JP7348892B2 - 眼疾患を予防または治療する組成物及び方法 - Google Patents

Description

本開示は、脂肪由来幹細胞条件培地に関し、特に、眼疾患を予防または治療する脂肪由来幹細胞条件培地に関する。また、本開示は、前記脂肪由来幹細胞条件培地を調製する方法に関する。

ドライアイ症候群（以下、ＤＥＳとも称する）の有病率は増えている。ドライアイは、眼部に不快感を引き起こし、視覚の品質を損なう（１）。ドライアイ症候群の現行の治療方針は、潤滑剤、抗炎症薬、例えば、コルチコステロイドやシクロスポリン、涙点閉鎖術、または自己血清を提供することを含む。涙点閉鎖術は、涙膜損失を軽減するが、涙膜における炎症性サイトカインまたは酵素を増加させる（２）。自己血清滴剤の局所投与は、自然の涙液を擬態している潤滑といくつかの生化学成分を提供する。しかしながら、自己血清の調製及び保存は不便で、ドライアイの症状及び徴候に対する効果が一致しないか、または不足している（３）。従来の治療方法の日常的な実施が理想的ではないため、更なる探究は要求されている。

幹細胞には退化性疾患において魅力的な役割があると信じられ、幹細胞から生成したパラクリン因子が組織再生及び治癒過程を向上させることが報告されている（４～６）。これらの上皮損傷における回復能力及び抗炎症効果も証明されている（７、８）。角膜や結膜上皮損傷及び炎症はドライアイの二つの重要な原因であるため、幹細胞及びパラクリン因子のドライアイに対する効果には更なる研究の価値がある。幹細胞自体には腫瘍特性または抗原特性を持つ可能性があるとは言え、関連技術において、ドライアイを効率的に予防または治療する医薬組成物の開発は解決すべき緊急問題である。

本開示は、必要のある対象の眼部上皮組織疾患を治療する方法であって、治療上有効量の生理活性製剤を前記対象に投与することを含み、前記生理活性製剤は、間葉系幹細胞を獲得すること、前記間葉系幹細胞を培地に培養すること、前記培地を採取すること、及び、採取した培地から３０ｋＤａ未満の画分（fraction）を獲得することにより調製した組成物を含有する、方法を提供する。少なくとも一つの実施態様において、前記培地には、血清及び間葉系幹細胞培養補助剤（mesenchymal stem cell culture adjuvant。以下、ＭＣＡとも称する）が追加されている。いくつかの実施態様において、前記血清は、前記培地において５％～１５％の範囲の濃度で含有されているウシ胎児血清またはヒト血清である。いくつかの実施態様において、前記培地には、約１０％の血清及び前記間葉系幹細胞培養補助剤(ＭＣＡ)が追加されている。いくつかの実施態様において、前記血清（例えば、ＦＢＳ）は、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％の量で、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間または１３２時間追加されている。

少なくとも一つの実施態様において、前記間葉系幹細胞培養補助剤(ＭＣＡ)は、線維芽細胞成長因子－２（以下、ＦＧＦ２とも称する）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（以下、ＮＡＣとも称する）及びＬ－アスコルビン酸－２－ホスフェート（以下、ＡｓＡ２Ｐとも称する）の少なくとも一つを含む。いくつかの実施態様において、前記線維芽細胞成長因子－２は、前記間葉系幹細胞培養補助剤において、５ｎｇ／ｍＬ～１５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で含有されている。いくつかの実施態様において、前記ＦＧＦ２は、前記間葉系幹細胞培養補助剤において、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬまたは１５ｎｇ／ｍＬの濃度で含有されている。

少なくとも一つの実施態様において、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）は、前記間葉系幹細胞培養補助剤（ＭＣＡ）において、１ｍＭ～５ｍＭの範囲の濃度で含有されている。いくつかの実施態様において、前記ＮＡＣは、前記間葉系幹細胞培養補助剤において、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭまたは５ｍＭの濃度で含有されている。

少なくとも一つの実施態様において、前記Ｌ－アスコルビン酸－２－ホスフェート（ＡｓＡ２Ｐ）は、前記間葉系幹細胞培養補助剤（ＭＣＡ）において、０．１ｍＭ～０．５ｍＭの範囲の濃度で含有されている。いくつかの実施態様において、前記ＡｓＡ２Ｐは、前記間葉系幹細胞培養補助剤（ＭＣＡ）において、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭまたは０．５ｍＭの濃度で含有されている。

いくつかの実施態様において、前記ＭＣＡは、約１０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子－２（ＦＧＦ２）、約２ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）及び約０．２ｍＭのＬ－アスコルビン酸－２－ホスフェート（ＡｓＡ２Ｐ）を含む。

少なくとも一つの実施態様において、前記間葉系幹細胞は、前記培地に、少なくとも２継代、例えば、２継代、３継代、４継代、または５継代培養される。

少なくとも一つの実施態様において、前記間葉系幹細胞は、対象から獲得される。いくつかの実施態様において、前記対象は、哺乳動物である。いくつかの実施態様において、前記対象は、ヒトである。いくつかの実施態様において、前記間葉系幹細胞は、前記対象の脂肪組織から獲得される。

少なくとも一つの実施態様において、本開示は、対象から間葉系幹細胞を獲得すること、前記間葉系幹細胞を培地に培養すること、前記培地を採取すること、及び、採取した培地から３０ｋＤａ未満の画分を獲得することにより調製した３０ｋＤａ未満（＜３０ｋＤａ）の画分を含む組成物を提供する。

少なくとも一つの実施態様において、前記採取した培地から、１０ｋＤａ未満（例えば、８ｋＤａ未満、５ｋＤａ未満、３ｋＤａ未満、２ｋＤａ未満または１ｋＤａ未満）の画分を獲得する。

少なくとも一つの実施態様において、本開示は、眼部上皮組織疾患の局所治療のための３０ｋＤａ未満の前記画分を含む前記組成物の使用も提供する。いくつかの実施態様において、前記眼部上皮組織疾患は、ドライアイ症候群である。いくつかの実施態様において、前記ドライアイ症候群は、涙液不足、乾燥空気または加齢の少なくとも一つに起因するものである。

本開示は、必要のある対象のドライアイ症候群を治療する方法であって、治療上有効量の生理活性製剤を前記対象に投与することを含み、前記生理活性製剤は、脂肪由来幹細胞（adipose-derived stem cells。以下、ＡＤＳＣとも称する）を獲得すること、前記ＡＤＳＣを第１の培地に維持すること、前記ＡＤＳＣを第２の培地に培養すること、前記第２の培地を採取すること、及び、前記第２の培地から３０ｋＤａ未満の画分を獲得することにより調製した組成物を含有する、方法を提供する。

いくつかの実施態様において、本開示は、対象から脂肪由来幹細胞を単離すること、前記ＡＤＳＣを間葉系幹細胞維持培地に維持すること、第２～５継代の前記ＡＤＳＣを収集すること、前記ＡＤＳＣを１ｍＭ～５ｍＭのグルタミン、５％～１５％のＦＢＳ及び間葉系幹細胞培養補助剤を追加したフェノールレッド無しのイスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、以下、ＩＭＤＭとも称する）に、３６時間～１３２時間培養して前記脂肪由来幹細胞条件培地（以下、ＡＤＳＣ－ＣＭとも称する）を獲得すること、前記ＡＤＳＣ－ＣＭを採取すること、及び、遠心分離した後に濾過することを含む、脂肪由来幹細胞条件培地の調製方法を提供する。いくつかの実施態様において、前記グルタミンは、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭまたは５ｍＭの量で、また、前記ＦＢＳは、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％の量で、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間または１３２時間追加されている。

本開示の少なくとも一つの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、３０ｋＤａ未満、例えば、２０ｋＤａ未満、１０ｋＤａ未満、８ｋＤａ未満、５ｋＤａ未満、３ｋＤａ未満、２ｋＤａ未満及び１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。

また、本開示は、前記方法により獲得した脂肪由来幹細胞条件培地（ＡＤＳＣ－ＣＭ）であって、３０ｋＤａ未満、例えば、２０ｋＤａ未満、１０ｋＤａ未満、８ｋＤａ未満、５ｋＤａ未満、３ｋＤａ未満、２ｋＤａ未満及び１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む、ドライアイを予防または治療する脂肪由来幹細胞条件培地を提供する。

本開示の少なくとも一つの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、３ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。

また、本開示は、前記方法により獲得した脂肪由来幹細胞条件培地（ＡＤＳＣ－ＣＭ）であって、３ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む、ドライアイを予防または治療する脂肪由来幹細胞条件培地を提供する。

本開示の少なくとも一つの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。

また、本開示は、前記方法により獲得した脂肪由来幹細胞条件培地（ＡＤＳＣ－ＣＭ）であって、１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む、ドライアイを予防または治療する脂肪由来幹細胞条件培地を提供する。

また、本開示は、前記方法により獲得し、かつ、３０ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含有する脂肪由来幹細胞条件培地を、必要のある対象の眼部に投与することを含む、ドライアイを予防または治療する方法を提供する。

また、本開示は、前記方法により獲得し、かつ、３ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含有する脂肪由来幹細胞条件培地を、必要のある対象の眼部に投与することを含む、ドライアイを予防または治療する方法を提供する。

また、本開示は、前記方法により獲得し、かつ、１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含有する脂肪由来幹細胞条件培地を、必要のある対象の眼部に投与することを含む、ドライアイを予防または治療する方法を提供する。

