KR101736342B1 - 인삼추출물을 유효성분으로 하는 안과질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼에서 분리한 당지질단백질인 진토닌(gintonin)을 유효성분으로 포함하는 각막 상피세포의 손상치료 및 재생촉진을 위한 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 진토닌은 고농도 LPA를 포함한 약물로써 손상된 각막에서 LPA의 농도를 높여 각막 상피세포의 증식을 유도하여 각막의 손상을 빠르고 탁월하게 회복시키는 효과가 있으므로, 본 발명의 조성물은 사람 및 동물의 각막미란 및 각막궤양의 치료를 위한 의약품 또는 이에 준하는 각막손상에 대한 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인삼추출물을 유효성분으로 하는 안과질환 치료용 조성물{Pharmaceutical composition comprising giseng extracts for prevention and treatment of ophthalmological diseases}

본 발명은 인삼에서 분리한 당지질단백질인 진토닌(gintonin)을 유효성분으로 포함하는 안과 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

인간을 포함한 동물의 눈은 주변 정보의 인식을 통한 정보 전달에 중요한 역할을 한다. 즉, 눈을 통해 주변 환경에 대해 정확한 이미지를 끊임없이 받아들이고 이를 뇌에서 받아들인 정보들을 처리하여 상황에 맞는 행동을 유도하는 다양한 기능들을 수행한다. 신체의 다른 장기들과 마찬가지로 눈에도 다양한 질환들이 발생한다. 가장 흔하게 발생하는 안질환은 각막염이 있고, 녹내장과 백내장과 망막질환이 있다. 특히 각막궤양에 의한 반흔이 전세계적으로 실명과 시력저하의 주된 원인이다. 이런 시력저하는 원인이 되는 진단과 적절한 치료를 하면 예방이 가능하다. (Vaughan General ophthalmology, 15/e 안과학 전국의과대학 안과학 교수편) 또한 각막궤양이 빨리 치료되지 않고 오랫동안 지속되게 되면, 각막에 반흔조직이 형성되게 되고 신생혈관이 각막에 들어오게 되어 각막의 투명도가 떨어지게 되고, 난시가 발생할 수 있게 된다. 그러므로 각막궤양이 모두 치료가 된 뒤에도 시력에 지속적인 좋지 않는 결과를 남기게 될 수 있다. 그러므로 각막궤양의 치료는 가능하면 빨리 궤양이 치료될 수 있게 하는 것이 중요한 치료목표이기도 하다.

또, 최근에 이르러 시력교정을 위하여 엑시머레이저를 이용한 굴절교정 각막수술을 많이 실시하고 있다. 엑시머레이저를 이용하여 각막의 실질조직을 절삭 가공하는 수술법으로 크게 각막의 상피세포를 벗겨내는 방법에 따라 라식 혹은 라섹으로 크게 나누어진다. 이 수술에서 각막상피세포의 손상과 상부의 각막실질세포의 일부 손상으로 인해 시력교정 수술후 각막에 매우 미세하게 남을 수 있는 반흔조직등은 수술후 통증과 합병증에 영향을 미칠 수 있다. 이로 인해 각막 상피세포의 빠른 치유방법은 현재 매우 중요하게 생각되어지는 연구분야이기도 하다. 또한 여러 안과적 시술에서 각막의 상피세포를 보호하고 빠르게 재생하는 것은 궁극적으로 눈의 치료를 효과적으로 하는 중요한 부분이라 할 수 있겠다.

현재 임상이나 수의학 임상에서 여러 원인에 의한 각막 손상에 따른 회복을 촉진하기 위하여 platelet rich plasma (PRP)이나, 혈장의 단백질 성분을 제거한 성분을 개발하여 사용하고 있으나, 아직 어떤 성분이 그 역할을 하는지 밝혀진바 없다.

글리세롤(Glycerol-) 및 스핑고신-기반 인지질(sphingosine-based phospholipids)들은 세포막에 아주 풍부하며, 주로 막을 구성하는 구조적인 성분들이다. 또한, 이들 성분들은 혈액에도 존재하며, 대사과정을 거칠 경우 일부는 리소인지질(lysophospholipids)이 형성된다(Okudaira et al., Biochimie 92, 698-706. 2010).

