TW201636032A - 使用前驅細胞治療眼睛病況 - Google Patents

Abstract

用於使用前驅細胞諸如產後衍生細胞及來自該等細胞之條件培養基治療眼科疾病、促進功能性神經元突觸之發育並改善神經元外生之方法及組成物係經揭示。亦揭示由促進突觸形成及神經元生長之細胞分泌之營養因子及其他劑。

Description

使用前驅細胞治療眼睛病況 【相關申請案之交互參照】

本申請案主張2014年12月5日提出申請之美國臨時申請案第62/088,429號、2015年2月27日提出申請之美國臨時申請案第62/126,370號及2015年9月18日提出申請之美國臨時申請案第62/220,873號之權益；上述各案之全部內容以全文引用方式併入本文中。

本發明係關於用於眼科疾病及病症，尤其是眼睛病況，諸如視網膜變性病狀的基於細胞或再生性療法的領域。本發明提供使用前驅細胞(諸如臍帶組織衍生細胞、胎盤組織衍生細胞)及由該些細胞製備之條件培養基來再生或修復眼細胞及組織之方法及組成物。

眼睛是一個複雜且敏感的身體器官，會罹患許多疾病及其他影響其正常發揮功能之能力的有害病狀。許多該些病狀與特定眼細胞及由該些細胞組成之組織的損傷或變性相關聯。舉例而言，視神經及視網膜之疾病及變性病狀為全世界失明之首要原因。角膜、 水晶體及相關眼組織之損傷或變性為全世界視力喪失之另一顯著原因。

視網膜含有七層交替細胞及將光信號轉化成神經信號之過程。視網膜光受體與鄰近視網膜色素上皮(RPE)形成功能單元，其在許多病症中由於遺傳突變或環境條件(包括年齡)而變得不平衡。此導致光受體經由細胞凋亡或繼發性變性而損失，從而導致視力之進行性劣化並在一些情況下導致失明(有關綜述參見例如，Lund,R.D.等人，Progress in Retinal and Eye Research,2001；20：415-449)。具有此模式之兩類眼病症為年齡相關性黃斑變性(AMD)及色素性視網膜炎(RP)。

AMD在美國是50歲或年齡更大之人口中視力喪失之最普遍原因且其盛行率隨年齡升高。AMD之原發性病症似乎係因RPE功能異常及在布魯赫氏(Bruch's)膜中之變化所致，其特徵在於特別是脂質沉積、蛋白質交聯及營養素滲透性降低(參見Lund等人，2001見前文)。多種要素可導致黃斑變性，包括遺傳構成、年齡、營養、吸煙、及暴露於陽光。非滲出性、或「乾性(dry)」形式之AMD佔AMD病例之90%；其他10%為滲出性、新生血管形式(「濕性(wet)」AMD)。在乾性AMD患者中，視網膜色素上皮(RPE)之逐漸消失導致環繞狀之萎縮區域。因為光受體損失跟隨在RPE消失之後，所以受影響之視網膜區域僅剩極少或完全無視覺功能。

AMD之當前療法涉及諸如例如雷射療法及醫藥介入之程序。雷射波束藉由轉移熱能來破壞黃斑下之滲漏血管，以延緩 視力喪失之速率。雷射療法之缺點在於，由波束遞送之高熱能亦破壞附近的健康組織。Neuroscience第4版(Purves,D，等人2008)指出「目前沒有乾性AMD之治療。」

RPE移植在人類中尚未成功。舉例而言，Zarbin,M,2003指出「在正常老化情況下，人類布魯赫氏膜(尤其在黃斑下區域中)經歷許多改變(例如，厚度增大、ECM及脂質之沉積、蛋白質之交聯、高級糖化終產物之非酶形成)。此等改變及由於AMD之額外改變可能降低ECM配體(例如，層黏蛋白、纖連蛋白素、及膠原蛋白IV)之生物可利用性，且造成AMD眼睛中極為不良的RPE細胞存活。因此，儘管人類RPE細胞表現附著於此等ECM分子所需之整合素，但是老化的黃斑下人類布魯赫氏膜上之RPE細胞存活仍然受損。」(Zarbin,MA,Trans Am Ophthalmol Soc,2003；101：493-514)。

色素性視網膜炎主要被認為是一種遺傳性疾病，其中超過100種突變與光受體損失相關聯(參見Lund等人，2001，見前文)。儘管大部分突變以光受體為目標，但有些突變直接影響RPE細胞。綜上，此等突變影響諸如光受體與RPE細胞之間的分子運輸及光傳導之過程。

其他較不常見但亦有損健康的視網膜病變也可涉及導致視力喪失及失明之進行性細胞變性。此等視網膜病變包括例如糖尿病視網膜病變及脈絡膜新生血管膜(CNVM)。

用於細胞及組織修復及再生之基於幹細胞的療法的出現，對許多前述細胞變性病變及其他視網膜病狀提供有前景之治療。幹細胞能夠自我更新及分化以產生多種成熟細胞譜系。此類細胞之移植可用來作為重構靶標組織之臨床工具，從而恢復生理及結構功能。幹細胞技術之應用範圍廣泛，包括組織工程化，基因療法遞送、及細胞治療，亦即，經由外源性供應可生產或含有生物治療劑之活細胞或細胞組分來遞送該些劑至靶標位置。(有關綜述，參見例如，Tresco,P.A.等人，Advanced Drug Delivery Reviews,2000,42：2-37)。

細胞療法證明在治療神經病症上具有高度潛能。移植細胞被認為藉由置換損傷細胞或藉由提供增強神經健康和再生的營養因子來促進恢復及神經保護。(Doeppner TR,Hermann DM,Frontiers in Cellular Neuroscience,.2014；8：357；Atala A,Lancet,2014/2015；385(9967)：487-488；Popovich PG,Cell,2012；150：1105-1106；Lindvall O，等人，Journal of Clinical Investigation,2010；120：29-40；Rao MS,Mechanisms of Aging Development,2001；122：713-734)。神經元突起(neuronal process)的萎縮為許多神經病症之普遍事件；因此，提供可引起神經突外生(outgrowth)的因子可於這些疾病中提供治療效果。特定言之，人類臍組織衍生細胞(hUTC)可為對神經元損失有前景之治療。人類臍帶可在無倫理顧慮之情況下收集自產後臍帶，顯示在體外培養期間具有核型穩定性，且可擴增(Lund等人，Stem Cells,2007；25(3)：602-61)。 各種動物疾病模型已證明hUTC投予之治療潛能。舉例而言，將hUTC遞送至中風動物模型(Moore等人，Somatosensory and Motor Research,2013；30：185-196；Zhang L，等人，Brain Research,2012；1489：104-112；Zhang L，等人，Cell transplantation,2013；22：1569-1576；Jiang Q，等人，PloS One,2012；7(8)：e42845；Zhang L，等人，Stroke；2011；42：1437-1444)；及視網膜變性動物模型(Lund等人，Stem Cells,2007見前文)，已顯示這些細胞增強功能恢復且防止神經元發生進行性變性及細胞死亡。

最近，已顯示產後衍生細胞改善視網膜變性(US 2010/0272803)。皇家外科學院(Royal College of Surgeons,RCS)大鼠具有影響外節吞噬之酪胺酸受體激酶(Mertk)缺陷，從而引起光受體細胞死亡。(Feng W.等人，J Biol Chem.,2002,10：277(19)：17016-17022)。發現將視網膜色素上皮(RPE)細胞移植至RCS大鼠之視網膜下空間中會限制光受體損失之進展且保留視覺功能。亦已證明，產後衍生細胞可在RCS模型中用於促進光受體救援且因此保留光受體。(US 2010/0272803)。將人類臍帶組織衍生細胞(hUTC)經視網膜下注射至RCS大鼠眼睛中改良視覺銳度且改善視網膜變性。此外，以衍生自hUTC之條件培養基(CM)進行治療，可使體外失養性RPE細胞恢復對ROS之吞噬。(US 2010/0272803)。此處進一步研究hUTC改善視力之機制。

本發明提供適用於眼科疾病及病症的基於細胞或再生性療法的組成物及方法。詳言之，本發明之特徵在於用於治療眼科疾病或病狀之方法及組成物，包括醫藥組成物，該等方法及組成物包括使用諸如產後衍生細胞之前驅細胞及由該些細胞產生之條件培養基來再生或修復眼細胞及組織。產後衍生細胞可為臍帶組織衍生細胞或胎盤組織衍生細胞。

本發明之一個態樣為一種藉由誘導神經元細胞中突觸新生來治療眼科疾病之方法，其包含投予前驅細胞群或由前驅細胞群製備之條件培養基。在本發明之一實施例中，神經元細胞或神經元為視網膜神經元諸如視網膜神經節細胞、光受體(視桿細胞及視錐細胞)、視網膜無軸突細胞、水平細胞或雙極細胞。在本發明之具體實施例中，前驅細胞為產後衍生細胞。在本發明之實施例中，產後衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織。在進一步實施例中，前驅細胞分泌營養因子。在一實施例中，條件培養基含有前驅細胞群分泌之營養因子。在實施例中，前驅細胞(諸如產後衍生細胞)分泌之營養因子誘導突觸新生。在實施例中，營養因子選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2及血小板反應蛋白-4。

在本發明之一態樣中，藉由誘導神經元細胞中神經突外生來治療眼科疾病之方法包含投予前驅細胞群或由前驅細胞群製備之條件培養基。在本發明之一實施例中，神經元細胞或神經元為視網膜神經元諸如視網膜神經節細胞、光受體(視桿細胞及視錐細 胞)、視網膜無軸突細胞、水平細胞或雙極細胞。在本發明之具體實施例中，前驅細胞為產後衍生細胞。在本發明之實施例中，產後衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織。在進一步實施例中，前驅細胞分泌營養因子。在一實施例中，條件培養基含有前驅細胞群分泌之營養因子。在實施例中，前驅細胞(諸如產後衍生細胞)分泌之營養因子誘導突觸新生。在實施例中，營養因子選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2及血小板反應蛋白-4。

本發明之進一步態樣為一種誘導神經突外生之方法，其包含投予前驅細胞群或由前驅細胞群製備之條件培養基。在本發明之一實施例中，神經元細胞(神經元)為視網膜神經元，例如，視網膜神經節細胞、光受體(視桿細胞及視錐細胞)、視網膜無軸突細胞、水平細胞或雙極細胞。在本發明之實施例中，前驅細胞為產後衍生細胞。在實施例中，產後衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織。在進一步實施例中，前驅細胞分泌營養因子。在一實施例中，條件培養基含有前驅細胞群分泌之營養因子。在實施例中，前驅細胞(諸如產後衍生細胞)分泌之營養因子誘導神經突外生。在進一步實施例中，由前驅細胞分泌之營養因子選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2及血小板反應蛋白-4。

本發明之另一實施例為一種使視網膜神經元中的功能性突觸發育之方法，其包含投予前驅細胞群或由前驅細胞群製備之條件培養基。在本發明之實施例中，視網膜神經元為視網膜神經 節細胞、光受體(視桿細胞及視錐細胞)、視網膜無軸突細胞、水平細胞或雙極細胞，且前驅細胞為產後衍生細胞。在實施例中，產後衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織。在進一步實施例中，前驅細胞分泌營養因子。在一實施例中，條件培養基含有前驅細胞群分泌之營養因子。在實施例中，前驅細胞(諸如產後衍生細胞)分泌之營養因子誘導神經突外生。在進一步實施例中，由前驅細胞分泌之營養因子選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2及血小板反應蛋白-4。

在本發明之實施例中，由前驅細胞(例如產後衍生細胞)群製備之條件培養基含有由該細胞群分泌之營養因子。此類由該等細胞分泌之營養因子選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2及血小板反應蛋白-4。產後衍生細胞為臍帶組織衍生細胞(UTC)或胎盤組織衍生細胞(PDC)。

在一實施例中，前驅細胞促進視網膜神經元中的功能性突觸之發育。在另一實施例中，由前驅細胞分泌之營養因子促進神經元中的功能性突觸之發育。在特定實施例中，營養因子選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2及血小板反應蛋白-4。在另一實施例中，前驅細胞群支持神經元細胞之生長。

在進一步實施例中，由前驅細胞群製備之條件培養基支持神經元細胞之生長。在本發明之實施例中，由上文所述之前驅細胞群製備之條件培養基含有由該細胞群分泌之營養因子。在特定 實施例中，營養因子選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2及血小板反應蛋白-4。

本發明之另一態樣之特徵在於一種用於促進視網膜變性中的突觸發育之方法，該方法包含向對象投予有效促進突觸發育之量的條件培養基。在本發明之一實施例中，條件培養基由產後衍生細胞群製備。在一具體實施例中，產後衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織。如在其他實施例中，條件培養基含有該細胞群分泌之營養因子。此類由該等細胞分泌之營養因子選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2及血小板反應蛋白-4。

在本發明之實施例中，產後衍生細胞係衍生自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織。在實施例中，該細胞能夠在培養物中擴增且具有分化成神經表型之細胞的潛能；其中該細胞需要L-纈胺酸以供生長且能夠於至少約5%氧氣中生長。該細胞進一步包含下列特徵中之一或多者：(a)在培養物中進行至少約40次倍增的潛能；(b)在經塗布或未經塗布的組織培養容器上附著並擴增，其中經塗布之組織培養容器包含明膠、層黏蛋白、膠原蛋白、聚鳥胺酸、玻璃連接蛋白、或纖連蛋白素之塗層；(c)生產組織因子、波形蛋白(vimentin)、及α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin)中之至少一者；(d)生產CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2及HLA-A,B,C中之至少一者；(e)不生產CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G、及 HLA-DR,DP,DQ中之至少一者，如藉由流動式細胞測量術所偵測；(f)針對編碼下列之至少一種基因的基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加：介白素8；內質網蛋白(reticulon)1；趨化激素(C--X--C模體)配體1(黑色素瘤生長刺激活性物，α)；趨化激素(C--X--C模體)配體6(顆粒性細胞趨化蛋白質2)；趨化激素(C--X--C模體)配體3；腫瘤壞死因子，α-誘發蛋白質3；C型凝集素超家族成員2；威爾姆斯(Wilms)腫瘤1；醛去氫酶1家族成員A2；腎素(renin)；氧化低密度脂蛋白受體1；智人(Homo sapiens)殖株IMAGE：4179671；蛋白質激酶C ζ；假想蛋白質DKFZp564F013；卵巢癌向下調控因子1；及殖株DKFZp547k1113之智人基因；(g)針對編碼下列之至少一種基因的基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經減少：矮小同源盒(short stature homeobox)2；熱休克27kDa蛋白質2；趨化激素(C--X--C模體)配體12(基質細胞衍生因子1)；彈性蛋白(瓣上主動脈狹窄，威廉-波倫(Williams-Beuren)症候群)；智人mRNA；cDNA DKFZp586M2022(來自殖株DKFZp586M2022)；間葉同源盒2(生長休止特異性同源盒(growth arrest-specific homeo box))；sine oculis同源盒同源物1(果蠅(Drosophila))；αB水晶體蛋白；形態發生紊亂關聯活化物2(disheveled associated activator of morphogenesis 2)；DKFZP586B2420蛋白質；類似於neuralin 1者；結合四素(tetranectin，纖維蛋白溶酶原(plasminogen)結合蛋白質)；src同源體3(SH3)與多 半胱胺酸區(cysteine rich domain)；膽固醇25-羥化酶；矮小相關轉錄因子3(runt-related transcription factor 3)；介白素11受體，α；原膠原蛋白C-內肽酶增強子(procollagen C-endopeptidase enhancer)；捲曲同源物7(frizzled homolog 7)(果蠅)；假想基因BC008967；第三型膠原蛋白α1；固生蛋白C(tenascin C,hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白質5(iroquois homeobox protein 5)；希菲斯特蛋白(hephaestin)；整合素β8；突觸囊泡醣蛋白(synaptic vesicle glycoprotein)2；神經胚細胞瘤，致腫瘤性抑制因子1；類胰島素生長因子結合蛋白質2，36kDa；智人cDNA FLJ12280 fis，殖株MAMMA1001744；類細胞介素受體因子1；鉀中間物/小電導鈣活化通道，次家族N，成員4；整合素β7；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；sine oculis同源盒同源物2(果蠅)；KIAA1034蛋白質；囊泡相關膜蛋白質5(肌短蛋白(myobrevin))；含EGF類fibulin細胞外基質蛋白質(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein)1；早期生長反應蛋白質(early growth response)3；無背端同源盒(distal-less homeo box)5；假想蛋白質FLJ20373；醛基-酮基還原酶家族1，成員C3(3-α羥類固醇去氫酶(3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase)，II型)；雙聚醣(biglycan)；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；纖連蛋白素1；腦啡肽前質(proenkephalin)；整合素，類β1(具有類EGF重複區)；智人mRNA全長插入物cDNA殖株EUROIMAGE 1968422；EphA3；KIAA0367蛋白質；利尿鈉胜肽受體C(natriuretic peptide receptor C)/鳥苷酸環化酶C(guanylate cyclase C)(心房利尿鈉胜肽受體C(atrionatriuretic peptide receptor C))；假想蛋白質FLJ14054；智人mRNA；cDNA DKFZp564B222(來自殖株DKFZp564B222)；BCL2/類腺病毒E1B 19kDa交互作用蛋白質3(adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like)；AE結合蛋白質1；細胞色素c氧化酶次單元VIIa多肽1(肌肉)；類似於neuralin 1者；B細胞轉位基因1；假想蛋白質FLJ23191；及DKFZp586L151；及(h)不表現hTERT或端粒酶。在一實施例中，臍帶組織衍生細胞進一步具有以下特徵：(i)分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、I309、MDC、RANTES、及TIMP1中之至少一者；(j)不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb、及VEGF中之至少一者，如藉由ELISA所偵測。在另一實施例中，胎盤組織衍生細胞進一步具有以下特徵：(i)分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES、及TIMP1中之至少一者；(j)不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、FGF、及VEGF中之至少一者，如藉由ELISA所偵測。

在特定實施例中，產後衍生細胞具有以下細胞型之所有識別特徵：細胞型UMB 022803(P7)(ATCC存取號PTA-6067)；細胞型UMB 022803(P17)(ATCC存取號PTA-6068)、細胞型PLA 071003(P8)(ATCC存取號PTA-6074)；細胞型PLA 071003(P11)(ATCC存取號PTA-6075)；或細胞型PLA 071003(P16)(ATCC存取號PTA-6079)。在一實施例中，衍生自臍組織之產後衍生細胞具有細胞型UMB 022803(P7)(ATCC存取號PTA-6067)或細胞型UMB 022803(P17)(ATCC存取號PTA-6068)之所有識別特徵。在另一實施例中，衍生自胎盤組織之產後衍生細胞具有以下細胞型之所有識別特徵：細胞型PLA 071003(P8)(ATCC存取號PTA-6074)；細胞型PLA 071003(P11)(ATCC存取號PTA-6075)；或細胞型PLA 071003(P16)(ATCC存取號PTA-6079)。

在某些實施例中，產後衍生細胞在一或多種酶活性存在下分離，該些酶活性包含金屬蛋白酶活性、黏液分解活性及中性蛋白酶活性。較佳地，該等細胞具有正常核型，其在細胞繼代培養時維持。在較佳實施例中，產後衍生細胞包含CD10、CD13、CD44、CD73、CD90中之各者。在一些實施例中，產後衍生細胞包含CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、及HLA-A,B,C中之各者。在較佳實施例中，產後衍生細胞不包含CD31、CD34、CD45、CD117中之任一者。在一些實施例中，產後衍生細胞不包含CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、或HLA-DR,DP,DQ中之任一者，如藉由流動式細胞測量術所偵測。在實施例中，該些細胞不表現hTERT或端粒酶。

在本發明之實施例中，細胞群為實質上均質性產後衍生細胞群。在特定實施例中，該族群為均質性產後衍生細胞群。在本發明之實施例中，產後衍生細胞係衍生自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織。

在某些實施例中，如上文所述之產後衍生細胞群或由產後衍生細胞群產生之條件培養基係與至少一種其他細胞型一起投 予，該等其他細胞型諸如星狀細胞、寡樹突細胞、神經元、神經前驅、神經幹細胞、視網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、或其他多潛能性或多能性幹細胞。在這些實施例中，其他細胞型可與該細胞群或該條件培養基同時、或在之前、或在之後投予。

同樣地，在這些及其他實施例中，如上文所述之產後衍生細胞群或由該細胞群製備之條件培養基係與至少一種其他藥劑諸如用於眼治療之藥品、或另一有益的輔助劑諸如消炎劑、抗細胞凋亡劑、抗氧化劑或生長因子一起投予。在這些實施例中，其他藥劑可與該細胞群或該條件培養基同時、在之前、或在之後投予。

在各種實施例中，產後衍生細胞群或由產後衍生細胞(臍或胎盤)產生之條件培養基係向眼睛表面投予、或向眼睛內部或向靠近眼睛之位置(例如於眼睛後面)投予。產後衍生細胞群或條件培養基可經由套管或自植入於眼睛內或靠近眼睛之患者體內之裝置投予，或可藉由植入具有產後衍生細胞群或條件培養基之基質或支架來投予。

本發明之另一態樣之特徵在於一種用於促進視網膜變性病狀中的功能性突觸發育之組成物，該組成物包含有效促進功能性突觸發育之量的產後衍生細胞群或由細胞群製備之條件培養基。較佳地，條件培養基由如上文所述之產後衍生細胞製備。更佳地，產後衍生細胞係分離自實質上不含血液之產後臍帶或胎盤。變性病狀可為急性、慢性或進行性病狀。

在某些實施例中，組成物包含至少一種其他細胞型，諸如星狀細胞、寡樹突細胞、神經元、神經前驅、神經幹細胞、視網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、或其他多潛能性或多能性幹細胞。在這些或其他實施例中，組成物包含至少一種其他藥劑，諸如用於治療眼變性病症之藥品或其他有益的輔助試劑，例如消炎劑、抗細胞凋亡劑、抗氧化劑或生長因子。

在一些實施例中，組成物為進一步包含醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物。

在某些實施例中，醫藥組成物經調配用於向眼睛表面投予。或者，其可經調配用於向眼睛內部或靠近眼睛處(例如眼睛後面)投予。組成物亦可調配為含有產後衍生細胞或條件培養基之基質或支架。

根據本發明之另一態樣，提供一種用於治療具有眼變性病狀之患者的套組。該套組包含醫藥上可接受之載劑、產後衍生細胞群或由產後衍生細胞(較佳為上文所述之產後衍生細胞)群產生之條件培養基、及於治療患者之方法中使用該套組之說明書。該套組亦可含有一或多種額外組分，諸如用於產生條件培養基之試劑及說明書、或至少一種其他細胞型之族群、或一或多種可用於治療眼變性病狀之劑。

在一實施例中，本發明為一種用於誘導視網膜變性中突觸形成之方法，該方法包含向對象投予有效誘導突觸形成之量的產後衍生細胞群或由產後衍生細胞群製備之條件培養基，其中該等 產後衍生細胞係衍生自實質上不含血液之人類臍帶組織或胎盤組織，且其中該細胞群能夠在培養物中擴增、具有分化成至少一神經表型之細胞的潛能、在繼代之後維持正常核型、且具有以下特徵：a)在培養物中進行40次族群倍增的潛能；b)生產CD10、CD13、CD44、CD73及CD90；及c)不生產CD31、CD34、CD45、CD117及CD141，且其中產後衍生細胞群分泌營養因子，或由產後衍生細胞群製備之條件培養基含有由該細胞群分泌之營養因子。在一實施例中，由細胞群分泌之營養因子選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2及血小板反應蛋白-4。在一些實施例中，細胞群為實質上均質性族群。在具體實施例中，細胞群為均質性。產後衍生細胞為臍帶組織衍生細胞或胎盤組織衍生細胞。在實施例中，臍帶組織衍生細胞群分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、I309、MDC、RANTES及TIMP1。此外，臍帶組織衍生細胞群不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb及VEGF，如藉由ELISA所偵測。在另一實施例中，胎盤組織衍生細胞群分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES及TIMP1。在實施例中，胎盤組織衍生細胞群不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、FGF及VEGF，如藉由ELISA所偵測。另外，細胞群不表現hTERT或端粒酶。在實施例中，臍帶組織衍生細胞群相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之 人類細胞，具有編碼介白素8與網狀內皮素1之基因表現增加。在實施例中，該細胞群生產波形蛋白與α-平滑肌肌動蛋白。

在另一實施例中，本發明為一種用於誘導視網膜變性中突觸形成之方法，該方法包含向對象投予有效誘導突觸形成之量的臍帶組織衍生細胞群或由人類臍帶組織衍生細胞群製備之條件培養基，其中該等細胞係衍生自實質上不含血液之人類臍帶組織，且其中該細胞群能夠在培養物中擴增、具有分化成至少一神經表型之細胞的潛能、在繼代之後維持正常核型、且具有以下特徵：a)在培養物中進行40次族群倍增的潛能；b)生產CD10、CD13、CD44、CD73及CD90；及c)不生產CD31、CD34、CD45、CD117及CD141，且其中臍帶組織衍生細胞群分泌營養因子，或由人類臍帶組織衍生細胞群製備之條件培養基含有由該細胞群分泌之營養因子。在一實施例中，由細胞群分泌之營養因子選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2及血小板反應蛋白-4。在一實施例中，細胞群分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、I309、MDC、RANTES及TIMP1。在實施例中，該細胞群不分泌TGF-β2、MIP1a、ANG2、PDGFbb及VEGF，如藉由ELISA所偵測。在一些實施例中，細胞群為實質上均質性族群。在具體實施例中，細胞群為均質性。另外，細胞群不表現hTERT或端粒酶。在實施例中，該細胞群相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨 髓細胞之人類細胞，具有編碼介白素8與網狀內皮素1之基因表現增加。在實施例中，該細胞群生產波形蛋白與α-平滑肌肌動蛋白。

在上文所述之實施例中，臍衍生細胞或胎盤衍生細胞具有下列特徵中之一或多者：HLA-A,B,C陽性；CD10、CD13、CD44、CD73、CD90陽性；HLA-DR,DP,DQ陰性；不生產或為CD31、CD34、CD45、CD117及CD141陰性。在實施例中，該等細胞生產波形蛋白與α-平滑肌肌動蛋白。

在上文所述之進一步實施例中，臍衍生細胞相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞，具有編碼介白素8與網狀內皮素1之基因表現增加。在實施例中，臍衍生細胞不表現hTERT或端粒酶。

在上文所述之本發明之一實施例中，視網膜變性、視網膜病變或視網膜/黃斑病症為年齡相關性黃斑變性。在一替代實施例中，視網膜變性、視網膜病變或視網膜/黃斑病症為乾性年齡相關性黃斑變性。

圖1A至圖1M. hUTC誘導經培養RGC之間的功能性突觸形成。(圖1A)實驗設計之示意圖。將經純化RGC單獨培養或與跨孔插入物中之hUTC、NHDF或大鼠ASC共培養6天。藉由基於免疫細胞化學及電生理學之檢定分別測定突觸之數目及功能。(圖1B)用對突觸前蛋白(Bassoon蛋白，紅色)及突觸後蛋白(Homer蛋白，綠色)具特異性之抗體染色之代表性RGC影像。底部：入口 處(白框)以較高放大率顯示且經共定位之突觸點(synaptic puncta)(合併，黃色)用白色箭頭標記。比例尺：20μm。(圖1C)經共定位突觸點數目之增加倍數(n=59至161個細胞/條件)及(圖1D)突觸密度(每單位樹突長度突觸之數目，n=30個細胞/條件)之定量顯示，hUTC(類似於ASC)誘導經培養RGC之間的興奮性突觸形成。(增加倍數係藉由將每細胞突觸數目用單獨RGC條件中之每細胞突觸數目正規化來計算)。圖1E至圖1I顯示經誘導突觸具電生理學功能。(圖1E)全細胞膜片鉗記錄之實例跡線(trace)顯示mEPSC。mEPSC之(圖1F)事件間間隔之累積機率曲線及(圖1G)平均頻率之定量顯示，與hUTC或ASC共培養誘導突觸事件數目增加。(圖1H)mEPSC振幅之累積機率曲線證明當相較於經單獨培養RGC時，與hUTC或ASC共培養之RGC中的大振幅事件增加。(圖1I)mEPSC振幅平均值在不同條件之間無區別。(對於電生理實驗，n=15個細胞/條件。所有數據表達為平均值±SEM，且顯著性表示為*** p<0.0001、** p<0.001、及* p<0.05，n.s.表示不顯著。)圖1J至圖1M顯示經hUTC及ASC共培養誘導突觸之電生理波形性質。相較於CTR(單獨RGC)，與ASC或hUTC共培養之RGC所記錄之mEPSC顯示(圖1J、圖1K)上升τ及衰退τ(圖1L、圖1M)兩者皆增加。n=15個細胞/條件。所有數據表達為平均值±SEM，且顯著性表示為*** p<0.0001、** p<0.001、及* p<0.05。

圖2A至圖2N. hUTC條件培養基(UCM)誘導經培養RGC之間的功能性突觸形成。(圖2A)實驗設計之示意圖。經純化 RGC經UCM(在各種濃度下)或ACM處理6天。藉由基於免疫細胞化學及電生理學之檢定分別測定突觸之數目及功能。(圖2B)用對突觸前蛋白(Bassoon蛋白，紅色)及突觸後蛋白(Homer蛋白，綠色)具特異性之抗體染色之代表性RGC影像。底部：入口處(白框)以較高放大率顯示且經共定位之突觸點(synaptic puncta)(合併，黃色)用白色箭頭標記。比例尺：20μm。(圖2C)突觸數目之增加倍數(n=65至157個細胞/條件)及(圖2D)突觸密度(每單位樹突長度突觸之數目，n=30個細胞/條件)之定量顯示，UCM(類似於ACM)誘導經培養RGC之間的興奮性突觸形成。(突觸數目之增加倍數係藉由將每細胞經共定位突觸點之數目用單獨RGC條件中之突觸數目正規化來計算。(圖2E)全細胞膜片鉗記錄之實例跡線顯示經單獨培養或用ACM(80μg/mL)或UCM(80μg/mL)處理之RGC的mEPSC。mEPSC之(圖2F)事件間間隔之累積機率曲線及(圖2G)平均頻率之定量顯示，用UCM或ACM處理誘導突觸事件數目增加。(圖2H)mEPSC振幅之累積機率曲線證明相較於經單獨培養RGC，當用UCM或ACM處理RGC時，大振幅事件增加。(圖2I)mEPSC振幅平均值在不同條件之間無顯著區別。(對於電生理實驗，n=15個細胞/條件。所有數據表達為平均值±SEM，且顯著性表示為*** p<0.0001、** p<0.001、及* p<0.05。)圖2J至圖2N UCM誘導突觸數目及電生理性質之變化。(圖2J)用各種濃度ACM及UCM處理之RGC中的突觸數目定量。結果表示為突觸數目之增加倍數(相對於單獨RGC條件中經共定位突觸點數目之數目 正規化，n=29至157個細胞/條件)。經ACM或UCM處理之RGC所記錄之mEPSC證明相較於經單獨培養RGC，(圖2K、圖2L)上升τ及(圖2M、圖2N)衰退τ兩者皆增加(n=15個細胞/條件)。所有數據表達為平均值±SEM，且顯著性表示為*** p<0.0001、** p<0.001、及* p<0.05。

