KR20150009586A - 폐질환 및 폐장애의 전염증성 매개체의 ｈＵＴＣ 조절 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상이 있는 환자에서 상기 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 전염증성 매개체의 생성을 조절하기 위해(예를 들어, 감소하기 위해), 제대 조직 유래 세포를 이용하는 방법, 약제학적 조성물, 및 키트를 포함한다. 본 발명은 또한 제대 조직 유래 세포를 이용하여, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상이 있는 환자에서 상기 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 전염증성 매개체의 생성을 억제하기 위해, 제대 조직 유래 세포를 이용하는 방법, 약제학적 조성물, 및 키트를 포함한다. 일 실시 형태에서, 제대 조직 유래 세포는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117 또는 CD45의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다.

Description

폐질환 및 폐장애의 전염증성 매개체의 ｈＵＴＣ 조절{hUTC MODULATION OF PRO-INFLAMMATORY MEDIATORS OF LUNG AND PULMONARY DISEASES AND DISORDERS}

본 발명은 폐질환 및 폐장애의 전염증성 매개체의 조절을 위한 세포 기반 요법에 관한 것이다.

폐질환(만성 및 급성), 폐장애, 및/또는 폐손상은 아직까지도 전 세계적으로 질병률과 사망률의 중요한 원인이다. 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 세계에서 주된 사망 원인 중 4위이며(문헌[Spurzem and Rennard, Semin Respir Crit Care Med, 2005; 26: 142-153]), 정상 호흡을 방해하는 점액에 의한 해부학적 기도 협착 또는 기도 폐쇄에 기인할 수 있다. 게다가, 폐섬유증으로도 알려진 간질성 폐질환은 각종 만성 폐장애를 포함하는 구속성 질환(restrictive disease)으로 분류된다. 만성 폐질환 관리에는 약물 요법, 산소 요법, 수술, 및 호흡 재활 치료가 포함된다.

COPD 환자의 90%가 흡연자이지만, 흡연자의 10%만이 발병된다는 것은, 유전적 소인이 중요한 예후 인자가 될 수 있음을 시사하고 있다(문헌[Siafakas and Tzortzaki, Respir Med, 2002; 96: 615-24]). 흡연자의 폐질환은 만성 활동성 염증, 기도 점액 과다분비, 및 폐기종을 특징으로 하며(문헌[MacNee, Proc Am Thorac Soc. 2005; 2: 258-66]), 금연 시에 부분적으로만 되돌릴 수 있다(문헌[Spurzem and Rennard, Semin Respir Crit Care Med, 2005; 26: 142-153]). 기도 염증 및 폐실질은 COPD의 발병에 중요한 역할을 한다. 담배 연기는 폐염증을 유발하며, 궁극적으로는 담배 연기 노출이 중지되더라도 COPD의 원인이 된다.

폐기종은 COPD의 질병률과 사망률을 결정하는 주요 인자 중 하나이다. 폐기종은 말초 폐포 기강(호흡세기관지 및 폐포 포함)의 확장으로 정의되며, 이는 폐포벽 구조의 파괴를 수반하고, 예를 들어, 폐포와 같은 폐조직을 지지하는 구조체의 파괴로 인한 폐조직의 탄력성 저하, 및 폐포에 영양을 공급하는 모세혈관의 파괴를 특징으로 한다. 예를 들어, 엘라스틴과 같은 염증성 효소는 이러한 파괴를 일으킬 수 있다. 폐기종의 발생률은 환경 오염물질, 흡연, 및 기타 유해 물질에의 노출의 증가로 증대되어 왔다. 현재, 중증 폐기종의 유일한 개선은 폐 이식이다. 따라서, 폐기종의 환자에서 폐손상을 치료, 회복 및/또는 개선하는데 적절하고 유용한 접근법에 대한 요구가 여전히 강하다.

급성 폐손상(ALI) 및 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 집중 치료 환경에서의 질병률 및 사망률의 중요한 원인이며, 직접적 손상(예를 들어, 익사, 폐렴, 유독가스 흡입, 및 폐좌상) 또는 간접적 손상(예를 들어, 중증 패혈증, 수혈, 쇼크, 및 췌장염)에 따른 미만성 폐수종과 함께 저산소혈증의 돌연 발증을 특징으로 한다. 인공호흡기 및 지지 요법은 ALI 및 ARDS의 현재의 치료법이다.

구속성 폐질환은 질병률과 사망률의 가장 일반적인 원인이며, 세 가지의 1차 병인을 갖고 있다: 폐암, 폐렴, 및 폐섬유증. 특발성 폐섬유증(IPF)은 진행성 호흡관란을 특징으로 하는 장애를 초래하는 질환(crippling disease)이며, 고 사망률의 진행성 고정 조직 섬유화, 구조적 왜곡(architectural distortion), 및 기능 상실을 수반한다(문헌[Ortiz L.A. et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2003; 100:8407-11]). 현재, IPF의 과정을 역전시키거나 지연시키는 효과적인 요법은 이용가능하지 않다. 코르티코스테로이드, 면역억제제, 면역조절제, 또는 항섬유화제와 같은 대부분의 치료법은 염증을 억제시키기 위한 것이나, 어느 것도 질환 진행을 변화시키지 않는 것으로 입증되었다. 따라서, 내인성 폐 회복 및 재생을 향상시키면서 섬유증을 감속시키거나 정지시키는 것을 목적으로 하는 신규 요법에 대한 요구가 강하다.

다수의 전염증성 매개체가 예를 들어, 호흡기 질환에서와 같은 폐질환, 폐장애, 및 폐손상의 병리에 관여하고 있다. 예를 들어, 폐섬유증에서, 섬유화성 간질성 폐렴의 만성형, 전섬유화(profibrotic) 사이토카인 과다 또는 항섬유화(antifibrotic) 사이토카인 부족은 질환의 병적 과정에 관여하고 있다(문헌[Zhao F. et al. Transplant Proceedings, 2008; 40(5):1700-1705]).

이와 같이, 이들 사이토카인 및 전염증성 매개체의 생성 감소 및/또는 억제는 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 증상 및/또는 병리를 경감시킬 수 있다. 따라서, 현재, 이러한 전염증성 매개체의 생성을 감소시키거나 이의 생성을 억제시키는 요법이 강하게 요구된다. 예를 들어, COPD와 같은 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 현재의 치료법으로는 흡입 또는 경구 코르티코스테로이드, 기관지확장제 및 항콜린제를 들 수 있다. 또한, 예를 들어, 천식에 대한 임상 시험에서의 용도를 비롯한 인터류킨 길항제 및 인터류킨에 대한 항체의 용도에 대하여 연구 조사되었다. 그러나, 이들 치료법 중 어느 것도 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 증상 및/또는 병리에 관여하는 전염증성 매개체의 생성을 감소시키고/시키거나 억제시키지는 않는다.

줄기 세포의 이식은 표적 조직을 재구성하는 임상 도구로서 이용되고, 이럼으로써 생리적인 그리고 해부학적인 기능성을 회복시킬 수 있다. 폐질환(만성 및 급성), 폐장애, 및/또는 폐손상의 치료법에서, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상에 의해 손상된 폐조직을 재생시키거나 회복시키기 위해 줄기 세포 기술을 이용하는 것에 주로 초점을 맞추어 왔다.

따라서, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리와 관련된 매개체를 조절하여, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상을 치료하는 방법이 필요하다. 특히, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리와 관련된 전염증성 매개체를 연속적으로 조절하는 방법이 필요하다.

본 발명의 한 측면은 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상이 있는 환자의 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 전염증성 매개체의 생성을 조절하는(예를 들어, 감소시키는) 방법을 특징으로 한다. 이러한 질환, 장애, 및/또는 손상으로는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)(예를 들어, 만성 기관지염, 폐기종), 폐섬유증, 급성 폐손상(ALI), 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 및 이것들과 관련된 손상을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시 형태는 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상이 있는 환자에게 유효량의 제대 조직 유래 세포를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 조절하는 방법이다. 다른 실시 형태는 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상이 있는 환자에게 유효량의 제대 조직 유래 세포를 투여하는(예를 들어, 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 감소시키는데 효과적인 양으로) 것을 포함하는, 상기 환자의 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 감소시키는 방법이다.

상기 방법은 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, CD117 또는 CD45의 생성이 결여되고, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는 세포를 이용한다. 일 실시 형태에서, 세포는 CD117 및 CD45의 생성이 결여되고, 임의로 또한 hTERT 및 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 다른 실시 형태에서, 세포는 hTERT 및 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 또 다른 실시 형태에서, 세포는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, CD117 또는 CD45의 생성이 결여되고, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않으며, 하나 이상의 하기 특성을 갖는다: CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90을 발현하는 것; CD31 또는 CD34를 발현하지 않는 것; 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하는 것; 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖는 것.

상기 방법은 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 많은 전염증성 매개체의 생성을 조절하는데(예를 들어, 감소시키는데) 적합하다. 일 실시 형태에서, 전염증성 매개체는 TNF-α, RANTES, MCP-1, IL-1β 및 이들의 조합이다. 전염증성 매개체는 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 진행에 관여할 수 있다.

일 실시 형태에서, 세포는 적어도 하나의 다른 세포 유형 및/또는 적어도 하나의 다른 제제와 함께 투여된다. 다른 세포 유형은 예를 들어, 전구 세포, 혈관 평활근 세포, 혈관 평활근 전구 세포, 혈관 주위 세포, 혈관 내피 세포, 혈관 내피 전구 세포, 또는 다른 다능성(multipotent) 또는 만능성(pluripotent) 줄기 세포와 같은 폐 세포일 수 있다. 상기 제제는 항혈전제(antithrombogenic agent), 항염증제, 면역억제제, 면역조절제, 전혈관형성제(pro-angiogenic agent), 또는 항세포사멸제(antiapoptotic agent)로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 유효량의 제대 조직 유래 세포를 포함하며, 상기 전염증성 매개체가 만성 폐쇄성 폐질환(예를 들어, 폐기종 또는 만성 기관지염)의 진행을 매개하고, 상기 세포가 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117 및 CD45의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는, 만성 폐쇄성 폐질환이 있는 환자에서 만성 폐쇄성 폐질환의 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 조절하는(예를 들어, 감소시키는) 방법이다. 일 실시 형태는 유효량의 제대 조직 유래 세포를 포함하며, 상기 전염증성 매개체가 만성 폐쇄성 폐질환(예를 들어, 폐기종 또는 만성 기관지염)의 진행을 매개하고, 상기 세포가 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117 및 CD45의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는, 만성 폐쇄성 폐질환이 있는 환자에서 만성 폐쇄성 폐질환의 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 조절하는 방법이다. 하나 이상의 전염증성 매개체는 TNF-α, RANTES, MCP-1, IL-1β 및 이들의 조합일 수 있다.

다른 실시 형태에서, 세포는 하기 특성 중 하나 이상을 추가로 가질 수 있다: CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90을 발현하는 것; CD31 또는 CD34를 발현하지 않는 것; 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하는 것; 및 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖는 것.

일부 실시 형태에서, 제대 조직 유래 세포는 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 제형화된다. 대안적으로, 세포는 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 키트로 제형화된다. 상기 방법은 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 억제할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 유효량의 제대 조직 유래 세포를 포함하는, 만성 폐쇄성 폐질환이 있는 환자에서 만성 폐쇄성 폐질환의 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 억제하는 방법이다. 하나 이상의 전염증성 매개체는 TNF-α, RANTES, MCP-1, IL-1β 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, COPD는 만성 기관지염 또는 폐기종이다.

제대 조직 유래 세포는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117 및 CD45의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 임의로, 세포는 하나 이상의 하기 특성을 추가로 갖는다: CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90을 발현하는 것; CD31 또는 CD34를 발현하지 않는 것; 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하는 것; 및 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖는 것.

일 실시 형태에서, 세포는 만성 폐쇄성 폐질환의 부위에 투여된다.

특정 실시 형태에서, 세포는 시험관 내에서 유도되어, 투여 전에 예를 들어, 혈관 평활근, 혈관 주위 세포, 또는 혈관 내피 계통 세포와 같은 폐조직 세포로 분화된다. 다른 실시 형태에서, 세포는 유전자 조작되어, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 치료를 촉진시키는 유전자 산물을 생성한다.

방법의 일부 실시 형태에서, 세포는 예를 들어, 폐 전구 세포, 혈관 평활근 세포, 혈관 평활근 전구 세포, 혈관 주위 세포, 혈관 내피 세포, 혈관 내피 전구 세포, 또는 다른 다능성 또는 만능성 줄기 세포과 같은 폐조직 세포를 포함할 수 있는 적어도 하나의 다른 세포 유형과 함께 투여된다. 다른 세포 유형이 제대 조직 유래 세포와 동시에, 그 전에 또는 그 후에 투여될 수 있다.

다른 실시 형태에서, 세포는 예를 들어, 항혈전제, 항염증제, 면역억제제, 면역조절제, 전혈관형성제, 또는 항세포사멸제일 수 있는 적어도 하나의 다른 제제와 함께 투여된다. 다른 제제는 제대 조직 유래 세포와 동시에, 그 전에, 또는 그 후에 투여될 수 있다.

세포는 바람직하게는 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 부위 또는 그 근위부에 투여되지만, 그러한 부위의 원위부의 위치에 투여될 수도 있다. 세포는 주사, 주입, 환자에 이식된 장치에 의해, 또는 세포를 함유하는 매트릭스(matrix) 또는 스캐폴드(scaffold)의 이식에 의해 투여될 수 있다. 세포는 환자의 폐조직에 대해 증식과 같은 영양적 효과(trophic effect)를 발휘할 수 있다. 세포는 예를 들어, 혈관 평활근 세포, 혈관 내피 세포, 폐 전구 세포, 혈관 주위 세포, 혈관 평활근 전구 세포, 또는 혈관 내피 전구 세포와 같은 폐조직 세포의 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 부위 또는 부위들로의 이동을 유도할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 제대 조직 유래 세포를 포함하며, 상기 세포가 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, CD117 및 CD45의 생성이 결여되고, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 조절하는 약제학적 조성물이다. 일 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 제대 조직 유래 세포를 포함하여, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 감소시킨다. 다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 제대 조직 유래 세포를 포함하여, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 억제시킨다. 본 발명의 다른 측면은 제대 조직 유래 세포의 산물을 포함하는 약제학적 조성물 및 키트에 의한 치료를 특징으로 한다.

약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 폐질환은 예를 들어, 만성 기관지염 또는 폐기종과 같은 만성 폐쇄성 폐질환일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시 형태는 약제학적으로 허용가능한 담체 및 제대 조직 유래 세포를 포함하는, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 조절하는 키트이다. 본 발명의 다른 실시 형태는 약제학적으로 허용가능한 담체 및 제대 조직 유래 세포를 포함하는, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 감소시키는 키트이다. 일 실시 형태에서, 제대 조직 유래 세포는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117 및 CD45의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 폐질환은 예를 들어, 만성 기관지염 또는 폐기종과 같은 만성 폐쇄성 폐질환일 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 실시예를 참조하여 이해될 것이다.

전술한 요약 뿐만 아니라 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용도 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시할 목적으로, 도면은 본 발명의 실시 형태를 보여준다. 그러나, 본 발명은 예시된 정확한 배열, 실시예 및 수단에 한정되지 않음을 이해하여야 한다.
<도 1>
도 1은 BALF 총 단백질 농도를 나타낸다. 총 단백질을 피어스(Pierce) BCA 단백질 분석(Protein Assay)을 이용하여 측정하였다. 각 데이터 포인트는 단일 동물로부터 얻어진 측정치를 나타낸다. 가로선은 모든 측정치의 평균치를 나타낸다. 스튜던트 T 검정(Student T-test) 분석을 행하였다. 데이터는 표 1.2에 하기 표 형식으로 나타낸다.
<도 2>
도 2는 사이토카인/케모카인 분석의 결과를 나타낸다. 도 2a는 폐 호모지네이트(Lung Homogenate)의 사이토카인/케모카인 분석을 나타낸다: 22종의 상이한 사이토카인/케모카인의 농도를 제조업자의 프로토콜에 따라 마우스 22-멀티플렉스 비드 키트(multiplex bead kit(밀리포어(Millipore)))를 사용하여 폐 호모지네이트에 대하여 측정하고, 바이오라드 바이오플렉스 머신(BioRad Bioplex machine)을 사용하여 분석하였다. 데이터 바는 6개의 샘플의 평균을 나타낸다. 데이터는 표 1-3 및 1-4에 표 형식으로 나타낸다. 도 2b는 BALF의 사이토카인/케모카인 분석을 나타낸다. 22종의 상이한 사이토카인/케모카인의 농도를 제조업자의 프로토콜에 따라 마우스 22-멀티플렉스 비드 키트(밀리포어)를 사용하여 BALF(기관지 폐포 세척액)에 대하여 측정하고, 바이오라드 바이오플렉스 머신을 사용하여 분석하였다. 데이터 바는 6개의 샘플의 평균을 나타낸다. 데이터는 표 1-5 및 1-6에 표 형식으로 나타낸다.
<도 3>
도 3은 인간 제대 조직 유래 세포(hUTC) 투여 후 1, 6, 10 및 14일째의 기관지 폐포 세척(BAL)액 조성물에 대한 hUTC 주입 및/또는 돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 처리의 효과를 나타낸다. 도 3a는 NSG 마우스에 대한 결과를 나타내며, 도 3b는 BALB/c 마우스에 대한 결과를 나타낸다. 음성 대조군은 생리식염수 및/또는 비히클로 감염/감작된 섐(sham)이었다. BAL액에 대하여 총 세포수를 검사하였다. 각 경우에, 다섯(5) 마리의 동물에 대하여 평가하였다. 결과는 세포수의 평균 ± S.E.M.으로 나타낸다(*, p < 0.05, ***, p<0.001).
<도 4>
도 4는 hUTC 투여 후 1, 6, 10 및 14일째의 BAL액 조성물에 대한 hUTC 주입 및/또는 돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 처리의 효과를 나타낸다. 음성 대조군은 생리식염수 및/또는 비히클로 감작된 섐이었다. BAL액에 대하여 호중구 및 대식세포의 존재를 검사하였다. 각 경우에, 다섯(5) 마리의 동물에 대하여 평가하였다. 결과는 세포수의 평균 ± S.E.M.으로 나타낸다(*, p < 0.05, ***, p<0.001).
<도 5>
도 5는 NOD/SCIDγ 마우스에로의 hUTC 투여 후 1, 6, 10 및 14일째의 BAL 상청액 사이토카인 조성물 중의 hUTC 주입 및/또는 돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 처리의 효과를 나타낸다. 도 5a는 MCP-1에 대한 사이토카인 반응을 나타낸다. 도 5b는 TNF-α에 대한 사이토카인 반응을 나타낸다. 도 5c는 TNF-α에 대한 반응을 나타내고, 도 5d는 IL-1β에 대한 반응을 나타낸다. 1군당 5마리의 마우스에서 독립적으로 반응을 측정하였으며, 평균 ± S.E.M으로 나타낸다(*, p < 0.05).
<도 6>
도 6은 BALB/c 마우스에서의 hUTC 투여 후 1, 6, 10 및 14일째의 BAL 상청액 조성물 중의 hUTC 주입 및/또는 돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 처리의 효과를 나타낸다. MCP-1(도 6a 참조), TNF-α(도 6b 참조), RANTES(도 6c 참조) 및 IL-1β(도 6d 참조)에 대한 사이토카인 반응을 나타낸다. 1군당 다섯(5) 마리의 마우스에서 독립적으로 반응을 측정하였으며, 평균 ± S.E.M으로 나타낸다(*, p < 0.05).
<도 7>
도 7은 x 100의 배율로 측정되고, 1군당 다섯(5) 마리의 동물 및 기간에서 평균 ± SD로 나타낸 평균 선형 절편(a) 및 폐포수(b)를 나타낸다. 부호는 통계 분석의 결과를 나타낸다: 엘라스타제 군과 비교하여, *p < 0.01, **p, 0.005, ***p, 0.001.
<도 8>
도 8은 대조 마우스(PBS) 또는 엘라스타제(El), 엘라스타제 +hUTC 요법(El+hUTC) 또는 hUTC 단독을 취한 마우스 유래의 고정 폐 절편(1군당 n = 5)의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 이용한 폐기종 손상의 검출을 나타낸다. 각 샘플에 대하여 세 가지(3)의 대표적인 슬라이드를 나타냈다. 초기 배율 x 100.
<도 9>
도 9는 hUTC에 의해 1, 6, 10 및 14일째에 면역 억제(immuno-compromised; NOD/SCIDγ) 마우스에서 엘라스타제 유발 폐기종의 진행도가 저하되었음을 나타낸다. 폐기종 손상을 고정 폐 절편(1군당 n = 5)의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 검출하였다. 초기 배율 x 100.
<도 10>
도 10은 hUTC에 의해 1, 6, 10 및 14일째에 면역 감응(immuno-competent; BALB/c) 마우스에서 엘라스타제 유발 폐기종의 진행도가 저하되었음을 나타낸다. 폐기종 손상을 고정 폐 절편(1군당 n = 5)의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 검출하였다. 초기 배율 x 100.
<도 11>
도 11은 NOD/SCIDγ 마우스(도 11a 참조) 및 BALB/c 마우스(도 11b 참조)에서의 hUTC 투여 후 1, 6, 10 및 14일째의 폐 기능에 대한 hUTC 주입 및/또는 돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 처리의 효과를 나타낸다. 음성 대조군은 생리식염수 및/또는 비히클로 처리된 섐이었다.

하기 예시적인 실시 형태의 상세한 설명에서, 이의 부분을 형성하는 첨부 도면에 관하여 언급하고자 한다. 이들 실시 형태는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 충분히 상세하게 기술되어 있으며, 다른 실시 형태가 이용될 수 있고, 타당한 구조적, 기계적, 전기적 및 화학적 변화가 본 발명의 사상 또는 범주를 벗어나지 않고서 일어날 수 있음을 이해한다. 당업자가 본 명세서에 기재된 실시 형태를 실시가능하게 하는데 필요가 없는 세부 사항을 피하기 위해, 당업자에게 공지된 특정 정보에 대한 설명을 생략할 수 있다. 따라서, 하기 상세한 설명은 한정적인 의미로 이해되어서는 안된다.

본 출원은 생체 내 환경에서의 인간 제대 조직 유래 세포가 예를 들어, COPD와 같은 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 전염증성 매개체의 생성을 조절한다는(예를 들어, 감소시킨다는) 발견에 기초를 두고 있다. 특히, 본 발명자들은 인간 제대 조직 유래 세포의 투여가, 예를 들어 TNF-α, RANTES, MCP-1 및 IL-1β와 같은 호흡기 질환(예를 들어, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상)의 전염증성 매개체의 생성을 감소시키거나 심지어는 이의 생성을 억제시키는 것을 알아냈다.

따라서, 본 발명은 폐질환을 앓고 있는 환자에서 예를 들어, COPD와 같은 폐질환의 병리에 관여하는 전염증성 매개체의 생성을 조절(예를 들어, 감소)하는데 제대 조직 유래 세포를 사용하는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 폐질환의 병리에 관여하는 전염증성 매개체를 감소시키거나 심지어는 억제시켜, 질환 증상을 경감시킨다. 최적으로, 본 발명은 특히 통상적인 약물 요법, 산소 요법, 수술, 및 호흡 재활 치료와 비교하여, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 증상 및/또는 병리에 관여하는 전염증성 매개체의 생성의 연속 조절(예를 들어, 감소) 및/또는 억제를 제공한다.

I. 정의

본 명세서 및 특허청구범위 전체에 걸쳐 다양한 용어가 사용된다. 이러한 용어는 달리 지시되지 않으면 본 기술 분야에서의 그의 통상적인 의미로 주어져야 한다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석된다.

"폐조직"에는 정맥, 동맥, 혈관, 모세혈관, 및 이러한 구조의 부분이거나 이와 관련된 타입의 세포; 폐 및 흉막 조직; 및 혈관 평활근, 혈관 주위 세포, 및 혈관 내피 세포 계열 및/또는 표현형이 포함되나, 이에 한정되지 않는 모든 폐조직 구조 및 관련 조직이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 "호흡기 질환 또는 폐질환, 호흡기 장애 및 폐장애, 및 호흡기 손상 및 폐손상"으로는 폐쇄성 폐질환, 구속성 폐질환, 호흡기 감염증(상기도 및 하기도), 호흡기 종양, 흉막강 질환, 및 폐혈관 질환이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 이들 질환, 장애 및/또는 손상으로 인한 폐조직 손상은 본 발명의 범위 내에서 폐손상으로 특징지어질 수 있다. 게다가, 본 발명에 의해 망라되는 손상된 폐조직은 정맥, 동맥, 혈관, 모세혈관, 및 이러한 구조의 부분이거나 이와 관련된 타입의 세포를 비롯한 모든 폐조직 구조 및 관련 조직을 포함한다.

"폐쇄성 폐질환"은 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)(예를 들어, 만성 기관지염 및 폐기종), 낭포성 섬유증, 기관지 확장증, 세기관지염, 및 알러지성 기관지폐 아스페르길루스증을 포함할 수 있다. 예를 들어, COPD는 유해 입자 또는 가스(통상 흡연으로부터)로 인해 발생되며, 폐에 비정상적인 염증 반응을 유발시킨다. 보다 큰 기도에서의 염증 반응은 만성 기관지염으로 알려져 있으며, 사람들이 자주 가래를 내뱉는 경우에 임상적으로 진단된다. 폐포에서, 염증 반응은 폐기종으로 알려진 과정인 폐조직의 파괴를 일으킨다. 이들 조직은 본 발명에 적용될 때에 COPD와 관련된 것임을 인지해야 한다. COPD의 병인에는 흡연, 작업장 분진(예를 들어, 탄광업, 금광업, 면직물 공업 및 화학 공업에서)에의 직업상 노출, 대기 오염, 및 유전적 특징이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 "구속성 폐질환"은 간질성 폐질환(ILD)으로도 알려져 있다. 이들 중 대부분은 특발성을 나타낸다. 이의 예에는 특발성 폐섬유증, 특발성 간질성 폐렴(이들 중 몇몇 타입이 있음), 유육종증, 호산구성 폐렴, 림프관평활근종증, 폐 랑게르한스세포 조직구증, 및 폐포단백질증이 포함된다. ILD는 폐간질에 영향을 미친다: 폐포 상피, 폐 모세혈관 내피, 기저막, 혈관주위 조직 및 외림프관 조직. 대부분의 타입의 ILD는 섬유증을 포함한다.

호흡기 종양은 악성 및 양성 종양을 포함한다. 악성 종양은 예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암(선암, 편평상피암, 및 미분화 대세포암), 림프종, 및 기타 암을 포함한다. 양성 종양은 희귀 질환이지만, 예를 들어, 폐과오종 및 선천성 기형을 들 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "급성 폐손상(ALI)"은 저산소혈증, 비심장성 폐수종, 저 폐 컴플라이언스 및 광범위한 모세관 누출을 특징으로 하는 미만성 이질성 폐손상이다. ALI는 국소 염증 또는 전신성 염증의 자극으로 인한 것이다. 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 ALI보다 더 심각하다. 본 명세서에서 사용되는 ALI 및 ARDS는 직접적 손상 또는 간접적 손상에 반응하여, 미만성 폐수종과 함께 저산소혈증의 돌연 발증을 특징으로 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "직접적 손상"은 익사 사건, 폐렴, 유독가스 흡입, 및 폐좌상에 의한 폐손상을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 "간접적 손상"은 예를 들어, 중증 패혈증, 수혈, 쇼크, 및 췌장염에 의한 것일 수 있다. ALI 및 ARDS를 유발하는 이러한 손상은 폐포-모세혈관 인터페이스의 파괴, 간질 및 폐포강에로의 단백질 풍부 체액의 누출, 광범위한 사이토카인의 방출, 및 호중구의 이동을 초래한다.

본 발명의 방법에 의해 망라되는 폐질환, 폐장애, 및 폐손상은 당업계에 공지되어 있다. 관련 합병증, 병인, 및 치료를 포함한 각각의 특성은 당업자에게 공지되어 있다. 이는 폐쇄성 및 구속성 폐질환, 폐장애 및 폐손상에 적용되기 때문에, 본 명세서에서 구체적으로 논의되지 않은 폐질환, 폐장애 및 폐손상을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 세포는 통상 산후 세포 또는 산후 유래 세포(PPDC)로 명명된다. 상기 세포는 더욱 구체적으로는 "제(umbilicus) 유래 세포" 또는 "제대 유래 세포(UDC)", 또는 "제대 조직 유래 세포(UTC)"이다. 또한, 세포는 줄기 또는 전구 세포인 것으로 기술될 수 있으며, 후자의 용어는 넓은 의미로 사용된다. 용어 "유래"는 세포를 이들의 생물학적 공급원으로부터 수득하고 성장시키거나, 아니면 시험관 내에서 조작한(예를 들어, 성장 배지에서 배양하여, 집단을 확장시키고/확장시키거나 세포주를 생성한) 것을 나타내기 위하여 사용된다. 제대 줄기 세포의 시험관 내 조작 및 본 발명의 제대 유래 세포의 독특한 특징은 하기에 상세히 기재된다.

