰老之前具有在培养物中至少倍增约40次的潜能；和(4) 它们在未包被或包被明胶、层粘连蛋白、胶原、聚鸟氨酸、玻连蛋白或纤连蛋白的组织培养容器上贴壁和扩增。
另外，本发明的方法中有用的UTC可拥有正常核型，所述核型随着细胞传代保持。用于核型分析的方法是可用的并且是本领域的技术人员已知的。
同样，本发明的方法中有用的UTC可通过某些蛋白质的产生表征，包括：(1) 组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中至少一种的产生；和(2) CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2和HLA-A、B、C 细胞表面标记中至少一种的产生，如通过流式细胞术检测的。此外，本发明的方法中有用的UTC可通过缺乏下列至少一种的产生表征：CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G和HLA-DR、DP、DQ细胞表面标记，如通过流式细胞术检测的。本发明的方法中有用的UTC可产生组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中至少两种；或蛋白质组织因子、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中所有三种。
此外，本发明的方法中有用的UTC可通过基因表达表征，所述基因表达相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，对于编码白细胞介素8、浆膜蛋白(reticulon) 1、趋化因子(C-X-C基序)配体1 (黑色素瘤（melonoma）生长刺激活性，α)、趋化因子(C-X-C基序)配体6 (粒细胞趋化蛋白2)、趋化因子(C-X-C基序)配体3、肿瘤坏死因子、α-诱导的蛋白3、C-型凝集素超家族成员2、Wilms瘤1、醛脱氢酶1家族成员A2、肾素、氧化的低密度脂蛋白受体1、智人(Homo sapiens)克隆IMAGE:4179671、蛋白激酶C ζ、假设的蛋白质DKFZp564F013、卵巢癌中下调的1和来自克隆DKFZp547k1113的智人基因中至少一种的基因增加。
同样，本发明的方法中有用的UTC可通过基因表达表征，所述基因表达相对于作为成纤维细胞、间充质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细胞，对于编码下列中至少一种的基因降低：身材矮小症同源框2、热休克27 kDa蛋白2、趋化因子(C-X-C基序)配体12 (基质细胞来源的因子1)、弹性蛋白(主动脉瓣上狭窄，Williams-Beuren综合征)、智人mRNA、cDNA DKFZp586M2022 (来自克隆KFZp586M2022)、间充质同源框2 (生长停滞特异的同源框)、sine oculis同源框同源物1 (果蝇属(Drosophila))、晶体蛋白α B、形态发生的散乱相关活化剂2、DKFZP586B2420蛋白、类似于neuralin 1、四连蛋白(纤溶酶原结合蛋白)、src同源三(SH3)和富含半胱氨酸结构域、胆固醇25-羟化酶、runt-相关的转录因子3、白细胞介素11受体α、前胶原 C-内肽酶增强子、frizzled同源物7 (果蝇属)、假设的基因BC008967、类型VIII α1胶原、生腱蛋白C (hexabrachion)、易洛魁族人同源框蛋白5、hephaestin、整联蛋白β8、突触小泡糖蛋白2、成神经细胞瘤致瘤性的抑制1、胰岛素样生长因子结合蛋白2(36kDa)、智人cDNA FLJ12280 fis克隆MAMMA1001744、细胞因子受体样因子1、钾中间的/小的电导钙-活化通道亚家族N成员4、整联蛋白β7、含PDZ-结合基序的转录辅激活物(TAZ)、sine oculis 同源框同源物2 (果蝇属)、KIAA1034蛋白、突触小泡相关膜蛋白5 (myobrevin)、含EGF的纤蛋白（fibulin）-样细胞外基质蛋白1、早期生长应答3、远端较小的(distal-less)同源框 5、假设的蛋白FLJ20373、醛酮还原酶家族1成员C3 (3-α羟基类固醇脱氢酶类型II)、双糖链蛋白聚糖、含PDZ结合基序的转录辅激活物(TAZ)、纤连蛋白 1、脑啡肽原、整联蛋白β-样1 (含EGF-样重复结构域)、智人mRNA全长插入片段cDNA克隆EUROIMAGE 1968422、EphA3、KIAA0367蛋白、利尿钠肽受体 C/鸟苷酸环化酶C (心房钠尿肽受体 C)、假设的蛋白FLJ14054、智人mRNA、cDNA DKFZp564B222 (来自克隆KFZp564B222)、BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3-样、AE结合蛋白1和细胞色素c氧化酶亚基VIIa多肽1 (肌肉)。
另外，本发明的方法中有用的UTC可通过下列至少一种的分泌表征：MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES和TIMP1。此外，本发明的方法中有用的UTC可通过下列至少一种的分泌的缺乏表征：TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1b、I309、MDC和VEGF，如通过ELISA检测的。
本发明的方法中有用的UTC优选地包括上文列出的生长、蛋白质/表面标记产生、基因表达或物质分泌特征中的两种或更多种。本发明的方法中有用的UTC可包括三、四、五、六、七、八或更多种所述特征。本发明的方法中有用的UTC还可包括所有上述特征。
在其几个方面中本发明的方法中有用的UTC中的是，具有上述特征的UTC，且更特别的是那些细胞，其中细胞具有正常核型并随着传代保持正常核型，并且此外，其中细胞表达标记CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的每一种，其中细胞产生免疫可检测的蛋白，所述蛋白对应于所列的标记。本发明的方法中有用的UTC还可包括除前述外不产生对应于标记CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR、DP、DQ中任一种的蛋白质的细胞，如通过流式细胞术检测的。
具有沿着导致各种表型的系分化的潜能的某些细胞是不稳定的，并且因而可以自发地分化。本发明的方法中有用的UTC是不自发分化的细胞，例如沿着神经系。本发明的方法中有用的UTC，当在生长培养基中生长时，就在它们表面上产生的细胞标记以及就各种基因的表达模式而言，基本是稳定的，例如使用Affymetrix GENECHIP测定的。所述细胞例如在传代期间和经过多个群体倍增在它们的表面标记特征方面基本保持恒定。
然而，本发明方法中有用的UTC的一个特征是，通过使它们经受分化-诱导细胞培养条件，可将它们故意地诱导以分化成神经谱系表型。这可通过本领域已知的一种或多种方法完成。例如，如本文所例示的，可将UTC铺平板在瓶上，所述瓶包被以在包含B27 (B27补充物，Invitrogen)、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的神经基础(Neurobasal)-A培养基(Invitrogen, Carlsbad, Ca.)中的层粘连蛋白，其组合在本文中称为神经祖先扩增(NPE)培养基。NPE培养基可进一步补充以bFGF和/或 EGF。可选地，本发明方法中有用的UTC可通过下列进行体外诱导以分化：(1) 共培养UTC与神经祖细胞，或(2) 使UTC在神经祖细胞-条件培养基中生长。
UTC的分化可通过具有延长突起的双极细胞形态学来证明。诱导的细胞群可对巢蛋白的存在染色阳性。分化的UTC可通过巢蛋白、TuJ1 (BIII微管蛋白)、GFAP、酪氨酸羟化酶、GABA、O4和/或MBP的检测进行评估。另外，本发明方法中有用的UTC可展示形成三维体(three-dimensional bodies)的能力，所述三维体是神经球(neurosphere)的神经元干细胞形成特有的。
本发明的方法中有用的UTC可包括异质的细胞群。本发明的方法中有用的异质细胞群可包含至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的如上所述的UTC。本发明的方法中有用的异质细胞群可进一步包含干细胞或其它祖细胞，例如神经祖细胞，或其可进一步包含完全分化的神经细胞。此外，群体可基本上是同质的，即，包含基本上仅仅UTC(如至少约96%、97%、98%、99%或更多的UTC)。本发明的方法中有用的同质细胞群可包含脐或胎盘-来源的细胞。脐-来源的细胞的同质群优选地不含母源谱系的细胞。胎盘-来源的细胞的同质群可以是新生儿或母源谱系的。细胞群的同质性可通过本领域已知的任何方法实现，例如，根据已知方法通过细胞分选(例如，流式细胞术)或通过克隆扩增。因而，本发明的方法中有用的同质UTC群可包含脐带组织来源的细胞的克隆细胞系。这种群体在具有高度希望的功能性的细胞克隆被分离时是特别有用的。
另外, 本发明方法中有用的UTC可包括在一种或多种因子存在下或在刺激干细胞沿神经原性途径分化的条件下温育的细胞群。这种因子是本领域已知的，并且技术人员将认识到，用于分化的合适条件的确定可以用常规实验完成。这种条件的最优化可以通过统计学实验设计和分析完成，例如反应表面方法学允许同时最优化多个变量，例如在生物学培养中。示范性因素包括但不限于因子诸如生长或营养因子、脱甲基化剂、与神经谱系细胞共培养或在神经谱系细胞-条件培养基中培养、以及本领域已知的刺激干细胞沿神经原性途径或谱系分化的其它条件。(参见，例如，Lang, KJD, 等人,J. Neurosci. Res., 2004; 76:184-192; Johe, KK, 等人,Genes Devel., 1996; 10:3129-3140; Gottleib, D,Ann. Rev. Neurosci., 2002; 25:381-407)。
也可将本发明方法中有用的UTC进行基因修饰，例如，以产生神经治疗上有用的基因产物，或产生抗瘤剂用于治疗肿瘤。遗传修饰可用多种载体中的任一种完成，包括但不限于整合病毒载体，例如，逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体；非整合复制载体，例如，乳头瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体；或复制-缺陷型病毒载体。将DNA引入细胞中的其它方法包括使用脂质体、电穿孔、基因枪或通过直接DNA注射。
宿主细胞可用DNA和选择标记转化或转染，所述DNA由一种或多种适当的表达控制元件控制或与所述控制元件操作性结合，控制元件诸如启动子或增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等。任何启动子都可用于驱动插入的基因的表达。例如，病毒启动子包括但不限于CMV启动子/增强子、SV 40、乳头瘤病毒、EB病毒或弹性蛋白基因启动子。此外，用于控制目的基因表达的控制元件可以允许基因的调节的表达以便只在体内需要时才合成产物。如果瞬时表达是希望的，那么可在非-整合和/或复制-缺陷型载体中使用组成型启动子。可选地，诱导型启动子可用于在需要时驱动插入的基因的表达。诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白和热休克蛋白相关的那些。
引入外来DNA后，可允许工程改造的细胞生长在富集培养基中并然后切换到选择性培养基。外来DNA中的选择标记赋予对选择的抗性并允许细胞稳定地将例如质粒上的外来DNA整合到它们的染色体中并生长以形成转化灶，其进而可以克隆和扩增为细胞系。该方法可以有利地用于工程改造表达基因产物的细胞系。
本发明的方法中有用的UTC可被基因工程改造以"敲除"或"击倒"促进植入位点处的炎症或排斥的因子的表达。用于减少靶基因表达水平或靶基因产物活性水平的负调节技术在下文中讨论。如本文使用的"负调节"指靶基因产物的水平和/或活性相对于缺乏调节治疗情况下靶基因产物的水平和/或活性的减少。对神经元或神经胶质细胞为天然的基因的表达可以被降低或敲除，其中使用许多技术，包括例如，通过使用同源重组技术灭活基因抑制表达。一般地，编码蛋白质的重要区域的外显子(或该区域5'的外显子)被阳性选择标记例如neo打断，从而防止正常mRNA从靶基因的产生并导致该基因的失活。基因也可通过在部分基因中产生缺失，或通过缺失整个基因而灭活。通过使用带有与靶基因具有同源性的在基因组中相距很远的两个区域的构建体，插入这两个区域的序列可以被缺失。(Mombaerts等人, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 1991; 88:3084)。反义、DNA核酶、核酶、小干扰RNA (siRNA)和抑制靶基因表达的其它这种分子也可以用于降低靶基因活性水平。例如，抑制主要组织相容性基因复合体(HLA)表达的反义RNA分子已显示就免疫应答而言最通用。又进一步地，三股螺旋分子可以在降低靶基因活性水平中使用。这些技术由Davis, L. G.等人, (eds), Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., 1994, Appleton & Lange, Norwalk, Ct.详细描述。
另外，提供了从UTC、或包含UTC的异质或同质细胞群、以及已被基因修饰或已被刺激以沿神经原性途径分化的UTC或其群体制备的细胞裂解物和细胞可溶性级分，它们在本发明方法中是有用的。UTC裂解物可溶级分(即，基本上不含膜)的体内使用，例如，允许有益的细胞内环境在患者中同种异体使用，而不引入最有可能触发排斥或其它不利的免疫应答的可观量的细胞表面蛋白质。裂解细胞的方法是本领域公知的并包括机械破裂、酶促破裂或化学破裂或其组合的各种方式。这种细胞裂解物可在它们的生长培养基中从细胞直接制备，并且因而包含分泌的生长因子等，或它们可从例如，在PBS或其它溶液中洗涤而不含培养基的细胞制备。如果优选，那么洗涤的细胞可在大于原始群密度的浓度重悬浮。
可制备发明的方法中有用的UTC的全细胞裂解物，例如，通过破裂细胞而不随后分离细胞级分。可选地，可通过本领域已知的常规方法从细胞可溶级分分离细胞膜级分，例如，离心、过滤或类似方法。
从本发明的方法中有用的脐带组织来源的细胞群制备的细胞裂解物或细胞可溶级分可照原样使用，通过例如超滤或冻干进一步浓缩，或甚至干燥、部分纯化、与本领域已知的药学上可接受的载体或稀释剂组合、或与其它化合物诸如生物制品例如药学上有用的蛋白质组合物组合。细胞裂解物或其级分可在体外或体内使用，单独或例如连同自体或同系活细胞。裂解物如果体内引入，则可在治疗位点局部引入或远距离引入，以向患者提供例如所需的细胞生长因子。
另外，本发明的方法中有用的UTC可以体外培养以高得率地产生生物学产物。例如，可以使用本文描述的培养技术克隆扩增天然产生特定的目标生物学产物(例如，营养因子)或已被基因工程改造以产生生物学产物的这种细胞。可选地，可在诱导分化为神经谱系或其他谱系的培养基中扩增细胞。在任一情况下，可以使用标准分离技术容易地从条件培养基分离细胞产生和分泌到培养基中的生物学产物，例如，诸如示差蛋白质沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、电泳和HPLC，仅举几个例子。"生物反应器"可用于利用流动方法进行进料，例如，体外三维培养。基本上，随着新鲜培养基通过三维培养物，生物学产物被洗出培养物并且可然后从流出物中分离，如上述。
可选地，目标生物学产物可保留在细胞内，并且因而其收集可需要细胞被裂解，如上文所述。生物学产物可然后使用上文列出的技术中的任何一种或多种进行纯化。
另外，来自本发明的方法中有用的培养的UTC的条件培养基可在体外和体内使用，如下文所述。UTC的细胞条件培养基的应用允许UTC分泌的有益的营养因子在患者中同种异体地使用，而不引入可触发排斥或其它不利的免疫应答的完整细胞。条件培养基通过在培养基中培养细胞，然后从培养基取出细胞制备。
从本发明的方法中有用的UTC群制备的条件培养基可照原样使用，通过例如超滤或冻干进一步浓缩，或甚至干燥、部分纯化、与本领域已知的药学上可接受的载体或稀释剂组合、或与其它化合物诸如生物制品例如药学上有用的蛋白质组合物组合。条件培养基可在体外或体内使用，例如单独或与自体或同系活细胞一起。条件培养基如果体内引入，则可在治疗位点局部引入或远距离引入，以向患者提供例如所需的细胞生长或营养因子。
另外，可以制备、收集且使用由在液体、固体或半固体基质上培养本发明的方法中有用的UTC产生的细胞外基质(ECM)，作为将活细胞植入需要组织修复或置换的受试者中的替代方案。在需要量的ECM在框架上分泌的条件下，在如本文其它处描述的三维框架上体外培养UTC。取出构成新组织的细胞，并处理ECM用于进一步使用，例如，作为可注射制剂。为了完成这一点，杀死框架上的细胞并从框架除去任何细胞碎片。该过程可以许多不同方式执行。例如，可以在液氮中瞬间冻结活组织，而不冷藏，或可以在无菌蒸馏水中浸入组织以使细胞响应于渗透压裂解。
一旦细胞已被杀死，就可破裂细胞膜并通过用温和去污剂漂洗诸如EDTA、CHAPS或两性离子去污剂处理除去细胞碎片。可选地，可以对组织进行酶促消化和/或用破坏细胞膜和允许去除细胞内容物的试剂提取。这种酶的例子包括但不限于，透明质酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶。去污剂的例子包括非离子去污剂诸如，例如，烷基芳基聚醚醇(TRITON X-100)、辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇(Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.)、BRIJ-35、聚乙氧基乙醇十二烷基醚(Atlas Chemical Co., San Diego, Ca.)、聚山梨醇酯 20 (TWEEN 20)、聚乙氧基乙醇失水山梨糖醇单月桂酸酯(Rohm and Haas)、聚乙烯十二烷基醚(Rohm and Haas)；和离子去污剂诸如十二烷基硫酸钠、硫酸化高级脂族醇、包含7至22个碳原子的支链或非支链磺化烷和磺化烷基芳烃。
ECM的收集可以以多种方式完成，这例如取决于新组织是否已在生物可降解的或非生物可降解的三维框架上形成。例如，如果框架是非生物可降解的，那么ECM可以通过使框架接受超声处理、高压水喷射、机械刮擦或用去污剂或酶温和处理或上述任何组合取出。
如果框架是生物可降解的，那么ECM可以例如通过允许框架降解或在溶液中溶解收集。可选地，如果生物可降解的框架由本身可以连同ECM注射的材料组成，那么框架和ECM可以整体(in toto)加工用于随后注射。可选地，ECM可以通过上文描述的用于从非生物可降解的框架收集ECM的方法中的任一种从生物可降解的框架取出。所有收集过程优选地进行设计以便不变性ECM。
已收集后，可对ECM进一步地进行加工。例如，可以使用本领域公知的技术，诸如通过超声处理将ECM同质化为细粒，以便使其可以通过外科手术针。如果需要，那么可以通过γ照射交联ECM的组分。例如，可以在0.25至2 百万拉德之间照射ECM以对ECM灭菌和交联。使用毒性试剂，诸如戊二醛的化学交联是可能的，但通常不是优选的。
通过混合本发明的方法中有用的UTC产生的ECM与一种或多种其它细胞类型的ECM，可调整蛋白质诸如ECM中存在的各种类型的胶原的量和/或比。此外，生物活性物质诸如蛋白质、生长因子和/或药物可以掺入ECM。示范性的生物活性物质包括组织生长因子，诸如TGF-β等，其在注射位点促进愈合和组织修复。这种另外的试剂可连同例如UTC产生的全细胞裂解物、可溶细胞级分或进一步纯化的组分和产物使用。
在另一方面，本发明提供药物组合物，其在用于治疗神经学损伤、改进神经学功能、刺激SVZ再生能力或减少SVZ中凋亡的各种方法中利用UTC、UTC群、UTC组分和产物。一些药物组合物包括活细胞(单独的UTC或与其它细胞类型混合)。其它药物组合物包括UTC细胞组分(例如，细胞裂解物、可溶性细胞级分、条件培养基、ECM或前述任一种的组分)或产物(例如，UTC天然产生或通过遗传修饰产生的营养和其它生物学因子，来自UTC培养物的条件培养基)。在任何情况下，药物组合物可进一步包括其它活性剂，诸如抗炎药、抗凋亡剂、抗氧化剂、生长因子、神经营养因子或神经再生或神经保护药物，如本领域已知的。
可加入UTC药物组合物的其它组分的实例包括但不限于：(1) 其它神经保护或神经有益药物；(2) 选择的细胞外基质组分，诸如一种或多种类型的本领域已知的胶原，和/或生长因子，富血小板血浆和药物(可选地，UTC可被基因工程改造以表达和产生生长因子)；(3) 抗凋亡剂(例如，促红细胞生成素(EPO)、EPO 模拟体(mimetibody)、血小板生成素、胰岛素样生长因子(IGF)-I、IGF- II、肝细胞生长因子、胱天蛋白酶抑制剂)；(4) 抗炎化合物(例如，p38 MAP激酶抑制剂、TGF-β抑制剂、抑制素、IL-6和IL-1抑制剂、吡嘧司特(PEMIROLAST)、曲尼司特(TRANILAST)、REMICADE、西罗莫司(SIROLIMUS)和非类固醇消炎药 (NSAIDS) (诸如替波沙林(TEPOXALIN)、托美汀(TOLMETIN)和SUPROFEN；(5) 免疫抑制或免疫调谐剂，诸如钙依赖磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗增殖剂、皮质类固醇和各种抗体；(6) 抗氧化剂诸如丙丁酚（probucol）、维生素C和E、辅酶Q-10、谷胱苷肽、L-半胱氨酸和N-乙酰基半胱氨酸；和(7) 局部麻醉剂，仅举几个例子。
本发明包含的药物组合物包括用药学上可接受的载体或介质配制的UTC或其组分或产物。合适的药学上可接受的载体包括水，盐溶液(诸如林格液)，醇，油，明胶，和碳水化合物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉，脂肪酸酯，羟甲基纤维素，和聚乙烯基吡咯烷。这种制剂可以是灭菌的，并且如果需要，则与辅助剂诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、和用于影响渗透压的盐、缓冲液和着色剂混合。适于在本发明中使用的药物载体是本领域已知的和在例如Pharmaceutical Sciences (17th Ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa.)和WO 96/05309中描述的。
一般地但不是排他地，将包含UTC组分或产物而不是活细胞的药物组合物配制为液体(或在口服递送适当时配制为固体片剂、胶囊等)。可将这些配制用于通过本领域已知的任何可接受途径施用，以实现药物和生物分子向靶神经组织的递送，包括但不限于，口、鼻、眼和肠胃外，包括静脉内。肠胃外施用的具体途径包括但不限于肌内、皮下、腹膜内、大脑内、心室内、脑室内、鞘内、脑池内、脊柱内和/或脊柱旁施用途径，其通过经颅内或脊椎内针和/或导管带有或不带有泵设备递送实施。
一般地，包含活UTC细胞的药物组合物配制为液体、半固体(例如，凝胶)或固体(例如，基质、支架等，适当地用于神经组织工程改造)。液体组合物被配制用于通过本领域已知的任何可接受的途径施用，以实现活细胞向靶神经组织的递送。一般地，这些包括注射或输注到CNS或PNS中，其或是以扩散方式或是靶向神经学损伤或痛苦位点，通过包括但不限于下列的施用途径实施：眼内、大脑内、心室内、脑室内、鞘内、脑池内、脊柱内和/或脊柱旁施用途径，通过经颅内或脊椎内针和/或导管带有或不带有泵设备递送。
包含半固体或固体载体中的活细胞的药物组合物一般地配制用于在神经学损伤或痛苦位点外科手术植入。将认识到，液体组合物也可通过外科手术程序施用。此外，半固体或固体药物组合物可包括半透凝胶、格栅、细胞支架等，其可为非生物可降解的或生物可降解的。例如，可希望或适于将外源细胞与它们的环境隔绝，而使得细胞能够分泌和递送生物分子(例如，神经营养因子)以包绕神经细胞。因此，细胞可配制为包含活UTC或含UTC的细胞群的自主植入物，所述细胞或细胞群被物理上分开移植的细胞与宿主组织的非可降解的选择性可渗透屏障包绕。这种植入物有时被称为"免疫保护的"，这是因为它们具有在不存在药物诱导的免疫抑制下防止免疫细胞和大分子杀死移植的细胞的能力。
可选地，不同种类的可降解凝胶和网络用于本发明药物组合物。例如，特别适合于持续释放制剂的可降解材料包括生物相容性聚合物，诸如聚(乳酸)、乳酸-乙醇酸共聚物、甲基纤维素、透明质酸、胶原等。
另外，可希望或适于将将细胞递送在生物可降解的，优选地生物可再吸收的或生物可吸收的支架或基质之上或之中。一般地，这些三维生物材料包含附着于支架、在支架中分散或掺入在支架中截留的细胞外基质中的活细胞。一旦植入到身体的靶区域，这些植入物就变得与宿主组织整合，其中移植的细胞逐渐确立。(参见，例如，Tresco, PA,等人,Adv. Drug Delivery Rev., 2000; 42:3-27; 也参见Hutmacher, DW,J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2001; 12:107-174)。
可在本发明中应用的支架或基质(有时统称为“框架”)材料的实例包括非编织的垫、多孔泡沫或自装配肽。非编织的垫可例如使用包含乙醇酸和乳酸的合成可吸收共聚物(PGA/PLA)的纤维形成，其在商标VICRYL下出售(Ethicon, Inc., Somerville, N. J.)。也可利用由诸如冷冻-干燥或冻干方法形成的、由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸) (PCL/PGA)共聚物组成的泡沫，如美国专利号6,355,699中论述的。也可应用水凝胶诸如自装配肽(例如, RAD16)。原位形成可降解网络也适于在本发明中应用(参见，例如，Anseth, KS, 等人,J. Controlled Release, 2002; 78:199-209; Wang, D, 等人,Biomaterials, 2003; 24:3969-3980; 美国专利公开2002/0022676)。将这些材料配制为适于注射的流体，然后可通过多种方式(例如温度、pH变化和暴露于光)诱导它们以在原位或体内形成可降解的水凝胶网络。
同样，框架可以是毡，它可由从生物可吸收的材料制成的复丝纱（multifilament yarn）组成。所述生物可吸收的材料例如PGA、PLA、PCL共聚物或掺合物或透明质酸。使用标准的纺织工艺技术将所述纱制成毡，所述技术由卷曲、切割、梳理和针刺组成。在另一个实施方案中，可将细胞接种于泡沫支架上，所述支架可为复合结构。
进一步地，可将框架模压成有用的形状，例如诸如具有用于神经束修复的分离柱(segregated column)的脊髓的那种(Friedman, JA, 等人,Neurosurgery, 2002; 51:742-51). 另外，将认识到，可在预先形成的非可降解外科手术或可植入设备上培养UTC，例如，如以相当于用于制备含成纤维细胞的GDC血管内线圈的方式(Marx, WF, 等人,Am. J. Neuroradiol., 2001; 22:323-333)。