圖3A至圖3J.經hUTC分泌因子促進RGC生存及神經突外生。(圖3A)經生存檢定試劑處理之RGC代表影像(鈣黃綠素-AM用於活細胞(綠色)且乙錠同質二聚體(Ethidium Homodimer)-1用於死亡細胞(紅色))。比例尺：100μm。(圖3B)相較於最低培養基中培養之RGC，在各種濃度的ACM及UCM存在下之RGC存活率定量。(n=9至10個顯微鏡視野/條件)(圖3C)UCM媒介之生存作用在所測試之所有UCM濃度下皆為毛喉素依賴性(n=9至18個顯微鏡視野/條件)。UCM(40μg/mL)之生存作用與(圖3D)BDNF及(圖3E)CNTF之生存作用具有相加性。(n=18至20個顯微鏡視野/條件)(圖3F)單獨培養或經ACM或UCM處理之RGC的代表性骨架化跡線。比例尺：100μm。(圖3G)神經突複雜性之Sholl分析證明，相較於經單獨培養RGC，經條件培養基處理RGC之精細化增加(n=20至24個細胞/條件)。相較於經單獨培養RGC，當用UCM或ACM處理RGC時，(圖3H)總神經突外生、(圖3I)突起數目及(圖3J)分支數目定量證明增加(n=25至36個細胞/條件)。圖形表示為相對於單獨RGC條件之值正規化 的增加倍數。所有數據表達為平均值±SEM，且顯著性表示為*** p<0.0001、** p<0.001、及* p<0.05，n.s.表示不顯著。

圖4A至圖4E.表徵UCM中之突觸形成因子。(圖4A)實驗設計之示意圖。經純化RGC用UCM處理6天，該UCM藉由使用不同截留分子量之離心濃縮管離拆。隨後如之前所述定量突觸數目。(圖4B)代表性RGC影像顯示經共定位突觸點(突觸前：Bassoon蛋白(紅色)，突觸後：Homer蛋白(綠色))。底部：白框以較高放大率顯示。白色箭頭指示經共定位突觸點。比例尺：20μm。(圖4C)定量突觸數目之增加倍數。增加倍數係藉由將經共定位突觸點/細胞之數目相對於單獨RGC條件中所獲得之值正規化來計算(n=30至44個細胞/條件)。(圖4D)代表性RGC影像顯示在加巴噴丁(GBP,32μM)存在或不存在下用UCM處理之RGC中之經共定位突觸點(白色箭頭，突觸前：Bassoon蛋白(紅色)及突觸後：Homer蛋白(綠色))。比例尺：20μm。(圖4E)定量相對於單獨RGC條件正規化之突觸數目之增加倍數(n=24至25個細胞/條件)。經UCM誘導之突觸新生受GBP抑制。所有數據表達為平均值±SEM，且顯著性表示為*** p<0.0001、** p<0.001、及* p<0.05。

圖5A至圖5K. TSP1、TSP2及TSP4為hUTC誘導突觸新生所需。(圖5A)TSP剔除實驗之實驗設計示意圖(圖5至圖7)。TSP1、TSP2及TSP4表現係藉由慢病毒shRNA轉導hUTC而靜默且收集剔除(KD)UCM。RGC經KD UCM處理6天。測定UCM對突觸形成(突觸檢定)、突觸功能(電生理學)、神經元生存 (生存檢定)、及神經突外生(外生檢定)之作用。(圖5B)西方墨點法確認使用慢病毒shRNA轉導剔除TSP1、TS2P及TSP4。稱為HEVIN之不相關之hUTC分泌蛋白用作加樣對照組。(圖5C)經淩亂對照組UCM(SCR-CTR)及TSP-KD UCM處理之RGC中的突觸數目增加倍數係相對於單獨RGC條件正規化(n=30個細胞/條件)。(圖5D)經各種TSP-KD UCM處理之RGC中的突觸數目增加倍數係相對於單獨RGC條件正規化(n=76至81個細胞/條件)。(圖5E)在純化TSP存在下經TSP1+2+4-KD UCM處理之RGC中的突觸數目增加倍數係相對於單獨RGC條件正規化(n=30個細胞/條件)。添加所有三種TSP(TSP1、TSP2及TSP4)救援TSP1+2+4-KD UCM之突觸新生作用。各種不同處理之RGC的代表影像可見圖5H至圖5J。圖5F及圖5G證明嘌呤黴素對慢病毒感染hUTC之選擇。(圖5F)未經慢病毒轉導之hUTC在各種嘌呤黴素濃度下之第3天及第5天殺死曲線(n=3個顯微鏡視野/條件)。(圖5G)經慢病毒感染及未經慢病毒感染之hUTC在嘌呤黴素(0.9μg/mL)存在下之第3天及第5天代表性影像。比例尺：50μm。圖5H至圖5L顯示hUTC分泌之TSP誘導RGC之間的突觸形成。(圖5H至圖5J)顯示經共定位突觸點之RGC代表性影像(突觸前：Bassoon蛋白(紅色)，突觸後：Homer蛋白(綠色))證明當使用TSP1+2+4-KD UCM時，UCM之突觸新生活性喪失。該喪失可藉由將經純化TSP1或TSP2或TSP4(150ng/ml)添加至KD UCM中而部分救援。添加所有三種TSP救援UCM之完整突觸新生作用。底部：白框以較高放大率顯 示。白色箭頭指示經共定位突觸點。比例尺：20μm。(圖5K)在用各種TSP-KD UCM處理之後定量突觸密度(經共定位突觸點數目/神經突長度)之變化。(圖5L)定量經單獨培養RGC(陰性對照組)或經KD CTR UCM處理之RGC在純化TSP存在下的突觸形成(n=30個細胞/條件)。將純化TSP添加至KD CTR UCM中不引起突觸數目進一步增加。所有數據表達為平均值±SEM，且顯著性表示為*** p<0.0001、** p<0.001、及* p<0.05，n.s.表示不顯著。

圖6A至圖6I. TSP1、TSP2及TSP4為hUTC誘導突觸功能增加所需。(圖6A)全細胞膜片鉗記錄之實例跡線顯示經AMC(陽性對照組)、SCR-CTR、TSP1+2+4-KD UCM處理之RGC或經單獨培養RGC(陰性對照組)之mEPSC。UCM(TSP1+2+4-KD)中TSP之靜默廢除由SCR-CTR達成之(圖6B、圖6C)頻率及(圖6D、圖6E)振幅兩者之增加。定量數據係顯示為累積機率曲線(圖6B、圖6D)及平均值之柱狀圖(圖6C、圖6E)。n=15個細胞/條件。(圖6F)全細胞膜片鉗記錄之實例跡線顯示經ACM(陽性對照組)、SCR-CTR或TSP1+2+4-KD UCM處理之RGC或經單獨培養RGC(陰性對照組)之mEPSC。UCM(TSP1+2+4-KD)中TSP之靜默廢除由SCR-CTR達成之頻率(圖6G至圖6H )及振幅(圖6I至圖6J)兩者之增加。定量數據係顯示為累積機率曲線( 圖6G、圖6I )及平均值之柱狀圖( 圖6H、圖6J )。n=15個細胞/條件。圖6K至圖6N證明TSP剔除對經UCM處理RGC之波形性質之作用。(圖6K、圖6L)上升τ或(圖6M、圖6N)衰退τ不受hUTC中TSP表現靜默 之顯著影響，如藉由經KD-CTR及TSP1+2+4-KD UCM處理之RGC記錄之間具有類似值所證明(n=15個細胞/條件)。所有數據表達為平均值±SEM，且顯著性表示為*** p<0.0001、** p<0.001、及* p<0.05。

圖7A至圖7O. TSP為UCM誘導神經突外生所需，但不為細胞生存所需。(圖7A)經SCR-CTR、KD-CTR或TSP1+2+4-KD UCM處理之RGC相較於單獨RGC(陰性對照組)之代表性骨架化跡線。比例尺：100μm。相較於兩個對照組(SCR-CTR及KD-CTR)，TSP靜默之hUTC UCM(TSP1+2+4-KD UCM)導致總神經突外生之(圖7B)長度、(圖7C)突起及(圖7D)分支減少(n=40至48個細胞/條件)。hUTC中之TSP靜默導致降低(圖7E)總神經突外生長度(n=120至169個細胞/條件)及(圖7F)由Sholl分析所示之複雜性(n=25個細胞/條件)之UCM。#指示相較於單獨RGC條件，總外生顯著減少(p<0.05)。(圖7G)經KD-CTR處理或經TSP1+2+4-KD UCM在純化TSP存在下處理之RGC之代表性骨架化跡線。比例尺：100μm。將純化TSP添加至TSP1+2+4-KD UCM中恢復UCM增強(圖7H)總神經突生長(n=29至33個細胞/條件)及(圖7I)複雜性(n=30個細胞/條件)之功能。#指示相較於單獨RGC條件，總外生顯著減少(p<0.05)。(圖7J)經生存檢定試劑處理之RGC代表影像(鈣黃綠素-AM用於活細胞(綠色)且乙錠同質二聚體-1用於死亡細胞(紅色))。比例尺：100μm。(圖7K)定量經各種TSP-KD UCM條件處理之RGC的存活百分比(n=30個顯微 鏡視野/條件)。TSP2或TSP4或所有三種TSP之靜默導致UCM之生存促進作用減小。(圖7L)將純TSP添加至TSP1+2+4-KD UCM中不恢復KD-UCM之完整生存作用(n=20個顯微鏡視野/條件)。圖7M至圖7O顯示TSP涉及UCM誘導之RGC神經突外生。(圖7M)經SCR-CTR、KD-CTR及TSP-KD UCM處理之RGC相較於單獨RGC(陰性對照組)之代表性骨架化跡線。比例尺：100μm。hUTC中之TPS剔除導致(圖7N)突起及(圖7O)分支數目減少(n=120至169個細胞/條件)。將突起及分支數目之倍數變化相對於單獨RGC對照組正規化。圖7P至圖7R顯示添加純化TSP救援TSP1+2+4-KD UCM之神經突外生功能。(圖7P)經KD-CTR處理或經TSP1+2+4-KD UCM在純化TSP存在下處理之RGC之代表性骨架化跡線。比例尺：100μm。將純化TSP添加回TSP1+2+4-KD UCM中(圖7Q)對突起數目僅具有些微作用，但(圖7R)恢復分支數目之倍數變化(n=29至33個細胞/條件)。所有數據表達為平均值±SEM，相對於單獨RGC正規化，且顯著性表示為***p<0.0001、** p<0.001、及* p<0.05。

圖8A至8J.在CSPG、Nogo-A或MBP存在下，hUTC分泌之TSP誘導神經突外生。總神經突外生之定量係於塗布有遞增濃度之(圖8A)CSPG(n=45至79個細胞/條件)或(圖8B)Nogo-A(n=30至37個細胞/條件)之蓋玻片上進行。圖形表示為相對於接種於不含有CSPG或Nogo-A之蓋玻片上的RGC外生值正規化的增加倍數。接種至(圖8C)CSPG(0.05ug/cm²)或(圖8D)Nogo-A(1 ug/cm²)塗布蓋玻片上之經SCR-CTR、TSP KD UCM及純化TSP處理之RGC的代表性骨架化跡線。比例尺：100μm。圖8E至圖8F.總神經突外生之定量係於接種至(圖8E)CSPG(0.05ug/cm²，n=62至103個細胞/條件)或(圖8F)Nogo-A(1ug/cm²，n=25至29個細胞/條件)塗布蓋玻片上之RGC進行。圖形表示為相對於僅經生長培養基(單獨RGC)培養之RGC值正規化之各種培養條件下的增加倍數。(圖8G)在MBP(10ug/mL)存在下，經SCR-CTR或TSP1+2+4-KD UCM單獨或補充純化TSP處理之RGC之代表性骨架化跡線。比例尺：100μm。(圖8H)在生長抑制物質存在下，經純化TSP處理之RGC之代表性骨架化跡線。比例尺：100μm。(圖8I)總神經突外生之定量證明在MBP存在下，經UCM分泌TSP2之神經突外生活性增強。(n=40-54個細胞/條件)。圖形表示為相對於單獨RGC條件之值正規化的增加倍數。(圖8J)在CSPG、Nogo-A或MBP存在下，用純化TSP處理RGC能夠誘導顯著外生(n=41至54個細胞/條件)。所有數據表達為平均值±SEM，且顯著性表示為*** p<0.0001、** p<0.001、及* p<0.05，n.s.表示不顯著。#指示相較於單獨RGC條件，總外生顯著減少(p<0.05)。

本發明之其他特性與益處將因以下之詳細說明與實例而清楚易見。

本說明書中提及各種專利及其他出版物。這些出版物之各者之全部內容以引用方式併入本文中。在下列說明性實施例之 詳細說明中，參照形成本說明書之一部分的隨附圖式。這些實施例係以足夠詳細之方式說明以讓熟習該項技術者能夠實行本發明，並會理解到尚可利用其他實施例，而且可在不偏離本發明之精神或範疇下作出邏輯結構、機械、電性與化學上的變化。為了避免非為所屬技術領域中具有通常知識者能夠實行本文中所述之實施例所需之細節，本說明書可能會省略某些所屬技術領域中具有通常知識者所習知之資訊。因此，以下實施方式不應理解為限制性意義，且說明性實施例之範疇由隨附申請專利範圍所限定。

定義

本說明書及申請專利範圍中所使用之各種用語如以下闡述所定義且意欲闡明本發明。

幹細胞(stem cell)為未分化之細胞，其係以單一細胞同時具有自我更新及分化以生產後裔細胞(progeny cell)的能力來定義，包括自我更新前驅(self-renewing progenitor)、非更新前驅(non-renewing progenitor)與最終分化細胞(terminally differentiated cell)。幹細胞之特徵亦在於其具有體外分化為多個胚層(內胚層、中胚層與外胚層)之各種細胞譜系之功能性細胞的能力，以及在移植後形成多個胚層之組織的能力，並且能夠在注入胚胞(blastocyst)後實質上促成大多數(如果不是全部)組織形成。

幹細胞依據其發展潛能分類如下：(1)全能性(totipotent)；(2)多能性(pluripotent)；(3)多潛能性(multipotent)；(4) 少能性(oligopotent)；與(5)單能性(unipotent)。全能性細胞能夠形成所有胚胎與胚外細胞型。多能性細胞能夠形成所有胚胎細胞型。多潛能性細胞包括該些能夠形成細胞譜系亞群，但全部在特定組織、器官、或生理系統內之細胞(例如，造血幹細胞(HSC)可生產後裔，包括HSC(自我更新)、血液細胞限制少能性前驅、及作為血液正常組分之所有細胞型及元件(例如，血小板))。少能性細胞可以形成比多潛能性幹細胞更受限之細胞譜系亞群；及單能性細胞能夠形成單一細胞譜系(例如生精幹細胞)。

幹細胞亦根據其獲得來源來分類。成體幹細胞(adult stem cell)通常為多潛能性未分化細胞，其在包含多重分化細胞型之組織中發現。成體幹細胞可自我更新。在正常環境下，其亦可分化以產生其始源組織之特化細胞型，並且亦可能產生其他組織型。誘導多能性幹細胞(iPS細胞)為轉化成多能性幹細胞之成體細胞。(Takahashi等人，Cell,2006；126(4)：663-676；Takahashi等人，Cell,2007；131：1-12)。胚胎幹細胞(embryonic stem cell)為來自胚胞階段胚胎之內細胞團(inner cell mass)的多能性細胞。胎體幹細胞(fetal stem cell)為源自胎體組織或膜之幹細胞。產後幹細胞(postpartum stem cell)為多潛能性或多能性細胞，其實質上源自生產後所能取得之胚外組織，亦即胎盤及臍帶。已發現這些細胞擁有多能性幹細胞之特性特徵，包括快速增生及分化為多種細胞譜系之潛能。產後幹細胞可為血液衍生(例如該些得自臍帶血之幹細胞)或非血液衍生(例如得自臍帶及胎盤之非血液組織)。

胚胎組織通常定義為源自胚胎(在人類係指自受精至發育約六週之期間)之組織。胎體組織係指源自胎體之組織，胎體在人類係指自發育約六週至分娩之期間。胚外組織為與胚胎或胎體相關但非源自胚胎或胎體之組織。胚外組織包括胚外膜(絨毛膜、羊膜、卵黃囊及尿囊)、臍帶及胎盤(其自身形成自絨毛膜及母體底蛻膜)。

分化(Differentiation)為未特化(「未定向(uncommitted)」)或特化較低之細胞藉以獲得特化細胞(諸如舉例來說神經細胞或肌肉細胞)特徵的過程。已分化細胞為佔據細胞譜系內較高特化(「定向(committed)」)位置之細胞。用語定向(committed)當應用於分化過程時，係指細胞在分化路徑中已進行達到一點，在正常環境下達到該點之細胞將會持續分化為特定細胞型或細胞型亞群，並且在正常環境下無法分化為不同細胞型或回復為較低分化之細胞型。去分化(De-differentiation)係指細胞藉以回復至細胞譜系內較低特化(或定向)位置的過程。如本文中所使用，細胞之譜系(lineage)定義細胞之遺傳，即細胞係來自哪些細胞以及細胞可形成哪些細胞。細胞之譜系將細胞放置於發育及分化之遺傳方案(hereditary scheme)內。

廣義而言，前驅細胞(progenitor cell)為能夠產生較其本身更高分化之後裔，但又保有補充前驅池之能力的細胞。就此定義而言，幹細胞本身亦為前驅細胞，如同終末分化細胞之較直接前體細胞(more immediate precursor)。當提及本發明之細胞時，如以下 所更詳述說明者，可使用此較廣之前驅細胞定義。狹義而言，前驅細胞通常定義為在分化路徑中作為中間者之細胞，即其係由幹細胞所形成並且在成熟細胞型或細胞型亞群之生產中作為中間者。此類型之前驅細胞通常無法自我更新。因此，如果在本文中提及此類型之細胞，將會稱其為非更新前驅細胞(non-renewing progenitor cell)或中間前驅或前體細胞(intermediate progenitor or precursor cell)。

如本文中所使用，片語「分化成眼譜系或表型(differentiates into an ocular lineage or phenotype)」係指細胞變得部分或完全定向至特定眼表型，包括但不限於視網膜及角膜幹細胞、視網膜及虹膜之色素上皮細胞、光受體、視網膜神經節及其他視神經譜系(例如，視網膜神經膠細胞、微膠細胞、星狀細胞、繆氏細胞(Mueller cell))、形成水晶體之細胞、及鞏膜、角膜、角膜緣(limbus)及結膜之上皮細胞。片語「分化成神經譜系或表型(differentiates into a neural lineage or phenotype)」係指細胞變得部分或完全定向至CNS或PNS之特定神經表型，亦即，神經元或膠細胞，後一類別包括但不限於星狀細胞、寡樹突細胞、許旺氏細胞(Schwann cell)及微膠細胞。

本文所例示且較佳用於本發明之細胞通常稱為產後衍生細胞(或PPDC)。其有時亦可更具體地被稱為臍衍生細胞或胎盤衍生細胞(UDC或PDC)。此外，該些細胞可被描述為幹細胞或前驅細胞(progenitor cell)，後項用語係以廣義的方式來使用。用語衍生(derived)係用來指明細胞係得自其生物來源，且於體外生長或 經其他方式調控(例如培養於生長培養基以擴增族群及/或生產細胞系(cell line))。臍幹細胞及胎盤幹細胞之體外調控以及本發明之臍衍生細胞及胎盤衍生細胞之獨有特性係詳述於後文中。藉由其他手段分離自產後胎盤及臍之細胞亦被認為適合用於本發明中。這些其他細胞在本文中稱為產後細胞(而非產後衍生細胞)。

使用各種用語來描述在培養物中之細胞。細胞培養物(cell culture)通常係指取自活體生物並且在受控制條件下生長(「在培養物中(in culture)」或「經培養(cultured)」)的細胞。初代細胞培養物(primary cell culture)為直接取自生物且在第一次亞培養前之細胞、組織或器官的培養物。當細胞置於生長培養基中並處於有利細胞生長及/或分裂之條件下時，其在培養物中擴增從而導致更大的細胞群。當細胞在培養物中擴增時，細胞增生之速率有時係以細胞數目倍增所需的時間量來量測。此稱為倍增時間(doubling time)。

細胞系(cell line)為由初代細胞培養物之一或多個亞培養(subcultivation)所形成的細胞群。每一輪亞培養稱為一個繼代(passage)。當細胞經過亞培養時，將它們稱為已繼代。特定之細胞群或細胞系有時會以其繼代次數來指稱或表徵。例如，繼代十次的經培養細胞群可稱為P10培養物。初代培養物(在細胞自組織分離出來後的第一次培養物)係命名為P0。在第一次亞培養後，該些細胞係描述為二次培養物(P1或繼代1)。在第二次亞培養後，該些細胞即變成三次培養物(P2或繼代2)，依此類推。所屬技術領域中具有通常知識者將會理解到，在繼代期間會有多次族群倍增；因此， 培養物之族群倍增次數大於其繼代次數。在繼代間隔期間的細胞擴增(即族群倍增次數)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、基材、培養基、生長條件及繼代間隔時間。

用語生長培養基(Growth Medium)通常係指足以培養PPDC之培養基。詳言之，用於培養本發明之細胞的一種目前較佳培養基包含達爾伯克改良必需培養基(Dulbecco's Modified Essential Media)(在本文中亦縮寫為DMEM)。尤其較佳的是DMEM-低葡萄糖(在本文中亦稱為DMEM-LG)(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。DMEM-低葡萄糖較佳係補充有15%(v/v)胎牛血清(例如限定之胎牛血清，Hyclone,Logan Utah)、抗生素/抗黴劑(較佳50至100個單位/毫升青黴素、50至100微克/毫升鏈黴素、及0至0.25微克/毫升兩性黴素B；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)、及0.001%(v/v)2-巰基乙醇(Sigma,St.Louis Mo.)。如以下實例中所使用，生長培養基係指具有15%胎牛血清及抗生素/抗黴劑之DMEM-低葡萄糖(當包括青黴素/鏈黴素時，其較佳分別為50U/ml及50微克/ml；當使用青黴素/鏈黴素/兩性黴素時，其較佳分別為100U/ml、100微克/ml及0.25微克/ml)。在一些情況下，使用不同生長培養基，或提供不同補充劑，這些通常在文中指明為生長培養基之補充劑。

條件培養基(conditioned medium)為其中特定細胞或細胞群係經培養且隨後移除之培養基。當細胞培養於培養基中時，其可分泌可提供營養支持給其他細胞之細胞因子。此類營養因子包 括但不限於荷爾蒙、細胞介素、細胞外基質(ECM)、蛋白質、囊泡、抗體、及顆粒。含有細胞因子之培養基為條件培養基。

通常，營養因子(trophic factor)係定義為促進細胞生存、生長、分化、增生及/或成熟之物質，或刺激細胞提高活性之物質。細胞之間經由營養因子的交互作用可發生在不同類型的細胞之間。藉助營養因子之細胞交互作用見於基本上所有的細胞型中，且為神經細胞型之通訊所尤其顯著的手段。營養因子亦可以自泌(autocrine)之方式作用，亦即，細胞可生產影響其自身生存、生長、分化、增生及/或成熟之營養因子。

當提及經培養脊椎動物細胞時，用語衰老(senescence)(還有複製性衰老(replicative senescence)或細胞衰老(cellular senescence))係指歸因於有限細胞培養物之性質；亦即，其無法生長超過有限的族群倍增次數(有時稱為海富利克界限(Hayflick's limit))。儘管細胞衰老最先係使用纖維母細胞樣細胞(fibroblast-like cell)來描述，但是可在培養物中成功生長之大部分正常人類細胞型均經歷細胞衰老。不同細胞型之體外壽命不同，但是最大壽命通常少於100次族群倍增(此為培養物中之所有細胞變衰老且因此使培養物無法分裂之倍增次數)。衰老並非取決於時序時間，而是由培養物所經歷之細胞分裂、或族群倍增之次數所量測。

用語眼(ocular)、眼科(ophthalmic)及視(optic)在本文中可互換使用以定義「眼睛的、或有關眼睛、或與眼睛相關(of,or about,or related to the eye)」。

用語眼變性病狀(ocular degenerative condition)(或病症(disorder))為包括性用語，涵蓋涉及細胞損傷、變性或損失之眼睛(包括眼睛與腦之間的神經連接)的急性及慢性病狀、病症或疾病。眼變性病狀可與年齡有關，或可因受傷或創傷所致，或可與特定疾病或病症有關。急性眼變性病狀包括但不限於與細胞死亡相關之病狀或影響眼睛的損害，包括由以下引起之病狀：腦血管機能不全、局灶性或瀰漫性腦創傷、瀰漫性腦損傷、傳染性或發炎性眼睛病狀、視網膜裂開或脫附、眼內病灶(挫傷穿透、壓迫、撕裂)或其他身體受傷(例如，物理或化學灼傷)。慢性眼變性病狀(包括進行性病狀)包括但不限於視網膜病變及其他視網膜/黃斑病症，諸如色素性視網膜炎(RP)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、脈絡膜新生血管膜(CNVM)；視網膜病變，諸如糖尿病視網膜病變、閉塞性視網膜病變、鐮狀細胞視網膜病變及高血壓視網膜病變、中央視網膜靜脈阻塞、頸動脈狹窄、視神經病變，諸如青光眼及相關症候群；水晶體及外眼之病症例如角膜緣幹細胞缺乏(LSCD)，亦稱為角膜緣上皮細胞缺乏(LECD)，諸如發生於化學或熱受傷中、Stevens-Johnson二氏症候群、隱形眼鏡誘導之角膜病變、眼瘢痕性類天皰瘡、先天無肛膜或外胚層發育不良疾病、及多發性內分泌缺乏相關角膜炎。

用語治療眼變性病狀(treating an ocular degenerative condition)或眼變性病狀之治療(treatment of an ocular degenerative condition)係指緩解如本文所定義之眼變性病狀之作用，或延緩、暫停或逆轉眼變性病狀之進展，或延緩或預防眼變性病狀之發生。

用語有效量(effective amount)係指試劑或醫藥組成物諸如生長因子、分化劑、營養因子、細胞群或其他藥劑之濃度或量，該濃度或量可有效產生預期結果，包括如本文所述之體外或體內之細胞生長及/或分化，或治療眼變性病狀。關於生長因子，有效量可在約1奈克/毫升至約1微克/毫升之範圍內。關於向患者體內投予之PPDC，有效量可在少至數百或更少、至多達數百萬或更多之範圍內。在特定實施例中，有效量可在10³至11¹¹個細胞之範圍內，更特定言之為至少約10⁴個細胞。應理解待投予之細胞數目將取決於待治療病症之細節，包括但不限於待治療之大小或總體積/表面積，以及投予位點與待治療區域之位置之靠近性，以及醫藥生物學家熟悉的其他因素而變化。

用語有效期間(effective period)(或時間(time))及有效條件(effective condition)係指對於劑或醫藥組成物而言，為達成其預期結果所必需或較佳的時間期間或其他可控條件(例如，體外方法之溫度、濕度)。

用語患者(patient)或對象(subject)係指用本文所述之醫藥組成物或根據本文所述之方法治療之動物，包括哺乳動物，較佳為人類。

用語醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)(或培養基(medium))可與用語生物可相容之載劑或培養基(biologically compatible carrier or medium)互換使用，係指試劑、細胞、化合物、材料、組成物、及/或劑型，其不僅可與供治療性投予 之細胞及其他藥劑相容，而且在合理的醫學判斷之範疇內適用於與人類及動物之組織接觸，而無過度毒性、刺激、過敏反應、或符合合理的利益/風險比的其他併發症。

在本文中使用若干關於細胞置換療法(cell replacement therapy)之用語。用語自體轉移(autologous transfer)、自體移植(autologous transplantation)、自體移接(autograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者亦為細胞置換療法之接受者之治療。用語同種異體轉移(allogeneic transfer)、同種異體移植(allogeneic transplantation)、同種異體移接(allograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者與細胞置換療法之接受者為相同物種，但非相同個體之治療。捐贈者細胞與接受者組織相容性匹配之細胞轉移有時稱為同基因轉移(syngeneic transfer)。用語異種轉移(xenogeneic transfer)、異種移植(xenogeneic transplantation)、異種移接(xenograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者與細胞置換療法之接受者為不同物種之治療。如本文中所使用之移植係指將自體、或同種異體捐贈者細胞置換療法引入至接受者。

如本文中所使用，用語「約」在指稱一可測量的值(例如數量、持續時間及類似者)時，意欲涵蓋在指定值之±20%或±10%、更佳為±5%、甚至更佳為±1%、且仍更佳為±0.1%內的變異，若此類變異為適合執行所揭露之方法者。

說明

眼變性病狀涵蓋成因分歧之急性、慢性及進行性病症及疾病，共同特徵為特定或易受傷害之眼細胞群的功能異常或損失。此共同性使能夠開發用於修復或再生易受傷害、受損或失去之眼組織或細胞之類似治療方式，其中之一為基於細胞之療法。眼變性病狀之細胞療法的開發受限於相對較少類型的幹細胞或前驅細胞，包括眼衍生幹細胞本身(例如，視網膜及角膜幹細胞)、胚胎幹細胞及少數類型的成體幹細胞或前驅細胞(例如，神經、黏膜上皮及骨髓幹細胞)。分離自產後臍帶及胎盤之細胞已被識別為適用於此目的之前驅細胞之顯著新來源。(US 2005-0037491及US 2010-0272803)。此外，由分離自產後胎盤及臍帶組織之細胞所產生之條件培養基提供另一種用於治療眼變性病狀之新來源。因此，在本文所述之各種實施例中，本發明之特徵在於用於(修復及再生眼組織)之方法及醫藥組成物，該方法及醫藥組成物使用來自前驅細胞諸如分離自產後臍帶或胎盤之細胞的條件培養基。本發明適用於眼變性病狀，但預期尤其適用於一些難以治療或治癒或無可得治療或療法之眼病症。這些眼病症包括但不限於年齡相關性黃斑變性、色素性視網膜炎、糖尿病性及其他視網膜病變。

預期衍生自前驅細胞(諸如根據所屬技術領域中已知之任何方法分離自產後臍帶或胎盤之細胞)之條件培養基適合用於本發明中。然而，在一實施例中，本發明使用衍生自如上文所定義之臍帶組織衍生細胞(hUTC)或胎盤組織衍生細胞(PDC)之條件培養基，該等細胞係衍生自較佳地根據下文所述之方法使之實質上不含 血液之臍帶組織或胎盤。hUTC或PDC能夠在培養物中擴增且具有分化成其他表型之細胞的潛能。某些實施例之特徵在於由此類前驅細胞所製備之條件培養基、包含條件培養基之醫藥組成物、及使用該醫藥組成物治療急性或慢性眼變性病狀患者之方法。本發明之產後衍生細胞係經其在培養物中之生長性質、其細胞表面標記、其基因表現、其生產某些生化營養因子之能力、及其免疫性質表徵。衍生自產後衍生細胞之條件培養基係經該些細胞所分泌之營養因子表徵。

製備細胞

用於本發明之組成物及方法中之細胞、細胞群及包含細胞溶解產物、條件培養基及其類似物之製劑係描述於本文，且詳細描述於美國專利第7,524,489號、及第7,510,873號、及美國公開申請案第2005/0058634號中，其各自以引用方式併入本文中。根據使用產後細胞之該些方法，將哺乳動物臍帶及胎盤在足月或不足月懷孕結束時或結束後不久例如在排出胎衣(after-birth)後回收。產後組織可在無菌容器例如燒瓶、燒杯、培養皿或袋中自生產地運輸至實驗室。該容器可具有溶液或培養基，包括但不限於鹽溶液如達爾伯克改質伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle's Medium,DMEM)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，或者任何用來運輸用於移植之器官的溶液如威斯康辛大學溶液(University of Wisconsin solution)或全氟化化合物溶液(perfluorochemical solution)。可將一或多種抗生 素及/或抗黴劑(例如但不限於青黴素(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)、兩性黴素B(amphotericin B)、建它黴素(gentamicin)與制黴菌素(nystatin))加至該培養基或緩衝液。產後組織可用抗凝劑溶液例如含肝素溶液來潤洗。較佳者為使該組織在萃取PPDC前保持在約4-10℃下。更佳者為使該組織在萃取PPDC前未經冷凍。

PPDC之分離較佳為在無菌環境中進行。臍帶可藉由該項技術領域中習知之手段來與胎盤分開。或者，臍帶與胎盤未經分開即可使用。較佳為在分離PPDC前自產後組織移除血液與碎屑。例如，產後組織可用緩衝液來清洗，諸如但不限於磷酸鹽緩衝鹽水。清洗緩衝液亦可包含一或多種抗黴劑及/或抗生素，諸如但不限於青黴素、鏈黴素、兩性黴素B、建它黴素及制黴菌素。

