KR20230063845A

KR20230063845A - 줄기세포 배양액 및 이로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20230063845A
Application number: KR1020220110631A
Authority: KR
Inventors: 김윤배; 최은경; 김태명
Original assignee: 주식회사 디자인셀
Priority date: 2021-11-02
Filing date: 2022-09-01
Publication date: 2023-05-09

Abstract

본 발명은 줄기세포 배양액 및 이로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 줄기세포 배양액은 높은 수준으로 엑소좀, 성장인자 및 신경영양인자를 포함하며, 망막 세포의 증식 및 상처 회복을 촉진하고, 산화 스트레스 또는 저산소에 대해 망막 세포를 보호하며, 녹내장 동물모델에서 증가된 안압을 강하시키고, 망막층 및 망막 신경절 세포층의 위축을 정상 수준으로 회복시키며, 망막 신경절 세포 및 신경세포 보호 효과를 나타냄으로써, 안구 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 배양액 및 이로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF OCULAR DISEASES COMPRISING CONDITIONED MEDIA OF STEM CELLS AND EXOSOMES PURIFIED FROM THE CONDITIONED MEDIA}

본 발명은 줄기세포 배양액 및 이로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

안구의 망막은 중추신경계에 속하는 기관으로, 성숙한 망막 세포는 뇌에 존재하는 대부분의 뉴런 세포와 마찬가지로 정상 상태에서는 분열하지 않는다. 따라서, 망막 세포의 기능이 저하되면 시각 기능에 이상이 나타나기 쉬우며, 노화가 빠르게 진행된다. 망막 세포의 기능이 저하되는 가장 큰 원인으로는 산화 스트레스가 가장 잘 알려져 있는데, 안구를 구성하는 망막, 시신경, 광수용체 세포 및 수정체를 포함하는 조직은 일상 생활을 통해 빛, 자외선과 같은 산화적 손상에 꾸준히 노출되기 때문이다. 이러한 산화적 손상에 의해 세포를 구성하는 DNA, 단백질, 지질 등에 변형이 유발되고, 세포 사멸이 유도되면서 안구 노화가 발생한다. 이와 같은 안구 노화는 망막 지도모양 위축증(retinal geographic atrophy), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma) 및 안구건조증(dry eye)과 같은 심각한 안질환을 발생시킨다.

안구의 노화에 의해 발생되는 질환 중 하나인 녹내장은 망막층 및 시신경 위축증의 형태를 나타내면서 망막 신경총 세포를 포함하는 시신경에 생기는 질환으로, 치료되지 않은 녹내장은 영구적인 시력 손상을 가져올 수 있다. 과거에는 정상보다 높은 안압에 의해 시신경 손상 및 이에 다른 시야장애가 초래되는 질환으로 정의되었으나, 최근에는 녹내장성 시신경 손상의 원인으로 높은 안압뿐 아니라 다른 여러 요소에 의해 시신경의 특징적인 변화 및 시야장애가 초래되는 진행형 시신경병증으로 정의된다.

녹내장은 일반적으로 안압조절을 위해 약물치료나 레이저 치료가 진행되는데, 이와 같은 치료에도 불구하고 시야 장애 및 녹내장성 시신경 변화가 계속 진행되는 경우에는 수술적 치료를 진행한다. 그러나, 수술적 치료는 수술 성공률을 높이기 위해 항대사제인 5-FU(5-fluorouracil)이나 MMC(mitomycin) 등을 보조제로 사용하고, 그에 따라 저안압, 여과포 누출, 여과포 관련 감염 등의 수술 합병증이 증가되었다. 이에, 수술적 치료 외에 녹내장을 치료하는 대체 방안이 필요한 실정이다. 관련하여, 대한민국 공개특허 제10-2020-0137499호는 녹내장의 예방 또는 치료용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 특정 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 망막 신경절 세포의 세포사멸을 억제하고, 시신경 유두 조직의 함몰 또는 변성을 억제하며, 망막 신경절 세포층에서의 망막 신경절 세포 소실을 억제할뿐 아니라, 시신경 손상에 의해 과도하게 활성화된 성상교세포(astrocyte) 또는 미세아교세포(microglia)의 활성을 억제함으로써, 녹내장의 치료에 사용될 수 있음을 개시하고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2020-0137499호