줄기 세포는 자가 재생할 뿐만 아니라, 분화하여, 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cell)를 생성하는 단일 세포의 능력에 의해 정의되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그들의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주사 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.

줄기 세포는 그들의 발생능(developmental potential)에 따라, (1) 전능성(totipotent); (2) 만능성; (3) 다능성; (4) 소기능성(oligopotent); 및 (5) 단일기능성(unipotent)으로 분류된다. 전능성 세포는 모든 배아 및 배외 세포 유형을 생성시킬 수 있다. 만능성 세포는 모든 배아 세포 유형을 생성시킬 수 있다. 다능성 세포는 세포 계통의 아형(subset)을 생성시킬 수 있으나, 모두 특정 조직, 기관 또는 생리계 내에 있는 것들을 포함한다. 예를 들어, 조혈모세포(HSC)는 HSC(자가 재생), 혈액 세포 제한 소기능성 전구세포 및 통상적인 혈액 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있다. 소기능성인 세포는 다능성 줄기 세포보다 더 제한된 아형의 세포 계통을 생성시킬 수 있다. 단일기능성인 세포는 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)을 생성시킬 수 있다.

줄기 세포는 또한 그들이 수득되는 공급원에 기초하여 분류된다. 성체 줄기 세포는 일반적으로 다수의 분화된 세포 유형을 포함하는 조직에서 관찰되는 다능성 미분화 세포이다. 성체 줄기 세포는 스스로 재생할 수 있다. 정상 환경 하에서, 이는 또한 분화하여, 이것이 유래되는 조직의 특수화된 세포 유형, 및 아마도 다른 조직형을 제공할 수 있다. 배아 줄기 세포는 배반포기 배아의 내세포집단 유래의 만능성 세포이다. 태아 줄기 세포는 태아 조직 또는 막에서 유래되는 것이다. 산후 줄기 세포는 실질적으로 출산 후에 입수할 수 있는 배외 조직, 즉 제대에서 유래되는 다능성 또는 만능성 세포이다. 이들 세포는 급속 증식 및 많은 세포 계통으로의 분화능을 포함하는 만능성 줄기 세포에 특유한 특징을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 산후 줄기 세포는 혈액 유래(예를 들어, 제대혈로부터 수득되는 것들과 같음)이거나 비혈액(non-blood) 유래(예를 들어, 제대의 비혈액 조직으로부터 수득되는 것들과 같음)일 수 있다.

다양한 용어를 사용하여 배양 중인 세포를 기재한다. "세포 배양물"은 일반적으로 살아있는 유기체로부터 취해지고, "배양 조건" 하에서 성장되거나 "배양된" 세포를 지칭한다. 1차 세포 배양물은 첫 번째 계대 배양(subculture) 전에 유기체(들)로부터 직접 취한 세포, 조직 또는 기관의 배양물이다. 세포를 세포 성장 및/또는 분열을 용이하게 하는 조건 하에 성장 배지 중에 둘 때, 세포는 배양 중 증식되어서 더욱 큰 세포 집단을 생성한다. 세포가 배양 중 증식될 때, 세포 증식 속도는 때때로 세포수의 배가에 필요한 시간의 양으로 측정된다. 이는 "배가 시간(doubling time)"으로 지칭된다.

일반적으로 용어 "세포주"는 1차 세포 배양물의 하나 이상의 계대 배양에 의해 형성되는 세포의 집단을 말한다. 계대 배양의 각각의 라운드(round)는 계대로 지칭된다. 세포가 계대 배양될 때, 세포는 "계대된" 것으로 명명된다. 세포의 특정 집단, 또는 세포주는 때로는 그가 계대된 횟수를 말하거나 상기 횟수에 의해 특성화된다. 예를 들어, 10회 계대된 배양 세포 집단은 P10 배양물로서 지칭될 수 있다. 1차 배양, 즉 조직으로부터 세포를 단리한 후 첫 번째 배양을 P0으로 명명한다. 첫 번째 계대 배양 후에, 세포를 2차 배양이라고 한다(P1 또는 계대 1). 두 번째의 계대 배양 후, 세포는 3차 배양물(P2 또는 계대 2) 등이 된다. 당업자라면 계대 기간 동안 많은 집단의 배가가 있을 수 있으며, 따라서, 배양물의 집단 배가 수는 계대 수보다 크다는 것을 이해할 것이다. 계대 사이의 기간 동안 세포의 증식(즉, 집단 배가 수)은 씨딩(seeding) 밀도, 기질, 배지, 성장 조건 및 계대 간 시간을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 인자에 좌우된다.

"분화"는 특수화되지 않은 "미수임된(uncommitted)" 또는 덜 특수화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특수화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. "분화된" 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특수화된 "수임된" 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "수임된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 아형으로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경 하에서 다른 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. "탈분화"는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특수화된(또는 수임된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 세포의 "계통"은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다.

넓은 의미에서, "전구 세포"는 그 자체보다 더 분화되지만, 전구 세포의 풀(pool)을 보충하는 능력을 유지하는 자손을 생성하는 능력을 갖는 세포이다. 이 정의에 의하면, 줄기 세포 그 자체는 또한, 최종 분화된 세포에 대한 더 가까운 전구체가 그러하듯이, 전구 세포이다. 본 발명의 세포를 지칭하는 경우, 하기에 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 이러한 넓은 정의의 전구 세포가 사용될 수 있다. 좁은 의미에서, 전구 세포는 종종 분화 경로에서의 중간체인 세포로 정의되며, 다시 말하면, 이는 줄기 세포로부터 발생하고, 성숙 세포 유형 또는 세포 유형의 아형의 생성에서의 중간체이다. 이러한 유형의 전구 세포는 일반적으로 자가 재생할 수 없다. 따라서, 이러한 유형의 세포가 본 명세서에 지칭되는 경우, 이는 "비재생 전구 세포" 또는 "중간 전구 세포 또는 선구 세포"로 지칭될 것이다.

몇몇 용어가 세포 또는 조직 이식 또는 세포 대체 요법에 관하여 본 명세서에서 사용된다. 용어 "자가 전달(autologous transfer), "자가 이식", "자가이식편" 등은 이식 공여자가 세포 또는 이식 수여자이기도 한 요법을 말한다. 용어 "동종 전달(allogeneic transfer), "동종 이식", "동종이식편" 등은 이식 공여자가 이식 수여자와 동일한 종이나, 그 수여자는 아닌 이식을 말한다. 공여자 세포가 조직학적으로 수여자와 매치되는 세포 이식물은 때때로 동계 전달(syngeneic transfer)로 지칭된다. 용어 "이종 전달(xenogeneic transfer)", 이종 이식, 이종이식편 등은 이식 공여자가 이식 수여자와 상이한 종인 이식을 말한다.

"약제학적으로 허용가능한 담체" 또는 "약제학적으로 허용가능한 배지"라는 용어는 "생물학적으로 적합한 담체" 또는 "생물학적으로 적합한 배지"라는 용어와 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 일반적으로, 치료적으로 투여할 세포 및 다른 제제에 적합할 뿐만 아니라, 타당한 유익성/위험성 비율(benefit/risk ratio)에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 합병증 없이, 인간 및 동물의 조직과의 접촉 시에 사용하기에 적합한 시약, 세포, 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 말한다.

"조정 배지"는 특정 세포 또는 세포 집단이 배양된 다음 제거된 배지이다. 세포가 배지 중에 배양될 때, 세포들은 다른 세포에 영양적 지원(trophic support)을 제공할 수 있는 세포 인자를 분비할 수 있다. 이러한 영양 인자(trophic factor)에는 호르몬, 사이토카인, 세포외 매트릭스(ECM), 단백질, 소포, 항체 및 과립이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 세포 인자를 함유하는 배지는 조정 배지이다.

일반적으로, "영양 인자"는 세포의 생존, 성장, 증식 및/또는 성숙을 촉진하거나 세포의 활성 증가를 자극하는 물질로 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 "성장 배지"라는 용어는 일반적으로 산후 유래 세포의 배양에 충분한 배지를 말한다. 특히, 본 발명의 세포를 배양하기 위한 현재 바람직한 하나의 배지는 둘베코 변형 필수 배지(Dulbecco's Modified Essential Media, DMEM)를 포함한다. 특히 바람직한 것은 DMEM-저농도 글루코스(low glucose)(DMEM-LG)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))이다. DMEM-LG는 바람직하게는 혈청, 가장 바람직하게는 소 태아 혈청 또는 인간 혈청이 보충된다. 전형적으로, 15%(v/v) 소 태아 혈청(예를 들어, 규명된 소 태아 혈청, 미국 유타주 로간 소재의 하이클론(Hyclone))이 항생제/항진균제(antimycotic)(바람직하게는 100 유닛/밀리리터의 페니실린, 100 밀리그램/밀리리터의 스트렙토마이신 및 0.25 마이크로그램/밀리리터의 암포테리신 B(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐), 및 0.001%(v/v)의 2-머캅토에탄올(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma))와 함께 첨가된다. 일부 경우에, 상이한 성장 배지가 사용되거나, 상이한 보충물이 제공되며, 이들은 보통 성장 배지에 대한 보충물로서 텍스트에 설명되어 있다. 특정 화학적 규명 배지에서, 세포는 제시되는 혈청이 전혀 없이 성장할 수 있다. 이러한 경우에, 세포는 특정 성장 인자를 필요로 할 수 있으며, 이는 배지에 첨가되어 세포를 지원하고 지속시킬 수 있다. 무혈청 배지에서 성장시키기 위해 첨가되는 현재 바람직한 인자는 bFGF, EGF, IGF-I 및 PDGF 중 하나 이상을 포함한다. 더욱 바람직한 실시 형태에서, 2개, 3개 또는 4개 모두의 인자가 무혈청 또는 화학적 규명 배지에 첨가된다. 다른 실시 형태에서, LIF가 무혈청 배지에 첨가되어, 세포의 성장을 지원하거나 향상시킨다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표준 성장 조건"은 5% CO₂를 포함하는 표준 대기 및 약 100%로 유지된 상대 습도에서 37℃에서 세포를 배양하는 것을 말한다. 상기 조건이 배양에 유용하지만, 이러한 조건이 세포를 배양하기 위한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 이용가능한 옵션을 인식할 통상의 기술자에 의해 달라질 수 있음이 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 측정가능한 값, 예를 들어 양, 시간적 지속 등을 말할 때 용어 "약"은 특정된 값으로부터 ± 20% 또는 ± 10%, 더 바람직하게는 ± 5%, 더욱 더 바람직하게는 ± 1%, 그리고 더욱 더 바람직하게는 ± 0.1%의 변화를 포함함을 의미하며, 이와 같이 변화는 개시된 방법을 수행하기에 적합하다.

"유효량"이라는 용어는 특정 생물학적 결과를 달성하기에 효과적인, 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물, 물질 또는 조성물의 농도 또는 양을 말한다. 이러한 결과는 본 발명의 범위 내의 질환, 장애, 및 손상으로 인한 폐손상이 있는 환자에서의 골격 조직의 재생, 회복 또는 개선, 혈류의 향상, 및/또는 혈관형성의 자극 및/또는 지원을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 이러한 유효 활성은 예를 들어, 본 발명의 세포 및/또는 조성물을 본 명세서에 기재된 폐손상이 있는 환자에게 투여함으로써 달성될 수 있다. 생체 내에서 환자에로의 UTC의 투여에 관하여, 유효량은 수백개 이하 만큼 적은 양부터 수백만 이상 만큼 많은 양까지의 범위일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 유효량은 약 10³ 내지 약 10¹¹ 개, 더욱 구체적으로는 적어도 약 10⁴개의 세포의 범위일 수 있다. 투여될 세포수는 의학 생물학자에게 잘 알려진 기타 인자들 중 특히, 치료할 크기 또는 총 체적/표면적, 및 치료할 영역의 위치에 대한 투여 부위의 근접성을 포함하나 이들에 한정되지 않는 조절할 폐질환, 폐장애, 또는 폐손상의 병리에 관여하는 전염증성 매개체의 세부 사항에 따라 달라질 것임이 인식될 것이다.

"치료하다", "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 증상의 경감, 완화, 감소와 같은, 또는 손상, 병리 또는 상태를 환자가 더욱 견딜만하게 만들거나, 퇴화 또는 감퇴 속도를 늦추거나, 퇴화의 최종점을 덜 쇠약하게 만들거나, 대상의 신체적 또는 정신적 웰빙(well-being)을 개선시키거나, 생존 기간을 연장시키는 임의의 객관적인 또는 주관적인 파라미터를 비롯한, 손상, 병리 또는 상태의 약화 또는 개선의 성공 또는 성공 지표를 말한다. 증상의 치료 또는 개선은 객관적인 또는 주관적인 파라미터를 기반으로 할 수 있으며; 이는 신체 검사 또는 신경학적 검사의 결과를 포함한다.

"유효 기간", "유효 시간" 또는 "유효 조건"이라는 용어는 일반적으로 제제 또는 약제학적 조성물이 그의 의도된 결과를 달성하는데 필요하거나 바람직한 소정의 기간 또는 다른 제어가능한 조건(예를 들어, 시험관 내 방법을 위한 온도, 습도)을 말한다.

"개체", "환자" 또는 "대상"이라는 용어는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 약제학적 또는 치료적 조성물로 치료되거나, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 치료되는 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "매트릭스"는 일반적으로 세포와 함께 환자에게 투여되는 생분해성 및/또는 생흡수성 물질을 말한다. 매트릭스는 새로이 성장한 세포, 예컨대 골격근, 혈관 주위 세포, 혈관 평활근 또는 혈관 내피 조직에 의해 대체될 때까지 일시적 스캐폴드로 작용할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 매트릭스는 세포와 함께 사용되는 영양 제작물(trophic facture) 또는 다른 제제의 지속적인 방출을 가능하게 하며, 환자에서 조직 성장을 촉진시키기 위한 구조체를 제공할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 매트릭스는 단순히 조직을 발생시키기 위한 일시적 스캐폴드를 제공한다. 매트릭스는 미립자 형태이거나(직경 10 미크론 초과의 마크로입자(macroparticle) 또는 직경 10 미크론 미만의 마이크로입자(microparticle)), 구조적으로 안정한 3차원 이식물의 형태일 수 있다(예를 들어, 스캐폴드). 매트릭스는 예를 들어, 정육면체, 원통, 튜브, 블록, 필름, 시트 또는 적절한 해부학적 형태일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "스캐폴드"는 일반적으로 세포 성장을 위한 주형을 제공하는 3차원 다공성 구조체를 말한다. 스캐폴드는 체내에서 시간에 따라 분해되는 생분해성 및/또는 생흡수성 물질로 형성된다. 스캐폴드가 분해되는데 소요된 시간 길이는 상기 물질의 분자량에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 고분자량 물질은 폴리머 스캐폴드를 형성할 수 있으며, 장기간 구조적 완전성을 유지하게 되는 반면에; 저분자량 물질은 보다 지속적인 방출 및 보다 짧은 스캐폴드 수명을 초래한다. 스캐폴드는 당업계에 공지된 수단에 의해 제조될 수 있다. 스캐폴드를 형성하는데 사용될 수 있는 폴리머의 예에는 천연 및 합성 폴리머가 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리하다"는 세포가 그의 천연 환경으로부터 분리되었음을 말한다. 이 용어는 그의 천연 환경으로부터의 총체적인 물리적 분리, 예를 들어 공여 동물로부터의 제거를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 단리된 세포는 조직에 존재하지 않으며, 즉, 세포는 이것이 보통 접촉 상태로 있는 인접 세포로부터 분리되거나 해리되어 있다. 바람직하게는, 세포는 세포 현탁액로서 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "세포 현탁액"은 배지와 접촉한 상태로 있고, 예를 들어 조직의 조각을 부드럽게 미분화함으로써 해리된 세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조절하다"는 일반적으로 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리(예를 들어, 폐조직의 변화와 같은 질환의 징후)에 관여하는 전염증성 매개체의 생성, 활성, 및/또는 양을 조정하거나 조절하는 것을 의미한다. 일 실시 형태에서, 용어 "조절하다"는 전염증성 매개체의 생성을 감소시키는 것을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 용어 "조절하다"는 전염증성 매개체의 생성을 억제시키는 것을 포함한다.

본 명세서에 기재된 이의 다양한 실시 형태에서, 본 발명은 산후 조직, 특히 제대 조직으로부터 유래되는 세포 집단 및 전구 세포를 사용하는, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 전염증성 매개체의 생성을 조절(예를 들어, 감소 또는 억제)하기 위한 방법 및 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 이들 방법 및 약제학적 조성물은 이러한 전염증성 매개체의 생성을 조절하도록(감소시키고/시키거나 억제시키도록) 설계된다. 또한, 이들은 임의로 혈관형성의 자극 및 지원하고, 혈류를 향상시키며, 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상에 의해 손상된 폐조직을 재생, 회복 또는 개선시키고/시키거나, 이러한 질환, 장애 및/또는 손상으로부터 폐조직을 보호하기 위해 설계될 수 있다.

본 발명의 약제학적 제제 및 방법에 사용되는 세포, 세포 집단, 및 세포 용해물, 조정 배지 등을 포함하는 제제는 미국 특허 제7,524,489호 및 제7,510,873호, 및 미국 특허 출원 공개 제2005/0058634호, 및 또한 본 명세서에 상세히 기술되어 있다.

II. 제대 조직 유래 세포의 단리 및 성장

본 명세서에 기술된 방법에 따르면, 포유류 제대는 만기(full-term) 임신 또는 조산(pre-term) 임신 중절 시에 또는 그 중절 직후에, 예를 들어 출산 후 만출(expulsion) 이후에 포유류 제대가 회수된다. 산후 조직은 출산 위치에서 살균 컨테이너, 예를 들어, 플라스크, 비커, 배양 디쉬 또는 백(bag) 내에서 실험실로 수송될 수 있다. 용기는 식염수, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)(둘베코 최소 필수 배지(Dulbecco's Minimal Essential Medium)로도 공지되어 있음) 또는 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 이식을 위해 사용되는 기관의 수송에 사용되는 임의의 용액, 예를 들어, 위스콘신 대학 용액(University of Wisconsin solution) 또는 퍼플루오로 화합물 용액(perfluorochemical solution)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 용액 또는 배지를 가질 수 있다. 하나 이상의 항생제 및/또는 항진균제, 예를 들어, 비제한적으로, 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B, 젠타마이신 및 니스타틴이 배지 또는 완충제에 첨가될 수 있다. 산후 조직은 항응고(anticoagulant) 용액, 예를 들어, 헤파린 함유 용액으로 헹굴 수 있다. UTC의 추출 전에 조직을 약 4℃ 내지 약 10℃로 유지하는 것이 바람직하다. UTC 추출 이전에는 조직을 동결시키지 않는 것이 더욱 더 바람직하다.

UTC의 단리는 바람직하게는 무균 환경에서 일어난다. 제대는 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 수단에 의해 태반으로부터 분리될 수 있다. 혈액 및 잔사는 UTC의 단리 이전에 산후 조직으로부터 제거되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 산후 조직은 인산염 완충 식염수를 포함하지만 이에 한정되지 않는 완충액으로 세척될 수 있다. 세척 완충제는 또한 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B, 젠타마이신 및 니스타틴을 포함하나 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 항진균제 및/또는 항생제를 포함할 수 있다.

제대 또는 이의 단편 또는 절편을 포함하는 산후 조직은 바람직하게는 기계력(다지는(mincing) 힘 또는 전단력)에 의해 분해된다. 현재 바람직한 실시 형태에서, 단리 절차는 또한 효소 소화 과정을 이용한다. 복합 조직 매트릭스로부터의 개별 세포의 단리에 유용하여, 배양 중 성장을 용이하게 하는 많은 효소가 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있다. 소화 효소는 약한 소화력(예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제 및 중성 프로테아제, 디스파아제(dispase))으로부터 강한 소화력(예를 들어, 파파인 및 트립신)의 범위에 있으며, 시판되고 있다. 이러한 효소의 불완전 목록은 점액용해(mucolytic) 효소 활성, 메탈로프로테아제(metalloprotease), 중성 프로테아제, 세린 프로테아제(예를 들어, 트립신, 키모트립신 또는 엘라스타제) 및 데옥시리보뉴클레아제를 포함한다. 현재 바람직한 것은 메탈로프로테아제, 중성 프로테아제 및 점액용해 활성으로부터 선택되는 효소 활성이다. 예를 들어, 콜라게나제는 조직으로부터 다양한 세포를 단리하는데 유용한 것으로 공지되어 있다. 데옥시리보뉴클레아제는 단일 가닥 DNA를 소화시킬 수 있으며, 단리 동안 세포 응집(clumping)을 최소화시킬 수 있다. 바람직한 방법은 콜라게나제 및 디스파아제, 또는 콜라게나제, 디스파아제 및 히알루로니다제를 사용한 효소 처리를 포함한다. 통상의 기술자라면, 많은 이러한 효소 처리가 다양한 조직 공급원으로부터의 세포 단리용으로 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있으며, 새로운 또는 추가의 효소 또는 효소 조합을 본 발명의 세포의 단리에 있어서의 그 유용성에 대하여 평가하는데 준비가 잘 되어 있음을 인지할 것이다. 바람직한 효소 처리는 약 0.5 내지 2시간 걸리거나, 이보다 더 길게 걸릴 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조직은 해리 단계의 효소 처리 동안 약 37℃에서 인큐베이션된다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 산후 조직은 조직의 다양한 양상, 예를 들어, 태반의 신생아, 신생아/모계, 및 모체 양상을 포함하는 절편으로 분리된다. 이어서, 분리된 절편은 본 명세서에 기술된 방법에 따라 기계적 및/또는 효소적 해리에 의해 해리된다. 신생아 또는 모계 계통의 세포는 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해, 예를 들어, Y 염색체에 대한 원위치(in situ) 혼성화 또는 핵형 분석에 의해 동정될 수 있다.

단리된 세포는 세포 배양을 개시하거나 씨딩하기 위해 사용될 수 있다. 단리된 세포를 세포외 매트릭스 또는 리간드, 예를 들어 라미닌, 콜라겐(천연, 변성 또는 가교결합), 젤라틴, 피브로넥틴, 및 다른 세포외 매트릭스 단백질로 코팅되거나 코팅되지 않은 멸균 조직 배양 용기로 옮긴다. 상기 세포는 DMEM(고농도 또는 저농도 글루코스), 고급(advanced) DMEM, DMEM/MCDB 201, 이글 기본 배지(Eagle's basal medium), 햄 F10 배지(Ham's F10 medium; F10), 햄 F-12 배지(F12), 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium), 중간엽 줄기 세포 성장 배지(MSCGM), DMEM/F12, RPMI 1640, 및 상표명 "셀-그로-프리(CELL-GRO-FREE)"(미국 버지니아주 헌든 소재의 메디아테크, 인코포레이티드(Mediatech, Inc.)) 하에 시판되는 혈청 미함유 배지와 같은 그러나 이에 한정되지 않는, 세포의 성장을 지속시킬 수 있는 임의의 배양 배지에서 배양된다. 배양 배지에는 예를 들어, 소 태아 혈청(FBS), 바람직하게는 약 2 내지 15%(v/v); 말 혈청(ES); 인간 혈청(HS); 베타-메르캅토에탄올(BME 또는 2-ME), 바람직하게는 약 0.001%(v/v); 하나 이상의 성장 인자, 예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 상피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 백혈구 저해 인자(LIF) 및 에리트로포이에틴(EPO); L-발린을 포함하는 아미노산; 및 예를 들어, 단독의 또는 조합된 페니실린 G, 스트렙토마이신 설페이트, 암포테리신 B, 젠타마이신 및 니스타틴과 같은 미생물 오염 제어를 위한 하나 이상의 항생제 및/또는 항진균제를 포함하는 하나 이상의 성분이 보충될 수 있다. 배양 배지는 바람직하게는 성장 배지(예를 들어, DMF-M-저농도 글루코스, 혈청, BME 및 항생제)를 포함한다.

세포는 세포 성장을 허용하는 밀도로 배양 용기에 씨딩된다. 일 실시 형태에서, 세포는 공기 중의 약 0 체적% 내지 약 5 체적%의 CO₂에서 배양된다. 일부 다른 실시 형태에서, 세포는 공기 중의 약 2% 내지 약 25%의 O₂, 바람직하게는 공기 중의 약 5% 내지 약 20%의 O₂에서 배양된다. 세포는 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서 배양되며, 더욱 바람직하게는 37℃에서 배양된다. 세포는 바람직하게는 인큐베이터에서 배양된다. 배양 용기의 배지는 정지 상태이거나, 예를 들어, 생물반응기를 이용하여 교반될 수 있다. UTC는 바람직하게는 낮은 산화 스트레스(예를 들어, 글루타티온, 비타민 C, 카탈라아제, 비타민 E, N-아세틸시스테인의 첨가에 의해) 하에 성장된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "낮은 산화 스트레스"는 배양 세포에 대한 자유 라디칼 손상이 전혀 없거나 또는 최소인 조건을 말한다.

가장 적절한 배양 배지, 배지 제제 및 세포 배양 기술의 선택 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Doyle et al., (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester]; 및 문헌[Ho and Wang (eds.), 1991, Animal Cell Bioreactors, Butterworth-Heinemann, Boston]을 비롯한 다양한 자료에 기재되어 있다.

본 발명의 일부 실시 형태에서, UTC는 처음에 사용된 것과 동일하거나 상이한 유형의 신선한 배지를 함유하는 별도의 배양 용기로 계대되거나 옮겨지며, 여기서, 세포 집단은 유사 분열로 증식될 수 있다. 본 발명의 세포는 계대 0 내지 노화의 임의의 시점에서 사용될 수 있다. 세포는 바람직하게는 약 3 내지 약 25회 계대되며, 더 바람직하게는 약 4 내지 약 12회 계대되며, 바람직하게는 10 또는 11회 계대된다. 클로닝 및/또는 서브클로닝을 수행하여 세포의 클론 집단이 단리되었음을 확인할 수 있다.

본 발명의 일부 태양에서, 산후 조직에 존재하는 상이한 세포 유형은 UTC가 단리될 수 있는 아집단(subpopulation)으로 분획된다. 분획 또는 선택은 산후 조직을 그의 성분 세포로 해리시키기 위한 효소 처리를 포함하지만 이에 한정되지 않는 세포 분리를 위한 표준 기술에 이어서, 클로닝, 및 형태적 및/또는 생화학적 마커; 원하는 세포의 선택적 성장(양성 선택); 원하지 않는 세포의 선택적 파괴(음성 선택); 예를 들어, 대두 응집소를 사용하는 것과 같이 혼합된 집단에서 차별적 세포 응집성을 기반으로 한 분리; 동결-해동 절차; 혼합된 집단에서의 세포의 차별적 유착 특성; 여과; 통상적인 띠 원심분리; 원심 세정(역류 원심분리(counter-streaming centrifugation)); 단위 중력 분리(unit gravity separation); 역류 분배; 전기영동; 및 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS)에 기초한 선택을 포함하나 이들에 한정되지 않는 특정 세포 유형의 선택을 사용하여 달성될 수 있다.

배양 배지는 필요에 따라 예를 들어, 피펫을 사용하여 접시로부터 배지를 조심스럽게 흡인시키고, 신선한 배지를 보충함으로써 변경된다. 인큐베이션은 충분한 개수 또는 밀도의 세포가 접시에 축적될 때까지 계속된다. 그 후에 존재하는 원래의 외식된 조직 절편이 제거될 수 있으며, 나머지 세포는 표준 기술을 이용하거나 셀 스크레이퍼(cell scraper)를 사용하여 접시를 트립신처리하여 분리될 수 있다. 트립신처리 후에, 세포를 수집하고, 신선한 배지로 옮기고, 상기와 같이 인큐베이션시킨다. 일부 실시 형태에서, 배지는 트립신처리 후 약 24시간 후에 적어도 1회 교체하여, 임의의 부유 세포를 제거한다. 배양액에 잔존하는 세포는 UTC인 것으로 여겨진다.