包含完整胎盤或臍帶、或其片段或區段之產後組織係藉由機械力(切碎或剪切力)來崩解。在目前較佳實施例中，分離程序亦利用酶消化法。許多種酶在該項技術領域中係習知可用來自複雜組織基質中分離出個別細胞以利於在培養物中生長。此類酶為市售可得，範圍從弱消化性(例如去氧核糖核酸酶及中性蛋白酶分散酶(dispase))到強消化性(例如木瓜酶及胰蛋白酶)皆有。相容於本文中之酶的非詳盡無遺清單包括黏液分解酶活性物、金屬蛋白酶(metalloprotease)、中性蛋白酶、絲胺酸蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶)與去氧核糖核酸酶。目前較佳者為選自金屬蛋白酶、中性蛋白酶與黏液分解活性物之酶活性物。例如，膠原蛋白酶已知可用來自組織分離出各種細胞。去氧核糖核酸酶可 消化單股DNA並且可使分離期間的細胞結塊(cell clumping)降至最低。較佳方法涉及用例如膠原蛋白酶及分散酶、或膠原蛋白酶、分散酶、及玻尿酸酶進行酶處理，且提供此類方法，其中在某些較佳實施例中，膠原蛋白酶與中性蛋白酶分散酶之混合物係用於解離步驟中。更佳者為該些於至少一種來自溶組織芽胞梭菌(Clostridium histolyticum)之膠原蛋白酶以及蛋白酶活性物、分散酶與嗜熱菌蛋白酶中之任一者存在下來進行消化之方法。再佳者為同時使用膠原蛋白酶與分散酶酶活性物來進行消化之方法。同樣較佳者為包括除了膠原蛋白酶與分散酶活性物外使用玻尿酸酶活性物來進行消化之方法。熟悉該項技藝人士將會瞭解到，許多種此類酶處理在該項技術領域中皆為習知可用於自各種組織來源分離出細胞。舉例而言，酶組合之LIBERASE^TM Blendzyme 3(Roche)系列適合用於本發明方法中。其他酶來源為習知者，並且熟悉該項技藝人士亦可直接自此類酶之天然來源獲得這些酶。熟悉該項技藝人士亦擁有充足知識，能夠針對新的或其他酶或酶組合在用於分離本發明之細胞方面評估其實用性。較佳酶處理費時0.5、1、1.5或2小時或更久。在其他較佳實施例中，組織在解離步驟之酶處理期間係培養於37℃下。

在本發明之一些實施例中，產後組織係分開為包含各種組織態樣舉例而言例如胎盤之新生兒、新生兒/母體及母體態樣的區段。分開之區段接著根據本文中所述之方法藉由機械及/或酶解離來解離。新生兒或母體譜系之細胞可藉由該項技術領域中習知的任 何手段來識別，例如藉由核型分析(karyotype analysis)或Y染色體之原位雜交。

經分離之細胞或PPDC自其所生長出之產後組織可用來起始或接種細胞培養物。將經分離之細胞轉移至無菌組織培養容器，並且容器未經塗布或經細胞外基質或配體如層黏蛋白、膠原蛋白(原生、變性或交聯)、明膠、纖連蛋白素與其他細胞外基質蛋白質塗布。PPDC係於任何能夠維持該等細胞生長之培養基中培養，諸如但不限於DMEM(高或低葡萄糖)、進階DMEM、DMEM/MCDB 201、伊格爾基礎培養基(Eagle’s basal medium)、哈姆F10培養基((Ham's F-10 medium,F10)、哈姆F-12培養基、伊思考夫改質達爾伯克培養基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)、間葉幹細胞生長培養基(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium,MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640及cellgro FREE^TM。培養基可補充一或多種組分，包括例如胎牛血清(FBS)(較佳為約2-15%(v/v))；馬血清(ES)；人血清(HS)；β-巰基乙醇(beta-mercaptoethanol,BME或2-ME)，較佳為約0.001%(v/v))；一或多種生長因子，例如血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子-1(IGF-1)、白血球抑制因子(LIF)及紅血球生成素；胺基酸，包括L-纈胺酸；以及一或多種抗生素及/或抗黴劑以控制微生物污染，例如青黴素G、硫酸鏈黴素、兩性黴素B、建它黴素及制黴菌素，不論單獨或組合使用。培養基較佳包含生長培養基(DMEM-低葡萄糖、血清、BME、及抗生素)。

細胞係以允許細胞生長之密度接種於培養容器中。在一較佳實施例中，細胞在約0至約5體積百分比的CO₂在空氣中培養。在一些較佳實施例中，細胞在約2至約25百分比的O₂在空氣中、較佳在約5至約20百分比的O₂在空氣中培養。細胞較佳在約25至約40℃下培養，且更佳在37℃下培養。細胞較佳於培養器中培養。培養容器中的培養基可為靜止或經攪拌，例如使用生物反應器。較佳為使PPDC在低氧化應力(oxidative stress)下生長(例如添加麩胱甘肽、維生素C、過氧化氫酶、維生素E、N-乙醯半胱胺酸)。如本文所用之「低氧化應力(Low oxidative stress)」係指對於所培養細胞無自由基傷害或最低自由基傷害之條件。

用於選擇最適當培養基、培養基製備與細胞培養技術之方法在該項技術領域為熟知者，並且係描述於各種不同來源中，包括Doyle等人，(編)，1995,Cell &TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES,John Wiley & Sons,Chichester；與Ho及Wang(編)，1991,ANIMAL CELL BIOREACTORS,Butterworth-Heinemann,Boston，上述皆以引用方式併入本文中。

在培養分離之細胞或組織片段一段足夠時間後，PPDC將會生長出來，此係因自產後組織遷移出來或因細胞分裂所致，或者兩者皆是。在本發明的一些實施例中，PPDC係經繼代或移除至含有與初始使用之培養基相同或不同類型之新鮮培養基的分開培養容器中，其中細胞群可經有絲分裂擴增。本發明之細胞可在 繼代0與衰老之間的任何時點使用。較佳為將細胞繼代約3與約25次之間，更佳為繼代約4至約12次，並且較佳為繼代10或11次。可執行選殖(Cloning)及/或次選殖(subcloning)以確認已分離出細胞的殖株族群(clonal population)。

在本發明之一些態樣中，存在於產後組織中的不同細胞型係經離拆(fractionated)為亞群，而PPDC可自該些亞群分離出來。此可使用細胞分離標準技術來達成，包括但不限於進行酶處理以將產後組織解離為其組分細胞，接著選殖及選擇特定細胞型，例如但不限於根據形態及/或生化標記來選擇；選擇性生長所欲之細胞(正向選擇)、選擇性破壞不欲之細胞(負向選擇)；根據混合族群中之差別細胞可凝集性來進行分離，例如使用黃豆凝集素；冷凍-解凍程序；在混合族群中之細胞的差別貼附性；過濾；傳統與區帶(zonal)離心；離心淘析(對流離心(counter-streaming centrifugation))；單元重力分離(unit gravity separation)；逆流分配(countercurrent distribution)；電泳；及螢光活化細胞分選(FACS)。有關殖株選擇及細胞分離技術之綜述，參見Freshney,1994,CULTURE OF ANIMAL CELLS：A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES，第3版，Wiley-Liss,Inc.,New York，其以引用方式併入本文。

視需要更換培養基，例如使用例如吸量管小心將培養基自皿吸出，然後以新鮮培養基補足。持續培養直到皿中累積足夠細胞數目或密度。可將原始外植之組織區段取出，然後使用標準技術或使用細胞刮杓來讓剩餘細胞進行胰蛋白酶消化(trypsinized)。在 胰蛋白酶消化後，將細胞收集、移至新鮮培養基然後如上述培養。在一些實施例中，培養基在胰蛋白酶消化後約24小時更換至少一次以移除任何飄浮細胞。培養物中剩餘之細胞被視為是PPDC。

PPDC可經凍存。因此，在以下更詳細描述之較佳實施例中，用於自體轉移之PPDC(無論是用於母親或嬰兒)可衍生自在嬰兒出生後之適當產後組織，接著經過凍存以使得之後需要移植該些細胞時可供使用。

細胞之特徵

本發明之前驅細胞諸如PPDC可藉由下列加以表徵：例如生長特徵(例如族群倍增能力、倍增時間、到達衰老之繼代數)、核型分析(例如正常核型；母體或新生兒譜系)、流動式細胞測量術(例如FACS分析)、免疫組織化學法及/或免疫細胞化學法(例如偵測表位)、基因表現概況(例如基因晶片陣列分析；聚合酶連鎖反應(例如反轉錄酶PCR、即時PCR及傳統PCR))、蛋白質陣列分析、蛋白質分泌法(例如藉由血漿凝固檢定或PDC條件培養基分析(例如藉由酶聯免疫吸附檢定法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)))、混合淋巴球反應(例如作為PBMC刺激作用之量測)及/或其他該項技術領域中所習知的方法。

衍生自臍組織之PPDC之實例係於2004年6月10日寄存於美國菌種保存中心(ATCC,10801 University Boulevard,Manassas,VA,20110)，且所獲派之ATCC存取號如下：(1)細胞株代 號UMB 022803(P7)所獲派之存取號為PTA-6067；以及(2)細胞株代號UMB 022803(P17)所獲派之存取號為PTA-6068。衍生自胎盤組織之PPDC之實例係寄存於ATCC(Manassas,Va.)，且所獲派之ATCC存取號如下：(1)細胞株代號PLA 071003(P8)於2004年6月15日寄存且所獲派之存取號為PTA-6074；(2)細胞株代號PLA 071003(P11)於2004年6月15日寄存且所獲派之存取號為PTA-6075；以及(3)細胞株代號PLA 071003(P16)於2004年6月16日寄存且所獲派之存取號為PTA-6079。

在各種實施例中，PPDC擁有以下生長特徵中之一或多者：(1)它們需要L-纈胺酸以在培養物中生長；(2)它們能夠在含有約5%到至少約20%氧的氣氛中生長(3)它們具有在培養物中進行至少約40次倍增(在到達衰老前)的潛能；以及(4)它們在經塗布或未經塗布的組織培養容器上附著並擴增，其中經塗布之組織培養容器包含明膠、層黏蛋白、膠原蛋白、聚鳥胺酸、玻璃連接蛋白、或纖連蛋白素之塗層。

在某些實施例中，PPDC擁有正常核型，其在細胞繼代時維持。核型分析尤其可用於識別並區分衍生自胎盤之新生兒與母體細胞。核型分析方法為所屬技術領域中具有通常知識者可使用且習知者。

在其他實施例中，PPDC可藉由生產某些蛋白質來表徵，包括：(1)生產波形蛋白(vimentin)與α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin)中之至少一者；以及(2)生產CD10、CD13、 CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、PD-L2與HLA-A,B,C細胞表面標記中之至少一者，如藉由流動式細胞測量術所偵測。在其他實施例中，PPDC可藉由不生產下列之至少一者來表徵：CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G以及HLA-DR,DP,DQ細胞表面標記，如藉由流動式細胞測量術所偵測。尤其較佳者為生產波形蛋白與α-平滑肌肌動蛋白的細胞。

在其他實施例中，PPDC可藉由針對編碼下列之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加來表徵：介白素8；內質網蛋白(reticulon)1；趨化激素(C--X--C模體)配體1(黑色素瘤生長刺激活性物，α)；趨化激素(C--X--C模體)配體6(顆粒性細胞趨化蛋白質2)；趨化激素(C--X--C模體)配體3；腫瘤壞死因子，α-誘發蛋白質3；C型凝集素超家族成員2；威爾姆斯(Wilms)腫瘤1；醛去氫酶1家族成員A2；腎素(renin)；氧化低密度脂蛋白受體1；智人(Homo sapiens)殖株IMAGE：4179671；蛋白質激酶C ζ；假想蛋白質DKFZp564F013；卵巢癌向下調控因子1；及殖株DKFZp547k1113之智人基因。在一實施例中，衍生自臍帶組織之PPDC可藉由針對編碼下列之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加來表徵：介白素8；內質網蛋白(reticulon)1；或趨化激素(C--X--C模體)配體3。在另一實施例中，衍生自胎盤組織之PPDC可藉由針對編碼腎素或氧化 低密度脂蛋白受體1之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經增加來表徵。

在其他實施例中，PPDC可藉由針對編碼下列之至少一者的基因之基因表現(相對於纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞)係經減少來表徵：矮小同源盒2；熱休克27kDa蛋白質2；趨化激素(C--X--C模體)配體12(基質細胞衍生因子1)；彈性蛋白(瓣上主動脈狹窄，威廉-波倫(Williams-Beuren)症候群)；智人mRNA；cDNA DKFZp586M2022(來自殖株DKFZp586M2022)；間葉同源盒2(生長休止特異性同源盒(growth arrest-specific homeo box))；sine oculis同源盒同源物1(果蠅(Drosophila))；αB水晶體蛋白；形態發生紊亂關聯活化物2(disheveled associated activator of morphogenesis 2)；DKFZP586B2420蛋白質；類似於neuralin 1者；結合四素(tetranectin，纖維蛋白溶酶原(plasminogen)結合蛋白質)；src同源體3(SH3)與多半胱胺酸區(cysteine rich domain)；膽固醇25-羥化酶；矮小相關轉錄因子3(runt-related transcription factor 3)；介白素11受體，α；原膠原蛋白C-內肽酶增強子(procollagen C-endopeptidase enhancer)；捲曲同源物7(frizzled homolog 7)(果蠅)；假想基因BC008967；第三型膠原蛋白α1；固生蛋白C(tenascin C,hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白質5(iroquois homeobox protein 5)；希菲斯特蛋白(hephaestin)；整合素β8；突觸囊泡醣蛋白(synaptic vesicle glycoprotein)2；神經胚細胞瘤，致腫瘤性抑制因子1；類胰島素生 長因子結合蛋白質2，36kDa；智人cDNA FLJ12280 fis，殖株MAMMA1001744；類細胞介素受體因子1；鉀中間物/小電導鈣活化通道，次家族N，成員4；整合素β7；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；sine oculis同源盒同源物2(果蠅)；KIAAI034蛋白質；囊泡相關膜蛋白質5(肌短蛋白(myobrevin))；含EGF類fibulin細胞外基質蛋白質(EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein)1；早期生長反應蛋白質(early growth response)3；無背端同源盒(distal-less homeo box)5；假想蛋白質FLJ20373；醛基-酮基還原酶家族1，成員C3(3-α羥類固醇去氫酶(3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase)，II型)；雙聚醣(biglycan)；具有PDZ-結合模體之轉錄共活化物(TAZ)；纖連蛋白素1；腦啡肽前質(proenkephalin)；整合素，類β1(具有類EGF重複區)；智人mRNA全長插入物cDNA殖株EUROIMAGE 1968422；EphA3；KIAA0367蛋白質；利尿鈉胜肽受體C(natriuretic peptide receptor C)/鳥苷酸環化酶C(guanylate cyclase C)(心房利尿鈉胜肽受體C(atrionatriuretic peptide receptor C))；假想蛋白質FLJ14054；智人mRNA；cDNA DKFZp564B222(來自殖株DKFZp564B222)；BCL2/類腺病毒E1B 19kDa交互作用蛋白質3(adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like)；AE結合蛋白質1；以及細胞色素c氧化酶次單元VIIa多肽1(肌肉)。

在其他實施例中，衍生自臍帶組織之PPDC可藉由分泌選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、及血小板反應蛋白-4之營養因子來表徵。在實施例中，PPDC可藉由分泌MCP-1、IL-6、 IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1b、I309、RANTES、MDC及TIMP1中之至少一者來表徵。在一些實施例中，衍生自臍帶組織之PPDC可藉由不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、MIP1a及VEGF中之至少一者來表徵，如藉由ELISA所偵測。在替代實施例中，衍生自胎盤組織之PPDC可藉由分泌MCP-1、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、HB-EGF、BDNF、TPO、MIP1a、RANTES及TIMP1中之至少一者，且不分泌TGF-β2、ANG2、PDGFbb、FGF及VEGF中之至少一者來表徵，如藉由ELISA所偵測。在進一步實施例中，PPDC不表現hTERT或端粒酶。

在較佳實施例中，細胞包含二或更多種以上列舉之生長、蛋白質/表面標記生產、基因表現或物質分泌之特徵。更佳者為該些包含三、四、或五或更多種該等特徵之細胞。再佳者為包含六、七或八或更多種該等特徵之PPDC。再佳者為該些包含所有上述特徵之細胞。

在特別較佳的實施例中，細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，該等細胞能夠在培養物中擴增、不生產CD117或CD45、且不表現hTERT或端粒酶。在一實施例中，細胞不生產CD117及CD45且可選地亦不表現hTERT及端粒酶。在另一實施例中，細胞不表現hTERT及端粒酶。在另一實施例中，細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織、能夠在培養物中擴增、不生產CD117或CD45、且不表現hTERT或端粒酶、且具有一或多種以下特徵：表現CD10、CD13、CD44、CD73及CD90；不表現CD31或 CD34；相對於人類纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞，表現增加水準之介白素8或內質網蛋白1；且具有分化之潛能。

在本發明之數個態樣中所使用之目前較佳的細胞為具有上述特徵之產後細胞，並且尤其是其中該些細胞具有正常核型並且在繼代時維持正常核型者，而進一步是其中該些細胞表現下列各標記者：CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A,B,C，其中該些細胞生產免疫學上可偵測且對應上列標記之蛋白質。再佳者為除了前述者外不生產對應於任何下列標記之蛋白質之該些細胞：CD31、CD34、CD45、CD117、CD141或HLA-DR,DP,DQ如由流動式細胞測量術所偵測。在進一步較佳實施例中，該些細胞不表現hTERT或端粒酶。

具有譜系分化的潛能而導致各種表型之某些細胞係不穩定且因此可自行分化。目前較佳用於本發明的細胞為不會例如沿著神經譜系自行分化之細胞。當較佳細胞生長於生長培養基中時，生產在其表面上之細胞標記，及其各種基因之表現模式(如使用Affymetrix GENECHIP所測定)為實質上穩定的。經由多次族群倍增的繼代，該些細胞例如在其表面標記特徵方面仍保持實質上恆定。

然而，PPDC之一個特徵在於可藉由使其經歷分化誘導細胞培養條件來有意地誘導其分化成各種譜系表型。在治療某些眼變性病狀的用途中，可使用所屬技術領域中已知的一或多種方法誘導PPDC分化成神經表型。舉例而言，如本文所例示，可將PPDC 接種於經層黏蛋白塗布之培養瓶中之含有B27(B27補充物，Invitrogen)、L-麩醯胺酸及青黴素/鏈黴素之Neurobasal-A培養基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)，其組合在本文稱為神經前驅擴增(NPE)培養基。NPE培養基可進一步補充有bFGF及/或EGF。或者，可藉由以下誘導PPDC體外分化：(1)將PPDC與神經前驅細胞共培養；或(2)使PPDC於神經前驅細胞條件培養基中生長。

PPDC分化成神經表型可藉由具有伸長突起之雙極細胞形態來證明。經誘導之細胞群可針對巢蛋白(nestin)之存在染色為陽性。經分化之PPDC可藉由偵測巢蛋白、TuJ1(BIII微管蛋白)、GFAP、酪胺酸羥化酶、GABA、04及/或MBP來評估。在一些實施例中，PPDC展現出形成神經球(neurosphere)之神經元幹細胞形成之三維體特徵的能力。

細胞群

本發明之另一態樣之特徵在於前驅細胞諸如產後衍生細胞或其他前驅細胞之族群。產後衍生細胞可分離自胎盤或臍組織。在較佳實施例中，細胞群包含上文所述之PPDC，且這些細胞群係描述於下節中。

在一些實施例中，細胞群為異質性。本發明之異質性細胞群可包含至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的細胞。本發明之異質性細胞群可進一步包含前 驅細胞(產後衍生細胞)、或其他前驅細胞，諸如上皮或神經前驅細胞，或其可進一步包含經完全分化之細胞。

在一些實施例中，該族群實質上為均質性，即實質上僅包含PPDC(較佳為至少約96%、97%、98%、99%或更多的細胞)。在一些實施例中，細胞群係均質性。在實施例中，本發明之均質性細胞群可包含臍衍生細胞或胎盤衍生細胞。臍衍生細胞之均質性族群較佳為不含母體譜系細胞。胎盤衍生細胞之均質性族群可為新生兒或母體譜系。細胞群之均質性可藉由任何該項技術領域中所習知的方法來達成，例如根據習知方法藉由細胞分選(例如流動式細胞測量術)或藉由殖株擴增達成。因此，較佳均質性PPDC族群可包含產後衍生細胞之殖株細胞系。當分離出具有高度所欲功能性之細胞殖株時，此類族群為尤其有用的。

本文亦提供在一或多種因子存在下，或在刺激幹細胞沿著所欲路徑(例如，神經、上皮)分化之條件下培養之細胞群。此類因子為所屬技術領域中已知的且熟悉該項技藝人士將會瞭解到，判定合適的分化條件可以常規實驗完成。此類條件之最佳化可藉由統計實驗設計及分析來完成，例如回應面方法論(response surface methodology)允許同時最佳化例如在生物培養物中的多個變數。目前較佳因子包括但不限於以下因子，諸如生長或營養因子、去甲基化劑、與神經或上皮譜系細胞共培養或於神經或上皮譜系細胞條件培養基中培養，以及所屬技術領域中已知用以刺激幹細胞沿著這些路徑分化的其他條件(關於可用於神經分化之因子，參見例如Lang, K.J.D.等人，2004,J.Neurosci.Res.76：184-192；Johe,K.K.等人，1996,Genes Devel.10：3129-3140；Gottleib,D.,2002,Ann.Rev.Neurosci.25：381-407)。

在本發明之實施例中，與RGC共培養之hUTC對RGC中之突觸形成、及神經元生存及外生具有正面作用。hUTC及RGC之共培養物展現突觸點(synaptic punctum)之數目增加且與星狀細胞(陽性對照組)可相比。(圖1B至圖1D)。

微興奮性突觸後電流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC)之量測顯示hUTC影響突觸形成。RGC經單獨培養或在hUTC或ASC存在下培養(圖1A)。RGC與hUTC之共培養類似與星狀細胞之共培養，引起突觸事件之頻率增加(圖1E至圖1G、圖1F，克拉斯卡-瓦立斯(Kruskal-Wallis)檢驗，p<.0001，圖1G，單向ANOVA，p<.0001)，這與所觀察到的突觸數目增加一致(圖1B至圖1D)。hUTC亦增加突觸後電流之振幅。類似於星狀細胞，hUTC加強突觸活性(圖1H、圖1I)。mEPSC峰之波形顯示上升及衰退τ均隨hUTC處理而增加(圖1J至圖1M)。hUTC誘導經培養RGC中之興奮性突觸形成且增強突觸功能。

條件培養基

在一個態樣中，本發明提供來自經培養之前驅細胞諸如產後衍生細胞、或其他前驅細胞之條件培養基，其如下文所述用於體外及體內。此類條件培養基之使用允許由細胞分泌之有益營養 因子同種異體地用於患者中，而無需引入可能引起排斥、或其他不良免疫反應之完整細胞。條件培養基係藉由於培養基中培養細胞(諸如細胞群)，隨後自培養基移除該些細胞來製備。在某些實施例中，產後細胞為UTC或PDC，更佳為hUTC。

由上文所述之細胞群所製備之條件培養基可按原樣使用、經進一步濃縮例如藉由超濾或凍乾、或甚至乾燥後使用、經部分純化後使用、如所述技術領域中已知與醫藥上可接受之載劑或稀釋劑組合使用、或與其他化合物諸如生物製品例如醫藥上可用的蛋白質組成物組合使用。條件培養基可在體外或體內單獨使用，或例如與自體或同基因活細胞一起使用。條件培養基若經引入體內，可被引入局部治療位點、或引入遠端以提供例如需要的細胞生長或營養因子給患者。

先前已證明，人類臍帶組織衍生細胞改良視覺功能且改善視網膜變性(US 2010/0272803)。亦已證明，產後衍生細胞可在RCS模型中用於促進光受體救援且因此保留光受體。(US 2010/0272803)。將hUTC經視網膜下注射至RCS大鼠眼睛中改良視覺銳度且改善視網膜變性。此外，以衍生自hUTC之條件培養基(CM)進行治療，可使體外失養性RPE細胞恢復對ROS之吞噬。(US 2010/0272803)。此處，本發明之實施例揭示先前未知的hUTC對促進神經突外生及突觸新生，尤其對視網膜神經元，包括視網膜神經節細胞、光受體(視桿細胞及視錐細胞)、視網膜無軸突細胞、水平細胞及雙極細胞的正面作用。

如本文所提供，製備hUTC條件培養基(UCM)且評估其對視網膜神經節細胞之突觸形成、神經元生存、及神經突外生之作用。RGC係與各種濃度的hUCM一起培養。突觸分析顯示hUCM以濃度依賴性方式誘導RGC之突觸形成，類似於星狀細胞條件培養基(ACM)。(圖2B)。UCM對Homer蛋白(Homer)及Bassoon蛋白(Bassoon)兩種突觸點數目具有正面作用。(圖2B至圖2D、圖2J)。

已顯示星狀細胞調控突觸形成。突觸形成被認為係經由經分泌突觸新生分子誘導，諸如血小板反應蛋白、hevin、富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖(glypican)、BDNF、TGF β-1、膽固醇及蝶素。(Clarke,Nature Reviews Neuroscience,2013；14：311-321；Bolton and Eroglu,Current Opinion in Neurobiology,2009；19：491-497)。在表徵本發明之hUCM時，星狀細胞及由形狀細胞製備之條件培養基有時用作陽性對照組。

hUCM亦加強功能性突觸，如藉由mEPSC之振幅及頻率增加所示。(圖2E至圖2N)。除了在hUTC移植之後觀察到的功能恢復外，動物疾病模型中的先前研究顯示，這些細胞對神經結構之保留具有作用(Lund等人，2007，同上；Moore等人，Somatosensory and motor research,2013；30：185-196；Zhang L，等人，Brain Research,2012；1489：104-112；Jiang Q，等人，PloS One,2012；7：e42845Zhang L，等人，Stroke；2011；42：1437-1444)。使用RGC培養系統顯示UCM對突觸新生及神經突外生之作用。除了hUCM 對突觸形成之作用外，其促進在無任何其他生長因子(例如，BDNF、及CTNF)存在下之RGC生存。(圖3A至圖3E)。

hUCM亦增強RGC神經突外生，如藉由總突起長度、突起數目及分支數目增加所證明。(圖3F至圖3J)。

在本發明之實施例中，hUTC分泌促進體外純化RGC之間的功能性突觸之發育的因子。此外，hUTC亦支持神經元生長及功能。

細胞改質、組分及產物

前驅細胞諸如產後細胞(較佳PPDC)亦可經基因改質以生產治療可用的基因產物，或生產用於治療腫瘤之抗癌藥物。基因改質可使用多種載體(vector)中之任一者實現，包括但不限於整合型病毒載體，例如，反轉錄病毒載體或腺相關病毒載體；非整合型複製載體，例如，乳突病毒載體、SV40載體、腺病毒載體；或複製缺陷型病毒載體。將DNA引入至細胞中之其他方法包括使用脂質體、電穿孔、粒子槍、或藉由直接DNA注射。

宿主細胞較佳係經DNA轉形或轉染，該DNA受到一或多種適當的表現控制元件諸如啟動子或增強子序列、轉錄終止子、多腺苷酸化位點等其他元件，及可選擇的標記控制或與其操作性相連。任何啟動子可用於驅動插入基因之表現。舉例而言，病毒啟動子包括但不限於CMV啟動子/增強子、SV40、乳突病毒、艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)或彈性蛋白基因啟動子。在一些實施例 中，用於控制關注基因之表現的控制元件可允許基因之調節表現，以使得產物僅於需要時在體內合成。若需要暫態表現，則組成性啟動子係較佳地用於非整合型及/或複製缺陷型載體中。或者，可誘導啟動子可用於當需要時驅動插入基因之表現。可誘導啟動子包括但不限於與金屬硫蛋白及熱休克蛋白質有關之啟動子。

在引入外來DNA之後，可允許經工程化之細胞生長於濃化培養基中且隨後切換至選擇性培養基。外來DNA中之可選擇的標記賦予選擇抗性且允許細胞將例如質體上之外來DNA穩定地整合至其染色體中且生長以形成細胞群落(foci)，其轉而可經選殖且擴增成細胞系。此方法可有利地用於工程化表現基因產物之細胞系。

細胞可經基因工程化以「敲除(knock out)」或「剔除(knock down)」在植入位點處促進發炎或排斥之因子之表現。以下討論用於減少靶標基因表現水準或靶標基因產物活性水準之負調控技術。如本文中所使用之「負調控(Negative modulation)」係指相對於靶標基因產物在調控處理不存在下之水準及/或活性，減少該靶標基因產物之水準及/或活性。神經元或膠細胞之天然基因之表現可使用許多技術來減少或敲除，包括例如藉由使用同源重組技術使基因失活來抑制表現。一般而言，編碼蛋白質之重要區域之外顯子(或位在該區域5'側之外顯子)由陽性可選擇的標記(例如neo)中斷，防止由靶標基因生產正常mRNA且導致基因之失活。基因亦可藉由產生基因之一部分之刪除、或藉由刪除整個基因來失活。藉由使用 具有兩個與靶標基因同源之區域且該兩區域在基因體中相隔遙遠之建構體，可將在該兩個區域之間的序列刪除(Mombaerts等人，1991,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88：3084-3087)。反義、DNA酶、核糖核酸酶、小干擾RNA(siRNA)及抑制靶標基因表現之其他此類分子亦可用於減少靶標基因活性之水準。舉例而言，抑制主要組織相容性基因複合體(HLA)表現之反義RNA分子已顯示在免疫反應方面最為多樣化。此外，三螺旋分子可被用於減少靶標基因活性之水準。這些技術由L.G.Davis等人(編)，1994,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第2版，Appleton & Lange,Norwalk,CT詳細描述。

在其他態樣中，本發明提供自產後幹細胞製備之細胞溶解產物及細胞可溶部分，產後細胞較佳PPDC、或包含PPDC之異質性或均質性細胞群、以及經基因改質或經刺激以沿著神經性路徑分化之PPDC或其族群。此類溶解產物及其部分具有許多用途。在體內使用細胞溶解產物可溶部分(亦即，實質上不含膜)例如允許將有益的細胞內環境(intracellular milieu)同種異體地用於患者，而不需引入最可能觸發排斥、或其他不良免疫反應之可察覺量的細胞表面蛋白質。溶解細胞之方法為所屬技術領域中所熟知且包括機械破裂、酶破裂、或化學破裂、或其組合之各種手段。此類細胞溶解產物可由在生長培養基中之細胞直接製備，因此含有分泌的生長因子及其類似物，或可由經例如PBS或其他溶液清洗而不含培養基 之細胞製備。經清洗之細胞可以大於原始族群密度之濃度再懸浮(若較佳)。

在一實施例中，全細胞溶解產物係例如藉由使細胞破裂而稍後不分離細胞部分來製備。在另一實施例中，藉由所屬技術領域中已知的常規方法，例如離心、過濾、或類似方法，將細胞膜部分與細胞之可溶部分分離。

由前驅細胞(諸如產後衍生細胞)群所製備之細胞溶解產物或細胞可溶部分可按原樣使用、經進一步濃縮例如藉由超濾或凍乾、或甚至乾燥後使用、經部分純化後使用、如所述技術領域中已知與醫藥上可接受之載劑或稀釋劑組合使用、或與其他化合物諸如生物製品例如醫藥上可用的蛋白質組成物組合使用。細胞溶解產物或其部分可在體外或體內單獨使用，或例如與自體或同基因活細胞一起使用。溶解產物若經引入體內，可被引入局部治療位點、或引入遠端以提供例如需要的細胞生長因子給患者。