さらに、本開示は、前記方法により獲得し、かつ、３０ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含有する脂肪由来幹細胞条件培地を含む、組成物を提供する。

さらに、本開示は、前記方法により獲得し、かつ、３ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含有する脂肪由来幹細胞条件培地を含む、組成物を提供する。

さらに、本開示は、前記方法により獲得し、かつ、１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含有する脂肪由来幹細胞条件培地を含む、組成物を提供する。

本開示は、添付の図面を参照して以下の実施態様の説明を読むことによって、より完全に理解することができる。

乾燥ストレス研究において、細胞数計測キット－８（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８、以下、ＣＣＫ－８とも称する）分析により評価したヒト角膜上皮細胞（以下、ＨＣＥＣとも称する）の生存率に対する異なる培地調製品の効果を示す図である。ＨＣＥＣは、約８０％コンフルエンスまで成長させ、その後、１０分間空気乾燥させた。乾燥後、前記細胞を異なる培地に移植した。２時間インキュベートした後、前記細胞を前記ＣＣＫ－８分析で計数した。対照群は、空気乾燥処理を受けていないＨＣＥＣを示す。Ｒは、Ｒｅｆｒｅｓｈ Ｐｌｕｓ Ｌｕｂｒｉｃａｎｔ点眼薬を示す。ＩＭは、１０％のウシ胎児血清及びグルタミンを追加したＩＭＤＭを示す。ＩＭＭＣＡは、１０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子－２（ＦＧＦ－２）、２ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン及び０．２ｍＭのＬ－アスコルビン酸－２－ホスフェートを追加したＩＭを示す。ＡＤＳＣ－ＣＭは、脂肪由来間葉系幹細胞の培養により条件づけられたＩＭＭＣＡを示す。ＣＥＭは、角膜上皮細胞成長キット成分を追加した角膜上皮細胞基礎培地を示す。数値は、３回の反復試験の平均値±ＳＥＭとして示す。対照群と比べて、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＣＥＭと比べて、^#Ｐ＜０．０５、^###Ｐ＜０．００１。 乾燥ストレス研究からのＨＣＥＣにおけるＪＵＫ、Ｐ３８及びＥｒｋ１／２遺伝子の発現のウエスタンブロット解析を示す図である。そのうち、Ｐは「リン酸化の」（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）を表し、ｔは「総」（ｔｏｔａｌ）を表す。 環境制御室（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｃｈａｍｂｅｒ、以下、ＣＥＣとも称する）に収容され、異なる点眼薬で治療されたＢＡＬＢ／ｃマウスの涙液体積を示す図である。涙液体積は、ミリメートル単位でフェノールレッド糸により測定した。非乾燥対照群、乾燥対照群、Ｒｅｆｒｅｓｈ群、ＩＭＭＣＡ群及びＡＤＳＣ－ＣＭ群における涙液体積平均を示す。＊は、非乾燥対照群との比較を意味し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。＃は、乾燥対照群との比較を意味し、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１。＆は、ＩＭＭＣＡ群との比較を意味し、＆ｐ＜０．０５、＆＆ｐ＜０．０１、＆＆＆ｐ＜０．００１。％は、Ｒｅｆｒｅｓｈ群との比較を意味し、％ｐ＜０．０５、％％ｐ＜０．０１、％％％ｐ＜０．００１。平均値±ＳＥＭ、Ｎ＝４。０．２％の塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）は一日一回で各目に投与される。 ＢＡＬＢ／ｃマウスのフルオレセイン染色及びローズベンガル染色を示す図である。ＣＥＣからのマウスにおいて、角膜染色が増加した。Ｒ、ＩＭＭＣＡまたはＡＤＳＣ－ＣＭの局所投与は、ローズベンガル染色を逆転させた。フルオレセイン染色の採点は、下記の通り：０＝染色なし；１＝わずかに点状の染色（＜３０箇所）があり；２＝点状の染色（＞３０箇所）があるが、拡散はない；３＝厳重に拡散した染色があるが、陽性プラークなし；及び４＝陽性フルオレセインプラークがある。角膜のローズベンガル染色の採点は、下記の通り：１＝少しの分散している斑点；２＝多数の分散している斑点；及び３＝融合している斑点（最大の点数は９点）。非乾燥対照群と比べて、＊ｐ＜０．０５。乾燥対照群と比べて、＋ｐ＜０．０５。乾燥対照群と比べて、＋＋ｐ＜０．０１。Ｎ＝５。 ＣＥＣ誘発のドライアイモデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける角膜上皮及び角膜上皮のタイトジャンクションバリアの完全性の共焦点顕微鏡試験を示す図である。ＢＦ：明視野。 異なる群の環境制御室誘発のドライアイにおいて、結膜杯細胞の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色の結果を示す図である。図６Ａ：非乾燥対照群。図６Ｂ～６Ｅ：ＣＥＣに置いた乾燥対照群としてのマウス（図６Ｂ）、ならびにＲ（図６Ｃ）、ＩＭＭＣＡ（図６Ｄ）、及びＡＤＳＣ－ＣＭ（図６Ｅ）を局所投与したマウス。倍率：４００Ｘ。スケールバー：２０μｍ。５μｍの切片。 異なる群のＣＥＣ誘発のドライアイの間の結膜杯細胞密度の統計学上の比較を示す図である。＊は、非乾燥対照群との比較を意味し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。＋は、乾燥対照群との比較を意味し、＋ｐ＜０．０５、＋＋＋ｐ＜０．００１。 免疫組織化学分析による、ＣＥＣにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスの結膜上皮における膜結合型ムチンＭＵＣ１６の発現に対する異なる点眼薬の効果を示す図である。ＡＤＳＣ－ＣＭ群における矢印は、結膜上皮細胞を指し示す。倍率：４００Ｘ。スケールバー：５０μｍ。５μｍの切片。 ＣＥＣに収容され、異なる点眼薬で治療されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの角膜の透過型電子顕微鏡の結果を示す図である。図８Ａ：非乾燥対照群。図８Ｂ：乾燥対照群。図８Ｃ：Ｒ。図８Ｄ：ＩＭＭＣＡ。図８Ｅ：ＡＤＳＣ－ＣＭ。倍率：４０，０００Ｘ。スケールバー：５００ｎｍ。 ＣＥＣに収容され、異なる点眼薬で治療されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの角膜の走査型電子顕微鏡の結果を示す図である。図９Ａ：非乾燥対照群。図９Ｂ：乾燥対照群。図９Ｃ：Ｒ。図９Ｄ：ＩＭＭＣＡ。図９Ｅ：ＡＤＳＣ－ＣＭ。倍率：２５，０００Ｘ。 乾燥ストレス研究及び高浸透圧ストレス研究において、ＣＣＫ－８分析により評価したＨＣＥＣの生存率に対する異なる培地調製品及びＡＤＳＣ－ＣＭ画分の効果を示す図である。数値は、３回の反復試験の平均値±ＳＥＭとして示す。対照群と比べて、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＣＥＭと比べて、^#Ｐ＜０．０５、^##Ｐ＜０．０１、^###Ｐ＜０．００１。 乾燥ストレス研究において、ＣＣＫ－８分析により評価したＨＣＥＣの生存率に対する異なる培地調製品及びＡＤＳＣ－ＣＭ画分の効果を示す図である。数値は、３回の反復試験の平均値±ＳＥＭとして示す。対照群と比べて、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＣＥＭと比べて、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１。 乾燥ストレス研究において、ＣＣＫ－８分析により評価したＨＣＥＣの生存率に対する異なる培地調製品及びＡＤＳＣ－ＣＭの０－１ｋＤａ画分の効果を示す図である。数値は、３回の反復試験の平均値±ＳＥＭとして示す。対照群と比べて、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＣＥＭと比べて、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１。 