UTC는 동결보존될 수 있다. 따라서, 하기에 더욱 상세히 기술된 바람직한 실시 형태에서, 자가 전달(어미 또는 아이 중 어느 하나)을 위한 UTC를 아이의 출산 후에 적절한 산후 조직으로부터 얻은 다음에, 동결보존시켜 이들이 이후에 이식을 위해 필요한 경우에 이용가능하게 될 수 있다.

III. 제대 조직 유래 세포의 특성

본 발명의 방법, 용도, 약제학적 조성물 및 키트에 적합한 제대 조직으로부터 유래되는 예시적인 UTC가 2004년 6월 10일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection(ATCC), 미국 버지니아주 머내서스 유니버시티 불르바르 10801 소재)에 기탁되었으며, 다음과 같이 ATCC 수탁 번호가 지정되었다: (1) 균주명(strain designation) UMB 022803(P7)은 수탁 번호 PTA-6067이 지정되었으며; (2) 균주명 UMB 022803(P17)은 수탁 번호 PTA-6068이 지정되었다.

UTC는 예를 들어, 성장 특성(예를 들어, 집단 배가 능력, 배가 시간, 노화까지의 계대), 핵형 분석(예를 들어, 정상 핵형; 모계 또는 신생아 계통), 유세포 분석법(예를 들어, FACS 분석법), 면역조직화학법 및/또는 면역세포화학법(예를 들어, 에피토프 검출을 위한 것), 유전자 발현 프로파일링(예를 들어, 유전자 칩 어레이; 폴리머라아제 연쇄 반응(예를 들어, 역전사 효소 PCR, 실시간 PCR 및 통상적인 PCR)), 단백질 어레이, 단백질 분비(예를 들어, 혈장 응고 검정 또는 PDC-조정 배지의 분석에 의해, 예를 들어 효소 결합 면역 흡착 측정법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)에 의해), 혼합 림프구 반응(예를 들어, PBMC의 자극의 척도로서), 및/또는 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지된 다른 방법에 의해 특징지어질 수 있다.

이로써, 본 발명에 사용하기에 적합한 UTC는 하기 특성 중 하나 이상의 조합에 의해 정의된다: (1) 성장 특징; (2) 특정 단백질의 생성; (3) 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 유전자 발현이 특정 유전자에 대해 증가됨; (4) 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 유전자 발현이 특정 유전자에 대해 감소되는 것을 특징으로 함; (5) 영양 인자의 분비 또는 분비 부족; (6) hTERT 또는 텔로머라아제가 발현되지 않음.

본 발명의 일 실시 형태에서, UCT는 하기 성장 특징 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다: 이들이 배양 중 성장을 위해 L-발린을 필요로 하는 특징; 이들이 약 5% 내지 약 20%의 산소를 함유하는 분위기에서 성장할 수 있는 특징; 이들이 노화에 도달하기 전에 배양 중 적어도 약 40회의 배가 능력을 가질 수 있는 특징; 및 이들이 코팅되지 않거나, 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리오르니틴, 비트로넥틴 또는 피브로넥틴으로 코팅된 조직 배양 용기 상에 부착 및 증식되는 특징. 특정 실시 형태에서, UTC는 또한 정상 핵형을 가질 수 있으며, 이는 세포가 계대됨에 따라 유지된다. 핵형 분석 방법은 당업자가 이용가능하며, 당업자에게 공지되어 있다.

다른 실시 형태에서, UTC는 조직 인자, 비멘틴 및 알파-평활근 액틴 중 적어도 하나의 생성; 및 (2) 유세포 분석법에 의해 검출시, CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-알파, PD-L2 및 HLA-A,B,C 세포 표면 마커 중 적어도 하나의 생성을 포함하는 특정 단백질의 생성을 특징으로 할 수 있다. 다른 실시 형태에서, UTC는 유세포 분석법에 의해 검출시, CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G 및 HLA-DR,DP,DQ 세포 표면 마커 중 적어도 하나의 생성의 결여를 특징으로 할 수 있다. 일 실시 형태에서, 세포는 CD45 및 CD117의 생성의 결여를 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 조직 인자, 비멘틴 및 알파-평활근 액틴 중 적어도 두 가지를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 세포는 단백질 조직 인자, 비멘틴 및 알파-평활근 액틴 중 세 가지 모두를 생성한다.

다른 실시 형태에서, UTC는 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 인터류킨 8; 레티큘론 1; 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 1(흑색종 성장 자극 활성, 알파); 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 6(과립구 주화성 단백질 2); 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 3; 종양 괴사 인자, 알파 유도 단백질 3 중 적어도 하나를 암호화하는 유전자에 대한 증가된 유전자 발현을 특징으로 할 수 있다. 일 실시 형태에서, UTC는 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 인터류킨 8, 레티큘론 1, 및 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 3; 종양 괴사 인자 중 적어도 하나를 암호화하는 유전자에 대한 증가된 유전자 발현을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 실시 형태에서, UTC는 또한 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 쇼트 스태쳐 호메오박스(short stature homeobox) 2; 열충격 27 kDa 단백질 2; 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 12(간질 세포 유래 인자 1); 엘라스틴(판상부대동맥협착증, 윌리암스-보이렌 증후군(Williams-Beuren syndrome)); 호모 사피엔스 mRNA; cDNA DKFZp586M2022(클론 DKFZp586M2022 유래); 중간엽 호메오 박스 2(성장 정지 특이적 호메오 박스); 사인 오쿨리스(sine oculis) 호메오박스 상동체 1(드로소필라(Drosophila)); 크리스탈린(crystallin), 알파 B; DAAM 2(dishevelled associated activator of morphogenesis 2); DKFZP586B2420 단백질; 시밀러 투 뉴랄린(similar to neuralin) 1; 테트라넥틴(플라스미노겐 결합 단백질); src 호몰로지 3(src homology three; SH3) 및 시스테인 풍부 도메인; 콜레스테롤 25-하이드록실라아제; runt-관련 전사 인자 3; 인터류킨 11 수용체, 알파; 프로콜라겐 C-엔도펩티다아제 인핸서(enhancer); 프리즐드 상동체(frizzled homolog) 7(드로소필라); 가상 유전자 BC008967; 콜라겐, 제VIII형, 알파 1; 테나신 C(헥사브라키온); 이로쿼이(iroquois) 호메오박스 단백질 5; 헤파에스틴; 인테그린, 베타 8; 시냅스 소포 당단백질 2; 신경아세포종, 종양 형성 억제 1; 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 2, 36 kDa; 호모 사피엔스 cDNA FLJ12280 fis, 클론 MAMMA1001744; 사이토카인 수용체 유사 인자 1; 칼륨 중간체/작은 전도도의 칼슘 활성화 채널, 서브패밀리 N, 구성원 4; 인테그린, 베타 7; PDZ 결합 모티프를 갖는 전사 보조 활성화 인자(TAZ); 사인 오쿨리스 호메오박스 상동체 2(드로소필라); KIAA1034 단백질; 소포 관련 막 단백질 5(미오브레빈); EGF 함유 피불린 유사 세포외 매트릭스 단백질 1; 초기 성장 반응 3; 디스탈-레스 호메오박스(distal-less homeo box) 5; 가상 단백질 FLJ20373; 알도-케토 리덕타아제 패밀리 1, 구성원 C3(3-알파 하이드록시스테로이드 데하이드로게나아제, 제II형); 바이글리칸; PDZ 결합 모티프를 갖는 전사 보조 활성화 인자(TAZ); 피브로넥틴 1; 프로엔케팔린; 인테그린, 베타 유사 1(EGF 유사 반복 도메인을 포함함); 호모 사피엔스 mRNA 전장 인서트 cDNA 클론 유로이미지(EUROIMAGE) 1968422; EphA3; KIAA0367 단백질; 나트륨이뇨 펩티드 수용체 C/구아닐레이트 사이클라아제 C(심방 나트륨이뇨 펩티드 수용체 C); 가상 단백질 FLJ14054; 호모 사피엔스 mRNA; cDNA DKFZp564B222(클론 DKFZp564B222 유래); BCL2/아데노바이러스 E1B 19 kDa 상호작용 단백질 3 유사; AE 결합 단백질 1; 및 사이토크롬 c 옥시다아제 서브유닛 VIIa 폴리펩티드 1(근육) 중 적어도 하나를 암호화하는 유전자에 대한 감소된 유전자 발현을 특징으로 할 수 있다.

다른 실시 형태에서, UTC는 세포가 배양 시험관 내에서 배양되는 경우에 검출되는 MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1β, I309, MDC, RANTES, 및 TIMP 중 적어도 하나의 분비를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시 형태에서, UTC는 세포가 배양 시험관 내에서 배양되는 경우에, 예를 들어 ELISA에 의해 검출되는 TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MIP1α 및 VEGF 중 적어도 하나의 분비 부족을 특징으로 할 수 있다.

바람직한 실시 형태에서, 세포는 hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 따라서, 본 발명의 일 실시 형태는 hTERT 또는 텔로머라아제(hTert)를 발현하지 않고, 본 명세서에 개시된 특성 중 하나 이상을 갖는 제대 유래 세포이다.

바람직한 실시 형태에서, 세포는 상기에 열거된 특성 중 두 가지 이상을 포함한다. 상기 특성들 중 세 가지, 네 가지, 다섯 가지 또는 그 이상을 포함하는 세포가 더 바람직하다. 상기 특성들 중 여섯 가지, 일곱 가지, 여덟 가지, 아홉 가지, 열 가지, 열 한가지 또는 그 이상을 포함하는 UTC가 더욱 더 바람직하다. 상기 특성들 전부를 포함하는 세포가 더 바람직하다.

일 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 제대 조직으로부터 유래되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, 성장을 위하여 L-발린을 필요로 하고, 적어도 약 5%의 산소에서 성장할 수 있으며, 하기 특성 중 적어도 하나를 포함한다: (1) 배양 중 적어도 약 40회의 배가 능력; (2) 코팅되지 않은 조직 배양 용기, 또는 젤라틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리오르니틴, 비트로넥틴 또는 피브로넥틴으로 코팅된 조직 배양 용기 상에 부착 및 증식되는 능력; (3) 비멘틴 및 알파-평활근 액틴의 생성; (4) CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90의 생성; 및 (5) 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 인터류킨 8 및 레티큘론 1을 암호화하는 유전자에 대한 증가된 유전자의 발현. 일부 실시 형태에서, 이러한 UTC는 CD45 및 CD117을 생성하지 않는다.

일 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. UTC는 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) CD31, CD34 또는 CD45를 발현하지 않고/않거나; (iii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하고/하거나; (iv) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖고/갖거나; (v) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현한다.

다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117 또는 CD45의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 이들 UTC는 임의로, 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; CD31 또는 CD34를 발현하지 않고/않거나; 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하고/하거나; 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖고/갖거나; CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90을 발현한다.

본 발명의 다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117 및 CD45의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 이들 UTC는 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) CD31 또는 CD34를 발현하지 않고/않거나; (iii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하고/하거나; (iv) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖고/갖거나; (v) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현한다.

다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117 및 CD45의 생성이 결여되며, hTERT 및 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 이들 UTC는 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) CD31 또는 CD34를 발현하지 않고/않거나; (iii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하고/하거나; (iv) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖고/갖거나; (v) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현한다.

다른 실시 형태에서, 세포는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117, CD34, CD31의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 이들 UTC는 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) CD45를 발현하지 않고/않거나; (iii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하고/하거나; (iv) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖고/갖거나; (v) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현한다.

또 다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117, CD45, CD34, CD31의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. UTC는 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하고/하거나; (iii) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖고/갖거나; (iv) CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90을 발현한다.

다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117, CD45, CD34, CD31의 생성이 결여되며, hTERT 및 텔로머라아제를 발현하지 않는다. UTC는 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하고/하거나; (iii) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖고/갖거나; (iv) CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90을 발현한다.

또 다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, 하기 특성들을 갖는다: CD117 및 CD45의 생성의 결여; hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않음; 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3의 발현; 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1의 발현; 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 가짐; 및 CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90의 발현. 다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, 하기 특성들을 갖는다: CD117 및 CD45의 생성의 결여; hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않음; 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1의 발현; 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 가짐; 및 CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90의 발현. 또 다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, 하기 특성들을 갖는다: CD117 및 CD45의 생성의 결여; hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않음; 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1의 발현; 및 CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90의 발현.

또 다른 실시 형태에서, UTC는 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, 하기 특성들을 갖는다: 배양 중 적어도 약 40회의 배가 능력; CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-알파, PD-L2 및 HLA-A,B,C의 생성; 유세포 분석법에 의해 검출시, CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, 및 HLA-DR,DP,DQ의 생성의 결여; 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 인터류킨 8, 레티큘론 1, 및 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 3의 증가된 발현; 및 hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는 것.

상술한 UTC는 폐질환을 앓고 있는 환자에서 상기 폐질환의 전염증성 매개체의 생성을 조절(예를 들어, 감소 및/또는 억제)하는 방법에 사용될 수 있다. 이들은 또한 폐질환을 앓고 있는 환자에서 상기 폐질환의 전염증성 매개체의 생성을 조절(예를 들어, 감소 및/또는 억제)하기 위해 약제학적 조성물에 사용될 수 있으며, 예를 들어 이러한 조성물은 이들 특성을 갖는 세포 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 본 명세서에 기술되고 예시된 바와 같은 이러한 방법 및 약제학적 조성물을 형성하고, 사용하며, 실시하기 위한 키트에 사용될 수 있다. 또한, 상술한 UTC를 사용하여, 제제, 예를 들어, 본 명세서에 기술되고 예시된 바와 같은 이러한 방법 및 약제학적 조성물을 형성하고, 사용하며, 실시하기 위해 사용될 수 있는 세포 추출물 및 준세포 분획을 제조할 수 있다.

다양한 표현형에 이르게 되는 방식으로 분화되는 잠재력을 갖는 소정 세포는 불안정하며, 따라서 자발적으로 분화될 수 있다. 예를 들어, 근아세포, 골격근, 혈관 평활근, 혈관 주위 세포, 혈관 발생, 혈관 형성, 맥관 형성(vasculogenic) 또는 혈관 내피 계통을 따라 자발적으로 분화하지 않는 UTC가 본 발명에 사용하기에 현재 바람직하다. 성장 배지에서 성장시킬 때, 바람직한 세포는 그들의 표면 상에서 생성되는 세포 마커와 관련하여, 그리고 다양한 유전자의 발현 패턴과 관련하여 실질적으로 안정한데, 예를 들어 이는 상표명 "진칩(GENECHIP)" (미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 아피메트릭스, 인코포레이티드(Affymetrix, Inc.)) 하에 시판되는 의료 진단 시험을 사용하여 결정되는 바와 같다. 세포는 다수의 집단 배가를 통한 계대 시에, 예를 들어 그 표면 마커 특징이 실질적으로 일정하게 유지된다.

IV. 제대 조직 유래 세포 집단

본 발명의 다른 태양은 폐질환이 있는 환자에서 전염증성 매개체의 생성을 감소시키는데(또는 심지어는 생성을 억제시키는데) 있어서의 상술한 UTC 집단의 용도를 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 세포 집단은 불균질할 수 있다. 본 발명의 불균질한 세포 집단은 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 본 발명의 UTC를 포함할 수 있다. 본 발명의 불균질한 세포 집단은 줄기 세포 또는 다른 전구 세포, 예를 들어 근아세포 또는 다른 근육 전구 세포, 혈관아세포 또는 혈관 전구 세포를 추가로 포함할 수 있거나; 또는 이것은 완전히 분화된 골격근 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 또는 혈관 내피 세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 집단은 실질적으로 균질하며, 즉, 실질적으로 오직 UTC 만을 포함한다(바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 UTC). 본 발명의 균질한 세포 집단은 제대 유래 세포로 구성된다. 제대 유래 세포의 균질한 집단에는 바람직하게는 모계 계통의 세포가 없다. 세포 집단의 균질성은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 세포 분류(cell sorting)(예를 들어, 유세포 분석법)에 의해, 또는 공지되어 있는 방법에 따른 클론 증식에 의해 달성될 수 있다. 균질한 UTC 집단은 산후 유래 세포의 클론 세포주를 포함할 수 있다. 이러한 집단은 매우 바람직한 기능성을 지닌 세포 클론이 단리되는 경우에 특히 유용하다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 실질적으로 균질한 UTC 집단이 사용된다. 일 실시 형태에서, 이러한 실질적으로 균질한 집단은 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는 UTC를 포함한다. UTC는 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) CD31, CD34 또는 CD45를 발현하지 않고/않거나; (iii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하고/하거나; (iv) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖고/갖거나; (v) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현한다. 다른 실시 형태에서, 상기 집단은 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117 및 CD45의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는 UTC를 포함한다. UTC는 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) CD31 또는 CD34를 발현하지 않고/않거나; (iii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하고/하거나; (iv) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖고/갖거나; (v) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현한다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 상기 집단은 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117, CD34 및 CD31의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는 UTC를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 집단은 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117, CD45, CD34, CD31 및/또는 텔로머라아제의 생성이 결여된다. 다른 실시 형태에서, 제대 유래 세포의 실질적으로 균질한 집단은 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, 하기 특성을 갖는다: 배양 중 적어도 약 40회의 배가 능력; CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-알파, PD-L2 및 HLA-A,B,C의 생성; CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, 및 HLA-DR,DP,DQ의 생성의 결여; 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 인터류킨 8, 레티큘론 1, 및 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 3의 증가된 발현; 및 hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않음.

본 발명의 다른 실시 형태에서, UTC의 균질한 집단이 시용된다. 일 실시 형태에서, 이러한 균질한 집단은 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는 UTC를 포함한다. 상기 집단은 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) CD31, CD34 또는 CD45를 발현하지 않고/않거나; (iii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하고/하거나; (iv) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖고/갖거나; (v) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현한다. 또 다른 실시 형태에서, 균질한 UTC 집단은 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117 및 CD45의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 상기 집단은 임의로, (i) 산화 저밀도 리포단백질 수용체 1, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3, 및/또는 과립구 주화성 단백질을 발현하고/하거나; (ii) CD31 또는 CD34를 발현하지 않고/않거나; (iii) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하고/하거나; (iv) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖고/갖거나; (v) CD10, CD13, CD44, CD73 및 CD90을 발현한다. 또 다른 실시 형태에서, 균질한 UTC 집단은 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117, CD34, CD31, 및/또는 텔로머라아제의 생성이 결여된다. 또 다른 실시 형태에서, 균질한 집단은 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, CD117, CD45, CD34, 및 CD31의 생성이 결여되며, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 다른 실시 형태에서, 제대 유래 세포의 실질적으로 균질한 집단은 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되며, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하고, 하기 특성을 갖는다: 배양 중 적어도 약 40회의 배가 능력; CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-알파, PD-L2 및 HLA-A,B,C의 생성; CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, 및 HLA-DR,DP,DQ의 생성의 결여; 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포인 인간 세포에 비하여, 인터류킨 8, 레티큘론 1, 및 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 3의 증가된 발현; 및 hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않음.

또한 하나 이상의 인자의 존재 하에, 또는 혈관 평활근, 혈관 내피, 또는 혈관 주위 세포 경로를 따른 줄기 세포 분화를 자극하는 조건 하에 인큐베이션시킨 세포 집단의 용도가 본 명세서에 제공된다. 이러한 인자는 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있으며, 통상의 기술자는 분화에 적절한 조건의 결정이 통상의 실험으로 달성될 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 조건의 최적화는 통계적 실험 설계 및 분석에 의해 달성될 수 있으며, 예를 들어, 반응 표면 방법(response surface methodology)은 예를 들어, 생물학적 배양에서의 다수의 변수의 동시 최적화를 가능하게 한다. 현재 바람직한 인자에는 성장 또는 영양 인자, 케모카인, 사이토카인, 세포 산물, 탈메틸화제, 및 예를 들어, 혈관형성, 혈구혈관발생(hemangiogenic), 맥관형성, 골격근, 혈관 평활근, 혈관 주위 세포, 또는 혈관 내피 경로 또는 계통의 분화를 자극하는 것으로 현재 알려져 있거나, 이후에 결정되는 다른 자극이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

V. 제대 조직 유래 세포의 유전자 변형

UTC는 또한 유전자적으로 변형되어, 치료적으로 유용한 유전자 산물을 생성하는데, 예를 들어, 추가의 혈관 형성 또는 성장을 용이하게 하거나 지원하기 위한 혈관형성제를 생성하거나, 내피 전구 세포를 폐손상의 부위로 동원하는 인자를 생성할 수 있다. 내피 전구 세포는 특히 허혈 사건 후에 맥관형성 및 혈류를 용이하게 한다(문헌[Urbich C and Dimmeler S., Circ. Res., 2004; 95:343-53]). 내피 세포 동원의 역할을 수행하는 인자에는 VEGF, 기질 유래 인자-1(SDF-1), 에리트로포이에틴(EPO), G-CSF, 스타틴, 에스트로겐, PPAR-γ, CXCR4, FGF 및 HGF가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 유전자 변형은 임의의 다양한 벡터를 사용하여 달성될 수 있으며, 상기 벡터는 통합 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터; 비통합 복제 벡터, 예를 들어 파필로마 바이러스 벡터, SV40 벡터, 아데노바이러스 벡터; 또는 복제 결손 바이러스 벡터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. DNA를 세포 내로 도입하는 다른 방법은 리포좀, 전기천공, 입자 총(particle gun)의 사용 또는 직접적 DNA 주입에 의한 것을 포함한다.

숙주 세포는 바람직하게는 선택가능 마커, 및 특히 프로모터 또는 인핸서 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위와 같은 하나 이상의 적절한 발현 조절 요소에 의해 조절되는 또는 상기 발현 조절 요소와 조작적으로 결합하여 DNA로 형질전환되거나 또는 트랜스펙션된다. 삽입된 유전자가 발현되게 하기 위하여 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 프로모터는 CMV 프로모터/인핸서, SV40, 파필로마바이러스, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 또는 엘라스틴 유전자 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 대상 유전자의 발현의 조절에 사용되는 조절 요소는, 산물이 생체 내에서 필요할 때에만 합성되도록 유전자의 조절된 발현을 가능하게 할 수 있다. 일시적 발현이 요구될 경우, 바람직하게는 구성적(constitutive) 프로모터가 비통합 및/또는 복제 결손 벡터에서 사용된다. 대안적으로, 필요할 경우, 삽입된 유전자가 발현되게 하기 위하여 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 유도성 프로모터는 메탈로티오네인 및 열충격 단백질과 관련된 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

외래 DNA의 도입 이후, 조작된 세포를 강화 배지에서 성장시키고, 그 후 선택 배지로 전환시킬 수 있다. 외래 DNA 내의 선택가능 마커는 선택에 대한 내성을 부여하며, 세포가 예를 들어, 플라스미드 상에서와 같이 외래 DNA를 그의 염색체 내에 안정하게 통합시켜서 성장시켜 증식소(foci)를 형성하게 하는데, 이는 결국 클로닝되고 세포주로 증식될 수 있다. 이러한 방법은 유전자 산물을 발현하는 세포주를 조작하기 위하여 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 세포는 이식 부위에서 염증 또는 거부를 촉진하는 인자의 발현을 "넉아웃(knock out)" 또는 "넉다운(knock down)"시키도록 유전자 조작될 수 있다. 표적 유전자 발현 수준 또는 표적 유전자 산물 활성 수준을 감소시키는 음성 조정 기술은 하기에 논의되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "음성 조절"은 조절 처리의 부재 하에서의 표적 유전자 산물의 수준 및/또는 활성에 비하여 표적 유전자 산물의 수준 및/또는 활성의 감소를 말한다. 골격근 세포, 혈관 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 혈관 내피 세포 또는 이의 전구 세포의 고유의 유전자의 발현은 예를 들어, 상동성 재조합 기술을 사용한 유전자의 불활성화에 의한 발현의 저해를 포함하는 다수의 기술을 사용하여 감소되거나 넉아웃될 수 있다. 전형적으로, 중요한 단백질 영역을 암호화하는 엑손(exon)(또는 상기 영역에 대하여 5'인 엑손)은 양성 선택가능 마커, 예를 들어 neo가 개재되며, 이는 표적 유전자로부터의 정상 mRNA의 생성을 방지하여 이 유전자를 불활성화시킨다. 또한 유전자는 유전자의 일부에서의 결실의 생성에 의해 또는 전체 유전자의 결실에 의해 불활성화될 수 있다. 게놈 내에서 멀리 떨어져 있는, 표적 유전자에 대하여 상동성인 두 영역을 지닌 구축물을 사용함으로써, 상기 두 영역에 개재된 서열을 결실시킬 수 있다(문헌[Mombaerts et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1991; 88:3084-87]). 또한, 안티센스, DNAzyme, 리보자임, 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 표적 유전자의 발현을 저해하는 기타 이러한 분자를 사용하여, 표적 유전자 활성의 수준을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 주요 조직적합성 유전자 복합체(histocompatibility gene complex; HLA)의 발현을 저해하는 안티센스 RNA 분자는 면역 반응과 관련하여 가장 다재다능한 것으로 밝혀졌다. 또한 추가로, 삼중 나선 분자가 표적 유전자 활성 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다.

VI. 제대 조직 유래 세포로부터 제조된 세포 용해물 및 세포 용해성 분획.

다른 태양에서, 본 발명은 UTC 또는 UTC를 포함하는 불균질하거나 균질한 세포 집단뿐만 아니라, 골격근, 혈관 평활근, 혈관 주위 세포 또는 혈관 내피 경로를 따라 분화하도록 유전자적으로 변형되거나 자극된 UTC 또는 이의 집단으로부터 제조된 세포 용해물 및 세포 용해성 분획을 사용한다. 이러한 용해물 및 이의 분획은 다수의 효용을 갖는다. 예를 들어, 생체 내 세포 용해물 용해성 분획(즉, 실질적으로 막이 없음)의 사용은 거부 또는 기타 불리한 면역 반응을 일으킬 것 같은 상당한 양의 세포 표면 단백질을 도입하지 않고, 환자에서 유익한 세포내 환경이 동종 간에 사용되게 한다. 세포의 용해 방법은 본 발명이 속한 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 기계적 파괴, 효소적 파괴 또는 화학적 파괴 또는 이들의 조합의 다양한 수단을 포함한다. 이러한 세포 용해물은 직접적으로 이들의 성장 배지 중 세포로부터 제조되어, 이에 따라, 분비된 성장 인자 등을 함유하거나, 배지가 없는 세척된, 예를 들어, PBS 또는 기타 용액 중 세포로부터 제조될 수 있다. 세척된 세포는 원래 집단 밀도보다 더 큰 농도로 재현탁될 수 있다.

일 실시 형태에서, 전 세포 용해물은 예를 들어, 이후의 세포 분획의 분리 없이, 세포를 파괴시킴으로써 제조된다. 다른 실시 형태에서, 세포막 분획은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있는 통상적인 방법, 예를 들어, 원심분리, 여과 또는 유사 방법에 의해 세포의 용해성 분획으로부터 분리된다.

산후 유래 세포 집단으로부터 제조된 세포 용해물 또는 세포 용해성 분획은 그대로 사용되거나, 예를 들어, 한외여과 또는 동결건조에 의해 추가로 농축되거나, 또는 심지어는 건조되거나, 부분 정제되거나, 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있는 바와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 배합되거나, 다른 화합물, 예를 들어, 생물학적 제제, 예컨대 약제학적으로 유용한 단백질 조성물과 배합될 수 있다. 세포 용해물 또는 이의 분획은 시험관 내에서 또는 생체 내에서, 단독으로, 또는 예를 들어, 자가 또는 동계 생세포와 함께 사용될 수 있다. 생체 내에 도입되는 경우, 용해물은 예를 들어, 필요한 세포 성장 인자를 환자에 제공하기 위해, 치료 부위에 국소로 또는 멀리서 도입될 수 있다. 생체 내에서의 세포 용해물의 사용은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가는 본 발명의 범위 내에서 용해물을 사용하기 위한 필요한 단계를 인지할 것이다.