在進一步實施例中，產後細胞較佳PPDC可於體外培養以生產高產率之生物產物。舉例而言，此類細胞不論是天然生產受關注的特定生物產物(例如，營養因子)，或經基因工程化以生產生物產物，皆可使用本文所述之培養技術選殖擴增。或者，細胞可於誘導分化成所要譜系之培養基中擴增。在任一情況下，由細胞生產且分泌至培養基中之生物產物可使用標準分離技術容易地自條件培養基分離，例如，諸如差別蛋白質沉澱、離子交換層析、膠濾層析、電泳、及HPLC等不及備舉。可使用「生物反應器(bioreactor)」 以利用流動法饋送例如體外三維培養物。基本上，在新鮮培養基通過三維培養物時，生物產物被洗出培養物且隨後可自流出物進行如上文所述之分離。

或者，關注的生物產物可保留於細胞內，因此其收集可能需要將細胞進行如上文所述之溶解。隨後可使用上文所列舉之技術中之任一或多者將生物產物純化。

在另一實施例中，藉由於液體、固體或半固體基材上培養產後細胞(較佳PPDC)所生產之細胞外基質(ECM)係經製備、收集且用作為植入活細胞至需要組織修復或置換之對象中之替代物。將細胞體外培養於如本文其他地方所述之三維架構上，且培養條件將使得所要量之ECM分泌至架構上。將細胞及架構移除，且ECM係經處理以供進一步使用，例如作為可注射製劑。為實現此目的，將架構上之細胞殺死且將任何細胞碎屑自架構移除。此製程可以許多不同方式進行。舉例而言，可將活組織置於不加冷凍保存劑之液態氮中驟冷凍，或可將組織浸沒於無菌蒸餾水中以使得細胞因滲透壓爆裂。

一旦細胞被殺死，細胞膜可能破裂且細胞碎屑藉由溫和清潔劑清洗諸如EDTA、CHAPS或兩性離子清潔劑處理來移除。或者，組織可經酶消化及/或用破壞細胞膜且允許移除細胞內容物之試劑萃取。此類酶之實例包括但不限於玻尿酸酶、分散酶、蛋白酶、及核酸酶。清潔劑之實例包括非離子清潔劑，諸如，例如烷芳基聚醚醇(TRITON X-100)、辛苯氧基聚乙氧基乙醇(Rohm and Haas Philadelphia,Pa.)、BRIJ-35、聚乙氧基乙醇月桂醚(Atlas Chemical Co.,San Diego,Calif.)、聚山梨醇酯20(TWEEN 20)、聚乙氧基乙醇去水山梨醇單月桂酸酯(Rohm and Haas)、聚乙烯月桂醚(Rohm and Haas)；及離子清潔劑，諸如，例如十二烷基硫酸鈉、硫酸化高級脂族醇、於支鏈或非支鏈中含有7至22個碳原子之磺化烷烴及磺化烷基芳烴。

ECM之收集可以多種方式實現，其取決於例如新組織係形成於可生物降解或不可生物降解之三維架構上。舉例而言，若架構為不可生物降解者，則ECM可藉由使架構經歷超音波處理、高壓射水機、機械刮削、或用清潔劑或酶溫和處理、或以上之任何組合來移除。

若架構為可生物降解者，則ECM可例如藉由使架構降解或溶解於溶液中來收集。或者，若可生物降解架構係由其自身可與ECM一起注射之材料組成，則可將架構及ECM全部一起處理以用於稍後注射。或者，可藉由上文所述之用於自不可生物降解架構收集ECM之任何方法，將ECM自可生物降解架構移除。所有收集製程係經較佳地設計，以使ECM不致變性。

在收集ECM之後，可將其進一步處理。舉例而言，可使用所述技術領域中熟知的技術諸如超音波處理，將ECM均質化成微細粒子，以使得其可通過外科針。若需要，ECM之組分可藉由γ照射來交聯。較佳地，ECM可經0.25至2百萬雷得之間照射， 以使ECM滅菌及交聯。使用具有毒性的劑諸如戊二醛之化學交聯係可能但通常不佳的。

蛋白質諸如存在於ECM中之各種類型之膠原蛋白之量及/或比率，可藉由將本發明之細胞所生產之ECM與一或多種其他細胞型之ECM混合來調整。此外，可將生物活性物質諸如蛋白質、生長因子及/或藥品併入至ECM中。例示性生物活性物質包括組織生長因子，諸如TGF-β，及類似物，其促進注射位點之癒合及組織修復。此類額外劑可用於上文所述之任何實施例中，例如與全細胞溶解產物、可溶細胞部分、或經進一步純化的由細胞所生產之組分及產物一起利用。

醫藥組成物

在另一態樣中，本發明提供醫藥組成物，其於多種用於治療眼變性病狀之方法中使用非胚胎幹細胞諸如產後細胞(較佳PPDC)、其細胞群、由此類細胞所生產之條件培養基、及由此類細胞所生產之細胞組分及產物。某些實施例涵蓋包含活細胞(例如，單獨PPDC或PPDC與其他細胞型混合)之醫藥組成物。其他實施例涵蓋包含PPDC條件培養基之醫藥組成物。其他實施例可使用PPDC之細胞組分(例如，細胞溶解產物、可溶細胞部分、ECM、或前述任一者之組分)或產物(例如，由細胞天然生產或經由基因改質所生產之營養因子及其他生物因子、培養該些細胞之條件培養基)。在任一情況下，醫藥組成物可進一步包含其他活性劑，諸如消 炎劑、抗細胞凋亡劑、抗氧化劑、生長因子、神經營養因子或所屬技術領域中已知的神經再生、神經保護或眼科藥品。

可添加至醫藥組成物之其他組分之實例包括但不限於：(1)其他神經保護或神經有益藥品；(2)選定之細胞外基質組分，諸如所屬技術領域中已知的一或多種類型的膠原蛋白、及/或生長因子、富血小板血漿、及藥品(或者，PPDC可經基因工程化以表現且生產生長因子)；(3)抗細胞凋亡劑(例如，紅血球生成素(EPO)、EPO模擬體(mimetibody)、血小板生成素(thrombopoietin)、類胰島素生長因子(IGF)-I、IGF-II、肝細胞生長因子、凋亡蛋白酶抑制劑)；(4)消炎化合物(例如，p38 MAP激酶抑制劑、TGF-β抑制劑、斯他汀類(statins)、IL-6及IL-1抑制劑、PEMIROLAST、TRANILAST、REMICADE、SIROLIMUS、及非固醇類消炎藥品(NSAIDS)(諸如TEPOXALIN、TOLMETIN、及SUPROFEN))；(5)免疫抑制或免疫調節劑，諸如鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑、mTOR抑制劑、抗增生劑、皮質類固醇及各種抗體；(6)抗氧化劑，諸如普洛布克(probucol)、維生素C與E、輔酶Q-10、麩胱甘肽、L-半胱胺酸及N-乙醯半胱胺酸；以及(6)局部麻醉劑等不及備舉。

本發明之醫藥組成物包含前驅細胞諸如產後細胞(較佳PPDC)、由該些細胞產生之條件培養基、或其組分或產物，其與醫藥上可接受之載劑或培養基調配。合適的醫藥上可接受之載劑包括水、鹽溶液(諸如林格氏溶液)、醇、油、明膠、及碳水化合物，諸如乳糖、直鏈澱粉、或澱粉、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、及聚乙 烯吡咯啶。此類製劑可經滅菌，且若有需要與輔助劑諸如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽、緩衝劑、及著色劑混合。通常但不排他地，包含細胞組分或產物而非活細胞之醫藥組成物係經調配成液體。包含PPDC活細胞之醫藥組成物一般係經調配成液體、半固體(例如，凝膠)或固體(例如，基質、支架及類似物，以適用於眼科組織工程)。

醫藥組成物可包含醫藥化學家或生物學家所熟悉之輔助劑組分。舉例而言，其可含有在一定範圍內的抗氧化劑，該些範圍取決於所使用之抗氧化劑之種類而異。普遍使用的抗氧化劑之合理範圍為約0.01重量/體積%至約0.15重量/體積%之EDTA、約0.01重量/體積%至約2.0重量/體積%之亞硫酸鈉、及約0.01重量/體積%至約2.0重量/體積%之偏二硫酸鈉。所屬技術領域中具有通常知識者可使用約0.1重量/體積%之濃度的上述各者。其他代表性化合物包括巰基丙醯基甘胺酸、N-乙醯基半胱胺酸、β-巰基乙胺、麩胱甘肽及類似物質，但亦可採用合適於眼投予之其他抗氧化劑，例如抗壞血酸及其鹽或亞硫酸鹽或偏二硫酸鈉。

可使用緩衝劑以將眼滴劑配方之pH保持在約4.0至約8.0之範圍內；以便使眼睛之刺激最小。至於直接玻璃體內或眼內注射，配方應在pH 7.2至7.5，較佳在pH 7.3至7.4。眼科組成物亦可包括適合用於向眼睛投予之張力劑。其中合適者為氯化鈉以使配方與0.9%鹽水溶液大致等滲。

在某些實施例中，醫藥組成物係與黏度增強劑一起調配。例示性劑為羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、及聚乙烯吡咯啶酮。若需要，醫藥組成物可添加共溶劑。合適的共溶劑可包括甘油、聚乙二醇(PEG)、聚山梨醇酯、丙二醇、及聚乙烯醇。亦可包括防腐劑，例如，氯化烷基二甲基苄基銨、氯化苯釷、氯丁醇、乙酸苯汞、硝酸苯汞、硫柳汞、對羥苄酸甲酯、或對羥苄酸丙酯。

用於注射之配方較佳經設計用於單次使用投予且不含有防腐劑。可注射溶液應具有等於0.9%氯化鈉溶液(290至300毫滲莫耳之滲透壓)之等滲度。此可藉由添加氯化鈉或如上文所列舉之其他共溶劑、或如上文所列舉之賦形劑諸如緩衝劑及抗氧化劑獲得。

眼前房之組織浸浴於前房液中，而視網膜係持續暴露於玻璃體。這些流體/凝膠以高度還原之氧還狀態存在，因為其含有抗氧化劑化合物及酶。因此，眼科組成物中包括還原劑可為有利的。合適的還原劑包括N-乙醯半胱胺酸、抗壞血酸或鹽形式、及亞硫酸鈉或偏二硫酸鈉，其中抗壞血酸及/或N-乙醯半胱胺酸或麩胱甘肽尤其適合用於可注射溶液。

包含細胞或條件培養基、或細胞組分或細胞產物之醫藥組成物可以所屬技術領域中已知的數種遞送方式中之一或多者遞送至患者眼睛。在可適合用於一些情況中之一個實施例中，組成物以眼滴劑或洗眼劑之形式局部遞送至眼睛。在另一實施例中，組成 物可經由週期性眼內注射或藉由輸注於灌洗溶液諸如BSS或BSS PLUS(Alcon USA,Fort Worth,Tex.)中遞送至眼睛內之各種位置。或者，組成物可以所屬技術領域中具有通常知識者已知的其他眼科劑量形式施加，諸如預形成或原位形成凝膠或脂質體，例如Herrero-Vanrell之美國專利第5,718,922號中所揭露。在另一實施例中，組成物可經由隱形眼鏡(例如Lidofilcon B,Bausch & Lomb CW79或DELTACON(Deltafilcon A))或其他暫時停留在眼睛表面上的物體遞送至或遞送通過需要治療之眼睛之水晶體。在其他實施例中，可採用諸如膠原蛋白角膜護罩(例如BIO-COR可溶性角膜護罩，Summit Technology,Watertown,Mass.)之支持物。組成物亦可藉由輸注至眼球中來投予，該輸注係經由滲透泵(ALZET,Alza Corp.,Palo Alto,Calif.)之套管或藉由植入定時釋放膠囊(OCCUSENT)或可生物降解盤(OCULEX,OCUSERT)之任一者進行。此等投予途徑具有向眼睛提供醫藥組成物之連續供應之優點。此可有利於角膜之局部遞送。

包含於半固體或固體載劑中之活細胞之醫藥組成物一般經調配用於外科植入眼損傷或痛苦之部位。應理解，液體組成物亦可藉由外科程序投予，例如條件培養基。在具體實施例中，半固體或固體醫藥組成物可包含半透性凝膠、格架(lattice)、細胞支架及類似物，其可為不可生物降解者或可生物降解者。舉例而言，在某些實施例中，使外源性細胞與其周圍環境隔絕，但仍使該些細胞 得以分泌且遞送生物分子至周圍細胞可為合意的或適當的。在這些實施例中，細胞可經調配成包含活的PPDC或含PPDC之細胞群之自主性植入物(autonomous implant)，該等活的PPDC或含PPDC之細胞群係由不可降解、選擇性可滲透之阻障圍繞以物理性分離移植細胞與宿主組織。此類植入物有時稱為「免疫保護性(immunoprotective)」，因為其具有防止免疫細胞及巨分子在醫藥誘導免疫抑制不存在下殺死移植細胞之能力(有關此類裝置及方法之綜述，參見例如P.A.Tresco等人，2000,Adv.Drug Delivery Rev.42：3-27)。

在其他實施例中，不同種類之可降解凝膠及網狀物(network)可用於本發明之醫藥組成物。舉例而言，尤其合適於持續釋放配方之可降解材料包括生物相容性聚合物，諸如聚(乳酸)、聚(乳-共-乙醇酸)、甲基纖維素、玻尿酸、膠原蛋白、及類似物。藥品遞送媒劑中可降解聚合物之結構、選擇及用途已綜述於數個出版物中，包括A.Domb等人，1992,Polymers for Advanced Technologies 3：279-291。Wong等人之美國專利第5,869,079號揭示可生物降解持續釋放眼植入物中親水性與疏水性實體之組合。此外，Guo等人之美國專利第6,375,972號、Chen等人之美國專利第5,902,598號、Wong等人之美國專利第6,331,313號、Ogura等人之美國專利第5,707,643號、Weiner等人之美國專利第5,466,233號及Avery等人之美國專利第6,251,090號各描述可用於遞送醫藥組成物之眼內植入物裝置及系統。

在例如用於修復神經病灶諸如損傷或切斷之視神經之其他實施例中，遞送於可生物降解(較佳生物可再吸收或生物可吸收)支架或基質之上或之中的細胞可為合意的或適當的。這些一般三維生物材料含有附著至支架、分散於支架內、或併入包埋於支架中之細胞外基質中之活細胞。一旦植入至身體之目標區域中，這些植入物變得與宿主組織整合，其中移植細胞逐漸變得確立(參見例如P.A.Tresco等人，2000，見前文；亦參見D.W.Hutmacher,2001,J.Biomater.Sci.Polymer Edn.12：107-174)。

可用於本發明中之支架或基質(有時統稱為「架構(framework)」)材料之實例包括非織物墊、多孔發泡體、或自組裝肽。非織物墊可例如使用包含乙醇酸及乳酸(PGA/PLA)之合成可吸收共聚物之纖維形成，其以商品名VICRYL(Ethicon,Inc.,Somerville,N.J)銷售。亦可利用由例如聚(ε-己內酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物組成之發泡體，其藉由諸如冷凍乾燥、或凍乾之製程形成，如美國專利第6,355,699號中所討論。亦可使用諸如自組裝肽(例如，RAD16)之水凝膠。原位形成可降解網狀物亦適用於本發明中(參見例如，Anseth,K.S.等人2002,J.Controlled Release 78：199-209；Wang,D.等人，2003,Biomaterials 24：3969-3980；He等人之美國專利公開案2002/0022676)。這些材料係經調配成適用於注射之流體，且隨後可藉由多種手段(例如，改變溫度、pH、暴露於光)誘導以原位或體內形成可降解水凝膠網狀物。

在另一實施例中，架構為毛氈(felt)，其可由自生物可吸收材料(例如，PGA、PLA、PCL共聚物或摻合物、或玻尿酸)製成之多絲纖維紗(multifilament yarn)組成。使用由捲曲、裁剪、分梳及針刺所組成之標準紡織加工技術將紗製成毛氈。在另一實施例中，細胞係經接種至可為複合結構之發泡體支架上。

在許多上文所提及之實施例中，可將架構模製成有用的形狀。此外應理解，可將PPDC培養於預形成、不可降解之外科或可植入裝置上，該培養方式為例如對應於用於製備例如含纖維母細胞GDC血管內線圈之方式(Marx,W.F.等人，2001,Am.J.Neuroradiol.22：323-333)。

在接種細胞之前，基質、支架或裝置可經處理以增強細胞附著。舉例而言，在接種之前，尼龍基質可用0.1莫耳乙酸處理且培養於聚離胺酸、PBS、及/或膠原蛋白中以塗布尼龍。聚苯乙烯可使用硫酸類似地處理。架構之外表面亦可經改質以改善細胞之附著或生長及組織之分化，諸如藉由血漿塗布架構或添加一或多種蛋白質(例如，膠原蛋白、彈性纖維、網狀纖維)、醣蛋白、醣胺聚醣(例如，硫酸肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸皮膚素、硫酸角蛋白)、細胞基質及/或其他材料，諸如但不限於明膠、藻酸鹽、瓊脂、瓊脂糖、及植物膠等其他者。

含有活細胞之架構係根據所屬技術領域中已知的方法製備。舉例而言，細胞可自由生長於培養容器中至次長滿或長滿、自培養物剝離(lifted)且接種至架構上。若需要，可在接種細胞之前、 之期間、或之後，將生長因子添加至培養基以觸發分化及組織形成。或者，架構本身可經改質以使得其上之細胞生長增強，或使得排斥植入物之風險減少。因此，可將一或多種生物活性化合物包括但不限於消炎劑、免疫抑制劑或生長因子添加至架構以用於局部釋放。

使用方法

前驅細胞諸如產後細胞(較佳hUTC或PDC)、或其細胞群、或由此類細胞所生產之條件培養基或其他組分或產物可以多種方式使用以支持且有利眼細胞及組織之修復及再生。此類用途涵蓋體外、離體及體內方法。以下所闡述之方法係關於PPDC，但其他前驅細胞亦可適用於該些方法中。

體外及離體方法

在一實施例中，前驅細胞諸如產後細胞(較佳hUTC或PDC)、及由其產生之條件培養基可於體外使用以篩選多種化合物之有效性及醫藥劑、生長因子、調節因子及類似物之細胞毒性。舉例而言，此類篩選可於實質上均質性PPDC族群上進行以評估欲與PPDC一起調配或共同投予以用於治療眼病症之候選化合物之效力或毒性。或者，出於評估新醫藥藥品候選者之效力之目的，此類篩選可於經刺激以分化成眼睛中所發現之細胞型之PPDC、或其前驅上進行。在此實施例中，PPDC保持在體外且暴露於欲測試之化 合物。潛在細胞毒性化合物之活性可藉由其損傷或殺死培養物中之細胞的能力來量測。此可藉由活體染色技術容易地評估。

如上文所討論，PPDC可於體外培養以生產由細胞自然生產、或由細胞在經誘導以分化成其他譜系時所生產、或由細胞經由基因改質所生產之生物產物。舉例而言，發現TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC與IL-8皆分泌自生長於生長培養基中之臍衍生細胞。臍衍生細胞亦分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、及血小板反應蛋白-4。發現TIMP1、TPO、KGF、HGF、HBEGF、BDNF、MIP1a、MCP-1、RANTES、TARC、伊紅趨素(Eotaxin)、與IL-8皆分泌自培養於生長培養基中之胎盤衍生PPDC(參見實例)。

就此而言，本發明之實施例之特徵在於使用PPDC以生產條件培養基。自PPDC生產條件培養基可來自未分化之PPDC或來自在刺激分化之條件下培養之PPDC。此類條件培養基係經考慮用於例如上皮或神經前驅細胞之體外或離體培養，或用於體內以支持包含PPDC之均質性族群或包含PPDC及其他前驅之異質性族群之移植細胞。

出於多種目的可使用PPDC之細胞溶解產物、可溶細胞部分或組分、或其ECM或組分。如上文所提及，此等組分中之一些可用於醫藥組成物中。在其他實施例中，細胞溶解產物或ECM係用於塗布或以其他方式處理欲用於外科、或用於植入、或用於離 體目的之物質或裝置，以促進在此類治療程序中所接觸之細胞或組織之癒合或生存。

如實例12及14中所述，已證明當PPDC與成體神經前驅細胞共培養生長時，PPDC具有支持該些細胞生存、生長及分化之能力。同樣，先前研究指出，PPDC可經由營養機制發揮支持視網膜細胞之功能。(US 2010-0272803)。因此，PPDC有利地用於體外共培養物中以提供營養支持給其他細胞，尤其神經細胞及神經和眼前驅(例如，神經幹細胞及視網膜或角膜上皮幹細胞)。至於共培養，將PPDC與所要其他細胞在兩種細胞型相接觸之條件下共培養可為合意的。此可例如藉由將細胞以異質性細胞群之形式接種於培養基中或接種至合適的培養基材上來達成。或者，首先可使PPDC生長至長滿，且隨後充當培養物中第二所要細胞型之基材。在此後者之實施例中，在共培養時期之後，可例如藉由膜或類似裝置將細胞進一步物理分離，以使得該其他細胞型可經移除且單獨使用。使用PPDC共培養以促進神經或眼細胞型之擴增及分化可具有在研究及臨床/治療領域中之適用性。舉例而言，可利用PPDC共培養以利培養物中之此類細胞之生長及分化，例如為了基礎研究目的或用於藥品篩選檢定。PPDC共培養亦可用於神經或眼前驅之離體擴增，以供稍後投予用於治療目的。舉例而言，神經或眼前驅細胞可自個體收集、與PPDC共培養離體擴增、隨後返回至該個體(自體轉移)或另一個體(同基因或同種異體轉移)。在此等實施例中，應理解在離體擴增之後，可將包含PPDC及前驅之混合細胞群向需要治療之 患者投予。或者，在自體轉移為適當的或合意的情況下，可將共培養細胞群在培養物中物理分離，使得能夠移除自體前驅以用於向患者投予。

體內方法

如實例中所闡述，前驅細胞(PPDC)、或由此類細胞產生之條件培養基可有效地用於治療眼變性病狀。一旦移植至眼睛中之目標位置中，前驅細胞或來自前驅細胞(諸如PPDC)之條件培養基原位提供營養支持給眼細胞，包括神經元細胞。

前驅細胞(PPDC)、來自前驅細胞之條件培養基可與以下一起投予：其他有益的藥品、生物分子(諸如生長因子、營養因子)、條件培養基(來自前驅細胞或分化細胞培養物)、或其他活性劑(諸如消炎劑、抗細胞凋亡劑、抗氧化劑、生長因子、神經營養因子或如所屬技術領域中已知的神經再生或神經保護藥品)。當條件培養基與其他藥劑投予時，其可以單一醫藥組成物之形式一起投予，或與其他藥劑同時或依次(在投予其他藥劑之前或之後)投予之分開醫藥組成物。

可與前驅細胞(諸如PPDC)及條件培養基產物一起投予之其他組分之實例包括但不限於：(1)其他神經保護或神經有益藥品；(2)選定之細胞外基質組分，諸如所屬技術領域中已知的一或多種類型的膠原蛋白、及/或生長因子、富血小板血漿、及藥品(或者，細胞可經基因工程化以表現且生產生長因子)；(3)抗細胞凋亡 劑(例如，紅血球生成素(EPO)、EPO模擬體(mimetibody)、血小板生成素(thrombopoietin)、類胰島素生長因子(IGF)-I、IGF-II、肝細胞生長因子、凋亡蛋白酶抑制劑)；(4)消炎化合物(例如，p38 MAP激酶抑制劑、TGF-β抑制劑、斯他汀類(statins)、IL-6及IL-I抑制劑、PEMIROLAST、TRANILAST、REMICADE、SIROLIMUS、及非固醇類消炎藥品(NSAIDS)(諸如TEPOXALIN、TOLMETIN、及SUPROFEN))；(5)免疫抑制或免疫調節劑，諸如鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑、mTOR抑制劑、抗增生劑、皮質類固醇及各種抗體；(6)抗氧化劑，諸如普洛布克(probucol)、維生素C與E、輔酶Q-10、麩胱甘肽、L-半胱胺酸及N-乙醯半胱胺酸；以及(6)局部麻醉劑等不及備舉。

液體或流體醫藥組成物可經投予至眼睛中更一般的位置(例如，局部地或眼內地)。

其他實施例涵蓋藉由投予醫藥組成物來治療眼變性病狀之方法，該些醫藥組成物包含來自前驅細胞(諸如PPDC)之條件培養基、或由該些細胞天然生產或經由細胞之基因改質生產之營養因子及其他生物因子。此外，這些方法可進一步包含投予其他活性劑，諸如生長因子、神經營養因子或如所屬技術領域中已知的神經再生或神經保護藥品。

用於投予來自前驅細胞(諸如PPDC)之條件培養基、或本文所述之任何其他醫藥組成物之劑量形式及方案係根據良好的醫療實踐得以發展，其考慮到個別患者之條件，例如，眼變性病狀 之性質與程度、年齡、性別、體重及一般醫學病狀、及醫學從業者已知的其他因素。因此，欲向患者投予之醫藥組成物之有效量係藉由如所屬技術領域中已知的這些考量判定。

在開始細胞治療之前，以醫藥免疫抑制患者可為合意的或適當的。此可經由使用全身或局部免疫抑制劑來實現，或可藉由遞送於囊封裝置中之細胞來實現，如上文所述。這些及其他用於減少或消除對移植細胞之免疫反應之手段為所屬技術領域中已知的。替代地，條件培養基可自經基因改質以減少其免疫原性(immunogenicity)之PPDC製備，如上文所提及。

移植細胞於活體患者中之生存可經由使用多種掃描技術來判定，例如，電腦化斷層(CAT或CT)掃描、磁共振成像(MRI)或正電子發射斷層攝影(PET)掃描。判定移植之生存亦可藉由移除組織且目視或經由顯微鏡檢查該組織來進行事後分析。或者，細胞可用對神經或眼細胞或其產物(例如，神經傳遞質)具特異性之染色劑處理。移植細胞亦可藉由事先併入示蹤染料諸如玫瑰紅或螢光素標記微球、快藍(fast blue)、鐵微粒、雙苯甲醯胺或基因引入之報告基因產物，諸如β-半乳糖苷酶或β-葡萄醣醛酸酶來識別。

將移植細胞或條件培養基功能性整合至眼組織或對象中可藉由檢查受損或患病之眼功能的恢復來評估。舉例而言，治療黃斑變性或其他視網膜病變之有效性可藉由視覺銳度之改善及評估立體眼底彩色相片之異常及分級來判定。(年齡相關性眼睛疾病研 究調查小組，NEI,NIH,AREDS報告第8號，2001,Arch.Ophthalmol.119：1417-1436)。

套組及存庫(Bank)

在另一態樣中，本發明提供套組，其於多種如上所述用於眼再生及修復之方法中利用前驅細胞(諸如PPDC)、及細胞群、由該些細胞(較佳PPDC)所製備之條件培養基及其組分及產物。當用於治療眼變性病狀、或其他計劃治療時，該些套組可包括一或多種細胞群或條件培養基(包括至少產後細胞或衍生自產後細胞之條件培養基)、及醫藥上可接受之載劑(液體、半固體或固體)。套組亦可選地可包括例如藉由注射投予細胞及條件培養基之手段。套組進一步可包括使用細胞及條件培養基之說明書。經製備用於野外醫院用途，諸如軍事用途之套組可包括全程序供應(full-procedure supply)，其包括組織支架、手術用縫線、及類似物，其中細胞或條件培養基與急性受傷之修復結合使用。如本文所述之用於檢定及體外方法之套組可含有例如以下中之一或多者：(1)PPDC或其組分、或PPDC之條件培養基或其他產物；(2)用於實踐體外方法之試劑；(3)適當時選用的其他細胞或細胞群；及(4)用於指導體外方法之說明書。

在另一態樣中，本發明亦提供用於存庫(banking)本發明之組織、細胞、細胞群、條件培養基、及細胞組分。如上文所討論，細胞及條件培養基易於凍存。因此本發明提供凍存細胞於存庫 中之方法，其中該些細胞經冷凍儲存且與基於細胞之免疫、生化及基因性質之細胞的完整表徵相關聯。冷凍細胞可經解凍及擴增或直接用於自體、同基因、或同種異體治療，其取決於程序之要求及患者之需要。較佳地，關於每一凍存樣本之資訊儲存於電腦中，其可基於外科醫師、程序及患者之要求來搜尋，其中合適的匹配係基於細胞或族群之表徵來得到。較佳地，使本發明之細胞生長且擴增至所要量之細胞，且治療性細胞組成物係在基質或支持物存在或不存在下分開製備或以共培養之形式製備。儘管對於一些應用而言，使用新鮮製備之細胞可為較佳的，但是可藉由將細胞冷凍且將資訊輸入於電腦中以將電腦條目與樣本相關聯來將剩餘物凍存且存庫。即使在不需要將來源或捐贈者與此類細胞之接受者匹配的情況中，出於免疫目的，存庫系統使其易於將例如存庫細胞之所需生化或基因性質與治療需要匹配。在找到與所需性質相匹配之存庫樣本後，可擷取樣本且製備以供治療使用。如本文所述所製備之細胞溶解產物、ECM或細胞組分亦可經凍存或以其他方式保留(例如，藉由凍乾)且根據本發明存庫。

提供以下實例以更詳細描述本發明。該等實例意欲說明而非限制本發明。

以下縮寫可出現於實例以及說明書與申請專利範圍中之其他地方：ANG2(或Ang2)為血管生成素2；APC為抗原呈現細胞；BDNF為腦衍生神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor)；bFGF為鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor)；bid(BID)為「一日兩次」(每天兩次)；CK18為細胞角蛋白(cytokeratin)18；CNS為中樞神經系統；CNTF為睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)；CXC配體3為趨化激素受體配體(chemokine receptor ligand)3；DMEM為達爾伯克(Dulbecco's)最低必需培養基；DMEM：lg(或DMEM：Lg、DMEM：LG)為具有低葡萄糖之DMEM；EDTA為乙二胺四乙酸；EGF(或E)為表皮生長因子(epidermal growth factor)；FACS為螢光活化細胞分選(fluorescent activated cell sorting)；FBS為胎牛血清；FGF(或F)為纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor)；GBP為加巴噴丁(gabapentin)；GCP-2為顆粒性細胞趨化蛋白質(granulocyte chemotactic protein)-2；GDNF為膠細胞衍生神經營養因子(glial cell-derived neurotrophic factor)；GF AP為膠細胞纖維酸性蛋白質(glial fibrillary acidic protein)；HB-EGF為肝素結合表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor)；HCAEC為人類冠狀動脈內皮細胞(Human coronary artery endothelial cell)；HGF為肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor)；hMSC為人類間葉幹細胞(Human mesenchymal stem cell)；HNF-1α為肝細胞特異性轉錄因子(hepatocyte-specific transcription factor)；HVVEC為人類臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell)；1309為趨化激素及CCR8受體之配體；IGF-1為類胰島素生長因子(insulin-like growth factor)1；IL-6為介白素(interleukin)6；IL-8為介白素8；K19為角蛋白(keratin)19；K8為角蛋白8；KGF為角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor)； LIF為白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)；MBP為髓鞘鹼性蛋白(myelin basic protein)；MCP-1為單核細胞趨化蛋白質(monocyte chemotactic protein)1；MDC為巨噬細胞衍生趨化激素(macrophage-derived chemokine)；MIP1α為巨噬細胞發炎蛋白質(macrophage inflammatory protein)1α；MIP1β為巨噬細胞發炎蛋白質1β；MMP為基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP)；MSC為間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)；NHDF為正常人類皮膚纖維母細胞(Normal Human Dermal Fibroblast)；NPE為神經前驅細胞擴增培養基(Neural Progenitor Expansion media)；NT3為神經營養蛋白(neurotrophin)3；04為寡樹突細胞(oligodendrocyte)或膠細胞分化標記(glial differentiation marker)04；PBMC為周邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell)；PBS為磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline)；PDGF-CC為血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor)C；PDGF-DD為血小板衍生生長因子D；PDGFbb為血小板衍生生長因子bb；PO為「經口」(經由嘴巴)；PNS為周邊神經系統(peripheral nervous system)；Rantes(或RANTES)為調控活化、正常T細胞表現與分泌(regulated on activation,normal T cell expressed and secreted)；rhGDF-5為重組人類生長及分化因子(recombinant human growth and differentiation factor)5；SC為皮下(subcutaneously)；SDF-1α為基質衍生因子(stromal-derived factor)1α；SHH為聲蝟(sonic hedgehog)； SOP為標準作業程序；TARC為胸腺與活化調控趨化激素(thymus and activation-regulated chemokine)；TCP為組織培養塑膠(Tissue culture plastic)；TCPS為組織培養聚苯乙烯；TGFβ1為轉形生長因子(transforming growth factor)β1；TGFβ2為轉形生長因子(transforming growth factor)β2；TGF β-3為轉形生長因子β-3；TIMP1為基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase)1；TPO為血小板生成素(thrombopoietin)；TSP為血小板反應蛋白；TUJ1為BIII微管蛋白(Tubulin)；VEGF為血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor)；vWF為馮威里氏因子(von Willebrand factor)；及αFP為α-胎蛋白(fetoprotein)。

