KR102068697B1 - 염증성 안구표면질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염증성 안구표면질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 스테로이드성 약물이 나타내는 부작용을 유발하지 않으며, 눈물 분비, 각막 세포 회복 및 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효과가 있으므로, 안구건조증 등의 염증성 안구표면질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

염증성 안구표면질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Inflammatory Ocular Surface Disease}

본 발명은 리퀴리티제닌(liquiritigenin)을 포함하는 염증성 안구표면질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증성 안구표면질환은 병원체, 손상된 세포 및/또는 자극물에 대한 안구 조직의 복잡한 생물학적 반응으로, 해로운 자극을 제거하고 치유과정을 개시하여 안구를 보호하는 반응이나, 조직의 점진적인 파괴에 의해 발생할 수 있다. 이러한 염증을 유도하는 염증성 매개체들은 감염 부위에서 세포 침윤을 조절하는 중요한 역할을 하며, 증가된 세포 침윤은 심각한 망막 손상을 초래한다.

안구건조증 또는 건성안(dry eye syndrome)은 가장 흔한 염증성 안구표면질환 중의 하나로, 눈물의 부족, 눈물의 지나친 증발 또는 눈물 구성성분의 불균형에 따른 안구 표면의 손상 및 눈의 자극감, 이물감, 건조감과 같은 자극 증상을 동반하는 안구 질환을 말한다.

안구건조증은 우리나라 성인의 약 20%에서 발생하는 흔한 질병이며, 환경오염 등으로 인하여 안구건조증 환자가 지속적으로 증가하고 있음에도 불구하고, 아직 발병 과정에 대해서는 완전히 밝혀지지 않은 상태이다. 최근 들어, 염증 세포 침윤, 면역 활성화 분자 및 접착분자의 증가된 발현, Th1 및 Th17 반응, 세포사멸 마커 및 케모카인을 특징으로 하는 안구건조증 질환에서 염증이 중요한 역할을 담당한다는 것을 뒷받침하는 연구결과들이 발표되고 있다.

안구건조증의 개선을 위하여 일반적으로 칼륨과 안토시아닌이 풍부한 음식 또는 케일, 키위, 사과 등의 과일섭취가 권장되며, 인공눈물을 점안하거나, 눈물점을 막아 배출되는 눈물의 양을 조절하는 치료법이 사용된다. 그러나, 인공 눈물 안약에 의한 눈물의 보충은 일시적인 증상의 개선에 그칠 뿐이며, 인공 눈물에 포함된 보존제 성분에 의하여 불필요한 자극을 느낄 수 있다. 또한, 스테로이드 성분이나 혈관수축제 성분이 들어있는 염증 치료용 안약을 장기적으로 사용할 경우 이들 성분에 의한 안압상승, 녹내장, 백내장 등의 부작용이 발생할 수 있다.

한국 등록특허 제10-1713419호는 황련, 황금 황백, 치자 및 감초의 혼합 추출물의 각막 창상 치유 효과를 개시하고 있다. 그러나, 감초는 혈중 스테로이드 농도를 증가시키므로, 안구의 스테로이드 성분 증가에 따라 부작용이 발생할 수 있어 문제가 된다. 따라서, 부작용 없이 안구건조증 등의 염증성 안구표면질환을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제에 대한 요구가 여전히 존재한다.

이에 본 발명자들은 안구의 염증을 감소시키면서 각막 세포를 회복시킬 수 있는 염증성 안구표면질환 치료제에 대한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허등록 제10-1713419호

본 발명의 목적은 리퀴리티제닌(liquiritigenin)을 포함하는 염증성 안구표면질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 리퀴리티제닌을 포함하는 염증성 안구표면질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 염증성 안구표면질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함된 리퀴리티제닌은 뛰어난 각막 염증억제 효능 및 각막세포 손상 치유기능을 나타내므로, 노화, 라식수술 등 다양한 원인에 따른 염증성 안구표면질환, 예를 들어, 눈물결핍, 혹은 눈물증가에 따른 눈물액의 삼투압 증가에 의해 발생하는 안구건조증의 염증반응 및 안구표면 상피의 손상을 예방 또는 치료하기 위한 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

리퀴리티제닌은 비스테로이드성 화합물이므로, 혈중 스테로이드 농도를 증가시키는 스테로이드제와는 달리, 스테로이드 부작용 없이 염증성 안구표면질환의 예방 또는 치료에 안전하게 활용될 수 있다.