可在接种细胞之前处理基质、支架或设备以增强细胞附着。例如，在接种之前，可以用0.1 摩尔乙酸处理尼龙基质并将其在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中温育以包被尼龙。可以应用硫酸类似地处理聚苯乙烯。也可对框架的外表面进行修饰以改进细胞的附着或生长以及组织的分化，诸如通过框架的血浆包被或一种或多种蛋白(例如，胶原、弹性纤维、网状纤维)，糖蛋白，糖胺聚糖(例如，硫酸肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白)，细胞基质和/或其它材料诸如但不限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物树胶等的添加。
含UTC框架是根据本领域已知的方法进行制备的。例如，可以使细胞在培养容器中自由生长至亚汇合或汇合，从培养物中取出并接种在框架上。可在接种细胞以触发分化和组织形成之前、期间或之后将生长因子加入培养基，如果需要的话。可选地，可对框架本身进行修饰以便其上的细胞生长得以增强，或以便植入物的排斥风险得以降低。因而，可将一种或多种生物活性化合物，包括但不限于抗炎药、免疫抑制剂或生长因子加入框架用于局部释放。
可以多种方式应用UTC、或包含UTC的细胞群、或UTC产生的组分或产物，以支持和促进神经细胞和组织的修复和再生。这种效用包括体外、先体外后体内和体内方法。
体外和先体外后体内方法：
可将UTC在体外使用以针对药物试剂、生长因子、调节因子等的有效性和细胞毒性筛选多种化合物。例如，这种筛选可在基本上同质的UTC群中进行以评估与UTC配制或共施用来治疗神经学损伤的候选化合物的功效或毒性。可选地，这种筛选可在已被刺激以分化成神经细胞或神经祖细胞的UTC上进行，用于评价新的药物候选物的功效。在此实施方案中，将UTC在体外维持并暴露于待测试化合物。潜在的细胞毒性化合物的活性可以通过其损害或杀死培养物中的细胞的能力测量。这可通过活体染色技术容易地评估。生长或调节因子的作用可通过分析与未暴露于所述因子的细胞相比培养的细胞的数目或强壮性(robustness)进行评估。这可应用标准的细胞学和/或组织学技术完成，包括利用限定类型特异性细胞抗原的抗体的免疫细胞化学技术的应用。
另外，如上文论述的，可以在体外培养UTC以产生生物学产物，所述产物或是细胞天然产生的，或是由细胞在诱导以分化成神经或其它谱系时产生的，或是由细胞通过遗传修饰产生的。例如，发现TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8从在生长培养基中生长的UTC分泌。这些营养因子中的一些，诸如BDNF和IL-6，在神经再生中具有重要作用。如尚未检测到或尚未检查到的在神经修复和再生中有用的其它营养因子有可能由UTC产生并可能分泌到培养基中。
同样，可将UTC用于条件培养基的产生，其或是从未分化的UTC或是从在刺激分化成神经或其它谱系的条件下温育的UTC产生。例如，这种条件培养基预期应用于神经原性前体细胞的体外或先体外后体内培养中，或在体内应用以支持包含UTC同质群或含UTC和神经祖先的异质群的移植的细胞。
另外，可将UTC裂解物、其可溶性细胞级分或组分、或ECM或其组分用于多种目的。如上文所指出的，可将这些组分中的一些用在药物组合物中。另外，可将细胞裂解物或ECM用于包被或以另外的方式处理待外科手术应用或用于植入或用于先体外后体内目的的物质或设备，以促进在这种治疗过程中接触的细胞或组织的愈合或存活。
进一步地，可将UTC用于体外共培养中以对其它细胞，具体而言神经细胞和神经祖先提供营养支持。对于共培养，可需要UTC和需要的其它细胞在其中两种细胞类型接触的条件下共培养。例如，这可以通过将作为异质细胞群的细胞接种在培养基中或接种在合适的培养基质上而实现。可选地，可以首先使UTC生长至汇合，并且然后将其充当用于培养物中的第二所需细胞类型的基质。另外，可对细胞进行进一步物理分离，例如，通过膜或类似设备，以便在共培养时间段后其它细胞类型可被取出并单独应用。UTC在共培养物中促进神经细胞类型扩增和分化的应用可在研究和在临床/治疗领域中具有可用性。例如，可利用UTC共培养来促进神经细胞在培养物中的生长和分化，例如，用于基础研究目的或在药物筛选测定中应用。也可利用UTC共培养进行神经祖先的先体外后体内扩增，用于针对治疗目的的随后施用。例如，可将神经祖细胞从个体收获，在与UTC的共培养物中先体外后体内扩增，然后返回到该个体(自体转移)或另一个体(同系或同种异体转移)中。先体外后体内扩增之后，可将包含UTC和神经祖先的混合细胞群施用给需要治疗的患者。可选地，在其中自体转移是适当的或需要的情况下，可将共培养的细胞群在培养物中物理分离，从而使得能够移动自体神经祖先用于给患者施用。
体内方法：
如实施例2-10列出的，UTC已显示出有效移植到体内，并且在对于其在人中的功效的可预测性公认的动物模型中提供丢失的神经功能。一旦移植到体内的靶向的神经位置，UTC本身就可分化成一种或多种神经表型，或它们可原位提供对神经祖先和神经细胞的营养支持，或它们可以这两种方式施加有益作用，以及其它。
可将UTC单独施用(例如，作为基本上同质群)或作为与其它细胞的混合物施用。如上所述，可将UTC如在与基质或支架或与常规药学上可接受的载体的药物制剂中配制的而施用。在将UTC连同其它细胞施用的情况下，它们可与其它细胞同时或顺序施用(或是在其它细胞之前或是在其它细胞之后)。可与UTC一起施用的细胞包括但不限于神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经祖细胞、神经干细胞和/或其它多能或多潜能干细胞。可在施用前立即或不久将不同类型的细胞与UTC混合，或可在施用前将它们一起共培养一段时间。
可将UTC连同其它神经-有益药物或生物分子、或其它活性剂施用，诸如抗炎药、抗凋亡剂、抗氧化剂、生长因子、神经营养因子或神经再生或神经保护药物，如本领域已知的。当将UTC连同其它试剂施用时，可将它们在单一药物组合物中一起施用，或在分开的药物组合物中与其它试剂同时或顺序施用(在其它试剂施用之前或之后)。
可连同UTC施用的其它组分的实例包括但不限于：(1) 其它神经保护或神经有益药物；(2) 选择的细胞外基质组分，诸如一种或多种类型的本领域已知的胶原，和/或生长因子，富血小板血浆和药物(可选地，UTC可被基因工程改造以表达和产生生长因子)；(3) 抗凋亡剂(例如，促红细胞生成素(EPO)、EPO 模拟体、血小板生成素、胰岛素样生长因子(IGF)-I、IGF- II、肝细胞生长因子、胱天蛋白酶抑制剂)；(4) 抗炎化合物(例如，p38 MAP激酶抑制剂、TGF-β抑制剂、抑制素、IL-6和IL-1抑制剂、吡嘧司特(PEMIROLAST)、曲尼司特(TRANILAST)、REMICADE、西罗莫司(SIROLIMUS)和非类固醇消炎药 (NSAIDS) (诸如替波沙林(TEPOXALIN)、托美汀(TOLMETIN)和SUPROFEN)；(5) 免疫抑制或免疫调谐剂，诸如钙依赖磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗增殖剂、皮质类固醇和各种抗体；(6) 抗氧化剂诸如丙丁酚、维生素C和E、辅酶Q-10、谷胱苷肽、L-半胱氨酸和N-乙酰基半胱氨酸；和(7) 局部麻醉剂，仅举几个例子。
例如，可将UTC作为未分化细胞施用，即，如在生长培养基中培养的。可选地，可将UTC在在培养物中暴露于刺激向所需神经表型分化的条件之后施用，所述所需神经表型例如星形胶质细胞、少突胶质细胞或神经元，和更具体地，5-羟色胺能、多巴胺能、胆碱能、γ-氨基丁酸-能或谷氨酸能神经元(参见，例如，Isacson, O,Lancet Neurology, 2003; 2(7):417-424，或支持神经再生或修复的其它谱系。
可将UTC外科手术植入、注射、递送(例如，通过导管或注射器的方式)或以其它方式直接或间接地施用到神经学损害或痛苦位点。UTC或其组合物的施用途径包括但不限于，静脉内、肌内、皮下、鼻内、大脑内、心室内、脑室内、鞘内、脑池内、脊柱内和/或脊柱旁施用途径，其通过经颅内或脊椎内针和/或导管带有或不带有泵设备递送实施。
当将细胞在半固体或固体设备中施用时，外科手术植入到体内精确位置一般是合适的施用方式。然而，可将液体或流体药物组合物施用到CNS或PNS中的更全面位置(例如，遍及弥散性受侵袭区域，例如，诸如在弥散性缺血损害中的情况)，因为神经祖细胞已显示能够从向神经系统的进入点广泛迁移到具体位置，例如，通过跟随放射状神经胶质细胞或通过响应于化学信号。
神经干细胞的该迁移能力已打开了用于恶性脑肿瘤治疗的新途径，即，应用祖细胞递送治疗性基因/基因产物用于这些迁移性肿瘤的治疗。例如，已报道，神经干细胞在植入成体啮齿类动物体内颅内神经胶质瘤时自身快速并且广泛地通过肿瘤床分布并与扩增和前进中的肿瘤细胞并列迁移，同时持续稳定地表达外来基因(Aboody, K, 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2000; 97:12846-12851)。也预期UTC适于这种类型的应用，即，可将基因修饰以产生凋亡或其它抗瘤剂，例如IL-12 (Ehtesham, M, 等人,Cancer Research, 2002; 62:5657-5663)或肿瘤坏死因子相关凋亡-诱导配体(Ehtesham, M, 等人,Cancer Research, 2002; 62:7170-7174)的UTC注射或以其它方式施用到恶性肿瘤(例如，成胶质细胞瘤)的全面位点，然后UTC可以迁移到肿瘤细胞用于治疗性试剂的局部递送。通过分化成一种或多种神经表型或通过对神经祖先和神经细胞提供营养支持，UTC也可以促进肿瘤治疗后的神经学修复，如上所述。
另外，本发明提供了通过施用包含UTC细胞组分(例如，细胞裂解物或其组分)或产物(例如，UTC天然产生或通过遗传修饰产生的营养和其它生物学因子，来自UTC 培养的条件培养基)的药物组合物治疗神经学损伤的方法。再次地，这些方法可进一步包括施用其它活性剂，诸如生长因子、神经营养因子或神经再生或神经保护药物，如本领域已知的。
用于施用UTC或本文描述的任何其它药物组合物的剂型和方案依照医学规范（good medical practice）考虑个别患者的状况开发，例如，神经变性状况的性质和程度、年龄、性别、体重和一般医学状况、和医学专业人员已知的其它因素。因而，待施用给患者的药物组合物的有效量通过本领域已知的这些考虑确定。
由于CNS是有些免疫特权的(immunoprivileged)组织，所以在起始应用UTC的细胞治疗之前可不必需或希望免疫抑制患者。以前已显示，UTC不刺激混合淋巴细胞反应中的同种异体PBMCs。(参见美国专利申请号10/877,269)。因此，用同种异体或甚至异种UTC移植在一些情况下可耐受。
在其它情况下，在起始细胞治疗之前，可希望或适于药学地免疫抑制患者。这可通过使用全身或局部免疫抑制剂完成，或其可通过在被囊化设备中递送细胞完成，如上文所述。用于降低或消除对移植的细胞的免疫应答的这些和其它方式是本领域已知的。作为替代，UTC可被基因修饰以降低它们的免疫原性，如上所述。
移植的UTC在活患者中的存活可以通过使用多种扫描技术测定，例如，计算机控制轴向X线断层摄影术(CAT或CT)扫描、磁共振成像(MRI)或正电子发射横体层摄影术(PET)扫描。移植物存活的测定也可以在死后通过取出神经组织、并视觉或通过显微镜检测它进行。可选地，细胞可以用特异于神经细胞或其产物如神经递质的染料处理。移植的细胞也可以通过在先掺入示踪染料进行鉴定，诸如罗丹明或荧光素标记的小球体、坚牢蓝、高铁微粒、双苯甲酰胺或遗传引入的报道基因产物诸如β-半乳糖苷酶或β-葡糖醛酸糖苷酶。
移植的UTC向受试者神经组织中的功能整合可以通过检查损害或患病的神经功能的恢复进行评估。根据神经生物学家和医师公知的程序，这种功能包括但不限于运动、认知、感觉和内分泌功能。可以将神经功能通过UTC的这种恢复用在神经学损伤后改进患者中神经学功能的方法中。
另外，可将UTC用在刺激患者中SVZ的再生能力的方法中。例如，SVZ的再生能力可通过显示存在神经发生、血管发生或突触发生方面的增加得到刺激。神经发生方面的增加指示SVZ中的祖细胞在制剂中增殖以取代损伤或损害的神经细胞，并且存在新形成的成神经细胞和其它未成熟的神经元。血管发生方面的增加指示在损伤或损害区域发生新血管形成以对损伤或损害组织或对正在形成以取代损伤或损害组织的组织提供氧供应。突触发生方面的增加指示新突触正在形成，这最有可能是响应于引起已存在的功能突触的数目方面的减少的一些刺激物。UTC引起神经发生、血管发生和突触发生方面增加的能力在实施例3-10中列出。
进一步地，UTC可减少脑的损伤或损害部分中凋亡细胞的数目。凋亡可为外伤性脑损伤后继发性脑损伤的原因，并且高凋亡速度可与外伤性脑损伤后较差的预后相关。(参见，Minambres等人,Journal of Neurotrauma, 2008; 25(6):581-591). 因此，经历损伤或损害的脑区域中凋亡的减少可增加存活、改进神经学功能和从损伤中恢复，并且可充当其它治疗的辅助，诸如刺激损伤后患者中SVZ的再生能力。实施例7和9证明UTC减少脑组织的损害部分中凋亡的能力。
另一方面，本发明提供在如上述用于神经再生和修复的各种方法中利用UTC、UTC群、UTC的组分和产物的试剂盒。在用于神经学损伤的治疗或其它预定治疗的情况下，试剂盒可包含一种或多种细胞群，其包含至少UTC和药学上可接受的载体(液体、半固体或固体)。试剂盒也任选地可包含施用细胞的工具，例如通过注射。试剂盒还可包含细胞的使用说明书。制备用于野战医院应用，诸如用于军事应用的试剂盒可包含全部程序供应，包含组织支架、外科手术缝线等，其中将细胞与急性损伤的修复一起使用。用于如本文描述的测定和体外方法的试剂盒可包含下列中的一种或多种：(1) UTC或UTC的组分或产物，(2) 用于实践体外方法的试剂，(3) 适当地，其它细胞或细胞群，和(4) 用于进行体外方法的说明书。
提供下列实施例以更详细地描述本发明。它们意图举例说明而不是限制本发明。
下列缩写可在实施例以及说明书和权利要求书中的其它处出现：
ANG2(或Ang2)表示促血管生成素 2
APC表示抗原呈递细胞
BDNF表示脑衍生神经营养因子
bFGF表示碱性成纤维细胞生长因子
bid (BID)表示“bis in die” (每日2次)
CK18表示细胞角蛋白18
CNS表示中枢神经系统
CXC配体 3表示趋化因子受体配体 3
DMEM表示Dulbecco’s极限必需培养基
DMEM:lg(或DMEM:Lg, DMEM:LG)表示带有低葡萄糖的DMEM
EDTA表示乙二胺四乙酸
EGF ( 或 E)表示表皮生长因子
FACS表示荧光激活细胞分选术
FBS表示胎牛血清
FGF ( 或 F)表示成纤维细胞生长因子
GCP-2表示粒细胞趋化蛋白-2
GFAP表示胶质细胞原纤维酸性蛋白
HB-EGF表示肝素-结合表皮生长因子
HCAEC表示人冠状动脉内皮细胞
HGF表示肝细胞生长因子
hMSC表示人间充质干细胞
HNF-1 α表示肝细胞-特异性转录因子1α；HUVEC表示人脐静脉内皮细胞
I309表示趋化因子和CCR8受体的配体
IGF-1表示胰岛素样生长因子 1
IL-6表示白细胞介素-6；IL-8表示白细胞介素8
K19表示角蛋白19；K8表示角蛋白 8
KGF表示角质形成细胞生长因子
LIF表示白血病抑制因子
MBP表示髓鞘碱性蛋白
MCP-1表示单核细胞趋化蛋白 1
MDC表示巨噬细胞-来源的趋化因子
MIP1 α表示巨噬细胞炎性蛋白 1 α
MIP1β表示巨噬细胞炎性蛋白 1 β
MMP表示基质金属蛋白酶 (MMP)
MSC表示间充质干细胞
NHDF表示正常人皮肤成纤维细胞
NPE表示神经祖先扩增培养基
O4表示少突胶质细胞或神经胶质细胞分化标记O4
PBMC表示外周血单核细胞
PBS表示磷酸缓冲盐水
PDGFbb表示血小板衍生生长因子
PO表示 “经口” (通过口)
PNS表示外周神经系统
Rantes(或RANTES)表示调节活化、正常T细胞表达和分泌
rhGDF-5表示重组人生长和分化因子5
SC表示皮下地
SDF-1 α表示基质衍生因子1 α
SHH表示sonic hedgehog
SOP表示标准操作程序
TARC表示胸腺和活化-调节的趋化因子
TCP表示组织培养塑料
TCPS表示组织培养聚苯乙烯
TGF β 2表示转化生长因子 β2
TGF β -3表示转化生长因子 β-3
TIMP1表示组织基质金属蛋白酶抑制剂1
TPO表示血小板生成素
TuJ1表示BIII 微管蛋白
VEGF表示血管内皮生长因子
vWF表示von Willebrand因子
α FP表示甲胎蛋白。
另外，如下列实施例和说明书中其它处所用的，可根据美国专利申请号10/877,269的公开内容对本发明方法中有用的UTC进行分离和表征，所述申请在其涉及UTC的描述、分离和表征的情况下整体引入作为参考。
实施例 1
细胞的长期神经分化
对脐-来源的细胞经历向神经谱系细胞长期分化的能力进行了评价。如实施例13-15中描述地对UTC进行分离和扩增。
将先前在生长培养基中生长的UTC(脐(022803) P11；(042203)P11；(071003) P12)的冷冻等分试样解冻并以5,000细胞/cm2铺平板在T-75瓶中，所述瓶包被以含有B27 (B27补充物，Invitrogen)、L-谷氨酰胺(4 mM)和青霉素/链霉素(10 毫升)的神经基础-A培养基 (Invitrogen, Carlsbad, Ca.)中的层粘连蛋白(BD, Franklin Lakes, N.J.)，其组合在本文中称为神经祖先扩增(NPE)培养基。将NPE培养基进一步补充以bFGF(20 ng/ml, Peprotech, Rocky Hill, N.J.)和EGF (20 ng/ml, Peprotech, Rocky Hill, N.J.)，其在本文中称为NPE + bFGF + EGF。
另外，将成体人皮肤成纤维细胞(P11, Cambrex, Walkersville, MD)和间充质干细胞(P5, Cambrex)解冻并以相同细胞接种密度在层粘连蛋白-包被的T-75瓶中铺平板在NPE + bFGF + EGF中。作为进一步的对照，将成纤维细胞、脐和胎盘-来源的细胞生长在生长培养基中，对所有培养物进行指定的时间段。
每周1次将来自所有培养物的培养基替换以新鲜培养基，并观察细胞扩增。一般地，每一培养物在1个月时间段内传代1次，这是因为在NPE + bFGF + EGF中的有限生长。
1个月时间段后，于室温将所有瓶用冷4% (w/v)低聚甲醛(Sigma)固定10分钟。应用针对TuJ1 (BIII 微管蛋白；1:500; Sigma, St. Louis, Mo.)和GFAP(胶质细胞原纤维酸性蛋白；1:2000; DakoCytomation, Carpinteria, Ca.)的抗体进行免疫细胞化学。 简言之，将培养物用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤并将其暴露于含PBS、4% (v/v)山羊血清(Chemicon, Temecula, Ca.)和0.3%(v/v)Triton(Triton X-100; Sigma)的蛋白封闭溶液中进行30分钟以接近细胞内抗原。然后将在封闭溶液中稀释的第一抗体应用到培养物中，在室温进行1小时时间段。然后，除去第一抗体溶液，并在应用含有连同山羊抗-小鼠IgG – Texas Red (1:250，Molecular Probes，Eugene，OR) 和山羊抗-兔IgG - Alexa 488 (1:250，Molecular Probes)一起的封闭的第二抗体溶液(在室温1小时)之前，将培养物用PBS洗涤。然后洗涤培养物，并应用10微摩尔DAPI (Molecular Probes)进行10分钟以使细胞核可见。
在免疫染色后，使用适当的荧光滤光片在Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus, Melville, N.Y.)上显现荧光。在所有情况下，阳性染色代表高于对照染色的荧光信号，在对照染色中遵循上文概述的整个程序，除了应用第一抗体溶液外。代表性图像是使用数字彩色摄影机和ImagePro软件(Media Cybernetics, Carlsbad, Ca.)捕获的。对三重染色的样品而言，每一张图像均是使用一次仅一个发射滤光片采集的。然后使用Adobe Photoshop软件(Adobe, San Jose, Ca.)制备分层的蒙太奇。
表1-1. 应用的第一抗体的概述
Figure 59353DEST_PATH_IMAGE001
铺平板后立即地，UTC亚群与包被有层粘连蛋白的培养瓶附着。这可归因于作为冻/融过程函数或由于新生长条件的细胞死亡。确实附着的细胞采取不同于在生长培养基中观察到的那些的形态学。
汇合时，对培养物传代并观察其生长情况。非常少的扩增在传代后存活的那些细胞中发生。在该点，不具有铺展形态学并具有相亮(phase-bright)特征的非常小的细胞开始出现在脐-来源的细胞的培养物中。随时间过去监视瓶的这些区域。从这些小细胞中出现双棘突起，具有沿它们长度的膨体(varicosities)，其特征非常类似于以前描述的PSA-NCAM+神经元祖先和来源于脑和脊髓的TuJ1+未成熟神经元(Mayer-Proschel, M, 等人Neuron, 1997; 19(4):773-85; Yang, H, 等人,PNAS, 2000; 97(24):13366-71)。随着时间，这些细胞变得更多，但仍然仅见于克隆中。这表明NPE + bFGF + EGF培养基减缓PPDCs的增殖并改变它们的形态学。
将培养物在解冻/铺平板后1个月固定并对神经元蛋白TuJ1和GFAP染色，GFAP是见于星形胶质细胞中的中间丝。尽管发现在生长培养基中生长的所有对照培养物以及在NPE + bFGF + EGF培养基中生长的人成纤维细胞和MSCs是TuJ1-/GFAP-，但TuJ1在脐和胎盘 PPDCs中得以检测。在具有和不具有神经元样形态学的细胞中观察到表达。在任一培养物中没有观察到GFAP表达。具有神经元样形态学的表达 TuJ1的细胞的百分比小于或等于整个群体的1%(n = 3个测试的脐-来源的细胞分离物)。尽管没有定量，但不具有神经元形态学的TuJ1+细胞的百分比在脐-来源的细胞培养物中高于胎盘-来源的细胞培养物。因为生长培养基中的年龄匹配的对照不表达TuJ1，所以这些结果看来是特异性的。这些结果指示UTC克隆表达神经元蛋白。
开发用于从UTC产生分化的神经元的方法(基于TuJ1 表达和神经元形态学)。尽管在早于1个月时未在体外检查到对于TuJ1的表达，但清楚的是，至少一小群UTC可以产生神经元，这或是通过默认分化或是通过暴露于补充有L-谷氨酰胺、碱性FGF和EGF的极限培养基1个月后的长期诱导。
实施例 2
脑损伤后细胞的施用对神经学功能的作用。
大鼠中的大脑内出血 (ICH) 模型
通过注射100µl的自体血液在称重300-350 g的雄性Wistar 大鼠中诱导ICH，基本上如Seyfried, 等人,J. Neuronsurg, 2006; 104:313-318 (2006)描述的。简言之，用赛拉嗪(10mg/kg)和氯胺酮(80 mg/kg)麻醉大鼠。一旦获得充分麻醉，就在整个外科手术程序中应用反馈调节的水加热垫将大鼠保持在37℃。在解剖视野内，沿着腹和右大腿形成的皱褶产生2cm腹侧皮肤切口。应用收肌的钝器解剖法显现右股动脉。从邻近的股动脉和隐神经小心地移动5至10毫米的动脉。将动脉在远端结扎，并且将近端部分用4-0缝线临时阻塞。然后将PE50导管通过小穿刺插入血管1-2 cm并用4-0缝线固定在合适位置。然后将大鼠俯卧放置在立体定位架上(David Kopf Instruments, Tujunja, Ca.)。在颅盖上作中线切口，并进行到骨膜。应用小骨膜剥离器暴露颅骨。一旦完成这一步，就应用立体定位架测量指导进行颅骨切除术的位点。首先进行前囟的鉴定，然后用立体定位钻进行颅骨切除术(中线侧面3.5mm，前囟前面0.5 mm，中线表面下深度5.5 mm)。将采自股动脉的0.3 ml自体血液放置在立体定位架上装载的带有26G½针的1cc注射器中。然后用输注泵(600-910/920, Harvard Apparatus, Holliston, MA)将0.1 ml血液以每分钟10µl的速度输注。为了防止血液倒退，应用一片骨腊关闭颅骨切除术位点并将血液保持在脑中。用4.0丝缝线再接近皮肤，简单缝合(simple running)。
在ICH后24小时或72小时，使随机选择的动物经历细胞移植。将动物用N2O:O2(2:1)中的3.5%卤烷麻醉并用面罩维持在0.5%卤烷下。将2 ml总流体体积PBS中的UTC (对于本发明方法中有用的UTCs的分离和表征的描述，参见美国专利申请号10/877,269)或单独的PBS(对照)注射到动物的尾静脉中。实验组(n=8/组)由单独的PBS和UTC (3×106)组成。允许所有大鼠在外科手术后存活28天。在所有动物中，在1天、4天和其后每周测量行为实验组。
mNSS是运动、感觉、平衡和反射测试的复合。以0至18的等级(正常分数0；最大缺陷分数 18)对如通过mNSS (如Chen, J, 等人,Stroke, 2001; 32:1005-1011描述的)评估的神经学功能进行评分。在损伤的严重性评分中，对某些异常行为的表现或对测试的反射的缺乏给予1分。因而，分数越高，损伤越严重。所应用的运动测试是通过尾巴提起大鼠，对于其给予下列分数：前肢屈曲(1)，后肢屈曲(1)，在30秒内头相对于垂直轴移动超过10o(1)；和在地面上行走，对于其给予下列分数：正常行走(0)，不能直行(1)，向轻瘫侧盘旋(2)，向轻瘫侧下落(3)。所应用的感觉测试是放置测试(placing test)(视觉和触觉测试)和本体感受测试(深部感觉，向着桌缘推动爪以刺激肢肌肉)。所应用的平衡测试是平衡木测试，对于其给予下列分数：平衡，具有稳定姿态(0)，抓平衡木侧部(1)，抱平衡木并且一个肢从平衡木下落(2)，抱平衡木并且两个肢从平衡木下落，或在平衡木上旋转(>60 s) (3)，试图在平衡木上平衡但落下(>40 s) (4)，试图在平衡木上平衡但落下(>20 s) (5)，和落下，不试图平衡或握住平衡木(<20 s) (6)。
进行如Zhang, L, 等人,J Neuronsci Methods, 2002; 117(2):207-14描述的墙角测试。简言之，将大鼠放置在两个连接的板(尺寸为30 × 20 × 1 cm3)之间。两个板的边缘是30°角，沿接合处有小的开口以鼓励进入墙角。将大鼠面对墙角放置并距墙角半程。当深入墙角中时，同时刺激两侧的触须。然后将大鼠向前上竖起，并且然后返回以面向开口。未损伤大鼠或是向左或是向右转动，但损伤大鼠优先地向未损害侧转动。对每测试记录10次实验的一个方向相对于另一个方向的转动，并将转动分数用作墙角测试分数。
得自功能测试的结果指示在24小时和72小时用UTC (3×106)治疗的大鼠在mNSS 测试和墙角测试中表现出显著(p<0.05)的改进。(参见图1和2)。在14、21和28天，与对照相比，在24小时和72小时用3×106UTC治疗的大鼠中mNSS总分数显著减少。(参见图1)。