ＣＥＣに収容され、異なるＡＤＳＣ－ＣＭ画分で治療されたマウスの涙液体積を示す図である。各群の涙液体積平均を示す。＊は、非乾燥対照群と比べて、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。＃は、乾燥対照群と比べて、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１。平均値±ＳＥＭ、Ｎ＝４。 異なるＡＤＳＣ－ＣＭ画分で治療されたＣＥＣ誘発のドライアイモデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける角膜上皮及び角膜上皮のタイトジャンクションバリアの完全性の共焦点顕微鏡試験を示す図である。ＢＦ：明視野。 異なるＡＤＳＣ－ＣＭ画分で治療されたＣＥＣ誘発のドライアイモデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける角膜上皮及び角膜上皮のタイトジャンクションバリアの完全性の共焦点顕微鏡試験を示す図である。ＢＦ：明視野。 異なるＡＤＳＣ－ＣＭ画分で治療されたＣＥＣ誘発のドライアイモデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける角膜上皮及び角膜上皮のタイトジャンクションバリアの完全性の共焦点顕微鏡試験を示す図である。ＢＦ：明視野。 異なる群のＣＥＣ誘発のドライアイにおいて、結膜杯細胞のＰＡＳ染色の結果を示す図である。図１７Ａ：非乾燥対照群。図１７Ｂ～１７Ｅ：ＣＥＣに置いた乾燥対照群としてのマウス（図１７Ｂ）、ならびにＡＤＳＣ－ＣＭ（図１７Ｃ）、ＡＤＳＣ－ＣＭ ３０－１００ｋＤａ（図１７Ｄ）、及びＡＤＳＣ－ＣＭ ０－３０ｋＤａ（図１７Ｅ）を使用したマウス。倍率：４００Ｘ。スケールバー：２０μｍ。３μｍの切片。 異なる群のＣＥＣ誘発のドライアイの間の結膜杯細胞密度の統計学上の比較を示す図である。＃は、乾燥対照群と比べて、＃ｐ＜０．０５。 異なる群のＣＥＣ誘発のドライアイにおいて、結膜杯細胞のＰＡＳ染色の結果を示す図である。図１８Ａ：非乾燥対照群。図１８Ｂ～１８Ｇ：ＣＥＣに置いた乾燥対照群としてのマウス（図１８Ｂ）、ならびにＡＤＳＣ－ＣＭ（図１８Ｃ）、ＡＤＳＣ－ＣＭ ＞１０ｋＤａ（図１８Ｄ）、ＡＤＳＣ－ＣＭ ＜１０ｋＤａ（図１８Ｅ）、ＡＤＳＣ－ＣＭ ＞３ｋＤａ（図１８Ｆ）、及びＡＤＳＣ－ＣＭ ＜３ｋＤａ（図１８Ｇ）を使用したマウス。倍率：４００Ｘ。スケールバー：２０μｍ、３μｍの切片。 異なる群のＣＥＣ誘発のドライアイの間の結膜杯細胞密度の統計学上の比較を示す図である。＊は、非乾燥対照群と比べて、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。＃は、乾燥対照群と比べて、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１。 異なる群のＣＥＣ誘発のドライアイにおいて、結膜杯細胞のＰＡＳ染色の結果を示す図である。図１９Ａ：非乾燥対照群。図１９Ｂ～１９Ｆ：ＣＥＣに置いた乾燥対照群としてのマウス（図１９Ｂ）、ならびにＡＤＳＣ－ＣＭ（図１９Ｃ）、ＡＤＳＣ－ＣＭ ０－３ｋＤａ（図１９Ｄ）、ＡＤＳＣ－ＣＭ ０－１ｋＤａ（図１９Ｅ）、及びＩＭＤＭ（図１９Ｆ）を使用したマウス。倍率：４００Ｘ。スケールバー：５０μｍ、３μｍの切片。 異なる群のＣＥＣ誘発のドライアイの間の結膜杯細胞密度の統計学上の比較を示す図である。＊は、非乾燥対照群と比べて、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。＃は、乾燥対照群と比べて、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１。＆は、ＩＭＤＭと比べて、＆ｐ＜０．０５、＆＆ｐ＜０．０１、＆＆＆ｐ＜０．００１。 マウス結膜上皮におけるＭＵＣ１６発現に対する免疫組織化学分析の結果を示す図である。図２０Ａ：非乾燥対照群。図２０Ｂ：乾燥対照群。図２０Ｃ：ＡＤＳＣ－ＣＭ。図２０Ｄ：ＡＤＳＣ－ＣＭの３０－１００ｋＤａ画分。図２０Ｅ：ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３０ｋＤａ画分。倍率：４００Ｘ。スケールバー：２０μｍ、３μｍの切片。データは、ＡＤＳＣ－ＣＭ及びＡＤＳＣ－ＣＭの０－３０ｋＤａ画分で治療した結膜は、他の点眼薬及び乾燥対照群と比べて、より高い結膜ＭＵＣ１６発現があることを示した。矢印は、結膜上皮表面におけるＭＵＣ１６発現を指し示す。 マウス結膜上皮におけるＭＵＣ１６発現に対する免疫組織化学分析の結果を示す図である。図２１Ａ：非乾燥対照群。図２１Ｂ：乾燥対照群。図２１Ｃ：ＡＤＳＣ－ＣＭ。図２１Ｄ：ＡＤＳＣ－ＣＭの＞１０ｋＤａ画分。図２１Ｅ：ＡＤＳＣ－ＣＭの＜１０ｋＤａ画分。図２１Ｆ：ＡＤＳＣ－ＣＭの＞３ｋＤａ画分。図２１Ｇ：ＡＤＳＣ－ＣＭの＜３ｋＤａ画分。倍率：４００Ｘ。スケールバー：２０μｍ、３μｍの切片。データは、ＡＤＳＣ－ＣＭ及びＡＤＳＣ－ＣＭの＜１０ｋＤａ及び＜３ｋＤａ画分で治療した結膜は、他の点眼薬及び乾燥対照群と比べて、より高い結膜ＭＵＣ１６発現があることを示した。矢印は、結膜上皮表面におけるＭＵＣ１６発現を指し示す。 マウス結膜上皮におけるＭＵＣ１６発現に対する免疫組織化学分析の結果を示す図である。図２２Ａ：非乾燥対照群。図２２Ｂ：乾燥対照群。図２２Ｃ：ＡＤＳＣ－ＣＭ。図２２Ｄ：ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３ｋＤａ画分。図２２Ｅ：ＡＤＳＣ－ＣＭの０－１ｋＤａ画分。図２２Ｆ：ＩＭＤＭ。倍率：２００Ｘ。スケールバー：５０μｍ、３μｍの切片。データは、ＡＤＳＣ－ＣＭならびにＡＤＳＣ－ＣＭの０－３ｋＤａ及び０－１ｋＤａ画分で治療した結膜は、ＩＭＤＭ及び乾燥対照群と比べて、より高い結膜ＭＵＣ１６発現があることを示した。 ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３０ｋＤａまたは３０－１００ｋＤａ画分で治療したマウス角膜上皮におけるＭＵＣ４に対する免疫組織化学分析を示す図である。倍率：４００Ｘ。スケールバー：２０μｍ、３μｍの切片。 ＡＤＳＣ－ＣＭの＞１０ｋＤａ、＜１０ｋＤａ、＞３ｋＤａまたは＜３ｋＤａ画分で治療したマウス角膜上皮におけるＭＵＣ４に対する免疫組織化学分析を示す図である。倍率：４００Ｘ。スケールバー：２０μｍ、３μｍの切片。 ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３ｋＤａまたは０－１ｋＤａ画分で治療したマウス角膜上皮におけるＭＵＣ４に対する免疫組織化学分析を示す図である。倍率：４００Ｘ。スケールバー：２０μｍ、３μｍの切片。 ＣＥＣに収容され、異なる点眼薬で治療されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの角膜の走査型電子顕微鏡の結果を示す図である。図２５Ａ：非乾燥対照群。図２５Ｂ：乾燥対照群。図２５Ｃ：ＡＤＳＣ－ＣＭ。図２５Ｄ：ＡＤＳＣ－ＣＭの３０－１００ｋＤａ画分。図２５Ｅ：ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３０ｋＤａ画分。倍率：２５，０００Ｘ。 ＣＥＣに収容され、異なる点眼薬で治療されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの角膜の走査型電子顕微鏡の結果を示す図である。図２６Ａ：非乾燥対照群。図２６Ｂ：乾燥対照群。図２６Ｃ：ＡＤＳＣ－ＣＭ。図２６Ｄ：ＡＤＳＣ－ＣＭの＞１０ｋＤａ画分。図２１Ｅ：ＡＤＳＣ－ＣＭの＜１０ｋＤａ画分。図２６Ｆ：ＡＤＳＣ－ＣＭの＞３ｋＤａ画分。図２６Ｇ：ＡＤＳＣ－ＣＭの＜３ｋＤａ画分。倍率：２５，０００Ｘ。 ＣＥＣに収容され、異なる点眼薬で治療されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの角膜の走査型電子顕微鏡の結果を示す図である。図２７Ａ：非乾燥対照群。図２７Ｂ：乾燥対照群。図２７Ｃ：ＡＤＳＣ－ＣＭ。図２７Ｄ：ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３ｋＤａ画分。図２７Ｅ：ＡＤＳＣ－ＣＭの０－１ｋＤａ画分。図２７Ｆ：ＩＭＤＭ。倍率：２５０，００Ｘ。