본 발명의 목적은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 엑소좀의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 줄기세포 배양액은 높은 수준으로 엑소좀, 성장인자 및 신경영양인자를 포함하며, 망막 세포의 증식 및 상처 회복을 촉진하고, 산화 스트레스 또는 저산소에 대해 망막 세포를 보호하며, 녹내장 동물모델에서 증가된 안압을 강하시키고, 망막층 및 망막 신경절 세포층의 위축을 정상 수준으로 회복시키며, 망막 신경절 세포 및 신경세포 보호 효과를 나타냄으로써, 안구 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포(AMMSC) 또는 상피줄기세포(AMESC)의 정상 배양액(NCM) 또는 엑소좀 풍부 배양액(ERCM)에서 엑소좀의 마커인 CD9의 발현을 확인한 결과 사진(A) 및 엑소좀의 수를 확인한 결과 그래프(B)이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 정상 배양액(NCM) 또는 엑소좀 풍부 배양액(ERCM)에서 성장인자 및 신경영양인자의 발현을 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액이 망막세포의 증식을 촉진시키는 것을 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액이 산화 스트레스에 대해 망막 세포를 보호하는 것을 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액이 저산소에 대해 망막 세포를 보호하는 것을 확인한 결과 사진(A) 및 세포 생존률을 나타낸 그래프(B)이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액이 망막 세포의 상처 회복 효과를 확인한 결과 사진(A) 및 세포 수를 나타낸 그래프(B)이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 녹내장 동물모델을 사용한 실험 디자인을 나타내는 모식도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 양막 유래 중간엽 줄기세포 또는 상피줄기세포의 배양액이 녹내장 동물모델에서 안압을 회복시키는 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 양막 유래 중간엽 줄기세포 또는 상피줄기세포의 배양액이 녹내장 동물모델에서 수축된 망막층을 회복시키는 효과를 확인한 결과 도면(A) 및 망막층의 두께를 나타낸 그래프(B)이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 양막 유래 중간엽 줄기세포 또는 상피줄기세포의 배양액이 녹내장 동물모델에서 수축된 망막 신경절 세포층을 회복시키는 효과를 세포층의 두께(A) 및 세포 수(B)로 확인한 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 양막 유래 중간엽 줄기세포 또는 상피줄기세포의 배양액이 녹내장 동물모델에서 증가된 NeuN 단백질의 발현 수준을 관찰한 도면(A) 및 그래프(B)이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 양막 유래 중간엽 줄기세포 또는 상피줄기세포의 배양액이 녹내장 동물모델에서 증가된 GFAP 단백질의 발현 수준을 관찰한 도면(A) 및 그래프(B)이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에서 양막 유래 중간엽 줄기세포 또는 상피줄기세포의 배양액이 녹내장 동물모델에서 증가된 GS 단백질의 발현 수준을 관찰한 도면(A) 및 그래프(B)이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "줄기세포(stem cell)"는 상대적으로 발생이 덜된 미분화된 세포로서 특정 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력을 기준으로 만능줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell) 또는 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)로 나눌 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 기원이 되는 세포에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell), 성체 줄기세포(adult stem cell) 또는 인간 체세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)로 구분될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 줄기세포는 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 용어, 성체 줄기세포는 성체의 조직 또는 기관에 존재하고, 원하는 세포로 분화가 가능하며 자기복제(self-renew)를 할 수 있는 미분화된 세포를 의미한다. 일례로, 본 발명에 따른 줄기세포는 양막 유래 성체줄기세포일 수 있고, 구체적으로, 상기 양막 유래 성체줄기세포는 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 상피줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 줄기세포 배양액은 낮은 산소 농도하에서 줄기세포를 배양함으로써 수득될 수 있다. 상기 낮은 산소 농도는 통상적인 대기하에서의 평균 산소농도인 약 20%보다 낮은 농도일 수 있다. 구체적으로, 상기 낮은 산소 농도는 10% 이하, 0.1 내지 10%, 0.1 내지 8%, 0.1 내지 5%, 0.1 내지 4%, 1 내지 10%, 1 내지 8%, 1 내지 5%, 1 내지 4%, 2 내지 10%, 2 내지 8%, 2 내지 5% 또는 2 내지 4%일 수 있다. 또한, 상기 배양은 1 내지 80시간, 1 내지 70시간, 1 내지 60시간, 1 내지 50시간, 10 내지 80시간, 10 내지 70시간, 10 내지 60시간, 10 내지 50시간, 20 내지 80시간, 20 내지 70시간, 20 내지 60시간, 20 내지 50시간, 30 내지 80시간, 30 내지 70시간, 30 내지 60시간, 30 내지 50시간, 40 내지 80시간, 40 내지 70시간, 40 내지 60시간 또는 40 내지 50시간 동안 수행될 수 있다.