以下實例進一步說明但不限制本發明。

實例1 前驅細胞對神經突外生及突觸新生之作用

突觸新生為神經元之間尤其是突觸前神經元(Bassoon蛋白)與突觸後神經元(Homer蛋白)之間的突觸形成。這種突觸形成之過程係由星狀細胞調節，星狀細胞除了促進突觸形成以外，亦提供支持給神經元生存及生長，包括視網膜神經節細胞。已顯示，向視網膜變性模型視網膜下投予離體人類臍組織衍生細胞(hUTC)保留光受體及視覺功能。(US 2010/0272803)。此處，檢測hUTC之 治療態樣且表徵衍生hUTC對功能性突觸形成(突觸新生)、神經元生存及外生之作用。

材料和方法

人類臍組織衍生細胞(hUTC)：獲自以下實例4至16中所述、及詳細描述於美國專利第7,524,489號與第7,510,873號、及美國公開申請案第2005/0058634號中之方法，兩者皆以引用方式併入本文中。簡言之，人類臍帶係經捐贈者同意捐贈且於活產後獲得。將組織絞碎且用酶消化。在用含有0.5U/mL膠原蛋白酶(Serva Elecrtrophoresis,Heidelberg,Germany)、5U/mL中性蛋白酶(Serva Elecrtrophoresis,Heidelberg,Germany)、及2U/mL玻尿酸酶(Cumulase；Origio a/s,Måløv,Denmark)之混合物的達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)-低葡萄糖(Lg)(SAFC Biosciences,Lenexa,KS)幾乎完全消化之後，將細胞懸浮液過濾通過70μm過濾器，且將上清液以250 x g離心。將分離之細胞於DMEM-Lg中清洗數次且以5,000個細胞/cm²之密度接種於含有15%(vol/vol)胎牛血清(FBS；SAFC Biosciences)之DMEM-Lg中(5%(vol/vol)二氧化碳，37℃)。當細胞達到大致70%長滿時(約3至4天)，使用TrypLE(Gibco,Grand Island,NY)繼代。將細胞擴增數次並存庫。使用凍存hUTC(16至20次族群倍增)。

視網膜神經節細胞：將視網膜神經節細胞(RGC)如先前所述藉由順序免疫淘選(immuno-panning)從任一性別之P7(出生 後第7天)史-道二氏大鼠(Charles River,Wilmington,MA)視網膜純化出(Winzeler A,Wang JT.,Cold Spring Harbor Protocols，2013；643-652)。簡言之，解剖視網膜並用木瓜酶(6U/mL,Worthington,Burlingame,CA)解離。經解離細胞首先用西非單葉豆凝集素(Bandeiraea Simplicifolia Lectin)I(BSL,Vector laboratories,Burlingame,CA)塗布之培養皿淘選以移除免疫細胞、細胞碎屑及纖維母細胞。將未結合細胞轉移至塗布有抗Thy1(殖株T11D7)之培養皿中從而實現RGC之特異性分離。將經純化RGC小心地用胰蛋白酶消化後再接種至24孔盤中之經聚-D-離胺酸(PDL)及層黏蛋白塗布玻璃蓋玻片上(35,000個細胞/蓋玻片)。將RGC培養於含有B27(Invitrogen,Grand Island,NY)、腦衍生神經營養因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、胰島素及毛喉素(forskolin)之無血清生長培養基中(培養基之完整配方可見Winzeler and Wang,Cold Spring Harbor Protocols，同上)。

皮質星狀細胞(ASC)：使用如McCarthy KD,de Vellis J.,J.Cell Biology,1980；85：890-902中所述之標準方法分離自任一性別之P1史-道二氏大鼠幼崽。關於星狀細胞共培養，跨孔插入物(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)係藉由在星狀細胞生長培養基(AGM，描述於McCarthy KD,de Vellis J.,J.Cell Biology,1980；85：890-902)中的每個插入物接種125,000個皮質星狀細胞來製備。第二天用RGC生長培養基置換AGM，且將跨孔插入物轉移至在蓋玻片上含有4 DIV(體外天數)RGC之24孔盤中。

正常人類皮膚纖維母細胞(NHDF)：獲自Lonza(Walkersville,MD)。依據製造商規程，使細胞擴增並在繼代4時凍存。

將RGC與hUTC、作為陽性對照組之ASC、或作為陰性對照組之NHDF細胞系共培養歷時六天。以10K、20K、30K、100K及200K接種DIV3之hUTC及NHDF。以130K接種星狀細胞。25K、50K及100K個hUTC、130K個星狀細胞、以及100K、150K及200K個NHDF係用於計算對突觸形成之作用。

關於共培養實驗，在與RGC共培養前一天將25,000個hUTC接種至hUTC生長培養基中之跨孔插入物中。在共培養當天用RGC生長培養基置換hUTC生長培養基且將跨孔插入物轉移至具有生長於玻璃蓋玻片上之4 DIV RGC的24孔盤中。

根據製造商推薦，將NHDF培養於纖維母細胞基礎培養基(FBM,Lonza)中。關於與RGC之共培養，在與RGC共培養前一天將150,000個NHDF接種至FBM培養基中之跨孔插入物中。第二天用RGC生長培養基置換FBM，且將跨孔插入物轉移至在蓋玻片上含有4 DIV RGC之24孔盤中。

藉由免疫細胞化學定量突觸數目(突觸檢定)：突觸形成係藉由共定位突觸前(Bassoon蛋白)及突觸後(Homer蛋白)標記之免疫細胞分析以及電生理學來評估。將35,000個RGC單獨培養於玻璃蓋玻片上歷時4 DIV且在4 DIV時添加跨孔插入物或條件培養基。為了阻斷TSP誘導之突觸形成，將32μM加巴噴丁(GBP) 與條件培養基一起添加，如Eroglu C，等人，Cell,2009；139：380-392中所述。在7 DIV時，經共培養細胞接受新鮮生長培養基。當使用條件培養基時，在7 DIV提供補充有條件培養基之生長培養基。在10 DIV時，用4% PFA(w/v)固定RGC且對突觸前及突觸後標記Bassoon蛋白(小鼠抗Bassoon蛋白，1：1000，RRID：AB_2038857,Enzo,Farmingdale,NY)及Homer蛋白-1(兔抗Homer蛋白，1：500，RRID：AB_1966438,Synaptic Systems,Goettngen,Germany)進行染色。經Alexa共軛二級抗體(Invitrogen，山羊抗兔AF-488(1：1000,RRID：AB_10563748)及山羊抗小鼠AF-594(1：500,RRID：AB_10561507)係用於偵測。將蓋玻片固定於玻片(VWR Scientific,Radnor,PA)上具有DAPI(Vector Laboratories)之Vectashield封片劑中。RGC係於Zeiss Axioimager M1落射螢光顯微鏡(Carl Zeiss,Thornwood,NY)上使用63X物鏡成像。藉由DAPI螢光隨機識別出與其最鄰近之細胞距離至少兩個細胞直徑的健康形態單一細胞。在每次實驗中，成像及分析每個條件至少15至20個細胞，且所顯示之結果為2至3次獨立實驗之平均值。用NIH影像處理包ImageJ之定製插件(plug-in)(由Barry Wark書寫，可向Duke University之Cagla Eroglu索取)分析經共定位突觸點之擷取影像。染色規程及定量方法細節詳述於Ippolito DM,Eroglu C.,J Vis Exp,.2010；16(45)：2270。藉由計數每100μm樹突中經共定位突觸點之數目來測定突觸密度(每神經突長度中之突觸數目)。對於此分析，每個影 像隨機選擇一個近側樹突/細胞。所顯示之突觸密度結果係來自一個30個細胞/條件之實驗。

RGC之電生理學記錄：藉由全細胞膜片鉗以-70mV之保持電位記錄微興奮性突觸後電流(mEPSC)。將細胞保持在23℃至24℃下、0.2mL/min流率之細胞外溶液連續灌注下。細胞外溶液含有：124mM NaCl、2.5mM KCl、2mM CaCl₂、1mM MgCl₂、26mM NaHCO₃、1.2mM NaH₂PO₄、10mM D-葡萄糖(pH 7.4)。在記錄期間將河豚毒素(TTX,Abcam,1μM,Abcam,Cambridge,MA)添加於細胞外溶液中。膜片吸量管中之內部溶液(2.5至5MΩ)含有：120mM甲烷磺酸銫、5mM NaCl、10mM氯化四乙銨、10mM HEPES、4mM利多卡因N-乙基溴化物、1.1mM EGTA、4mM ATP鎂鹽、及0.3mM GTP鈉鹽，pH用CsOH調整至7.2且滲透壓用蔗糖設成300mOsm。信號係藉由MultiClamp 700B放大器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)記錄，並用Digidata 1440A數化器(Molecular Devices)以10kHz過濾及以20kHz數位化。在全細胞組態中，僅當串聯電阻<20MΩ時才接受記錄。所有數據於pCLAMP10(Molecular Devices)中使用峰偵測軟體分析。所顯示之數據係得自15個細胞/條件，該等數據係經由3次獨立實驗記錄。

神經突外生檢定：將RGC以低密度(1,500個細胞/蓋玻片)接種至經聚-D-離胺酸(PDL)及小鼠層黏蛋白(20ng/ml)塗布之玻璃蓋玻片上歷時24小時，隨後用4% PFA(w/v)固定，並用兔抗β微管蛋白抗體(LI-COR,RRID：AB_1850029,Lincoln,NE)及接著的 山羊抗兔AF-488進行免疫染色以可視化神經突。24小時之後，將神經突藉由用CellTracker Red CMPTX染料(Inivtirogen)培養15min接著用4% PFA(w/v)固定來可視化。使用Zeiss Axioimager M1落射螢光顯微鏡(Carl Zeiss)上之20X物鏡擷取單一RGC及其神經突之影像。在每次實驗中，成像及分析每個條件至少30個細胞，且所顯示之結果為2至3次獨立實驗之平均值。神經元形態係使用Metamorph軟體(Molecular Devices)中之神經突外生應用模組分析。如Ferreira TA，等人，Nature Methods,2014；11：982-984中所述，使用Fiji之插件進行Sholl分析。

使用單向變異數分析(ANOVA)接著使用各對(Each Pair)司徒頓(Student)t(費雪(Fisher)LSD)後檢驗進行經定量數據之統計分析。對於神經突外生檢定之Sholl分析，進行共變異數分析(ANCOVA)。對於mEPSC之累積機率，使用克拉斯卡-瓦立斯檢驗，接著使用鄧恩(Dunn)多重比較事後測試進行分析。將嵌入有SAS 9.2軟體(SAS)之JMP Genomics 5用於所有數據之統計分析。所有數據表達為平均值±SEM，且顯著性表示為*** p<0.0001、** p<0.001、及* p<0.05。

結果

當經純化RGC與跨孔插入物中之hUTC一起共培養時，發現經純化RGC之間發生突觸數目及功能之變化。與初代大鼠星狀膠質細胞(astroglial)培養物(ASC)共培養之RGC提供陽性對照 組，因為研究顯示星狀細胞強烈增加突觸數目並增強突觸活性(Pfrieger FW,Barres BA,Science,1997；277：1684-1687；Ullian EM，等人，Science,2001；291：657-661)。用NHDF處理之RGC提供陰性對照組，因為其在視網膜變性模型中不誘導顯著的功能或結構恢復(Lund等人，2007，同上)。hUTC及RGC之共培養物展現突觸點(synaptic punctum)之數目增加且與星狀細胞(陽性對照組)可相比。(圖1B至圖1D)。4 DIV之後，RGC係與hUTC、ASC或NHDF共培養額外6天，且突觸數目係藉由用突觸前及突觸後蛋白對(分別為Bassoon蛋白及Homer蛋白)免疫染色來評估(圖1A)。使用先前所述之方法，以突觸前及突觸後標記之共定位來測定突觸(Ippolito DM,Eroglu C.,J Vis Exp,.2010，同上)(圖1B，箭頭處)。相較於單獨培養的RGC，hUTC誘導RGC之間形成興奮性突觸(圖1B、圖1C)。而與NHDF共培養不誘導突觸數目之顯著增加(圖1B、圖1C、圖1D)。每單位神經突長度突觸數目之定量顯示hUTC主要藉由增加突觸密度提高突觸數目(圖1D，單向ANOVA，p<.0001)。

全細胞膜片鉗記錄量測微興奮性突觸後電流(mEPSC)。RGC經單獨培養或在hUTC或ASC存在下培養(圖1A)。RGC與hUTC之共培養類似與星狀細胞之共培養，引起突觸事件之頻率增加(圖1E至圖1G、圖1F，克拉斯卡-瓦立斯(Kruskal-Wallis)檢驗，p<.0001，圖1G，單向ANOVA，p<.0001)，這與所觀察到的突觸數目大量增加一致(圖1B至圖1D)。hUTC亦增加突觸後電流之振幅。類似於星狀細胞，hUTC增強突觸活性(圖1H、圖1I，克拉斯卡- 瓦立斯檢驗，p<.0001)。mEPSC峰之波形顯示上升及衰退τ均隨hUTC處理而增加(圖1J至圖1M)。hUTC誘導經培養RGC中之興奮性突觸形成且增強突觸功能，與ASC類似。

實例2 條件培養基對神經突外生及突觸新生之作用

評估hUTC條件培養基在RGC培養中之作用。

如以上實例1中所述獲得hUTC、RGC及星狀細胞。

製備條件培養基：將純星狀細胞培養物或hUTC生長於10-cm組織培養皿(Corning,Corning,NY)中之其個別生長培養基中直至70%長滿。隨後用溫DPBS(Gibco)清洗細胞兩次，向各皿中添加10mL條件化培養基，條件化培養基係由補充有L-麩醯胺酸(2mM,Gibco)、丙酮酸鈉(1mM,Gibco)、青黴素(100U/mL)及鏈黴素(100μg/mL,Gibco)之Neurobasal®(Gibco)組成。培養基係經細胞條件化5天。收集無細胞條件培養基且藉由使用5kDa截留分子量Vivaspin 20離心濃縮管(Sartorius,Bohemia,NY)濃縮10次。依據製造商推薦藉由Bradford檢定(Thermo Scientific,Grand Island,NY)量測各條件培養基之蛋白質濃度。於低蛋白質結合管(Eppendorf,Hamburg,Germany)中之星狀細胞條件培養基(ACM)及hUTC條件培養基(UCM)之等分係經快速冷凍於液態氮中，且在-80℃下儲存直至使用。為了離拆具有不同截留分子量之UCM，使用30kDa及100kDaVivaspin 20離心濃縮管。為了收集5至100kDa UCM部分，將100 kDa Vivaspin 20之流出物(flow-through)用5kDa Vivaspin 20濃縮管濃縮。為了收集5至100kDa UCM部分，將100kDa Vivaspin 20之流出物用5kDa Vivispan濃縮管濃縮。關於處理方面，使冷凍等分在冰上緩慢融化，且將條件培養基以所需濃度添加至冰冷RGC生長培養基(突觸及外生檢定)或最低培養基(生存檢定)中。

條件培養基之西方墨點分析：10至20μg條件培養基係經製備於含有5% β-巰基乙醇(v/v)之5x Laemmli加樣緩衝液(Thermo Scientific)中以用於聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。將蛋白質於95℃變性15分鐘。將蛋白質於10% SDS-PAGE凝膠(BioRad,Hercules,CA)中分離且隨後轉移至PVDF膜(Millipore)上。為了偵測TSP，使用山羊抗人類TSP1(1：250,RRID：AB_2201958)、TSP2(1：250,RRID：AB_220268)、TSP4(1：200,RRID：AB_2202087)(R&D Systems)。對於加樣對照組，使用山羊抗Hevin抗體(1：250,RRID：AB_2195103,R&D systems)偵測另一種hUTC分泌蛋白，稱為Hevin/SPARCL1。山葵過氧化酶(HRP)共軛抗山羊抗體(R&D,1：5000)用作二級抗體。依據製造商推薦，用Amersham^TM ECL西方墨點分析系統套組(GE Healthcare,Winterville,NC)或SuperSignal^® West Femto最大靈敏度受質(Thermo Scientific)進行偵測。

突觸檢定、電生理學記錄、及神經突外生檢定描述於實例1中。

細胞生存檢定：將RGC直接接種至24孔組織培養盤上(7,500個細胞/孔)。孔係經PDL及層黏蛋白塗布。將細胞培養 於含有Neurobasal®(Invitrogen)、SATO補充物(100μg/ml運鐵蛋白、100μg/ml牛血清白蛋白、60ng/ml助孕酮、16μg/ml腐肉鹼、40ng/ml亞硒酸鈉)、N-乙醯半胱胺酸(5μg/ml)、三碘甲狀腺胺酸(4μg/ml)、L-麩醯胺酸(2mM)、青黴素(100U/mL)、鏈黴素(100μg/mL)、丙酮酸鈉(1mM)及毛喉素(5μM)之最低培養基中。為了測試UCM及ACM對生存之作用，在毛喉素、BDNF(200ng/mL)或CNTF(40ng/mL)不存在/存在下，將最低培養基補充各種濃度的條件培養基。依據製造商之說明書，使用LIVE/DEAD^®哺乳動物細胞存活性套組(Invitrogen)在3 DIV時評估細胞存活性。在施加套組劑之後15分鐘進行存活性計數，且使用Zeiss Axio Observer A1落射螢光顯微鏡(Carl Zeiss)之20X物鏡擷取代表影像。每次實驗中計數每個處理至少10個視野，且所顯示之結果為2至3次實驗之平均值。存活百分比之計算為活細胞數目除以死亡細胞及活細胞之總數乘以100。

經定量數據之統計分析係如實例1中所述進行。

結果

將RGC饋以各種濃度的hUTC條件培養基(hUCM)。hUTC係經單獨培養且收集hUTC條件培養基(UCM)(圖2A)。將RGC用UCM處理，且使用與實例1中相同的檢定，評估條件培養基對突觸數目及功能之作用。突觸分析顯示，hUCM足以用濃度依賴性方式類似於hUTC在跨孔插入物中誘導RGC之突觸形成並增強突觸功能(圖2B至圖2N)，類似於星狀細胞條件培養基(ACM)。(圖 2B至圖2D及圖2J)。濃度在20至80μg總蛋白質/mL培養基之間的UCM顯示完全突觸新生活性。UCM可取代hUTC共培養。hUCM亦加強功能性突觸，如藉由mEPSC之振幅及頻率增加所示。(圖2E至圖2I)。

這些結果證明hUTC誘導突觸形成且增強突觸功能。hUTC之突觸新生作用有助於藉由將這些細胞遞送至動物疾病模型而發生的功能恢復。

除了hUCM對突觸形成之作用外，其促進在無任何其他生長因子(例如，BDNF、及CTNF)存在下之RGC生存。(圖3A、圖3D及圖3E)。將RGC於最低培養基中培養3 DIV，該最低培養基缺少培養基補充物B27及生長因子BDNF、CNTF及胰島素，但含有毛喉素(稱為最低培養基對照條件之CTR)。在這些最低培養基條件下，小於5% RGC於3 DIV結束時存活(圖3A左圖及圖3B)。添加生長因子諸如BDNF或CNTF僅在有毛喉素存在下增加RGC存活率(Meyer-Franke A，等人，Neuron,.1995；15：805-819)。培養基中之毛喉素增加模擬進行中神經元活性之神經元中的cAMP含量，其對於CNS神經元之生存來說係關鍵的(Meyer-Franke等人，1995)。將UCM添加至最低培養基中以濃度依賴性方式刺激RGC生存(圖3A右圖及圖3B)；而相同濃度下之ACM不促進RGC生存(圖3B)。

UCM之生存促進活性在有毛喉素存在下之最低培養基中具功能性(圖3C)。這些結果證明UCM刺激RGC生存。在較 低濃度(40μg/ml)下，UCM之生存作用與BDNF或CNTF之生存作用似乎有相加性(圖3D、圖3E)。

UCM亦增強RGC神經突外生，如藉由總突起長度、突起數目及分支數目增加所證明。(圖3F至圖3J)。RGC生長培養基在接種時具有UCM顯示UCM含有促進神經突外生及精細化之因子(圖3F至圖3J)。ACM亦促進神經突外生(圖3F至圖3J)；UCM一般在誘導整體精細化及分枝中更有效(圖3F及圖3J)。Sholl分析顯示，相較於經單獨培養的RGC，UCM增加神經元複雜性(圖3G)。

總之，hUTC分泌促進體外純化RGC之間的功能性突觸之發育的因子。此外，hUTC亦支持神經元生存及生長。

實例3 由前驅細胞分泌之突觸形成因子

已顯示，來自hUTC之分泌蛋白體(secretome)對功能性突觸之發育、及神經元的生存及外生具有正面作用。在此實例中，識別由hUTC分泌之突觸形成因子。

免疫細胞化學檢定：如以上實例1中所述獲得hUTC及RGC。如實例2製備hUTC條件培養基(UCM)。

藉由截留分子量(MWCO)約5kDa至約100kDa分離UCM中之蛋白質。將80ug/mL UCM用於培養RGC，並藉由免疫細 胞化學突觸檢定進行分析。經分離蛋白質>5kDa、>30kDA、及>100kDa係與單獨RGC及UCM 5-100kDa進行比較。(圖4A)。

使用突觸新生阻斷劑加巴噴丁(GBP)，以進一步識別由hUTC分泌之突觸形成因子。

神經突外生檢定：為了測試在病理學(亦即生長抑制性)培養條件下之神經突外生，將RGC(1,500個細胞/蓋玻片)接種至塗布有各種濃度的硫酸軟骨素蛋白聚醣(CSPG,EMD Millipore,Billerica,MA)、Nogo-A(R&D Systems,Minneapolis,MN)或有可溶性髓鞘鹼性蛋白(MBP,10ug/mL,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)存在之蓋玻片上。24小時之後，將神經突藉由用CellTracker Red CMPTX染料(Inivtirogen)培養15min接著用4% PFA(w/v)固定來可視化。使用Zeiss Axioimager M1落射螢光顯微鏡(Carl Zeiss)上之20X物鏡擷取單一RGC及其神經突之影像。在每次實驗中，成像及分析每個條件至少30個細胞，且所顯示之結果為2至3次獨立實驗之平均值。神經元形態係使用Metamorph軟體(Molecular Devices)中之神經突外生應用模組分析。如Ferreira TA，等人，Nature Methods,2014；11：982-984中所述，使用Fiji之插件進行Sholl分析。

剔除檢定：用慢病毒shRNA培養hUTC以製備剔除(KD)UCM。隨後將RGC培養於KD UCM中並分析突觸形成、電生理學、及神經元生存及外生。(圖5A)。靶向人類THBS1、THBS2或THBS4 mRNA(其分別轉譯成TSP1、TSP2及TSP4)之選殖至pLKO.1-puro載體中之shRNA建構體池係購自Thermo Scientific。 空pLKO.1 puro載體係購自Addgene(質體8453,Cambridge,MA)且用作剔除對照組。個別建構體之剔除效率藉由轉染至hUTC中來測定。選擇各TSP之一個顯示最有效剔除之shRNA建構體用於後續慢病毒生產。

為了製備慢病毒，在轉染前一天以每T75培養瓶8×10⁶個細胞接種293T慢病毒包裝細胞。第二天，將含有Thbs1(選殖編號TRCN00224)、Thbs2(選殖編號TRCN53972)、Thbs4(選殖編號TRCN54048)之shRNA之pLKO.1-puro慢病毒質體、或剔除對照組(Addgene質體8453)轉染至293T細胞中。對於淩亂shRNA對照組，使用含有Thbs1(5'-ATAACTCCGATCGTTCAATAT-3')、Thbs2(5'-GTTACATCTCGATACGATACA-3')及Thbs4(5'-ATATAAGACGCTAGATCCACA-3')shRNA之相同正義及反義淩亂序列之寡核苷酸。將亂序shRNA寡核苷酸黏合(anneal)且選殖至pLKO.1-puro中並用於生產慢病毒。依據製造商推薦，使用X-tremeGENE轉染試劑(Roche,Basel,Switzerland)共轉染包裝質體R8.2及VSV-G。在轉染後48及72小時收集慢病毒上清液，且過濾通過0.45μm過濾器(Millipore)。使用Lenti-X^TM GoStix^TM(Clontech,Mountain View,CA)偵測病毒粒子。在補充聚凝胺(polybrene)(2μg/ml,Sigma)之後，經過濾上清液用於感染hUTC。經轉導hUTC藉由將嘌呤黴素(900ng/mL)添加至hUTC培養基中5天來進一步選擇，之後再用於條件化用於RGC實驗之培養基。

重組TSP之生產及純化：經純化重組人類TSP1係購自R&D Systems。對於TSP2純化，表現小鼠TSP2之CHO細胞系係用於生產條件培養基。使用親和力層析術程序利用HiTRAP肝素HP(GE Healthcare)如先前所述(Oganesian A，等人，Molecular Biology of Cell,2008；19：563-571)自培養基純化出經分泌重組TSP2。對於TSP4，依據製造商之說明書，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，將6-組胺酸標記大鼠TSP4建構體(pcDNA3-TSP4，如Kim DS，等人，J Neurosci,2012；32：8977-8987中所述)轉染至HEK293細胞中。依據製造商之說明書，藉由Ni-螯合層析法使用Ni-NTA樹脂(Qiagen,Venlo,Netherlands)自培養基純化出經分泌重組TSP4。用30kDa截留Vivaspin 20(Sartorius)將經純化重組TSP濃縮至1mg/mL，且將等分快速冷凍於液態氮中並在-80℃下儲存直至使用。

突觸檢定、電生理學記錄、及神經突外生檢定描述於實例1中。經定量數據之統計分析係如實例1中所述進行。條件培養基之西方墨點分析描述於實例2中。

結果

使用不同截留分子量粒徑篩析柱離拆含有hUTC分泌之突觸形成因子之UCM(圖4A)，結果UCM之突觸新生作用集中在大於100kDa之部分內(圖4B、圖4C)。UCM與RGC之培養的免疫細胞化學顯示在5至100kD範圍內的突觸形成因子的作用最小， 大於100kDa之因子具有最大作用。(圖4B、圖4C)。與TSP在UCM誘導突觸形成中之作用一致，添加GBP阻斷突觸形成因子。(圖4D、圖4E)。加巴噴丁為已知的突觸新生血小板反應蛋白家族阻斷劑，此結果顯示TSP家族蛋白為hUTC所分泌之主要突觸形成因子。

異構體特異性shRNA係使用慢病毒媒介之方式用於個別或組合地剔除TSP1、TSP2及TSP4。(圖5A)確認TSP為hUTC CM中之突觸形成因子。西方墨點法確認各TSP由對應shRNA特異性剔除(圖5B)。慢病毒轉導不具有shRNA之相同親代質體載體所生產之UCM(KD-CTR)或用含有淩亂TSP1、TSP2及TSP4 shRNA之慢病毒三重感染所生產之UCM(SCR-CTR)係用作對照組。UCM係自經慢病毒感染之hUTC生產，且施加至RGC以識別TSP剔除之作用(圖5A)。TSP-1、TSP-2及TSP-4之shRNA建構體係經遞送至hUTC，導致剔除各TSP之表現。(圖5B及圖5D)。RGC中突觸數目及突觸密度之定量顯示所有三種TSP(TSP1、TSP2及TSP4)皆有助於UCM之突觸新生功能(圖5C、圖5D、圖5H至圖5J)。相較於KD-CTR UCM，TSP之個別剔除使突觸數目減少(圖5C、圖5D、圖5H至圖5J)。剔除所有三種TSP(TSP1+2+4-KD)廢除UCM之突觸新生作用(圖5C、圖5D、圖5J)。

用純SP1、TSP2及TSP4(各150ng/ml)補充TSP1+2+4-KD UCM使TSP1+2+4-KD UCM之突觸新生作用恢復(圖5C、圖5E、圖5I)。將純TSP添加至KD-CTR UCM不會進一步增加突觸數目(圖5K)。

mEPSC電生理學記錄顯示，靜默TSP之表現降低hUTC之突觸新生作用，其中mEPSC之振幅及頻率減小。用ACM(陽性對照組)、SCR-CTR或TSP1+2+4-KD UCM處理之RGC顯示，靜默TSP之表現減少經UCM所誘導之突觸事件頻率增加(圖6F、圖6G、圖6H)。這與TSP(TSP1、TSP2及TSP4)為UCM誘導突觸新生所需之發現一致(圖5)。TSP剔除對mEPSC峰性質諸如振幅(圖6I、圖6J)及上升τ(圖6K、圖6L)具有較溫和作用。此外，TSP剔除不影響UCM增加衰退τ之能力(圖6M、圖6N)。靜默hUTC中之TSP1、TSP2、及TSP4消除這些細胞誘導突觸數目增加之能力。TSP之損失不完全減弱UCM對突觸電流振幅及mEPSC峰波形之作用。

此外，靜默TSP表現廢除UCM之神經突外生作用(圖7A、圖7B、圖7C、圖7D、圖7E)。TSP1、TSP2或TSP4之單一剔除廢除UCM之神經突外生促進作用(圖7E)，包括對突起數目及分支數目之作用(圖7N至圖7O)。剔除TSP2或TSP4或所有三種TSP(但僅剔除TSP1則無)減小UCM之生存促進活性(圖7K)。用純TSP個別地或所有一起補充TSP1+2+4-KD UCM不救援UCM之生存促進功能(圖7L)。用純TSP(TSP1、TSP2及TSP4)(各150ng/ml)補充TSP1+2+4-KD UCM恢復UCM之神經突外生刺激功能(圖7H、圖7i、圖7Q、圖7R)。

在CNS損傷時，由反應性神經膠細胞生產之硫酸軟骨素蛋白聚醣(CSPG)、及髓鞘蛋白(諸如Nogo A)係自變性神經元釋 放。這些蛋白質抑制軸突再生(Niederost等人，2002；Silver及Miller,2004；Usher等人，2010；Walker等人，2012)，妨礙神經元修復及損傷。經修改RGC神經突外生檢定說明hUTC在抑制生長之條件下促進神經突外生。在使用CSPG或Nogo-A之經修改RGC神經元外生檢定(圖8A及圖8B)中，CSPG自0.05μg/cm²開始阻礙神經突外生且在0.2μg/cm²或更高濃度下完全阻斷生長(圖8A)。Nogo-A自1μg/cm²開始阻斷RGC中之神經突外生，其中在2μg/cm²下抑制超過50%之神經突生長(圖8B)。經編碼淩亂shRNA之慢病毒轉導之UCM(SCR-CTR UCM)誘導接種至具有0.05μg/cm² CSPG或1μg/cm² Nogo-A之蓋玻片上之RGC中之神經突外生(圖8A及圖8B)。hUCM即使在生長抑制條件下亦誘導神經突外生。SCR-CTR UCM無法在高CSPG(>0.2μg/cm²)及Nogo-A(2μg/cm²)濃度下引起神經突外生(圖8A及圖8B)。