VII. 제대 조직 유래 세포를 포함하는 약제학적 조성물 및 매트릭스

다른 태양에서, 본 발명은 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 전염증성 매개체의 조절을 위한 다양한 방법에서 UTC, UTC 집단, UTC 성분, 및 UTC 산물을 사용하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시 형태는 생세포(단독의 또는 다른 세포 유형과 혼합된 UTC)를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 다른 실시 형태는 UTC 세포 성분(예를 들어, 세포 용해물, 용해성 세포 분획, 조정 배지, ECM 또는 상기의 것 중 임의의 것의 성분) 또는 산물(예를 들어, UTC에 의해 자연적으로, 또는 유전자 변형을 통해 생성되는 영양 인자 및 기타 생물학적 인자, UTC 배양으로부터의 조정 배지)을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 UTC 성분 및 산물은 미국 특허 제7,524,489호 및 제7,510,873호, 및 미국 특허 출원 공개 제2005/0058634호에 기재되어 있으며, 본 명세서에 참조로 포함된다. 어느 경우에도, 약제학적 조성물은 다른 활성 작용제, 예를 들어, 본 발명이 속한 기술 분야에 알려져 있는 바와 같은 항염증제, 항세포사멸제, 항산화제, 성장 인자, 근육영양 인자(myotrophic factor), 또는 근육재생 또는 근육보호 약물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 hUTC 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체는 액체, 반고체(예를 들어, 겔) 및 고체 물질(예를 들어, 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 명세서에 보다 상세히 기술되어 있는 세포 스캐폴드 및 매트릭스, 튜브 시트 및 기타 이러한 물질)을 포함한다. 이들 반고체 및 고체 물질은 체 내의 분해에 저항성을 나타내도록 설계되거나(비생분해성) 또는 이들은 체 내에서 분해되도록 설계될 수 있다(생분해성, 생부식성). 생분해성 물질은 추가로 생재흡수성(bioresorbable) 또는 생흡수성(bioabsorbable)일 수 있으며, 다시 말하면, 이는 용해되고 체액으로 흡수되거나(수용성 임플란트가 일례이다), 분해되고, 다른 물질로의 전환, 또는 천연 경로를 통한 분해 및 제거에 의해 궁극적으로 신체로부터 제거될 수 있다. 생분해율은 일단 체 내에 이식되면, 원하는 방출률에 따라 달라질 수 있다.

UTC 생세포를 포함하는 약제학적 조성물은 전형적으로, 액체, 반고체(예를 들어, 겔) 또는 고체(예를 들어, 혈관 또는 폐조직 공학에 적합한 것으로, 매트릭스, 스캐폴드 등)로 제형화된다. 액체 조성물은 표적 혈관 또는 폐조직 조직으로의 생세포의 전달을 달성하기 위해 본 발명이 속한 기술 분야에 알려져 있는 임의의 허용가능한 경로에 의한 투여를 위해 제형화된다. 전형적으로, 이들에는 확산 방식의, 또는 주사바늘이 있는 주사기 및/또는 펌프 장치가 있거나 이것이 없는 카테터를 통한 근육내, 정맥내 또는 동맥내 전달을 포함하나 이들에 한정되지 않는 투여 경로에 의한 폐손상, 폐상해, 또는 폐통증의 부위에 표적화된 주사 또는 주입이 포함된다.

반고체 또는 고체 담체 중 생세포를 포함하는 약제학적 조성물은 폐손상, 폐상해, 또는 폐통증의 부위에서의 수술에 의한 이식을 위해 제형화된다. 액체 조성물이 또한 수술 절차에 의해 투여될 수도 있음이 인식될 것이다. 특정 실시 형태에서, 반고체 또는 고체 약제학적 조성물은 반투과성 겔, 격자(lattice), 세포 스캐폴드 등을 포함할 수 있으며, 이는 비생분해성이거나 생분해성일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시 형태에서, 외인성 세포를 그들의 주변으로부터 격리시켜, 생물학적 분자(예를 들어, 근육영양 인자, 혈관영양(angiotrophic) 인자 또는 내피 전구 세포 동원 인자)가 주변 폐조직 또는 혈관 세포로 분비되고 전달되게 하는 것이 바람직하거나 적절할 수 있다. 이들 실시 형태에서, 세포는 이식된 세포를 숙주 조직으로부터 물리적으로 분리시키는, 비분해성이며 선택적으로 투과성인 장벽(barrier)에 의해 둘러싸인 UTC를 포함하는 세포 집단 또는 UTC 생세포를 포함하는 자가 이식물로 제형화될 수 있다. 이러한 이식물은 때때로 "면역보호"로 지칭되는데, 이들이 약리학적으로 유도된 면역억제의 부재 하에 면역 세포 및 거대분자가 이식된 세포를 사멸시키는 것을 방지하는 능력을 갖기 때문이다.

다른 실시 형태에서, 다양한 상이한 종류의 분해성 겔 및 네트워크가 약제학적 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 서방형 제형에 특히 적합한 분해성 물질은 생체적합성(biocompatible) 폴리머, 예를 들어, 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 메틸셀룰로스, 히알루론산, 콜라겐 등을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 생분해성, 바람직하게는 생재흡수성 또는 생흡수성 스캐폴드 또는 매트릭스 상에서 또는 그 내에서 세포를 전달하는 것이 바람직하거나 적절할 수 있다. 이들 전형적인 3차원 바이오재료는 스캐폴드에 부착되거나, 스캐폴드 내에 분산되거나, 스캐폴드 내에 포획된(entrapped) 세포외 매트릭스 내에 혼입된 생세포를 포함한다. 일단 신체의 표적 영역으로 이식되면, 이들 이식물은 숙주 조직에 통합되고, 여기서, 이식된 세포는 점차 정착하게 된다(예를 들어, 문헌[Tresco, P A, et al., Adv. Drug Delivery Rev., 2000; 42:3-27] 참조; 또한, 문헌[Hutmacher, D.W., J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2001; 12:107-174] 참조).

생체적합성 매트릭스는 호모폴리머, 코폴리머 및 블록 폴리머, 및 이들의 조합을 포함하는 천연, 변형된 천연 또는 합성 생분해성 폴리머로 구성될 수 있다. 폴리머는 일반적으로 폴리머가 합성되는 모노머에 기초하여 표기되는 것으로 알려져 있다.

적절한 생분해성 폴리머 또는 폴리머 부류의 예에는 피브린, 콜라겐, 엘라스틴, 젤라틴, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 라미닌, 트롬빈, 폴리(아미노산), 산화 셀룰로스, 트로포엘라스틴, 실크, 리보핵산, 데옥시리보핵산, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 재구성 기저막 매트릭스, 전분, 덱스트란, 알긴산염, 히알루론, 키틴, 키토산, 아가로스, 다당류, 히알루론산, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리에틸렌 글리콜, 탈세포화(decellularized) 조직, 자가 조립(self-assembling) 펩티드, 폴리펩티드, 글리코사미노글리칸, 이들의 유도체 및 이들의 혼합물이 포함된다. 글리콜산 및 락트산의 경우에, 전형적으로 중간체 환상 다이머가 제조되며, 중합 전에 정제된다. 이들 중간체 다이머는 각각 글리콜리드 및 락티드로 지칭된다. 다른 유용한 생분해성 폴리머 또는 폴리머 부류에는 제한 없이, 지방족 폴리에스테르, 폴리(알킬렌 옥살레이트), 티로신 유래 폴리카보네이트, 폴리이미노카보네이트, 폴리오르토에스테르, 폴리옥사에스테르, 폴리아미도에스테르, 아민기를 함유하는 폴리옥사에스테르, 폴리(프로필렌 푸마레이트), 폴리다이옥사논, 폴리카보네이트, 폴리옥살레이트, 폴리(알파-하이드록시산), 폴리(에스테르), 폴리우레탄, 폴리(에스테르 우레탄), 폴리(에테르 우레탄), 폴리무수물(polyanhydride), 폴리아세테이트, 폴리카프로락톤, 폴리(오르토에스테르), 폴리아미노산, 폴리아미드 및 이들의 배합물 및 코폴리머가 포함된다. 추가의 유용한 생분해성 폴리머에는 제한 없이, L- 및 D-락트산의 스테레오폴리머(stereopolymer), 비스(파라-카복시페녹시) 프로판과 세바스산의 코폴리머, 세바스산 코폴리머, 카프로락톤의 코폴리머, 폴리(락트산)/폴리(글리콜산)/폴리에틸렌 글리콜 코폴리머, 폴리우레탄과 폴리(락트산)의 코폴리머, 알파-아미노산의 코폴리머, 알파-아미노산과 카프로산의 코폴리머, 알파-벤질 글루타메이트와 폴리에틸렌 글리콜의 코폴리머, 석시네이트와 폴리(글리콜)의 코폴리머, 폴리포스파젠, 폴리(하이드록시알카노에이트) 및 이들의 혼합물이 포함된다. 이성분계 및 삼성분계도 고려된다.

일반적으로, 매트릭스로 사용하기에 적절한 생분해성 폴리머는 바람직하게는, 이것이 의도된 응용에 적합한 기계적 특성을 갖고; 조직이 성장되고 치유될 때까지 충분히 무손상으로 유지되고; 염증 또는 독성 반응을 일으키지 않고; 이의 목적이 달성된 후에 체 내에서 대사되고; 형성되어야 할 원하는 최종 산물로 용이하게 처리되고; 허용가능한 저장 수명을 입증하고; 용이하게 살균되도록 구성된다.

본 발명의 일 태양에서, 매트릭스를 형성하기 위해 사용되는 생체적합성 폴리머는 하이드로겔의 형태로 존재한다. 일반적으로, 하이드로겔은 특유한 3차원 구조를 유지하면서 물을 그의 중량의 20%를 초과하여 흡수할 수 있는 가교결합된 중합체 물질이다. 이러한 정의는 수팽윤된 물질 뿐만 아니라 수성 환경에서 팽윤될 건조 가교결합 중합체도 포함한다. 다수의 친수성 중합체는 상기 중합체가 생체 유래의 중합체이든지, 반합성 중합체이든지 또는 완전 합성 중합체이든지 간에, 하이드로겔을 생성하도록 가교결합될 수 있다. 하이드로겔은 합성 중합체 물질로 생성될 수 있다. 이러한 합성 중합체는 다양한 특성 및 예측가능한 로트 간(lot-to-lot) 균일성에 맞춰 만들어 질 수 있으며, 일반적으로 면역원성에 대한 염려가 없는 물질의 신뢰성 있는 공급원을 대표할 수 있다. 매트릭스는 미국 특허 제5,670,483호 및 제5,955,343호, 미국 특허 출원 공개 제2002/0160471호 및 PCT 출원 공개 제WO 02/062969호에 논의된 것들과 같이, 자가 조립 펩티드로부터 형성된 하이드로겔을 포함할 수 있으며, 이들의 개시 내용이 하이드로겔 형성 자가 조립 펩티드에 관한 것이므로, 참조로 포함된다.

하이드로겔을 약물 전달 응용에서 가치 있게 만드는 특성은 평형 팽윤도, 흡착 동역학, 용질 투과성, 및 하이드로겔의 생체 내 성능 특성을 포함한다. 화합물에 대한 투과성은 부분적으로는 팽윤도 또는 수분 함량 및 생물 분해 속도에 따라 달라진다. 겔의 기계적 특성은 팽윤도에 직접적으로 비례하여 감소하기 때문에, 하이드로겔을 기재에 부착시킬 수 있어서 상기 복합 시스템이 기계적 강도를 향상시키도록 하는 것이 또한 충분히 본 발명에 고려된다. 일부 실시 형태에서, 하이드로겔은 하이드로겔의 유용한 전달 특성과 함께, 기재의 기계적 강도를 얻기 위하여, 다공성 기재 내에 함침될 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 스캐폴드 또는 매트릭스(때때로 집합적으로 "프레임워크"로 지칭)의 비제한적인 예에는 텍스타일 구조, 예를 들어, 위브(weave), 니트, 브레이드(braid), 메쉬(mesh), 부직포 및 경편직물(warped knit); 다공성 폼, 준다공성(semi-porous) 폼, 천공된 필름 또는 시트, 미립자, 비드 및 구체 및 상기 구조의 조합인 복합 구조가 포함된다. 부직 매트(mat)는 예를 들어, 상표명 "빅릴(VICRYL)" 봉합사(미국 뉴저지주 섬머빌 소재의 에티콘, 인코포레이티드(Ethicon, Inc.))로 시판되는 글리콜산과 락트산(PGA/PLA)의 합성 흡수성 코폴리머로 구성된 섬유를 사용하여 형성될 수 있다. 미국 특허 제6,355,699호에 논의된 바와 같이, 예를 들어, 냉동 건조 또는 동결 건조와 같은 과정에 의해 형성되는 폴리(엡실론-카프로락톤)/폴리(글리콜산)(PCL/PGA) 코폴리머로 구성된 폼도 사용될 수 있다. 하이드로겔, 예를 들어, 자가 조립 펩티드(예를 들어, RAD16)도 사용될 수 있다. 원위치 형성 분해성 네트워크도 본 발명에 사용하기에 적합하다(예를 들어, 문헌[Anseth, K S et al., J. Controlled Release, 2002; 78:199-209]; 문헌[Wang, D. et al., Biomaterials, 2003; 24:3969-3980]; 및 미국 특허 공개 제 2002/0022676호 참조). 이들 원위치 형성 물질은 주사에 적합한 유체로서 제형화되며, 그 후 다양한 수단, 예를 들어, 원위치에서 또는 생체 내에서, 온도, pH, 광조사의 변화에 의해 하이드로겔을 형성하도록 유도될 수 있다.

다른 실시 형태에서, 프레임워크는 생흡수성 물질, 예를 들어 PGA, PLA, PCL 코폴리머 또는 블렌드, 또는 히알루론산으로 만들어진 멀티필라멘트사로 구성될 수 있는 펠트(felt)이다. 멀티필라멘트사는 권축, 절단, 카딩(carding) 및 니들링(needling)으로 이루어진 표준 텍스타일 가공 기술을 이용하여 펠트로 만들어진다. 다른 실시 형태에서, 세포는 복합 구조일 수 있는 폼 스캐폴드 상에 씨딩된다.

상술한 많은 실시 형태에서, 프레임워크는 혈관의 형상과 같은 유용한 형상으로 몰딩될 수 있다. 추가로, UTC가 사전 형성된 비분해성 수술 또는 이식형 장치 상에, 예를 들어, 섬유아세포 함유 GDC 혈관내 코일의 제조에 사용되는 것에 상응하는 방식으로 배양될 수 있는 것이 인식될 것이다(문헌[Marx, W. F. et al., Am. J. Neuroradiol., 2001; 22:323-333]).

매트릭스, 스캐폴드 또는 장치는 세포 부착을 증진시키기 위해 세포의 접종 전에 처리될 수 있다. 예를 들어, 접종 전에, 나일론 매트릭스는 0.1 몰의 아세트산으로 처리되고, 폴리라이신, PBS, 및/또는 콜라겐 중에서 인큐베이션시켜 나일론을 코팅할 수 있다. 폴리스티렌을 황산을 사용하여 유사하게 처리할 수 있다. 프레임워크의 외부 표면은 또한 프레임워크의 플라스마 코팅 또는 하나 이상의 단백질(예를 들어, 콜라겐, 탄성 섬유, 세망 섬유), 당단백질, 글리코사미노글리칸(예를 들어, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라틴 설페이트), 유전 물질, 예를 들어, 사이토카인 및 성장 인자, 세포 매트릭스, 및/또는 세포 생존 및 분화에 영향을 미치는 다른 인자들 중 특히 젤라틴, 알긴산염, 한천, 아가로스, 식물 고무를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다른 물질의 부가에 의한 것과 같이, 세포의 부착 또는 성장, 및 조직의 분화가 향상되도록 변형될 수 있다.

UTC 함유 프레임워크는 본 발명이 속한 기술 분야에 알려져 있는 방법에 따라 제조된다. 예를 들어, 세포를 배양 용기에서 자유롭게 서브-컨플루언시(sub-confluency) 또는 컨플루언시까지 성장시키고, 배양물로부터 옮겨, 프레임워크로 접종시킬 수 있다. 성장 인자는 세포의 접종 전에, 그 동안 또는 그 후에 배양 배지에 첨가되어, 필요에 따라, 분화 및 조직 형성을 촉발시킬 수 있다. 대안적으로, 프레임워크 그 자체는 그 위에서의 세포의 성장이 향상되거나, 이식물의 거부 위험이 감소되도록 변형될 수 있다. 따라서, 항염증 화합물, 면역억제제 또는 성장 인자를 포함하나 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 생물학적 활성 화합물을 국소 방출을 위하여 프레임워크에 첨가할 수 있다.

UTC, UTC의 일부 또는 UTC를 포함하는 세포 집단, 또는 UTC의 성분 또는 UTC에 의해 생성되는 산물이 다양한 방식으로 사용되어, 특히, 폐질환 환자에서 폐 세포 및 조직의 회복, 재생 및 개선을 지원 및 촉진시키고, 혈류를 향상시키고, 혈관형성을 자극하고/하거나 지원할 수 있다. 이러한 효용에는 시험관 내, 생체 외 및 생체 내 방법이 포함된다.

본 발명의 특정 실시 형태는 폐손상 또는 폐장애의 치료를 위한 혈관의 직접적인 회복, 재생 또는 대체, 또는 이의 회복, 재생 또는 대체의 지원에 관한 것이다.

UTC는 단독으로(예를 들어, 실질적으로 균질한 집단으로) 또는 다른 세포와의 혼합물로 투여될 수 있다. 상술한 바와 같이, UTC는 매트릭스 또는 스캐폴드, 또는 통상적인 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 약제학적 제제로 제형화된 것으로 투여될 수 있다. UTC가 다른 세포와 함께 투여되는 경우, 이들은 다른 세포와 동시에 또는 순차적으로(다른 세포 전에 또는 후에) 투여될 수 있다. UTC와 함께 투여될 수 있는 세포에는 근세포, 폐조직 세포, 골격근 전구 세포, 혈관 평활근 세포, 혈관 평활근 전구 세포, 혈관 주위 세포, 혈관 내피 세포, 또는 혈관 내피 전구 세포, 및/또는 기타 다능성 또는 만능성 줄기 세포가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 상이한 유형의 세포는 투여 직전에 UTC와 혼합될 수 있거나, 이들은 투여 이전에 소정의 기간 동안 함께 공배양될 수 있다.

UTC는 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있는 바와 같은 다른 유익한 약물 또는 생물학적 분자 또는 다른 활성 제제, 예를 들어, 항염증제, 항세포사멸제, 항산화제, 성장 인자, 혈관형성 인자 또는 근육재생 또는 근육보호 약물과 함께 투여될 수 있다. UTC가 다른 제제와 함께 투여되는 경우, 이들은 단일 약제학적 조성물 중에, 또는 개별 약제학적 조성물 중에 다른 제제와 동시에 또는 순차적으로(다른 제제의 투여 전 또는 후) 함께 투여될 수 있다. 다른 제제는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가가 적절한 것으로 여기는 것과 같이, 이식 전에 시작하고 회복 과정 내내 지속되거나, 이식 시에 시작되거나 심지어는 이식 후에 개시될 수 있는 치료 요법의 일부일 수 있다.

일 실시 형태에서, UTC는 미분화 세포로서, 즉, 성장 배지에 배양된 것으로서 투여된다. 대안적으로, UTC는 원하는 폐조직 표현형, 예를 들어 혈관 평활근, 혈관 주위 세포, 또는 혈관 내피 표현형으로의 분화를 자극하는 조건의 배양액 중에서 노출된 후에 투여될 수 있다.

본 발명의 세포는 수술에 의해 이식되거나, 주사되거나, 전달되거나(예를 들어, 카테터, 주사기, 션트(shunt), 스텐트, 마이크로카테터 또는 펌프에 의해), 아니면 폐손상, 폐상해 또는 폐통증의 부위에 직접적으로 또는 간접적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 세포 또는 이의 조성물의 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 비강내, 척추강내, 낭내, 또는 주사바늘이 있는 주사기 또는 펌프 장치가 있거나 이것이 없는 카테터를 통한 경로를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

세포가 반고체 또는 고체 장치에서 투여되는 경우, 체 내의 정확한 위치로의 외과적 이식이 전형적으로 적절한 투여 수단이다. 그러나, 액체 또는 유체의 약제학적 조성물은 혈액을 통해 또는 직접적으로 이환 폐조직(예를 들어, 미만성 ALI 또는 ARDS의 경우에서 그런 것처럼 확산에 의해, 이환 영역의 도처에) 투여될 수 있다. UTC의 이동은 화학적 신호, 성장 인자 또는 칼페인에 의해 안내될 수 있다.

제대 조직 유래 세포 또는 제대 조직 유래 세포를 포함하는 조성물 및/또는 매트릭스는 마이크로 카테터, 내부 카테터법(intracatheterization)을 통해 또는 미니-펌프를 통해 부위에 전달될 수 있다. 비히클 부형제 또는 담체는 환자에게, 특히 세포 분화가 유도되어야 할 부위에 국소적으로 투여하기에 약제학적으로 허용가능한 것으로 알려져 있는 것들 중 임의의 것일 수 있다. 예에는 액체 배지, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 멸균 식염수, 멸균 인산염 완충 식염수, 레이보비츠(Leibovitz's) 배지(L15, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐), 멸균수 중의 덱스트로스 및 임의의 다른 생리학적으로 허용가능한 액체가 포함된다.

다른 실시 형태는 약제학적으로 허용가능한 담체 및 UTC 세포 성분(예를 들어, 세포 용해물 또는 이의 성분) 또는 산물(예를 들어, UTC에 의해 자연적으로 생성되거나 유전자 변형을 통해 생성되는 영양 및 다른 생물학적 인자, UTC 배양 유래의 조정 배지), 또는 UTC 성장 배지 또는 성장 배지로부터 정제된 산물을 포함하는 치료적 조성물을 투여하는 단계에 의한 폐손상 또는 폐상해의 병리에 관여하는 전염증성 매개체를 조절하는 방법을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 생물학적 인자는 FGF 및 HGF이다. 이들 방법은 다른 활성 제제, 예를 들어 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 성장 인자, 혈관형성 인자 또는 근육재생 또는 근육보호 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

UTC 또는 본 명세서에 기재된 다른 치료적 또는 약제학적 조성물 중 임의의 것을 투여하기 위한 제형 및 요법은 개별 환자의 증상, 예를 들어, 폐손상 이벤트로부터의 손상 또는 상해의 특성 및 정도, 연령, 성별, 체중 및 일반 의학적 상태, 및 의사에게 알려져 있는 다른 인자를 고려하여 우수한 의료 행위에 따라 변한다. 따라서, 환자에게 투여될 약제학적 조성물의 유효량은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려져 있는 이들 고려사항에 의해 결정된다.

UTC는 혼합 림프구 반응에서 동종 PBMC를 자극하는 것으로 보이지 않았다. 따라서, UTC의 동종 또는 심지어는 이종 이식은 일부 경우에 허용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, UTC 그 자체는 면역억제 효과를 제공하여, 이에 의해, 이식된 UTC의 숙주 거부가 방지된다. 이러한 예에서, 세포 요법 동안의 약리학적 면역억제는 필요하지 않을 수 있다.

그러나, 다른 경우에, 세포 요법을 개시하기 전에 환자를 약리학적으로 면역억제시키는 것이 바람직하거나 적절할 수 있다. 상술한 바와 같이, 이는 전신 또는 국소 면역억제제의 사용을 통하여 달성되거나, 이는 캡슐화된 장치에서 세포를 전달함으로써 달성될 수 있다. 이식된 세포에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하기 위한 이들 및 다른 수단은 해당 분야에 알려져 있다. 대안으로서, UTC를 상기 언급된 바와 같이 이들의 면역원성을 감소시키기 위해 유전자 변형시킬 수 있다.

살아있는 환자에서의 이식된 UTC의 생존은 다양한 스캐닝 기술, 예를 들어, 컴퓨터 단층 촬영(CAT 또는 CT) 스캔, 자기 공명 영상화(MRI) 또는 양전자 방출 단층촬영술(PET) 스캔의 사용을 통해 결정될 수 있다. 이식물 생존의 결정은 또한 폐조직 또는 혈관 조직을 제거하고, 이를 가시적으로 또는 현미경을 통해 검사함으로써 사후에 행해질 수 있다. 대안적으로, 세포는 폐조직 세포, 예를 들어 혈관 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 또는 혈관 내피 세포에 특이적인 염색으로 처리될 수 있다. 또한, 이식된 세포는 추적 염료, 예를 들어, 로다민- 또는 플루오레세인 표지 미소구체, 패스트 블루(fast blue), 제2철(ferric) 미립자, 비스벤즈아미드 또는 유전자적으로 도입된 리포터 유전자 산물, 예를 들어, 베타-갈락토시다제 또는 베타-글루쿠로니다제의 사전 혼입에 의해 동정될 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 상술한 바와 같이, 혈관형성을 자극하고/하거나 지원하고, 혈류를 향상시키고, 폐손상 이벤트에 의해 상해를 입거나 손상되는 폐조직의 재생, 회복 및 개선을 위한 다양한 방법에서 UTC, UTC 집단, UTC의 성분 및 산물을 사용하는 키트를 제공한다. 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상에 의해 야기되는 손상 또는 상해의 치료 또는 다른 예정된 치료를 위해 사용되는 경우, 키트는 적어도 UTC를 포함하는 하나 이상의 세포 집단 및 약제학적으로 허용가능한 담체(액체, 반고체 또는 고체)를 포함할 수 있다. 키트는 또한 임의로 예를 들어, 주사에 의한 세포의 투여 수단을 포함할 수 있다. 키트는 추가로 세포의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다. 야전 병원, 예를 들어, 군용으로 제조된 키트는 조직 스캐폴드, 수술 봉합사 등을 비롯한 절차의 완전한 공급물을 포함할 수 있으며, 야전 병원, 예를 들어, 군용으로 제조된 키트는 조직 스캐폴드, 수술 봉합사 등을 비롯한 절차의 완전한 공급물을 포함할 수 있으며, 세포는 급성 상해의 회복과 관련하여 사용될 것이다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 검정 및 시험관 내 방법을 위한 키트는, (1) UTC, 또는 UTC의 성분 또는 산물; (2) 시험관 내 방법을 실시하기 위한 시약; (3) 필요에 따라, 다른 세포 또는 세포 집단; 및 (4) 시험관 내 방법을 행하기 위한 설명서 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

게다가, 하기 실시예 및 본 명세서의 다른 곳에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 장치 및 방법에 유용한 UTC는 전체적으로 참고로 포함된 미국 특허 제7,524,489호 및 제7,510,873호, 및 미국 특허 출원 공개 제2005/0058634호의 개시내용에 따라 단리되고 특성화될 수 있으며, 그 이유는 상기 공보들이 hUTC의 설명, 단리 및 특성화에 관련되어 있기 때문이다.

추가의 설명 없이, 당업자라면, 전술한 설명 및 하기의 예시적인 실시예를 이용하여 본 발명을 만들어 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 형태들을 구체적으로 언급한 것으로, 어떠한 방식으로든지 본 개시 내용의 나머지를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

산소과잉에 의해 유발된 급성 폐손상의 마우스 모델에 있어서의 폐 예방 효과

본 실시예는 산소과잉에 의해 유발된 폐손상의 모델에서 폐 회복 및 재생을 향상시키는 인간 UTC(hUTC의 단리 및 특성화는 실시예 6 내지 16에서 발견될 수 있음)의 효능을 예시한다.

제대 세포 배양 및 단리

제대 유래 세포(UDC, hUTC)를 미국 특허 제7,524,489호 및 제7,510,873호, 및 미국 특허 출원 공개 제2005/0058634호에 기술된 바와 같이 준비하였다. 세포를 원하는 계대로 배양한 다음에, 냉동 보존시켰다.

동물 모델

암컷 C57BL/6 마우스(7주령)를 에이스 에니멀즈(Ace Animals; 미국 펜실베이니아주 보여타운 소재)로부터 획득하였다. 주사 직전에, hUTC를 37℃(수조)에서 해동시켜, 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 세척하여, 1 mL의 PBS에 재현탁시켰다. 세포를 혈구계를 사용하여 계수하였다. 세포 생존율을 트리판 블루 색소 배제에 의해 측정하였다. 세포를 200 ㎕ PBS 중의 1 × 10⁶개의 세포의 농도로 재구성하였다.

연구 조사 개요를 하기 표 1-1에 요약한다. 0일째에, 세포(200 ㎕ PBS 중의 1 × 10⁶개의 hUTC) 또는 PBS 비히클을 1 mL 주사기 및 26 게이지 주사바늘을 사용하여 정맥내 꼬리 정맥 주사에 의해 마우스에 서서히 투여한 다음에, 동물을 실내 공기 또는 90% O₂에 노출시켰다. 90% O₂에의 노출을, 준비하여 1시간 동안 90% O₂ 로 평형화시킨 바이오스페릭스 챔버(BioSpherix chamber; 미국 뉴욕주 라코나 소재의 바이오스페릭스, 리미티드(BioSpherix, LTD)에 동물을 둠으로써 수행하였다. 지지 요법(열 지원 및 뉴트리칼(NutriCal))을 이들 동물에게 매일 제공하였다. 각 탱크에 대한 동물 관찰, 사망률, 생존, 및 % 산소 농도를 1일 2회 기록하였다. 처리후 4일째에, 동물을 50 mg/mL 넴뷰탈(펜토바르비탈)을 사용하여 안락사시켰다.