下記の実施態様は、本開示を例示するために使用される。当業者は、本開示の明細書に基づいて、本開示の他の態様を予想できる。本開示は、異なる実施態様に記載されるように実施または適用できる。本開示の範疇に反せずに、異なる態様及び適用において、本開示を実施するための実例を修飾及び／または変更できる。

さらに、対象が単一であると特別にまたは明確に限定されていない限り、本明細書で使用されている単数形式である「一つ」（ａ）、「一つ」（ａｎ）及び「前記」（ｔｈｅ）は複数の対象を含むことに留意されたい。文脈がそうでないと明記されていない限り、「または」という用語と「及び／または」という用語は互換に使用できる。

本開示は、必要のある対象のドライアイ症候群を治療する方法であって、治療上有効量の生理活性製剤を前記対象に投与することを含み、前記生理活性製剤は、脂肪由来幹細胞（以下、ＡＤＳＣとも称する）を獲得すること、前記ＡＤＳＣを第１の培地に維持すること、前記ＡＤＳＣを第２の培地に培養すること、前記第２の培地を採取すること、及び、採取した前記第２の培地から３０ｋＤａ未満の画分を獲得することにより調製した組成物を含有する、方法を提供する。

前記ＡＤＳＣを維持及び培養するために、異なる種類の培地が使用されてもよく、当業者により選択されてもよい。少なくとも一つの実施態様において、前記培地は、α最少必須培地（以下、ＭＥＭとも称する）、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、以下、ＤＭＥＭとも称する）、ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、以下、ＲＰＭＩとも称する）培地、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、改良された最少必須培地（ＩＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）及びＡＩＭ－Ｖ培地からなる群から選ばれる。細胞は、増殖のために、ウシ胎児血清または他の成長因子を含む様々な培地に培養してもよい。少なくとも一つの実施態様において、前記細胞は血清が実質上欠乏している培地に移植し、また、投与の前の前記条件培地の調製は様々な手段で行ってもよく、例えば、前記条件培地は、いくつかの条件下で濾過滅菌または濃縮されてもよい。いくつかの実施態様において、前記条件培地は、更なる調製工程を受けて、１００ｋＤａ超え、３０ｋＤａ超え、３ｋＤａ超え、１ｋＤａ超え、１００ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満、１０ｋＤａ未満、５ｋＤａ未満、３ｋＤａ未満、１ｋＤａ未満、０ｋＤａ超えと１００ｋＤａの間、０ｋＤａ超えと３０ｋＤａの間、０ｋＤａ超えと３ｋＤａの間、または０ｋＤａ超えと１ｋＤａの間の範囲のサイズの異なる分子を含む異なる画分を得る。

いくつかの実施態様において、前記条件培地は、医薬製剤製造のための活性成分として使用される。少なくとも一つの実施態様において、前記幹細胞条件培地は、治療薬として単独で投与されてもよい。いくつかの実施態様において、前記投与は、経口投与のための錠剤、カプセル剤あるいはエリキシル剤、直腸内投与のための坐剤、非経口あるいは筋肉内投与のための無菌液あるいは懸濁剤、リポソームあるいはカプセル化製剤、前記治療薬が単独で、または送達剤あるいは媒介物に結合された製剤などの公知の医薬製剤の方式を含んでもよい。本開示の治療実体は、移転、送達、忍容性などの改善を提供するために、製剤に組み込まれている適切な担体、賦形剤及び／または他の剤と共に投与されることが理解され得る。多くの適切な製剤は、全ての薬学化学者に知られている処方集に見つけられる。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、蝋、油、脂質、小胞（例えば、リポフェクチン）を含む脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油型や油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックス含有半固体混合物を含む。前記製剤における活性成分が製剤に不活化されず、かつ、前記製剤と投与経路とは生理的に適合性及び忍容性がある限り、前記混合物のいずれも、本開示による処置及び治療に適している。

いくつかの実施態様において、本開示によって調製した前記組成物は、局所製剤で投与される。局所製剤は、皮膚疾患に関する症状の治療に有用である。例えば、投与の局所形式は、例えば、水性や非水性ゲル、クリーム、複合エマルション、ミクロエマルション、リポソーム、軟膏、水性や非水性溶液、ローション、エアロゾル、皮膚パッチ、炭化水素ベース及び粉末から構成されてもよく、また、賦形剤、例えば、可溶化剤、透過促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール及びアミノ酸）、及び親水性重合体（例えば、ポリカルボフィル及びポリビニルピロリドン）を含んでもよい。少なくとも一つの実施態様において、薬学的に許容される担体は、リポソームまたは経皮促進剤である。本開示の局所製剤は、皮膚科学的に許容される担体、例えば、製剤の他の成分を、これらの成分が皮膚に許容される適用または吸収されるように皮膚に送達可能な物質を含んでもよい。前記担体には、一般的に、治療薬を溶解または分散する溶剤を含み、必要に応じて、一つまたは複数の賦形剤または他の媒介物成分を含む。本開示の局所製剤によれば、有用な担体は、非限定的な例として、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン－１，３－ジオール、アクリレート共重合体、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油、バター、アロエ、タルク、植物性油、植物性ジュース、植物性抽出物、植物性粉末、他の植物性誘導体、ラノリン、尿素、石油製品、タール製品、植物または動物脂肪、植物または動物油、石鹸、トリグリセリド、及びケラチンを含んでもよい。本開示の局所製剤は、本開示の組成物と、当技術分野の公知方法、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１５７７－１５９１，１６７２－１６７３，８６６－８８５（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）及びＧｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｔｏｐｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９７）のような標準的な参照テキストから提供される方法による局所担体とを混合することで調製される。いくつかの実施態様において、本開示の局所製剤には、要望に応じて、保湿剤または湿潤剤、サンスクリーン剤、芳香剤、染料及び／または増粘剤、例えば、パラフィン、ホホバ、ＰＡＢＡ及び蝋、界面活性剤、閉塞剤、吸湿剤、乳化剤、軟化剤、脂質無しの洗剤、酸化防止剤及び親油性剤を添加してもよい。本開示の局所製剤は、皮膚に残り、適用の後ですぐに洗い流されないように設計されてもよい。あるいは、前記局所製剤は、適用の後で所定の時間内に洗い流されるように設計されてもよい。

本開示は、脂肪由来幹細胞条件培地の調製方法であって、対象から脂肪由来幹細胞を単離すること、前記ＡＤＳＣを間葉系幹細胞維持培地に維持すること、第２～５継代の前記ＡＤＳＣを収集すること、前記ＡＤＳＣを１ｍＭ～５ｍＭのグルタミン、５％～１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び間葉系幹細胞培養補助剤（以下、ＭＣＡとも称する）を追加したフェノールレッド無しのイスコフ改変ダルベッコ培地（以下、ＩＭＤＭとも称する）に、３６時間～１３２時間培養して脂肪由来幹細胞条件培地を獲得すること、前記ＡＤＳＣ－ＣＭを採取すること、及び、遠心分離した後に濾過することを含み、前記ＭＣＡは、５ｎｇ／ｍＬ～１５ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子－２、１ｍＭ～５ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン（以下、ＮＡＣとも称する）、及び０．１ｍＭ～０．５ｍＭのＬ－アスコルビン酸－２－ホスフェート（以下、ＡｓＡ２Ｐとも称する）を含有する、方法を提供する。

本開示の少なくとも一つの実施態様において、前記ＩＭＤＭは、２ｍＭのグルタミン、１０％のＦＢＳ及びＭＣＡが、７２時間追加されている。

本開示の少なくとも一つの実施態様において、前記ＭＣＡは、５ｎｇ／ｍＬ～１５ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子－２（ＦＧＦ２）、１ｍＭ～５ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）及び０．１ｍＭ～０．５ｍＭのＬ－アスコルビン酸－２－ホスフェート（ＡｓＡ２Ｐ）を含む。本開示のいくつかの実施態様において、前記ＭＣＡは、約１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、約２ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン及び約０．２ｍＭのＬ－アスコルビン酸－２－ホスフェート（ＡｓＡ２Ｐ）を含む。

本開示の少なくとも一つの実施態様において、前記方法は、さらに、濾過後の凍結工程を含む。

本開示の少なくとも一つの実施態様において、前記対象は、哺乳動物である。いくつかの実施態様において、前記対象は、ヒト、ラット、マウス、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、子ウシまたはヒヒである。

本開示の少なくとも一つの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、３０ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。

本開示のいくつかの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、３ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。

本開示のいくつかの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。

また、本開示は、ドライアイを予防または治療する脂肪由来幹細胞条件培地も提供する。本開示の少なくとも一つの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、３０ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。本開示のいくつかの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、３ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。本開示のいくつかの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。

本明細書に使用されている、「ドライアイ」という用語とは、涙欠乏または過度の蒸発による涙膜の障害を意味し、眼瞼間の眼表面に損傷を発生させ、眼部不快感症状に関連している（３７）。

また、本開示は、前記方法により獲得した脂肪由来幹細胞条件培地を対象の眼部に適用することを含む、ドライアイを予防または治療する方法も提供する。少なくとも一つの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、３０ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。本開示のいくつかの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、３ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。本開示のいくつかの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。さらに、本開示は、前記方法により獲得した脂肪由来幹細胞条件培地を含む、医薬組成物を提供する。少なくとも一つの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、３０ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。本開示のいくつかの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、３ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。本開示のいくつかの実施態様において、前記ＡＤＳＣ－ＣＭは、１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む。

以下、実施例は本開示の効果をさらに証明するが、本開示の範囲を限定するものではない。

調製例１：ＡＤＳＣ－ＣＭの単離及び維持
この研究は、台湾仏教慈済総合医院内部審査委員会（ＩＲＢ１０２－１３０）によって認可され、すべての研究対象からインフォームド・コンセントが得られていた。ヒト脂肪組織は、それぞれ２３歳、２８歳、及び３０歳の３人の女性の腹部皮下脂肪から美容用脂肪吸引の際に採取された。間質血管画分細胞は、Ｇｒｉｅｓｃｈｅ及びその同僚によって提供された方法と同様の方法（９）を使用して分離された。最終濃度０．４ｍｇ／ｍＬのＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、ハイブリダイゼーションオーブンで、３７℃、３０°の角度、及び１５ｒｐｍの条件で４５分間酵素消化を行った。消化された脂肪組織は、４００×ｇで１０分間遠心分離し、後のＡＤＳＣ培養用の間質血管画分（ＳＶＦ）ペレットを生成した。ＡＤＳＣ集団を維持及び拡張するために、前述の通り（１０、１１）、細胞をイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｇｉｂｃｏ）、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）及び１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する間葉系幹細胞維持培地に培養した。実験は、第２～５継代（Ｐ２～Ｐ５）のＡＤＳＣを使用して実施した。