상기와 같이 배양된 줄기세포 배양액은 통상적인 조건에서 배양된 배양액과 비교하여, 더 높은 수준의 엑소좀을 포함할 수 있다. 즉, 상기 줄기세포 배양액은 엑소좀 풍부 배양액일 수 있다. 상기 용어, "엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM)"은 상기 서술한 바와 같은 특징을 갖는 줄기세포를 배양하여 수득된 배양액을 의미한다. 즉, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 줄기세포 배양액뿐 아니라 이에 포함되는 엑소좀에 의해서도 목적하는 효과를 달성할 수 있다.

상기 용어, "엑소좀(exosome)"은 여러 종류의 세포로부터 분비되는 막 구조의 세포외소포체(extracellular vesicle, EV)를 의미한다. 상기 엑소좀은 다른 세포나 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 기능을 하며, 일반적으로 약 50 내지 200 ㎚의 평균 직경을 가질 수 있다. 상기 엑소좀은 이에 포함되는 마커 단백질을 이용하여 확인할 수 있다. 상기 마커 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 마커 단백질을 포함할 수 있고, 일례로, 상기 마커 단백질은 CD9 단백질일 수 있다.

본 발명에 따른 줄기세포 배양액은 필요에 따라 불순물을 제거하기 위해 여과되거나, 농축될 수 있다. 또한, 상기 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법 또한 통상의 기술분야에 자명하다. 상기 방법은 필요에 따라 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, "안구 질환(ocular disease)"은 안압 변화, 산소 부족, 산화적 스트레스, 고혈당, 안구건조, 감염, 대사장애, 노폐물 축적, 노화 등에 의해 안구를 구성하는 망막, 각막, 시신경, 안검, 수정체 등이 손상됨으로써 발생하는 안질환을 의미한다. 구체적으로, 상기 안구 질환은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 안구 질환을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 안질환은 시신경위축, 녹내장, 눈중풍, 망막혈관폐쇄, 포도막염, 시신경염, 망막염, 각막염, 백내장, 안검염, 시신경유두부종, 시신경척수염 또는 허혈성시신경염일 수 있다.

한편, 상기 용어, "녹내장(glaucoma)"은 망막 및 시신경 위축증의 형태를 보이면서 망막 신경절 세포를 포함하는 시신경 손상에 의해 발생하는 질환으로, 상기 녹내장은 녹내장성 망막 및 시신경 손상의 원인으로 높은 안압 및 다양한 요소의 관여에 의해 발생할 수 있다. 구체적으로, 상기 녹내장은 원인에 따라 개방각 녹내장(open angle glaucoma), 폐쇄각 녹내장(closed angle glaucoma), 선천 녹내장(congenital glaucoma), 속발 녹내장(secondary glaucoma), 수정체 융해 녹내장, 거짓비늘 녹내장, 수정체팽대 녹내장, 신생혈관 녹내장, 스테로이드 녹내장 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 엑소좀을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크 등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.

상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더, 안약 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 안구내, 초자체내, 망막하, 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있고, 안구 점적일 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 또는 수회일 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여 시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품에 포함되는 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 엑소좀은 상기 서술한 바와 같은 특징을 포함할 수 있다.

상기 건강기능식품은 이의 유효성분인 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 엑소좀을 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.