[표 1-1]

기관지 폐포 세척액( BALF ) 총 단백질 분석

각 샘플의 총 단백질을 측정하기 위해, 무세포 BALF를 BCA 단백질 분석(피어스)을 이용하여 분석하였다. 소프트맥스(Softmax) 4.0 프로그램을 이용하여 분석을 완료하여, 데이터를 그래프패드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism Software)를 사용하여 그래프로 나타내었다.

BALF 및 폐 호모지네이트 사이토카인/케모카인 분석

BALF를 준비하기 위해, 처리군 당 여섯(6) 마리의 동물을 안락사시켜, 폐를 1.0 mL 멸균 PBS(인비트로겐)로 1회 세척하고, 튜브를 녹은 얼음 위에 두었다. BALF를 5분간 1000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하여, 추가 분석을 위해 사용하였다.

폐 호모지네이트를 준비하기 위해, 1군 당 여섯(6) 마리의 동물을 안락사시켜, PBS로 전신 관류을 행하고, 좌측 폐를 절개하여, 라이싱(Lysing) 매트릭스 D 튜브 내의 얼음 위에 둔 다음에, 40초간 4.0의 속도로 패스트프레프(FastPrep)® 기기에서 원심분리하였다.

BALF 및 폐 호모지네이트 상청액 중의 사이토카인/케모카인 수준을 제조업자의 프로토콜에 따라 마우스 22-멀티플렉스 비드 키트(밀리포어)를 사용하여 측정하고, 바이오라드 바이오플렉스 머신을 사용하여 분석하였다. 결과를 그래프로 나타내고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

인간 세포 검출

전체 RNA를 회사 표준 조작 절차에 따라 아스우라겐, 인코포레이티드(Asuragen, Inc.)에 의해 마우스 조직으로부터 단리하였다. 전체 RNA 샘플의 순도 및 품질을 나노드롭(NanoDrop) ND-1000 UV 분광 광도계를 사용하여 260 및 280 nm에서 흡광도 측정치에 의해 결정하였다. RNA 완전성을 아질런트 바이오애널라이저(Agilent Bioanalyzer)를 사용하여 평가하였다.

GAPDH mRNA(Hs99999905_m1_GAPDH)에 대한 인간 특이적 분석을 이용하여, 마우스 폐조직 내의 hUTC 수를 추정하였다. 단일 튜브 TaqMan^® 분석(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 이용한 정량 RT-PCR(qRT-PCR) 분석용 샘플을 회사 표준 조작 절차에 따라 아스우라겐, 인코포레이티드에 의해 처리하였다. 전체 RNA의 희석물을 제조업자의 설명서에 따라 희석물 당 20 마이크로리터의 총 반응 체적으로 TaqMan^® 고용량 cDNA 합성 키트(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 역전사시켰다. 그 다음에, 50 ng 입력 cDNA를 PCR로 분석하였다. 모든 증폭을 유효한 ABI 7500 실시간 유전자 증폭기 상에서 3회 행하였다. 95℃에서 10분간 인큐베이션한 후에, 샘플을 95℃에서 15초간, 이어서 60℃에서 1분간 40 사이클로 증폭시켰다. 마우스 폐 내의 hUTC 총수를 기지량의 정제된 hUTC 전체 RNA를 분석하여 형성한 표준 곡선에 기초하여 추정하였다.

BALF 총 단백질

4일간 90% O₂에 노출시켜, 실내 공기의 대조 동물과 비교하여, BALF의 총 단백질 함량이 증가되었다(p < 0.01, 도 1, 표 1-2). 게다가, 90% O₂ PBS 처리군과 비교하여, 90% O₂ hUTC 처리군에서 총 BALF 단백질이 통계적으로 유의한 감소를 보였다(p < 0.05).

[표 1-2]

BALF 및 폐 호모지네이트 사이토카인 분석

표 1-3 내지 1-6은 폐 호모지네이트(표 1-3 및 1-4) 및 BALF(기관지 폐포 세척액)(표 1-5 및 1-6)의 케모카인/사이토카인 분석을 나타낸다. 데이터에 나타낸 데이터는 또한 그래프로 나타낸다(도 2a 및 2b). PBS 비히클로 처리되고 90% O₂에 노출된 동물과 비교하여, hUTC로 처리되고 90% O₂에 노출된 동물에서 BALF 케라티노사이트 인자(KC), 감마 인터페론 유도 사이토카인(IP-10), 인터류킨 1α(IL-1α) 및 폐 호모지네이트 단구 주화성 인자-1(MCP-1)의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다(p < 0.02)(도 2a 및 2b, 표 1-3 및 1-4). (nd = 검출되지 않음).

[표 1-3]

[표 1-4]

[표 1-5]

[표 1-6]

인간 세포 생착(engraftment)

처리후 4일째에, 동물을 희생시켜, 폐를 수확하여, 전체 RNA를 인간 세포 검출을 위해 단리시켰다. 결과는 hUTC 처리된 동물의 폐 내에서 hUTC의 존재를 나타내지만, PBS 처리된 동물의 폐에는 존재하지 않음을 나타내었다(표 1-3).

표 1-7은 인간 세포 검출의 결과를 나타낸다. 처리후 4일째에 마우스 폐 내의 hUTC의 존재를 실시간 PCR을 사용하여 인간 특이적 GAPDH mRNA 전사물을 측정함으로써 결정하였다. 34 미만의 사이클 임계값(cycle threshold; CT)은 hUTC가 마우스 폐조직 내에 존재함을 나타낸다. 마우스 폐조직 내에 hUTC mRNA 전사물이 검출되지 않았다(부재). 마우스 폐조직 내에 hUTC mRNA 전사물이 존재하였다(존재).

[표 1-7]

마우스에서의 산소과잉에 의해 유발된 급성 폐손상의 발증에 대한 hUTC의 예방적 정맥내 투여 효과를 평가하였다. 90% O₂에 노출된 마우스에 hUTC를 투여한 후에, BALF 중의 총 단백질 수준 저하는 hUTC가 폐의 산소과잉으로 인해 유발된 혈관 누출/부종을 감소시킬 수 있음을 시사한다. 또한, 데이터는 hUTC가 세 가지의 중요한 케모카인의 수준 저하를 가져오며, 이것이 폐의 염증 저하를 시사함을 보여주었다. 이들 데이터는 hUTC가 폐질환의 치료를 위한 중요한 치료제일 수도 있다는 증거를 제공한다.

실시예 2

엘라스타제 유발 폐기종의 신규 인간화 뮤린 ( Humanized Murine ) 모델에 있어서의 인간 제대 조직 유래 세포( hUTC )의 예방 효과 평가

본 실시예는 신규 및 전통적인 COPD(폐기종) 모델에 있어서의 인간 제대 조직 유래 세포(hUTC)의 효능을 평가하였다. 이들 모델은 기종성 파괴로 이어지는 기도에로의 엘라스타제의 전달을 기초로 하였다. 전통적인 모델은 BALB/c 마우스를 사용하였고; 신규 모델은 NOD/SCID/사이토카인 수용체 감마쇄 눌마우스(NOD/SCIDγ)(이하, "NSG")를 사용하였으며, 이들은 인간 세포 요법을 시험하기 위한 시험대로서 개발되었다.

연구 설계

마우스를 14일간 동안(주당 3회 마다 1 x 30 ㎍) 아이소플루란의 흡입 및 소정의 돼지 췌장 엘라스타제(시그마 알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)의 6회 비내 투여에 의해 마취시켰다. 대조 마우스에는 다만 생리식염수를 비내 투여하였다. 첫 번째 엘라스타제 처리 후 2시간 후에, 0.5 × 10⁶개의 인간 제대 조직 세포(hUTC)를 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. hUTC를 일회량으로서 100 ㎕의 총체적으로 투여하였다. 비히클 단독을 hUTC 처리군에서와 유사한 방법으로 투여하였다.

본 연구는 생화학/단백질 분석(파트 1) 및 (2) 조직학 및 폐 기능 검사(혈량측정(plethysmography)(파트 2)를 포함하였다.

본 연구를 위해, 0일째에 마우스에게 돼지 췌장 엘라스타제(PPE)를 비강내(i.n.), hUTC를 정맥내(i.v.) 주사하였다. 2, 5, 7, 9 및 11일째에, 마우스에게 PPE를 추가로 주사하였다. 1, 6, 10 및 14일째에, 추가 분석을 위해 마우스를 수확하였다. 320마리의 6 내지 8주령의 암컷 마우스는 균주/종: NOD/SCIDγ(160) 또는 야생형(BALB/C) 무스 무스쿨라리스(Mus muscularis)(160)를 사용하였다. 표 2-1은 실험 설계를 요약한다.

[표 2-1]

제대 세포 배양 및 단리

제대 유래 세포("UDC" 또는 "hUTC")를 미국 특허 제7,524,489호 및 제7,510,873호, 및 미국 특허 출원 공개 제2005/0058634호에 기술된 바와 같이 준비하였다. 세포를 원하는 계대로 배양한 다음에, 냉동 보존시켰다.

1회분 제제

주사 직전에, hUTC를 37℃(수조)에서 해동시켰다. 세포를 혈구계를 사용하여 계수하였다. 세포 생존율을 트리판 블루 색소 배제에 의해 측정하였다. 세포는 주사 시에 80% 이상의 생존율을 나타내어야 했다. 생존율이 80% 미만이면, 세포를 폐기하였다. 세포를 비히클을 사용하여 적절한 농도로 100 ㎕로 조절하였다. 비히클에 현탁시킨 세포를 주사기 펌프, 적절한 작은 용량의 주사기, 및 28 게이지 주사바늘을 사용하여 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 세포가 전달 횟수 기록과 함께 약 0.33 mL/min/㎏으로 전달되도록, 세포를 8 내지 9분간에 걸쳐서 서서히 투여하였다. 세포 투여는 준비 80분 이내에 일어났다. 세포를 투여 전에 녹은 얼음 위에 유지시켜, 투여 횟수를 기록하였다.

절차

상기에서 논의된 바와 같이, 연구 파트 1의 동물은 생화학적/단백질 분석을 위해 사용되었으며, 파트 2의 동물을 조직학 및 폐 기능 검사(혈량측정)를 위해 사용되었다.

생화학적/단백질 분석(파트 1)을 위해, 비히클 또는 hUTC 주사 후에 1, 6, 10, 및 14일째에, 각각의 군에서 4 또는 5마리의 동물을 희생시켰다. 기관지 폐포 세척액(BALF)을 각 동물로부터 수득하여, BALF에 존재하는 사이토카인의 분석 시까지 -70℃로 보관하였다. 폐, 간, 및 비장을 급속 냉동시켜, 후속 RNA 추출을 위해 -70℃로 RNAlater®(라이프 테크놀러지즈(Life Technologies), 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재)에 보관하였다. 간 및 비장의 분취량을 추가의 전사 분석을 위해 RNAlater®에 보관하였다.

BALF 중의 영양 인자의 분석

BALF 및 폐 호모지네이트 상청액 중의 세포질 및 사이토카인/케모카인 수준(뮤린 MCP-1, IL-1β, TNF-α, RANTES)을 제조업자의 프로토콜에 따라 마우스 멀티플렉스 비드 어레이 키트(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 사용하여 측정하고, 비드 어레이 유세포 분석법을 이용하여 분석하였다. 뮤린 대상을 병리학적 기구의 감소에 초점을 두고 선택하였다. 후보 인간 이펙터 대상은 인간 HGF, 인간 IL-1RA, 및 VEGF를 포함하였다. 인간 인자를 다만 실현가능성을 위해 한 시점에서 풀(pooled) 재료에서 분석하였다. BALF 중의 총 단백질을 BCA™ 단백질 분석(피어스, 미국 일리노이주 록퍼드 소재)을 사용하여 정량화하여, 샘플 군 내에서 정규화하였다.

폐 호모지네이트 중의 영양 인자의 분석

폐 호모지네이트의 세포 샘플을 뮤린 MCP-1, IL-1β, TNF-α, RANTES, 인간 HGF, 인간 IL-1RA 및 VEGF에 대한 정량적 RT-PCR에 의해 평가하여, 병리 마커(MCP-1, TNF-α, IL-1β 및 RANTES) 또는 치료 활성 인디케이터(인간 HGF, IL-1RA 또는 VEGF)를 평가하였다. 폐조직 호모지네이트 중의 인간 IL-1RA 및 VEGF에 대한 RT-PCR에 의해, 어느 시점에서도 사이토카인이 검출되지 않았음을 나타내었다.

파트 2는 파트 1을 반복하였지만, 파트 1에서의 절차와 호환되지 않는 리드아웃(readout)을 이용하였다. 비히클 또는 hUTC 주사 후에 1, 6, 10 및 14일째에, 제한된 혈량측정을 각 군의 동물에 대하여 수행하였다. 게다가, 후술하는 바와 같이, 각 시점에서 4 또는 5마리의 마우스를 희생시켜, 폐를 샘플링하였다.

혈량 측정

혈량 측정을 마우스에 대하여 각 시점 및 실험의 종료 시에 수행하였다. 간략하게, 폐 기능을 제한된 방법으로 측정하여, 호흡 빈도수, 1회 호흡량, 이완 시간, 최대 흡기 및 호기 유량, EF50, 및 폐기량 변화를 측정하였다. 이는 다양한 경우에 있어서의 폐 기능에 대한 세포 요법의 영향을 나타낸다.

조직 병리

각 시점에서 각 처리군으로부터 폐를 수득하였다. 폐를 10% 포름알데히드 중성 완충액으로 고정시켜, 단계적 에탄올계에서 탈수시키고, 파라핀에 임베딩(embedding)하여, 4 ㎛로 슬라이싱하였다. 조직 병리 분석을 위해 파라핀 절편을 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색하였다. 조직 절편을 손상에 대하여 평가하였다. 폐포 표면적을 국립보건원(National Institute of Health)으로부터 온라인으로 이용가능한 이미지 제이 소프트웨어(Image J software)를 이용하여 분석한 병리조직학적 영상을 사용하여 측정하였다. 각 폐 절편에 대하여, 5개의 랜덤 필드(random field) 내의 폐포 표면적을 측정하여, 평균 표면적을 계산하였다. 손상된 폐의 폐포강의 축소가 폐포 탄력성 및 컴플라이언스 개선과 상관관계가 있고, 이것이 이들 파라미터에 대한 세포 요법의 영향을 나타낸다는 것은 잘 알려져 있다.

결과

주입을 위한 세포의 재구성

본 실험에서 10개의 hUTC 바이알을 사용하였으며, 품질 기준에서 아무것도 폐기하지 않았다. 생존율은 각 경우에 >80%이었다. 세포의 회복 세부사항을 하기 표 2-2 및 2-3에 나타낸다. 회복은 높고, 기대값의 100%를 약간 초과하였다(아마 바이알로부터 기대값보다 약간 더 큰 양의 회복으로 인해).

[표 2-2]

[표 2-3]

동물 보고서 및 관찰

일부의 마우스 꼬리가 정맥내 주사 시에 백색 패칭(patching)을 나타내었다. 이는 세포 요법과는 관계가 없으나, 전달 시에 투여 주사바늘의 위치가 잘못되었다. 이것이 일어나면, 주사바늘을 제거하고, 정맥에 정확히 삽입하여, 세포/비히클을 계속해서 투여하였다. 엘라스타제 처리 또는 세포 전달의 결과로, 동물이 죽지 않았다. hUTC 전달의 결과로, 어떠한 동물에게서도 검출가능한 부작용이 관찰되지 않았다.

기관지 폐포 세척액( BALF )의 분석

각 시점에서, 마우스를 나트륨 펜토바르비탈의 치사량 주사에 의해 희생시키고, BALF를 수집하였다. 총 백혈구(도 3) 및 백혈구 백분율 검사(differential cell count)(도 4)를 세포 펠릿에 대하여 수행하였다. 얻어진 상청액을 추가의 사이토카인 활성(도 5 및 6) 및 총 단백질 수준(표 2.4 내지 2.7)의 분석을 위해 회수하였다.

BALF 중의 총 백혈구

대조 마우스는 기관지 폐포 세척에서 최소 세포 침윤을 나타내는 반면에, 엘라스타제 투여는 상당한 세포 침윤을 나타내었다. 총 세포 침윤이 엘라스타제로 처리된 마우스에서 감소되었으며, 양쪽 마우스주는 hUTC를 수용하였다.

BALF 의 분별 세포 염색( differential cell staining )

사이토스핀을 BALF에 대하여 수행하여, 변형 김자 염색 프로토콜(modified Giemsa staining protocol)을 사용하여 염색하였다. 샘플에 대하여 림프구, 대식세포, 및 호중구의 존재를 분석하였다. 사이토스핀 당 100개의 세포를 계수하여, 세포수를 BALF 체적에 대하여 보정하였다. 결과를 평균 ± 표준 오차로 나타내었다. 3개 이상의 군 사이의 비교를 분산 분석(ANOVA)에 의해 행하였다. 차이가 p<0.05로 유의한 것으로 간주되었다.

분별 염색 분석의 요약

NSG 마우스에서, hUTC 요법에 의해 hUTC를 수용하지 않은 엘라스타제로 처리된 마우스와 비교하여, 엘라스타제로 처리된 마우스에 10일째에 대식세포가 상당히 감소되었다. 유사하게는, hUTC를 수용한 엘라스타제로 처리된 마우스에서 6 및 10일째에 호중구의 현저한 감소가 관찰되었다. 대조적으로, 어느 시점에서 hUTC를 수용한 엘라스타제로 처리된 야생형 마우스에서 대식세포 또는 호중구가 그다지 감소되지 않은 것으로 관찰되었다.

사이토카인 분석

BALF 및 폐조직 호모지네이트를 추출하여, 염증성 매개체 MCP-1, TNF-α, RANTES 및 IL-1β에 대한 멀티플렉스 비드 어레이에 의해 분석하였는데, 점액 과다분비, 기도 유조직의 파괴, 섬유증, 조직 손상 및 COPD와 관련된 염증에서 명확히 정의된 역할을 하기 때문이다.

hUTC는 엘라스타제로 처리된 NSG(NOD/SCIDγ) 마우스의 기관지 폐포 세척액(BALF) 상청액에서의 사이토카인 반응을 조절하였다(도 5). 엘라스타제로 처리되지 않은 대조 마우스는 MCP-1, TNF-α, RANTES 및 IL-1β를 거의 또는 전혀 나타내지 않는 반면에, 엘라스타제로 처리된 마우스는 각 시점에서 모든 표적 사이토카인에서 전형적인 증가를 나타내었다. 그러나, hUTC를 수용하는 마우스의 BALF에서 1/10일째에 RANTES; 1일째에 IL-1β; 1, 6, 10일째에 TNF-α; 1일, 10일째에 MCP-1의 염증성 매개체의 유의한 감소가 관찰되었다(* p<0.05)(도 5 참조).

기관지 폐포 세척액(BALF) 상청액의 hUTC 및 사이토카인 반응을 엘라스타제로 처리된 야생형 BALB/c 균주 마우스에 대하여 측정하였다(도 6). hUTC 투여 후 1, 6, 10 및 14일째의 BAL 상청액 조성물에 대한 hUTC 주입 및/또는 돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 처리의 효과를 나타낸다. 간략하게, 반응은 이러한 균주에서 변화가 심하고, 일정하거나 상당한 차이가 관찰되지 않았다.

총 단백질 농도

회수한 BALF 및 폐조직 호모지네이트의 총 단백질 농도를 브래드포드 분석(바이오-래드(Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 허큘리스 소재)을 이용하여 측정하였으며, 소혈청알부민(BSA)을 사용하여 표준화하였다(하기 표 2-4 내지 2-7 참조).

[표 2-4]

[표 2-5]

[표 2-6]

[표 2-7]

각 균주의 처리군 간의 총 단백질에 유의차가 검출되지 않았다.

조직학

정량적 분석

미세척된 마우스로부터 폐를 제거하여, 10%(v/v) 포르말린/PBS에 고정시키고, 파라핀에 임베딩하고, 절개하여, 헤마톡실린/에오신(H&E)으로 염색하였다(도 7 참조). 기공 확대를 정량화하였다. 폐포의 선형 절편을 측정하고, 평균 선형 절편(Lm)을 폐기종의 형태 계측 파라미터(morphometric parameter)로서 사용하였다. 각 폐 샘플로부터, 세개(3)의 대표적인 비중첩 필드를 선택하였다. 랜덤하게 분포된 그리드를 H&E 염색 절편의 이미지에 오버레이하였다. 하기 정량적 척도를 계산하였다: 평균 선형 절편(Lm); 및 폐포수. Lm은 폐포의 평균 크기를 나타낸다. 기관지 및 혈관을 측정으로부터 제외시켰다.

조직 병리

미세척된 마우스로부터 폐를 제거하여, 10%(v/v) 포르말린/PBS에 고정시키고, 파라핀에 임베딩하고, 절개하여, 헤마톡실린/에오신(H&E)으로 염색하였다. 도 8은 1일째에 각 처리군의 대표적인 현미경 사진을 나타낸다. 그 후에 hUTC를 수용한 엘라스타제로 처리된 마우스는 동일한 시점에서 생리식염수를 수용한 엘라스타제로 처리된 마우스와 비교하여, 상당히 감소된 병리를 나타내었다. 엘라스타제 처리로 인한 기공 확대는 hUTC 투여에 의해 약화되었다(도 8 및 관련된 범례 공개 공보 p17). 도 9는 hUTC에 의해 1, 6, 10 및 14일째에 면역 억제(NOD/SCIDγ) 마우스에서 엘라스타제 유발 폐기종의 진행도가 저하되었음을 나타낸다. 도 10은 hUTC에 의해 1, 6, 10 및 14일째에 면역 감응(BALB/c) 마우스에서 엘라스타제 유발 폐기종의 진행도가 저하되었음을 나타낸다.

폐 기능

혈량측정을 선행 연구에 기재된 바와 같이, 각 마우스에 대하여 각 시점 및 실험의 종료 시에 수행하였다. 폐 기능을 제한된 방법으로 측정하여, 호흡 빈도수, 1회 호흡량, 이완 시간, 최대 흡기 및 호기 유량, EF50, 및 폐기량 변화를 측정하였다. 군 사이에 유의차가 검출되지 않았다(일원(one-way) 분산 분석에 의한 통계 분석). 모든 파라미터를 도 11a 및 11b에 나타낸다.

폐 호모지네이트 중의 영양 인자의 분석

폐 호모지네이트로부터의 세포 샘플을 인간 HGF, IL-1RA 및 VEGF에 대하여 mRNA를 측정하도록 정량적 RT-PCR로 평가하여, 치료 활성 인디케이터를 평가하였다. 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여, 폐 호모지네이트 중에 인간 HGF, VEGF, 또는 IL-1RA가 검출되지 않았다.

결론

본 연구는 만성 폐질환의 한 종류인 폐기종의 표준 또는 신규 뮤린 모델에 있어서의 hUTC의 효능을 평가하였다. 엘라스타제를 양쪽의 마우스주의 폐에 주입하였더니, 인간 및 실험적 폐기종에 특유한 변화를 가져오고: 폐포벽의 파괴로 인해, 커지지만 적은 수의 폐포가 생겨나고 폐포 표면적이 감소되며; 염증성 매개체의 생성이 증가되고; 염증성 세포 유형이 기관지 폐포 세척액에 유입되었다. hUTC에 의한 처리는 모델에 있어서 이러한 작용을 억제시켜, 폐기종(즉, COPD)을 예방하거나 개선시키므로, 인간에 있어서 유사한 효과를 일으킬 가능성이 있음을 시사한다.

이들 데이터는 많은 의미를 부여한다. 첫째로, hUTC는 신규 인간-인-마우스(human-in-mouse) 모델에서 COPD의 중요한 기종성 특징의 예방에 효과적이다. hUTC는 NSG 모델에서 병리와 통상 관련된 전염증성 매개체(TNF-α, RANTES, MCP-1 및 IL-1β)의 생성을 억제하였다. 더욱 중요하게는, hUTC는 뮤린 폐에 있어서 엘라스타제 유발 폐기종의 정도를 유의하게 감소시켰으며, hUTC로 처리된 COPD 마우스(양쪽 모델)는 미처리 기종성 대조군보다 폐포 간의 평균 선형 절편(Lm)이 상당히 짧게(즉, 덜 파괴됨) 나타났다. 마찬가지로, hUTC 처리는 COPD의 인간화 NSG 모델에 있어서의 폐포수 증가 및 BAL액 중의 염증성 세포 침윤 감소를 유지하였다. 따라서, hUTC는 병리의 중요한 특징을 효과적으로 방해한다.

NSG 모델은 또한 인간 세포 요법을 조사하기 위한 유용한 시험대이며, 효과적인 세포 요법으로서 hUTC를 지원하는 향후 연구를 행할 기회를 제공한다. 이러한 모델은 또한 치료 효과의 메카니즘과, 실제로 대략적인 투여 시기 및 횟수 문제에 대한 더욱 기초적인 검사 기회를 부여한다.

전체적으로, 단회 hUTC 투여 후의 병리 차이 및 염증성 매개체 감소는 신규 모델에서의 hUTC 효능을 강하게 지지한다.

따라서, 본 실험의 중요한 발견은 다음과 같았다:

hUTC는 "인간화"(NSG) COPD 모델에 있어서의 전염증성 매개체(TNF-α, RANTES, MCP-1 및 IL-1β)의 생성을 억제시키며, 면역 감응 뮤린 모델에 있어서의 이들 사이토카인 반응을 조절하지 않는다.

양쪽 모델에 있어서의 뮤린 폐의 엘라스타제 유발 폐기종의 정도를 유의하게 감소시켰다.

hUTC로 처리된 COPD 마우스(양쪽 모델)는 미처리 기종성 대조군보다 폐포 간의 평균 선형 절편(Lm)이 상당히 짧게(즉, 덜 파괴됨) 나타났다. 마찬가지로, hUTC 처리는 폐포수 증가를 유지하였다.

hUTC는 인간화(NSG) COPD 모델에 있어서의 BAL액 중의 세포 침윤이 감소되었다.

실시예 3

세포 단리

제대 세포 단리

제대를 NDRI(National Disease Research Interchange, 미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재)로부터 획득하였다. 조직을 정상 분만 후 획득하였다. 세포 단리 프로토콜을 층류 후드에서 무균적으로 수행하였다. 혈액 및 잔사를 제거하기 위하여, 제대를 100 단위/밀리리터의 페니실린 및 100 마이크로그램/밀리리터의 스트렙토마이신, 및 0.25 마이크로그램/밀리리터의 암포테리신 B(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)의 존재 하에, 인산염 완충 식염수(PBS; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)로 세척하였다. 그 후, 조직이 미세 펄프로 다져질 때까지, 150 ㎠의 조직 배양 플레이트에서, 50 밀리리터의 배지(DMEM-저농도 글루코스 또는 DMEM-고농도 글루코스; 인비트로겐)의 존재 하에 기계적으로 해리시켰다. 잘게 조각낸(chopped) 조직을 50 밀리리터 원뿔형 튜브(튜브당 약 5 그램의 조직)로 옮겼다.

그 후, 조직을 DMEM-저농도 글루코스 배지 또는 DMEM-고농도 글루코스 배지 중 어느 하나에서 소화시켰으며, 상기 배지 각각은 100 단위/밀리리터의 페니실린, 100 마이크로그램/밀리리터의 스트렙토마이신, 0.25 마이크로그램/밀리리터의 암포테리신 B, 및 소화 효소들을 함유하였다. 일부 실험에서, 콜라게나아제와 디스파아제의 효소 혼합물을 사용하였다("C:D")(DMEM-저농도 글루코스 배지 중의 콜라게나아제(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마), 500 단위/밀리리터; 및 디스파아제(인비트로겐), 50 단위/밀리리터). 다른 실험에서, 콜라게나아제, 디스파아제 및 히알루로니다아제의 혼합물(C:D:H)을 사용하였다(C:D:H = DMEM-저농도 글루코스 중의 콜라게나아제, 500 단위/밀리리터; 디스파아제, 50 단위/밀리리터; 및 히알루로니다아제(시그마), 5 단위/밀리리터). 조직, 배지 및 소화 효소를 함유하는 원뿔형 튜브를 회전식 진탕기(미국 뉴욕주 브루클린 소재의 인바이런(Environ))에서, 225 rpm으로 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.