리퀴리티제닌은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로써, (2S)-7-하이드록시-2-(4-하이드록시페닐)-2,3-디하이드로크로멘-4-온((2S)-7-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-2,3-dihydrochromen-4-one)이다.

[화학식 1]

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 염증성 안구표면질환의 증상이 발생하지 않도록 하는 것을 의미하며, 이미 발병한 염증성 안구표면질환의 증세가 악화되지 않도록 증상을 유지하는 것을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 염증성 안구표면질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 리포좀, 산제, 분말제, 과립제, 정제, 서방형 제제, 점안제(eye drop) 및 캡슐제로 구성된 군에서 선택되는 제형일 수 있으며, 국소 투여가능한 안약 용액일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 염증성 안구표면질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물이 안약 용액으로 배합되는 경우에서, 상기 조성물은 약 1 내지 1000㎎/㎖(0.1~100w/v%)의 양으로 포함될 수 있다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한 희석제"는 당업자에게 공지된 안약 조성물에 사용되는 임의의 희석제, 예를 들어 물, 생리식염수, 인공 누액 등일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 안약 조성물에 일반적으로 사용되는 다양한 성분, 예컨대 안정제, 멸균제, 완충제, 등장성제, 킬레이트제, pH 조절제, 계면활성제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 안약 용액으로 배합되는 경우, 조성물의 pH 는 바람직하게는 5 내지 8로 조절된다. 안약 용액은 한 번 투여시에 약 1 내지 1000㎕/안구, 바람직하게는 약 10 내지 500㎕/안구, 더욱 바람직하게는 약 30 내지 300㎕/안구의 양으로, 하루에 약 1 내지 10회, 바람직하게는 하루에 약 1 내지 4회 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 약학적 조성물은, 염증성 안구표면질환에 활성을 갖는 1종 이상의 공지된 유효성분과 공동-투여될 수 있다. "공동-투여"는 용어는 본 발명의 약학 조성물의 투여 이전, 동시 및 이후에 염증성 안구표면질환에 약학적으로 활성인 성분을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이 경우 본 발명의 약학적 조성물과 1종 이상의 공지된 유효성분은 서로 단일 투약량 형태 또는 각각 개별 투약량 형태로 배합될 수 있다. 예를 들어, 인공 누액, 히알루론산 및 콘드로이틴 설페이트와 같은 다당류 설페이트, 시클로스포린, 글루타티온, 플라빈-아데닌 뉴클레오티드 나트륨, 코르티코스테로이드, 테트라시클린, 비타민 A(레티놀) 및 이의 유도체(예컨대 레티놀 팔미테이트 및 레티놀 아세테이트를 포함하는 비타민 A 에스테르), 및 간세포 성장 인자(HGF), 상피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF), 혈소판-유도 성장 인자(PDGF), 전환 성장 인자(TGF-α 및 TGF-β) 및 케라티노사이트 성장 인자(KGF)와 같은 세포 성장 인자 등을 본 발명의 조성물과 공동-투여할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 염증성 안구표면질환은 안구건조증일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "안구건조증"은 수성 눈물층 부족 안구건조증(ADDE, aqueous deficiency dry eye) 및 증발성 안구건조증을 포함할 수 있다. 특히, 무루증, 각막건조증, 쇼그렌 증후군, 건조 각막결막염, 스티븐 존슨 증후군, 눈 유사물집증 및 다래끼와 같은 안구건조증 상태를 포함할 수 있다. 또한, 안구건조증은 백내장 수술 및 굴절교정술과 같은 전방 안과 수술(anterior ophthalmic operation) 이후의 안구건조증, 및 알레르기성 결막염뿐만 아니라 VDT(영상 단말기) 노동자의 눈물 감소 및 예를 들어, 공기 조절장치에 의한 건조한 방에 의해 야기되는 임의의 전신 증상이 없는 눈물 감소와 같은 안구건조증 유사 상태를 동반하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 염증성 사이토카인을 감소시키는 것일 수 있다.

안구건조증 등의 염증성 안구표면질환은 안구의 염증을 유발한다. 본 발명의 약학적 조성물의 처리에 의해 염증성 사이토카인, 예를 들어, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-13, TNFα 및/또는 IFNγ의 발현을 억제함으로써, 안구건조증의 염증 증상을 완화 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 손상된 각막세포를 재생하는 것일 수 있다.