상기 건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

실시예 1. 양막 유래 줄기세포의 준비

인간 양막 중간엽 줄기세포(AMMSC) 및 양막 상피줄기세포(AMESC)를 다음과 같은 방법으로 준비하였다.

먼저, 고려대학교 안암병원 기관윤리위원회(Institutional Review Board, IRB)의 심의를 거쳐 건강한 산모의 동의서를 받고, 제왕절개 출산 후 양막을 채취하였다. 채취된 양막 조직에 콜라게나아제 I(collagenase I)을 처리하고, 동량의 10% FBS(fetal bovine serum)을 포함하는 배양배지를 첨가하여 1,500 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 펠렛을 2회 세척한 후, 적혈구를 RBC 용해완충액으로 용해시켰다. 상기 용해물에서 남은 세포를 5% FBS, 100 unit/㎖의 페니실린 및 100 ㎎/㎖의 스트렙토마이신이 포함된 각질형성세포(keratinocyte) 무혈청 배지(SFM, Invitrogen, 미국)에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 37℃ 및 5% CO₂ 조건하에서 배양하면서 2 내지 3일마다 배양배지를 교체하였다. 배양된 줄기세포를 유세포 분석 시스템으로 분석하여 마커 유전자를 확인함으로써, 상기 줄기세포가 양막 중간엽 줄기세포 및 양막 상피줄기세포인 것을 알 수 있었다.

실시예 2. 엑소좀 풍부 배양액의 제조

상기 수득된 인간 양막 중간엽 줄기세포 및 상피줄기세포를 다음과 같이 배양하여 상기 세포 및 이를 배양한 배양배지의 엑소좀 함량을 증진시켰다.

구체적으로, 상기 인간 양막 중간엽 줄기세포 및 상피줄기세포를 하이퍼 플라스크(hyper flask, Nunc, 미국)에 넣고, 무혈청 배지로 현탁하였다. 이를 5% 이산화탄소 및 20% 산소 조건하에서 3일 동안 배양하였다. 상기 배양액을 취하여 병뚜껑 진공 필터 시스템(bottle-top vacuum filter system, 0.22 ㎛, PES membrane, Corning, 미국)을 사용하여 여과하였다. 여과된 배양액을 비바플로우-200(vivaflow-200, Sartorius, 독일)을 사용하여 30배 농축하고, 동결건조함으로써, 엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium)을 제조하였다. 한편, 상기 인간 양막 중간엽 줄기세포 및 상피줄기세포를 20% 산소하에서 배양한 배양액을 정상 배양액(normal conditioned medium)으로서 준비하였다.

실시예 3. 엑소좀 함량 분석-(1)

상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 엑소좀의 함량을 엑소좀 표지자인 CD9의 발현을 확인하여 분석하였다.

먼저, 상기 준비된 엑소좀 풍부 배양액으로부터 엑소좀을 통상적인 방법으로 분리하였다. 분리된 엑소좀의 단백질량을 단백질 DC 분석 키트(protein DC assay kit, Bio-Rad Laboratories, USA)로 정량하고, 25 ㎍을 취하여 6× 변성 완충액(denaturation buffer)과 혼합하고, 95℃에서 10분 동안 반응시켜 단백질을 변성시켰다. 변성된 단백질은 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동하고, 임모빌온-P PVDF 막(immobilon-P PVDF membrane)으로 옮겼다. 항체와의 비특이적 결합을 막기 위해 상기 막을 5% 탈지유에 넣고 전처리하였다. 전처리된 PVDF 막을 세척하고, CD9 또는 ARF-6 단백질에 대한 1차 항체를 첨가하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PVDF 막을 0.1% Tween-20이 포함된 TBS-T 완충액으로 세척하고 여기에 2차 항체인 IgG-HRP-결합된 전체 항체(IgG-HRP-linked whole antibody)를 처리하고 실온에서 다시 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PVDF 막을 ECL 플러스 웨스턴 블롯팅 디텍션 시스템(ECL plus western blotting detection system, GE HealthCare)으로 확인하였다. 그 결과, CD9의 발현 정도를 촬영한 결과 사진을 도 1A에 나타내었다.