소화 후, 조직을 5분간 150 x g으로 원심분리하여, 상청액을 흡인하였다. 펠릿을 20 밀리리터의 성장 배지(DMEM: 저농도 글루코스(인비트로겐), 15%(v/v)의 소 태아 혈청(FBS; 규정된 소 태아 혈청; 로트 번호: AND18475; 미국 유타주 로건 소재의 하이클론(Hyclone)), 0.001%(v/v)의 2-메르캅토에탄올(시그마), 100 단위/밀리리터의 페니실린, 100 마이크로그램/밀리리터의 스트렙토마이신, 및 0.25 마이크로그램/밀리리터의 암포테리신 B(각각 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐으로부터 수득))에 재현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을 70 마이크로미터의 나일론 BD 팔콘(FALCON) 세포 스트레이너(Strainer)(미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 비디 바이오사이언시즈)를 통하여 여과하였다. 성장 배지를 포함하는 추가의 5 밀리리터 린스를 스트레이너에 통과시켰다. 그 후, 세포 현탁액을 40 마이크로미터의 나일론 세포 스트레이너(미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 비디 바이오사이언시즈)에 통과시키고, 추가의 5 밀리리터의 성장 배지의 린스로 추적하였다.

여과액을 성장 배지(총 체적 50 밀리리터)에 재현탁시키고, 5분간 150 x g으로 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 세포를 50 밀리리터의 신선한 성장 배지에 재현탁시켰다. 이 과정을 2회 더 반복하였다.

최종 원심분리 후에 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 5 밀리리터의 신선한 성장 배지에 재현탁시켰다. 생존가능한 세포의 수를 트리판 블루 염색을 이용하여 측정하였다. 그 후, 세포를 표준 조건 하에 배양하였다.

제대 조직으로부터 단리한 세포를 성장 배지 중에, 젤라틴 코팅 T-75 플라스크(미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝 인코포레이티드(Corning Inc.)) 상에 5,000개의 세포/㎠로 씨딩하였다. 2일 후, 사용 후 배지(spent medium) 및 비유착 세포를 플라스크로부터 흡인하였다. 유착성 세포를 PBS로 3회 세척하여, 잔사 및 혈액 유래된 세포를 제거하였다. 그 후, 세포에 성장 배지를 보충하고, 상기 세포를 계대 1까지 컨플루언스(confluence)가 되도록 성장시켰다(계대 0으로부터 약 10일). 후속적인 계대시에(계대 1 내지 2 등), 세포는 4 내지 5일 후에 서브컨플루언스(sub-confluence)(75 내지 85%의 컨플루언스)에 도달하였다. 이들 후속 계대에 있어서, 세포를 5,000개의 세포/㎠로 씨딩하였다. 세포를 5%의 이산화탄소를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37℃에서 성장시켰다.

일부 실험에서, 세포는 DMEM-저농도 글루코스 배지 중의 산후 조직으로부터, 리베라제(2.5 밀리그램/밀리리터, 블렌드자임(Blendzyme) 3; 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로슈 어플라이드 사이언시즈(Roche Applied Sciences)) 및 히알루로니다아제(5 단위/밀리리터, 시그마)를 이용한 소화 후에 단리되었다. 조직의 소화 및 세포의 단리는 상기 다른 프로테아제 소화에 대하여 설명한 바와 같지만, C:D 또는 C:D:H 효소 혼합물 대신에 리베라제/히알루로니다아제 혼합물을 사용하였다. 리베라제를 이용한 조직 소화는 쉽게 증식되는 산후 조직으로부터의 세포 집단의 단리로 이어졌다.

상이한 효소 조합들을 이용한 제대로부터의 세포의 단리를 위해 절차들을 비교하였다. 소화에 대하여 비교한 효소들은 하기를 포함하였다: 콜라게나아제; 디스파아제; 히알루로니다아제; 콜라게나아제:디스파아제 혼합물(C:D); 콜라게나아제:히알루로니다아제 혼합물(C:H); 디스파아제:히알루로니다아제 혼합물(D:H); 및 콜라게나아제:디스파아제:히알루로니다아제 혼합물(C:D:H). 이들 상이한 효소 소화 조건들을 이용한 세포 단리에 있어서 차이가 관찰되었다(표 3-1).

상이한 접근법들에 의해 제대로부터 세포의 풀을 단리하려는 다른 시도가 이루어졌다. 일례로서, 제대를 슬라이싱하고, 성장 배지로 세척하여, 혈전 및 젤라틴 물질을 제거하였다. 혈액, 젤라틴 물질 및 성장 배지의 혼합물을 수집하고, 150 x g으로 원심분리하였다. 펠릿을 성장 배지 중에 재현탁시켜서 젤라틴 코팅 플라스크에 씨딩하였다. 이들 실험으로부터, 세포 집단을 단리하였으며, 이는 용이하게 증식되었다.

또한, 세포를 NDRI로부터 수득한 제대혈 샘플로부터 단리하였다. 사용한 단리 프로토콜은 호(Ho) 등의 국제 특허 출원 제PCT/US2002/029971호의 것이었다. 제대혈(미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재의 NDRI)의 샘플들(각각, 50 밀리리터 및 10.5 밀리리터)을 용해 완충제(필터 살균된 155 밀리몰의 염화암모늄, 10 밀리몰의 중탄산칼륨, 0.1 밀리몰의 EDTA(pH 7.2로 완충됨)(모든 성분들은 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마제))와 혼합하였다. 세포를 1:20의 제대혈:용해 완충제의 비로 용해시켰다. 얻어진 세포 현탁액을 5초 동안 와동시키고, 주위 온도에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 상기 용해물을 원심분리하였다(200 x g로 10분간). 세포 펠릿을 10% 소 태아 혈청(미국 유타주 로간 소재의 하이클론), 4 밀리몰 글루타민(미국 버지니아주 헤른던 소재의 메디아테크(Mediatech)), 100 단위/밀리리터의 페니실린 및 100 마이크로그램/밀리리터의 스트렙토마이신(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코 (Gibco))을 함유하는 완전 최소 필수 배지(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 원심분리하여(200 x g로 10분간), 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 완전 배지로 세척하였다. 세포를 T75 플라스크(미국 뉴욕주 소재의 코닝), T75 라미닌 코팅 플라스크, 또는 T175 피브로넥틴 코팅 플라스크(미국 매사추세츠주 베드포드 소재의 벡톤 디킨슨) 중 어느 하나 내에 직접적으로 씨딩하였다.

세포 집단을 상이한 조건들 하에서 단리하고 단리 직후 다양한 조건들 하에서 증식시킬 수 있는지를 결정하기 위하여, 상기에 제공된 절차에 따라, C:D:H의 효소 조합을 이용하여, 0.001%(v/v) 2-메르캅토에탄올(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)을 포함하거나 포함하지 않는 성장 배지에서 세포를 소화시켰다. 모든 세포를 100 단위/밀리리터의 페니실린 및 100 마이크로그램/밀리리터의 스트렙토마이신의 존재 하에 성장시켰다. 모든 시험된 조건들 하에서, 세포는 계대 0과 계대 1 사이에서 잘 부착되어 증식되었다(표 2-2). 조건들 5 내지 8 및 13 내지 16에서의 세포는 씨딩 후 4회의 계대까지는 충분히 증식하는 것으로 입증되었으며, 이 시점에서 상기 세포를 동결보존하였다.

C:D:H의 조합은 최상의 단리 후 세포 수율을 제공하였으며, 세포를 생성시켜, 다른 조건들보다 더욱 많은 배양 중 세대로 증식시켰다(표 3-1). 증식성 세포 집단은 콜라게나아제 또는 히알루로니다아제 단독을 사용해서는 획득되지 않았다. 이 결과가 시험한 콜라게나아제에 대하여 특이적인 것인지를 결정하려는 시도는 하지 않았다.

[표 3-1]

세포는 효소 소화 및 성장에 대하여 시험한 모든 조건 하에서 계대 0과 계대 1 사이에서 잘 부착하여 증식되었다(표 3-2). 실험 조건들 5 내지 8 및 13 내지 16에서의 세포는 씨딩 후 4회의 계대까지는 충분히 증식하였으며, 이 시점에 상기 세포를 동결보존하였다. 모든 세포를 추가의 분석을 위하여 동결보존하였다.

[표 3-2]

유핵 세포는 부착하여 빠르게 성장하였다. 이들 세포를 유세포 분석법에 의해 분석하였으며, 상기 세포는 효소 소화에 의해 수득된 세포와 유사하였다.

상기 제제들은 적혈구 및 혈소판을 함유하였다. 처음 3주 동안에는 유핵 세포가 부착하여 분열하지 않았다. 배지를 씨딩한지 3주 후에 교환하였으며, 어느 세포도 부착하여 성장하지 않는 것으로 관찰되었다.

세포 집단은 효소 조합, 콜라게나아제(메탈로프로테아제), 디스파아제(중성 프로테아제) 및 히알루로니다아제(하이알루론산을 분해하는 점액 분해 효소)를 이용하여 제대 조직으로부터 효율적으로 단리될 수 있었다. 콜라게나아제와 중성 프로테아제의 블렌드인 리베라제가 또한 사용될 수 있다. 또한, 콜라게나아제(4 분쉬(Wunsch) 단위/그램) 및 서모라이신(1714 카제인 단위/그램)인 블렌드자임 3을 히알루로니다아제와 함께 사용하여 세포를 단리하였다. 이들 세포는 젤라틴 코팅 플라스틱 상에서 성장 증식 배지에서 배양할 때 많은 계대에 걸쳐 쉽게 증식되었다.

또한 세포를 제대혈이 아닌 제대 중 잔류 혈액으로부터 단리하였다. 사용한 조건들 하에서 부착하여 성장하는, 상기 조직으로부터 세척한 혈전 중 세포의 존재는 절개 과정 동안 방출된 세포로 인한 것일 수 있다.

실시예 4

세포의 성장 특성

제대 유래 세포의 세포 증식 능력을 단리된 줄기 세포의 다른 집단과 비교하였다. 노화에로의 세포 증식의 과정은 헤이플릭 한계(Hayflick's limit)로 지칭된다(문헌[Hayflick L., J. Am. Geriatr. Soc., 1974; 22(1):1-12]; 문헌[Hayflick L., Gerontologist, 1974; 14(1):37-45]).

실온에서 20분간 20 밀리리터의 2%(w/v) 젤라틴(B형: 225 블룸(Bloom); 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)을 T75 플라스크(미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝 인코포레이티드)에 첨가하여, 조직 배양 플라스틱 플라스크를 코팅하였다. 젤라틴 용액을 제거한 후에, 10 밀리리터의 인산염 완충 식염수(PBS)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)를 첨가한 다음에, 흡인하였다.

성장 증식 능력을 비교하기 위해, 하기 세포 집단을 이용하였다: i) 중간엽 줄기 세포(MSC; 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 캄브렉스(Cambrex)); ii) 지방 유래 세포(미국 특허 제6,555,374호; 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0058412호); iii) 정상 피부 섬유아세포(cc-2509 로트 번호 9F0844; 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 캄브렉스); 및 iv) 제대 유래 세포. 세포를 처음에 성장 배지 중의 젤라틴 코팅 T75 플라스크 상에 5,000개의 세포/㎠로 씨딩하였다. 후속 계대를 위해, 세포 배양물을 다음과 같이 처리하였다. 트립신 처리 후, 생존 세포를 트리판 블루 염색 후에 계수하였다. 세포 현탁액(50 마이크로리터)을 트리판 블루(50 마이크로리터, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)와 배합하였다. 생존 세포수를 혈구계를 사용하여 추정하였다.

계수 후에, 세포를 25 밀리리터의 신선한 성장 배지에서 젤라틴 코팅 T 75 플라스크 상에 5,000개의 세포/㎠로 씨딩하였다. 세포를 37℃에서 표준 대기(5% 이산화탄소(v/v)) 중에서 성장시켰다. 성장 배지를 주당 2회 교환하였다. 세포가 약 85% 컨플루언스에 도달할 때에, 세포는 계대되었으며; 이러한 과정은 세포가 노화에 이를 때까지 반복되었다.

각 계대에서, 세포를 트립신 처리하여 계수하였다. 생존 세포 수율, 집단 배가 [ln(최종 세포수/초기 세포수)/ln2], 및 배가 시간(배양 시간/집단 배가)을 계산하였다. 최적 세포 증식을 결정하기 위해, 계대 당 총 세포 수율을 이전 계대의 총 수율에 각 계대의 증식 인자(즉, 증식 인자 = 최종 세포수/초기 세포수)를 곱하여 결정하였다.

계대 10에 뱅크된 세포의 증식 능력도 시험하였다. 다양한 조건을 사용하였다. 정상 피부 섬유아세포(cc-2509 로트 번호 9F0844; 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 캄브렉스) 및 제대 유래 세포를 시험하였다. 이들 세포 집단을 사전에 계대 10에 뱅크하여, 그 시점까지 각 계대에서 5,000개의 세포/㎠로 배양하였다. 계대 10에서의 세포 해동 후의 세포 집단에 대한 세포 밀도의 효과를 측정하였다. 세포를 표준 조건 하에서 해동하여, 트리판 블루 염색을 사용하여 계수하였다. 그 다음에, 해동된 세포를 성장 배지에서 1,000개의 세포/㎠로 씨딩하였다. 세포를 37℃에서 표준 대기 조건 하에서 성장시켰다. 성장 배지를 주당 2회 교환하였다. 약 85% 컨플루언스에 도달했기 때문에, 세포를 계대하였다. 이어서, 세포를 노화될 때까지, 즉, 더 이상 증식할 수 없을 때까지 계대하였다. 각 계대에서 세포를 트립신 처리하여 계수하였다. 세포 수율, 집단 배가(ln(최종 세포수/초기 세포수)/ln2) 및 배가 시간(배양 시간/집단 배가)을 계산하였다. 계대 당 총 세포 수율을 이전 계대의 총 수율에 각 계대의 증식 인자(즉, 증식 인자 = 최종 세포수/초기 세포수)를 곱하여 결정하였다.

저 세포 씨딩 조건 하에서의 새로 단리된 제대 유래 세포 배양물의 증식 능력을 다른 실험에서 시험하였다. 제대 유래 세포를 이전의 실시예에 기재된 바와 같이 단리하였다. 세포를 1,000개의 세포/㎠로 씨딩하여, 노화될 때까지, 상술한 바와 같이 계대하였다. 세포를 37℃에서 표준 대기 조건 하에서 성장시켰다. 성장 배지를 주당 2회 교환하였다. 약 85% 컨플루언스에 도달했기 때문에, 세포를 계대하였다. 각 계대에서, 세포를 트립신 처리하여, 트리판 블루 염색으로 계수하였다. 각 계대에 대하여, 세포 수율, 집단 배가(ln(최종 세포수/초기 세포수)/ln 2) 및 배가 시간(배양 시간/집단 배가)을 계산하였다. 계대 당 총 세포 수율을 이전 계대의 총 수율에 각 계대의 증식 인자(즉, 증식 인자 = 최종 세포수/초기 세포수)를 곱하여 결정하였다. 세포를 젤라틴 코팅 플라스크 및 젤라틴 코팅을 안한 플라스크 상에 성장시켰다.

저 O₂ 세포 배양 조건이 특정 상황에서는 세포 증식을 향상시킬 수 있는 것으로 입증되었다(미국 특허 출원 공개 제2004/0005704호). 제대 유래 세포의 세포 증식이 세포 배양 조건을 변경하여 향상될 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 제대 유래 세포의 배양물을 저 산소 조건에서 성장시켰다. 세포를 젤라틴 코팅 플라스크 상에서의 성장 배지에서 5,000개의 세포/㎠로 씨딩하였다. 세포를 초기에 표준 분위기 조건 하에서 배양하고 계대 5를 통해, 그 시점에서 저 산소(5% O₂) 배양 조건으로 옮겼다.

다른 실험에서, 세포를 코팅되지 않은 플라스크, 콜라겐 코팅 플라스크, 피브로넥틴 코팅 플라스크, 라미닌 코팅 플라스크 및 마트리겔 코팅 플라스크에서 증식시켰다. 배양물이 이들 다양한 매트릭스 상에서 충분히 증식하는 것으로 입증되었다.

제대 유래 세포를 60일간 40 계대를 초과하여 증식시켜, > 1E17 세포수의 세포 수율을 얻었다. 대조적으로, MSC 및 섬유아세포는 각각, < 25일 및 < 60일 후에 노화되었다. 지방 유래 및 대망(omental) 세포가 거의 60일간 증식되었지만, 이들은 각각, 4.5E12 및 4.24E13의 총 세포 수율을 얻었다. 따라서, 이용된 실험 조건 하에서 5,000개의 세포/㎠로 씨딩한 경우에, 제대 유래 세포는 동일한 조건 하에 성장된 다른 세포 유형보다 훨씬 더 양호하게 증식되었다(표 4-1).

[표 4-1]

제대 유래 세포 및 섬유아세포를 60일간 10 계대를 초과하여 증식시켜, > 1E11 세포수의 세포 수율을 얻었다(표 4-2). 이러한 조건 하에서, 섬유아세포 및 제대 유래 세포 집단은 80일 후에 노화되었으며, 각각 > 50 및 > 40 집단 배가를 달성하였다.

[표 4-2]

세포가 저산소 조건 하에서 충분히 증식되었지만; 저산소 조건 하에서의 배양은 산후 유래 세포의 세포 증식에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 이러한 결과는 저산소 효과에 대하여 이루어진 궁극적인 결론이 초기 단리로부터 저산소 중에서 세포를 성장시키는 것에 대한 실험에서 가장 잘 얻어질 거라는 의미에서 예비적이다. 표준 대기 조건은 이미 충분한 수의 세포를 성장시키는데 성공적인 것으로 입증되어 있으며, 저산소 배양이 산후 유래 세포의 성장에 필요하지 않다.

표준 대기 산소 하에 젤라틴 코팅 또는 젤라틴 코팅을 하지 않은 플라스크 상에서의 성장 배지에서 약 5,000개의 세포/㎠의 밀도로, 단리된 제대 유래 세포를 성장시키는 현재 세포 증식 조건은 계대 11로 많은 수의 세포를 생성시키는데 충분하다. 게다가, 데이터는 세포가 보다 낮은 밀도의 배양 조건(예를 들어, 1,000개의 세포/㎠)을 이용하여 용이하게 증식될 수 있음을 시사한다. 세포 증식 능력의 점진적인 개선이 이러한 성장 조건을 이용할 때에 아직도 관찰되지 않았지만, 저산소 조건에서의 제대 유래 세포 증식은 세포 증식을 촉진시킨다. 현재, 제대 유래 세포를 표준 대기 조건 하에서 배양하는 것이 큰 세포 풀을 생성하는데 바람직하다. 그러나, 배양 조건이 변경되는 경우에, 제대 유래 세포 증식은 마찬가지로 변경될 수 있다. 이러한 전략은 이들 세포 집단의 증식능 및 분화능을 향상시키는데 사용될 수 있다.

이용된 조건 하에서, MSC 및 지방 유래 세포의 증식 능력이 제한되지만, 제대 유래 세포는 상당수로 용이하게 증식한다.

실시예 5

D-발린을 함유하는 배지에서의 세포 성장

통상적인 L-발린 아이소폼 대신에 D-발린을 함유하는 배지가 배양 중 섬유아세포 유사 세포의 성장을 선택적으로 억제시키는데 사용될 수 있는 것으로 보고되어 있다(문헌[Hongpaisan, J. Cell Biol. Int., 2000; 24:1-7]; 문헌[Sordillo et al., Cell Biol. Int. Rep., 1988; 12:355-64]). 제대 유래 세포가 D-발린을 함유하는 배지에서 성장할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.

제대 유래 세포(P5) 및 섬유아세포(P9)를 젤라틴 코팅 T75 플라스크(미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝)에 5,000개의 세포/㎠로 씨딩하였다. 24시간 후에, 배지를 제거하여, 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)로 세척하여, 잔류 배지를 제거하였다. 배지를 변형 성장 배지(D-발린(깁코로부터 특별 주문), 15%(v/v) 투석된 소 태아 혈청(미국 유타주 로건 소재의 하이클론), 0.001%(v/v) 베타메르캅토에탄올(시그마), 50 단위/밀리리터의 페니실린 및 50 밀리그램/밀리리터의 스트렙토마이신(깁코)을 함유한 DMEM)로 교체하였다.

D-발린 함유 배지에 씨딩된 제대 유래 세포 및 섬유아세포는 투석된 혈청을 함유하는 성장 배지에 씨딩된 세포와는 달리, 증식하지 않았다. 섬유아세포는 형태적으로 변화되어, 크기가 증대되고, 형상이 변화하였다. 모든 세포가 사멸하여, 결국은 4주 후에 플라스크 표면으로부터 탈리되었다. 따라서, 제대 조직 유래 세포가 세포 성장을 위해, 장기간 생존력을 유지하기 위해 L-발린을 필요로 하는 것으로 결론을 낼 수 있다. L-발린은 제대 조직 유래 세포의 성장 배지로부터 제거되지 않는 것이 바람직하다.

실시예 6

세포의 핵형 분석

세포 요법에서 사용되는 세포주는 균질하고 오염 세포 유형을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 세포 요법에서 사용되는 인간 세포는 정상 구조를 갖는 정상 개수(46개)의 염색체를 가져야 한다. 균질하고 비제대 조직 유래의 세포를 포함하지 않는 제대 유래 세포주를 동정하기 위하여, 세포 샘플들의 핵형을 분석하였다.

신생아 남아의 산후 조직 유래의 UTC를 성장 배지에서 배양하였다. 신생아 남아(X,Y)로부터의 산후 조직을 선택하여 신생아 유래 세포와 모계 유래 세포(X,X)를 구별하였다. 세포를 T25 플라스크(미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝)에서 성장 배지 중에 제곱센티미터당 5,000개의 세포로 씨딩하여, 80% 컨플루언스로 증식시켰다. 세포를 포함하는 T25 플라스크를 성장 배지로 목 부분까지 충전시켰다. 샘플들을 택배로 임상 세포유전학 실험실로 배달하였다(출발 실험실에서 도착 실험실까지의 예상된 수송 시간은 1시간이다). 염색체 분석은 미국 뉴저지주 뉴어크 소재의 뉴저지 메디칼 스쿨(New Jersey Medical School)의 인간 및 분자 유전학 센터(Center for Human & Molecular Genetics)가 실시하였다. 염색체가 가장 잘 가시화되는 때인 중기 동안 세포를 분석하였다. 계수한 중기의 20개의 세포 중 5개를 정상 균질 핵형 수(2)에 대하여 분석하였다. 두 핵형이 관찰되면 세포 샘플을 균질한 것으로 특징지어졌다. 두 가지가 넘는 핵형이 관찰되면 세포 샘플을 불균질한 것으로 특징지어졌다. 불균질한 핵형 수(4)가 확인되는 때에 추가의 중기 세포를 계수하고 분석하였다.

염색체 분석을 위하여 보낸 모든 세포 샘플은 세포유전학 실험실 스태프에 의해 정상 외관을 나타내는 것으로 해석되었다. 분석한 16가지의 세포주 중 세 가지는 이종성 표현형(XX 및 XY)을 나타냈으며, 이는 신생아 및 모계 기원으로부터 유래된 세포의 존재를 나타내는 것이었다(표 6-1). 각각의 세포 샘플을 균질한 것으로 특징지어졌다(표 6-1).

[표 6-1]

임상 세포유전학 실험실에 의해 해석된 바와 같이 핵형이 정상으로 나타난 제대 유래 UTC를 염색체 분석에 의해 동정하였다. 균질한 핵형에 의해 확인되는 바와 같이, 핵형 분석에 의해 모계 세포를 포함하지 않는 세포주도 동정하였다.

실시예 7

세포 표면 마커들의 유세포 분석법에 의한 평가

유세포 분석법에 의한 세포 표면 단백질 또는 "마커"의 특성화를 이용하여 세포주의 동일성(identity)을 결정할 수 있다. 발현 농도(consistency)는 다수의 공여체로부터, 그리고 다양한 프로세싱 및 배양 조건에 노출된 세포에서 측정될 수 있다. 제대로부터 단리한 산후 세포주를 유세포 분석법에 의해 특징지어졌으며, 이는 이들 세포주의 동정을 위한 프로파일을 제공하였다.

세포를 플라즈마 처리된 T75, T150, 및 T225 조직 배양 플라스크(미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝)에서 컨플루언스까지 성장 배지에서 배양하였다. 플라스크의 성장 표면을 실온에서 20분 동안 2%(w/v) 젤라틴(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)의 인큐베이션에 의해 젤라틴으로 코팅하였다.

플라스크 내의 유착성 세포를 인산염 완충 식염수(PBS; 미국 미주리주 칼스배드 소재의 깁코)로 세척하여, 트립신/EDTA(깁코)로 탈리시켰다. 세포를 수확하여, 원심분리하고, 1 밀리리터당 1×10⁷개의 세포 농도로 PBS 중의 3%(v/v) FBS에 재현탁시켰다. 제조업자의 설명서에 따라, 관심 대상의 세포 표면 마커에 대한 항체(하기 참조)를 100 마이크로리터의 세포 현탁액에 첨가하여, 혼합물을 암소에서 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하여 비결합 항체를 제거하였다. 세포를 500 마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고, 유세포 분석법으로 분석하였다. 유세포 분석법에 의한 분석을 FACScalibur 기기(미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 벡톤 디킨슨)를 이용하여 수행하였다. 하기 세포 표면 마커 항체를 사용하였다(표 7-1 참조).

[표 7-1]

제대 유래 세포를 계대 8, 15, 및 20에서 분석하였다. 공여체들 간의 차이를 비교하기 위하여, 상이한 공여체들로부터의 제대를 서로 비교하였다. 젤라틴 코팅 플라스크에서 배양한 제대 유래 세포를 코팅되지 않은 플라스크에서 배양한 제대 유래 세포와 비교하였다.

세포의 단리 및 준비에 사용한 네 가지의 처리를 비교하였다. 1) 콜라게나아제; 2) 콜라게나아제/디스파아제; 3) 콜라게나아제/히알루로니다아제; 및 4) 콜라게나아제/히알루로니다아제/디스파아제로 처리함으로써 산후 조직으로부터 유래된 세포들을 비교하였다.

유세포 분석법에 의해 분석한 계대 8, 15, 및 20의 제대 유래 세포는 모두 CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-알파 및 HLA-A, B, C를 발현하였으며, 이는 IgG 대조군에 비하여 증가된 형광값을 나타내었다. 이들 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, 및 HLA-DR, DP, DQ에 대하여 음성이었으며, 이는 IgG 대조군과 일치하는 형광값으로 나타났다.

유세포 분석법에 의해 분석한 별도의 공여체들로부터 단리한 제대 유래 세포들 각각은 CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-알파 및 HLA-A, B, C의 생성에 대하여 양성을 나타냈으며, 이는 IgG 대조군에 비하여 증가된 형광값으로 반영되었다. 이들 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, 및 HLA-DR, DP, DQ의 생성에 대하여 음성이었으며, 이때 형광값은 IgG 대조군과 일치하였다.

유세포 분석법에 의해 분석한 젤라틴 코팅 및 코팅되지 않은 플라스크에서 증식된 제대 유래 세포들은 모두 CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-알파 및 HLA-A, B, C의 생성에 대하여 양성을 나타냈으며, 이는 IgG 대조군에 비하여 증가된 형광값을 나타내었다. 이들 세포는 CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, 및 HLA-DR, DP, DQ의 생성에 대하여 음성이었으며, 이때 형광값은 IgG 대조군과 일치하였다.

유세포 분석법에 의한 제대 유래 세포의 분석에 의해 이들 세포주의 동일성을 확립하였다. 제대 조직 유래 세포는 CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-알파, HLA-A,B,C에 대하여 양성이며, CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 및 HLA-DR, DP, DQ에 대하여 음성이다. 이러한 동일성은 공여체, 계대, 배양 용기 표면 코팅, 소화 효소 및 태반 층을 비롯한 변수의 변동들 사이에서 일치하였다. 개별적인 형광값 히스토그램 곡선 평균 및 범위에 있어서 다소 변동이 관찰되었지만, 시험한 모든 조건 하에서의 모든 양의 곡선은 정상이었으며, IgG 대조군보다 더 큰 형광값을 나타냈고, 따라서 세포가 양성 마커 발현을 갖는 균질한 집단을 포함함을 확인해 주었다.