調製例２：ＡＤＳＣ－ＣＭの調製
ＡＤＳＣをフラスコごとに１×１０⁶細胞で１５０ｃｍ²の組織培養フラスコ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、３５５００１、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）に播種し、２ｍＭのグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）と、１０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）と、１０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞成長因子－２（ＦＧＦ２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ）及び０．２ｍＭのＬ－アスコルビン酸－２－ホスフェート（ＡｓＡ２Ｐ、Ｓｉｇｍａ）を含有する間葉系幹細胞培養補助剤（ＭＣＡ）とを追加したフェノールレッド無しのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）に培養した。ＡＤＳＣ条件培地（ＡＤＳＣ－ＣＭ）は、７２時間培養の後に収集し、３００×ｇで５分間遠心分離し、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。Ｐ２～Ｐ５のＡＤＳＣからのＡＤＳＣ－ＣＭを収集して混合し、更なる使用のために分注して冷凍した。

調製例３：ＡＤＳＣ－ＣＭの異なるサイズの画分
ＡＤＳＣ－ＣＭの異なるサイズの画分は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離用管またはＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ中空糸フィルターを使用して調製した。具体的には、タンパク質含有画分（ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価）をプールし、Ａｍｉｃｏｎ遠心濃縮機（分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）＝３０ｋＤａ、３ｋＤａ、または１ｋＤａ）で最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように濃縮し、通過画分を収集して最終濃度が１．５ｍｇ／ｍＬになるように濃縮した。サンプルを瞬間冷凍し、必要になるまで－２０℃で保存した。
濃縮条件培地は、細胞数計測キット－８で生細胞数を定量するために、ＩＭＤＭで希釈され、細胞に添加した。
凍結乾燥条件培地試験のために、透析サンプルのアリコート（１ｍＬ）を５ｍＬの凍結乾燥バイアルに調製した後、プログラマブル凍結乾燥機で凍結乾燥した。
熱安定性試験のために、条件培地を５６℃、３０分間または１００℃、３分間インキュベートした。
脂質抽出のために、条件培地は、１：１の比率でヘキサンで３回処理し、下層の水相を収集した。
帯電試験のために、条件培地は、まず、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に透析した。透析後、サンプルをＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陽イオン交換カラムに適用した。前記カラムは、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を使用して６カラム容量で溶出した。

実施例１：ＡＤＳＣ－ＣＭの生体外でのヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ）乾燥ストレス研究
アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）からの通常の一次ＨＣＥＣを、指示に従って維持した。前記ＨＣＥＣを角膜上皮細胞成長キット成分を追加した角膜上皮細胞基礎培地（ＣＥＭ、ＡＴＣＣ）で成長した。前記細胞を３７℃で５％二酸化炭素含有湿潤雰囲気で培養した。前記培養の培地は、２または３日ごとに交換した。この実施例において、第４継代のサブコンフルエントなＨＣＥＣのみが使用された。
ＨＣＥＣに対して修正された生体外乾燥ストレスを使用した（１２－１４）。簡単に言えば、ＨＣＥＣを約８０％コンフルエンスまで成長させた。前記培地を吸引し、そのシャーレを３７℃で１０分間乾燥させた。乾燥ストレスの後、前記細胞を、ＣＥＭ（Ｒｅｆｒｅｓｈ Ｐｌｕｓ Ｌｕｂｒｉｃａｎｔ点眼薬、以下、Ｒと略し、Ａｌｌｅｒｇａｎ、Ｗｅｓｔｐｏｒｔ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、１０％のウシ胎児血清及びグルタミンを追加したＩＭＤＭ（以下、ＩＭと略す）、１０％のＦＢＳ、グルタミン及びＭＣＡを追加したＩＭＤＭ（以下、ＩＭＭＣＡと略し、ＡＤＳＣによって条件づけられていない対照培地として使用）、及びＡＤＳＣ－ＣＭを含む異なる培地に移植した。２時間のインキュベーションの後、前記細胞を、細胞数計測キット－８（ＣＣＫ－８分析、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）で計数し、またはウエスタンブロット解析のために放射性免疫沈降分析（ｒａｄｉｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ、以下、ＲＩＰＡとも称する）緩衝剤に溶解した。
細胞生存率分析のために、上記の異なる培地を１００μＬ含む９６穴型培養プレートで成長させた細胞に、１０μＬのＣＣＫ－８試剤を添加した。細胞を３７℃で３時間インキュベートした。４５０ｎｍにおける吸光度は、マイクロプレートリーダー（ＭｉｃｒｏＱｕａｎｔ、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、 Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）を使用して測定した。結果は、平均値±３回の反復試験の平均値の標準誤差でプロットされた。図１に示すように、生体外でのＨＣＥＣ乾燥ストレスの結果では、１０分間の乾燥が細胞生存率または増殖を有意に低下させることを示した。しかしながら、前記低下は逆転可能であり、また、ＡＤＳＣ－ＣＭはＨＣＥＣにおける乾燥ストレスに対抗する最高の保護効果を有することを示した。
ウエスタンブロット解析のために、前記細胞を氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、氷上でＨａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を含むＲＩＰＡ緩衝剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）に２０分間溶解した。細胞抽出物を１３，２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、実験のために上清を収集した。細胞抽出物のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）を使用し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で、既知濃度のウシ血清アルブミンを標準として、測定した。
５０μｇのタンパク質サンプルを１０％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで分離した後、電気泳動を行ってフッ化ポリビニリデン（以下、ＰＶＤＦとも称する）膜（Ｓｉｇｍａ）にブロッティングした。前記膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（以下、ＰＢＳ－Ｔとも称する）を含むＰＢＳにおける５％脱脂乳で室温で１時間ブロックした後、適切な一次抗体であるウサギモノクローナル抗Ｅｒｋ１／２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １／２）抗体、ウサギモノクローナル抗リン酸化Ｅｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体、ウサギモノクローナル抗Ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ、以下、ＭＡＰＫとも称する）抗体、ウサギモノクローナル抗リン酸化Ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）抗体、ウサギモノクローナル抗ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（ｓｔｒｅｓｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ／ｃ－Ｊｕｎ ＮＨ₂－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ）抗体、Ｓｅｐｐｒｏストリッピング緩衝剤（Ｓｉｇｍａ）で１：１０００に希釈したウサギモノクローナル抗リン酸化ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、または１：５０００に希釈したウサギモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、前記膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）とともに室温で１時間インキュベートした。シグナルは、ＶｉｓＧｌｏｗ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｓｕａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ、台北、台湾）を使用して現像させた。画像は、Ｗｅａｌｔｅｃ ＫＥＴＡイメージングシステムで獲得した。
図２に示す結果から、ＡＤＳＣ－ＣＭは、ＨＣＥＣにおけるリン酸化ＪＵＫ（Ｐ－ＪＵＫ）、リン酸化Ｐ３８（Ｐ－Ｐ３８）及びリン酸化Ｅｒｋ１／２（Ｐ－Ｅｒｋ１／２）の発現を増加させることが明らかになった。

実施例２：ＡＤＳＣ－ＣＭの生体内でのドライアイ動物研究
１．マウスドライアイモデルの確立
すべての実験操作は、慈済大学の実験動物管理使用委員会によって認可された。ＢＡＬＢ／ｃマウスのドライアイ関連眼表面徴候は、前述のように環境制御室（以下、ＣＥＣとも称する）で誘発された（１５）。簡単に言えば、１３週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを相対湿度１０±３％、温度２１～２５℃、気流１０～１５Ｌ／ｍｉｎに監視及び維持したＣＥＣに曝露させた。前記マウスを五つの群に分けた。各実験及び対照群は五匹のマウスからなる。四つの群をドライアイ群としてＣＥＣに保管され、一つの群を正常の非乾燥対照群として湿度７５±３％室に保管された。これら四つのＣＥＣドライアイ群のうち、一つの群は何らかの点眼薬も投与されていないドライアイ対照群とし、残りの三つの群は、それぞれ、下記の点眼薬であるＲ、ＩＭＭＣＡ（ＡＤＳＣによって条件づけられていない対照培地として使用）及びＡＤＳＣ－ＣＭ培地を１日２回で２８日間にわたって投与された。毎回約５０μＬの一滴を与えた。涙液分泌分析は毎週で実施された。
実験の終わり（すなわち、２８日目の終わり）に、眼表面をフルオレセイン染色及びローズベンガル染色によって評価し、角膜の厚さを光干渉断層撮影によって推定した。前記マウスを犠牲にし、免疫組織化学的研究及び電子顕微鏡試験のために、その眼球を保存した。
さらに、データの統計分析は、平均値±平均値の標準誤差として表された。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及び２サンプルのｔ検定を使用して、ＣＣＫ－８分析、フルオレセインやローズベンガル染色、及び結膜杯細胞密度を比較した。ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なされた。

２．涙液分泌分析
涙液分泌は、Ｚｏｎｅ－Ｑｕｉｃｋフェノールレッド糸（昭和薬品化工株式会社、日本）における涙液吸収変色領域の長さで推定した。簡単に言えば、余分な涙を標準時間４秒間で除去し、前記Ｚｏｎｅ－Ｑｕｉｃｋフェノールレッド糸をジュウェラー鑷子で保持して側円蓋に３０秒間置いた。まず、左目を測定し、次に右目を測定した。分析のために両目の平均を算出した。この実施例において、各実験及び対照群は１０個の目（ｎ＝５マウス／群）からなる。
図３に示すように、涙液分泌分析において、ＡＤＳＣ－ＣＭにおけるマウスに分泌された涙液体積は、他の群と比べて、有意差がある。治療の１週間目及び２週間目において、ＡＤＳＣ－ＣＭ群におけるマウスが非乾燥対照群と同等の涙液体積を有することは、ＡＤＳＣ－ＣＭ群が、非乾燥対照群と同じように、涙液体積のレベルを維持できること示す。 ３週間目及び４週間目においても、ＡＤＳＣ－ＣＭ群におけるマウスに分泌された涙液体積は、乾燥対照群及びＩＭＭＣＡで治療されたマウスの涙液体積よりも有意に高い。