도 1A에 나타난 바와 같이, 낮은 산소농도의 조건하에서 배양된 양막 중간엽 줄기세포 및 양막 상피줄기세포의 배양액에서 CD9의 발현량이 현저히 증가하였다.

실시예 4. 엑소좀 함량 분석-(2)

상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 엑소좀의 함량을 NTA 시스템(Nanosight NS300, NanoSight, 영국)을 사용하여 정량적으로 확인하였다. 그 결과, 엑소좀의 함량을 도 1B에 나타내었다.

도 1B에 나타난 바와 같이, 낮은 산소농도의 조건하에서 배양된 양막 중간엽 줄기세포 및 양막 상피줄기세포의 배양액에서 엑소좀의 함량이 현저히 증가하였다. 구체적으로, 낮은 산소농도의 조건에서 배양된 양막 중간엽 줄기세포 및 양막 상피줄기세포의 배양액은 각각 4.5×10¹⁰ 개/㎖ 및 3.9×10¹⁰ 개/㎖의 엑소좀을 포함하여 엑소좀 함량이 정상 산소농도 조건하에서 배양한 경우보다 약 50배 정도 증가하였다.

실험예 1. 성장인자 및 신경영양인자의 분석

상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 성장인자 및 신경영양인자를 다음과 같이 분석하였다. 구체적으로, FGF(fibroblast growth factor), EFG(elongation factor G), IGF(insulin-like growth factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), TGF-β(transforming growth factor-β), BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 및 PDGF(platelet-derived growth factor) 단백질의 발현 수준을 ELISA 분석방법으로 제조사의 프로토콜에 따라 확인하였다. 이때, 대조군으로서는 정상 배양액을 사용하였고, 확인된 성장인자 및 신경영양인자의 발현 수준은 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 낮은 산소농도의 조건하에서 배양된 양막 중간엽 줄기세포 배양액에서 성장인자 및 신경영양인자의 발현 수준히 현저히 증가하였다.

실험예 2. 망막세포의 증식 촉진 확인

줄기세포 배양액에 의한 망막세포의 증식 촉진 효과를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

먼저, 1×10⁵/㎖의 ARPE-19 세포주(#CRL2302, ATCC, 미국)를 96웰에 분주하고, 하룻밤 동안 배양하였다. 배양된 세포주에 양막 중간엽 줄기세포 배양액을 0, 6.25, 12.5, 25, 50 또는 100 ㎕/㎖로 첨가하고, 37℃ 및 정상 산소 조건(20% O₂)에서 더 배양하였다. 24시간 후, 배양된 세포의 수를 계수하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 양막 중간엽 줄기세포 배양액의 처리농도에 의존적으로 망막세포의 증식이 촉진되었다. 특히, 25 내지 100 ㎕/㎖의 고농도로 양막 중간엽 줄기세포 배양액을 처리한 경우 망막세포의 증식이 현저히 증가하였다.

실험예 3. 산화 스트레스에 대한 망막세포 보호 확인

산화 스트레스에 대한 줄기세포 배양액의 망막세포 보호 효과를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

먼저, 1×10⁵/㎖의 ARPE-19 세포주를 96웰에 분주하고, 하룻밤 동안 배양하였다. 배양된 세포주에 200 μM의 과산화수소를 처리하고, 동시에 0, 12.5, 25, 50 또는 100 ㎕/㎖의 양막 중간엽 줄기세포 배양액을 첨가하고, 37℃ 및 정상 산소 조건(20% O₂)에서 더 배양하였다. 24시간 후, 배양된 세포의 수를 계수하였다. 계수된 세포 수로부터 세포 생존율을 계산하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 과산화수소에 의해 약 42%까지 감소된 세포 생존율이 양막 중간엽 줄기세포 배양액에 의해 회복되었다. 세포 생존율의 회복은 양막 중간엽 줄기세포 배양액의 처리 농도에 의존적으로 증가하였으며, 특히, 25 내지 100 ㎕/㎖의 고농도로 처리한 경우에는 산화 스트레스로부터 세포의 손상이 완전히 회복되었을 뿐 아니라 오히려 세포 증식을 촉진하여 무처리 대조군에 비해 세포 수가 더욱 증가하였다.