实施例 3
脑损伤后细胞的施用对室下区中细胞增殖的作用
可以在细胞周期的S期期间将胸苷类似物溴脱氧尿苷(BrdU)掺入细胞基因组DNA中。将室下区(SVZ)中的BrdU阳性细胞考虑为在细胞周期的S期中经历DNA合成的祖细胞。将SVZ中BrdU细胞的数目用作神经发生的指示物。
大鼠接受100 mg/Kg BrdU的每日腹膜内注射(IP)，这开始于ICH后24小时并随后再进行14 天。28天后，用氯胺酮(80 mg/kg)和(赛拉嗪 13mg/kg) IP注射再次麻醉动物，并处死动物(首先通过心脏穿刺从体内排出全部血液并用生理盐水以及然后用4%低聚甲醛冲洗系统)。然后用咬骨钳切掉颅骨并且取出脑和随后在4%低聚甲醛中固定，并切片以粗略地和组织学地评估出血区域。对BrdU应用免疫组织化学染色(小鼠单克隆抗体，1:100; Boehringer Mannheim, Indianapolis, In.)。简言之，在第三区组(block)上前囟的+0.1和0.86 mm之间存在的脑组织是损伤最严重的，并且因此第三区组被特定地选择用于免疫染色。将来自前囟的+0.1–0.86 mm的每40th冠状切片用于用相同的抗体的免疫化学染色。将切片在含5%正常山羊血清、1% BSA和0.05% TWEEN-20的Tris-缓冲盐水中封闭。然后将切片与第一抗体温育，然后与合适的第二抗体温育。对照实验由如上述染色脑冠状组织切片组成但省略第一抗体。应用Olympus BX40显微镜和与MCID图像分析系统(Imaging Research, St. Catharines, 加拿大)接合的3-CCD彩色摄影机(Sony DXC-970MD)计数同侧室下区(SVZ)中的BrdU-阳性细胞数目。对同侧SVZ中BrdU-阳性细胞的总数目进行报告。
结果显示，与对照PBS组相比，在ICH后24小时或72小时时用3×106UTC治疗的大鼠的同侧半球的SVZ中BrdU阳性细胞的数目显著增加(p<0.05) (参见图3E和3F)。
实施例 4
脑损伤后细胞的施用对脑损害区域中血管发生的作用
损害周围的界面中的扩大和薄壁血管指示血管发生(Li, Y, 等人,Neurology, 2002; 59:514-523)。28天后，将动物再次麻醉、处死并且取出它们的脑，如实施例3中对于组织学评估所详述的。应用针对vWF的单克隆抗体(1:400, Dako, Carpinteria, Ca.)。
结果显示，与对照PBS组相比，在ICH后24小时或72小时时应用3×106UTC的治疗组中，血管周长显著增加(p<0.05) (参见图4E和4F)。
另外，如上面的实施例3中指出的，在细胞周期的S期期间可以将BrdU掺入细胞基因组DNA。通过评估与BrdU掺入结合的Von Willebrand因子的表达，可以确定活跃分裂细胞是否有助于ICH界面处新血管的生长(参见上面的方案)。
对BrdU呈阳性的内皮细胞在图5A中显示。对Von Willebrand因子(vWF)呈阳性的血管在图5B中显示。图5C示出与血管中vWF阳性染色组织共定位的BrdU反应性细胞的双重免疫染色。双重染色揭示表达血管标记同时仍然分裂的细胞亚群，从而提示血管表型呈阳性的细胞是在恢复期期间形成的。
实施例 5
脑损伤后细胞的施用对室下区中神经发生的作用
双皮层蛋白(DCX)是神经发生的标记，其在新形成的成神经细胞中瞬时表达(在约2-3周期间)。28天后，将动物再次麻醉、处死并且取出它们的脑，如实施例3中对于组织学评估所详述的。应用山羊抗-DCX (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Ca.)。
结果显示，与对照PBS组相比，在ICH后24小时或72小时时应用3×106UTC的治疗组中，SVZ中的DCX免疫表达显著增加(p<0.05) (参见图6E和6F)。
另外，BIII微管蛋白(TUJ1)是在胎儿和出生后发育期间以及在SVZ的推定神经元细胞中表达的神经元特异性微管蛋白。对TUJ1表达进行评估以检测任何新形成的未成熟神经元。应用小鼠抗-TUJ1(1:1000, Novus Biologicals Inc. Littleton, CO)。
结果显示，与对照PBS组相比，在ICH后24小时或72小时时应用3×106UTC的治疗组中，SVZ中的TUJ1免疫表达显著增加(p<0.05) (参见图7E和7F)。
实施例 6
脑损伤后细胞的施用对血肿界面区中突触发生的作用
将突触前小泡蛋白突触小泡蛋白用作突触发生的指示物(Ujike, H, 等人,Ann N Y Acad Sci., 2002; 965:55-67)。28天后，将动物再次麻醉、处死并且取出它们的脑，如实施例3中对于组织学评估所详述的。应用突触小泡蛋白(1:40 mAb, Clone SY 38, Millipore, Billerica, MA)。
结果显示，与对照PBS组相比，在ICH后24小时或72小时应用3×106UTC，沿血肿界面区突触小泡蛋白表达显著增加(p<0.05) (参见图8E和8F)。
实施例 7
脑损伤后细胞的施用对脑损害区域中凋亡的作用
28天后，将动物再次麻醉、处死并且取出它们的脑，如实施例3中对于组织学评估所详述的。根据制造商的说明书，应用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-介导的dUTP-生物素切口末端标记(TUNEL)方法(ApopTag Kit; Oncor, Gaithersburg, MD)评估原位凋亡检测。TUNEL方法基于TdT与DNA的3’-OH末端的特异性结合，和随后发生的多脱氧核苷酸聚合物细胞的合成。简言之，在对脑切片脱蜡并应用蛋白酶K消化蛋白并然后用PBS中的2% H2O2猝灭内源性过氧化物酶活性后，将载玻片置于平衡缓冲液中，并然后置于工作强度的TdT酶中，随后置于工作强度的终止/洗涤缓冲液中。在将两滴抗抗洋地黄毒苷-过氧化物酶应用到载玻片之后，用DAB检测过氧化物酶。在制备工作强度的TdT中用蒸馏水实施TdT 酶的阴性对照。TUNEL方法的标记靶是通过DNA断裂产生的新3’-OH DNA末端，其一般位于形态学上可鉴定的细胞核和具有深棕色、圆形或卵圆形体的凋亡小体中。
TUNEL染色显示具有典型的深棕色、圆形或卵圆形凋亡小体的凋亡细胞。分散的凋亡细胞在整个损害组织中存在，其中大多数位于血肿界面区。结果显示，与对照PBS组相比，在ICH后24小时或72小时应用3×106UTC，同侧半球中凋亡细胞数目显著降低(p<0.05) (参见图9E和9F)。
实施例 8
脑损伤后细胞的施用对脑损害区域中组织丢失的作用
28天后，将动物再次麻醉、处死并且取出它们的脑，如实施例3中对于组织学评估所详述的。将大脑组织切成7个相等间隔的(2 mm)冠状块，然后处理用于石蜡切片。以冠状平面从每个块切下一系列邻近的6-µm厚切片，并用苏木精和伊红染色。通过Global Laboratory Image分析系统(Data Translation, Mariborn, Ma.)追踪切片。将在出血侧上保持的纹状体面积从对侧的该面积中减去，因而确定可归因于ICH的组织丢失的程度，并比较治疗与未治疗动物。结果显示，与对照PBS组相比，在ICH后24小时或72小时应用3×106UTC，没有显著的组织丢失方面的差异(参见图10A和10B)。
实施例 9
在脑损伤后不同时间点的细胞施用的作用
实施例 2-8 描述在外科手术后24小时和72小时UTC施用的作用。在本研究中，治疗窗通过在7天延迟的施用得以扩展，这较好地模拟临床情况(即，如果细胞可在7天施用，那么更多患者将能够得到治疗)。
在成体Wistar大鼠中诱导ICH，如在实施例2中描述的(参见Seyfried, D, 等人,J Neurosurg,2006; 104:313-318)，其中将一组大鼠(n=40)分成4组，每组10只动物。在ICH后72 小时或1周，随机选择的动物经历细胞移植。将动物用N2O:O2(2:1)中的3.5%氟烷麻醉并用面罩维持在0.5% 氟烷下。将2 ml总流体体积PBS中的UTC 或单独的PBS(对照)注射到尾静脉中。实验组(n=10/组)由单独的PBS和UTC(3百万)组成。允许所有大鼠在细胞移植后存活28天。
在所有动物中，在其后1天、4 天、1周、2周、3周、4周、31 天和35 天测量行为实验组。
如实施例2中所述，nMSS (参见Chen, J, 等人,Stroke, 2001; 32:1005-1011)和墙角测试(参见Zhang, L, 等人,J Neurosci Methods, 2002; 117:207-214)指示神经学功能。
将圆筒测试(参见Zhang, L, 等人,J Neurosci Methods, 2002; 117:207-214，和Hua, Y, 等人,Stroke, 2002; 33:2478-2484)适用于大鼠中以评估前肢应用和在透明圆筒(20 cm直径和30 cm高)中的旋转不对称性，取决于实验期间的活性程度进行3至10分钟。以能够记录前肢运动的角度将镜子置于圆筒侧部，甚至当动物离开照相机时。由对动物状况不知情的实验者应用带有慢动作和清楚的停帧能力的磁带录像机进行评分。根据下列标准对行为进行评分：(1) 左或右前肢的独立应用，用于在完全竖起期间接触壁，以起始重量-转移(weight-shifting)运动或以直立姿态侧向运动时恢复重心，和(2) 左和右前肢的同时应用，用于在完全竖起期间接触圆筒壁，以及用于改变沿壁的侧向步进运动。
对于粘合剂-去除躯体感觉测试(参见，Chen, J, 等人,Stroke, 2001; 32:2682-2688)，将小片的背面带有粘合剂的纸点(尺寸相同，56.55 mm2)用作占据每一前肢腕上桡骨远侧区域的双侧触觉刺激物。然后使大鼠返回其笼子。记录每天在5个实验中从前肢去除每一刺激物的时间。在外科手术前训练动物3天。一旦大鼠能够在10秒内去除点，就使它们经受ICH。
结果
1. 神经学功能
得自功能测试的结果指示在第7天或第3天用3×106UTC治疗的大鼠在mNSS测试、墙角测试和圆筒测试中表现显著的(p<0.05)神经学功能改进。
mNSS: 与对照相比，在第7天接受治疗的大鼠中，在第21、28和35天，mNSS总分数显著减少；并且在第3天用3×106UTC治疗的大鼠中，在第14、21、28和31天总分数显著减少。(参见，图11A和11B)。
墙角测试：与对照相比，在第7天或第3天用3×106UTC治疗的大鼠中，墙角测试分数在第21和28天显著减少；并且分数在第31和35天减少但不显著(参见，图12A和12B)。
圆筒测试：与对照相比，在第7天或第3天用3×106UTC治疗的大鼠中，圆筒分数在第21、28、31和35天显著减少。(参见，图13A和13B)。
粘合剂测试：与对照相比，在第7天或第3天用3×106UTC治疗的大鼠中，粘合剂测试分数在任何时间都不显著减少。(参见，图14A和14B)。
2. 组织学
与对照PBS组相比，在ICH后第3天或第7天用3×106UTC治疗的大鼠同侧半球的SVZ中BrdU 阳性细胞数目显著增加(p<0.05)。 (参见图15A – 15F)。
损害周围的界面中的扩大和薄壁血管指示血管发生(参见Li, Y, 等人,Neurology, 2002; 59:514-523)。数据显示，与对照PBS组相比，在ICH后第7天或第3天应用3×106UTC的治疗组中，血管周长显著增加(p<0.05)。 (参见图16A – 16F)。
BrdU-阳性内皮细胞和vWF-阳性血管显示在图17A – 17D中ICH界面处。图17E和17F显示与血管中vWF阳性染色组织共定位的BrdU反应性细胞的双重免疫染色。双重染色揭示表达血管标记同时仍然分裂的细胞亚群，从而提示血管表型呈阳性的细胞是在恢复期期间形成的。(参见图17E – 17F)。
进行TUJ1标记以检测任何新形成的未成熟神经元。在此研究中，与对照PBS组相比，在ICH后第7天或第3天应用3×106UTC细胞的治疗组中，SVZ中TUJ1的免疫表达显著增加(p<0.05)。(参见图18A – 18 F)。
将突触前小泡蛋白突触小泡蛋白用作突触发生的指示物(参见， Ujike, H, 等人,Ann N Y Acad Sci., 2002; 965:55-67)。数据证明，与对照PBS组相比，在UTC细胞治疗组中沿血肿界面区突触小泡蛋白表达显著增加(p<0.05) (参见图19A – 19F)。
TUNEL染色显示脑中的凋亡细胞，其具有典型的深棕色、圆形或卵圆形凋亡小体。分散的凋亡细胞在整个损害组织中存在，其大多数位于血肿界面区。与对照PBS组相比，在ICH后第3天的UTC治疗组中，同侧半球中凋亡细胞显著减少(p<0.05)。在第7天组中，没有检测到总凋亡细胞数目的显著差异。(参见图20A – 20F)。
为了确定组织丢失，将大脑组织切成7个相等间隔的(2 mm)冠状块，然后处理用于石蜡切片。以冠状平面从每个块切下一系列邻近的6-µm厚切片，并用苏木精和伊红染色。通过Global Laboratory Image分析系统(Data Translation, Marlboro, MA)追踪切片。将在出血侧上保持的纹状体面积从对侧的该面积中减去，因而计算ICH引起的组织丢失的程度，并比较治疗与未治疗动物。结果显示，与对照PBS组相比，在ICH后3天或7天应用3×106UTC没有显著的组织丢失差异。(参见图21A和21B)。
对于供体细胞鉴定，将大鼠脑中移植的人细胞用三种不同抗体染色：NuMa (Ab-2)小鼠mAb (107-7) (抗核基质，目录号NA09L, Calbiochem)；纯化的小鼠抗人β2微球蛋白(目录号555550, BD Biosciences)和小鼠抗人线粒体(目录号E5204, Spring Bioscience Corp)。将免疫染色与两个阴性对照(即，省略第一抗体和应用预免疫血清)和用于免疫测定程序的质量控制的一个阳性对照同时实施。阳性对照是被移植到小鼠脑中的人细胞。结果显示，阳性对照运转得非常好，但在我们的实验载玻片和阴性对照载玻片中没有见到阳性染色细胞。我们怀疑在组织处理或注射的细胞批次中存在造成不与抗体反应的因素。
结果显示，与对照PBS组相比，在治疗组中，ICH后第7天或第3天施用的移植的UTC 可以显著改进mNSS 测试、墙角转动测试和圆筒测试得到的功能结果 (P < 0.05)。治疗作用在ICH后第14天变得在统计学上是显著的，并且持续至少直至外科手术后第28天。另外，与对照PBS组相比，在ICH后第7天或第3天给予3×106UTC的治疗组中，大鼠同侧半球SVZ中存在显著更多的BrdU阳性细胞和具有TUJ1表达的细胞(p<0.05)。与对照组相比，在ICH后第3天应用注射的细胞的治疗组中，微血管和突触小泡蛋白表达在损害区域的界面区显著增加；并且发现显著较低数目的凋亡细胞。UTC静脉内输注的有益作用在ICH后第7天和第3天施用之间没有显著差异。
实施例 10
脑损伤后细胞的施用对增强组织修复的作用
测试UTC和MSCs以治疗患有外伤性脑损伤的大鼠，以寻求增强组织修复的新方式。施用UTC或MSCs以治疗TBI后的年轻成体雄性大鼠。
将体重300-330 g的24只雄性Wistar大鼠用于此实验中(Charles River Breeding Company)。适当的检疫时间段后，将每一大鼠用水合氯醛(400 mg/kg)麻醉。在手术前将盐酸叔丁啡（Buprenex）0.05 mg/kg给予所有动物。使大鼠经受可控的皮层冲击(controlled cortical impact，CCI)。用加热垫和K模件将体温维持在37℃。
将24只大鼠分在3组中(每组8只)。在TBI后24h，两个治疗组接受通过尾静脉施用的UTC或MSCs(4×106，在2 ml PBS中)。对于此，将大鼠用腹膜内(i.p)施用的水合氯醛400 mg/kg麻醉。对照动物只接受2 ml静脉内(i.v.)PBS。
在TBI后的不同时间点，在改良的神经学严重性分数(mNSS)测试和Morris水迷宫测试中对所有大鼠进行测试。对于标记增殖细胞，每日注射(腹膜内)溴脱氧尿苷(BrdU, 200 mg/kg; Sigma Chemical)到大鼠中，进行14天，起始于TBI后第1天。在TBI后第35天，通过腹膜内注射氯胺酮(160 mg/kg)和赛拉嗪(20 mg/kg)对所有大鼠进行麻醉。处理脑组织用于组织学分析(染色)。
在TBI之前1天，然后在TBI之后第1、4、7、14、28和35天实施mNSS。在TBI之后第31-35天实施Morris水迷宫测试。通过HVS Image 2020 Plus Tracking System (US HVS Image, San Diego, Ca.)对数据收集进行自动化。
用标准H&E以及免疫组织化学对所有脑样品染色。实施H&E染色以计算损害体积。应用抗人线粒体抗体(E 5204)进行免疫组织化学用于鉴定UTC或MSCs。
为了鉴定新增殖的细胞，进行BrdU免疫组织化学。进行MAP-2和vWF的双重染色以鉴定新增殖的细胞的表型。
结果
在两个治疗组(UTC或MSCs 治疗大鼠)和对照组之间，在mNSS方面有显著差异，其在第7天首先可见，并持续直至实验结束。(参见，图22)。在两个治疗组之间没有差异。
应用Morris水迷宫测试，与对照相比，在UTC或MSCs 治疗组中，在第35天见到改进。(参见，图23)
对于损害体积计算，在UTC或MSC治疗大鼠和对照组动物之间，在损害体积方面没有显著差异(参见，图24) (*P=0.07,#P=0.2)
为了鉴定UTC或MSCs，应用E5204抗体实施免疫组织化学以鉴定供体UTC或MSCs。35天后，我们在UTC和MSCs治疗组的少数脑切片中发现E5204阳性染色的细胞。细胞主要在损害界面区见到。对照组中没有发现阳性染色的细胞(参见，图25A和25B)
BrdU阳性细胞见于UTC(参见，图26A)和MSC(参见，图26B)，主要在损害界面区(参见，图27)，从而指示新-细胞增殖。非常少的细胞可见于齿状回中。(参见，图28)。然而，在治疗和对照组动物之间没有差异。(参见，图27和28)
实施vWF /DAB 染色以鉴定UTC(参见，图29A)和MSC(参见，图29B)中的血管发生。在界面区或齿状回中，在治疗比对照组动物中没有阳性染色的血管数目的统计学差异。(参见，图30和图31)
对于新产生的细胞的表型的鉴定，将切片用Map-2(神经元标记)和vWF(内皮标记)染色。在一些治疗组动物中发现BrdU和Map-2之间的重叠。BrdU和Map-2免疫组织化学之间的阳性重叠指示新增殖细胞可以分化成神经元(参见，图32)。在对照动物中不可见阳性双重染色。也将细胞用BrdU和vWF双重染色。在它们之间不可见重叠。
实施例 11
用于神经祖先支持的营养因子
检查UTC通过非接触依赖(营养)机制对成体神经干细胞和祖细胞存活和分化的影响。
通过CO2窒息随后进行颈脱位法处死Fisher 344成体大鼠。应用咬骨钳将全脑完整取出，并基于脑运动和躯体感觉区后的冠状切口切割海马组织(Paxinos, G, & Watson, C, 1997, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates)。将组织在神经基础-A培养基(Invitrogen, Carlsbad, Ca.)中洗涤，所述培养基含有B27 (B27补充物; Invitrogen)、L-谷氨酰胺 (4mM; Invitrogen)和青霉素/链霉素 (Invitrogen)，其组合在本文中称为神经祖先扩增(NPE)培养基。将NPE培养基进一步补充以bFGF(20 ng/ml, Peprotech, Rocky Hill, N.J.)和EGF(20 ng/ml, Peprotech, Rocky Hill, N.J.)，其在本文中称为NPE + bFGF + EGF。
洗涤之后，去除上覆的脑膜，并用手术刀切碎组织。收集切碎的组织并以总体积的75%加入胰蛋白酶/EDTA (Invitrogen)。也加入DNA酶 (每8 ml总体积100 µl，Sigma, St. Louis, Mo.)。然后，将组织/培养基顺序通过18号针、20号针、且最后是25号针，每个针1次(所有针来自Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)。在250 × g下将混合物离心3分钟。去除上清液，加入新鲜的NPE + bFGF + EGF并重悬浮沉淀。将得到的细胞悬浮液通过40 µm细胞滤过器 (Becton Dickinson)，铺平板在层粘连蛋白-包被的T-75瓶(Becton Dickinson)或低聚簇24-孔板(Becton Dickinson)上并生长在NPE + bFGF + EGF培养基中，直至得到足够的细胞数目用于概述的研究。
将之前在生长培养基中生长的脐带组织-来源的细胞(脐 (022803) P12, (042103) P12, (071003) P12)以5,000细胞/Transwell小室(insert) (针对24孔板设定尺寸)铺平板并在小室的生长培养基中生长1周时间段以达到汇合。
以大约2,000细胞/孔的密度在层粘连蛋白-包被的24孔板上将作为神经球或作为单细胞生长的神经祖先接种在NPE + bFGF + EGF中，进行1天时间段以促进细胞附着。1天之后，根据下列方案加入包含UTC的transwell小室：
(1) Transwell (生长培养基中的脐-来源的细胞，200 µl) + 神经祖先(NPE + bFGF + EGF, 1 ml)。
(2) Transwell (生长培养基中的成体人皮肤成纤维细胞[1F1853; Cambrex, Walkersville, MD] P12，200 µl) + 神经祖先(NPE + bFGF + EGF, 1 ml)。
(3) 对照：单独的神经祖先(NPE + bFGF + EGF, 1 ml)。
(4) 对照：单独的神经祖先(仅NPE，1 ml)。
在共培养中7天之后，于室温将所有条件用冷4% (w/v)低聚甲醛(Sigma)固定10分钟时间段。应用针对表11-1中列出的表位的抗体实施免疫细胞化学。简言之，将培养物用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤并暴露于含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemicon, Temecula, Ca.)和0.3%(v/v)Triton(Triton X-100; Sigma)的蛋白封闭溶液进行30分钟，以接近细胞内抗原。然后于室温将在封闭溶液中稀释的第一抗体应用到培养物中，进行1小时时间段。然后，将第一抗体溶液去除，并在应用含有连同山羊抗-小鼠IgG – Texas Red (1:250，Molecular Probes，Eugene，OR)和山羊抗-兔IgG - Alexa 488 (1:250，Molecular Probes)一起的封闭溶液的第二抗体溶液(在室温1小时)之前，将培养物用PBS洗涤。然后洗涤培养物，并应用10 µm DAPI (Molecular Probes)进行10分钟以使细胞核可见。
在免疫染色后，使用适当的荧光滤光片在Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus, Melville, N.Y.)上显现荧光。在所有的情况中，阳性染色代表高于对照染色的荧光信号，在对照染色中遵循上面概述的整个程序，除了应用第一抗体溶液外。代表性图像是使用数字彩色摄影机和ImagePro软件(Media Cybernetics, Carlsbad, Ca.)捕获的。对三重染色的样品而言，每一张图像均是使用一次仅一个发射滤光片采集的。然后使用Adobe Photoshop软件(Adobe, San Jose, Ca.)制备分层的蒙太奇。
表11-1. 应用的第一抗体
Figure 976493DEST_PATH_IMAGE002
检查海马神经祖先分化的定量。每一条件计数最少1000个细胞，或在细胞较少的情况下在该条件中观察的细胞总数目。通过用阳性细胞数目除以通过DAPI(核)染色确定的细胞总数目，评估对于给定染色阳性的细胞百分比。
为了鉴定作为共培养结果的独特的分泌因子，将在培养固定前采取的条件培养基样品在-80℃冷冻过夜。然后将样品应用于超滤旋转设备(MW截止30 kD)。将保留物(retentate)应用到免疫亲和层析柱(抗-Hu-清蛋白；IgY) (免疫亲和不从样品去除清蛋白)。通过MALDI分析滤液。将通过物(pass through)应用到Cibachron Blue亲和层析柱。通过SDS-PAGE和2D 凝胶电泳分析样品。
与脐-来源的细胞培养之后，来源于成体大鼠海马的共培养神经祖细胞表现沿中枢神经系统中所有三个主要谱系的显著的分化。在共培养中5天之后明显观察到该作用，众多细胞产生复杂的突起并丢失分裂祖细胞特有的它们的相亮特征。相反地，在缺乏bFGF和EGF下单独生长的神经祖先似乎不健康并且存活受限。
程序完成后，针对指示未分化干细胞和祖细胞(巢蛋白)、不成熟和成熟神经元(TuJ1)、星形胶质细胞 (GFAP)和成熟少突胶质细胞(MBP)的标记对培养物染色。对沿所有三个谱系的分化进行确认，而对照条件不展示显著的分化，如通过大多数细胞中巢蛋白-阳性染色的保留所证实的。
对与脐-来源的细胞共培养之后分化的神经祖先的百分比进行定量。脐-来源的细胞显著增强成熟少突胶质细胞(MBP)的数目(24.0%比0%，在两个在对照条件下)。另外，共培养增强培养物中GFAP+星形胶质细胞和TuJ1+神经元的数目(分别是47.2%和8.7%)。这些结果得到巢蛋白染色的证实，其指示祖先状态在共培养后丢失(13.4%比71.4%，在对照条件4中)。
尽管分化看来也受到成体人成纤维细胞的影响，但这种细胞不能促进成熟少突胶质细胞的分化，它们也不能产生可观量的神经元。尽管不进行定量，但成纤维细胞确实看来增强神经祖先的存活。
表11-2. 在对照比与脐-来源的细胞的transwell共培养中，祖先分化的定量(E=EGF, F=bFGF)
Figure 818548DEST_PATH_IMAGE003
对来自脐-来源的共培养物的条件培养基、连同合适的对照(NPE培养基 ± 1.7 %血清，来自与成纤维细胞的共培养的培养基)检查差异。对潜在独特的化合物进行鉴定并从它们各自的2D凝胶切出。
成体神经祖细胞与脐-来源的细胞的共培养导致那些细胞的分化。本实施例中呈现的结果表明，与脐-来源的细胞共培养后的成体神经祖细胞的分化是特别完全的。具体而言，显著百分比的成熟的少突胶质细胞在脐-来源的细胞的共培养物中产生。鉴于脐-来源的细胞和神经祖先之间接触的缺乏，该结果看来为从脐-来源的细胞释放的可溶性因子的功能(营养作用)。
进行了几个其它观察。首先，在其中EGF和bFGF被去除的对照条件下有非常少的细胞。大多数细胞死亡，并且每孔平均有约100个细胞或更少。其次，也预期在其中EGF和bFGF在整个培养基中保留的对照条件下有非常少的分化，这是因为这正常是扩增培养基。尽管观察到细胞中的大约70%保留它们的祖先状态(巢蛋白+)，但约30%是GFAP+ (指示星形胶质细胞)。这可归因于下列事实：这种显著的扩增是在祖先之间的接触诱导该分化的整个程序过程期间发生的(Song, H, 等人,Nature, 2002; 417:29-32)。