３．フルオレセイン染色及びローズベンガル染色分析
９０秒間で結膜嚢に１％フルオレセインを一滴１μＬで適用した後、下記のフルオレセイン染色採点システムを使用して角膜を個別に評価した。０＝染色なし；１＝わずかに点状の染色（＜３０箇所）があり；２＝点状の染色（＞３０箇所）があるが、拡散はない；３＝厳重に拡散した染色があるが、陽性プラークなし；及び４＝陽性フルオレセインプラークがある（１６）。
１５秒間で結膜嚢に１％ローズベンガルを一滴１μＬで滴下した後、下記のようにＶａｎ Ｂｉｊｓｔｅｒｖｅｌｄシステムを使用して角膜のローズベンガル染色を採点した。１＝少しの分散している斑点；２＝多数の分散している斑点；及び３＝融合している斑点（最大の点数は９点）（１７）。
図４に示すように、結果では、乾燥対照群が最も高い染色点数を有するが、Ｒ、ＩＭＭＣＡ、またはＡＤＳＣ－ＣＭの適用によって軽減されたことを示した。ＡＤＳＣ－ＣＭ群の染色は最も軽減され、非乾燥対照群と同様のレベルに戻ったことに留意されたい。

４．免疫蛍光二重染色
眼は１０％ホルムアルデヒドに固定された。パラフィン包埋した後、厚さ３μｍの切片をキシレンで脱ロウし、一連のエタノール溶液で再水和し、蒸留水で２回洗浄した。抗原検索は、ＤＡＫＯ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐＨ＝９（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して９０～９５℃で１５分間行った。切片を、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳにおける１％ＢＳＡによって、室温で少なくとも１時間ブロックした。スライドは、ウサギ抗ＺＯ－１（Ｍｉｄ）（１：１００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、マウス抗オクルディン（１：５０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）またはヤギ抗サイトケラチン１２（１：５０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：８００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ ５５０－結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）またはＤｙｌｉｇｈｔ ５５０－結合ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００、Ｂｅｔｈｙｌ、Ｍｏｎｔｈｏｍｅｒｙ、ＴＸ、ＵＳＡ）とともに室温で１時間インキュベートした。核は、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）で対比染色した。スライドをマウントし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡で検査した。陰性対照群において、一次抗体をブロッキング緩衝剤に置換した。
結果を図５Ａ及び５Ｂに示した。図５Ａは、ＣＥＣにおけるＢＡＬＢ／ｃマウスでは、密着帯－１（以下、ＺＯ－１とも称する）及びオクルディンの発現が抑制されたことを示した。ＲまたはＩＭＭＣＡの局所投与は抑制された発現を軽減したが、ＡＤＳＣ－ＣＭは最良の救済を示した。別の実験では、図５Ｂは、ＣＥＣにおけるＢＡＬＢ／ｃマウスでは、ＺＯ－１及びケラチン１２（以下、Ｋ１２とも称する）の発現も抑制されたことを示した。ＡＤＳＣ－ＣＭの局所投与を受けたマウスは最良の発現を示した。よって、結果、ＣＥＣ誘発のドライアイにおいて、ＺＯ－１、オクルディン、及びＫ１２の発現が低下したことが明らかになった。前記低下は、Ｒ及びＩＭＭＣＡによって部分的に逆転されたが、ＡＤＳＣ－ＣＭ群に最良の発現が認められた。

５．組織学的分析及び免疫組織化学（以下、ＩＨＣとも称する）分析
組織学的分析のために、眼は１０％ホルムアルデヒドに固定され、パラフィンに包埋された。厚さ３μｍの中央垂直面切片を、ヘマトキシリン－エオシンまたは過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。角膜上皮の形態、及び角膜中央部の上皮や間質の厚さは推定され、その平均結膜杯細胞密度はＩｍａｇｅＪ分析で算出された。
図６Ａ～６Ｅに示すように、ＰＡＳ染色の結果は、ＣＥＣ誘発のドライアイにおいて結膜杯細胞が減少したことを示した。Ｒ及びＩＭＭＣＡは減少を部分的に逆転したが、ＡＤＳＣ－ＣＭは杯細胞の密度を最も維持した。図６Ｆは、各群で観察された平均結膜杯細胞密度の間の統計学上の比較を提供する。図６Ｆに示すように、すべての治療群のうち、ＡＤＳＣ－ＣＭは最も高い平均結膜杯細胞密度を有し、また、非乾燥対照群に匹敵する。
ＭＵＣ１６の免疫組織化学について、眼は１０％ホルムアルデヒドに固定された。パラフィン包埋の後、厚さ８μｍの切片をキシレンで脱ロウし、一連のエタノール溶液で再水和し、蒸留水で２回洗浄した。抗原検索は、ＤＡＫＯ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐＨ＝９（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して９０～９５℃で１５分間行った。ＭＵＣ１６染色は、厚さ８μｍの切片にＨｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｍｏｕｓｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（ニチレイ、東京、日本）を使用して行った。前記切片は、マウス抗ＭＵＣ１６（１：５０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベートし、最終的にＨｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ Ｍａｘ ＰＯとともに１０分間インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ反応は、コバルトを含有する３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩（Ｄ－０４２６、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓｅ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）によって現像した。陰性対照群研究は、一次抗体を使用せずに同じく行った。段階的にエタノール及びキシレンで脱水した後、切片をＨｉｓｔｏｋｉｔ（Ｈｅｃｈｔ Ａｓｓｉｓｔｅｎｔ、Ｓｏｎｄｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にマウントし、分析した。
図７に示すように、ＭＵＣ１６の免疫組織化学分析は、非乾燥対照群において結膜のＭＵＣ１６発現が継続的であったが、乾燥対照群、Ｒ群及びＩＭＭＣＡ群において中断されたことを示した。しかしながら、ＣＥＣドライアイマウスにおいて、ＡＤＳＣ－ＣＭの局所投与は、ＭＵＣ１６の継続的発現を維持することに役立つ。さらに、結果は、ＡＤＳＣ－ＣＭ群が最良のＭＵＣ１６発現を有することも示した。ＡＤＳＣ－ＣＭ群における矢印は、結膜上皮細胞を指し示す。

６．透過型電子顕微鏡（以下、ＴＥＭとも称する）分析
新鮮な角膜サンプルは、まず、２％パラホルムアルデヒドに２４時間固定され、次に、０．２Ｍのカコジル酸緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒド溶液に固定され、そして、１％タンニン酸を加えてｐＨ７．０～７．３で２４時間固定され、さらに、０．２Ｍのカコジル酸緩衝液中の１％四酸化オスミウム溶液に１時間の後固定を行った。更なる後固定の後、サンプルは、０．２％酢酸ウラニルで２時間一括染色し、エタノール／アセトンで脱水し、純Ｓｐｕｒｒ樹脂に室温で８時間包埋された。最後に、サンプルを６２℃で４８時間重合させた後、透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ－７５００、株式会社日立製作所、日本）で撮影した。
図８Ａ～８Ｅに示すように、ＴＥＭ研究から、ＣＥＣ誘発のドライアイマウスにおいて角膜上皮細胞間のタイトジャンクション及び指状突起鉗合の減少が明らかになった。ＡＤＳＣ－ＣＭによる治療は、隣接した角膜上皮細胞間の指状突起鉗合及びタイトジャンクションの形成を増加させた。

７．走査型電子顕微鏡（以下、ＳＥＭとも称する）分析
新鮮な角膜は、まず、２％パラホルムアルデヒドに２４時間固定され、次に、０．２Ｍのカコジル酸緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒド溶液、及び１％タンニン酸に、ｐＨ７．０～７．３で、さらに２４時間固定された後、０．２Ｍのカコジル酸緩衝液中の１％四酸化オスミウム溶液に１時間の後固定を行った。サンプルは臨界点乾燥機（株式会社日立製作所、日本）で脱水し、イオンスパッタコーター（株式会社日立製作所、日本）によって白金でコーティングした。最後に、サンプルを走査型電子顕微鏡（株式会社日立製作所、日本）で観察、撮影した。
図９Ａ～９Ｅに示すように、ＳＥＭ研究は、ＣＥＣ誘発のドライアイマウスにおいて角膜上皮の微絨毛が損失したことを証明した。Ｒ及びＩＭＭＣＡの局所投与は角膜上皮の微絨毛を部分的に維持したが、ＡＤＳＣ－ＣＭは微絨毛を乾燥損傷から最もよく保護した。