실험예 4. 저산소(hypoxia)에 대한 망막세포 보호 확인

저산소에 대한 줄기세포 배양액의 망막세포 보호 효과를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

먼저, 1×10⁵/㎖의 ARPE-19 세포주를 96웰에 분주하고, 하룻밤 동안 배양하였다. 배양된 세포주에 0, 12.5, 25, 50 또는 100 ㎕/㎖의 양막 중간엽 줄기세포 배양액을 첨가하고, 37℃ 및 저산소 조건(2% O₂)에서 더 배양하였다. 24시간 후, 배양된 세포의 수를 계수하였다. 그 결과, 세포의 성장 정도를 촬영한 사진을 도 5A에 계수된 세포 수로부터 계산된 세포 생존율을 도 5B에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 정상 산소 조건(20% O₂)에서 배양한 세포를 사용하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 저산소 조건에서 배양된 세포는 생존율이 약 39%까지 감소하였으나, 이는 양막 중간엽 줄기세포 배양액에 의해 회복되었다. 세포 생존율을 양막 중간엽 줄기세포 배양액의 처리 농도에 의존적으로 증가하였으며, 특히, 25 내지 100 ㎕/㎖의 고농도로 처리한 경우에는 산화 스트레스로부터 세포의 손상이 완전히 회복되었을 뿐 아니라 오히려 세포 증식을 촉진하여 무처리 대조군에 비해 세포 수가 더욱 증가하였다.

실험예 5. 망막세포의 상처 회복 확인

망막세포의 상처에 대한 줄기세포 배양액의 회복 활성을 세포 이동 어세이(cell migration assay) 방법으로 확인하였다.

먼저, 1×10⁵/㎖의 ARPE-19 세포주를 T-75 플레이트에 분주하고 배양하였다. 세포가 플라스크에 약 90% 정도까지 성장하였을 때, 파이펫 팁을 사용하여 약 5 ㎜의 상처를 만들었다. 여기에 0, 12.5, 25, 50 또는 100 ㎕/㎖의 양막 중간엽 줄기세포 배양액을 첨가하고, 37℃ 및 저산소 조건(2% O₂)에서 더 배양하였다. 24시간 후, 남아 있는 상처부위의 면적을 촬영한 사진을 도 6A에 면적의 넓이를 계산한 결과를 도 6B에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 파이펫 팁에 의한 상처가 무처리 대조군에 의해 24시간 동안 약 20% 회복되었다. 한편, 25, 50 또는 100 ㎕/㎖의 양막 중간엽 줄기세포 배양액을 처리한 경우에는 각각 88%, 93% 및 98%까지 세포의 상처부위가 회복되었다.

실험예 6. 동물모델에서 녹내장 치료 확인

녹내장 동물모델에 줄기세포 배양액을 투여하여 녹내장 치료 효과를 확인하였다.

6-1. 동물모델의 준비 및 약물의 투여

6주령의 수컷 SD(Sprague-Dawley) 랫트(대한바이오링커, 한국)는 23±2℃의 일정한 온도에서, 55±10%의 상대습도, 12시간의 명암주기(light/dark cycle)하에서 사육하였다. 이때, 표준 설치류 사료와 정제수를 공급하였다. 동물실험의 모든 절차는 충북대학교 실험실 동물연구센터(LARC)의 기관동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)에 따라 승인 후, 수행되었다. 35마리의 랫트 왼쪽눈에 안고혈압을 외과적으로 유도하여 녹내장 동물모델을 제조하였다. 구체적으로, 랫트를 졸레틸®(Zoletil®, 버박코리아, 한국) 및 럼푼®(Rumpun®, 바이엘코리아, 한국)을 2:1의 부피비로 혼합하여 2 ㎖/㎏의 부피로 복강내 주사하여 전신마취시켰다. 마취된 랫트의 공막 정맥에 1.8 M의 고장성 식염수를 해밀턴 마이크로리터 주사기(Hamilton microliter syringe, Hamilton, 미국)로 50 ㎕/min의 속도로 주입하였다. 이후, 랫트의 양안 안압(intraocular pressure, IOP)은, 랫트를 0.4% 이소플루란으로 흡입 마취하고, 토노랩 안압계(TonoLab tonometer, Icare Finland Oy, 핀란드)로 측정하였다. 최대 안압을 나타낸지 일주일 후, 10 ㎕의 양막 중간엽 줄기세포 배양액 또는 양막 상피줄기세포 배양액을 랫트의 유리체에 투여하였다. 이때, 대조군으로서 0.9%의 식염수를 사용하였다. 각 마우스 그룹에 따른 투여조건을 하기 표 1에 동물실험 계획을 도 7에 나타내었다.