实施例 12
细胞的短期神经分化
检查脐-来源的细胞分化成神经谱系细胞的能力。如实施例12中所述地分离和扩增脐带组织。
将最初实施以测试骨髓基质细胞的神经诱导潜能的改良的Woodbury-Black规程用于评估UTC分化成神经谱系细胞的能力(Woodbury, D, 等人J Neurisci. Research, 2000; 61(4):364-70)。简言之，将UTC (022803) P4解冻并将培养物以5,000细胞/cm2在生长培养基中扩增，直至达到亚汇合(75%)。然后将细胞胰蛋白酶消化并以6,000细胞每孔Titretek II载玻片(VWR International, Bristol, CT)接种。作为对照，将间充质干细胞(P3; 1F2155; Cambrex, Walkersville, MD)、成骨细胞(P5; CC2538; Cambrex)、脂肪-来源的细胞(Artecel, US 6,555,374B1) (P6; Donor 2)和新生人皮肤成纤维细胞(P6; CC2509; Cambrex)也在相同条件下接种。
将所有细胞在含有15% (v/v) 胎牛血清 (FBS; Hyclone, Logan, UT)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF; 20 ng/ml; Peprotech, Rocky Hill, N.J.)、表皮生长因子 (EGF; 20 ng/ml; Peprotech)和青霉素/链霉素 (Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen, Carlsbad, Ca.)中最初扩增4天。4天后，将细胞在磷酸缓冲盐水(PBS; Invitrogen)中漂洗，并随后在DMEM/F12培养基 + 20% (v/v) FBS + 青霉素/链霉素中培养24小时。24小时后，将细胞用PBS漂洗。然后将细胞在诱导培养基中培养1 – 6 小时，所述培养基包含DMEM/F12 (无血清)，其含有200 mM丁化羟基苯甲醚、10 µM氯化钾、5 mg/ml胰岛素、10 µM毛喉素、4 µM丙戊酸和2 µM氢化可的松(所有化学试剂都来自Sigma, St. Louis, Mo.)。然后将细胞在100%冰冷甲醇中固定并进行免疫细胞化学(参见下文的方法)以评估人巢蛋白蛋白表达。
将UTC (022803 P11)和成体人皮肤成纤维细胞 (1F1853, P11)解冻并将培养物以5,000细胞/cm2在生长培养基中扩增，直至达到亚汇合(75%)。然后将细胞胰蛋白酶消化并以与上文公开类似的密度接种，但是接种在(1) 24孔组织培养物-处理的板(TCP, Falcon brand, VWR International)，(2) TCP孔 + 2% (w/v) 在室温吸附1小时的明胶，或(3) TCP孔 + 20 µg/毫升吸附的小鼠层粘连蛋白(在37℃吸附最少2小时; Invitrogen)上。
如上文论述的，将细胞初始扩增并将培养基以前述时间范围切换。在5天和6小时，将一组培养物如前固定，这次应用冰冷的4% (w/v)低聚甲醛(Sigma)，在室温进行10分钟。在第二组培养物中，将培养基去除并切换为由包含B27 (B27补充物; Invitrogen)、L-谷氨酰胺 (4 mM)和青霉素/链霉素 (Invitrogen)的神经基础-A培养基(Invitrogen)组成的神经祖先扩增培养基(NPE)。将NPE培养基进一步补充以视黄酸(RA; 1 µM; Sigma)。4天后去除该培养基，并在室温用冰冷的4% (w/v)低聚甲醛(Sigma)固定培养物10分钟，并针对巢蛋白、GFAP和TuJ1蛋白表达染色(参见表12-1)。
表12-1. 应用的第一抗体的概述
将脐-来源的细胞(042203; P11)成体人皮肤成纤维细胞(P11; 1F1853; Cambrex)解冻并将培养物以5,000细胞/cm2在生长培养基中扩增，直至达到亚汇合(75%)。然后将细胞胰蛋白酶消化并以2,000细胞/cm2接种，但在补充有bFGF (20 ng/ml; Peprotech, Rocky Hill, N.J.)和EGF (20 ng/ml; Peprotech)的NPE培养基[整个培养基组合物进一步称为NPE + F + E ]存在下接种在包被有层粘连蛋白 (BD Biosciences, Franklin Lakes, N.J.)的24孔板上。同时，将从海马分离的成体大鼠神经祖先(P4; (062603)也铺平板在24孔层粘连蛋白-包被的板上的NPE + F + E培养基中。将所有培养物维持在这种条件下进行6天时间段(在该时间期间饲养细胞1次)，在此时，将培养基切换为列出的分化条件，进行额外7天时间段。在室温用冰冷的4% (w/v)低聚甲醛(Sigma)固定培养物10分钟，并针对人或大鼠巢蛋白、GFAP和TuJ1蛋白表达染色。
表12-2. 用于两阶段分化规程的条件的概述
Figure 90446DEST_PATH_IMAGE005
将脐-来源的细胞(P11; (042203))解冻并将培养物以5,000细胞/cm2在生长培养基中扩增，直至达到亚汇合(75%)。然后将细胞胰蛋白酶消化并在NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml)存在下以2,000细胞/cm2接种在24孔层粘连蛋白-包被的板(BD Biosciences)上。另外，一些孔含有NPE + F + E + 2% FBS或10% FBS。4天的“前分化”条件之后，将所有培养基去除并将样品切换到补充有Shh(SHH; 200 ng/ml; Sigma, St. Louis, Mo.)、FGF8 (100 ng/ml; Peprotech)、BDNF (40 ng/ml; Sigma)、GDNF (20 ng/ml; Sigma)和视黄酸(1µM; Sigma)的NPE培养基。培养基改变后7天，在室温将培养物用冰冷的4% (w/v)低聚甲醛(Sigma)固定10分钟，并针对人巢蛋白、GFAP、TuJ1、结蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达染色。
在层粘连蛋白-包被的24孔皿(BD Biosciences)上将作为神经球或作为单细胞(10,000细胞/孔)的成体大鼠海马祖先(062603)铺平板在NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml)中。
单独地，将脐-来源的细胞(042203) P11解冻并将培养物以5,000细胞/cm2在NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml)中扩增48小时的时间段。然后将细胞胰蛋白酶消化并以2,500细胞/孔接种在现有的神经祖先培养物上。那时，将现有的培养基交换为新鲜培养基。4天后，在室温将培养物用冰冷的4% (w/v)低聚甲醛(Sigma)固定10分钟，并针对人核内蛋白(hNuc; Chemicon)染色 (上文的表11-1)以鉴定UTC。
应用表11-1中列出的抗体实施免疫细胞化学。将培养物用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤并将其暴露于含PBS、4% (v/v)山羊血清(Chemicon, Temecula, Ca.)和0.3%(v/v)Triton(Triton X-100; Sigma)的蛋白封闭溶液中进行30分钟以接近细胞内抗原。然后将在封闭溶液中稀释的第一抗体应用到培养物中，在室温进行1小时时间段。然后，除去第一抗体溶液，并在应用含有连同山羊抗-小鼠IgG – Texas Red (1:250，Molecular Probes，Eugene，Or.) 和山羊抗-兔IgG - Alexa 488 (1:250，Molecular Probes)一起的封闭溶液的第二抗体溶液(在室温1小时)之前，将培养物用PBS洗涤。然后洗涤培养物，并应用10微摩尔DAPI (Molecular Probes)进行10分钟以使细胞核可见。
在免疫染色后，使用适当的荧光滤光片在Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus, Melville, N.Y.)上显现荧光。在所有的情况中，阳性染色代表高于对照染色的荧光信号，在对照染色中遵循上面概述的整个程序，除了应用第一抗体溶液外。代表性图像是使用数字彩色摄影机和ImagePro软件(Media Cybernetics, Carlsbad, Ca.)捕获的。对三重染色的样品而言，每一张图像均是使用一次仅一个发射滤光片采集的。然后使用Adobe Photoshop软件(Adobe, San Jose, Ca.)制备分层的蒙太奇。
在应用载玻片在上文列出的第一神经诱导组合物中温育时，所有细胞类型转化成具有双极形态学和延长突起的细胞。也观察到其它较大的非双极形态学。另外，诱导的细胞群对多能神经干细胞和祖细胞的标记巢蛋白阳性染色。
当在组织培养塑料(TCP)皿上重复时，如在上文列出的第二神经诱导组合物中所描述，如果层粘连蛋白不预吸附在培养物表面，则观察不到巢蛋白表达。为了进一步评估巢蛋白-表达细胞是否将然后继续产生成熟神经元，将UTC和成纤维细胞暴露于NPE + RA (1µM)——已知诱导神经干细胞和祖细胞分化成这种细胞的培养基组合物(Jang, YK, 等人,J. Neurosci. Research, 2004; 75(4):573-84; Jones-Villeneuve, EM, 等人,Mol Cel Biol., 1983; 3(12):2271-9; Mayer-Proschel, M, 等人,Neuron, 1997; 19(4):773-85)。将细胞针对未成熟和成熟神经元的标记TuJ1、星形胶质细胞的标记GFAP、和巢蛋白染色。在所有条件下都未检测到TuJ1，也没有观察到具有神经元形态学的细胞，从而提示神经元不在短期内产生。另外，巢蛋白和GFAP不再由UTC表达，如通过免疫细胞化学确定的。
将UTC 分离物(以及分别作为阴性和阳性对照细胞类型的人成纤维细胞和啮齿类动物神经祖先)铺平板在层粘连蛋白(神经促进)-包被的皿上并将其暴露于已知促进神经祖先分化成神经元和星形胶质细胞的13种不同的生长条件(和两种对照条件)。另外，将两种条件加入以检查GDF5和BMP7对PPDC分化的影响，一般地， 采取两步分化方法，其中首先将细胞放置在神经祖先扩增条件下进行6天时间段，随后将其放置在完全分化条件下进行7天。在形态学上，脐-和胎盘-来源的细胞在该程序的整个时程中都展示细胞形态学方面的重要改变。然而，没有观察到神经元或星形胶质细胞形状的细胞，除了在对照神经祖先-铺平板条件下。对人巢蛋白、TuJ1和GFAP呈阴性的免疫细胞化学证实了形态学观察。
对多种神经分化剂暴露1周之后，将细胞针对指示神经祖先(人巢蛋白)、神经元(TuJ1)和星形胶质细胞(GFAP)的标记染色。在第一阶段在不含无血清培养基中生长的细胞具有与在含血清(2%或10%)培养基中的那些细胞不同的形态学，从而指示潜在的神经分化。具体地，在将脐-来源的细胞暴露于EGF和bFGF，然后暴露于SHH、FGF8、GDNF、BDNF和视黄酸的两步程序之后，细胞显示类似于培养的星形胶质细胞的形态学的长的延长突起。当在分化第一阶段包括2% FBS或10% FBS时，细胞数目增加并且细胞形态学与高密度的对照培养物没有变化。潜在的神经分化没有得到针对人巢蛋白、TuJ1或GFAP的免疫细胞化学分析的证明。
将UTC铺平板在两天前接种在神经扩增条件下(NPE + F + E)的大鼠神经祖先培养物中。尽管铺平板的UTC的视觉确认证明这些细胞作为单细胞被铺平板，但铺平板后4 天(共6天)人-特异性核染色(hNuc)显示它们趋向于滚成球(ball up)并和避免与神经祖先接触。另外，在UTC附着的情况下，这些细胞展开并看来被大鼠起源的分化的神经元神经支配，从而提示UTC可能已分化成肌细胞。该观察基于相差显微镜术下的形态学。另一观察是典型大的细胞体(大于神经祖先)拥有类似神经祖先的形态学，具有在多方向拉长的细突起。HNuc 染色(见于一半的细胞核中)提示在一些情况下，这些人细胞可能已与大鼠祖先融合并呈现它们的表型。只含神经祖先的对照孔具有比含有脐或胎盘-来源的细胞的共培养物孔少的总祖先和明显的分化细胞，从而进一步指示脐-和胎盘-来源的细胞都影响神经祖先的分化和行为，这或是通过趋化因子和细胞因子的释放、或是通过接触介导的作用。
进行多个规程以确定UTC分化成神经谱系细胞的短期潜能。这些包括形态学的相差成像结合针对巢蛋白、TuJ1和GFAP的免疫细胞化学，巢蛋白、TuJ1和GFAP是分别与多能神经干细胞和祖细胞、未成熟和成熟神经元以及星形胶质细胞相关的蛋白。观察到证据提示在这些短期规程中的某些情况下发生神经分化。
几个值得注意的观察在UTC与神经祖先的共培养物中进行。应用人UTC连同异种细胞类型的该方法允许这些培养物中每一细胞的来源的绝对确定。首先，在这些培养物中观察到一些细胞，其中细胞质扩大，具有从细胞体伸出的神经突样突起，但只有一半的细胞体标记有hNuc蛋白。那些细胞可为已分化成神经谱系细胞的人UTC或它们可为已与神经祖先融合的UTC。其次，看来神经祖先以表明祖先分化成神经元和神经支配UTC的方式向UTC伸出神经突。第三，神经祖先和UTC的培养物具有比单独神经祖先的对照培养物更多的大鼠来源细胞和更大的分化量，进一步指示铺平板的UTC提供可溶性因子和或刺激神经祖先存活、增殖和/或分化的接触依赖性机制。
实施例13
细胞的分离
脐带是从National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, Pa.)获得的。这些组织是在正常分娩之后获得的。细胞分离规程是在层流罩超净台中在无菌条件下进行的。为了除去血液和碎片，将脐带在磷酸缓冲盐水(PBS; Invitrogen, Carlsbad, Ca.)中在100 单位/毫升青霉素、100 毫克/毫升链霉素和.025 微克/毫升两性霉素B(Invitrogen, Carlsbad, Ca.)存在下洗涤。然后将组织在150 cm2组织培养板中在50毫升培养基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖，Invitrogen)存在下进行机械解离，直至组织被绞碎成细浆。将该剁碎的组织转移至50毫升锥形管中(大约每管5克组织)。
然后将组织在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基中消化，每一种培养基中含有100 单位/毫升青霉素、100 毫克/毫升链霉素、0.25 微克/毫升两性霉素B和消化酶。在一些实验中，使用胶原酶和分散酶的酶混合物(“C:D”)(胶原酶(Sigma, St Louis, Mo.)，500单位/毫升；以及分散酶(Invitrogen)，50单位/毫升，于DMEM-低葡萄糖培养基中)。在其它实验中，使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶的混合物(“C:D:H”)(C:D:H=胶原酶，500单位/毫升；分散酶，50单位/毫升；以及透明质酸酶(Sigma)，5单位/毫升，于DMEM-低葡萄糖中)。将含有组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃在定轨振荡器(Environ, Brooklyn, N.Y.)中于225 rpm温育2小时。
消化后，将组织在150 × g离心5分钟，吸出上清液。将沉淀重悬浮于20毫升生长培养基(DMEM:低葡萄糖(Invitrogen)，15% (v/v)胎牛血清(FBS，确定成分的胎牛血清；Lot#AND18475，Hyclone, Logan, Ut.)、0.001% (v/v) 2-巯基乙醇(Sigma)、100 单位/毫升青霉素、100 微克/毫升链霉素和0.25 微克/毫升两性霉素B(各来自Invitrogen, Carlsbad, Ca))中。将该细胞悬浮液过滤通过70-微米尼龙BD FALCON Cell Strainer (BD Biosciences, San Jose, Ca.)。使包含生长培养基的另外5毫升漂洗液(rinse)通过该滤过器。然后将该细胞悬浮液通过40-微米尼龙细胞滤过器(BD Biosciences, San Jose, Ca.)，并追加另外5毫升的生长培养基漂洗液。
将滤液重悬浮于生长培养基(总体积50毫升)中并在150 × g离心5分钟。吸出上清液并将细胞重悬浮于50毫升的新鲜生长培养基中。将该过程再重复两次。
最后离心后，吸出上清液并将细胞沉淀重悬浮于5毫升新鲜生长培养基中。使用锥虫蓝染色测定活细胞数目。然后将细胞在标准条件下培养。
将从脐带组织分离出的细胞以5000细胞/cm2在明胶-包被的T-75瓶(Corning Inc., Corning, N.Y.)上接种于生长培养基中。2天后，从瓶中吸出使用过的培养基和非贴壁细胞。将贴壁细胞用PBS洗涤三次以除去碎片和血液来源的细胞。然后对细胞补充生长培养基并允许其生长至汇合(从传代0起约10天至传代1)。在随后的传代(从传代1至传代2等)中, 细胞在4-5天内达到亚汇合(75-85%汇合)。对这些随后的传代而言，将细胞以5000细胞/cm2接种。使细胞在含5%二氧化碳的湿润培养箱中在37℃生长。
在一些实验中，在用LIBERASE (2.5 毫克每毫升, BLENDZYME 3; Roche Applied Sciences, Indianapolis, In.)和透明质酸酶(5 单位/毫升, Sigma)消化后，在DMEM-低葡萄糖培养基中将细胞从脐带组织分离。组织消化和细胞分离如上文对其它蛋白酶消化所述，但使用LIBERASE/透明质酸酶混合物替代C:D或C:D:H酶混合物。用LIBERASE组织消化导致细胞群从容易扩增的产后组织分离。
比较使用不同酶组合从脐带分离细胞的程序。针对消化比较的酶包括：i) 胶原酶；ii) 分散酶；iii) 透明质酸酶；iv) 胶原酶：分散酶混合物 (C:D)；v) 胶原酶：透明质酸酶混合物(C :H)；vi) 分散酶：透明质酸酶混合物(D :H)；和vii) 胶原酶：分散酶：透明质酸酶混合物(C:D:H)。观察到利用这些不同酶消化条件的细胞分离差异(表13-1)。
进行其它尝试以通过不同方法从脐带分离细胞库。在一种情况下，对脐带切片并用生长培养基洗涤，以移去血凝块和胶状材料。收集血液、胶状材料和生长培养基的混合物并在150 x g离心。将沉淀重悬浮和在明胶包被的瓶上接种于生长培养基中。根据这些实验，分离出容易扩增的细胞群。
细胞也已分离自得自NDRI的脐带血样品。使用的分离规程是Ho等人的国际专利申请PCT/US2002/029971的规程。将脐带血(NDRI, Philadelphia Pa.)样品(分别是50毫升和10.5毫升)与裂解缓冲液(过滤灭菌的155毫摩尔氯化铵，10毫摩尔碳酸氢钾，0.1毫摩尔EDTA，缓冲为pH 7.2 (所有组分来自Sigma, St. Louis, Mo.)混合。以1 :20 脐带血对裂解缓冲液的比裂解细胞。涡旋产生的细胞悬浮液5分钟，并在环境温度温育2分钟。将裂解物离心(10 分钟，200 x g)。将细胞沉淀重悬浮于包含10%胎牛血清(Hyclone, Logan UT)、4毫摩尔谷氨酰胺(Mediatech Herndon, VA)、100单位每毫升青霉素和100 微克每毫升链霉素(Gibco, Carlsbad, Ca.)的完全极限必需培养基 (Gibco, Carlsbad Ca.)中。将重悬浮的细胞离心(10 分钟，200 x g), 吸出上清液，并且在完全培养基中洗涤细胞沉淀。将细胞直接接种在T75 瓶 (Corning, N.Y.)、T75 层粘连蛋白-包被的瓶或T 175纤连蛋白-包被的瓶(均为 Becton Dickinson, Bedford, Ma.)上。
为了确定细胞群是否会在不同条件下分离并在分离后立即在多种条件下扩增，根据上文提供的程序，在带有或没有0.001%(v/v) 2-巯基乙醇的生长培养基(Sigma, St. Louis, Mo.)中使用C:D:H酶组合消化细胞。所有细胞在100 单位每毫升青霉素和100 微克每毫升链霉素存在下生长。在所有测试条件下，细胞在传代0和传代1之间附着和扩增良好(表13-2)。在条件5-8和13-16中的细胞表现增殖良好直至接种后4次传代，在该点它们被冷藏。
C:D:H组合提供分离后最佳的细胞得率，并生成比其它条件在培养中扩增多得多的世代的细胞(表13-1)。使用单独的胶原酶或透明质酸酶不得到可扩增细胞群。没有进行尝试来确定该结果是否特异于被测试的胶原酶。
表13-1：使用不同酶组合从脐带组织分离细胞
Figure 912908DEST_PATH_IMAGE006
关键字：+ = 好， ++ = 非常好，+++ = 极好的，X = 在测试的条件下不成功。
细胞在针对酶消化和生长测试的所有条件下在传代0和1间附着和扩增良好。实验条件5-8和13-16中的细胞增殖良好直至接种后4次传代，在该点它们被冷藏。对所有细胞冷藏用于进一步分析。
表13-2：在不同条件下脐带细胞的分离和培养扩增
Figure 179942DEST_PATH_IMAGE007
具核细胞迅速地附着和生长。通过流式细胞术分析这些细胞，并且其类似于通过酶消化得到的细胞。
制剂包含红细胞和血小板。在前3周期间没有具核细胞附着和分裂。接种后3周改变培养基，且没有观察到细胞附着和生长。
细胞群可使用酶组合胶原酶(金属蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)和透明质酸酶(粘液溶解酶，其分解透明质酸)有效地从脐组织分离。也可使用作为胶原酶和中性蛋白酶掺合物的LIBERASE。BLENDZYME 3，其为胶原酶(4 Wunsch 单位/克)和嗜热菌蛋白酶(1714 酪蛋白单位/克)，也与透明质酸酶共同使用以分离细胞。当在生长扩增培养基中在明胶包被的塑料上培养时，这些细胞容易扩增许多代。
细胞也从脐带中的残余血液而不是脐带血中分离。从组织洗涤的血凝块中在所用条件下附着和生长的细胞的存在可归因于在解剖过程中释放的细胞。
实施例14
细胞的生长特征
将脐带组织来源的细胞的细胞扩增潜能与分离的干细胞的其它群比较。细胞扩增至衰老的过程被称为Hayflick's极限(Hayflick L., J. Am. Geriatr. Soc. 1974; 22(1): 1-12; Hayflick L., Gerontologist, 1974; 14(l):37-45), 1974)。
于室温通过将20毫升 2% (w/v)明胶(Type B: 225 Bloom; Sigma, St Louis, Mo.)加入T75瓶(Corning Inc., Corning, N.Y.)包被组织培养塑料瓶20分钟。移去明胶溶液后加入10 毫升磷酸缓冲盐水(PBS) (Invitrogen, Carlsbad, Ca.)，然后吸出。
对于生长扩增潜能的比较，利用下列细胞群：i) 间充质干细胞 (MSC; Cambrex, Walkersville, Md.)；ii) 脂肪-来源的细胞(美国专利号6,555,374 B1；美国专利申请US20040058412)；iii) 正常皮肤成纤维细胞(cc-2509 lot # 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD)；和iv) 脐-来源的细胞。细胞最初以5,000 细胞/cm2在明胶-包被的T75瓶上接种在生长培养基中。对于随后的传代，如下处理细胞培养物。胰蛋白酶消化后，在锥虫蓝染色后计数活细胞。将细胞悬浮液(50 微升)与锥虫蓝(50 微升, Sigma, St. Louis Mo.)组合。使用血细胞计数器估计活细胞数目。
计数后，将细胞以5,000细胞/cm2在明胶-包被的T75 瓶上接种于25毫升的新鲜生长培养基中。使细胞在标准气氛(5%二氧化碳(v/v))中在37℃生长。每周改变生长培养基2次。当细胞达到约85%汇合时，使它们传代；重复该过程直至细胞达到衰老。
在每一传代对细胞进行胰蛋白酶消化和计数。计算活细胞得率、群体倍增[ln (细胞最终/细胞起始)/ln2]和倍增时间(在培养中的时间/群体倍增)。为了确定最佳细胞扩增的目的，通过在前传代的总得率乘以每一传代的扩增系数 (即，扩增系数 = 细胞最终/细胞起始)确定每一传代的总细胞得率。
也测试堆积(banked)在传代10的细胞的扩增潜能。应用不同组的条件。测试正常皮肤成纤维细胞 (cc-2509 lot # 9F0844; Cambrex, Walkersville, Md.)、脐-来源的细胞。这些细胞群在前已堆积在传代10，已在5,000 细胞/cm2下在每一传代培养至该点。测定细胞密度对细胞解冻后传代10时细胞群的作用。将细胞在标准条件下解冻并使用锥虫蓝染色计数。然后将解冻的细胞以1,000 细胞/cm2接种在生长培养基中。使细胞在标准气氛条件下在37℃生长。每周改变生长培养基2次。细胞在它们达到约85%汇合时传代。然后细胞传代直至衰老，即，直至它们不再能进一步扩增。在每一传代对细胞进行胰蛋白酶消化并计数。计算细胞得率、群体倍增（ln (细胞最终/细胞起始)/ln2）和倍增时间(在培养中的时间/群体倍增)。通过在前传代的总得率乘以每一传代的扩增系数 (即，扩增系数 = 细胞最终/细胞起始)确定每一传代的总细胞得率。
在另一实验中测试在低细胞接种条件下的新分离的脐带组织-来源的细胞培养物的扩增潜能。脐-来源的细胞如实施例12中所述地分离。将细胞以1,000 细胞/cm2接种和如上文所述传代直至衰老。使细胞在标准气氛条件下在37℃生长。每周改变生长培养基2次。细胞在它们达到约85%汇合时传代。在每一传代对细胞进行胰蛋白酶消化并通过锥虫蓝染色计数。对每一传代计算细胞得率、群体倍增（ln (细胞最终/细胞起始)/ln2）和倍增时间(在培养中的时间/群体倍增)。通过在前传代的总得率乘以每一传代的扩增系数 (即，扩增系数 = 细胞最终/细胞起始)确定每一传代的总细胞得率。使细胞在明胶和非明胶包被的瓶上生长。
已证明，在某些情况中低O2细胞培养条件可以改进细胞扩增(美国专利申请号US20040005704)。为了确定UTC的细胞扩增是否可以通过改变细胞培养条件改进，将脐-来源的细胞的培养物在低氧条件中生长。将细胞以5,000 细胞/cm2在明胶包被的瓶上接种在生长培养基中。将细胞最初在标准气氛条件下培养至传代5，在该点将它们转移到低氧(5% O2)培养条件。
在其它实验中，使细胞在未包被的、胶原-包被的、纤连蛋白-包被的、层粘连蛋白-包被的和matrigel-包被的板上扩增。培养物已证明在这些不同基质上扩增良好。
脐-来源的细胞扩增大于40次传代，在60天内产生> 1x1017细胞的细胞得率。与之相比，MSCs和成纤维细胞分别在< 25天和<60天后衰老。尽管脂肪-来源的和网膜细胞扩增几乎60天，但它们分别生成4.5x1012和4.24x1013的总细胞得率。因而，当在所用的实验条件下以5,000 细胞/cm2接种时，脐-来源的细胞扩增得比在相同条件下生长的其它细胞类型好得多(表14-1)。