안구건조증 등의 염증성 안구표면질환은 안구의 세포 손상을 유발한다. 본 발명의 약학적 조성물은 안구의 손상된 상피세포 및/또는 각막세포를 회복시킬 수 있으므로, 안구에 유발된 세포의 손상을 개선할 수 있다.

본 발명의 염증성 안구표면질환의 예방 또는 치료용 조성물은 스테로이드성 약물이 나타내는 부작용이 없을 뿐만 아니라, 눈물 분비, 각막 세포 회복 및 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효과가 있으므로, 안구건조증 등의 염증성 안구표면질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용된 3차원 배양된 인간 결막 세포주(Chang's cell)의 공초점 형광 사진이다.
도 2는 0.01μM 내지 100μM 농도에서 리퀴리티제닌(liquiritigenin)의 세포독성 여부를 확인한 그래프이다.
도 3은 0.1μM 내지 10μM 농도에서 리퀴리티제닌의 세포 생존력 범위를 확인한 그래프이다.
도 4는 NaCl, 리퀴리티제닌(LIQ) 및 덱사메타손(DEX) 처리의 IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, MUC1, MUC4, MUC5AC 및 MUC7의 발현에 대한 효과를 나타낸다.
도 5는 NaCl, 리퀴리티제닌(LIQ) 및 덱사메타손(DEX) 처리에 따른 IL-1β 및 IL-8의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 리퀴리티제닌(LIQ)에 의한 MUC5AC 발현의 증가를 확인한 형광사진이다.
도 7은 시간에 따른 리퀴리티제닌(LIQ)의 처리에 의한 JNK, P-JNK, p38 및 P-p38의 발현 변화를 확인한 사진이다.
도 8은 70mM NaCl에 의해 Chang's cell에서 발현되는 IL-8의 덱사메타손 및 리퀴리티제닌의 농도에 따른 IC₅₀(the half maximal inhibitory concentration) 값을 나타낸 그래프이다.
도 9는 정상군, 스코폴라민(SCO) 10일 처리군 및 생리식염수(NS), 리퀴리티제닌LIQ) 및 덱사메타손(DEX)의 3일, 7일, 14일 및 28일 처리군에 대한 페놀레드 테스트(PRT) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 생리식염수(NS), 리퀴리티제닌LIQ) 및 덱사메타손(DEX)의 3일, 7일, 14일 및 28일 처리군에 대한 각막 형광 염색 점수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 생리식염수(normal saline), 리퀴리티제닌 및 덱사메타손(dexamethasone)의 3일, 7일, 14일 및 28일 처리군에 대한 각막 형광 변화를 나타낸 동물모델의 안구 사진이다.
도 12는 DAPI 염색을 통해서 핵을 비교 염색한 증식세포핵항원(Proliferating Cell NuclearAntigen: PCNA) 형광 염색 사진으로, 스코폴라민(SCO) 10일 처리군 및 생리식염수(NS), 리퀴리티제닌LIQ) 및 덱사메타손(DEX)의 3일, 7일, 14일 및 28일 처리군에 대한 조직학적 평가에 따른 리퀴리티제닌의 각막 세포 회복효과를 나타낸 것이다
도 13은 DAPI 염색을 통해서 핵을 비교 염색한 상피세포의 온전함(integrity)을 나타내는 E-cadherin의 형광염색 사진으로, 스코폴라민(SCO) 10일 처리군 및 생리식염수(NS), 리퀴리티제닌LIQ) 및 덱사메타손(DEX)의 3일, 7일, 14일 및 28일 처리군에 대한 조직학적 평가에 따른 리퀴리티제닌의 각막 세포 회복효과를 나타낸 것이다
도 14는 정상군, 스코폴라민(SCO) 10일 처리군 및 생리식염수(NS), 리퀴리티제닌LIQ) 및 덱사메타손(DEX)의 3일, 7일, 14일 및 28일 처리군에 대한 IL-1β, IL-4, IL-6 및 IL-8의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 15는 정상군, 스코폴라민(SCO) 10일 처리군 및 생리식염수(NS), 리퀴리티제닌LIQ) 및 덱사메타손(DEX)의 3일, 7일, 14일 및 28일 처리군에 대한 IL-13, TNFα 및 IFNγ의 발현량을 나타낸 그래프이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 안구건조증에 대한 리퀴리티제닌의 in vitro 효과 확인

1-1. 3차원 배양 시스템을 이용한 in vitro 안구건조증 모델 제조

세포 실험에 사용된 인간 결막세포주(Chang's cell line)는 3차원 배양이 가능하여 실제 각막 조건과 유사한 환경을 제공할 수 있다.