실시예 8

올리고뉴클레오티드 어레이에 의한 세포의 분석

올리고뉴클레오티드 어레이를 사용하여 제대 유래 세포 및 태반 유래 세포의 유전자 발현 프로파일을 섬유아세포, 인간 중간엽 줄기 세포, 및 인간 골수로부터 유래된 다른 세포주와 비교하였다. 이 분석은 산후 유래 세포의 특성화를 제공하며, 이들 세포에 고유한 분자 마커를 동정하였다.

산후 조직 유래 세포

인간 제대 및 태반을 환자의 동의를 얻어 정상 만삭 분만으로부터, NDRI(미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재)로부터 획득하였다. 조직을 수령하여, C:D:H 혼합물로 소화 후에, 실시예 6에서 설명한 바와 같이, 세포를 단리하였다. 세포를 젤라틴 코팅 플라스틱 조직 배양 플라스크에서 성장 배지에서 배양하였다. 배양물을 5% CO₂를 이용하여 37℃에서 인큐베이션하였다.

섬유아세포

인간 피부 섬유아세포를 캄브렉스 인코포레이티드(미국 메릴랜드주 워커스빌 소재; 로트 번호: 9F0844) 및 ATCC CRL-1501(CCD39SK)로부터 구입하였다. 두 가지의 세포주를 10%(v/v) 소 태아 혈청(하이클론) 및 페니실린/스트렙토마이신(인비트로겐)을 포함하는 DMEM/F12 배지(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)에서 배양하였다. 세포를 표준 조직 처리 플라스틱에서 성장시켰다.

인간 중간엽 줄기 세포( hMSC )

hMSC를 캄브렉스 인코포레이티드(미국 메릴랜드주 워커스빌 소재; 로트 번호: 2F1655, 2F1656 및 2F1657)로부터 구입하여, 제조업자의 설명서에 따라 MSCGM 배지(캄브렉스)에서 배양하였다. 세포를 5% CO₂를 이용하여 37℃에서 표준 조직 배양 플라스틱에서 성장시켰다.

인간 장골능 골수 세포( ICBM )

인간 장골능 골수를 환자의 동의를 얻어 NDRI로부터 수령하였다. 상기 골수를 호(Ho) 등이 약술한 방법에 따라 처리하였다(국제 특허 공개 제WO 03/025149호). 상기 골수를 용해 완충제 20부에 대하여 골수 1부의 비율로 용해 완충제(155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 및 0.1 mM EDTA, pH 7.2)와 혼합하였다. 세포 현탁액을 와동시키고, 주위 온도에서 2분 동안 인큐베이션하여, 500 x g으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 10%(v/v) 소 태아 혈청 및 4 mM 글루타민이 보충된 최소 필수 배지-알파(인비트로겐)에 재현탁시켰다. 세포를 다시 원심분리하여, 세포 펠릿을 신선한 배지에 재현탁시켰다. 생존가능한 단핵 세포를 트리판 블루 배제(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)를 이용하여 계수하였다. 단핵 세포를 5 × 10⁴개의 세포/㎠로 플라스틱 조직 배양 플라스크에 씨딩하였다. 표준 대기중 O₂ 또는 5% O₂에서, 5% CO₂를 이용하여 37℃에서 세포를 인큐베이션하였다. 세포를 배지 교환 없이 5일 동안 배양하였다. 배지 및 비유착성 세포를 5일간의 배양 후 제거하였다. 유착성 세포를 배양물 중에서 유지시켰다.

활발하게 성장 중인 세포 배양물들을 냉각 인산염 완충 식염수(PBS) 중에서 셀 스크레이퍼를 이용하여 플라스크로부터 제거하였다. 상기 세포를 300 x g으로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 신선한 PBS에 재현탁시키고, 다시 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 즉시 동결시키고, -80℃로 보관하였다. 세포 mRNA를 추출하여, cDNA로 전사시켰다. 그 후, cDNA를 cRNA로 전사시키고, 바이오틴으로 표지하였다. 바이오틴 표지된 cRNA를 아피메트릭스 진칩(Affymetrix GENECHIP) HG-U133A 올리고뉴클레오티드 어레이(미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 아피메트릭스)와 혼성화하였다. 혼성화 및 데이터 수집을 제조업자의 설명서에 따라 실시하였다. 데이터 분석을 "SAM(Significance Analysis of Microarrays)" 버전 1.21 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 실시하였다(문헌[Tusher, V.G. et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5116-5121]). 분석용 소프트웨어에 대한 라이센스는 스탠포드 대학(Stanford University)의 기술 이전 사무소(Office of Technology Licensing)를 통하여 입수가능하며, 더 많은 정보는 스탠포드 대학 통계학과의 팁쉬라니(Tibshirani) 교수의 웹 사이트에서 월드 와이드 웹 상에서 이용가능하다(www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/).

본 연구에서 14가지의 상이한 세포 집단을 분석하였다. 계대 정보, 배양 기재 및 배양 배지와 함께 세포가 표 8-1에 열거되어 있다. 세포주는 분석 시의 계대, 세포 성장 기재, 및 성장 배지와 함께 이의 세포 동정 코드에 의해 열거된다.

[표 8-1]

상술한 SAM 소프트웨어를 이용하여 주성분 분석에 의해 데이터를 평가하였다. 상기 분석은 시험한 세포에서 상이한 상대적인 양들로 발현되는 290가지의 유전자를 보여 주었다. 이 분석은 집단들 사이에서의 상대적인 비교를 제공하였다.

표 8-2는 세포쌍 비교용으로 계산된 유클리드 거리(Euclidean distance)를 나타낸다. 유클리드 거리는 세포 유형들 사이에서 차별적으로 발현된 290가지의 유전자를 기반으로 한 세포의 비교를 기초로 하였다. 유클리드 거리는 290가지의 유전자의 발현 사이의 유사성에 반비례한다. 유클리드 거리를 세포 유형들 사이에서 차별적으로 발현된 290가지의 유전자를 이용하여 세포 유형들에 대하여 계산하였다. 세포들 사이의 유사성은 유클리드 거리에 반비례한다.

[표 8-2]

표 8-3, 표 8-4, 및 표 8-5는 태반 유래 세포에서 증가된(표 8-3), 제대 유래 세포에서 증가된(표 8-4), 그리고 제대 및 태반 유래 세포에서 감소된(표 8-5) 유전자들의 발현을 나타낸다.

[표 8-3]

[표 8-4]

[표 8-5]

표 8-6, 표 8-7 및 표 8-8은 인간 섬유아세포 (표 8-6), ICBM 세포 (표 8-7), 및 MSC (표 8-8)에서 유전자 발현이 증가되었음을 나타낸다.

[표 8-6]

[표 8-7]

[표 8-8]

본 실시예는 제대 및 태반으로부터 유래된 세포의 분자적 특성화를 제공하기 위하여 실시하였다. 이러한 분석은 3가지의 상이한 제대 및 3가지의 상이한 태반으로부터 유래된 세포를 포함하였다. 본 연구는 또한 2가지의 상이한 피부 섬유아세포주, 3가지의 중간엽 줄기 세포주, 및 3가지의 장골능 골수 세포주를 포함하였다. 이들 세포에 의해 발현된 mRNA를 22,000가지의 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 진칩 올리고뉴클레오티드 어레이에서 분석하였다.

이 분석은 290가지의 유전자에 대한 전사체가 이들 5가지의 상이한 세포 유형에서 상이한 양들로 존재함을 보여 주었다. 이들 유전자는 태반 유래 세포에서 특이적으로 증가하는 10가지의 유전자 및 제대 유래 세포에서 특이적으로 증가하는 7가지의 유전자를 포함한다. 54가지의 유전자는 태반 유래 세포 및 제대 조직 유래 세포에서 특이적으로 더 낮은 발현 수준을 갖는 것으로 밝혀졌다.

실시예 9에 제시된 바와 같이, 선택된 유전자의 발현을 PCR로 확인하였다. 통상, 산후 유래 세포, 특히 제대 유래 세포는 예를 들어, 본 실시예에서 시험된 다른 인간 세포, 예컨대 골수 유래 세포 및 섬유아세포와 비교하여, 뚜렷한 유전자 발현 프로파일을 갖는다.

실시예 9

세포 마커

인간 제대 및 인간 태반으로부터 유래된 세포의 유전자 발현 프로파일을 아피메트릭스 진칩을 이용하여 다른 공급원으로부터 유래된 세포의 것과 비교하였다. 6가지의 "시그너처(signature)" 유전자를 동정하였다: 산화 LDL 수용체 1, 인터류킨-8(IL-8), 레닌, 레티큘론, 케모카인 수용체 리간드 3(CXC 리간드 3), 및 과립구 주화성 단백질 2(GCP-2). 이들 "시그너처" 유전자는 제대 유래 세포에서 비교적 높은 수준으로 발현되었다.

본 실시예에서 설명한 절차를 행하여 마이크로어레이 데이터를 검증하고, 유전자 및 단백질 발현 데이터를 비교하며, 이외에도, 제대 유래 세포의 고유 식별자의 검출을 위한 일련의 신뢰성 있는 분석법을 확립하였다.

제대 유래 세포(4개의 분리주(isolate)), 태반 유래 세포(핵형 분석에 의해 동정한 주로 신생아의 1개의 분리주를 비롯한 3개의 분리주) 및 정상 인간 피부 섬유아세포(NHDF; 신생아 및 성인)를 젤라틴 코팅 T75 플라스크에서 성장 배지에서 성장시켰다. 중간엽 줄기 세포(MSC)를 중간엽 줄기 세포 성장 배지 불렛(Bullet) 키트(MSCGM; 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 캄브렉스)에서 성장시켰다.

IL-8 실험에 있어서, 세포를 액체 질소로부터 해동시켜, 젤라틴 코팅 플라스크에 5,000개의 세포/㎠로 도말하여, 성장 배지에서 48시간 동안 성장시킨 다음에, 10 밀리리터의 혈청 기아 배지 [DMEM ―저농도 글루코스(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코), 페니실린(50 단위/밀리리터), 스트렙토마이신(50 마이크로그램/밀리리터)(깁코) 및 0.1%(w/v) 소혈청알부민(BSA; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)]에서 추가로 8시간 동안 성장시켰다. 그 다음에, RNA를 추출하고, 상청액을 150 x g으로 5분 동안 원심분리하여 세포 잔사를 제거하였다. 상청액을 ELISA 분석 시까지 -80℃로 냉동시켰다.

인간 신생아 포피로부터 유래된 인간 섬유아세포 뿐만 아니라, 제대 조직 유래 세포 및 태반 조직 유래 세포를 젤라틴 코팅 T75 플라스크에서 성장 배지에서 배양시켰다. 세포를 액체 질소에서 계대 11에서 냉동시켰다. 세포를 해동시켜, 15 밀리리터 원심분리관으로 옮겼다. 5분간 150 x g으로 원심분리 후, 상청액을 버렸다. 세포를 4 밀리리터 배양 배지에 재현탁시켜, 계수하였다. 세포를 15 밀리리터의 성장 배지를 함유하는 75 ㎠ 플라스크에서 플라스크당 375,000개의 세포로 24시간 동안 성장시켰다. 배지를 8시간 동안 혈청 기아 배지로 교환하였다. 혈청 기아 배지를 인큐베이션 종료 시에 수집하여, 5분간 14,000 x g으로 원심분리하였다(그리고 -20℃로 보관하였다).

각각의 플라스크에서의 세포수를 측정하기 위해, 2 밀리리터의 트립신/EDTA(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)를 각각의 플라스크에 첨가하였다. 세포를 플라스크로부터 탈리시킨 후, 트립신 활성을 8 밀리리터의 성장 배지로 중화시켰다. 세포를 15 밀리리터의 원심분리관으로 옮겨, 5분간 150 x g으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 1 밀리리터의 성장 배지를 각각의 튜브에 첨가하여 세포를 재현탁시켰다. 세포수를 혈구계를 이용하여 측정하였다.

세포에 의해 혈청 기아 배지 내로 분비되는 IL-8의 양을 ELISA 분석법(미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 알앤디 시스템즈(R&D Systems))을 이용하여 분석하였다. 모든 분석을 제조업자가 제공한 설명서에 따라 수행하였다.

RNA를 컨플루언트(confluent) 제대 유래 세포 및 섬유아세포로부터 추출하거나, IL-8 발현을 위해서는 상술한 바와 같이 처리한 세포로부터 추출하였다. 세포를 제조업자의 설명서에 따라 베타-메르캅토에탄올(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)을 함유하는 350 마이크로리터의 완충제 RLT를 이용하여 용해시켰다(알엔이지(RNeasy)® 미니 키트(Mini Kit); 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠(Qiagen)). RNA를 제조업자의 설명서에 따라 추출하고(알엔이지 미니 키트; 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠), DNase 처리(2.7 단위/샘플)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)를 가하였다. RNA를 50 마이크로리터의 DEPC 처리된 물로 용리시켜, -80℃로 보관하였다. 또한 RNA를 인간 제대로부터 추출하였다. 조직(30 밀리그램)을 베타-메르캅토에탄올을 함유하는 700 마이크로리터의 완충제 RLT에 현탁시켰다. 샘플을 기계적으로 균질화하여, 제조업자의 설명서에 따라 RNA 추출을 진행하였다. RNA를 50 마이크로리터의 DEPC 처리된 물로 추출하여, -80℃로 보관하였다.

RNA를 탁맨(TaqMan)® 역전사 시약(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 이용하여 25℃, 10분; 37℃, 60분; 및 95℃, 10분에서 랜덤 헥사머를 사용하여 역전사시켰다. 샘플들을 -20℃로 보관하였다.

제대 세포 및 태반 세포에서 특이적으로 조절되는 것으로서 cDNA 마이크로어레이에 의해 동정된 유전자(시그너처 유전자 - 산화 LDL 수용체, 인터류킨-8, 레닌 및 레티큘론을 포함함)를 실시간 및 통상적인 PCR을 사용하여 추가로 조사하였다.

PCR을 상품명 "어세이즈-온-디맨드(ASSAYS-ON-DEMAND)" 하의 유전자 발현 산물로 시판되는 유전자 발현 산물을 사용하여 cDNA 샘플에서 수행하였다. 산화 LDL 수용체(Hs00234028); 레닌(Hs00166915); 레티큘론(Hs00382515); CXC 리간드 3(Hs00171061); GCP-2(Hs00605742); IL-8(Hs00174103); 및 GAPDH를, ABI 프리즘(Prism) 7000 SDS 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템즈)를 갖춘 7000 서열 검출 시스템을 이용하여, 제조업자의 설명서(어플라이드 바이오시스템즈)에 따라 cDNA 및 탁맨® 범용 PCR 마스터 믹스(master mix)와 혼합하였다. 열사이클(thermal cycle) 조건은 처음에 50℃, 2분 및 95℃, 10분, 이어서 95℃, 15초 및 60℃, 1분의 40 사이클이었다. PCR 데이터를 제조업자의 설명서(ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템용 어플라이드 바이오시스템즈의 사용자 불레틴 #2)에 따라 분석하였다.

통상적인 PCR을 ABI 프리즘 7700(미국 매사추세츠주 보스턴 소재의 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템즈(Perkin Elmer Applied Biosystems))을 사용하여 수행하여 실시간 PCR로부터의 결과를 확인하였다. PCR을 2 마이크로리터의 cDNA 용액(1× Taq 폴리머라아제(상품명 "앰플리탁 골드(AMPLITAQ GOLD)") 범용 믹스 PCR 반응 완충제(어플라이드 바이오시스템즈) 및 94℃에서의 5분 동안의 초기 변성을 이용하여 수행하였다. 증폭을 각각의 프라이머 세트에 대하여 최적화하였다. IL-8, CXC 리간드 3, 및 레티큘론의 경우(94℃, 15초; 55℃, 15초 및 72℃, 30초, 30 사이클); 레닌의 경우(94℃, 15초; 53℃, 15초 및 72℃, 30초, 38 사이클); 산화 LDL 수용체 및 GAPDH의 경우(94℃, 15초; 55℃, 15초 및 72℃, 30초, 33 사이클). 증폭에 이용한 프라이머가 표 9-1에 열거되어 있다. 최종 PCR 반응물 중의 프라이머 농도는 0.5 마이크로몰인 GAPDH를 제외하고는 1 마이크로몰이었다. GAPDH 프라이머는, 제조업자의 탁맨® 프로브를 최종 PCR 반응물에 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시간 PCR과 동일하였다. 샘플을 2%(w/v) 아가로스 겔 상에서 분리하여, 브롬화에티듐(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)로 염색하였다. 고정 초점 거리 폴라로이드(POLAROID) 카메라(미국 뉴저지주 사우스 플레인필드 소재의 브이더블유알 인터내셔널(VWR International))를 사용하여 667 필름(범용 트윈팩(Twinpack), 미국 뉴저지주 사우스 플레인필드 소재의 브이더블유알 인터내셔널)에 영상을 포착하였다.

[표 9-1]

제대 유래 세포 및 태반 조직 유래 세포를 냉각 4%(w/v) 파라포름알데히드(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치)를 이용하여 실온에서 10분 동안 고정하였다. 계대 0(P0)(단리 직후) 및 계대 11(P11)(제대 유래 세포의 2개의 분리주)의 제대 유래 세포 중 각각의 1개의 분리주와, 섬유아세포(P11)를 사용하였다. 면역세포화학법을 하기 에피토프에 대한 항체를 사용하여 수행하였다: 비멘틴(1:500, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마), 데스민(1:150; 시그마 - 토끼에 대하여 생성함; 또는 1:300; 미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재의 케미콘(Chemicon) ― 마우스에 대하여 생성함), 알파-평활근 액틴(SMA; 1:400; 시그마), 사이토케라틴 18(CK18; 1:400; 시그마), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor; vWF; 1:200; 시그마), 및 CD34(인간 CD34 클래스 III; 1:100; 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재의 다코사이토메이션(DAKOCytomation)). 게다가, 하기 마커를 계대 11의 제대 유래 세포에서 검사하였다: 항인간 GRO알파 - PE(1:100; 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 디킨슨), 항인간 GCP-2(1:100; 미국 캘리포니아주 샌타크루즈 소재의 샌타크루즈 바이오테크(Santa Cruz Biotech)), 항인간 산화 LDL 수용체 1(ox-LDL R1; 1:100; 샌터크루즈 바이오테크), 및 항인간 NOGA-A(1:100; 샌터크루즈 바이오테크).

배양물을 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고, PBS, 4%(v/v) 염소 혈청(미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재의 케미콘), 및 0.3%(v/v) 트리톤(트리톤 X-100; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)을 함유하는 단백질 차단 용액에 30분 동안 노출시켜 세포내 항원에 접근하였다. 관심대상의 에피토프가 세포 표면(CD34, ox-LDL R1) 상에 위치하는 경우, 에피토프 손실을 방지하기 위해 트리톤 X-100을 이 절차의 모든 단계에서 제외시켰다. 더욱이, 일차 항체를 염소(GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A)에 대하여 생성하는 경우에, 3%(v/v) 당나귀 혈청을 이 과정 전체에 걸쳐 염소 혈청 대신에 사용하였다. 그 후, 차단 용액에 희석시킨 일차 항체를 실온에서 1시간 동안 상기 배양물에 적용하였다. 일차 항체 용액을 제거하여, 배양물을 PBS로 세척한 후, 차단액을 염소 항마우스 IgG ― 텍사스 레드(Texas Red)(1:250; 미국 오리건주 유진 소재의 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes)) 및/또는 염소 항토끼 IgG - 알렉사(Alexa) 488(1:250; 몰레큘러 프로브즈) 또는 당나귀 항염소 IgG ― FITC(1:150, 샌터크루즈 바이오테크)와 함께 함유하는 이차 항체 용액을 적용하였다(실온에서 1시간). 그 후, 배양물을 세척하고, 10 마이크로몰의 DAPI(몰레큘러 프로브즈)를 10분 동안 적용하여 세포핵을 가시화하였다.

면역염색 후, 올림푸스(Olympus) 도립 에피 형광 현미경(미국 뉴욕주 멜빌 소재의 올림푸스)에서 적절한 형광 필터를 사용하여 형광을 가시화하였다. 모든 경우에, 양성 염색은 대조군 염색보다 더 많은 형광 신호를 나타냈으며, 여기서 일차 항체 용액(1°대조군 없음)의 적용을 제외하고는 상기에 약술된 전체 절차를 따랐다. 대표적인 영상을 디지털 컬러 비디오 카메라 및 이미지-프로(Image-Pro) 소프트웨어(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 메디아 사이버네틱스(Media Cybernetics))를 사용하여 포착하였다. 삼중 염색된 샘플에 있어서, 각각의 영상을 한 번에 단지 하나의 방사 필터를 사용하여 촬영하였다. 그 후, 어도비 포토샵(Adobe Photoshop) 소프트웨어(미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 어도비(Adobe))를 사용하여 층상 몽타주를 작성하였다.

플라스크 내의 유착성 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)로 세척하여, 트립신/EDTA(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)로 탈리시켰다. 세포를 수확하여, 원심분리하고, 1 밀리리터당 1×10⁷개의 세포 농도로 PBS 중의 3%(v/v) FBS에 재현탁시켰다. 100 마이크로리터의 분취물을 원뿔형 튜브에 전달하였다. 세포내 항원에 대하여 염색된 세포를 투과/세척(Perm/Wash) 완충제(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 비디 파밍젠)로 투과처리하였다. 제조업자의 설명서에 따라 항체를 분취물에 첨가하여, 세포를 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하여 여분의 항체를 제거하였다. 이차 항체를 필요로 하는 세포를 100 마이크로리터의 3% FBS에 재현탁시켰다. 제조업자의 설명서에 따라 이차 항체를 첨가하여, 세포를 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하여 여분의 이차 항체를 제거하였다. 세척된 세포를 0.5 밀리리터의 PBS에 재현탁시켜, 유세포 분석법으로 분석하였다. 하기 항체를 사용하였다: 산화 LDL 수용체 1(sc-5813; 샌터크루즈 바이오테크), GROa(555042; 미국 매사추세츠주 베드포드 소재의 비디 파밍젠), 마우스 IgG1 카파(P-4685 및 M-5284; 시그마), 및 염소 IgG에 대한 당나귀(sc-3743; 샌터크루즈 바이오테크). 유세포 분석법에 의한 분석을 FACScalibur(미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 벡톤 디킨슨)를 이용하여 수행하였다.

인간 제대, 인간 태반 조직, 성인 및 신생아 섬유아세포, 및 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 유래된 세포의 cDNA에 대하여 수행된 선택된 "시그너처" 유전자에 관한 실시간 PCR의 결과는 레티큘론 발현이 다른 세포와 비교하여, 제대 유래 세포에서 더 높았음을 나타낸다. 실시간 PCR로부터 수득된 데이터를 ΔΔCT법으로 분석하여, 로그 스케일로 표시하였다. CXC 리간드 3 및 GCP-2의 발현 수준에 있어서의 유의차가 산후 세포와 대조군 사이에서 발견되지 않았다. 실시간 PCR의 결과를 통상적인 PCR로 확인하였다. PCR 산물의 서열결정은 이들 관찰을 더욱더 입증하였다. 표 9-1에 열거된 통상적인 PCR CXC 리간드 3 프라이머들을 사용한 CXC 리간드 3의 발현 수준에 있어서의 유의차가 산후 유래 세포와 대조군 사이에서 발견되지 않았다.

제대 세포에서의 사이토카인, IL-8의 발현은 성장 배지 배양 세포 및 혈청 기아 제대 유래 세포에서 향상되었다. 모든 실시간 PCR 데이터를 통상적인 PCR을 이용하여, PCR 산물의 서열결정에 의해 입증하였다.

무혈청 배지에서의 성장 후에, 조정 배지를 IL-8의 존재에 대하여 조사하였다. 표 9-2는 인간 피부 섬유아세포 뿐만 아니라, 태반 유래 세포 및 제대 유래 세포에 대하여 수행된 인터류킨-8(IL-8)에 관한 ELISA 분석의 결과를 나타낸다. 본 실시예에 나타낸 값은 피코그램/백만 세포, n=2, sem이다. ND: 검출되지 않음.

제대 세포가 성장된 배지에서 가장 많은 양의 IL-8가 검출되었다(표 9-2). 인간 피부 섬유아세포가 성장된 배지에서는 IL-8가 검출되지 않았다.

[표 9-2]

계대 0의, 인간 제대로부터 유래된 세포를 면역세포화학적 분석에 의해, 선택된 단백질의 생성에 대하여 프로빙하였다. 단리 직후(계대 0), 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 6가지의 단백질에 대한 항체에 노출시켰다: 폰 빌레브란트 인자, CD34, 사이토케라틴 18, 데스민, 알파-평활근 액틴, 및 비멘틴. 제대 유래 세포는 알파-평활근 액틴 및 비멘틴에 대하여 양성이었으며, 이때 염색 패턴은 계대 11까지 일관되었다.

계대 11의 제대 유래 세포에 있어서의 GRO알파, GCP-2, 산화 LDL 수용체 1 및 레티큘론(NOGO-A)의 생성을 면역세포화학에 의해 조사하였다. 제대 유래 세포는 GCP-2에 대하여 양성이지만, GRO 알파 생성은 이러한 방법에 의해 검출되지 않았다. 게다가, 세포는 NOGO-A에 대하여 양성이었다.

마이크로어레이 및 PCR(실시간 PCR 및 통상적인 PCR)에 의해 측정한 유전자 발현 수준들 사이의 일치가 하기 4가지의 유전자에 대하여 확립되었다: 산화 LDL 수용체 1, 레닌, 레티큘론, 및 IL-8. 이들 유전자의 발현은 제대 유래 세포에서 mRNA 수준에서 차별적으로 조절되었으며, 이때 IL-8도 단백질 수준에서 차별적으로 조절되었다. GCP-2 및 CXC 리간드 3의 차별적 발현이 mRNA 수준에서 확인되지 않았다. 이러한 결과가 마이크로어레이 실험으로부터 최초에 얻은 데이터를 지지하지는 않지만, 이것은 방법의 감도차로 인한 것일 수 있다.

계대 0의, 인간 제대로부터 유래된 세포를 알파-평활근 액틴 및 비멘틴의 발현에 대하여 프로빙하였으며, 이들 둘 다에 대하여 양성이었다. 염색 패턴은 계대 11까지 보존되었다.

결론적으로, 완전한 mRNA 데이터는 마이크로어레이 실험으로부터 얻은 데이터를 적어도 부분적으로 입증한다.

실시예 10

세포 표현형의 면역조직화학적 특성화

인간 제대 조직 내에서 발견되는 세포의 표현형을 면역조직화학법에 의해 분석하였다.

인간 제대 조직을 수확하여, 4%(w/v) 파라포름알데히드에서 4℃에서 하룻밤 침지 고정시켰다. 면역조직화학법을 하기 에피토프에 대한 항체들을 사용하여 수행하였다(표 10-1 참조): 비멘틴(1:500; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마), 데스민(1:150, 토끼에 대하여 생성; 시그마; 또는 1:300, 마우스에 대하여 생성; 케미콘, 미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재), 알파-평활근 액틴(SMA; 1:400; 시그마), 사이토케라틴 18(CK18; 1:400; 시그마), 폰 빌레브란트 인자(vWF; 1:200; 시그마), 및 CD34(인간 CD34 클래스 III; 1:100; 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재의 다코사이토메이션). 게다가, 하기 마커를 시험하였다: 항인간 GRO알파-PE(1:100; 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 디킨슨), 항인간 GCP-2(1:100; 미국 캘리포니아주 샌타크루즈 소재의 샌타크루즈 바이오테크), 항인간 산화 LDL 수용체 1(ox-LDL R1; 1:100; 샌타크루즈 바이오테크), 및 항인간 NOGO-A(1:100; 샌타크루즈 바이오테크). 고정시킨 표본을 메스로 트리밍하여(trimmed), 에탄올을 함유하는 드라이아이스조에서 OCT 임베딩 컴파운드(embedding compound)(티슈-텍 오씨티(Tissue-Tek OCT); 미국 캘리포니아주 토란스 사쿠라 소재) 내에 두었다. 그 후, 냉동 블록을 표준 저온 유지 장치(cryostat)(라이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems))를 사용하여 박편화하고(10 ㎛의 두께), 염색을 위하여 유리 슬라이드 상에 탑재하였다.