表14-1：生长至衰老的不同细胞群的生长特征
Figure 441159DEST_PATH_IMAGE008
脐-来源的细胞和成纤维细胞扩增大于10次传代，在60天内产生> 1x1011细胞的细胞得率(表14-2)。在这些条件下60天后，成纤维细胞变得衰老，而脐-来源的细胞群在80天后衰老，完成>40群体倍增。
表14-2: 使用低密度生长扩增的不同细胞群从传代10直至衰老的生长特征
Figure 110038DEST_PATH_IMAGE009
细胞在减少的氧条件下扩增良好，然而，对于脐带组织来源的细胞在低氧条件下培养似乎不对细胞扩增具有显著作用。标准气氛条件已证实成功用于生长足够数目的细胞，并且低氧培养对于脐带组织来源的细胞的生长是不需要的。
以约5,000细胞/cm2的密度、在生长培养基中在明胶-包被或未包被瓶上、在标准大气氧下生长分离的脐带组织来源的细胞的目前的细胞扩增条件足以在传代11产生大数目的细胞。另外，数据提示细胞可以使用较低密度培养条件(例如，1,000 细胞/cm2)容易地扩增。在低氧条件下的脐带组织-来源的细胞扩增也促进细胞扩增，尽管在利用这些条件用于生长时没有观察到细胞扩增潜能方面的增加的改进。目前，在标准气氛条件下培养脐带组织来源的细胞优选用于产生大的细胞库。但当培养条件改变时，脐带组织-来源的细胞扩增可以同样改变。该策略可用于增强这些细胞群的增殖和分化能力。
在所利用的条件下，尽管MSC和脂肪-来源的细胞的扩增潜能受到限制，但UTC容易扩增成大的数目。
实施例15
细胞在包含 D- 缬氨酸的培养基中的生长
已报告，包含D-缬氨酸而不是正常L-缬氨酸同工型（isoform）的培养基可以用于选择性抑制成纤维细胞-样细胞在培养物中的生长(Hongpaisan, J. Cell Biol Int., 2000; 24:1-7; Sordillo LM.等人, Cell Biol Int Rep., 1988; 12:355-64.)。实施实验以确定脐带组织来源的细胞是否能在包含D-缬氨酸的培养基中生长。
将脐-来源的细胞(P5)和成纤维细胞(P9)以5,000 细胞/cm2接种于明胶-包被的T75瓶(Corning, Corning, N.Y.)中。24小时后，移去培养基并用磷酸缓冲盐水(PBS)(Gibco, Carlsbad, Ca.)洗涤细胞以除去残余的培养基。将培养基替换以改良的生长培养基(DMEM，带有D-缬氨酸(特殊定制，Gibco)、15% (v/v)透析的胎牛血清(Hyclone, Logan, UT)、0.001% (v/v) β巯基乙醇(Sigma)、50单位/毫升青霉素和50毫克/毫升链霉素(Gibco))。
接种在含D-缬氨酸培养基中的脐-来源的细胞和成纤维细胞不增殖，这与接种在含透析的血清的生长培养基中的细胞不同。成纤维细胞在形态学上变化，大小增加和改变形状。4周后，所有细胞死亡并从瓶表面最终脱离。因而，可断定脐带组织来源的细胞需要L-缬氨酸用于细胞生长和维持长期生存力。L-缬氨酸优选地不从用于脐带组织来源的细胞的生长培养基除去。
实施例16
细胞的核型分析
在细胞疗法中使用的细胞系优选地是同质的，并且不含任何污染的细胞类型。在细胞疗法中使用的人细胞应当具有正常数目(46)的带有正常结构的染色体。为了鉴定同质的并且不含非产后组织起源细胞的脐带组织-来源的细胞系，对细胞样品的核型进行分析。
将来自雄性新生儿产后组织的脐带组织来源的细胞在生长培养基中培养。选择来自雄性新生儿(X, Y)的脐带组织以允许在新生儿-来源的细胞和母本来源的细胞(X,X)之间的区分。将细胞以5,000细胞每平方厘米接种在T25 瓶(Corning, Corning, N.Y.)中的生长培养基中，并扩增至80%汇合。将含有细胞的T25瓶填充以生长培养基至瓶颈。将样品通过快递递送到临床细胞遗传学实验室(估计的实验室至实验室递送时间是1小时)。由New Jersey Medical School, Newark, N.J.的Center for Human & Molecular Genetics实施染色体分析。细胞在染色体最可见的中期期间进行分析。在计数的20个中期细胞中，分析5个的正常同质核型数(2)。如果观察到2个核型，则将细胞样品表征为同质的。如果观察到大于2个核型，则将细胞样品表征为异质的。当鉴定出异质核型数(4)时，对另外的中期细胞进行计数和分析。
送去进行染色体分析的所有细胞样品被细胞遗传学实验室工作人员解释为表现正常的外观。分析的16个细胞系中的3个表现异质表型(XX和XY)，这表明存在来源于新生儿和母本起源的细胞。每一细胞样品被表征为同质的(表15-1)。
表16-1. UTC核型分析的结果
Figure 368981DEST_PATH_IMAGE010
染色体分析鉴定核型显示正常的脐-来源的细胞，如临床细胞遗传学实验室所解释的。核型分析也鉴定不含母本细胞的细胞系，如同质核型所确定的。
实施例17
细胞表面标记的流式细胞术评价
细胞表面蛋白质或"标记"通过流式细胞术的表征可以用于确定细胞系的特征。表达的一致性可以从多个供体以及在暴露于不同处理和培养条件的细胞确定。（通过流式细胞术）表征分离自脐的细胞系，从而提供用于鉴定这些细胞系的概况。
将细胞在具有青霉素/链霉素的生长培养基（Gibco Carlsbad, Ca.）中培养。在血浆处理的T75、T150和T225组织培养瓶(Corning, Corning, N. Y.)中培养细胞，直至汇合。通过将2% (w/v)明胶(Sigma, St. Louis, Mo.)在室温温育20分钟而将瓶的生长表面包被以明胶。
将瓶中的贴壁细胞在PBS中洗涤并用胰蛋白酶/EDTA脱离。收获细胞、离心并以1 × 107每ml的细胞浓度重悬浮于PBS中的3% (v/v)FBS中。根据生产商的说明书，将目标细胞表面标记的抗体(参见下面)加入到100 µl细胞悬浮液中，并将该混合物在暗处、在4℃温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去未结合的抗体。将细胞再悬浮于500 µl PBS中并通过流式细胞术分析。流式细胞术分析采用FACS calibur仪器(Becton Dickinson, San Jose, Ca.)进行。
使用针对细胞表面标记的下列抗体。
Figure 123310DEST_PATH_IMAGE011
在传代8、15和20分析脐带细胞。
为了比较供体间的差异，将来自不同供体的脐带-来源的细胞进行彼此比较。
将在明胶-包被的瓶上培养的脐带-来源的细胞与在未包被的瓶上培养的脐带-来源的细胞进行比较。
比较用于分离和制备细胞的4种处理。比较通过用1)胶原酶；2)胶原酶/分散酶；3)胶原酶/透明质酸酶；和4)胶原酶/透明质酸酶/分散酶处理的来源于产后组织的细胞。
通过流式细胞术分析的在传代8、15和20的脐带-来源的细胞都表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A, B, C，这通过相对于IgG对照增加的荧光指示。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的，这通过与IgG对照一致的荧光值指示。
通过流式细胞术分析的分离自单独供体的脐带-来源的细胞各自显示对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr- α和HLA-A, B, C的生产阳性，这反映在相对于IgG对照增加的荧光值上。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD 141、和HLA-DR、DP、DQ的生产是阴性的，具有与IgG对照一致的荧光值。
通过流式细胞术分析的在明胶包被和未包被的瓶上扩增的脐带-来源的细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A, B, C的生产都是阳性的，相对于IgG对照具有增加的荧光值。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD 141和HLA-DR、DP、DQ的生产是阴性的，具有与IgG对照一致的荧光值。
通过流式细胞术对脐带-来源的细胞的分析已确立了这些细胞系的特性。这些脐带-来源的产后细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A,B,C是阳性的，并且对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的。该鉴定在变量的变异之间是一致的，所述变量包括供体、传代、培养容器表面包被、消化酶和胎盘层。在个体荧光值直方图曲线平均值和范围中观察到一些变异，但在所有所测试条件下的所有阳性曲线是正常的并表达大于IgG对照的荧光值，从而证实细胞包括具有所述标记的阳性表达的同质群。
实施例18
通过寡核苷酸阵列的细胞分析
使用寡核苷酸阵列以比较脐-来源的和胎盘-来源的细胞和成纤维细胞、人间充质干细胞以及人骨髓来源的另一细胞系的基因表达概况。该分析提供了产后来源的细胞的表征，并鉴定了这些细胞的独特分子标记。
人脐带和胎盘得自National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, Pa.)，来自患者知情同意的正常足月分娩。接收这些组织，并在用C:D:H 混合物消化后如实施例13所述分离细胞。将细胞培养于在明胶包被的塑料组织培养瓶上的生长培养基中。将培养物在37℃、在5% CO2下温育。
人皮肤成纤维细胞购买自Cambrex Incorporated (Walkersville, MD.，批号9F0844)和ATCC CRL-1501 (CCD39SK)。将两个系均培养于含10% (v/v)胎牛血清(Hyclone)和青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen, Carlsbad, Ca.)中。使细胞生长于标准组织处理过的塑料上。
hMSCs购买自Cambrex Incorporated (Walkersville, Md.，批号2F1655、2F1656和2F1657)，并根据生产商的说明书将其培养于MSCGM培养基(Cambrex)中。使这些细胞在37℃、在5% CO2下生长于标准组织培养过的塑料中。
人髂嵴骨髓接受自NDRI，具有患者的知情同意。将骨髓根据Ho等人(WO03/025149)提出的方法进行处理。将骨髓与裂解缓冲液(155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3和0.1 mM EDTA, pH 7.2)以1份骨髓对20份裂解缓冲液的比率混合。将该细胞悬浮液进行涡旋，在环境温度温育2分钟，并在500 × g离心10分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬浮于补充有10% (v/v)胎牛血清和4 mM谷氨酰胺的极限必需培养基-α (Invitrogen)中。将该细胞再次离心，并将细胞沉淀重悬浮于新鲜培养基中。使用锥虫蓝排除(Sigma, St. Louis, Mo.)对活的单核细胞进行计数。将该单核细胞以5 × 104细胞/cm2接种于塑料组织培养瓶中。将该细胞在37℃、在5% CO2下、在标准大气O2或5% O2下温育。将细胞培养5天，而不改变培养基。在5天的培养之后除去培养基和非贴壁细胞。将贴壁细胞保持在培养中。
使用于冷磷酸缓冲盐水(PBS)中的细胞刮棒将细胞的活性生长培养物从瓶中取出。将该细胞在300 × g离心5分钟。除去上清液，并将该细胞重悬浮于新鲜PBS中并再次离心。除去上清液，并将细胞沉淀立即冷冻并贮存在-80℃。提取细胞mRNA并将其转录为cDNA。然后将cDNA转录为cRNA并进行生物素标记。将该生物素标记的cRNA与Affymetrix GENECHIP HG-U133A寡核苷酸阵列(Affymetrix, Santa Clara, Ca.)杂交。该杂交和数据采集是根据生产商的说明书进行的。该杂交和数据采集是根据生产商的说明书进行的。数据分析是使用“微阵列的显著性分析”(SAM)版本1.21计算机软件(Tusher, VG.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98:5116-5121)进行的。
在该研究中分析了14个不同的细胞群。在表18-1中列出了细胞和传代信息、培养基质和培养基。
表18-1. 通过微阵列研究分析的细胞。通过识别码列出了细胞系、以及分析时的传代、细胞生长基质和生长培养基
Figure 860322DEST_PATH_IMAGE012
如上所述通过主组分分析用SAM软件对数据进行评价。分析揭示在所测试细胞中以不同相对量表达的290个基因。该分析提供群之间的相对比较。
表18-2显示了对细胞对的比较而计算的欧氏(Euclidean)距离。该欧氏距离基于细胞比较，所述细胞比较基于在所述细胞类型之中差异表达的290个基因。该欧氏距离与290个基因表达之间的相似性成反比。
表18-2. 细胞对的欧氏距离。使用在细胞类型之间差异表达的290个基因计算细胞类型的欧氏距离。细胞间的相似性与欧氏距离成反比。
Figure 242762DEST_PATH_IMAGE013
表18-3、18-4和18-5显示在脐组织-来源的细胞中增加的(表18-3)、在胎盘-来源的细胞中增加的(表18-4)和在脐和胎盘-来源的细胞中降低的(表18-5)基因表达。
表18-3. 与所测定的其它细胞系相比，UTC中显示具有特别增加的表达的基因
Figure 672606DEST_PATH_IMAGE014
表18-4. 与所测定的其它细胞系相比，胎盘-来源的细胞中显示具有特别增加的表达的基因
Figure 976548DEST_PATH_IMAGE015
表18-5. 与所测定的其它细胞系相比，脐-来源的和胎盘-来源的细胞中显示具有降低的表达的基因
Figure 895143DEST_PATH_IMAGE017
表18-6、18-7和18-8显示人成纤维细胞(表18-6)、ICBM 细胞(表18-7)和MSCs(表18-8)中增加的基因表达。
表18-6. 与测定的其它细胞系相比，在成纤维细胞中显示具有增加的表达的基因。
双重特异性磷酸酶2
KIAA0527 蛋白
智人cDNA: FLJ23224 fis, 克隆ADSU02206
动力蛋白，胞质的、中间多肽1
锚蛋白3，神经纤维结(锚蛋白G)
抑制素，β A (激活蛋白A、激活蛋白AB α多肽)
胞外核苷酸焦磷酸酶 /磷酸二酯酶4 (推定的功能)
KIAA1053蛋白
微管相关蛋白1A
锌指蛋白41
HSPC019蛋白
智人cDNA: FLJ23564 fis,克隆LNG10773
智人mRNA; cDNA DKFZp564A072 (来自克隆DKFZp564A072)
LIM蛋白(类似于大鼠蛋白激酶C-结合enigma)
B-细胞中的κ轻多肽基因增强子的抑制剂，激酶复合物相关蛋白
假设的蛋白FLJ22004
人(克隆CTG-A4) mRNA序列
ESTs，适度相似于细胞因子受体样因子2；细胞因子受体CRL2前体[智人]
转化生长因子，β2
假设的蛋白MGC29643
通过单克隆抗体MRC OX-2鉴定的抗原
推定的X-连锁视网膜病蛋白
表18-7. 与测定的其它细胞系相比，在ICBM-来源的细胞中显示具有增加的表达的基因。
Figure 224810DEST_PATH_IMAGE019
表18-8. 与测定的其它细胞系相比，在MSC细胞中显示具有增加的表达的基因。
Figure 162679DEST_PATH_IMAGE020
实施本实施例以提供来源于脐带和胎盘的细胞的分子表征。该分析包括来源自三个不同脐带和三个不同胎盘的细胞。研究也包括两个不同系的皮肤成纤维细胞、三个系的间充质干细胞和三个系的髂嵴骨髓细胞。在含有针对22,000个基因的寡核苷酸探针的GENECHIP寡核苷酸阵列上分析由这些细胞表达的mRNA。
分析揭示在这些五种不同的细胞类型中，290个基因的转录物以不同量存在。这些基因包括在脐组织-来源的细胞中特别增加的7个基因，和在胎盘-来源的细胞中特别增加的10个基因。发现54个基因在胎盘-来源的和脐带-来源的细胞中具有特别较低的表达水平。
已经通过PCR证实了所选择的基因的表达，如实施例18所示。一般而言产后-来源的细胞以及具体地脐来源的细胞具有截然不同的基因表达概况，例如，与其它人细胞诸如本文测试的骨髓来源的细胞和成纤维细胞相比。
实施例19
脐带组织来源的细胞中的细胞标记
使用Affymetrix基因芯片将来源于脐带的细胞的基因表达概况与来源于其它来源的细胞的那些相比较。鉴定了六个“特征”基因：氧化的LDL受体1、白细胞介素-8（IL-8）、肾素、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3 (CXC配体3)和粒细胞趋化蛋白2 (GCP-2)。这些“特征”基因在脐-来源的细胞中以相对高的水平表达。
进行该实施例中描述的程序以验证微阵列数据并比较基因和蛋白质表达的数据，以及确立一系列可靠的测定用于检测脐带组织-来源的细胞的独特标识符。
使脐-来源的细胞(四份分离物)和正常的人皮肤成纤维细胞(NHDF，新生儿的和成人的)在明胶包被的T75瓶中生长于生长培养基中。使间充质干细胞(MSCs)生长于间充质干细胞生长培养基 Bullet试剂盒(MSCGM; Cambrex, Walkerville, Md.)中。
对IL-8实验而言，将细胞从液氮中解冻并以5000细胞/cm2铺平板于明胶包被的瓶中，在生长培养基中生长48小时，且然后在10毫升血清饥饿培养基 [DMEM –低葡萄糖(Gibco, Carlsbad, Ca.)，青霉素(50 单位/毫升)，链霉素(50 微克/毫升)(Gibco)和0.1% (w/v)牛血清清蛋白(BSA; Sigma, St. Louis, Mo.)]中再生长8小时。然后提取RNA并将上清液在150 × g离心5分钟以除去细胞碎片。将上清液在-80℃冷冻直至ELISA分析。
将脐带组织-来源的细胞以及来源于人新生儿包皮的人成纤维细胞在明胶包被的T75瓶中培养于生长培养基中。在传代11将细胞在液氮中冷冻。将细胞解冻并转移至15毫升离心管中。在150 × g离心5分钟后，弃去上清液。将细胞重悬浮于4毫升培养基中并计数。使细胞以375,000细胞/瓶在含15毫升生长培养基的75 cm2瓶中生长24小时。将该培养基改变为血清饥饿培养基进行8小时。在温育结束时收集血清饥饿培养基，在14,000 × g离心5分钟(并贮存在-20℃)。
为了估计每一瓶中的细胞数目，将2毫升胰蛋白酶/EDTA (Gibco, Carlsbad, Ca.)加入到每一瓶中。在细胞从瓶脱离后，采用8毫升生长培养基中和胰蛋白酶活性。将细胞转移至15毫升离心管中并在150 × g离心5分钟。除去上清液并将1毫升生长培养基加入到每一管中以重悬浮细胞。使用血细胞计数器确定细胞数目。
使用 ELISA 测定(R&D System, Minneapolis, Mn.)分析由细胞分泌进入血清饥饿培养基的IL-8量。所有测定是根据制造商提供的说明书进行的。
从汇合的脐带-来源的细胞和成纤维细胞提取RNA，或用于来自如上处理的细胞的IL-8表达。根据制造商的说明书(RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, Ca.)，将细胞用350微升含β-巯基乙醇(Sigma, St. Louis, Mo.)的缓冲液RLT裂解。根据制造商的说明书(RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, Ca.)提取RNA，并进行DNA酶处理(2.7单位/样品) (Sigma St. Louis, Mo.)。将RNA用50微升DEPC处理过的水洗脱并贮存在-80℃。从人脐带提取RNA。将组织(30毫克)悬浮于700微升含2-巯基乙醇的缓冲液RLT中。将样品机械匀浆，并按照制造商的说明书进行RNA提取。采用50微升DEPC处理过的水提取RNA并贮存在-80℃。
使用含TaqMan逆转录试剂(Applied Biosystems, Foster City, Ca.)的随机六聚体将RNA逆转录，在25℃进行10分钟、在 37℃进行60分钟，以及在95℃进行10分钟。将样品贮存在-20℃。
使用实时PCR和常规PCR对通过cDNA微阵列鉴定为在脐带细胞中独特调节的基因(特征基因-包括氧化的LDL受体、白细胞介素-8、肾素和浆膜蛋白)进行进一步的研究。
使用在商标Assays-On-Demand (Applied Biosystems)基因表达产物下出售的基因表达产物对cDNA样品进行PCR。根据制造商的说明书(Applied Biosystems)使用配有ABI Prism 7000 SDS软件(Applied Biosystems)的7000序列检测系统将氧化的LDL受体(Hs00234028)、肾素(Hs00166915)、浆膜蛋白 (Hs00382515)、CXC配体3 (Hs00171061)、GCP-2 (Hs00605742)、IL-8 (Hs00174103)和GAPDH与cDNA和TaqMan通用PCR主混合物混合。热循环条件为最初50℃进行2分钟和95℃进行10分钟，随后40个循环的95℃进行15秒和60℃进行1分钟。根据制造商的说明书(来自Applied Biosystems用于ABI Prism 7700序列检测系统的User Bulletin#2)分析PCR数据。
使用ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, Ma.)进行常规PCR以证实来自实时PCR的结果。PCR是使用2微升cDNA溶液(1 x Taq聚合酶(商标AMPLITAQ GOLD)通用混合PCR反应缓冲液(Applied Biosystems)和在94℃最初变性5分钟实施的。对每一引物组进行了扩增最优化。对IL-8、CXC配体3和浆膜蛋白 (94℃进行15秒，55℃进行15秒和72℃进行30秒，进行30个循环)；对肾素(94℃进行15秒，53℃进行15秒和72℃进行30秒，进行38个循环)；对氧化的LDL受体和GAPDH (94℃进行15秒，55℃进行15秒和72℃进行30秒，进行33个循环)。用于扩增的引物在表19-1中列出。在最终的PCR反应中引物的浓度是1微摩尔，除GAPDH为0.5微摩尔外。GAPDH引物与实时PCR相同，除未将制造商的TaqMan探针加入到最终的PCR反应中外。将样品在2% (w/v)琼脂糖凝胶中分离，并用溴化乙锭(Sigma, St. Louis, Mo.)染色。使用固定焦距POLAROID照相机(VWR International, South Plainfield, N.J.)在667胶片(Universal Twinpack, VWR International, South Plainfield, N.J.)上捕获图像。
表19-1：使用的引物
Figure 660656DEST_PATH_IMAGE021
将脐带-来源的细胞用冷的4% (w/v)低聚甲醛(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.)在室温固定10分钟。使用了传代0(P0)的脐带-来源的细胞(分离后直接使用)和传代11 (P11)(脐带-来源的细胞的两份分离物)以及成纤维细胞(P11)的各一份分离物。使用针对下列表位的抗体进行免疫细胞化学：波形蛋白 (1:500, Sigma, St. Louis, Mo.)、结蛋白 (1:150; Sigma – 对抗兔产生的；或1:300; Chemicon, Temecula, Ca. – 对抗小鼠产生的)、α-平滑肌肌动蛋白 (SMA; 1:400; Sigma)、细胞角蛋白18 (CK18; 1:400; Sigma)、von Willebrand因子(vWF; 1:200; Sigma)、和CD34 (人CD34 III类; 1:100; DAKOCytomation, Carpinteria, Ca.)。此外，对传代11脐带-来源的细胞测试了下列标记：抗人GRO α - PE (1:100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)、抗人GCP-2 (1:100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, Ca.)、抗人氧化的LDL受体1 (ox-LDL R1; 1:100; Santa Cruz Biotech)和抗人NOGA-A (1:100; Santa Cruz, Biotech)。
将培养物用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，并将其暴露于含PBS、4% (v/v)山羊血清(Chemicon, Temecula, Ca.)和0.3% (v/v) Triton (Triton X-100; Sigma, St. Louis, Mo.)的蛋白质封闭溶液中进行30分钟以接近细胞内抗原。在目标表位被定位于细胞表面(CD34、ox-LDL R1)的情况中，在程序的所有步骤中省略Triton X-100以防止表位损失。此外，在第一抗体对抗山羊产生(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况中，在整个方法过程中使用3% (v/v)驴血清代替山羊血清。然后将在封闭溶液中稀释的第一抗体应用到培养物中，在室温进行1小时时间段。除去第一抗体溶液，并在应用含有连同山羊抗-小鼠IgG – Texas Red (1:250，Molecular Probes，Eugene，OR) 和/或山羊抗-兔IgG - Alexa 488 (1:250，Molecular Probes)或驴抗-山羊IgG – FITC (1:150; Santa Cruz Biotech)一起的封闭的第二抗体溶液(在室温1小时)之前，将培养物用PBS洗涤。然后洗涤培养物，并应用10微摩尔DAPI (Molecular Probes)进行10分钟以使细胞核可见。
在免疫染色后，使用适当的荧光滤光片在Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus, Melville, N.Y.)上显现荧光。在所有的情况中，阳性染色代表高于对照染色的荧光信号，在对照染色中遵循上面概述的整个程序，除了应用第一抗体溶液外(1° 号对照)。代表性图像是使用数字彩色摄影机和ImagePro软件(Media Cybernetics, Carlsbad, Ca.)捕获的。对三重染色的样品而言，每一张图像均是使用一次仅一个发射滤光片采集的。然后使用Adobe Photoshop软件(Adobe, San Jose, Ca.)制备分层的蒙太奇。