인간 결막세포주(Chang's cell line)를 10% 소태아혈청(FBS)을 함유하는 RPMI-1640 배양액에서 성장시켰다. 1×10⁴개의 결막 세포주를 24 웰 세포배양 플레이트의 인서트(Corning, 0.4 um pore size membrane insert) 위에 접종한 후 연접배양(confluent culture)을 실시하였으며, 이후 air-liquid interface 배양을 일주일간 실시하여 in vitro 안구건조증 모델인 3차원으로 배양된 인간 결막 세포주를 제조하였으며(도 1), 37℃의 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

1-2. 세포독성 확인

3차원으로 배양된 인간 결막 세포주를 이용하여 리퀴리티제닌(liquiritigenin: LIQ, NPBANK, 경산시, 경상북도)이 세포독성을 나타내는 범위를 확인하였다.

구체적으로, 1-1에서 제조한 in vitro 안구건조증 모델에 리퀴리티제닌을 0.01μM, 0.1μM, 1μM, 10μM 또는 100μM 처리하고 24시간 후, CCK8 분석을 통하여 세포독성을 측정하였다.

그 결과, 리퀴리티제닌의 0.01μM 내지 10μM 범위에서는 세포 생존율에 유의적인 차이가 없었으나, 리퀴리티제닌을 100μM 처리한 경우, 세포 생존율이 대조군 대비 약 30% 정도로 낮아져, 세포독성이 나타남을 확인하였다(도 2). 따라서, 이후 실험에서는 10μM 이하의 농도로 리퀴리티제닌을 처리하였다.

1-3. 세포 생존력 확인

3차원으로 배양된 인간 결막 세포주를 이용하여 리퀴리티제닌이 세포 생존력에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.

구체적으로, 무혈청 배지를 이용하여, 1-1에서 제조한 in vitro 안구건조증 모델을 12시간 동안 기아 상태로 유지한 다음, NaCl(70mM)을 처리하기 전, 리퀴리티제닌 0.1μM, 1μM, 5μM, 10μM 을 2시간 동안 전처리하여 세포 생존력을 측정하였다.

그 결과, 리퀴리티제닌 0.1μM 내지 10μM 범위에서의 세포 생존력과 리퀴리티제닌을 처리하지 않은 대조군의 세포 생존력 사이에 유의적인 차이가 나타나지 않음을 확인하였다(도 3).

1-4. mRNA 분석

3차원으로 배양된 인간 결막 세포주를 이용하여 리퀴리티제닌이 안구건조증과 관련된 사이토카인 및 뮤신의 발현에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.

구체적으로, NaCl에 의해 유도된 인간 결막 세포주에서의 안구건조증 모델을 12시간 동안 무혈청 배지를 이용하여 기아 상태로 유지한 다음, NaCl(70mM)을 처리하기 전, 덱사메타손 10μM 또는, 리퀴리티제닌 0.1μM, 1μM, 5μM 또는 10μM 을 2시간 동안 전처리하여 24시간 배양 후 PBS로 2회 세척하였다. 이후 각각의 세포는 Reliaprep™ RNA miniprep 키트(Promega, medison, WI, USA)를 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 mRNA를 추출하였다.

추출한 mRNA에 의해 사이토카인 및 뮤신의 발현을 비교한 결과, 리퀴리티제닌을 처리한 안구건조증 모델에서, 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNFα의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 또한, 눈물이 마르는 것을 막아주는 당단백질로 알려진 뮤신, 특히, MUC5AC의 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 4).

1-5. ELISA 분석

3차원으로 배양된 인간 결막 세포주를 이용하여 리퀴리티제닌이 안구건조증과 관련된 사이토카인의 발현에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.