동물모델	그룹	약물처리	투여량
정상 동물모델	정상대조군	-	-
녹내장 동물모델 (1.8 M 식염수)	음성대조군	0.9% 식염수	10 ㎕
	실험군	정상 배양액	10 ㎕
		양막 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액	10 ㎕
		양막 상피줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액	10 ㎕

6-2. 안압 증가 억제 확인

상기 녹내장 동물모델의 안압 측정을 통해 녹내장 치료 효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 녹내장 동물모델에 고장성 식염수를 투여한 날로부터 3주 동안 주 2회 동일한 시간에 안압을 측정하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 고장성 식염수의 주입에 의해 급격히 증가한 안압이 줄기세포 배양액의 처리에 의해 정상수준(10 내지 17 ㎜Hg)까지 유의적으로 감소하였다. 특히 낮은 산소 농도에서 배양하여 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 경우, 정상 산소 농도에서 배양하여 수득된 정상 배양액보다 더욱 현저한 효과를 나타내었다.

6-3. 망막층 수축 회복 확인

줄기세포 배양액을 투여한 녹내장 동물모델을 희생시켜 망막층을 헤마토자일린-에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색하여 망막층의 수축 회복을 확인하였다.

먼저, 깊은 마취로 상기 랫트를 희생시키고, 안구를 적출하였다. 적출된 안구를 데이비슨 용액(Davison's solution, BBC Biochemical, 미국)에 24시간 동안 침지시켜 고정하고, 이를 세척 및 탈수하였다. 탈수된 안구를 파라핀에 포매하고, 마이크로톰(microtome, Leica Biosystems, 독일)을 사용하여 4 ㎛ 두께의 절편으로 절단하였다. 절편을 슬라이드에 두고, 헤마토자일린-에오신으로 염색한 후, 광학 현미경(Carl Zeiss, 독일)으로 관찰하였다. 그 결과, 광학 현미경으로 관찰한 결과 사진을 도 9A에, 상기 결과 사진으로부터 망막층의 두께를 측정한 결과를 도 9B에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 녹내장 유발에 의해 망막층이 정상대조군과 비교하여 약 35%까지 위축되었다. 그러나 이와 같은 망막층의 수축은 줄기세포 배양액의 처리에 의해 유의적으로 회복되었으며, 특히, 낮은 산소 농도에서 배양하여 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 경우, 정상 산소 농도에서 배양하여 수득된 정상 배양액보다 더욱 현저한 효과를 나타내었다.

6-4. 망막 신경절 세포층의 수축 회복 확인

상기 녹내장 동물모델의 망막 신경절 세포층(retinal ganglionic cell layer) 수축이 줄기세포 배양액에 의해 회복되는지 상기 실험예 6-3에 기재된 바와 동일한 방법 및 조건으로 확인하였다. 그 결과, 망막 신경절 세포층의 두께를 확인한 결과를 도 10A에, 망막 신경절 세포의 수를 측정한 결과를 도 10B에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, 녹내장에 의해 수축된 망막 신경절 세포층의 두께와 감소된 망막 신경절 세포 수가 줄기세포 배양액의 처리에 의해 유의적으로 회복되었다. 특히, 낮은 산소 농도에서 배양하여 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 경우, 정상 산소 농도에서 배양하여 수득된 정상 배양액보다 더욱 현저한 효과를 나타내었다.

6-5. 망막 신경절 망막 세포의 보호 확인

상기 녹내장 동물모델의 망막 신경절 내 존재하는 망막 세포를 NeuN(neuronal nuclei) 단백질을 면역염색함으로써 줄기세포 배양액에 의한 망막 세포의 보호 효과를 확인하였다.