将瓶中的贴壁细胞在磷酸缓冲盐水(PBS) (Gibco, Carlsbad, Ca.)中洗涤，并用胰蛋白酶/ EDTA (Gibco, Carlsbad, Ca.)进行脱离。将细胞收集、离心并以1×107每毫升的细胞浓度重悬浮于PBS中的3% (v/v) FBS中。将一百微升等分试样递送至锥形管中。将针对细胞内抗原染色的细胞用Perm/Wash缓冲液(BD Pharmingen, San Diego, Ca.)进行透化。按照制造商的说明书将抗体加入到等分试样中，并将所述细胞在暗处、在4℃温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去过量的抗体。将需要第二抗体的细胞重悬浮于100微升3% PBS中。按照制造商的说明书加入第二抗体并将所述细胞在暗处、在4℃温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去过量的第二抗体。将洗涤过的细胞重悬浮于0.5毫升PBS中，并通过流式细胞术进行分析。使用了下列抗体：氧化的LDL受体1 (sc-5813; Santa Cruz, Biotech)、GROa (555042; BD Pharmingen, Bedford, Ma.)、小鼠IgG1 κ, (P-4685和M-5284; Sigma)、以及驴抗山羊IgG (sc-3743; Santa Cruz, Biotech.)。流式细胞术分析采用FACScalibur (Becton Dickinson San Jose, Ca.)进行。
在来源于人脐带、成体和新生儿成纤维细胞和间充质干细胞(MSCs)的细胞的cDNA上实施的针对选择的"特征"基因的实时 PCR结果表明浆膜蛋白和氧化的LDL受体表达在脐-来源的细胞中较其它细胞高。将从实时PCR获得的数据通过ΔΔCT方法进行分析并以对数标度表达。产后细胞和对照之间未发现CXC配体3和GCP-2表达水平的显著差异。通过常规PCR证实了实时PCR的结果。PCR产物的测序进一步验证了这些观察。使用表19-1中所列的常规PCR CXC配体3引物在产后细胞和对照之间未发现CXC配体3表达水平的显著差异。
脐带组织来源的细胞中细胞因子，IL-8的表达在生长培养基培养的和血清饥饿的脐带来源的细胞中均提高。采用常规PCR并通过测序PCR产物验证了所有的实时PCR数据。
于无血清培养基中生长之后，检查条件培养基中IL-8的存在。在脐细胞已在其中生长的培养基中检测到了IL-8的最大量(表19-2)。在人皮肤成纤维细胞已在其中生长的培养基中未检测到IL-8。
表19-2: 通过ELISA测量的IL-8蛋白（pg/106细胞）
Figure 432303DEST_PATH_IMAGE022
将来源于人脐带的传代0细胞通过免疫细胞化学分析探测所选择的蛋白质的产生。在分离后立即(传代0)将细胞用4%低聚甲醛固定并将其暴露于针对六种蛋白质的抗体：von Willebrand因子、CD34、细胞角蛋白18、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。脐带来源的细胞对α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白是阳性的，具有直达传代11一致的染色模式。
通过免疫细胞化学研究GROα、GCP-2、氧化的LDL受体 1和浆膜蛋白(NOGO-A)在脐带-来源的传代11细胞中的的产生。脐带-来源的细胞是GCP-2阳性的，但GRO α产生通过该方法未检测到。另外，细胞是NOGO-A阳性的。
已经对四个基因确立了通过微阵列和PCR(实时和常规两种)测量的基因表达水平之间的一致性：氧化的LDL受体1、肾素、浆膜蛋白和IL-8。这些基因的表达在脐带-来源的细胞中在mRNA水平是差异地调节的，IL-8在蛋白质水平也差异地调节。GCP-2和CXC 配体3的差异表达未在mRNA水平证实。虽然该结果不支持从微阵列实验原始获得的数据，但这可能是归因于方法学灵敏度方面的差异。
对来源于人脐带的传代0细胞探测α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的表达，且它对两者均是阳性的。该染色模式保持直达传代11。
结论是，全部mRNA数据至少部分地证实得自微阵列实验的数据。
实施例20
细胞表型的免疫组织化学表征
通过免疫组织化学分析在人脐带中发现的细胞的表型。
收获人脐带组织并于4℃在4% (w/v)低聚甲醛中浸没固定过夜。使用针对下列表位的抗体(参见表20-1)实施免疫组织化学：波形蛋白(1 :500; Sigma, St. Louis, Mo.)，结蛋白(1 : 150，针对兔产生；Sigma；或1 :300，针对小鼠产生；Chemicon, Temecula, Ca.)，α-平滑肌肌动蛋白(SMA; 1 :400; Sigma)，细胞角蛋白18 (CK18; 1:400; Sigma)、von Willebrand因子(vWF; 1:200; Sigma)和CD34 (人CD34 III类; 1:100; DAKOCytomation, Carpinteria, Ca.)。此外，测试了下列标记：抗人GROα-PE (1 :100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N. J.)，抗人GCP-2 (1 :100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, Ca.)，抗人氧化的LDL受体 1 (ox-LDL R1; 1 : 100; Santa Cruz Biotech)和抗人NOGO-A (1 : 100; Santa Cruz Biotech)。用外科手术刀修剪固定的样品并在含乙醇的干冰浴上置于OCT包埋化合物(Tissue- Tek OCT; Sakura, Torrance, Ca.)中。然后使用标准恒冷切片机(Leica Microsystems)对冷冻块切片(10 微米厚)并封固在载玻片上用于染色。
与在前研究类似地实施免疫组织化学(例如，Messina,等人, Exper. Neurol, 2003; 184: 816-829)。将组织切片用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤并暴露于含PBS、4% (v/v)山羊血清(Chemicon, Temecula, Ca.)和0.3% (v/v) Triton (Triton X-100; Sigma)的蛋白质封闭溶液1小时以接近细胞内抗原。在目标表位被定位于细胞表面(CD34、ox-LDL R1)的情况中，在程序的所有步骤中省略triton以防止表位丢失。此外，在第一抗体对抗山羊产生(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)的情况中，在整个程序过程中使用3% (v/v)驴血清代替山羊血清。然后将在封闭溶液中稀释的第一抗体应用到切片中，在室温进行4小时时间段。除去第一抗体溶液，并在应用含有连同山羊抗-小鼠IgG – Texas Red (1:250，Molecular Probes，Eugene，Or.) 和/或山羊抗-兔IgG - Alexa 488 (1:250，Molecular Probes)或驴抗-山羊IgG – FITC (1:150; Santa Cruz Biotech)一起的封闭的第二抗体溶液(在室温1小时)之前，将培养物用PBS洗涤。洗涤培养物，并应用10微摩尔DAPI (Molecular Probes)进行10分钟以使细胞核可见。
在免疫染色后，使用适当的荧光滤光片在Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus, Melville, N.Y.)上显现荧光。阳性染色由高于对照染色的荧光信号代表。代表性图像是使用数字彩色摄影机和ImagePro软件(Media Cybernetics, Carlsbad, Ca.)捕获的。对三重染色的样品而言，每一张图像均是使用一次仅一个发射滤光片采集的。然后使用Adobe Photoshop软件(Adobe, San Jose, Ca.)制备分层的蒙太奇。
表20-1： 使用的第一抗体的概述
Figure 445259DEST_PATH_IMAGE023
波形蛋白、结蛋白、SMA、CK18、vWF和CD34标记在脐带中发现的细胞亚群中表达(数据未显示)。具体地，vWF和CD34表达限制于脐带中包含的血管。CD34+细胞在最内层(腔侧)。波形蛋白表达在整个基质和脐带血管中发现。SMA限制于基质和动脉及静脉的外壁，但不包含在血管本身中。CK18和结蛋白仅在血管中观察到，结蛋白限制于中层和外层。
波形蛋白、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、细胞角蛋白18, von Willebrand 因子和CD 34在人脐带内的细胞中表达。基于显示仅表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的体外表征研究，数据提示目前的脐带-来源的细胞分离方法收获细胞亚群或分离的细胞改变标记的表达以表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。
实施例21
营养因子的分泌
测量选择的营养因子从脐-来源的细胞的分泌。选择用于进行检测的因子包括：（1）已知具有血管生成活性的那些，诸如肝细胞生长因子(HGF) (Rosen 等人,. Ciba Found. Symp., 1997; 212:215-26)、单核细胞趋化蛋白质 1 (MCP-1) (Salcedo等人, Blood, 2000; 96;34-40)、白细胞介素-8 （IL-8) ( Li等人, J. Immunol., 2003; 170:3369-76)、角质形成细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF) (Hughes等人, Ann. Thorac. Surg., 2004; 77:812-8)、基质金属蛋白酶1 (TIMP1)、促血管生成素(angiopoietin) 2 (ANG2)、血小板衍生生长因子(PDGF-bb)、血小板生成素(TPO)、肝素结合表皮生长因子(HB- EGF)、基质衍生因子1 α (SDF-1α)；（2）已知具有神经营养/神经保护活性的那些，例如脑衍生神经营养因子(BDNF) (Cheng 等人, Dev. Biol, 2003; 258;319-33)、白细胞介素-6 (IL-6)、粒细胞趋化蛋白-2 (GCP-2)、转化生长因子β2 (TGFβ2)；和（3）已知具有趋化因子活性的那些，例如巨噬细胞炎性蛋白1 α (MIP1a)、巨噬细胞炎性蛋白1 β (MlP1b)、单核细胞化学引诱物-1 (MCP-1)、Rantes (调节活化、正常T细胞表达和分泌)、1309、胸腺和活化-调节的趋化因子(TARC)、Eotaxin、巨噬细胞-来源的趋化因子 (MDC)和IL-8。
将来源于脐带的细胞以及来源于人新生儿包皮的人成纤维细胞在明胶包被的T75瓶中培养于生长培养基中。在传代11将细胞冷藏并贮存在液氮中。解冻后将生长培养基加入细胞，然后转移到15毫升离心管并在150 x g离心细胞5分钟。将细胞沉淀重悬浮于4 毫升生长培养基中，并对细胞进行计数。将细胞以5,000 细胞/cm2接种在各自包含15毫升生长培养基的T75瓶中并培养24小时。将培养基变成无血清培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco)，0.1% (w/v)牛血清清蛋白(Sigma)，青霉素(50 单位/毫升)和链霉素(50微克/毫升, Gibco))，进行8小时。在温育结束时通过在14,000 x g离心5分钟收集条件无血清培养基并贮存在-20℃。
为了估计每一瓶中的细胞数目，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞并使用2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco)脱离。通过加入8毫升生长培养基抑制胰蛋白酶活性。在150 x g对细胞离心5分钟。除去上清液，并将细胞重悬浮于1毫升生长培养基中。用血细胞计数器估计细胞数目。
使细胞在37℃在5%二氧化碳和大气氧下生长。通过ELISA (R&D Systems, Minneapolis, Mn.)确定每一细胞样品产生的MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1α、GCP-2、IL-8和TGF-β2的量。根据制造商的说明书实施所有测定。呈现的值是皮克每毫升每百万细胞(n=2, sem)。
使用 SEARCHLIGHT Proteome Array (Pierce Biotechnology Inc.)测量趋化因子(MIP1α、MIP1β、MCP-1、Rantes、I309、TARC、Eotaxin、MDC、IL8)、BDNF和血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGFbb、TPO、HB-EGF。Proteome Arrays是用于定量测量2至16种蛋白质每孔的多重夹心ELISAs。该阵列通过将2 x 2、3 x 3或4 x 4模式的4至16种不同俘获抗体点到96孔板的每一孔产生。夹心ELISA程序之后，对整个板成像以俘获在板的每一孔中的每一点生成的化学发光信号。在每一点生成的信号与原始标准或样品中的靶蛋白质的量成比例。
MCP-1和IL-6由脐-来源的细胞和皮肤成纤维细胞分泌(表21-1)。SDF-1α和GCP-2由成纤维细胞分泌。GCP-2和IL-8 由脐-来源的细胞分泌。TGF-β2未通过ELISA从任一细胞类型检测到。
表21-1. ELISA测定结果
（呈现的值是picog/ml/百万细胞（n＝2，sem）
Figure 327764DEST_PATH_IMAGE024
TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8从脐-来源的细胞分泌(表21-2和21-3)。没有检测到Ang2、VEGF或PDGF-bb。
表21-2. SEARCHLIGHT Multiplexed ELISA测定结果
Figure 742565DEST_PATH_IMAGE025
关键字：hFB (人成纤维细胞), U1 (脐-来源的细胞 (022803))，U3 (脐-来源的细胞(071003))。ND：未检测到。
表21-3. SEARCHLIGHT Multiplexed ELISA测定结果
关键字：hFB (人成纤维细胞)，U1(脐-来源的PPDC (022803))，U3 (脐 -来源的PPDC (071003))。ND：未检测到。
脐-来源的细胞分泌许多营养因子。这些营养因子中的一些，诸如HGF、bFGF、MCP-1和IL-8在血管发生中起重要作用。其它营养因子诸如BDNF和IL-6在神经再生中具有重要作用。
实施例22
体外免疫学
在体外评价脐带细胞系的免疫学特征以预测这些细胞将在体内移植时引起的免疫学应答，如果有的话。通过流式细胞术对脐带细胞系测定HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达。这些蛋白质是由抗原呈递细胞(APC)表达的，并是幼稚 CD4+T细胞的直接刺激所要求的(Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171)。也通过流式细胞术分析了该细胞系的HLA-G (Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171)、CD178 (Coumans等人, Journal of Immunology Methods, 1999; 224, 185-196)和PD-L2 (Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171; Brown等人, The Journal of Immunology, 2003; 170, 1257-1266)的表达。由残留于胎盘组织中的细胞进行的这些蛋白质的表达被认为在子宫内介导胎盘组织的免疫特权状态(immuno-privileged status)。为了预测脐带组织-来源的细胞系在体内引起免疫应答的程度，在单向混合淋巴细胞反应(MLR)中测试了该细胞系。
在包被有2%明胶(Sigma, St. Louis, Mo.)的T75瓶(Corning, Corning, N.Y.)中，将细胞在生长培养基(DMEM-低葡萄糖 (Gibco, Carlsbad, Ca.)，15% (v/v) 胎牛血清 (FBS)；(Hyclone, Logan, Ut.)，0.001% (v/v) β巯基乙醇 (Sigma, St. Louis, Mo.)，50 单位/毫升青霉素，50 微克/毫升链霉素 (Gibco, Carlsbad, Ca.)中培养直至汇合。
将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS) (Gibco, Carlsbad, Ca.)中洗涤，并用胰蛋白酶/EDTA (Gibco, Carlsbad, Ca.)进行脱离。将细胞收获、离心并以1×107每毫升的细胞浓度重悬浮于PBS中的3% (v/v) FBS中。按照制造商的说明书，将抗体(表22-1)加入到一百微升的细胞悬浮液中并将其在暗处、在4℃温育30分钟。温育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去未结合的抗体。将细胞重悬浮于五百微升PBS中，并通过流式细胞术使用FACS calibur仪器(Becton Dickinson, San Jose, Ca.)进行分析。
表22-1. 抗体
Figure 123048DEST_PATH_IMAGE027
将标记为细胞系A的传代10脐带-来源的细胞的冷藏小瓶包裹在干冰上并送至CTBR (Senneville, Quebec)以使用CTBR SOP号CAC-031进行混合淋巴细胞反应。从多名男性和女性志愿者供体收集外周血单核细胞(PBMCs)。将刺激物(供体)同种异体 PBMC、自体PBMC和脐带组织-来源的细胞系用丝裂霉素C处理。将自体的和丝裂霉素C处理过的刺激物细胞加入到反应者(受者) PBMCs中并培养4天。温育后，向每一样品中加入[3H]胸苷并培养18小时。收获细胞后，提取放射性标记的DNA，并使用闪烁计数器测量[3H]-胸苷的掺入。
同种异体供体的刺激指数(SIAD)是这样计算的：接受者(receiver)加丝裂霉素C处理的同种异体供体的平均增殖除以接受者的基线增殖。脐带-来源的细胞的刺激指数是这样计算的：接受者加丝裂霉素C处理的脐带组织-来源的细胞系的平均增殖除以接受者的基线增殖。
筛选了六例人志愿者血液供体以鉴定将在与其它五例血液供体的混合淋巴细胞反应中显示稳健的增殖反应的单个同种异体供体。选择该供体作为同种异体阳性对照供体。选择剩余的五例血液供体作为受者。该同种异体阳性对照供体和脐带-来源的细胞系是用丝裂霉素C处理过的，并在混合淋巴细胞反应中与所述五例个体同种异体接受者一起培养。使用两个细胞培养板(每个板具有三例接受者)一式三份进行反应(表22-2)。平均刺激指数的范围为6.5(板1)至9(板2)，且同种异体供体阳性对照的范围为42.75 (板1)至70 (板2) (表22-3)。
表22-2：混合淋巴细胞反应数据-细胞系A (脐带)
用于增殖测定的DPM
板ID：板1
Figure 605982DEST_PATH_IMAGE028
板ID：板2
Figure 78551DEST_PATH_IMAGE029
表22-3. 脐带-来源的细胞和同种异体供体在与五个个体同种异体接受者的混合淋巴细胞反应中的平均刺激指数
受者 脐带
板1 (接受者1-4) 42.75 6.5
板2 (接受者5) 70 9
通过流式细胞术分析的脐带-来源的细胞的直方图显示HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达，如通过与IgG对照一致的荧光值所记录的，从而表明脐带-来源的细胞系缺乏直接刺激同种异体PBMCs（例如，CD4+T细胞）所需的细胞表面分子。
通过流式细胞术分析的脐带-来源的细胞的直方图显示PD-L2的阳性表达，如通过相对于IgG对照增加的荧光值所记录的，并显示CD 178和HLA-G的阴性表达，如通过与IgG对照一致的荧光值所记录的。
在采用脐带-来源的细胞系进行的混合淋巴细胞反应中，平均刺激指数的范围是6.5至9，且同种异体阳性对照的平均刺激指数的范围是42.75至70。脐带-来源的细胞系对刺激蛋白HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达是阴性的，如通过流式细胞术所测量的。脐带-来源的细胞系对免疫调节蛋白HLA-G和CD 178的表达是阴性的，并且对PD-L2的表达是阳性的，如通过流式细胞术所测量的。同种异体供体PBMCs包含表达HLA-DP、DR、DQ、CD80、CD86和B7-H2的抗原呈递细胞，从而允许对同种异体PBMCs（例如，幼稚CD4+T细胞）的刺激。脐带-来源的细胞上抗原呈递细胞表面分子的缺失要求同种异体PBMCs（例如，幼稚CD4+T细胞）的直接刺激，且免疫调节蛋白PD-L2的存在可解释与同种异体对照相比在MLR中由这些细胞表现的低刺激指数。
实施例23 端粒酶活性的测定
端粒酶的功能是合成用于保护染色体完整性和用于延长细胞的复制寿命的端粒重复序列(Liu, K等人, PNAS,1999: 96:5147-5152)。端粒酶由两个组分组成，端粒酶RNA模板(hTERT)和端粒酶逆转录酶(hTERT)。端粒酶的调节通过hTERT的转录而不是hTERT确定。因而用于hTERT mRNA的实时聚合酶链反应(PCR)是用于确定细胞的端粒酶活性的可接受方法。
细胞分离
实施实时PCR实验以测定人脐带组织来源的细胞的端粒酶产生。人脐带组织来源的细胞依照实施例13-15和美国申请系列号10/877,012 ('012申请)中列出的实施例制备。通常，得自 National Disease Research Interchange (Philadelphia, Pa.)的脐带在正常递送后被洗涤以除去血和碎片并被机械解离。然后将组织与包括胶原酶、分散酶和透明质酸酶的消化酶在培养基中于37℃温育。根据'012申请的实施例中列出的方法培养人脐带组织来源的细胞。间充质干细胞和正常皮肤成纤维细胞(cc-2509 lot # 9F0844)得自Cambrex, Walkersville, Md.。多潜能人睾丸胚胎性癌(畸胎瘤)细胞系nTera-2 细胞 (NTERA- 2 cl.Dl) (参见 Plaia 等人, Stem Cells, 2006; 24(3):531-546)购自ATCC (Manassas, Va.)并根据'012申请列出的方法培养。
总 RNA 分离
使用RNeasy®试剂盒(Qiagen, Valencia, Ca.)从细胞提取RNA。用50微升DEPC-处理过的水洗脱RNA并将其贮存在-80℃。使用含TaqMan®逆转录试剂(Applied Biosystems, Foster City, Ca.)的随机六聚体将RNA逆转录，在25℃进行10分钟、在 37℃进行60分钟，以及在95℃进行10分钟。将样品贮存在-20℃。
实时 PCR
根据制造商的说明书(Applied Biosystems)，使用Applied Biosystems Assays-On-Demand™ (也称为 TaqMan® Gene Expression Assays)对cDNA 样品实施PCR。该商业试剂盒广泛用于测定人细胞中的端粒酶。简言之，使用带有ABI prism 7000 SDS软件的7000序列检测系统(Applied Biosystems)，将hTERT(人端粒酶基因) (HsOO 162669)和人GAPDH (内部对照)与cDNA和TaqMan® Universal PCR主混合物（master mix）混合。热循环条件为最初在50℃进行2分钟和在95℃进行10分钟，然后是在95℃进行15秒和在60℃进行1分钟的40个循环。根据制造商的说明书分析PCR数据。
对人脐带组织来源的细胞 (ATCC 登记号PTA-6067)、成纤维细胞和间充质干细胞测定hTERT和18S RNA。如表22-1所示，在人脐带组织-来源的细胞中未检测到hTERT以及从而未检测到端粒酶。
表22-1
hTERT 18S RNA
脐细胞(022803) ND +
成纤维细胞 ND +
ND- 未检测到；+ 检测到信号
测定人脐带组织来源的细胞(分离物022803，ATCC登录号PTA-6067)和nTera-2 细胞，且结果显示在两批hUTC中没有端粒酶表达，而畸胎瘤细胞系揭示高水平的表达(表22-1)。
表22-1
Figure 457580DEST_PATH_IMAGE030
因此，可以断定人脐组织-来源的细胞不表达端粒酶。
序列表
<110> SEYDA, AGNIESZKA
GOSIEWSKA, ANNA
<120> 损伤后神经组织的再生和修复
<130> 026038.0228PTWO
<140>
<141>
<150> 61/139,305
<151> 2008-12-19
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 1
gagaaatcca aagagcaaat gg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 2
agaatggaaa actggaatag g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 3
tcttcgatgc ttcggattcc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 4
gaattctcgg aatctctgtt g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 5
ttacaagcag tgcagaaaac c 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 6
agtaaacatt gaaaccacag cc 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 7
tctgcagctc tgtgtgaagg 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 8
cttcaaaaac ttctccacaa cc 22
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 9
cccacgccac gctctcc 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 10
tcctgtcagt tggtgctcc 19