不同於SCR-CTR UCM，當存在0.05μg/cm² CSPG(圖8C及圖8E)或1μg/cm² Nogo-A(圖8D及圖8F)時，TSP1+2+4-KD UCM不引起神經突外生，顯示TSP對於在生長抑制條件下hUCM之神經突外生促進作用而言具重要性。單獨添加經純化TSP2或TSP4或一起添加所有三種TSP救援TSP1+2+4-KD UCM在CSPG或Nogo-A存在下誘導神經突外生之能力(圖8C至圖8F)。這些結果顯示TSP(尤其TSP2及TSP4)負責hUCM在CSPG或Nogo-A存在下之生長刺激作用。

CNS損傷所產生之髓鞘碎屑亦排出高含量髓鞘蛋白MBP(Liu等人，2006；Stapulionis等人，2008)。在10μg/ml可溶性MBP存在下進行之RGC外生檢定顯示MBP對CNS神經元具有神經突外生抑制作用。先前研究顯示，MBP在高於10μg/ml之濃度下誘導神經毒性(Zhang等人，2014)。此處，10μg/ml之MBP導致RGC中神經突外生之損失(圖8J，相較於在正常生長培養基條件下之RGC培養，外生減少14±0.07%)。SCR-CTR UCM在MBP存在下誘導神經突外生，且當TSP經靜默時，UCM之這種作用喪失(亦即TSP1+2+4-KD UCM，圖8G及圖8I)。僅將純TSP2添加回TSP1+2+4-KD UCM中救援外生促進作用。這些結果顯示，在MBP存在下，TSP2可媒介神經突外生，且在生長抑制條件下，hUTC分泌之TSP(TSP2及TSP4)媒介神經突外生。在CSPG、Nogo-A或MBP存在下，將純TSP添加至生長培養基亦誘導RGC神經突外生(圖8H及圖8J)。

實例4 自產後組織衍生細胞

此實例描述自胎盤及臍帶組織製備產後衍生細胞。在足月或不足月生產後獲得產後臍帶及胎盤。細胞係收集自五位不同捐贈者之臍帶及胎盤組織。測試不同的細胞分離方法產生具有以下潛能之細胞的能力：1)分化成具有不同表型之細胞的潛能，此為幹 細胞共有之特徵；或2)提供可用於其他細胞及組織之營養因子之潛能。

方法及材料

臍細胞分離：臍帶係得自國家疾病研究交換中心(NDRI,Philadelphia,Pa.)。組織係在正常分娩後獲得。細胞分離規程係在層流櫃(laminar flow hood)中無菌執行。為了移除血與碎屑，將臍帶於抗黴劑及抗生素(100個單位/毫升青黴素、100微克/毫升鏈黴素、0.25微克/毫升兩性黴素B)存在之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中清洗。接著在150cm²組織培養盤上並且於50毫升的培養基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖；Invitrogen)存在下機械解離組織，直到將組織切碎為細泥。將切碎的組織轉移至50毫升錐形管(每管約5公克的組織)。

隨後將組織於DMEM-低葡萄糖培養基或DMEM-高葡萄糖培養基中消化，各培養基含有如上文所述之抗黴劑及抗生素。在一些實驗中，使用膠原蛋白酶與分散酶的酶混合物(「C：D」)(膠原蛋白酶(Sigma,St Louis,Mo.)，500個單位/毫升；與分散酶(Invitrogen)，50個單位/毫升，在DMEM-低葡萄糖培養基中)。在其他實驗中，使用膠原蛋白酶、分散酶與玻尿酸酶的混合物(「C：D：H」)(膠原蛋白酶，500個單位/毫升；分散酶，50個單位/毫升；與玻尿酸酶(Sigma)，5個單位/毫升，在DMEM-低葡萄糖中)。使含有組 織、培養基與消化酶的錐形管在37℃下在迴轉式振盪器(Environ,Brooklyn,N.Y)中以225rpm培養2小時。

在消化後，將組織以150 x g離心5分鐘，且將上清液吸出。將團塊再懸浮於20毫升的生長培養基(DMEM-低葡萄糖(Invitrogen)、15百分比(v/v)胎牛血清(FBS；定義牛血清(defined bovine serum)；批號AND18475；Hyclone,Logan,Utah)、0.001%(v/v)2-巰基乙醇(Sigma)、每100毫升1毫升如上文所述之抗生素/抗黴劑。使細胞懸浮液通過70微米尼龍細胞濾器(BD Biosciences)過濾。使額外5毫升包含生長培養基的潤洗液通過濾器。接著使細胞懸浮液通過40微米的尼龍細胞濾器(BD Biosciences)，然後用額外5毫升的生長培養基潤洗液來趕出。

將濾液再懸浮於生長培養基(總體積50毫升)中然後以150 x g離心5分鐘。將上清液吸出然後將細胞再懸浮於50毫升的新鮮生長培養基中。將此過程再重複兩次。

在最終離心後，將上清液吸出然後將細胞團塊再懸浮於5毫升的新鮮生長培養基中。使用台盼藍染色來測定存活細胞數目。接著在標準條件下培養細胞。

將分離自臍帶的細胞以5,000個細胞/cm²接種於經明膠塗布T-75cm²培養瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)上並且於具有如上文所述之抗生素/抗黴劑的生長培養基中。2天後(在各種實驗中，細胞培養2至4天)，將用過的培養基自瓶吸出。用PBS清洗細胞三次以去除碎屑與血衍生細胞。接著用生長培養基補充細胞並讓其 生長至長滿(自繼代0至繼代1約10日)。在後續繼代時(自繼代1至2等等)，細胞在4至5日後達到次長滿(75至85百分比長滿)。針對這些後續繼代，以5000個細胞/cm²接種細胞。使細胞在加濕培養器中於5百分比二氧化碳及大氣氧氣、37℃下生長。

胎盤細胞分離：胎盤組織係獲自NDRI(Philadelphia,Pa.)。該些組織係來自孕婦且在正常外科分娩時獲得。胎盤細胞係如臍細胞分離所述分離。

以下實例應用於自胎盤組織分離母體衍生及新生兒衍生之分開細胞群。

細胞分離規程係在層流櫃(laminar flow hood)中無菌執行。將胎盤組織在有抗黴劑及抗生素(如上文所述)存在之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中清洗以移除血及碎屑。隨後將胎盤組織解剖成三區：頂線(新生兒側或態樣)、中線(混合的細胞分離新生兒及母體)及底線(母體側或態樣)。

將分開的區個別於具有抗生素/抗黴劑之PBS中清洗數次以進一步移除血及碎屑。接著在150cm²組織培養盤上於50毫升的DMEM-低葡萄糖存在下機械解離各區，直到將各區切碎為細泥。將泥轉移至50毫升錐形管中。各管含有大致5公克組織。將組織於含有抗黴劑及抗生素(100U/毫升青黴素、100微克/毫升鏈黴素、0.25微克/毫升兩性黴素B)及消化酶之DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖培養基中消化。在一些實驗中，使用膠原蛋白酶與分散酶的酶混合物(「C：D」)，其於DMEM-低葡萄糖培養基中含有 500個單位/毫升之膠原蛋白酶(Sigma,St Louis,Mo.)與50個單位/毫升之分散酶(Invitrogen)。在其他實驗中，使用膠原蛋白酶、分散酶與玻尿酸酶的混合物(C：D：H)(膠原蛋白酶，500個單位/毫升；分散酶，50個單位/毫升；與玻尿酸酶(Sigma)，5個單位/毫升，在DMEM-低葡萄糖中)。使含有組織、培養基與消化酶的錐形管在37℃下在迴轉式振盪器(Environ,Brooklyn,NY)中以225rpm培養2小時。

在消化後，將組織以150^xg離心5分鐘，將所得上清液吸出。將團塊再懸浮於20毫升具有青黴素/鏈黴素/兩性黴素B之生長培養基中。使細胞懸浮液過濾通過70微米的尼龍細胞濾器(BD Biosciences)，用額外5毫升的生長培養基潤洗液來趕出。使總細胞懸浮液通過40微米的尼龍細胞濾器(BD Biosciences)，接著用額外5毫升的生長培養基作為潤洗液。

將濾液再懸浮於生長培養基(總體積50毫升)中然後以150 x g離心5分鐘。將上清液吸出然後將細胞團塊再懸浮於50毫升的新鮮生長培養基中。將此過程再重複兩次。在最終離心後，將上清液吸出然後將細胞團塊再懸浮於5毫升的新鮮生長培養基中。使用台盼藍排除測試來測定細胞計數。接著在標準條件下培養細胞。

LIBERASE細胞分離：於具有LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.)(每毫升2.5毫克，Blendzyme 3；Roche Applied Sciences,Indianapolis,Ind.)與玻尿酸酶(5個單位/ 毫升，Sigma)之DMED-低葡萄糖培養基中將細胞自臍帶組織分離。組織消化與細胞分離係如以上之其他蛋白酶消化所述，但使用LIBERASE/玻尿酸酶混合物代替C：D或C：D：H酶混合物。用LIBERASE消化組織會使來自產後組織迅速擴增的細胞族群得以分離出來。

使用其他酶組合之細胞分離：對於使用不同酶組合以自臍帶分離出細胞的程序進行比較。用於消化比較之酶包括：i)膠原蛋白酶；ii)分散酶；iii)玻尿酸酶；iv)膠原蛋白酶：分散酶混合物(C：D)；v)膠原蛋白酶：玻尿酸酶混合物(C：H)；vi)分散酶：玻尿酸酶混合物(D：H)；與vii)膠原蛋白酶：分散酶：玻尿酸酶混合物(C：D：H)。觀察利用這些不同酶消化條件之細胞分離的差異(表4-1)。

自臍帶中之殘餘血液分離細胞：進行其他嘗試以藉由不同方式將細胞池自臍帶分離。在一個例子中，將臍帶切片然後用生長培養基清洗以排出血塊與凝膠狀材料。收集血、凝膠狀材料與生長培養基之混合物然後以150 x g離心。將團塊再懸浮並接種於經明膠塗布培養瓶上之生長培養基中。透過這些實驗，分離出會迅速擴增的細胞群。

自臍帶血分離細胞：亦自獲自NDR1之臍帶血樣本分離細胞。此處所使用之分離規程為Ho等人之國際專利申請案WO 2003/025149中者(Ho,T.W.，等人，「Cell Populations Which Co-Express CD49C and CD90」，申請號PCT/US02/29971)。將臍帶血(NDRI,Philadelphia PA)樣本(分別為50毫升與10.5毫升)與裂 解緩衝液(經過濾器滅菌之155mM氯化銨、10毫莫耳碳酸氫鉀、0.1毫莫耳EDTA、緩衝至pH 7.2(所有組分皆來自Sigma,St.Louis,Mo.))混合。使細胞以1：20臍帶血對裂解緩衝液的比例溶解。使所生成的細胞懸浮液渦動5秒鐘，然後在環境溫度下培養2分鐘。將溶解產物離心(以200^xg離心10分鐘)。將細胞團塊再懸浮於完全最低必需培養基(Gibco,Carlsbad,Calif.)中，該培養基含有10百分比胎牛血清(Hyclone,Logan Utah)、4毫莫耳麩醯胺酸(Mediatech,Herndon,Va.)、每100毫升100個單位青黴素與每100毫升100微克鏈黴素(Gibco,Carlsbad,Calif.)。將再懸浮之細胞離心(以200^xg離心10分鐘)、將上清液吸出然後在完全培養基中清洗細胞團塊。將細胞直接接種至T75培養瓶(Corning,N.Y.)、T75經層黏蛋白塗布培養瓶或T175經纖連蛋白素塗布培養瓶(均來自Becton Dickinson,Bedford,Mass.)。

使用不同酶組合與生長條件分離細胞：為了要判定細胞群是否可在不同條件下分離並且在分離後是否可立即在各種條件下擴增，根據以上提供之程序使用C：D：H的酶組合，將細胞在含有或未含0.001百分比(v/v)2-巰基乙醇(Sigma,St.Louis,Mo.)的生長培養基中消化。在多種條件下接種如此分離之胎盤衍生細胞。所有細胞皆於青黴素/鏈黴素存在下生長。(表4-2)。

使用不同酶組合與生長條件分離細胞：在所有條件下，細胞在繼代0與1之間附著及擴增良好(表4-2)。條件5至8與13 至16中之細胞皆顯示在接種後良好增生多達4次繼代，將這些細胞在此時點凍存且存庫。

結果

使用不同酶組合之細胞分離：C：D：H組合提供最佳分離後細胞產率，並且比起其他條件在培養中產生擴增更多代的細胞(表4-1)。單獨使用膠原蛋白酶或玻尿酸酶無法獲得可擴增的細胞群。未試圖判定此結果是否專屬於所測試之膠原蛋白。

使用不同酶組合與生長條件分離細胞：在所有針對酶消化與生長所測試的條件下，細胞皆在繼代0與1之間附著及擴增良好(表4-2)。實驗條件5至8與13至16中之細胞皆在接種後良好增生多達4次繼代，將這些細胞在此時點凍存。所有細胞皆經凍存以備進一步研究。

表4-2：產後細胞在不同條件下之分離與培養擴增：

自臍帶中之殘餘血液分離細胞：已成核細胞附著且生長快速。以流動式細胞測量術分析這些細胞，而這些細胞與透過酶消化所得之細胞相似。

自臍帶血分離細胞：製劑含有紅血球及血小板。在前3個星期期間沒有已成核細胞之附著與分裂。在接種後3個星期更換培養基但仍未觀察到細胞附著與生長。

概述：可使用膠原蛋白酶(基質金屬蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)與玻尿酸酶(分解玻尿酸之黏液分解酶)的酶組合，將細胞群自臍帶及胎盤組織有效地衍生出來。亦可使用名為Blendzyme之LIBERASE。特定言之，亦可使用Blendzyme 3並搭配玻尿酸酶來分離細胞，Blendzyme 3為膠原蛋白酶(4 Wunsch單位 /g)與嗜熱菌蛋白酶(1714酪蛋白單位/g)。當在明膠塗布之塑膠上的生長培養基中培養時，這些細胞迅速擴增許多個繼代。

亦自臍帶中的殘餘血分離出細胞，但該殘餘血並非臍帶血。自組織洗出的血塊中之所以存在於所用之條件下會貼附與生長之細胞，可能是因為細胞在解剖過程期間釋出。

實例5 產後衍生細胞之核型分析

細胞療法所用之細胞系較佳為均質性並且不含任何汙染細胞型。細胞療法所用之細胞應具有正常染色體數目(46)及結構。為了要識別出均質性且不含非產後組織來源之細胞的胎盤及臍帶衍生細胞系，對於細胞樣本之核型進行分析。

方法及材料

在含有青黴素/鏈黴素之生長培養基中培養來自男新生兒之產後組織的PPDC。選用來自男新生兒(X,Y)的產後組織以能夠區別新生兒衍生細胞與母體衍生細胞(X,X)。將細胞以每平方公分5,000細胞接種於T25培養瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)中的培養基中並且擴增至80%長滿。將含有細胞之T25培養瓶用生長培養基填充至頸部。由快遞員將樣本送至臨床細胞遺傳學實驗室(估計實驗室至實驗室交通時間為一小時)。在中期(metaphase)分析細胞，此時染色體係最佳可視化。在所計數之二十個處於中期的細胞中，有 五個分析出具有正常均質性核型數目(兩個)。如果觀察到兩個核型，即將細胞樣本歸類為均質性。如果觀察到超過兩個核型，即將細胞樣本歸類為異質性。當識別出異質性核型數目(四個)時，即計數額外中期細胞並加以分析。

結果

所有送交染色體分析的細胞樣本皆判讀為展現正常外觀。16個經分析之細胞系中的三個展現異質性表型(XX與XY)，從而指示存在有同時衍生自新生兒與母體來源的細胞(表5-1)。將衍生自組織胎盤-N之細胞自胎盤之新生兒態樣分離。在繼代零，此細胞系顯現出均質性XY。然而，在繼代九，該細胞系為異質性(XX/XY)，指出先前未偵測出的母體來源細胞存在。

概述：染色體分析識別出核型顯現為正常(由臨床細胞遺傳學實驗室判讀)的胎盤及臍帶衍生細胞。核型分析亦識別出不含母體細胞的細胞系，此係由均質性核型來判定。

實例6 藉由流動式細胞測量術評估人類產後衍生細胞表面標記

藉由流動式細胞測量術來表徵細胞表面蛋白質或「標記」可用來判定細胞系的身份(identity)。表現的一致性可由多個捐贈者來判定，並且在暴露於不同處理與培養條件的細胞中判定。自胎盤及臍分離出的產後衍生細胞(PPDC)系係經表徵(藉由流動式細胞測量術)，從而提供用於識別這些細胞系的概況。

方法及材料

培養基及培養容器：將細胞培養於具有青黴素/鏈黴素之生長培養基(Gibco Carlsbad,Calif.)中。使細胞在經血漿處理之T75、T150與T225組織培養瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)中培養 直到長滿。培養瓶的生長表面係藉由在室溫下培養2%(w/v)明膠(Sigma,St.Louis,Mo.)20分鐘來塗布明膠。

抗體染色及流動式細胞測量術分析：將瓶中之貼附細胞於PBS中清洗且用胰蛋白酶/EDTA脫附。將細胞收集、離心，且以每毫升1×10⁷的細胞濃度再懸浮於3%(v/v)FBS於PBS中。根據製造商規範，將關注的細胞表面標記之抗體(請見後文)加至一百微升的細胞懸浮液然後將混合物在黑暗中在4℃下培養30分鐘。在培養之後，將細胞用PBS清洗且離心以移除未結合的抗體。將細胞再懸浮於500微升PBS中且藉由流動式細胞測量術分析。流動式細胞測量術分析係用FACScalibur ^TM 儀器(Becton Dickinson,San Jose,Calif.)來執行。表6-1列舉所使用之細胞表面標記之抗體。

胎盤與臍比較：在繼代8將胎盤衍生細胞與臍衍生細胞進行比較。

繼代對繼代比較：在繼代8、15、及20分析胎盤衍生細胞及臍衍生細胞。

捐贈者對捐贈者比較：為了比較捐贈者之間的差異，將來自不同捐贈者之胎盤衍生細胞互相比較，且將來自不同捐贈者之臍衍生細胞互相比較。

表面塗層比較：將培養於經明膠塗布培養瓶上的胎盤衍生細胞與培養於未經塗布培養瓶上之胎盤衍生細胞進行比較。將培養於經明膠塗布培養瓶上的臍衍生細胞與培養於未塗布培養瓶上之臍衍生細胞進行比較。

消化酶比較：對於四種用於分離與製備細胞的處理進行比較。分離自用1)膠原蛋白酶；2)膠原蛋白酶/分散酶；3)膠原蛋白酶/玻尿酸酶；與4)膠原蛋白酶/玻尿酸酶/分散酶處理之胎盤之細胞係經比較。

胎盤層比較：將衍生自胎盤組織之母體態樣之細胞與衍生自胎盤組織之絨毛區之細胞以及衍生自胎盤之新生胎兒態樣之細胞進行比較。

結果

胎盤與臍比較：藉由流動式細胞測量術分析之胎盤衍生細胞及臍衍生細胞顯示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、 PDGFr-α及HLA-A,B,C之陽性表現，此係由相對於IgG對照組的螢光值增加來指示。這些細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、與HLA-DR,DP,DQ的可偵測表現為陰性，此係由螢光值與IgG對照組可相比來指示。考慮到陽性曲線之螢光值之變異。陽性曲線之平均值(亦即CD13)及範圍(亦即CD90)顯示一些變異，但曲線顯現正常，證實為均質性族群。兩個曲線個別展現大於IgG對照組之值。

繼代對繼代比較--胎盤衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析之繼代8、15、及20之胎盤衍生細胞皆陽性表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A,B,C，如相對於IgG對照組的螢光值增加所反映。該些細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR,DP,DQ的表現為陰性，具有與IgG對照組一致的螢光值。

繼代對繼代比較--臍衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析之繼代8、15與20之臍衍生細胞皆表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α與HLA-A,B,C，由相對於IgG對照組的螢光增加來指示。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR,DP,DQ陰性，此係由螢光值與IgG對照組一致來指示。

捐贈者對捐贈者比較--胎盤衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析分離自分開捐贈者之胎盤衍生細胞各表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α與HLA-A,B,C，其中螢光 值相對於IgG對照組增加。該些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR,DP,DQ表現陰性，此係由螢光值與IgG對照組一致來指示。

捐贈者對捐贈者比較--臍衍生細胞：藉由流動式細胞測量術分析分離自分開捐贈者之臍衍生細胞各顯示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α與HLA-A,B,C之陽性表現，此係反映在螢光值相對於IgG對照組增加。這些細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR,DP,DQ的表現為陰性，具有與IgG對照組一致的螢光值。

明膠表面塗層對胎盤衍生細胞之作用：藉由流動式細胞測量術分析在經明膠塗布或未經塗布培養瓶上擴增之胎盤衍生細胞皆表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α與HLA-A,B,C，如相對於IgG對照組的螢光值增加所反映。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR,DP,DQ表現陰性，此係由螢光值與IgG對照組一致來指示。

明膠表面塗層對臍衍生細胞之作用：藉由流動式細胞測量術分析在明膠上或未經塗布培養瓶上擴增之臍衍生細胞皆陽性表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α與HLA-A,B,C，其相對於IgG對照組具有增加的螢光值。這些細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR,DP,DQ的表現為陰性，具有與IgG對照組一致的螢光值。

用於製備細胞之酶消化程序對細胞表面標記概況之作用：藉由流動式細胞測量術分析之使用各種消化酶所分離之胎盤衍生細胞皆表現CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α與HLA-A,B,C，如藉由相對於IgG對照組之螢光值增加所指示。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLADR,DP,DQ表現陰性，如藉由螢光值與IgG對照組一致來指示。

胎盤層比較：藉由流動式細胞測量術分析之分別分離自胎盤之母體、絨毛、及新生兒層的細胞顯示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α及HLA-A,B,C之陽性表現，如藉由相對於IgG對照組的螢光值增加所指示。這些細胞為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141與HLA-DR,DP,DQ表現陰性，如藉由螢光值與IgG對照組一致來指示。

概述：胎盤衍生細胞及臍衍生細胞的流動式細胞測量術分析結果已建立這些細胞系的身份。胎盤衍生細胞及臍衍生細胞為CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、HLA-A,B,C陽性，且為CD31、CD34、CD45、CD117、CD141及HLA-DR,DP,DQ陰性。此身份在變項包括捐贈者、繼代、培養容器表面塗層、消化酶與胎盤層的變異間皆一致。觀察到在個別螢光值直方圖曲線平均值與範圍上有一些變異，但在所有測試條件下的所有陽性曲線皆為正常並且表現出大於IgG對照組的螢光值，因而確認該些細胞包含具有該些標記之陽性表現的均質性族群。

實例7 產後組織表型的免疫組織化學特徵

人類產後組織(即臍帶及胎盤)中所發現的細胞之表型係以免疫組織化學法分析。

方法及材料

組織製備：將人類臍帶及胎盤組織收集且在4℃下浸漬固定於4%(w/v)多聚甲醛中隔夜。使用針對下列表位的抗體來執行免疫組織化學法：波形蛋白(1：500；Sigma,St.Louis,Mo.)、肌間線蛋白(desmin，1：150，對抗兔而生成；Sigma；或1：300，對抗小鼠而生成；Chemic on,Temecula,Calif.)，α-平滑肌肌動蛋白(SMA；1：400；Sigma)，細胞角蛋白18(CK18；1：400；Sigma)，馮威里氏因子(vWF；1：200；Sigma)與CD34(人類CD34 Class III；1：100；DAKOCytomation,Carpinteria,Calif)。此外，測試以下標記：抗人類GROα--PE(1：100；Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J)、抗人類GCP-2(1：100；Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,Calif)、抗人類氧化LDL受體1(ox-LDL R1；1：100；Santa Cruz Biotech)與抗人類NOGO-A(1：100；Santa Cruz Biotech)。用解剖刀修剪經固定之樣品，然後將其置於在含乙醇之乾冰浴上的OCT包埋化合物(Tissue-Tek OCT；Sakura,Torrance,Calif)內。接著使用標準低溫恒溫器(Leica Microsystems)將冷凍之包埋塊切片(10μm厚)然後固定於玻片上以備染色。

免疫組織化學：類似於先前研究執行免疫組織化學(例如，Messina，等人，2003，Exper.Neurol.184：816-829)。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗組織切片然後將其暴露於含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif)與0.3%(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白質阻斷液中1小時以獲取細胞內抗原。在感興趣表位會位於細胞表面(CD34、ox-LDL R1)上的情況中，省略該程序的所有步驟中之Triton以避免表位流失。再者，在一級抗體係對抗山羊(GCP-2,ox-LDL R1,NOGO-A)而生成的情況中，整個程序中使用3%(v/v)驢血清來取代山羊血清。接著在室溫下將一級抗體(稀釋於阻斷液中)施用於切片歷時4小時。將一級抗體溶液移除，用PBS清洗培養物，然後施用二級抗體溶液(在室溫下1小時)，該二級抗體溶液含有阻斷劑以及山羊抗小鼠IgG--Texas Red(1：250；Molecular Probes,Eugene,Oreg.)及/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1：250；Molecular Probes)或驢抗山羊IgG--FITC(1：150；Santa Cruz Biotech)。清洗培養物，然後施用10微莫耳DAPI(Molecular Probes)10分鐘以可視化細胞核。

在免疫染色後，在Olympus倒立落射螢光顯微鏡(Olympus,Melville,N.Y.)上使用適當螢光濾光片來可視化螢光。高於對照組染色的螢光信號即代表陽性染色。使用數位彩色攝影機與ImagePro軟體(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif.)來擷取代表影像。針對三重染色的樣本，一次僅使用一個發射濾光片來拍攝各影像。 接著使用Adobe Photoshop軟體(Adobe,San Jose,Calif.)來製備分層合成影像(Layered montage)。

結果

臍帶特徵：波形蛋白、肌間線蛋白、SMA、CK18、vWF與CD34標記係表現於臍帶內發現之細胞亞群中。特定而言，vWF與CD34表現限制於臍帶內所含之血管。CD34+細胞係位於最內層(管腔側)上。波形蛋白表現係發現於整個臍帶基質與血管中。SMA限於動脈及靜脈的基質與外壁，但血管本身則不含。僅在血管內觀察到CK18與肌間線蛋白，且肌間線蛋白限於中層及外層。

胎盤特徵：波形蛋白、肌間線蛋白、SMA、CK18、vWF與CD34標記全部在胎盤內觀察到且為區域特異性。

GROα、GCP-2、ox-LDL RI、及NOGO-A組織表現：此等標記皆未在臍帶或胎盤組織內觀察到。

概述：人類臍帶及胎盤內的細胞中皆會表現波形蛋白、肌間線蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、細胞角蛋白18、馮威里氏因子與CD 34。

實例8 使用寡核苷酸陣列分析產後組織衍生細胞

Affymetrix GENECHIP陣列係用來比較臍衍生與胎盤衍生細胞與纖維母細胞、人類間葉幹細胞與另一個衍生自人類骨髓 之細胞系的基因表現概況。此分析提供產後衍生細胞之特徵並識別這些細胞的獨特分子標記。

方法及材料

細胞之分離及培養：人類臍帶與胎盤係得自國家疾病研究交換中心(NDRI,Philadelphia,Pa.)，來自正常足月分娩並且獲得患者同意。如實例6中所述接受組織並分離細胞。將細胞培養於經明膠塗布的組織培養塑膠培養瓶上之生長培養基(使用DMEM-LG)中。培養物係在37℃下以5% CO₂培養。

人類皮膚纖維母細胞係購自Cambrex Incorporated(Walkersville,Md.；批號9F0844)與ATCC CRL-1501(CCD39SK)。將兩個細胞系在DMEM/F12培養基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中培養，培養基含有10%(v/v)胎牛血清(Hyclone)與青黴素/鏈黴素(Invitrogen)。使細胞生長於標準組織處理塑膠上。

人類間葉幹細胞(hMSC)係購自Cambrex Incorporated(Walkersville,Md.；批號2F1655、2F1656與2F1657)並根據製造商規範在MSCGM培養基(Cambrex)中培養。使細胞在37℃下以5% CO₂生長於標準組織培養塑膠上。

人類髂骨崤骨髓係接受自NDRI並獲得患者同意。骨髓係根據Ho等人(W003/025149)所概述之方法來處理。將骨髓與裂解緩衝液(155mM NH4Cl、10mM KHCO₃與0.1mM EDTA，pH 7.2)混合，並且混合比例為1份骨髓對20份裂解緩衝液。使細胞懸浮液 渦動、在環境溫度下培養2分鐘然後以500^xg離心10分鐘。將上清液丟棄，並將細胞團塊再懸浮於補充10%(v/v)胎牛血清與4mM麩醯胺酸之最低必需培養基α(Invitrogen)中。將細胞再次離心然後將細胞團塊再懸浮於新鮮培養基中。使用台盼藍排除法(Sigma,St.Louis,Mo.)來計數存活單核細胞。將單核細胞以5×10⁴個細胞/cm²接種於組織培養塑膠瓶中。將細胞在37℃下以5% CO₂、在標準大氣O₂或在5% O₂下培養。將細胞培養5日並且未進行培養基更換。在5日的培養後將培養基與非貼附細胞移除。將貼附細胞維持於培養中。

mRNA之分離及GENECHIP分析：將活性生長之細胞培養物用細胞刮杓自培養瓶移除於冷PBS中。將細胞以300^xg離心5分鐘。將上清液移除，然後將細胞再懸浮於新鮮PBS並再次離心。將上清液移除，然後立即將細胞團塊冷凍並儲存在-80℃下。將細胞mRNA萃取出來然後轉錄為cDNA，隨後將其轉錄成cRNA且經生物素標記。使經生物素標記之cRNA與HG-U133A GENECHIP寡核苷酸陣列(Affymetrix,Santa Clara,Calif.)雜交。雜交與數據收集係根據製造商規範來執行。分析係使用「Significance Analysis of Microarrays」(SAM)第1.21版電腦軟體(Stanford University；Tusher,V.G.等人，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：5116-5121)執行。

結果

分析了十四個不同細胞群。細胞以及繼代資訊、培養基材與培養基係列於表8-1。

數據藉由主組分分析(Principle Component Analysis)評估，分析在細胞中有差別表現的290個基因。此分析允許族群之間相似性之相對比較。

表8-2顯示計算用於細胞對比較之歐幾里德距離(Euclidean distance)。歐幾里德距離係根據基於290個基因的細胞比較結果，這些基因在不同細胞型間有差別表現。歐幾里德距離與290個基因之表現之間的相似性成反比(亦即，距離越大，存在的相似性越小)。

表8-3、8-4與8-5顯示在胎盤衍生細胞中增加表現(表8-3)、在臍衍生細胞中增加表現(表8-4)及在臍與胎盤衍生細胞中減少表現(表8-5)之基因。標題「探針組ID」之欄係指製造商對於定位於晶片上具體位點上之數種寡核苷酸探針組之識別碼，該些探針組與經列名之基因(「基因名稱」欄)雜交，該等基因包含可在NCBI(GenBank)數據庫內以指定存取號(「NCBI存取號」欄)查找之序列。

表8-6、8-7與8-8顯示在人類纖維母細胞(表8-6)、ICBM細胞(表8-7)與MSC(表8-8)中增加表現之基因。

概述：本檢測係為了提供衍生自臍帶與胎盤之產後細胞的分子特徵而執行。此分析包括衍生自三個不同臍帶與三個不同胎盤的細胞。此檢測亦包括兩個不同的皮膚纖維母細胞系、三個間葉幹細胞系與三個髂骨崤骨髓細胞系。這些細胞所表現之mRNA係使用寡核苷酸陣列來分析，該陣列含有22,000個基因的探針。結果顯示，290個基因在這五種不同細胞型中有差別表現。這些基因包括十個在胎盤衍生細胞中特異地增加的基因，以及七個在臍帶衍生細胞中特異地增加的基因。發現相較於其他細胞型，四十四個基因具有在胎盤與臍帶中特異地較低的表現水準。選定基因之表現已藉由PCR來確認(參見以下實例)。此等結果證明，產後衍生細胞具有獨特的基因表現概況，例如相較於骨髓衍生細胞及纖維母細胞。