먼저, 실험예 6-3에 기재된 바와 같이 안구 절편을 수득하고, 슬라이드에 두었다. 상기 슬라이드에 1% 과산화수소를 처리하고 30분 동안 반응시켰다. 반응 후, 조직을 PBS로 세척하고, 스트렙타비딘-비오틴 퍼록시다제 복합체(streptavidin-biotin peroxidase complex, LSAB2 kit, Dako, 미국)를 처리하였다. 이를 20분 동안 반응시킨 후, 정상 염소 혈청(goat serum, Vectastain Elite ABC kit, Vector Laboratories, 미국)을 처리하여 30분 동안 전처리하였다. 이후, 1차 항체로서 NeuN 단백질에 대한 단일클론 토끼 항체(1:1,000, Abcam, 영국)를 희석하여 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 바이오틴화된 2차 항체(Vectastain Elite ABC kit, Vector Laboratories, 미국)를 처리하고, 실온에서 한시간 동안 더 반응시켰다. 이후, 상기 절편을 PBS로 세척하고, DAB(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride, Novus Biologicals, 미국)을 처리하고 1 내지 2분 동안 발색시켰다. 상기 절편을 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin)으로 대조염색한 후, 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 광학 현미경으로 관찰한 결과 사진을 도 11A에, 염색된 세포 수를 측정한 결과를 도 11B에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, 녹내장에 의해 감소된 NeuN 양성인 망막 세포의 수가 줄기세포 배양액의 처리에 의해 유의적으로 회복되었다. 특히, 낮은 산소 농도에서 배양하여 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 경우, 정상 산소 농도에서 배양하여 수득된 정상 배양액보다 더욱 현저한 효과를 나타내었다.

6-6. 시신경 보호 확인

상기 녹내장 동물모델의 GFAP(glial fibrillary acidic protein) 및 GS(glutamine synthetase) 단백질의 발현을 확인함으로써, 줄기세포 배양액의 시신경 보호 효과를 확인하였다. GFAP 및 GS 단백질은 뮐러 세포(Muller cell)를 구성하는 단백질로서, 뮐러 세포가 활성화되면, 시신경의 손상을 의미한다.

실험은 NeuN 단백질에 대한 1차 항체 대신, GFAP 단백질에 대한 다중클론 토끼 항체(1:500, Millipore, 미국) 또는 GS 단백질에 대한 단일클론 토끼 항체(1:500, Abcam, 영국)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 6-5와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 그 결과 염색된 시신경에서 GFAP 단백질의 발현을을 광학 현미경으로 관찰한 결과 사진을 도 12A에, 상기 발현정도를 정량적으로 나타낸 결과를 도 12B에 나타내었다. 한편, GS 단백질의 발현을 광학 현미경으로 관찰한 결과 사진은 도 13A에, 상기 발현 정도를 정량적으로 나타낸 결과는 도 13B에 나타내었다.

도 12 및 13에 나타난 바와 같이, 녹내장에 의해 증가된 GFAP 및 GS 단백질의 발현 수준이 줄기세포 배양액의 처리에 의해 유의적으로 감소하였다. 특히, 낮은 산소 농도에서 배양하여 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 경우, 정상 산소 농도에서 배양하여 수득된 정상 배양액보다 더욱 현저한 효과를 나타내었다.

Claims

줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 양막 유래 줄기세포인, 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 양막 유래 줄기세포는 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 상피줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 배양액은 줄기세포를 10% 이하의 산소 농도하에서 배양하여 수득된, 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 배양액은 줄기세포를 1 내지 5%의 산소 농도하에서 배양하여 수득된, 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 안구 질환은 망막, 각막, 시신경, 안검 및 수정체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 손상에 의해 유발되는 안질환인, 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 안구 질환은 시신경위축, 녹내장, 눈중풍, 망막혈관폐쇄, 포도막염, 시신경염, 망막염, 각막염, 백내장, 안검염, 시신경유두부종, 시신경척수염 또는 허혈성시신경염인, 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.