Claims (35)

1.治疗患有神经学损伤的患者的方法，包括以有效治疗所述神经学损伤的量给所述患者施用分离的脐带组织-来源的细胞，其中所述脐带组织-来源的细胞来源于基本上不含血液的人脐带组织，其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化成至少神经表型的细胞的潜能；并且其中所述细胞不表达CD117。
2.权利要求1 的方法，其中所述神经学损伤是脑缺血、急性缺血后再灌注、围产期缺氧-缺血性损伤、心跳停止、颅内出血、颅内损害、颈椎挫伤或惊吓婴儿综合征。
3.权利要求1 的方法，其中将所述细胞基因工程改造以产生促进所述神经学损伤治疗的基因产物。
4.权利要求1 的方法，其中将所述细胞连同至少一种其它细胞类型施用。
5.权利要求4的方法，其中所述其它细胞类型是星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、神经祖先、神经干细胞或其它多能或多潜能干细胞。
6.权利要求1 的方法，其中将所述细胞在所述患者中枢或外周神经系统中的预定位点施用。
7.权利要求1 的方法，其中所述脐带组织-来源的细胞不表达 hTERT或端粒酶。
8.权利要求1 的方法，其中将所述细胞通过注射或输注施用。
9.刺激患者室下区(SVZ)的再生能力的方法，包括以有效增加神经发生、血管发生或突触发生的量给所述患者施用分离的脐带组织-来源的细胞，其中所述脐带组织-来源的细胞来源于基本上不含血液的人脐带组织，其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化成至少神经表型的细胞的潜能；并且其中所述细胞不表达CD117。
10.权利要求9 的方法，其中将所述细胞基因工程改造以产生促进所述室下区的再生能力的基因产物。
11.权利要求9 的方法，其中将所述细胞连同至少一种其它细胞类型施用。
12.权利要求11的方法，其中所述其它细胞类型是星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、神经祖先、神经干细胞或其它多能或多潜能干细胞。
13.权利要求9 的方法，其中将所述细胞在所述患者中枢或外周神经系统中的预定位点施用。
14.权利要求9 的方法，其中将所述细胞通过注射或输注施用。
15.权利要求1 的方法，其中所述细胞需要L-缬氨酸用于生长并且可以在至少约5%氧中生长。
16.权利要求1 的方法，其中所述细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的一种或多种。
17.权利要求1 的方法，其中所述细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的每一种。
18.权利要求1 的方法，其中所述细胞不表达CD31、CD34、CD45、CD141和HLA-DR、DP、DQ中的一种或多种。
19.权利要求1 的方法，其中所述细胞不表达CD31、CD34、CD45、CD141和HLA-DR、DP、DQ中的任一种。
20.权利要求9 的方法，其中所述细胞需要L-缬氨酸用于生长并且可以在至少约5%氧中生长。
21.权利要求1 的方法，其中所述细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的一种或多种。
22.权利要求1 的方法，其中所述细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的每一种。
23.权利要求1 的方法，其中所述细胞不表达CD31、CD34、CD45、CD141和HLA-DR、DP、DQ中的一种或多种。
24.权利要求1 的方法，其中所述细胞不表达CD31、CD34、CD45、CD141和HLA-DR、DP、DQ中的任一种。
25.用于治疗患有神经学损伤的患者的药物组合物，包含药学上可接受的载体和有效治疗所述神经学损伤的量的分离的脐带组织-来源的细胞，其中所述脐带组织-来源的细胞来源于基本上不含血液的人脐带组织，其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化成至少神经表型的细胞的潜能；并且其中所述细胞不表达CD117。
26.权利要求25的药物组合物，其中所述细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的一种或多种。
27.权利要求25的药物组合物，其中所述细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的每一种。
28.权利要求25的药物组合物，其中所述细胞不表达CD31、CD34、CD45、CD141和HLA-DR、DP、DQ中的一种或多种。
29.权利要求25的药物组合物，其中所述细胞不表达CD31、CD34、CD45、CD141和HLA-DR、DP、DQ中的任一种。
30.用于治疗患有神经学损伤的患者的试剂盒，所述试剂盒包含药学上可接受的载体、分离的脐带组织-来源的细胞的群和在治疗所述患者的方法中应用所述试剂盒的说明书，其中所述脐带组织-来源的细胞来源于基本上不含血液的人脐带组织，其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化成至少神经表型的细胞的潜能；并且其中所述细胞不表达CD117。
31.权利要求30的试剂盒，其还包含至少一种其它细胞类型的群。
32.权利要求30的试剂盒，其中所述细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的一种或多种。
33.权利要求30的试剂盒，其中所述细胞表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α和HLA-A、B、C中的每一种。
34.权利要求30的试剂盒，其中所述不表达CD31、CD34、CD45、CD141和HLA-DR、DP、DQ中的一种或多种。
35.权利要求30的试剂盒，其中所述细胞不表达CD31、CD34、CD45、CD141和HLA-DR、DP、DQ中的任一种。
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Free format text: FORMER OWNER: ADVANCED TECHNOLOGIES AND REGE