구체적으로, 무혈청 배지를 이용하여 3차원으로 배양된 인간 결막 세포주를 12시간 동안 기아상태로 유지한 다음, NaCl(70mM)을 이용하여 안구건조증과 유사한 환경을 유도하였다. NaCl 처리 2시간 전, 리퀴리티제닌을 처리하고, 24시간 배양한 다음, 세포 밖으로 배출된 IL-1β 및 IL-8의 농도변화를 확인하기 위하여, 세포 배양에 사용된 배지를 수거한 다음, LEGEND MAX™ Human IL-1β ELISA kit with Pre-coated Plates(Biolegend, San Diego, CA, USA)와 LEGEND MAX™ HumanIL-8 ELISA kit with Pre-coated Plates(Biolegend, San Diego, CA, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA를 수행하였다.

그 결과, 리퀴리티제닌을 처리한 안구건조증 모델에서, 염증성 사이토카인인 IL-1β 및 IL-8의 발현이 감소한 것을 확인하였다(도 5).

1-6. 조직학적 평가에 따른 리퀴리티제닌의 MUC5AC 발현 증가 효과 확인

NaCl에 의해 유도된 안구건조증에 대한 리퀴리티제닌의 보호효과를 확인하기 위하여 3차원으로 배양된 인간 결막 세포주에서 MUC5AC의 발현을 조사하였다. MUC5AC는 안구건조증 환자의 눈에서 발현이 감소되는 것으로 알려져 있다.

구체적으로, 무혈청 배지를 이용하여 3차원으로 배양된 인간 결막 세포주를 12시간 동안 기아상태로 유지한 다음, NaCl(70mM)을 이용하여 안구건조증과 유사한 환경을 유도하였다. NaCl 처리 2시간 후, 리퀴리티제닌를 처리하고, 24시간 배양한 다음, PBS로 2회 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 시편은 Alexa Alexa Fluor® 488-Conjugated 팔로이딘(phalloidin) 및 555-conjugated MUC5AC로 염색하고, 이를 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 안구건조증을 유도한 세포주에 리퀴리티제닌을 처리할 경우, 리퀴리티제닌을 처리하지 않은 안구건조증 유도 세포주 대비 MUC5AC의 발현이 증가함을 확인하였다(도 6).

1-7. Western blot 분석에 따른 리퀴리티제닌의 JNK 및 P38의 인산화 억제 효과 확인

NaCl에 의해 유도된 안구건조증에 대한 리퀴리티제닌의 보호효과를 확인하기 위하여 3차원으로 배양된 인간 결막 세포주에서 인산화된 JNK(P-JNK), 인산화된 P38(P-P38) 및 JNK, P38의 발현 정도를 Western blot 분석으로 확인하였다. 인산화된 JNK 및 P38은 안구에서 염증을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

구체적으로, 무혈청 배지를 이용하여 3차원으로 배양된 인간 결막 세포주를 12시간 동안 기아상태로 유지한 다음, NaCl(70mM)을 이용하여 안구건조증과 유사한 환경을 유도하였다. NaCl 처리 2시간 후, 리퀴리티제닌 5μM을 처리하고 0, 15, 30, 60, 120 및 240분 동안 배양하였다. 배양된 결막세포주를 각 시간별로 얼음위에서 채취한 후, 냉각된 PBS로 2회 세척하였다. 채취된 세포를 Protease inhibitor cocktail set I(Calbiochem, CA, USA)을 함유한 RIPA 완충액(sigma-aldrich USA)으로 용해시켰다. 총 세포 용해물을 13,000rpm, 5분에서 원심 분리하고 상등액을 분리하였다. 총 단백질 정량은 Pierce™ BCA 단백질 분석 키트(Thermo-scientific, CA, USA)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 이후 12% 아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다. 각 15㎍의 단백질을 넣고 100V, 4℃에서 1.5시간 전기영동을 수행한 후 100V, 4℃에서 1시간 동안 니트로 셀룰로스 막에 옮겼다. 블롯을 0.1% TBS로 세척한 뒤 2.5% BSA를 이용해 블로킹하였다. 1차 항체(1:1000)로 4℃에서 하룻밤 블로킹한 후, TBS-T 완충액으로 3회 세척하고 Pierce ECL western blotting 기질 키트(Thermo-scientific, CA, USA)와 Imagequant™ LAS 4000(GE healthcare, Buckinghamshire,UK)을 사용하여 단백질 밴드를 시각화하였다.

그 결과, 안구건조증을 유도한 세포주에 리퀴리티제닌을 처리할 경우, 리퀴리티제닌을 처리하지 않은 안구건조증 유도 세포주 대비 JNK 및 P38의 인산화가 억제됨을 확인하였다(도 7A 및 도 7B).