実施例３：ＡＤＳＣ－ＣＭの異なるサイズの画分を用いた生体外でのヒト角膜上皮細胞（以下、ＨＣＥＣとも称する）乾燥ストレス研究
ＡＤＳＣ－ＣＭの異なるサイズの画分は、上記の調製例３に記載されているように調製した。ＡＤＳＣ－ＣＭの＞７５０ｋＤａ、０－７５０ｋＤａ、３００－７５０ｋＤａ、０－３００ｋＤａ、１００－３００ｋＤａ、０－１００ｋＤａ、３０－１００ｋＤａ、及び０－３０ｋＤａ画分を獲得し、乾燥ストレス及び高浸透圧ストレスの対象にしてＣＣＫ－８分析よって評価した。ＣＣＫ－８分析による乾燥ストレス研究は上記の実施例２で説明した通りである。高浸透圧ストレスのために、ＨＣＥＣを約６０％コンフルエンスまで成長させ、新鮮な培地（３１１ミリオスモル（ｍｉｌｌｉｏｓｍｏｌｅ、以下、ｍＯｓＭとも称する））または９０ｍＭのＮａＣｌ（４８０ｍＯｓＭ）を含む培地で２４時間処理した。高浸透圧処理後、細胞を異なる培地に培養した。２時間のインキュベーション後、前記細胞をＣＣＫ－８分析の対象にした。
結果を図１０Ａ～１０Ｄに示した。ＡＤＳＣ－ＣＭの０－７５０ｋＤａ、０－３００ｋＤａ、０－１００ｋＤａ、及び０－３０ｋＤａ画分は、ＡＤＳＣ－ＣＭの乾燥ストレス及び高浸透圧ストレスから細胞を保護する効果を維持する効果があることを示した。
ＡＤＳＣ－ＣＭにおける活性成分のサイズの分析のために、ＡＤＳＣ－ＣＭの他のサイズの画分を調製した。ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３０ｋＤａ、０－１０ｋＤａ、０－３ｋＤａ、＞３０ｋＤａ、＞１０ｋＤａ、及び＞３ｋＤａ画分を獲得し、上記のように乾燥ストレス研究の対象にしてＣＣＫ－８分析よって評価した。結果は、図１１に示し、ＡＤＳＣ－ＣＭの＞３０ｋＤａ、＞１０ｋＤａ及び＞３ｋＤａ画分よりも、ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３０ｋＤａ、０－１０ｋＤａ、及び０－３ｋＤａ画分の方がより良いＡＤＳＣ－ＣＭの乾燥ストレスから細胞を保護する効果を維持する効果があることを示した。
ＡＤＳＣ－ＣＭの０－１ｋＤａ画分において、同じ乾燥ストレス研究を繰り返してＣＣＫ－８分析によって評価され、その結果を図１２に示した。ＡＤＳＣ－ＣＭの０－１ｋＤａ画分は、依然として乾燥ストレスから細胞を保護する効果があり、ＡＤＳＣ－ＣＭで処理したものと同じような百分率の細胞が維持された。

実施例４：ＡＤＳＣ－ＣＭの異なるサイズの画分を用いた生体内でのドライアイの動物研究
上記調製したＡＤＳＣ－ＣＭ画分は、さらに、生体内での動物研究によってドライアイの治療に対する効果を評価した。上記のように、涙液分泌分析、免疫蛍光二重染色、組織学的分析、免疫組織化学分析（ＩＨＣ）、透過型電子顕微鏡分析（ＴＥＭ）、及び走査型電子顕微鏡分析（ＳＥＭ）を実施した。
図１３Ａ～１３Ｃは、異なるＡＤＳＣ－ＣＭの３０－１００ｋＤａ、０－３０ｋＤａ、＞１０ｋＤａ、＜１０ｋＤａ、＞３ｋＤａ、＜３ｋＤａ、０－３ｋＤａ及び０－１ｋＤａ画分で実施された涙液分泌分析の結果を示した。結果は、ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３０ｋＤａ、＜１０ｋＤａ、＜３ｋＤａ、０－３ｋＤａ及び０－１ｋＤａ画分が乾燥室で処理されたマウスを刺激することができ、非乾燥対照群と同じ程度、またはより多い涙液体積を分泌させることを示した。
さらに、図１４Ａ～１４Ｂ、図１５Ａ～１５Ｂ、及び図１６Ａ～１６Ｂは、それぞれ、ＡＤＳＣ－ＣＭの３０－１００ｋＤａ、０－３０ｋＤａ画分（図１４Ａ～１４Ｂ）、＞１０ｋＤａ、＜１０ｋＤａ、＞３ｋＤａ、＜３ｋＤａ画分（図１５Ａ～１５Ｂ）、０－３ｋＤａ及び０－１ｋＤａ画分（図１６Ａ～１６Ｂ）の免疫蛍光二重染色結果を示し、角膜上皮特異的タンパク質Ｋ１２の発現、ならびにＺＯ－１及びオクルディンの発現によるタイトジャンクションバリアの完全性に対して、異なる点眼薬の効果を分析した。結果から、角膜上皮特異的タンパク質Ｋ１２の発現は、異なる点眼治療に対しては変化なく、乾燥処理されたマウスにおいて、マウス角膜上皮におけるタイトジャンクション関連タンパク質ＺＯ－１及びオクルディンの発現レベル低下が観察されたが、ＡＤＳＣ－ＣＭ、ならびにＡＤＳＣ－ＣＭの０－３０ｋＤａ、＜１０ｋＤａ、＜３ｋＤａ、０－３ｋＤａ及び０－１ｋＤａ画分によって成功に防止できた。
上記のように組織学的分析を実施し、角膜上皮の形態、角膜中央部の上皮や間質の厚さ、及び平均結膜杯細胞密度に対するＡＤＳＣ－ＣＭの異なるサイズの画分の効果を比較した。図１７Ａ～１７Ｆに示すように、ＡＤＳＣ－ＣＭ及びＡＤＳＣ－ＣＭの０－３０ｋＤａ画分は、ＣＥＣ誘発のドライアイで観察された結膜杯細胞の減少を逆転させたが、ＡＤＳＣ－ＣＭの３０－１００ｋＤａ画分では、同じ効果を示さなかった。
図１８Ａ～１８Ｈにおいて、ＡＤＳＣ－ＣＭならびにＡＤＳＣ－ＣＭの＜１０ｋＤａ及び＜３ｋＤａ画分は、ＣＥＣ誘発のドライアイで観察された結膜杯細胞の減少を逆転させたが、ＡＤＳＣ－ＣＭの＞１０ｋＤａ及び＞３ｋＤａ画分では、同じ効果を示さなかった。図１９Ａ～１９Ｇにおいて、ＡＤＳＣ－ＣＭならびにＡＤＳＣ－ＣＭの０－３ｋＤａ及び０－１ｋＤａ画分は、ＣＥＣ誘発のドライアイで観察された結膜杯細胞の減少を逆転させたが、ＩＭＤＭ治療では、同じ効果を示さなかった。
さらに、ＩＨＣ分析は、ＡＤＳＣ－ＣＭの異なるサイズの画分で治療されたマウスのＭＵＣ４及びＭＵＣ１６の発現を調査するために実施した。図２０Ａ～２０Ｅは、ＣＥＣに収容され、ＡＤＳＣ－ＣＭ及び異なるＡＤＳＣ－ＣＭ画分で治療されたマウスのＭＵＣ１６発現の結果を示した。ＡＤＳＣ－ＣＭ（図２０Ｃ）及びＡＤＳＣ－ＣＭの０－３０ｋＤａ画分（図２０Ｄ）は、ＣＥＣ誘発のドライアイでは抑制されることが観察されたＭＵＣ１６の発現を誘発したが、ＡＤＳＣ－ＣＭの３０－１００ｋＤａ画分（図２０Ｅ）では、同じ効果を示さなかった。図２０Ｅにおける矢印は、結膜上皮細胞を指し示す。
図２１Ａ～２１Ｇは、ＣＥＣに収容され、ＡＤＳＣ－ＣＭ及び異なるＡＤＳＣ－ＣＭ画分で治療されたマウスのＭＵＣ１６発現の結果を示した。ＡＤＳＣ－ＣＭ（図２１Ｃ）ならびにＡＤＳＣ－ＣＭの＜１０ｋＤａ画分（図２１Ｄ）及び＜３ｋＤａ画分（図２１Ｅ）で治療されたドライアイは、ＡＤＳＣ－ＣＭの＞１０ｋＤａ画分（図２１Ｆ）及び＞３ｋＤａ画分（図２１Ｇ）よりも、より高いＭＵＣ１６発現を示した。
図２２Ａ～２２Ｆは、ＣＥＣに収容され、ＡＤＳＣ－ＣＭならびにＡＤＳＣ－ＣＭの０－３ｋＤａ及び０－１ｋＤａ画分で治療されたマウスのＭＵＣ１６発現の結果を示した。ＡＤＳＣ－ＣＭ（図２２Ｃ）ならびにＡＤＳＣ－ＣＭの０－３ｋＤａ画分（図２２Ｄ）及び０－１ｋＤａ画分（図２２Ｅ）で治療されたドライアイは、非乾燥対照群及びこれらのＡＤＳＣ－ＣＭで治療されたものと同様のＭＵＣ１６発現を有するが、これらのＩＭＤＭ（図２２Ｆ）で治療されたものは乾燥対照群と同様に少ないＭＵＣ１６発現を有する。
同じように、ＣＥＣに収容され、異なるＡＤＳＣ－ＣＭ画分で治療された動物モデルによってＭＵＣ４発現レベルを調査した。図２３Ａは、ＡＤＳＣ－ＣＭならびにＡＤＳＣ－ＣＭの３０－１００ｋＤａ及び０－３０ｋＤａ画分のＭＵＣ４発現レベルの結果を示し、図２３Ｂは、ＡＤＳＣ－ＣＭならびにＡＤＳＣ－ＣＭの＞１０ｋＤａ、＜１０ｋＤａ、＞３ｋＤａ及び＜３ｋＤａ画分のＭＵＣ４発現レベルの結果を示した。ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３０ｋＤａ、＜１０ｋＤａ及び＜３ｋＤａ画分は、非乾燥対照群及びこれらのＡＤＳＣ－ＣＭで治療されたものと同様のＭＵＣ４発現レベルを示したが、ＭＵＣ４の減少は乾燥対照群ならびにＡＤＳＣ－ＣＭの＞１０ｋＤａ及び＞３ｋＤａ画分で観察された。
図２４は、ＡＤＳＣ－ＣＭならびにＡＤＳＣ－ＣＭの０－３ｋＤａ及び０－１ｋＤａ画分のＭＵＣ４発現レベルの結果を示した。ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３ｋＤａ及び０－１ｋＤａ画分のいずれも、非乾燥対照群及びこれらのＡＤＳＣ－ＣＭで治療されたものと同様のＭＵＣ４発現レベルを示したが、ＩＭＤＭで治療されたマウスは、乾燥対照群で観察されたのと同様のＭＵＣ４発現レベルの低下を示した。
さらに、上記のように、ＣＥＣに収容され、異なるＡＤＳＣ－ＣＭ画分で治療されたマウスを使用してＳＥＭ研究を実施した。図２５Ａ～２５Ｅに示すように、ＣＥＣ誘発のドライアイマウスにおいて、角膜上皮の微絨毛は退化し、損失した（図２５Ｂ）。ＡＤＳＣ－ＣＭの＜３０ｋＤａ画分の局所投与（図２５Ｅ）は、角膜上皮の微絨毛を維持し、ＡＤＳＣ－ＣＭを適用したもの（図２５Ｃ）及び非乾燥対照群と同様の効果を有した。しかしながら、ＡＤＳＣ－ＣＭの３０－１００ｋＤａ画分（図２５Ｄ）では、同じ効果を示さなかった。
同様に、図２６Ａ～２６Ｇは、ＡＤＳＣ－ＣＭの＞１０ｋＤａ、＜１０ｋＤａ、＞３ｋＤａ及び＜３ｋＤａ画分を使用したＳＥＭの結果。ＡＤＳＣ－ＣＭの＜１０ｋＤａ画分（図２６Ｅ）及び＜３ｋＤａ画分（図２６Ｇ）の局所投与は、角膜上皮の微絨毛を維持し、ＡＤＳＣ－ＣＭを適用したもの（図２６Ｃ）及び非乾燥対照群（図２６Ａ）と同様の効果を有した。しかしながら、ＡＤＳＣ－ＣＭの＞１０ｋＤａ画分（図２６Ｄ）及び＞３ｋＤａ画分（図２６Ｆ）で治療されたドライアイでは、ドライアイに誘発された角膜上皮の微絨毛を維持することができなかった。
さらに、図２７Ａ～２７Ｆは、ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３ｋＤａ及び０－１ｋＤａ画分で治療されたドライアイのＳＥＭ結果を示した。ＡＤＳＣ－ＣＭの０－３ｋＤａ画分（図２７Ｄ）及び０－１ｋＤａ画分（図２７Ｅ）のいずれも、非乾燥対照群（図２７Ａ）及びＡＤＳＣ－ＣＭで治療されたもの（図２７Ｃ）で観察されたのと同様の角膜上皮の微絨毛の維持を示したが、ＩＭＤＭで治療されたマウス（図２７Ｆ）は、乾燥対照群（図２７Ｂ）で観察されたのと同様の角膜上皮の微絨毛の損失及び退化を示した。