면역조직화학법을 이전 연구와 유사하게 수행하였다(예를 들어, 문헌[Messina, et al. Exper. Neurol., 2003; 184: 816-829]). 간략하게는, 조직 절편을 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여, PBS, 4%(v/v) 염소 혈청(미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재의 케미콘), 및 0.3%(v/v) 트리톤(트리톤 X-100; 시그마)을 함유하는 단백질 차단 용액에 1시간 동안 노출시켜 세포내 항원에 접근하였다. 관심대상의 에피토프가 세포 표면(CD34, ox-LDL R1) 상에 위치하는 경우, 에피토프 손실을 방지하기 위해 트리톤을 이 절차의 모든 단계에서 제외시켰다. 더욱이, 일차 항체를 염소(GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A)에 대하여 생성하는 경우에, 3%(v/v) 당나귀 혈청을 이 절차 전체에 걸쳐 염소 혈청 대신에 사용하였다. 그 후, 차단 용액에서 희석시킨 일차 항체를 실온에서 4시간 동안 상기 절편에 적용하였다. 일차 항체 용액을 제거하여, 배양물을 PBS로 세척한 후, 차단액을 염소 항마우스 IgG -텍사스 레드(1:250; 미국 오리건주 유진 소재의 몰레큘러 프로브즈) 및/또는 염소 항토끼 IgG - 알렉사 488(1:250; 몰레큘러 프로브즈) 또는 당나귀 항염소 IgG - FITC(1:150; 샌타크루즈 바이오테크)와 함께 함유하는 이차 항체 용액을 적용하였다(실온에서 1시간). 배양물을 세척하고, 10 마이크로몰의 DAPI(몰레큘러 프로브즈)를 10분 동안 적용하여 세포핵을 가시화하였다.

면역염색 후, 올림푸스 도립 에피 형광 현미경(미국 뉴욕주 멜빌 소재의 올림푸스)에서 적절한 형광 필터를 사용하여 형광을 가시화하였다. 양성 염색은 대조군 염색보다 더 많은 형광 신호를 나타냈다. 대표적인 영상을 디지털 컬러 비디오 카메라 및 이미지-프로 소프트웨어(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 메디아 사이버네틱스)를 사용하여 포착하였다. 삼중 염색된 샘플에 있어서, 각각의 영상을 한 번에 단지 하나의 방사 필터를 사용하여 촬영하였다. 그 후, 어도비 포토샵 소프트웨어(미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 어도비)를 사용하여 층상 몽타주를 작성하였다.

[표 10-1]

비멘틴, 데스민, SMA, CK18, vWF, 및 CD34 마커가 제대 내에서 발견되는 세포의 아형에서 발현되었다(데이터는 예시되어 있지 않음). 특히, vWF 및 CD34 발현은 제대 내에 함유된 혈관에 제한되었다. CD34+ 세포는 가장 안쪽의 층(세포내강측)에 있었다. 비멘틴 발현이 제대의 혈관 및 매트릭스 전체에 걸쳐 발견되었다. SMA는 동맥 및 정맥의 외벽 및 매트릭스에 한정되었지만, 혈관 그 자체는 포함되지 않았다. CK18 및 데스민이 단지 혈관 내에서 관찰되었으며, 데스민은 중간층 및 외층에 제한되었다.

이들 마커들 중 어떠한 것도 제대 내에서 관찰되지 않았다(데이터는 예시되어 있지 않음).

비멘틴, 데스민, 알파-평활근 액틴, 사이토케라틴 18, 폰 빌레브란트 인자, 및 CD 34는 인간 제대 내의 세포에서 발현된다. 단지 비멘틴 및 알파-평활근 액틴이 발현됨을 나타내는 시험관 내 특성화 연구를 기반으로 하면, 당해 데이터는 현재의 제대 유래 세포 단리 과정이 세포의 아집단을 수확하거나 단리된 세포가 비멘틴 및 알파-평활근 액틴이 발현되도록 마커의 발현을 변화시킴을 시사한다.

실시예 11

UTC의 배양액 중에서의 성장 시의 영양 인자의 분비

제대 유래 세포로부터의 선택된 영양 인자의 분비를 측정하였다. 혈관형성 활성을 갖는 인자를 선택하였다(즉, 간세포 성장 인자(HGF)(문헌[Rosen et al. Ciba Found. Symp. 1997; 212:215-26]), 단핵구 주화성 단백질 1(단핵구 화학주성인자-1로도 공지됨)(MCP-1)(문헌[Salcedo et al. Blood, 2000; 96;34-40]), 인터류킨-8(IL-8)(문헌[Li et al. J. Immunol., 2003; 170:3369-76]), 케라틴 세포 성장 인자(KGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF)(문헌[Hughes et al. Ann. Thorac. Surg., 2004 77:812-8]), 매트릭스 메탈로프로테이나아제 1의 조직 저해제(TIMP1), 앙기오포이에틴 2(ANG2), 혈소판 유래 성장 인자(PDGFbb), 트롬보포이에틴(TPO), 헤파린 결합 표피 성장 인자(HB-EGF), 신경 영양/신경보호 활성(뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)(문헌[Cheng et al. Dev. Biol., 2003; 258;319-33]), 간질 유래 인자 1알파(SDF-1알파), 인터류킨-6(IL-6), 과립구 주화성 단백질-2(GCP-2), 형질전환 성장 인자 베타2(TGF베타2)), 또는 케모카인 활성(대식세포 염증성 단백질 1알파(MIP1알파(MIP1α)), 대식세포 염증성 단백질 1 베타(MIP1베타(MIP1β)), RANTES(활성화 시에 조절된, 발현 및 분비된 정상 T 세포), I309, 흉선 및 활성화 조절 케모카인(TARC), 에오탁신(Eotaxin), 대식세포 유래 케모카인(MDC).

인간 신생아 포피로부터 유래된 인간 섬유아세포 뿐만 아니라, 제대로부터 유래된 세포도 젤라틴 코팅 T75 플라스크에서 성장 배지에서 배양하였다. 세포를 계대 11에서 동결보존하여, 액체 질소에서 보관하였다. 해동 후, 성장 배지를 세포에 첨가하고, 이어서 15 밀리리터 원심분리관에 옮겨, 세포를 5분간 150 x g으로 원심분리하였다. 세포 펠릿을 4 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시켜, 세포를 계수하였다. 세포를 각각 15 ml의 성장 배지를 포함하는 T75 플라스크들에서 5,000개의 세포/㎠로 씨딩하여, 24시간 동안 배양하였다. 배지를 8시간 동안 무혈청 배지(DMEM-저농도 글루코스(깁코), 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민(시그마), 페니실린(50 단위/밀리리터) 및 스트렙토마이신(50 마이크로그램/밀리리터, 깁코))로 교환하였다. 무혈청 조절 배지를 인큐베이션 종료 시에 5분간 14,000 x g으로 원심분리하여 수집하고, -20℃로 보관하였다.

각각의 플라스크에서의 세포수를 측정하기 위해, 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여, 2 밀리리터의 트립신/EDTA(깁고)를 사용하여 탈리시켰다. 트립신 활성을 8 밀리리터의 성장 배지의 첨가에 의해 억제시켰다. 상기 세포를 5분간 150 x g으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하여, 세포를 1 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시켰다. 세포수를 혈구계를 이용하여 개산하였다.

세포를 5% 이산화탄소 및 대기중 산소에서 37℃에서 성장시켰다. 각각의 세포 샘플에 의해 생성된 MCP-1, IL-6, VEGF, SDF-1알파, GCP-2, IL-8, 및 TGF-베타2의 양을 ELISA(미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 알앤디 시스템즈)로 측정하였다. 모든 분석을 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. 제시된 값들은 100만개의 세포당 1 ml당 피코그램이다(n=2, sem).

케모카인(MIP1알파(MIP1α), MIP1베타(MIP1β), MCP-1, RANTES, I309, TARC, 에오탁신, MDC, IL-8), BDNF, 및 혈관형성 인자(HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1, ANG2, PDGFbb, TPO, HB-EGF)를 서치라이트(SearchLight)™ 프로테옴 어레이즈(Proteome Arrays)(피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology Inc.))를 사용하여 측정하였다. 프로테옴 어레이즈는 웰당 2 내지 16가지의 단백질의 정량적 측정을 위한 다중 샌드위치 ELISA이다. 상기 어레이는 96-웰 플레이트의 각각의 웰 내에 4 내지 16가지의 상이한 포착 항체의 2 × 2, 3 × 3, 또는 4 × 4 패턴의 스포팅(spotting)에 의해 생성된다. 샌드위치 ELISA 절차 이후에, 전체 플레이트를 플레이트의 각각의 웰 내에서 각각의 스폿(spot)에서 발생된 화학발광 시그널을 포착하도록 영상화한다. 각각의 스폿에서 발생된 시그널은 원래의 표준물질 또는 샘플 중의 표적 단백질의 양에 비례한다.

MCP-1 및 IL-6은 제대 유래 PPDC 및 피부 섬유아세포에 의해 분비되었다(표 11-1). SDF-1알파(SDF-1α) 및 GCP-2는 섬유아세포에 의해 분비되었다. GCP-2 및 IL-8은 제대 유래 PPDC에 의해 분비되었다. TGF-베타2는 ELISA에 의해 어떤 세포 유형으로부터도 검출되지 않았다.

[표 11-1]

서치라이트™ 다중 ELISA 분석

배양액 중에서의 성장 시에, TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1베타, MCP1, RANTES, I309, TARC, MDC, 및 IL-8이 제대 유래 PPDC로부터 분비되었다(하기 표 11-2 및 11-3 참조). Ang2, VEGF, 또는 PDGFbb는 검출되지 않았다.

[표 11-2]

[표 11-3]

제대 유래 세포는 배양 시에 다수의 영양 인자를 분비하였다. HGF, bFGF, MCP-1 및 IL-8과 같은 이들 영양 인자 중 일부는 혈관형성에 있어서 중요한 역할을 한다. 다른 영양 인자, 예를 들어 BDNF 및 IL-6은 신경 재생 또는 보호에서 중요한 역할을 한다.

실시예 12

시험관 내에서의 면역학

제대 세포주를, 있다면, 이들 세포가 생체 내 이식시에 유발하였을 면역 반응을 예측하기 위해 그의 면역학적 특성에 대하여 시험관 내에서 평가하였다. 산후 세포주를 HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, 및 B7-H2의 발현에 대하여 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 이들 단백질은 항원 제시 세포(antigen-presenting cell; APC)에 의해 발현되며, 미성숙(

) CD4⁺ T 세포의 직접적인 자극에 필요하다(문헌[Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5th Ed.(2003) Saunders, Philadelphia, p. 171]). 또한 상기 세포주들을 HLA-G(상기 문헌[Abbas & Lichtman] 참조), CD178(문헌[Coumans, et.al., (1999) Journal of Immunological Methods 224, 185-196]), 및 PD-L2(상기 문헌[Abbas & Lichtman] 참조; 문헌[Brown, et. al. The Journal of Immunology 170, 2003; 1257-1266])의발현에 대하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 산후 제대 유래 세포주가 생체 내에서 면역 반응을 유발하는 정도를 예측하기 위하여, 상기 세포주들을 일방향 혼합 림프구 반응(MLR)에서 시험하였다.

2% 젤라틴(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)으로 코팅된 T75 플라스크(미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝)에서 성장 배지에서 컨플루언트될 때까지 세포를 배양하였다.

세포를 인산염 완충 식염수(PBS)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 깁코)로 세척하여, 트립신/EDTA(미국 미주리주 칼스배드 소재의 깁코)로 탈리시켰다. 세포를 수확하여, 원심분리하고, 1 밀리리터당 1×10⁷개의 세포 농도로 PBS 중의 3%(v/v) FBS에 재현탁시켰다. 항체(표 12-1)를 제조업자의 설명서에 따라, 100 마이크로리터의 세포 현탁액에 첨가하여, 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리하여 미결합 항체를 제거하였다. 세포를 500 마이크로리터의 PBS에서 재현탁시켜, FACSCalibur 기기(미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 벡톤 디킨슨)를 사용하여 유세포 분석법으로 분석하였다.

[표 12-1]

세포주 "A"로 표지한, 계대 10의 제대 유래 PPDC의 동결보존된 바이알을 드라이아이스 상에서 패키징하여, CTBR(캐나다 퀘벡주 센느빌)로 보내서 CTBR SOP 번호 CAC-031을 사용하여 혼합 림프구 반응을 행하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 다수의 남성 및 여성 자원 공여체로부터 수집하였다. 6가지의 인간 자원 혈액 공여체를 스크리닝하여, 다른 5가지의 혈액 공여체를 이용한 혼합 림프구 반응에서 강한 증식 반응을 나타낸 하나의 동종 이계 공여체를 동정하였다. 이 공여체를 동종 이계 양성 대조 공여체로서 선택하였다. 나머지 5가지의 혈액 공여체를 수령체로서 선택하였다. 자극(공여체) 동종 이계 PBMC, 자가 PBMC, 및 산후 세포주를 마이토마이신 C로 처리하였다. 자가 및 마이토마이신 C 처리 자극 세포를 응답(수령) PBMC에 첨가하여, 4일 동안 배양하였다. 인큐베이션 후, [³H]티미딘을 각각의 샘플에 첨가하여, 18시간 동안 배양하였다. 세포 수확 후, 방사성 표지된 DNA를 추출하고, [³H]-티미딘 혼입량을 신틸레이션 카운터(scintillation counter)를 사용하여 측정하였다. 반응은 플레이트당 3가지의 수령체를 포함하는 2개의 세포 배양 플레이트를 사용하여 삼중으로 수행하였다.

동종 이계 공여체의 자극 지수(stimulation index for the allogeneic donor; SIAD)는 수령체 + 마이토마이신 C 처리 동종 이계 공여체의 평균 증식률을 수령체의 기저선 증식률로 나눈 것으로 계산하였다. 산후 세포의 자극 지수는 수령체 + 마이토마이신 C 처리 산후 세포주의 평균 증식률을 수령체의 기저선 증식률로 나눈 것으로 계산하였다.

6가지의 인간 자원 혈액 공여체를 스크리닝하여, 다른 5가지의 혈액 공여체를 이용한 혼합 림프구 반응에서 강한 증식 반응을 나타낼 하나의 동종 이계 공여체를 동정하였다. 이 공여체를 동종 이계 양성 대조 공여체로서 선택하였다. 나머지 5가지의 혈액 공여체를 수령체로서 선택하였다. 동종 이계 양성 대조 공여체 및 제대 유래 세포주를 마이토마이신 C 처리하고, 5가지의 개별 동종 이계 수령체를 이용한 혼합 림프구 반응에서 배양하였다. 반응은 플레이트당 3가지의 수령체를 포함하는 2개의 세포 배양 플레이트를 사용하여 삼중으로 수행하였다(표 12-2). 평균 자극 지수는 6.5(플레이트 1) 내지 9(플레이트 2)의 범위였으며, 동종 이계 공여체 양성 대조군은 42.75(플레이트 1) 내지 70(플레이트 2)의 범위였다(표 12-3).

[표 12-2]

[표 12-3]

IgG 대조군과 일치하는 형광값으로 나타내어지는 바와 같이, 유세포 분석법에 의해 분석된 제대 유래 세포의 히스토그램은 HLA-DR, DP, DQ, CD80, CD86, 및 B7-H2의 음성 발현을 나타내며, 이는 제대 유래 세포주가 동종 이계 PBMC(예를 들어, CD4⁺ T 세포)를 직접적으로 자극하는데 필요한 세포 표면 분자의 결여를 나타내는 것이다.

유세포 분석법에 의해 분석된 제대 세포는 IgG 대조군에 비하여 형광값 증가로 반영된 바와 같이, PD-L2의 발현에 대하여 양성을 나타내었다. 상기 세포는 IgG 대조군과 일치한 형광값으로 언급된 바와 같이, CD178 및 HLA-G의 발현에 대하여 음성을 나타내었다.

제대 세포주를 이용하여 행해진 혼합 림프구 반응에서, 평균 자극 지수는 6.5 내지 9의 범위이었으며, 동종 이계 양성 대조군의 것은 42.75 내지 70의 범위이었다. 제대 세포주는 유세포 분석법에 의해 측정되는 바와 같이, 자극 단백질 HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, 및 B7-H2의 검출량을 발현하지 않았다. 제대 세포주는 또한 면역 조절 단백질 HLA-G 및 CD178을 발현하지 않지만, PD-L2의 발현은 유세포 분석법에 의해 검출되었다. 동종 이계 공여체 PBMC는 HLA-DR, DQ, CD8, CD86, 및 B7-H2를 발현하는 항원 제시 세포를 함유함으로써, 동종 이계 림프구세포를 자극할 수 있다. 미성숙 CD4⁺ T 세포의 직접적인 자극에 필요한 항원 제시 세포 표면 분자의 제대 유래 세포 상에서의 부재, 및 면역 조절 단백질인 PD-L2의 존재는 동종 이계 대조군과 비교하여, MLR에서 이들 세포가 나타내는 낮은 자극 지수를 설명할 수 있다.

실시예 13

텔로머라아제 활성에 대한 분석

텔로머라아제는 염색체의 완전성을 보호하고 세포의 복제 수명을 연장시키는 역할을 하는 말단 소립 반복체를 합성하는 기능을 한다(문헌[Liu, K, et al., PNAS, 1999; 96:5147-5152]). 텔로머라아제는 2개의 구성요소, 텔로머라아제 RNA 주형(hTER) 및 텔로머라아제 역전사효소(hTERT)로 이루어진다. 텔로머라아제의 조절은 hTER이 아닌 hTERT의 전사에 의해 결정된다. 따라서, hTERT mRNA를 위한 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)은 세포의 텔로머라아제 활성을 결정하는 용인된 방법이다.

세포 단리

실시간 PCR 실험을 수행하여, 인간 제대 조직 유래 세포의 텔로머라아제 생성량을 측정하였다. 인간 제대 조직 유래 세포를 상기 실시예 및 미국 특허 제7,510,873호에 기술된 실시예에 따라 준비하였다. 일반적으로, 정상 분만 후 NDRI(미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재)로부터 획득한 제대를 세척하여, 혈액 및 잔사를 제거하고, 기계적으로 해리시켰다. 그 후, 조직을 37℃에서 배양 배지 중에서 콜라게나아제, 디스파아제, 및 히알루로니다아제를 포함하는 소화 효소와 함께 인큐베이션하였다. 인간 제대 조직 유래 세포를 상기 '012 출원의 실시예에 기술된 방법에 따라 배양하였다. 중간엽 줄기 세포 및 정상 피부 섬유아세포(cc-2509 로트 번호 9F0844)를 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 캄브렉스로부터 획득하였다. 만능성 인간 고환 태생성 암종(기형종) 세포주 nTera-2 세포(NTERA-2 cl.Dl)(문헌[Plaia et al., Stem Cells, 2006; 24(3):531-546] 참조)를 ATCC(미국 버지니아주 매너서스 소재)로부터 구입하여, 미국 특허 제7,510,873호에 기술된 방법에 따라 배양하였다.

전체 RNA 단리

RNA를 알엔이지® 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)를 사용하여 세포로부터 추출하였다. RNA를 50 마이크로리터의 DEPC 처리된 물로 용리시켜, -80℃로 보관하였다. RNA를 탁맨® 역전사 시약(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 25℃, 10분; 37℃, 60분; 및 95℃, 10분에서 랜덤 헥사머를 사용하여 역전사시켰다. 샘플들을 -20℃로 보관하였다.

실시간 PCR

제조업자의 설명서(어플라이드 바이오시스템즈)에 따라, 어플라이드 바이오시스템즈 어세이즈-온-디맨드™(탁맨® 진 익스프레션 어세이즈(Gene Expression Assays)로도 공지됨)를 사용하여 cDNA 샘플에서 PCR을 수행하였다. 이러한 시판용 키트는 인간 세포에서의 텔로머라아제를 분석하는데 널리 사용된다. 간략하게는, hTert(인간 텔로머라아제 유전자)(Hs00162669) 및 인간 GAPDH(내부 대조군)를 cDNA 및 탁맨® 범용 PCR 마스터 믹스와 혼합하였는데, 이는 ABI 프리즘 7000 SDS 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템즈)를 갖춘 7000 서열 검출 시스템을 이용하였다. 열사이클 조건은 처음에 50℃, 2분 및 95℃, 10분, 이어서 95℃, 15초 및 60℃, 1분의 40 사이클이었다. PCR 데이터를 제조업자의 설명서에 따라 분석하였다.

인간 제대 조직 유래 세포(ATCC 수탁 번호 PTA-6067), 섬유아세포, 및 중간엽 줄기 세포를 hTert 및 18S RNA에 대해 분석하였다. 표 13-1에 나타낸 바와 같이, hTert 및 이에 따라 텔로머라아제는 인간 제대 조직 유래 세포에서 검출되지 않았다.

[표 13-1]

인간 제대 조직 유래 세포(분리주 022803, ATCC 수탁 번호 PTA-6067) 및 nTera-2 세포를 분석하였고, 그 결과는 2개의 로트의 인간 제대 조직 유래 세포에서 텔로머라아제의 발현을 나타내지 않았지만, 기형종 세포주는 높은 수준의 발현을 나타내었다(표 13-2).

[표 13-2]

그러므로, 본 발명의 인간 제대 조직 유래 세포는 텔로머라아제를 발현하지 않는 것으로 결론지을 수 있다.

본 발명을 다양한 특정한 재료, 절차 및 실시예를 참고로 하여 본 명세서에서 설명하고 예시하였지만, 본 발명은 이 목적용으로 선택된 재료 및 절차의 특정한 조합에 제한되지 않음이 이해된다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 이러한 상세 사항에 대한 다양한 변화가 암시될 수 있다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되는 것으로 의도되며, 이때 본 발명의 실제 범주 및 사상은 하기 특허청구범위에 의해 나타난다. 본 출원에서 언급되는 모든 참고 문헌, 특허 및 특허 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA-6067 20040610 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA-6068 20040610

SEQUENCE LISTING <110> DEPUY SUNTHES PRODUCTS, LLC. <120> hUTC MODULATION OF PRO-INFLAMMATORY MEDIATORS OF LUNG AND PULMONARY DISEASES AND DISORDERS <130> 18668-329484 <150> US 13/471,095 <151> 2012-05-14 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 gagaaatcca aagagcaaat gg 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 agaatggaaa actggaatag g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 tcttcgatgc ttcggattcc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 gaattctcgg aatctctgtt g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 ttacaagcag tgcagaaaac c 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 agtaaacatt gaaaccacag cc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 tctgcagctc tgtgtgaagg 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 cttcaaaaac ttctccacaa cc 22 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 cccacgccac gctctcc 17 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 tcctgtcagt tggtgctcc 19

Claims (31)

1. 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상이 있는 환자에서 상기 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 조절하는데 사용되는 제대 조직 유래 세포로서, 상기 세포는, 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, CD117 또는 CD45의 생성이 결여되고, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는, 제대 조직 유래 세포.
2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 전염증성 매개체는 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 진행에 관여하는, 제대 조직 유래 세포.
3. 제1항에 있어서, 상기 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상은, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐섬유증, 급성 폐손상(ALI), 및 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제대 조직 유래 세포.
4. 제3항에 있어서, 상기 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상은 만성 폐쇄성 폐질환인, 제대 조직 유래 세포.
5. 제4항에 있어서, 상기 만성 폐쇄성 폐질환은 만성 기관지염 또는 폐기종인, 제대 조직 유래 세포.
6. 제1항에 있어서, 상기 조절은, 상기 세포를 적어도 하나의 다른 세포 유형 및/또는 적어도 하나의 다른 제제(agent)와 함께 투여하는 것을 포함하는, 제대 조직 유래 세포.
7. 제6항에 있어서, 상기 다른 세포 유형은, 폐 전구 세포, 혈관 평활근 세포, 혈관 평활근 전구 세포, 혈관 주위 세포, 혈관 내피 세포, 혈관 내피 전구 세포, 또는 다른 다능성(multipotent) 또는 만능성(pluripotent) 줄기 세포로부터 선택되는 폐조직 세포인, 제대 조직 유래 세포.
8. 제6항에 있어서, 상기 제제는 항혈전제, 항염증제, 면역억제제, 면역조절제, 전혈관형성제(pro-angiogenic agent), 또는 항세포사멸제(antiapoptotic agent)인, 제대 조직 유래 세포.
9. 제1항에 있어서, 상기 세포는 상기 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 감소시키는, 제대 조직 유래 세포.
10. 제1항에 있어서, 상기 세포는 상기 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 억제시키는, 제대 조직 유래 세포.
11. 제1항에 있어서, 상기 조절은, 주사, 주입, 상기 환자에 이식된 장치에 의해, 또는 세포를 함유하는 매트릭스(matrix) 또는 스캐폴드(scaffold)의 이식에 의해 상기 세포를 투여하는 것을 포함하는, 제대 조직 유래 세포.
12. 제1항에 있어서, 상기 세포는 상기 환자의 폐조직, 혈관 평활근, 또는 혈관 내피에 대해 영양적 효과(trophic effect)를 발휘하는, 제대 조직 유래 세포.
13. 만성 폐쇄성 폐질환이 있는 환자에서 상기 만성 폐쇄성 폐질환의 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 감소시키는데 사용되는 제대 조직 유래 세포로서, 상기 세포는, 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, CD117 및 CD45의 생성이 결여되고, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는, 제대 조직 유래 세포.
14. 제13항에 있어서, 상기 세포는 만성 폐쇄성 폐질환의 상기 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 억제시키는, 제대 조직 유래 세포.
15. 제13항에 있어서, 상기 만성 폐쇄성 폐질환은 폐기종인, 제대 조직 유래 세포.
16. 제13항에 있어서, 상기 만성 폐쇄성 폐질환은 만성 기관지염인, 제대 조직 유래 세포.
17. 제13항에 있어서, 상기 감소는, 상기 세포를 상기 만성 폐쇄성 폐질환의 부위에 투여하는 것을 포함하는, 제대 조직 유래 세포.
18. 제1항 또는 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 전염증성 매개체는, TNF-α, RANTES, MCP-1, IL-1β 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제대 조직 유래 세포.
19. 제1항 또는 제13항에 있어서, 상기 세포는 CD117 및 CD45의 생성이 결여되는, 제대 조직 유래 세포.
20. 제1항 또는 제13항에 있어서, 상기 세포는 하기 특성들 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 제대 조직 유래 세포:
    (a) CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90을 발현하는 것;
    (b) CD31 또는 CD34를 발현하지 않는 것;
    (c) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하는 것; 및
    (d) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖는 것.
21. 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 조절하는데 사용되는 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 단리된 인간 제대 조직 유래 세포를 포함하며, 상기 세포는, 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 수득될 수 있고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, CD117 및 CD45의 생성이 결여되고, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는, 약제학적 조성물.
22. 제21항에 있어서, 상기 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상은, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐섬유증, 급성 폐손상(ALI), 및 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
23. 제22항에 있어서, 상기 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상은 만성 폐쇄성 폐질환인, 약제학적 조성물.
24. 제23항에 있어서, 상기 만성 폐쇄성 폐질환은 만성 기관지염 또는 폐기종인, 약제학적 조성물.
25. 만성 폐쇄성 폐질환이 있는 환자에서 상기 만성 폐쇄성 폐질환의 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 감소시키는데 사용되는 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 단리된 인간 제대 조직 유래 세포를 포함하며, 상기 세포는, 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 수득될 수 있고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, CD117 및 CD45의 생성이 결여되고, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는, 약제학적 조성물.
26. 제25항에 있어서, 상기 사용은 만성 폐쇄성 폐질환의 상기 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 억제시키는, 약제학적 조성물.
27. 제25항에 있어서, 상기 만성 폐쇄성 폐질환은 만성 기관지염 또는 폐기종인, 약제학적 조성물.
28. 제21항 또는 제25항에 있어서, 상기 하나 이상의 전염증성 매개체는, TNF-α, RANTES, MCP-1, IL-1β 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
29. 제21항 또는 제25항에 있어서, 상기 세포는 하기 특성들 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물:
    (a) CD10, CD13, CD44, CD73, 및 CD90을 발현하는 것;
    (b) CD31 또는 CD34를 발현하지 않는 것;
    (c) 인간 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 또는 장골능 골수 세포에 비하여, 증가된 수준의 인터류킨 8 또는 레티큘론 1을 발현하는 것; 및
    (d) 적어도 폐조직의 세포로 분화되는 잠재력을 갖는 것.
30. 폐질환, 폐장애, 및/또는 폐손상의 병리에 관여하는 하나 이상의 전염증성 매개체의 생성을 조절하기 위한 키트로서, 상기 키트는 약제학적으로 허용가능한 담체 및 제대 조직 유래 세포를 포함하며, 상기 세포는, 실질적으로 혈액이 없는 인간 제대 조직으로부터 단리되고, 배양 중 자가 재생 및 증식이 가능하며, CD117 및 CD45의 생성이 결여되고, hTERT 또는 텔로머라아제를 발현하지 않는, 키트.
31. 제30항에 있어서, 상기 폐질환은 만성 폐쇄성 폐질환인, 키트.

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