實例9 產後衍生細胞之細胞標記

在前述實例中，衍生自人類胎盤及人類臍帶之細胞的相似性及差異性係藉由比較其基因表現概況與衍生自其他來源之細 胞的基因表現概況來評估(使用寡核苷酸陣列)。識別六個「簽名」基因：氧化LDL受體1、介白素-8、凝乳酶、內質網蛋白、趨化激素受體配體3(CXC配體3)、及顆粒性細胞趨化蛋白質2(GCP-2)。此等「簽名」基因在產後衍生細胞中以相對高的水準表現。

進行此實例中所述之程序以驗證微陣列數據且找出基因與蛋白質表現之間的一致性/不一致性，以及建立一系列可靠的檢定以用於偵測胎盤衍生細胞與臍衍生細胞之唯一識別符。

方法及材料

細胞：胎盤衍生細胞(三個分離株，包括一個經核型分析所識別主要為新生兒之分離株)、臍衍生細胞(四個分離株)、及正常人類皮膚纖維母細胞(NHDF；新生兒及成人)，生長於經明膠塗布之T75培養瓶中具有青黴素/鏈黴素之生長培養基中。間葉幹細胞(MSCS)係生長於間葉幹細胞生長培養基Bullet套組(MSCGM；Cambrex,Walkerville,Md.)中。

至於IL-8規程，將細胞自液態氮解凍且以5,000個細胞/cm²接種於經明膠塗布之培養瓶中，於生長培養基中生長48小時且隨後於10毫升血清饑餓培養基[DMEM--低葡萄糖(Gibco,Carlsbad,Calif.)、青黴素/鏈黴素(Gibco,Carlsbad,Calif.)及0.1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA；Sigma,St.Louis,Mo.)]中再生長8小時。在此處理之後，萃取RNA且將上清液以150xg離心5分鐘以移除細胞碎屑。隨後將上清液冷凍在-80℃下以供ELISA分析。

ELISA檢定之細胞培養物：將衍生自胎盤與臍之產後細胞，以及衍生自人類新生兒包皮之人類纖維母細胞培養在經明膠塗布之T75培養瓶中的生長培養基中。將細胞在繼代11時冷凍於液態氮中。將細胞解凍且轉移至15毫升離心管。在以150 x g離心5分鐘之後，將上清液丟棄。將細胞再懸浮於4毫升培養基中且計數。使細胞以375,000個細胞/培養瓶生長於含有15毫升生長培養基之75cm²培養瓶中24小時。將培養基更換成血清饑餓培養基8小時。在培養結束時以14,000^xg離心5分鐘來收集血清饑餓培養基(且保存在-20℃下)。

為了估計各培養瓶中細胞之數目，各培養瓶中添加2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Calif)。在將細胞自培養瓶脫附之後，用8毫升生長培養基中和胰蛋白酶活性。將細胞轉移至15毫升離心管且以150xg離心5分鐘。移除上清液且將1毫升生長培養基添加至各管以再懸浮細胞。使用血球計估計細胞數目。

ELISA檢定：由細胞分泌至血清饑餓培養基之IL-8之量係使用ELISA檢定(R&D Systems,Minneapolis,Minn.)來分析。所有檢定皆根據製造商所提供之說明書來測試。

總RNA分離：將RNA自長滿之產後衍生細胞及纖維母細胞萃取出或就IL-8表現而言自如上文所述處理之細胞萃取。根據製造商之說明書(RNeasy^® Mini Kit；Qiagen,Valencia,Calif)，將細胞用350微升含有β-巰基乙醇(Sigma,St.Louis,Mo.)之緩衝液RLT溶解。根據製造商之說明書(RNeasy^® Mini Kit；Qiagen,Valencia, Calif)，將RNA萃取出且使其經歷DNase處理(2.7U/樣本)(Sigma St.Louis,Mo.)。用50微升經DEPC處理水將RNA沖提出來然後儲存於-80℃下。

反轉錄：RNA亦自人類胎盤及臍萃取出。將組織(30毫克)懸浮於700微升含有2-巰基乙醇之緩衝液RLT中。將樣本機械均質化且根據製造商之規範進行RNA萃取。用50微升經DEPC處理水將RNA萃取出來然後儲存於-80℃下。使用隨機六聚物以TaqMan^®反轉錄試劑(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)來反轉錄RNA，反轉錄在25℃下歷時10分鐘、在37℃下歷時60分鐘、且在95℃下歷時10分鐘。樣本儲存於-20℃。

藉由cDNA微陣列識別為在產後細胞中所獨特調節之基因(簽名基因--包括氧化LDL受體、介白素-8、凝乳酶、及內質網蛋白)係使用即時及傳統PCR進一步研究。

即時PCR：使用Assays-on-Demand^®基因表現產物對cDNA樣本執行PCR：使用具有ABI Prism 7000 SDS軟體之7000序列偵測系統(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)，根據製造商之說明書(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)，將氧化LDL受體(Hs00234028)；凝乳酶(Hs00166915)；內質網蛋白(Hs003825 15)；CXC配體3(Hs00171061)；GCP-2(Hs00605742)；IL-8(Hs00174103)；及GAPDH(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)與cDNA及TaqMan^® Universal PCR主混合物混合。熱循環條件為開始50℃歷時2min及95℃歷時10min，接著為40個95℃歷時15sec及60℃ 歷時1min之循環。根據製造商之規範分析PCR數據(Applied Biosystems關於ABI Prism 7700序列偵測系統之使用者佈告#2)。

傳統PCR：使用ABI PRISM 7700(Perkin Elmer Applied Biosystems,Boston,Mass.,USA)執行傳統PCR以確認即時PCR之結果。使用2微升cDNA溶液、1x AmpliTaq Gold通用混合物PCR反應緩衝液(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)及在94℃下初始變性歷時5分鐘來執行PCR。擴增係針對各引子組最佳化。針對IL-8、CXC配體3、及內質網蛋白(94℃歷時15秒、55℃歷時15秒及72℃歷時30秒持續30個循環)；針對凝乳酶(94℃歷時15秒、53℃歷時15秒及72℃歷時30秒持續38個循環)；針對氧化LDL受體與GAPDH(94℃歷時15秒、55℃歷時15秒及72℃歷時30秒持續33個循環)。擴增所使用之引子列舉於表9-1中。最終PCR反應中之引子濃度為1微莫耳，除了GAPDH，其為0.5微莫耳。GAPDH引子與即時PCR相同，除了未將製造商之TaqMan^®探針添加至最終PCR反應。將樣本於2%(w/v)瓊脂糖凝膠上運行(run)且用溴化乙錠(Sigma,St.Louis,Mo.)染色。使用667 Universal Twinpack膜(VWR International,South Plainfield,N.J.)使用焦距Polaroid照相機(VWR International,South Plainfield,N.J.)擷取影像。

免疫螢光：將PPDC在室溫下用冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)固定10分鐘。使用臍衍生細胞及胎盤衍生細胞各者在繼代0(P0)(分離後直接使用)的一個分離株，及臍衍生細胞及胎盤衍生細胞之繼代11(P 11)(兩個胎盤衍生細胞分離株、兩個臍衍生細胞分離株)及纖維母細胞(P 11)。使用針對以下表位的抗體執行免疫細胞化學：波形蛋白(1：500,Sigma,St.Louis,Mo.)、肌間線蛋白(1：150；Sigma--對抗兔而生成；或1：300；Chemicon,Temecula,Calif--對抗小鼠而生成)、α-平滑肌肌動蛋白(SMA；1：400；Sigma)，細胞角蛋白18(CK18；1：400；Sigma)，馮威里氏因子(vWF；1：200；Sigma)與CD34(人類CD34 Class III；1：100；DAKOCytomation,Carpinteria,Calif)。此外，於繼代11產後細胞上測試以下標記：抗人類GRO α--PE(1：100；Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)、抗人類GCP-2(1：100；Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,Calif)、抗人類氧化LDL受體1(ox-LDL R1；1：100；Santa Cruz Biotech)與抗人類NOGA-A(1：100；Santa Cruz,Biotech)。

用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗培養物然後將其暴露於含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif)與0.3%(v/v) Triton(Triton X-100；Sigma,St.Louis,Mo.)的蛋白質阻斷液中30分鐘以獲取細胞內抗原。當感興趣表位係位於細胞表面(CD34、ox-LDL R1)上時，省略該程序的所有步驟中之Triton X-100以避免表位流失。再者，在一級抗體係對抗山羊(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)而生成的情況中，全程會使用3%(v/v)驢血清來取代山羊血清。接著在室溫下將一級抗體(稀釋於阻斷液中)施用於培養物歷時1小時。將一級抗體溶液移除，用PBS清洗培養物，然後施用二級抗體溶液(在室溫下1小時)，該二級抗體溶液含有阻斷劑以及山羊抗小鼠IgG--Texas Red(1：250；Molecular Probes,Eugene,Oreg.)及/或山羊抗兔IgG-Alexa 488(1：250；Molecular Probes)或驢抗山羊IgG--FITC(1：150,Santa Cruz Biotech)。隨後清洗培養物，然後施用10微莫耳DAPI(Molecular Probes)10分鐘以可視化細胞核。

在免疫染色後，在Olympus®倒立落射螢光顯微鏡(Olympus,Melville,N.Y.)上使用適當螢光濾光片來可視化螢光。在所有情況下，陽性染色代表高於對照組染色的螢光訊號，其中遵照上文所概述的全部程序，除了施加一級抗體溶液。使用數位彩色攝影機與ImagePro®軟體(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif)來擷取代表影像。針對三重染色的樣本，一次僅使用一個發射濾光片來拍攝各影像。接著使用Adobe Photoshop®軟體(Adobe,San Jose,Calif)來製備分層合成影像(Layered montage)。

製備細胞以進行FACS分析：將培養瓶中之貼附細胞於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(Gibco,Carlsbad,Calif)中清洗且用胰蛋白 酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Calif)脫附。將細胞收集、離心，且以每毫升1×10 7的細胞濃度再懸浮於3%(v/v)FBS於PBS中。將一百微升等分遞送至錐形管中。細胞內抗原經染色之細胞係用Perm/Wash緩衝液(BD Pharmingen,San Diego,Calif)穿透。將抗體按製造商規範添加至等分中且將細胞在4℃下於黑暗中培養30分鐘。在培養之後，將細胞用PBS清洗且離心以移除過量抗體。將需要二級抗體之細胞再懸浮於100微升3% FBS中。按製造商規範添加二級抗體且將細胞在4℃下於黑暗中培養30分鐘。在培養之後，將細胞用PBS清洗且離心以移除過量二級抗體。將經清洗之細胞再懸浮於0.5毫升PBS中且藉由流動式細胞測量術分析。使用以下抗體：氧化LDL受體1(sc-5813；Santa Cruz,Biotech)、GROa(555042；BD Pharmingen,Bedford,Mass.)、小鼠IgG1κ(P-4685及M-5284；Sigma)、驢抗山羊IgG(sc-3743；Santa Cruz,Biotech.)。流動式細胞測量術分析係用FACScalibur^TM(Becton Dickinson San Jose,Calif.)來執行。

結果

在來自衍生自人類胎盤、成體及新生兒纖維母細胞與間葉幹細胞(MSC)之細胞的cDNA上所執行之針對選定「簽名」基因之即時PCR之結果指出，氧化LDL受體及凝乳酶兩者在胎盤衍生細胞中相較於其他細胞以較高水準表現。獲自即時PCR之數據係藉由AACT方法分析且以對數標度之形式表達。臍衍生細胞中內質網蛋白與氧化LDL受體表現水準相較於其他細胞為較高的。在產後 衍生細胞與對照組之間未發現CXC配體3及GCP-2之表現水準有顯著差異。即時PCR之結果係藉由傳統PCR確認。PCR產物之定序進一步驗證這些觀察。使用上表9-1中所列舉之傳統PCR CXC配體3引子，發現產後衍生細胞與對照組之間CXC配體3之表現水準沒有顯著差異。

產後細胞介素IL-8之生產在經生長培養基培養及經血清饑餓培養之產後衍生細胞兩者中均提高。所有即時PCR數據皆用傳統PCR及藉由定序PCR產物來驗證。

當檢測生長於無血清培養基中之細胞的上清液中IL-8之存在時，最高量在衍生自臍細胞及胎盤細胞之一些分離株之培養基中偵測出(表9-2)。在衍生自人類皮膚纖維母細胞之培養基中未偵測出IL-8。

亦藉由FACS分析檢測胎盤衍生細胞的氧化LDL受體、GCP-2及GROα之生產。經測試細胞為GCP-2陽性。此方法未偵測到氧化LDL受體及GRO。

亦藉由免疫細胞化學分析測試胎盤衍生細胞之選定蛋白質之生產。在分離後(繼代0)，立即將衍生自人類胎盤之細胞用4%多聚甲醛固定且暴露於針對六種蛋白質之抗體：馮威里氏因子、CD34、細胞角蛋白18、肌間線蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、及波形蛋白。經染色細胞呈現α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白陽性。此模式直到繼代11仍保留。在繼代0時僅一些細胞(<5%)為細胞角蛋白18染色陽性。

衍生自人類臍帶之細胞在繼代0時藉由免疫細胞化學分析探查到選定蛋白質之生產。在分離後(繼代0)，立即將細胞用4%多聚甲醛固定且暴露於針對六種蛋白質之抗體：馮威里氏因子、CD34、細胞角蛋白18、肌間線蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、及波形蛋白。臍衍生細胞為α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白陽性，其中染色模式直到繼代11仍一致。

概述：對於以下四種基因，已確立藉由微陣列與PCR(即時及傳統兩者)所量測之基因表現水準之間的一致性：氧化LDL受體1、凝乳酶、內質網蛋白、及IL-8。這些基因之表現在PPDC中的mRNA水準上受到差別調節，其中IL-8在蛋白質水準上亦受差別調節。藉由FACS分析，在衍生自胎盤之細胞中的蛋白質水準上未偵測出氧化LDL受體之存在。藉由FACS分析，GCP-2及CXC 配體3於胎盤衍生細胞中在mRNA水準上之差別表現未經確認，但是在蛋白質水準上偵測出GCP-2。儘管此結果未由最初獲自微陣列實驗之數據反映出，但是此可能由於方法之靈敏度不同所致。

在分離後(繼代0)，立即染色衍生自人類胎盤之細胞呈現α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白陽性。此模式亦在繼代11的細胞中觀察到。波形蛋白及α-平滑肌肌動蛋白表現可在繼代(在生長培養基中及在這些程序中所利用之條件下)細胞中保留。在繼代0之衍生自人類臍帶之細胞係經探查α-平滑肌肌動蛋白及波形蛋白之表現，且兩者皆為陽性。此染色模式直到繼代11仍保留。

實例10 產後衍生細胞之體外免疫評估

體外評估產後衍生細胞(PPDC)之免疫特徵以預測這些細胞在體內移植後可能引發之免疫反應(若有的話)。藉由流動式細胞測量術檢定PPDC中HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86、及B7-H2之存在。這些蛋白質係由抗原呈現細胞(APe)表現且為純真CD4+T細胞之直接刺激所需(Abbas及Lichtman,CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY，第5版(2003)Saunders,Philadelphia，第171頁)。亦藉由流動式細胞測量術分析細胞系中HLA-G(Abbas及Lichtman,2003，見前文)、CD 178(Coumans，等人，(1999)Journal of Immunological Methods 224,185-196)、及PD-L2(Abbas及Lichtman,2003，見前文；Brown, 等人(2003)The Journal of Immunology,170：1257-1266)之表現。認為存在於胎盤組織中的細胞所表現之這些蛋白質媒介子宮內胎盤組織之免疫豁免狀態。為了預測胎盤與臍衍生細胞系於體內引發免疫反應之程度，於單向混合淋巴球反應(MLR)中測試細胞系。

方法及材料

細胞培養：於用2%明膠(Sigma,St.Louis,Mo.)塗布之T75培養瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)中之含有青黴素/鏈黴素之生長培養基中培養細胞至長滿。

抗體染色：將細胞於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(Gibco,Carlsbad,Calif)中清洗且用胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Carlsbad,Mo.)脫附。將細胞收集、離心，且以每毫升1×10⁷的細胞濃度再懸浮於3%(v/v)FBS於PBS中。按製造商規範將抗體(表10-1)添加至一百微升細胞懸浮液中且在4℃下於黑暗中培養30分鐘。在培養之後，將細胞用PBS清洗且離心以移除未結合的抗體。將細胞再懸浮於五百微升PBS中且使用FACSCalibur^TM儀器(Becton Dickinson,San Jose,Calif.)藉由流動式細胞測量術分析。

混合淋巴球反應：將標記為細胞系A之繼代10臍衍生細胞與標記為細胞系B之繼代11胎盤衍生細胞之凍存小瓶於乾冰上送至CTBR(Senneville,Quebec)以使用CTBR SOP No.CAC-031進行混合淋巴球反應。自多個男性及女性自願捐贈者收集周邊血液單核細胞(PBMC)。用絲裂黴素C處理刺激物(捐贈者)同種異體PBMC、自體PBMC、及產後細胞系。將自體及經絲裂黴素C處理之刺激物細胞添加至回應物(接受者)PBMC且培養4天。在培養之後，將[³H]-胸苷添加至各樣本中且培養18小時。在收集細胞之後，萃取放射性標記DNA，且使用閃爍計數器量測[³H]-胸苷併入。

同種異體捐贈者刺激指數(SIAD)係經計算為：接收者之平均增生加上經絲裂黴素C處理之同種異體捐贈者之平均增生除以接收者之基線增生。PPDC刺激指數係經計算為：接收者之平均增生加上經絲裂黴素C處理之產後細胞系之平均增生除以接收者之基線增生。

結果

混合淋巴球反應(胎盤衍生細胞)：七個人類自願血液捐贈者係經篩選以識別出在與其他六個血液捐贈者進行混合淋巴球反應時會展現穩固增生反應的單一同種異體捐贈者。此捐贈者係經選擇為同種異體陽性對照組捐贈者。剩餘六個血液捐贈者係選擇 為接受者。將同種異體陽性對照組捐贈者及胎盤衍生細胞系用絲裂黴素C處理且與六個個別同種異體接收者培養於混合淋巴球反應中。反應係使用兩個細胞培養盤重複三次執行，每盤具有三個接收者(表10-2)。平均刺激指數之範圍為1.3(盤2)至3(盤1)，且同種異體捐贈者陽性對照組之範圍為46.25(盤2)至279(盤1)(表10-3)。

混合淋巴球反應(臍衍生細胞)：六個人類自願血液捐贈者係經篩選以識別出在與其他五個血液捐贈者進行混合淋巴球反應時會展現穩固增生反應的單一同種異體捐贈者。此捐贈者係經選擇為同種異體陽性對照組捐贈者。剩餘五個血液捐贈者係選擇為接受者。將同種異體陽性對照組捐贈者及胎盤細胞系用絲裂黴素C處理且與五個個別同種異體接收者培養於混合淋巴球反應中。反應係使用兩個細胞培養盤重複三次執行，每盤具有三個接收者(表10-4)。平均刺激指數之範圍為6.5(盤1)至9(盤2)，且同種異體捐贈者陽性對照組之範圍為42.75(盤1)至70(盤2)(表10-5)。

抗原呈現細胞標記(胎盤衍生細胞)：藉由流動式細胞測量術所分析之胎盤衍生細胞之直方圖顯示HLA-DR,DP,DQ、CD80、CD86、及B7-H2之陰性表現，如藉由與IgG對照組一致的螢光值所說明，這表示胎盤細胞系缺乏直接刺激CD4+T細胞所需之細胞表面分子。

免疫調節標記(胎盤衍生細胞)：藉由流動式細胞測量術所分析之胎盤衍生細胞之直方圖顯示PD-L2之陽性表現，如藉由相對於IgG對照組螢光值增加所說明，以及CD178及HLA-G之陰性表現，如藉由與IgG對照組一致的螢光值所說明。

抗原呈現細胞標記(臍衍生細胞)：藉由流動式細胞測量術所分析之臍衍生細胞之直方圖顯示HLA-DR,DP,DQ、CD80、CD86、及B7-H2之陰性表現，如藉由與IgG對照組一致的螢光值 所說明，這表示臍細胞系缺乏直接刺激CD4+T細胞所需之細胞表面分子。

免疫調節細胞標記(臍衍生細胞)：藉由流動式細胞測量術所分析之臍衍生細胞之直方圖顯示PD-L2之陽性表現，如藉由相對於IgG對照組螢光值增加所說明，以及CD178及HLA-G之陰性表現，如藉由與IgG對照組一致的螢光值所說明。

概述：在用胎盤衍生細胞系進行之混合淋巴球反應中，平均刺激指數之範圍為1.3至3，且同種異體陽性對照組之平均刺激指數之範圍為46.25至279。在用臍衍生細胞系進行之混合淋巴球反應中，平均刺激指數之範圍為6.5至9，且同種異體陽性對照組之平均刺激指數之範圍為42.75至70。胎盤及臍衍生細胞系對於刺激蛋白質HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86、及B7-H2之表現為陰性，如藉由流動式細胞測量術所量測。胎盤及臍衍生細胞系對於免疫調節蛋白質HLA-G及CD178之表現為陰性且對於PD-L2之表現為陽性，如藉由流動式細胞測量術所量測。同種異體捐贈者PBMC含有表現HLA-DR,DQ、CD8、CD86、及B 7-H2之抗原呈現細胞，從而允許純真CD4+T細胞之刺激。胎盤及臍衍生細胞上不存在直接刺激純真CD4+ T細胞所需之抗原呈現細胞表面分子及存在免疫調節蛋白質PD-L2，可說明於MLR中相較於同種異體對照組，這些細胞所展現之刺激指數較低。

實例11 由產後衍生細胞分泌之營養因子

對於來自胎盤及臍衍生細胞之選定營養因子的分泌係經量測。所偵測之選定因子包括：(1)已知具有血管生成活性之因子，諸如肝細胞生長因子(HGF)(Rosen等人(1997)Ciba Found.Symp.212：215-26)、單核細胞趨化蛋白質1(MCP-1)(Salcedo等人(2000)Blood 96；34-40)、介白素-8(IL-8)(Li等人(2003)J.Immunol.170：3369-76)、角質細胞生長因子(KGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)(Hughes等人(2004)Ann.Thorac.Surg.77：812-8)、基質金屬蛋白酶1(TIMP1)、血管生成素2(ANG2)、血小板衍生生長因子(PDGF-bb)、血小板生成素(TPO)、肝素結合表皮生長因子(HB-EGF)、基質衍生因子1α(SDF-1α)；(2)已知具有神經營養/神經保護活性之因子，諸如腦衍生神經營養因子(BDNF)(Cheng等人(2003)Dev.Biol.258；319-33)、介白素-6(IL-6)、顆粒性細胞趨化蛋白質-2(GCP-2)、轉形生長因子β2(TGFβ2)；及(3)已知具有趨化激素活性之因子，諸如巨噬細胞發炎蛋白質1α(MIP1a)、巨噬細胞發炎蛋白質1β(MIP1b)、單核細胞化學吸引因子-1(MCP-1)、Rantes(調控活化、正常T細胞表現與分泌)、I309、胸腺與活化調控趨化激素(TARe)、伊紅趨素(Eotaxin)、巨噬細胞衍生趨化激素(MDC)、IL-8。

方法及材料

細胞培養物：將胎盤與臍之PPDC以及衍生自人類新生兒包皮之人類纖維母細胞培養於經明膠塗布之T75培養瓶中的具有青黴素/鏈黴素之生長培養基中。將細胞在繼代11時凍存並儲存於液態氮中。在解凍細胞後，將生長培養基加至細胞，接著轉移至15毫升離心管中然後以150 x g離心細胞5分鐘。捨棄上清液。將細胞沉澱物再懸浮於4毫升生長培養基中，然後計數細胞。使細胞以375,000個細胞/75cm²接種於含有15毫升生長培養基之培養瓶中且培養24小時。將培養基更換為無血清培養基(DMEM-低葡萄糖(Gibco)、0.1%(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)、青黴素/鏈黴素(Gibco))歷時8小時。在培養結束時以14,000^xg離心5分鐘來收集無血清條件培養基，然後儲存在-20℃下。

為了要評估各培養瓶中的細胞數目，用PBS清洗細胞然後使用2毫升胰蛋白酶/EDTA脫附。藉由加入8毫升生長培養基來抑制胰蛋白酶活性。將細胞以150xg離心5分鐘。將上清液移除然後將細胞再懸浮於1毫升的生長培養基中。使用血球計估計細胞數目。

ELISA檢定：使細胞在37℃下生長於5%二氧化碳與大氣氧氣中。亦使胎盤衍生細胞(批次101503)生長於5%氧氣或β-巰基乙醇(BME)中。各細胞樣本所生產之MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1α、GCP-2、IL-8及TGF-β2之量係以ELISA檢定(R&D Systems,Minneapolis,Mn.)來量測。所有檢定皆依據製造商說明書來執行。

SearchLight ^TM多工ELISA檢定：趨化激素(MIP1a、MIP1b、MCP-1、Rantes、1309、TARC、伊紅趨素(Eotaxin)、MDC、IL8)、BDNF與血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGF-bb、TPO、HB-EGF)皆使用SearchLight^TM Proteome Arrays(Pierce Biotechnology Inc.)來量測。Proteome Arrays為多工三明治法ELISA，用於進行每孔二至16種蛋白質的定量量測。藉由將四至16種不同捕捉抗體(capture antibody)以2×2、3×3、或4×4圖案點樣至96孔盤的各孔中而生產陣列。在進行三明治法ELISA程序後，將整個盤成像以捕捉盤上各孔內之各點樣處所產生的化學發光信號。在各點樣處所產生的信號量係正比於原始標準品或樣本中的目標蛋白質之量。

結果

ELISA檢定：MCP-1及IL-6係由胎盤及臍衍生細胞以及皮膚纖維母細胞分泌(表11-1)。SDF-1α係由培養於5% O2中之胎盤衍生細胞及纖維母細胞所分泌。GCP-2及IL-8係由臍衍生細胞及在BME或5% O₂存在下培養之胎盤衍生細胞所分泌。GCP-2亦由人類纖維母細胞所分泌。TGF-β2未由ELISA檢定偵測出。

SearchLight ^TM多工ELISA檢定：TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1b、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC與IL-8皆分泌自臍衍生細胞(表11-2及11-3)。TIMP1、TPO、KGF、HGF、HBEGF、BDNF、MIP1a、MCP-1、RANTES、TARC、Eotaxin、與IL-8皆分泌自胎盤衍生細胞(表11-2及11-3)。未偵測到Ang2、VEGF或PDGF-bb。

實例12 產後衍生細胞之短期神經分化

檢測胎盤與臍衍生細胞(統稱為產後衍生細胞或PPDC)分化成神經譜系細胞之能力。

方法及材料

產後細胞之分離與擴增：將來自胎盤與臍組織之PPDC如實例4中所述分離且擴增。

修改的伍德柏-布萊克(Woodbury-Black)規程(A)：此檢定改編自最初執行以測試骨髓基質細胞之神經誘導潛能(1)之檢定。將臍衍生細胞(022803)P4與胎盤衍生細胞(042203)P3解凍且以5,000個細胞/cm²培養擴增於生長培養基中直到達到次長滿(75%)。隨後將細胞進行胰蛋白酶消化且以每孔6,000個細胞接種於Titretek II玻片(VWR International,Bristol,Conn.)上。在對照組方面，間葉幹細胞(P3；1F2155；Cambrex,Walkersville,Md.)、造骨細胞(P5；CC2538；Cambrex)、脂肪衍生細胞(Artecel，美國專利第6,555,374 B1號)(P6；捐贈者2)與新生兒人類皮膚纖維母細胞(P6；CC2509；Cambrex)亦在相同條件下接種。

最初將所有細胞於DMEM/F12培養基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中擴增4天，該培養基含有15%(v/v)胎牛血清(FBS；Hyclone,Logan,Utah)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF；20奈克/毫升；Peprotech,Rocky Hill,N.J.)、表皮生長因子(EGF；20奈克/毫升；Peprotech)與青黴素/鏈黴素(Invitrogen)。四天後，將細胞於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；Invitrogen)中潤洗且隨後培養於DMEM/F12培養基+20%(v/v)FBS+青黴素/鏈黴素中24小時。24小時後，將細胞用PBS潤洗。隨後使細胞於包含DMEM/FI2(無血清)之誘導培養基中培養1至6小時，該培養基含有200mM丁基化羥基甲氧苯、10μM氯化鉀、5毫克/毫升胰島素、10μM毛喉素(forskolin)、4μM丙戊酸、與2μM氫皮質酮(所有化學品皆來自Sigma,St.Louis,Mo.)。隨後將細胞固定於100%冰冷甲醇中且執行免疫細胞化學(參見以下方法)以評估人類巢蛋白表現。

修改的伍德柏-布萊克規程(B)：將PPDC(臍(022803)P11；胎盤(042203)P11)與成體人類皮膚纖維母細胞(1F1853,P11)解凍且以5,000個細胞/cm²培養擴增於生長培養基中直到達到次長滿(75%)。隨後將細胞進行胰蛋白酶消化且以與(A)類似的密度接種，但是接種至(1)24孔經組織培養物處理之盤(TCP,Falcon brand,VWR International)、(2)TCP孔+2%(w/v)明膠(在室溫下吸附1小時)、或(3)TCP孔+20μg/毫升吸附小鼠層黏蛋白(在37℃下吸附最少2小時；Invitrogen)。

和(A)中完全相同，細胞最初係經擴增且在前述時間框下轉換培養基。如前述在5天6小時固定一組培養物，但此次在室溫下使用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)歷時10分鐘。在第二組培養物中，將培養基移除且轉換成神經前驅擴增培養基(NPE)，其由含有B27(B27補充物；Invitrogen)、L-麩醯胺酸(4mM)、及青黴素/鏈黴素(Invitrogen)之Neurobasal-A培養基(Invitrogen)組成。將NPE培養基用視黃酸(RA；1μM；Sigma)進一步補充。4天後將此培養基移除且在室溫下將培養物用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)固定10分鐘，並針對巢蛋白、GFAP、與TuJ1蛋白質表現進行染色(參見表12-1)。

兩階段分化規程：將PPDC(臍(042203)P11、胎盤(022803)P11)、成體人類皮膚纖維母細胞(P11；1F1853；Cambrex)解凍且以5,000個細胞/cm²培養擴增於生長培養基中直到達到次長滿(75%)。隨後將細胞進行胰蛋白酶消化且以2,000個細胞/cm²接種， 但在補充有bFGF(20奈克/毫升；Peprotech,Rocky Hill,N.J.)與EGF(20奈克/毫升；Peprotech)之NPE培養基[整個培養基組成物進一步稱為NPE+F+E]存在下接種至經層黏蛋白(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.)塗布之24孔盤上。同時，亦將分離自海馬體(P4；(062603))之成鼠神經前驅接種至經層黏蛋白塗布之24孔盤上之NPE+F+E培養基中。將所有培養物保持在此類條件下歷時6天之時期(在該時間期間餵養細胞一次)，此時將培養基轉換成表12-2中所列舉之分化條件再歷時7天之時期。將培養物在室溫下用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)固定10分鐘，且針對大鼠巢蛋白、GF AP、及TuJ1蛋白質表現進行染色。

多重生長因子規程：將臍衍生細胞(P11；(042203))解凍且以5,000個細胞/cm²培養擴增於生長培養基中直到達到次長滿(75%)。隨後將細胞進行胰蛋白酶消化且以2,000個細胞/cm²接種至有NPE+F(20奈克/毫升)+E(20奈克/毫升)存在之24孔經層黏蛋白塗布之盤(BD Biosciences)上。此外，一些細胞含有NPE+F+E+2% FBS或10% FBS。在四天「分化前(pre-differentiation)」條件之後，將所有培養基移除且將樣本轉換成NPE培養基，該培養基補充有聲蝟(SHH；200奈克/毫升；Sigma,St.Louis,Mo.)、FGF8(100奈克/毫升；Peprotech)、BDNF(40奈克/毫升；Sigma)、GDNF(20奈克/毫升；Sigma)、及視黃酸(1μM；Sigma)。在培養基更換後七天，在室溫下將培養物用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)固定10分鐘，且針對人類巢蛋白、GFAP、TuJ1、肌間線蛋白、及α-平滑肌肌動蛋白表現進行染色。