실시예 2. 덱사메타손 및 리퀴리티제닌의 IL-8의 분비 감소 효과 비교

리퀴리티제닌의 IC₅₀ 값을 덱사메타손과 비교하여 확인하였다.

구체적으로, NaCl에 의해 안구건조증이이 유도된 Chang's cell에 덱사메타손을 100pM, 1nM, 10nM, 100nM, 1uM, 10uM 또는 100uM 처리한 후, ELISA를 통하여 IL-8의 분비량을 측정하였다. 측정된 값을 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad software, Inc., La Jolla, CA, USA)를 이용하여 상용로그로 농도를 변환하여 그래프화 하였으며, GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 추세선을 생성 후, 덱사메타손의 IC₅₀ 값을 분석하였으며, 이를 리퀴리티제닌과 비교하였다.

그 결과, 덱사메타손의 IC₅₀ 값은 0.009161로 확인되었으며, 100nM 내지 100uM의 범위에서, 동일 농도의 덱사메타손 대비 리퀴리티제닌의 IL-8 분비 감소 효과가 우수함을 확인하였다(도 8).

실시예 3. 안구건조증에 대한 리퀴리티제닌의 in vivo 효과 확인

3-1. 동물모델 사육

본 연구에서 사용된 8 내지 12주령의 BALB/C 마우스 125마리는 오리엔트 바이오(경기도, 한국 남부)에서 구입하였다. 실험에 사용된 마우스들은 IVC(실내 온도: 21℃±2.5℃, 습도 50%±10%, 명암주기: 오전 7시부터 오후 7시까지)를 사용하여 표준 환경에서 사육하였다. 모든 동물실험은 대구경북 의료혁신재단의 실험동물센터(IACUC No. DGMIF-17042503-00)의 지침에 따라 승인 및 실시되었다.

3-2. 안구건조증 유발 동물모델 제조

안구건조증 유발 동물모델은 스코폴라민(scopolamine)(SCO, Sigma Aldrich, S1013)을 마우스의 복강 내 주사 방법 및 습도가 제어된 챔버(Controled environment chamber: CEC 또는 Air controlled environment: ACE)에서 사육함으로써 유도하였다.

구체적으로, 본 실험을 위해 특별히 제작된 CEC 챔버 내부의 습도는 상대습도 제어기 및 공기압축기에 의해 제어되었다(상대습도: 18.5%±5%, 공기 유량: 20L/분). 챔버의 내부 온도는 시설과 동일한 공기를 사용하기 때문에 챔버 밖의 사육시설(23℃±2.5℃)과 동일하게 유지되었다. 마우스는 3.3mg/ml 스코폴라민 200㎕를 매일 3회(오전 10시, 오후 2시, 오후 6시) 복강주사 하였다. 10일간의 스코폴라민 주사와 CEC 챔버에서의 사육에 의해 안구건조증이 유발된 마우스는 이후 정상적인 사육 환경에서 사육하였다. 안구건조증이 유발된 마우스는 생리식염수 처치군, 리퀴리티제닌(5μM) 처치군 및 덱사메타손(sigma-aldrich, 10μM) 처치군으로 나누어 실험하였다. 각각의 약물은 매일 3회씩 마우스의 양쪽 눈에 직접 국소투여 하였다. 각각의 군은 약물 처치가 시작된 후 3일, 7일, 14일, 28일째 희생하였으며, 이후 각막, 결막 및 눈물샘을 분리한 후 실험에 사용하였다.

3-3. 페놀레드 테스트에 따른 리퀴리티제닌의 눈물 분비량 증가 효과 확인

안구건조증 유발 및 치료 이후 마우스의 눈물의 양을 측정하기 위하여, 페놀레드(phenol red thread) 테스트를 수행하였다.

페놀레드로 염색된 면사(Zone-Quick, Yokota, Tokyo, Japan)를 마우스 눈의 아래위 눈꺼풀이 만나는 후방에 넣은 후 30초 동안 흡수시켜, 변화된 색의 길이를 밀리미터 단위로 측정하였다.

그 결과, 리퀴리티제닌의 경우, 투여가 시작된 후 7일 이내에 눈물의 분비량이 정상 수준으로 회복됨을 확인하였으며, 대조군 대비 눈물 분비량 증가 효과가 처리 초기에서 특히 우수함을 확인하였다(도 9).