Effective date: 20140702

Owner name: DEPUY SPYER CORP.

Free format text: FORMER OWNER: DEPUYI ORTHOPEDIC COMPANY

Effective date: 20140702

Owner name: HAND INNOVATIONS LLC

Free format text: FORMER OWNER: DEPUY SPINE INC.

Effective date: 20140702

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: Massachusetts, USA

Applicant after: DEPUY SYNTHES PRODUCTS, LLC

Address before: American Florida

Applicant before: HAND INNOVATIONS, LLC

Address after: Massachusetts, USA

Applicant after: Depp Speyer Iraq LLC

Address before: Massachusetts, USA

Applicant before: DEPUY SPINE, Inc.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: DEPUY SPYER CORP. TO: DEPUY SPINE INC.

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: HAND INNOVATIONS LLC TO: DEPUY SYNTHES PRODUCTS LLC

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20140702

Address after: American Florida

Applicant after: HAND INNOVATIONS, LLC

Address before: Massachusetts, USA

Applicant before: Depp Speyer Iraq LLC

Effective date of registration: 20140702

Address after: Massachusetts, USA

Applicant after: DEPUY SPINE, Inc.

Address before: indiana

Applicant before: Depp Iraq orthopedic Co.

Effective date of registration: 20140702

Address after: indiana

Applicant after: Depp Iraq orthopedic Co.

Address before: Massachusetts, USA

Applicant before: ADVANCED TECHNOLOGIES AND REGENERATIVE MEDICINE, LLC

C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120516