神經前驅共培養規程：將成鼠海馬前驅(062603)以神經球或單一細胞(10,000個細胞/孔)接種至經層黏蛋白塗布之24孔盤(BD Biosciences)上之NPE+F(20奈克/毫升)+E(20奈克/毫升)中。

分開地，將臍衍生細胞(042203)P11與胎盤衍生細胞(022803)P11解凍且以5,000個細胞/cm²培養擴增於NPE+F(20奈克/毫升)+E(20奈克/毫升)中歷時48小時之時期。隨後將細胞進 行胰蛋白酶消化且以2,500個細胞/孔接種至神經前驅之現有培養物上。此時，將現有培養基交換成新鮮培養基。四天後，將培養物在室溫下用冰冷的4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)固定10分鐘，且針對人類核蛋白(hNuc；Chemicon)進行染色(上文表12-1)以識別PPDC。

免疫細胞化學：使用表12-1中所列舉之抗體執行免疫細胞化學。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗培養物然後將其暴露於含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemicon,Temecula,Calif)與0.3%(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白質阻斷液中30分鐘以獲取細胞內抗原。接著在室溫下將一級抗體(稀釋於阻斷液中)施用於培養物歷時1小時。接著，將一級抗體溶液移除，用PBS清洗培養物，然後施用二級抗體溶液(在室溫下1小時)，該二級抗體溶液含有阻斷溶液以及山羊抗小鼠IgG--Texas Red(1：250；Molecular Probes,Eugene,OR)及山羊抗兔IgG-Alexa 488(1：250；Molecular Probes)。隨後清洗培養物，然後施用10微莫耳DAPI(Molecular Probes)10分鐘以可視化細胞核。

在免疫染色後，在Olympus倒立落射螢光顯微鏡(Olympus,Melville,N.Y.)上使用適當螢光濾光片來可視化螢光。在所有情況下，陽性染色代表高於對照組染色的螢光訊號，其中遵照上文所概述的全部程序，除了施加一級抗體溶液。使用數位彩色攝影機與ImagePro軟體(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif)來擷取代表影像。針對三重染色的樣本，一次僅使用一個發射濾光片來拍攝 各影像。接著使用Adobe Photoshop軟體(Adobe,San Jose,Calif)來製備分層合成影像(Layered montage)。

結果

修改的伍德柏-布萊克規程(A)：在於此神經誘導組成物中培養之後，所有細胞型轉形成具有雙極形態及伸長突起之細胞。亦觀察到其他更大的非雙極形態。此外，所誘導之細胞群為巢蛋白染色陽性，巢蛋白為多潛能神經幹細胞與前驅細胞之標記。

修改的伍德柏-布萊克規程(B)：當在組織培養塑膠(TCP)盤上重複時，未觀察到巢蛋白表現，除非將層黏蛋白預吸附至培養物表面。為進一步評估巢蛋白表現細胞是否可隨後繼續產生成熟神經元，將PPDC與纖維母細胞暴露於NPE+RA(1μM)中，RA為已知可誘導神經幹細胞與前驅細胞分化成此類細胞(2,3,4)之培養基組成物。將細胞針對TuJ1(不成熟與成熟神經元之標記)、GFAP(星狀細胞之標記)、及巢蛋白進行染色。在此類條件下未偵測出TuJ1，也未觀察到具有神經元形態之細胞。此外，PPDC不再表現巢蛋白及GF AP，如藉由免疫細胞化學所判定。

兩階段分化：將臍與胎盤PPDC分離株(以及分別作為陰性及陽性對照組細胞型之人類纖維母細胞與嚙齒動物神經前驅)接種於經層黏蛋白(神經促進)塗布之盤上且暴露於已知促進神經前驅分化成神經元與星狀細胞之13種不同生長條件(與兩種對照組條件)。此外，添加兩種條件以檢測GDF5與BMP7對PPDC分化之 影響。一般而言，採取兩步驟分化方式，其中首先將細胞放置於神經前驅擴增條件中歷時6天之時期，接著放置於全分化條件歷時7天。在形態學上，臍與胎盤衍生細胞兩者在此程序之整個時程皆展現細胞形態之基本改變。然而，未觀察到神經元或星狀細胞形狀之細胞，除了在對照組、神經前驅接種之條件中。免疫細胞化學(對人類巢蛋白、TuJ1、與GFAP為陰性)確認形態學之觀察。

多重生長因子：在暴露於各種神經分化劑一週之後，將細胞針對指示神經前驅(人類巢蛋白)、神經元(TuJ1)、與星狀細胞(GFAP)之標記進行染色。在第一階段中生長於不含血清之培養基的細胞具有與該些含血清(2%或10%)之培養基中的細胞不同之形態，指出潛在的神經分化。特定言之，在將臍衍生細胞暴露於EGF與bFGF，接著暴露於SHH、FGF8、GDNF、BDNF、與視黃酸之兩步程序之後，細胞顯示類似於所培養的星狀細胞之形態的伸長突起。當2% FBS或10% FBS包括在分化之第一階段中時，細胞數目增加且細胞形態與高密度對照組培養物無異。人類巢蛋白、TuJ1、或GFAP的免疫細胞化學分析未證明潛在的神經分化。

神經前驅與PPDC共培養：PPDC係經接種至兩天前接種於神經擴增條件(NPE+F+E)中的大鼠神經前驅之培養物上。儘管經接種之PPDC之視覺確認證明這些細胞係以單一細胞接種，但是接種後4天(總計6天)的人類特異性核染色(hNuc)顯示，其趨向於捲成球狀(ball up)且避免與神經前驅接觸。此外，當PPDC附著時，這些細胞展開且似乎受到大鼠來源的分化神經元之神經支配， 表示PPDC可能已分化成肌細胞。此觀察係基於在相位差顯微鏡下之形態。另一觀察為，一般大型細胞本體(大於神經前驅)擁有類似神經前驅之形態，其中薄突起以多個方向跨出。hNuc染色(發現於一半的細胞核中)顯示，在一些情況下，這些人類細胞可與大鼠前驅融合且採取其表型。僅含有神經前驅之對照組孔相較於含有臍或胎盤PPDC之共培養孔，具有較少總前驅及明顯分化之細胞，此進一步表示，臍與胎盤衍生細胞兩者均影響神經前驅之分化及行為，其作用係藉由釋放趨化激素與細胞介素，或藉由接觸媒介作用。

概述：進行多個規程以判定PPDC分化成神經譜系細胞之短期潛能。這些包括形態學之相位差成像與針對巢蛋白、TuJ1、及GFAP(分別為與多潛能神經幹細胞及前驅細胞、不成熟及成熟神經元、及星狀細胞相關聯的蛋白質)之免疫細胞化學之組合。

實例13 產後衍生細胞之長期神經分化

評估臍與胎盤衍生細胞(統稱為產後衍生細胞或PPDC)進行長期分化成神經譜系細胞之能力。

方法及材料

PPDC之分離與擴增：如先前實例中所述將PPDC分離與擴增。

PPDC細胞解凍與接種：將先前生長於生長培養基中之PPDC冷凍等分(臍(022803)P11；(042203)P11；(071003)P12；胎盤(101503)P7)解凍且以5,000個細胞/cm 2接種於經層黏蛋白(BD,Franklin Lakes,N.J.)塗布之T-75培養瓶中之含有B27(B27補充物，Invitrogen)、L-麩醯胺酸(4mM)、及青黴素/鏈黴素(10毫升)之Neurobasal-A培養基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)，其組合在本文中稱為神經前驅擴增(NPE)培養基。將NPE培養基用bFGF(20奈克/毫升，Peprotech,Rocky Hill,N.J.)及EGF(20奈克/毫升，Peprotech,Rocky Hill,N.J.)進一步補充，本文稱為NPE+bFGF+EGF。

對照組細胞接種：此外，將成體人類皮膚纖維母細胞(P11,Cambrex,Walkersville,Md.)與間葉幹細胞(P5,Cambrex)解凍且以相同細胞接種密度接種於經層黏蛋白塗布之T-75培養瓶中之NPE+bFGF+EGF中。作為進一步對照組，使纖維母細胞、臍與胎盤PPDC生長於生長培養基中歷時所有培養物所指定的時期。

細胞擴增：每週將所有培養物之培養基用新鮮培養基替換一次且觀察細胞之擴增。大致上，各培養物由於在NPE+bFGF+EGF中生長受限，在一個月期間內僅繼代一次。

免疫細胞化學：在一個月期間之後，將所有培養瓶在室溫下用冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)固定10分鐘。使用針對TuJ1(BIII微管蛋白；1：500；Sigma,St.Louis,Mo.)及GFAP(膠細胞纖維酸性蛋白質；1：2000；DakoCytomation,Carpinteria,Calif.)之 抗體執行免疫細胞化學。簡言之，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗培養物然後將其暴露於含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif.)與0.3%(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白質阻斷液中30分鐘以獲取細胞內抗原。接著在室溫下將一級抗體(稀釋於阻斷液中)施用於培養物歷時1小時。接著，將一級抗體溶液移除，用PBS清洗培養物，然後施用二級抗體溶液(在室溫下1小時)，該二級抗體溶液含有阻斷劑以及山羊抗小鼠IgG--Texas Red(1：250；Molecular Probes,Eugene,OR)及山羊抗兔IgG-Alexa 488(1：250；Molecular Probes)。隨後清洗培養物，然後施用10微莫耳DAPI(Molecular Probes)10分鐘以可視化細胞核。

在免疫染色後，在Olympus倒立落射螢光顯微鏡(Olympus,Melville,N.Y.)上使用適當螢光濾光片來可視化螢光。在所有情況下，陽性染色代表高於對照組染色的螢光訊號，其中遵照上文所概述的全部程序，除了施加一級抗體溶液。使用數位彩色攝影機與ImagePro軟體(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif.)來擷取代表影像。針對三重染色的樣本，一次僅使用一個發射濾光片來拍攝各影像。接著使用Adobe Photoshop軟體(Adobe,San Jose,Calif.)來製備分層合成影像(Layered montage)。

結果

NPE+bFGF+EGF培養基延緩PPDC之增生且更改其形態。在接種之後，一亞群之PPDC立即附著至經層黏蛋白塗布之培養瓶。此可能因為細胞隨冷凍/解凍過程變化而死亡或由於新的生長條件。附著的細胞採用不同於在生長培養基中所觀察到的細胞之形態。

臍衍生細胞之殖株表現神經元蛋白質：培養物係於解凍/接種後一個月固定且針對神經元蛋白質TuJ1及GFAP(在星狀細胞中發現之中間絲)進行染色。儘管發現生長於生長培養基中之所有對照組培養物及生長於NPE+bFGF+EGF培養基中之人類纖維母細胞及MSC為TuJ1-/GFAP-，但是在臍與胎盤PPDC中偵測出TuJ1。在具有及不具有類神經元形態之細胞中觀察到表現。所有培養物中皆未觀察到GFAP之表現。表現TuJ1且具有類神經元形態之細胞的百分比小於或等於總族群之1%(n=3個經測試的臍衍生細胞分離株)。儘管未定量，但是TuJ1+且不具有神經元形態之細胞在臍衍生細胞培養物中之百分比高於在胎盤衍生細胞培養物中之百分比。這些結果似乎具有特異性，因為生長培養基中之年齡匹配的對照組不表現TuJ1。

概述：用於自臍衍生細胞產生經分化之神經元(基於TuJ1表現與神經元形態)之方法係經發展。儘管早於一個月的體外培養未檢測出TuJ1之表現，但是很明顯，至少一小族群的臍衍生細 胞可經由預設分化(default differentiation)或經由在暴露於補充有L-麩醯胺酸、鹼性FGF、與EGF之最低培養基一個月的長期誘導而形成神經元。

實例14 用於神經前驅支持之PPDC營養因子

臍與胎盤衍生細胞(統稱為產後衍生細胞或PPDC)經由非接觸依賴性(營養)機制對成體神經幹細胞與前驅細胞存活及分化之影響係經檢測。

方法及材料

成體神經幹細胞與前驅細胞分離：Fisher 344成鼠係藉由CO₂窒息接著頸椎脫位術殺死。使用骨鉗將全部大腦完整移除，且基於在大腦之運動與體感覺區域之後的冠狀切口將海馬體組織解剖(Paxinos,G.& Watson,C.1997.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates)。組織係於含有B27(B27補充物；Invitrogen)、L-麩醯胺酸(4mM；Invitrogen)、及青黴素/鏈黴素(Invitrogen)之Neurobasal-A培養基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中清洗，其組合在本文稱為神經前驅擴增(NPE)培養基。將NPE培養基用bFGF(20奈克/毫升，Peprotech,Rocky Hill,N.J.)及EGF(20奈克/毫升，Peprotech,Rocky Hill,N.J.)進一步補充，本文稱為NPE+bFGF+EGF。

在清洗之後，移除上覆腦膜，且將組織用解剖刀切碎。收集切碎之組織且添加75%總體積之胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)。亦添加DNase(100微升/8毫升總體積，Sigma,St.Louis,Mo.)。接著，使組織/培養基依序通過18號針頭、20號針頭、與最終25號針頭各一次(所有針頭皆來自Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)。將混合物在250g下離心3分鐘。移除上清液，添加新鮮NPE+bFGF+EGF且將團塊再懸浮。使所得細胞懸浮液通過40微米細胞濾器(Becton Dickinson)，接種於經層黏蛋白塗布之T-75培養瓶(Becton Dickinson)或低團簇24孔盤(Becton Dickinson)上，且生長於NPE+bFGF+EGF培養基中直到獲得概述研究所需之足夠細胞數目。

PPDC接種：先前生長於生長培養基中之產後衍生細胞(臍(022803)P12、(042103)P12、(071003)P12；胎盤(042203)P12)係以5,000個細胞/跨孔插入物(transwell insert)(適用24孔盤之大小)接種且於生長培養基中於插入物中生長一週之時期以達成長滿。

成體神經前驅接種：生長為神經球或單一細胞之神經前驅係以大致2,000個細胞/孔之密度接種至經層黏蛋白塗布之24孔盤上之NPE+bFGF+EGF中歷時一天之時期以促進細胞附著。一天後，根據以下方案添加含有產後細胞之跨孔插入物：

a. 跨孔(臍衍生細胞於生長培養基中，200微升)+神經前驅(NPE+bFGF+EGF，1毫升)

b. 跨孔(胎盤衍生細胞於生長培養基中，200微升)+神經前驅(NPE+bFGF+EGF，1毫升)

c. 跨孔(成體人類皮膚纖維母細胞[1 F 1853；Cambrex,Walkersville,Md.]P12於生長培養基中，200微升)+神經前驅(NPE+bFGF+EGF，1毫升)

d. 對照組：單獨神經前驅(NPE+bFGF+EGF，1毫升)

e. 對照組：單獨神經前驅(僅NPE，1毫升)

免疫細胞化學：在共培養物中7天之後，將所有條件在室溫下用冷4%(w/v)多聚甲醛(Sigma)固定10分鐘之時期。使用針對表14-1中所列舉之表位的抗體來執行免疫細胞化學。簡言之，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗培養物然後將其暴露於含PBS、4%(v/v)山羊血清(Chemic on,Temecula,Calif.)與0.3%(v/v)Triton(Triton X-100；Sigma)的蛋白質阻斷液中30分鐘以獲取細胞內抗原。接著在室溫下將一級抗體(稀釋於阻斷液中)施用於培養物歷時1小時。接著，將一級抗體溶液移除，用PBS清洗培養物，然後施用二級抗體溶液(在室溫下1小時)，該二級抗體溶液含有阻斷溶液以及山羊抗小鼠IgG--Texas Red(1：250；Molecular Probes,Eugene,OR)及山羊抗兔IgG-Alexa 488(1：250；Molecular Probes)。隨後清洗培養物，然後施用10微莫耳DAPI(Molecular Probes)10分鐘以可視化細胞核。

在免疫染色後，在Olympus倒立落射螢光顯微鏡(Olympus,Melville,N.Y.)上使用適當螢光濾光片來可視化螢光。在 所有情況下，陽性染色代表高於對照組染色的螢光訊號，其中遵照上文所概述的全部程序，除了施加一級抗體溶液。使用數位彩色攝影機與ImagePro軟體(Media Cybernetics,Carlsbad,Calif.)來擷取代表影像。針對三重染色的樣本，一次僅使用一個發射濾光片來拍攝各影像。接著使用Adobe Photoshop軟體(Adobe,San Jose,Calif.)來製備分層合成影像(Layered montage)。

神經前驅分化之定量分析：海馬神經前驅分化之定量係經檢測。每個條件計數最少1000個細胞，或若更少，則計數該條件中所觀察到的細胞總數。對於給定染色劑為陽性的細胞百分比係藉由將陽性細胞數目除以藉由DAPI(核)染色所判定之細胞總數來評估。

質譜分析及2D凝膠電泳：為了識別獨特的、因共培養而分泌之因子，將在培養物固定之前所取得的條件培養基樣本在-80℃下冷凍隔夜。隨後將樣本施加至超濾自旋裝置(截留MW為30kD)。將滯留物(Retentate)施加至免疫親和層析法(抗Hu-白蛋白；IgY)(免疫親和不將白蛋白自樣本移 除)。藉由MALDI分析濾液。將通過液(pass through)施加至Cibachron Blue親和層析法。藉由SDS-PAGE及2D凝膠電泳分析樣本。

結果

PPDC共培養刺激成體神經前驅分化：在與臍或胎盤衍生細胞培養之後，經共培養之衍生自成鼠海馬體之神經前驅細胞展現沿著中樞神經系統中所有三大譜系的顯著分化。在共培養五天之後清楚觀察到此作用，其中許多細胞發展出複雜突起且喪失屬於前驅細胞分裂表徵之相明亮特徵。相反地，在bFGF及EGF不存在下單獨生長之神經前驅外觀不健康且存活受限。

在程序完成之後，將培養物針對指示未分化幹細胞及前驅細胞(巢蛋白)、不成熟及成熟神經元(TuJ1)、星狀細胞(GFAP)、及成熟寡樹突細胞(MBP)之標記進行染色。沿著所有三種譜系之分化係經確認，儘管對照組條件並未展現顯著分化，如大部分細胞保留巢蛋白陽性染色所證明。儘管臍及胎盤衍生細胞皆誘導細胞分化，但是與胎盤衍生細胞之共培養物中的所有三種譜系之分化程度小於與臍衍生細胞之共培養物中。

與臍衍生細胞共培養之後的分化神經前驅之百分比係經定量(表14-2)。臍衍生細胞顯著提高成熟寡樹突細胞(MBP)之數目(24.0%相較於兩種對照組條件之0%)。此外，共培養提高培養物中GFAP+星狀細胞與TuJ1+神經元的數目(分別為47.2%與 8.7%)。這些結果係經巢蛋白染色之確認，指示在共培養之後喪失前驅狀態(13.4%相較於對照組條件4之71.4%)。

雖然分化似乎亦受成體人類纖維母細胞影響，但是此類細胞無法促進成熟寡樹突細胞之分化，也不能產生可察覺量的神經元。儘管未定量，但是纖維母細胞似乎確實增強神經前驅之生存。

獨特化合物之識別：檢測來自臍及胎盤衍生共培養物之條件培養基，與適當對照組(NPE培養基±I.7%血清，來自與纖維母細胞之共培養的培養基)之差異。潛在之獨特化合物係經識別且自其各自2D凝膠切除。

概述：成體神經前驅細胞與臍或胎盤PPDC之共培養導致該些細胞之分化。此實例中所表現的結果指示，在與臍衍生細胞共培養之後，成體神經前驅細胞之分化尤其突出。特定言之，在臍衍生細胞之共培養物中產生顯著百分比的成熟寡樹突細胞。

實例15 產後衍生細胞之移植

衍生自產後臍及胎盤之細胞可用於再生性治療。對藉由用可生物降解材料將產後衍生細胞(PPDC)移植至SCID小鼠中所生產之組織進行評估。所評估之材料為Vicryl非織物、35/65 PCL/PGA發泡體、及RAD 16自組裝肽水凝膠。

方法及材料

細胞培養：胎盤及臍衍生細胞係生長於經明膠塗布之培養瓶中之生長培養基(DMEM-低葡萄糖(Gibco,Carlsbad Calif.)、15%(v/v)胎牛血清(批號SH30070.03；Hyclone,Logan,Utah)、0.001%(v/v)β巰基乙醇(Sigma,St.Louis,Mo.)、青黴素/鏈黴素(Gibco))中。

樣本製備：將一百萬個存活細胞接種於15微升生長培養基中至5mm直徑、2.25mm厚Vicryl非織物支架(64.33毫克/cc；批號3547-47-1)或5mm直徑35/65 PCL/PGA發泡體(批號3415-53)上。使細胞附著兩小時，之後添加更多生長培養基以覆蓋支架。使細胞於支架上生長隔夜。亦將不具有細胞的支架培養於培養基中。

RAD16自組裝肽(3D Matrix,Cambridge,MA)係以無菌1%(w/v)水溶液之形式獲得，將其與1×10⁶個細胞於10%(w/v)蔗糖(Sigma,St Louis,Mo.)、10mM HEPES於達爾伯克改良培養基(DMEM；Gibco)中以1：1混合，之後立即使用。細胞於RAD 16水凝膠中之最終濃度為1×10⁶個細胞/100微升。

測試材料(N=4/Rx)

a. Vicryl非織物+1×10⁶個臍衍生細胞

b. 35/65 PCL/PGA發泡體+1×10⁶個臍衍生細胞

c. RAD 16自組裝肽+1×10⁶個臍衍生細胞

d. Vicryl非織物+1×10⁶個胎盤衍生細胞

e. 35/65 PCL/PGA發泡體+1×10⁶個胎盤衍生細胞

f. RAD 16自組裝肽+1×10⁶個胎盤衍生細胞

g. 35/65 PCL/PGA發泡體

h. Vicryl非織物

動物製劑：根據動物福利法案(Animal Welfare Act)之現行規定操作及飼養動物。藉由遵守動物福利法規(9 CFR)且符合Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,7th edition中所公布的現行標準來實現對上文公共法案之遵守。

小鼠(小家鼠(Mus Musculus))/Fox Chase SCID/雄性(Harlan Sprague Dawley,Inc.,Indianapolis,Ind.)，5週齡：SCID小鼠之所有操作皆在層流櫃中進行。將小鼠個別稱重且用60毫克/kg KETASET(鹽酸氯胺酮，Aveco Co.,Inc.,Fort Dodge,Iowa)與10毫克/kg ROMPUN(xylazine,Mobay Corp.,Shawnee,Kans.)及鹽水之混合物進行腹膜內注射來麻醉。在導入麻醉之後，使用動物電剪將動物自背頸區域至背腰區域之整個背部的毛髮剃光。隨後將該區域用氯己定二乙酸鹽(chlorhexidine diacetate)刷洗，用醇潤洗，乾燥，然 後用1%有效碘(available iodine)之帶碘化合物(iodophor)水溶液塗抹。將眼科軟膏施加至眼睛以預防在麻醉期間組織乾燥。

皮下移植技術：在小鼠背部做出四個皮膚切口，各大致1.0cm長。兩個頭側位點(cranial site)係橫向地定位於背外側胸腔、手觸摸肩胛骨下邊緣後方約5-mm之區域，其中一個在脊柱左側，另一個在脊柱右側。另外兩個位點係橫向地定位於後薦腰(caudal sacro-Iumbar)處、手觸摸髂骨崤後方約5-mm之臀肌區域，中線兩側各一。根據試驗計劃，將植入物隨機放置於這些位點中。使皮膚與下伏結締組織分離以製成小口袋，將植入物放入(或RAD16為注射入)切口後方約1-cm處。將適當測試材料植入至皮下空間。將皮膚切口用金屬夾封閉。

動物安置：在整個研究時程中，將小鼠個別安置於微型隔離籠中，溫度範圍為64℉至79℉，相對濕度為30%至70%，且保持大致12小時亮/12小時暗循環。將溫度與相對濕度盡可能地保持在所述範圍內。食物由經照射的Pico Mouse Chow 5058(Purina Co.)組成且無限制飲水。

小鼠在其指定期間藉由二氧化碳來進行安樂死。將皮下植入位點連同其上覆皮膚切除且冷凍以用於組織學研究。

組織學：將切除皮膚連同植入物用10%中性緩衝福馬林(Richard-Allan Kalamazoo,Mich.)固定。將樣本連同上覆及相鄰組織由中間對切，使用常規方法用石臘處理及包埋切割表面。使用常 規方法，藉由薄片切片機獲得五微米組織切片且用蘇木精與曙紅(Poly Scientific Bay Shore,N.Y.)染色。

結果

30天後，經植入SCID小鼠皮下之發泡體(無細胞)中有極小的內生長。相反地，含有臍衍生細胞或胎盤衍生細胞之植入發泡體中充滿廣泛的組織。於Vicryl非織物支架中觀察到一些組織內生長。接種臍或胎盤衍生細胞之非織物支架顯示基質沉積及成熟血管增加。

概述：合成性可吸收非織物/發泡體盤(5.0mm直徑×1.0mm厚)或自組裝肽水凝膠係經衍生自人類臍或胎盤的細胞接種，且雙側皮下植入於SCID小鼠之背脊部。結果證明，產後衍生細胞可大幅增加可生物降解支架中高品質的組織形成。

實例16 臍組織衍生細胞中之端粒酶表現

端粒酶的功能是合成端粒重複序列(telomere repeat)，端粒重複序列用來保護染色體完整性並延長細胞的複製壽命(Liu,K，等人，PNAS,1999；96：5147-5152)。端粒酶由兩個組分所組成，即端粒酶RNA模板(hTER)與端粒酶反轉錄酶(hTERT)。端粒酶的調控係由hTERT而非hTER的轉錄來決定。hTERT mRNA的即時聚合 酶連鎖反應(PCR)因而是一種已獲認可的細胞端粒酶活性測定方法。

細胞分離。執行即時PCR實驗以測定人類臍帶組織衍生細胞的端粒酶生產。根據上文所述之實例製備人類臍帶組織衍生細胞。一般而言，得自國家疾病研究交換中心(Philadelphia,Pa.)的臍帶在正常分娩後會經過清洗以去除血液與碎屑然後進行機械解離。隨後將組織在37℃下用包括膠原蛋白酶、分散酶與玻尿酸酶之消化酶培養於培養基中。根據上文實例中所述之方法培養人類臍帶組織衍生細胞。間葉幹細胞與正常皮膚纖維母細胞(cc-2509批號9F0844)係得自Cambrex,Walkersville,Md。多能性人類睪丸胚胎性癌(畸胎瘤)細胞系nTera-2細胞(NTERA-2 cl.Dl)(參見Plaia等人，Stem Cells,2006；24(3)：531-546)係購自ATCC(Manassas,Va.)並且將其根據上文中所述之方法來培養。

總RNA分離。使用RNeasy®套組(Qiagen,Valencia,Ca.)將RNA自細胞萃取出來。用50微升經DEPC處理水將RNA沖提出來然後儲存於-80℃下。使用隨機六聚物以TaqMan®反轉錄試劑(Applied Biosystems,Foster City,Ca.)來反轉錄RNA，反轉錄在25℃下歷時10分鐘、在37℃下歷時60分鐘、且在95℃下歷時10分鐘。將樣本儲存在-20℃下。

即時PCR。使用Applied Biosystems Assays-On-Demand^TM(亦已知為TaqMan® Gene Expression Assays)根據製造商規範(Applied Biosystems)在cDNA樣本上執行PCR。此 商用套組廣泛用來檢定人類細胞中的端粒酶。簡言之，使用7000序列偵測系統(搭載ABI prism 7000 SDS軟體(Applied Biosystems))，將hTert(人類端粒酶基因)(Hs00162669)及人類GAPDH(內部對照組)與cDNA及TaqMan® Universal PCR主混合物混合。熱循環條件初始為50℃歷時2分鐘然後95℃歷時10分鐘，接著進行40次95℃歷時15秒鐘然後60℃歷時1分鐘的循環。依據製造商規範來分析PCR數據。

人類臍帶組織衍生細胞(ATCC存取號PTA-6067)、纖維母細胞及間葉幹細胞係針對hTert及18S RNA來檢定。如表16-1中所示，hTert及因此端粒酶皆未在人類臍帶組織衍生細胞中偵測到。

人類臍帶組織衍生細胞(分離株022803，ATCC存取號PTA-6067)及nTera-2細胞皆經檢定，結果顯示在兩批人類臍帶組織衍生細胞中皆無端粒酶表現，然而畸胎瘤細胞系則顯示高表現水準(表16-2)。

因此，可做出本發明之人類臍組織衍生細胞不表現端粒酶之結論。

本說明書中提及各種專利及其他出版物。這些出版物之各者之全部內容以引用方式併入本文中。

儘管上文已藉由實例與較佳實施例說明本發明之各種態樣，但是應理解，本發明之範疇並不由前文描述限定，而是以下根據專利法原理正確解讀的申請專利範圍來限定。

<110> 哈理斯伊恩(HARRIS,IAN)

<110> 戴尼卡那丁(DEJNEKA,NADINE)

<120> 使用前驅細胞治療眼病狀

<130> JBI5060

<140>

<141> 2015-12-_

<150> 62/088,429

<151> 2014-12-05

<150> 62/126,370

<151> 2015-02-27

<150> 62/220,873

<151> 2015-09-18

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成引子

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成引子

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成引子

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成引子

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成引子

<400> 5

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列說明：合成引子

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列說明：合成引子

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列說明：合成引子

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列說明：合成引子

<400> 9

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 人工序列說明：合成引子

<400> 10

Claims (10)

1. 一種向具有視網膜變性之對象之眼睛投予產後衍生細胞群之方法，其中該細胞群為均質性人類臍帶組織衍生細胞群，其中該等人類臍帶組織衍生細胞係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該細胞群分泌至少一種突觸形成因子，且其中該突觸形成因子係選自TSP-1、TSP-2及TSP-4。
2. 一種誘導視網膜神經元中突觸形成或神經突外生之方法，其包含向對象之眼睛投予均質性人類臍帶組織衍生細胞群，其中該細胞群係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該人類臍帶組織衍生細胞群分泌至少一種突觸形成因子，且其中該突觸形成因子係選自TSP-1、TSP-2及TSP-4。
3. 一種使具有視網膜變性之對象之視網膜神經元中的功能性突觸發育之方法，其包含向該對象之眼睛投予包含均質性人類臍帶組織衍生細胞群之組成物，其中該細胞群係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該人類臍帶組織衍生細胞群分泌至少一種突觸形成因子，且其中該突觸形成因子係選自TSP-1、TSP-2及TSP-4。
4. 一種向具有視網膜變性之對象之眼睛投予人類臍帶組織衍生細胞群之方法，其中該細胞群係分離自實質上不含血液之人類臍帶組織，其中該人類臍帶組織衍生細胞群分泌至少一種突觸形成因子，且其中該突觸形成因子係選自TSP-1、TSP-2及TSP-4。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之方法，其中分離自實質上不含血液之人類臍帶組織之該細胞群能夠在培養物中擴增、具有分化成至少一種神經表型之細胞的潛能、維持在繼代之後之正常核型、且具有以下特徵：a)在培養物中進行40次族群倍增的潛能；b)生產CD10、CD13、CD44、CD73及CD90；c)不生產CD31、CD34、CD45、CD117及CD141；及d)相對於為纖維母細胞、間葉幹細胞或髂骨崤骨髓細胞之人類細胞，增加編碼介白素8與內質網蛋白1(reticulon 1)之基因的表現。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該細胞群為HLA-A、HLA-B、HLA-C陽性，及HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ陰性。
7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之方法，其中該等視網膜神經元係選自由視網膜神經節細胞、光受體(視桿細胞及視錐細胞)、視網膜無軸突細胞、水平細胞或雙極細胞所組成的群組。
8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之方法，其中向該眼睛之投予係選自投予至眼睛之內部或投予於該眼睛後面。
9. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該組成物為醫藥組成物。
10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該醫藥組成物包含醫藥上可接受之載劑。