上記の実施例１～４から、３０ｋＤａ未満、３ｋＤａ未満、または１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含むＡＤＳＣ－ＣＭは、対象におけるドライアイを効率的に治療することが明らかになった。

生体外でのＨＣＥＣ乾燥ストレス研究において、ＨＣＥＣの生存率は、１０分間の乾燥によって低下し、Ｒｅｆｒｅｓｈ、ＩＭＤＭ、またはＩＭＭＣＡによって軽減されなかったが、ＡＤＳＣ－ＣＭならびに３０ｋＤａ未満、３ｋＤａ未満、または１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含むＡＤＳＣ－ＣＭ画分によって有意に救済された。同時に行ったウエスタンブロット解析でも、ＡＤＳＣ－ＣＭに培養したＨＣＥＣのＰ３８及びｐ－Ｅｒｋ１／２の発現が増加することが明らかになった。

乾燥ＣＥＣにおけるマウスは、蒸発がより多いため、角膜のフルオレセイン染色及びローズベンガル染色が多かった。前記染色はＡＤＳＣ－ＣＭ群で最も薄かった。角膜の免疫組織化学的研究でも、ＣＥＣにおけるマウスはタイトジャンクションのマーカーであるＺＯ－１及びオクルディンの発現を有意に減少することが明らかになった。乾燥損傷によるＺＯ－１及びオクルディンの発現減少は、ＡＤＳＣ－ＣＭならびにＡＤＳＣ－ＣＭの３０ｋＤａ未満、３ｋＤａ未満、または１ｋＤａ未満画分の適用によって、ほぼ逆転、またはより良くなった。ＡＤＳＣ－ＣＭ群における角膜上皮は、最も良いＫ１２発現も示し、これは角膜上皮の特性を維持することを意味する。角膜のタイトジャンクションに対するＡＤＳＣ－ＣＭ及びその画分の有益効果は、共焦点免疫組織化学的研究によって明らかにになっただけでなく、ＴＥＭ研究によっても証明された。ＡＤＳＣ－ＣＭによるタイトジャンクションの維持は、角膜上皮が、体液喪失、毒素刺激及び病原体侵入に対するバリアの提供を含む外部環境に対する境界を形成するハウスキーピング機能を実行することに役立てられる。

ＡＤＳＣ－ＣＭ及びその画分は、角膜上皮細胞のタイトジャンクションを保護するだけでなく、結膜杯細胞及び膜結合型ムチンＭＵＣ１６発現も保護した。結膜杯細胞密度は、ＣＥＣマウスにおいて有意に低下したが、Ｒｅｆｒｅｓｈ、ＩＭＭＣＡまたはＡＤＳＣ－ＣＭによって軽減された。ＡＤＳＣ－ＣＭ及びその画分は、前記杯細胞密度を非乾燥マウスよりも高いレベルまで、最も良く増加させた。ＭＵＣ１６発現は、非乾燥対照群において継続的であり、乾燥対照群において中断された。ＡＤＳＣ－ＣＭ及びその画分は、ＭＵＣ１６発現の完全性を維持するのに役立つ。

乾燥損傷は、角膜上皮の微絨毛の損失を引き起こした。ＲｅｆｒｅｓｈまたはＩＭＭＣＡによる潤滑は、乾燥ストレスに引き起こされた微絨毛損失を軽減したが、ＡＤＳＣ－ＣＭ及びその画分は、最も良く微絨毛を維持した。

結論として、本開示は、おそらくＥｒｋ１／２及びＰ３８の活性化によって、乾燥誘発の眼表面損傷に対するＡＤＳＣ－ＣＭの効果を証明した。

本開示は、例示的な実施態様を使用して説明された。しかしながら、本開示の範囲は、開示された実施態様に限定されるものではないことを理解するべき。むしろ、様々な変更及び同様の再構成を含むことを意図している。したがって、特許請求の範囲の範疇は、すべてのこのような変更及び同様の配置を包含するように、最も広い解釈を与えられるべきである。

Claims (12)

1. 必要のある対象のドライアイ症候群を予防または治療するための生理活性製剤を製造する方法であって、
   採取された脂肪組織から間葉系幹細胞を獲得すること、
   前記間葉系幹細胞を培地に培養すること、
   前記培地を採取すること、及び、
   採取した前記培地から１０ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む画分を獲得することを含み、
   前記培地は、血清及び間葉系幹細胞培養補助剤が追加されており、
   前記間葉系幹細胞培養補助剤は、線維芽細胞成長因子－２、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン及びＬ－アスコルビン酸－２－ホスフェートの少なくとも一つを含む、方法。
2. 前記血清は、前記培地において、５％～１５％の範囲の濃度で含有されているウシ胎児血清またはヒト血清である、請求項１に記載の方法。
3. 前記線維芽細胞成長因子－２は、前記間葉系幹細胞培養補助剤において、５ｎｇ／ｍＬ～１５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で含有されている、請求項１に記載の方法。
4. 前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システインは、前記間葉系幹細胞培養補助剤において、１ｍＭ～５ｍＭの範囲の濃度で含有されている、請求項１に記載の方法。
5. 前記Ｌ－アスコルビン酸－２－ホスフェートは、前記間葉系幹細胞培養補助剤において、０．１ｍＭ～０．５ｍＭの範囲の濃度で含有されている、請求項１に記載の方法。
6. 前記画分は、３ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記画分は、１ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記間葉系幹細胞は、前記培地に、少なくとも２継代培養される、請求項１に記載の方法。
9. 前記間葉系幹細胞は、前記対象から獲得された、請求項１に記載の方法。
10. 前記対象は、哺乳動物である、請求項９に記載の方法。
11. 前記対象は、ヒトである、請求項１０に記載の方法。
12. 請求項１に記載の方法によって獲得された前記１０ｋＤａ未満の分子量を有する活性成分を含有する画分を含む、ドライアイ症候群を予防または治療するための医薬組成物。

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