3-4. 각막 형광 염색 점수에 따른 리퀴리티제닌의 상피세포 회복효과 확인

안구건조증의 유발 및 치료 이후 마우스의 안구 표면의 상피세포의 손실 및 회복을 확인하기 위하여 각막 형광 염색 점수(Corneal fluorescein staining score)를 측정하였다.

구체적으로, 0.5% 플루오레세인 수용액 5μL를 안구 표면에 떨어뜨린 뒤 눈꺼풀에 묻지 않도록 조심히 두세번 깜박거리게 한 후, 슬릿램프 현미경 하에서 안구표면에서 나타나는 형광을 확인하였다. 이후, 안구 표면의 상피세포에 0.05% Na-Fluorescein 용액을 1㎕를 점안하고 30초 후에 사진을 촬영한 다음, 각 사진을 Bron AJ, et al.(Grading of corneal and conjunctibal staining in the context of other dry eye tests., Cornea, 2003;22:640-650)에 제시된 기준에 따라 분류하는 oxford grading 방법을 이용하여 수치화하였다.

그 결과, 리퀴리티제닌 및 양성대조군인 덱사메타손의 경우, 투여가 시작된 후 14일경 상피세포가 정상 수준으로 회복되었다(도 10 및 도 11).

3-5. 조직학적 평가에 따른 리퀴리티제닌의 각막세포 회복효과 확인

동물모델에서, 안구건조증에 따른 손상된 각막 세포의 회복효과를 확인하기 위하여 형광염색을 통한 조직학적 평가를 수행하였다.

구체적으로, 실험에 사용된 마우스의 눈꺼풀, 결막, 각막을 포함하는 눈 전체를 수거한 뒤 4% 파라포름알데히드를 이용해 고정하였다. 이후 파라핀 절편법을 이용해 수직 단면이 되도록 10μm의 두께로 절단한 후, PCNA(proliferating cell nuclear antigen) 또는 E-카데린(cadherin)을 형광 염색하여 각막 세포의 회복을 관찰하였다. 또한, 과요오드산-쉬프염색(periodic acid Schiff: PAS)법을 이용하여 각 시기별로 배상세포의 밀도를 확인하였다.

그 결과, 정상 각막의 상피에서는 기저층(basal layer)에만 국한되어 발현하는 PCNA가 안구건조증 유도 조건에서 그 상부의 익세포(wing cell)에서도 관찰되었으며, 이후 시간이 지남에 따라 정상 각막 상피의 발현 양상으로 돌아가는 양상을 확인하였다. 특히, 리퀴리티제닌 및 덱사메타손의 처리군에서는 생리식염수(NS)의 처리군보다 이러한 양상이 빠른 시기에 일어나므로, 치료의 과정이 빠르게 일어난다는 것을 확인하였다(도 12).

한편, 상피의 기저세포(basal cell), 익세포(wing cell) 및 편평상피세포(squamous cell)를 포함한 전체 세포층에서 관찰되는 E-cadherin은 건성안 유도의 조건에서 일부 기저세포를 제외하고는 염색의 양상이 감소하였으며, 치료과정에서 점진적으로 염색의 강도가 회복됨을 확인하였다. 특히, 리퀴리티제닌 및 덱사메타손의 경우 처리 14일부터 전체 상피층의 염색을 확인하였다. E-cadherin의 염색 양상이 회복되는 것으로 보아, 정상 각막 상피로 회복되는 속도가 생리식염수(NS)보다 빠르다는 것을 확인하였다(도 13)

3-6. qRT PCR에 따른 리퀴리티제닌의 사이토카인 발현 개선 효과 확인

동물모델에서, 안구건조증에 의해 분비된 사이토카인의 수준이 감소되는지 여부를 확인하기 위하여 qRT PCR 분석을 수행하였다.

구체적으로, 마우스의 눈 조직은 각막과 결막, 눈물샘을 분리한 다음 Trizol™ reagent(Thermo fisher scientific)를 이용해 총 RNA를 추출하였다. 각각의 RNA의 정량은 Nanodrop™(thermos fisher scientific)을 이용하였다. cDNA는 High capacity DNA reverse transcription kit(Applied Biosystems, Waltham, MA)를 사용하여 합성하였다. 이후, 뮤신과 염증성 사이토카인들의 발현을 측정하기 위하여, 표 1의 프라이머 및 SYBR® Green PCR Master Mix를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. StepOnePlus™ Realtime PCR 시스템(Applied Biosystems, CA, USA)을 사용하여 분석하였으며, 제조자의 프로토콜에 따라 PCR 반응을 수행하였다.

프라이머명		프라이머 서열(5'→3')	서열번호
MUC1	forward	TGC TTT GTC TAC TGG GGT CT	서열번호 1
	reverse	GAC ATT GAT GGT ACC TTC TCG	서열번호 2
MUC4	forward	TCC GTG ATT CCC TCT ACT TC	서열번호 3
	reverse	CAG GCT GTG TTC ACC ATA GA	서열번호 4
MUC5AC	forward	CAA CGG AGA CTG CGA GTA CA	서열번호 5
	reverse	GAA AAT CTT GAT GGC CTT GG	서열번호 6
MUC7	forward	GAA AGA TTC ACA CTG CAC CAG AGA	서열번호 7
	reverse	AAG TGA GAT TTG GGT GAT TGG TGA	서열번호 8
MUC16	forward	AGT GTC CTT GTG GAT GGG TA	서열번호 9
	reverse	GAT CCT CCA GGT CTA GGT GT	서열번호 10
IL-1β	forward	TGA ACT GAA AGC TCT CCA CC	서열번호 11
	reverse	CTG ATG TAC CAG TTG GGG AA	서열번호 12
IL-6	forward	AGG AGA CTT GCC TGG TGA AA	서열번호 13
	reverse	CAG GGG TGG TTA TTG CAT CT	서열번호 14
IL-8	forward	ATG ACT TCC AAG CTG GCC GT	서열번호 15
	reverse	TGT GGT CCC TCT CAA TCA CTC	서열번호 16
IL-17A	forward	ACC AAT CCC AAA AGG TCC TC	서열번호 17
	reverse	GGG GAC AGA GTT CAT GTG GT	서열번호 18
TNFα	forward	TCA GCC TCT TCT CCT TCC TG	서열번호 19
	reverse	TGA AGA GGA CCT GGG AGT AG	서열번호 20

IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-13, TNFα 및 IFNγ의 발현을 전체적으로 고려한 결과, 리퀴리티제닌의 효과가 덱사메타손 대비 우수함을 확인하였으며, 특히, 치료 초기에 있어서, 효과가 우수함을 확인하였다(도 14 및 도 15).

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for Preventing or Treating Inflammatory Ocular Disease <130> PN180024 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1_forward <400> 1 tgctttgtct actggggtct 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1_reverse <400> 2 gacattgatg gtaccttctc g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC4_forward <400> 3 tccgtgattc cctctacttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC4_reverse <400> 4 caggctgtgt tcaccataga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5AC_forward <400> 5 caacggagac tgcgagtaca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5AC_reverse <400> 6 gaaaatcttg atggccttgg 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC7_forward <400> 7 gaaagattca cactgcacca gaga 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC7_reverse <400> 8 aagtgagatt tgggtgattg gtga 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC16_forward <400> 9 agtgtccttg tggatgggta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC16_reverse <400> 10 gatcctccag gtctaggtgt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b_forward <400> 11 tgaactgaaa gctctccacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b_reverse <400> 12 ctgatgtacc agttggggaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6_forward <400> 13 aggagacttg cctggtgaaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6_reverse <400> 14 caggggtggt tattgcatct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8_forward <400> 15 atgacttcca agctggccgt 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8_reverse <400> 16 tgtggtccct ctcaatcact c 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17A_forward <400> 17 accaatccca aaaggtcctc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17A_reverse <400> 18 ggggacagag ttcatgtggt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFa_forward <400> 19 tcagcctctt ctccttcctg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFa_reverse <400> 20 tgaagaggac ctgggagtag 20

Claims (5)

1. 리퀴리티제닌(liquiritigenin)을 포함하는 염증성 안구표면질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서,
   상기 염증성 안구표면질환은 안구건조증인 것인 염증성 안구표면질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인을 감소시키는 것인 염증성 안구표면질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 손상된 각막세포를 재생하는 것인 염증성 안구표면질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 리포좀, 산제, 분말제, 과립제, 정제, 서방형 제제, 점안제(eye drop) 및 캡슐제로 구성된 군에서 선택되는 제형인 것인 염증성 안구표면질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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