리소인지질 중에 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC)이 있는데 LPC가 오토탁신(autotaxin)으로도 알려져 있는 리소포스포리파제 D(lysophospholipase D)라는 효소의 작용을 받아 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid, LPA; 1- or 2-acyl-sn-glycerol-3-phosphate)이 생성된다(Aoki, Seminars Cell & Dev. Biol. 15, 477-489, 2004; Okudaira et al., Biochimie 92, 698-706. 2010). 초기에는 LPA가 혈소판이 활성될 때 생성되는 것으로 알려져 지혈, 상처 치유 및 조직 재생과 관련이 있는 것으로 보고되었으나, 최근의 연구에 따르면 LPA는 혈소판 외에, 혈장, 혈청(serum), 타액, 정액(seminal fluid), 난포액(follicular fluid) 등에 존재하며, 혈장에서는 80-100 nM, 혈청에서는 1-5 μM 농도로 존재하는 것으로 알려져 있다(Aoki, Seminars Cell & Dev. Biol. 15, 477-489, 2004). 또한, 지방 세포, 섬유아세포(fibroblast), 뇌 및 여러 기관들과 같은 다양한 세포들에 널리 분포하는 것으로 밝혀졌다(Pages et al., Prostaglandins 64, 1-10, 2001).

혈액에 존재하는 LPA는 주로 혈장 단백질(예, 알부민)과 결합할 경우 더 안정하며, LPA는 주로 혈장 단백질(주로 알부민)과 결합하여 혈액 순환시 혈장 단백질과 같이 순환하면서 타겟 장기에 존재하는 LPA 수용체와 결합하여 그 효과를 발휘한다(Croset et al., Biochem J 345, 61-67, 2000). LPA의 인산기(phosphate group)와 글리세롤 골격(glycerol backbone) 부위가 LPA 작용에 중요한 역할을 하며(Jalink et al., Biochem J. 307, 609-615, 1995), 인산기가 혈액중에 존재하는 LPA는 1~5 M 정도로 존재할지라도, 혈액 혹은 세포막에 있는 리소인지질 인산분해효소(lysophospholipid phosphatase)라는 효소에 의해 LPA의 인산기가 아주 짧은 시간에 제거되어 LPA가 불활성화 되기 때문에, 효소의 영향을 받아 쉽게 대사되지 않고 오랫동안 작용하는 LPA 유사체(LPA analogs)의 합성 혹은 개발에 많은 연구를 진행하고 있으나 아직 임상적 응용에 적합한 화합물은 발견되지 않았다(Pilquil et al., Prostaglandins. 64, 83-92, 2001; Brindley and Pilquil, J Lipid Res. 50 SupplS225-230, 2009; Croset et al., Biochem J 345. 61-67, 2000; Deng et al., Gastroenterology 132. 1834-1851, 2007). 진토닌의 단백질 성분이 LPAs을 보호하며 안정시키는 안정제 역할을 하는 것으로 예상하고 있다.

대한민국 등록특허 10-1182115

본 연구자들은 다양한 원인들에 의하여 생기는 안과질환 특히 각막질환 회복에 LPA가 관여하고 있음을 인지하여 진토닌이 가진 특징을 이용해 각막손상에 대한 치료제를 개발하였다. 또한 토끼를 이용한 in vivo 연구 및 동물병원에 내원하는 안과 질환이 있는 개의 치료 효능에 대한 연구로서 진토닌이 눈의 각막 손상 혹은 눈의 감염으로 각막염을 빠른 치료를 유도하는 효능이 기존의 사용 약물에 비하여 우수함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 진토닌(gintonin)을 유효성분으로 포함하는 안과 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 진토닌(gintonin)을 유효성분으로 포함하는 안과 질환의 개선용 건강기능식을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 안구에 진토닌(gintonin)을 처리하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 안과 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시험관 내에서 각막세포에 진토닌을 처리하는 단계를 포함하는, 각막세포의 손상을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 마지막 목적은 인삼분말에 알콜을 가하여 추출하여 알콜추출물을 제조는 단계; 상기 알콜추출물을 음이온 교환수지를 이용하여 회수하는 단계; 공극크기(pose size) 6,000~8,000의 투석막으로 분획하는 단계;를 포함하는 진토닌(gintonin)을 유효성분으로 포함하는 안과 질환의 예방 또는 치료용 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 진토닌(gintonin)을 유효성분으로 포함하는 안과 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 진토닌은 인삼으로부터 분리한 당지질단백질인 것을 특징으로 하는 안과 질환의 예방 또는 치료용 조성물.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 진토닌은 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올 중에서 하나 이상을 용매로 선택하여 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 진토닌은 음이온 교환수지를 이용하여 저분자 물질을 제거한 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인삼은 인삼의 뿌리(root), 잎(leaves), 줄기(stem), 열매 및 꽃으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인삼은 홍삼, 수삼, 백삼, 재배삼, 장뇌삼, 산삼, 인삼 및 홍삼 부산물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인삼은 고려삼(Panax ginseng), 회기삼(P.quiquefolius), 전칠삼(P.notoginseng), 죽절삼(P.japonicus), 삼엽삼(P.trifolium), 히말라야삼(P.pseudoginseng), 베트남삼(P.vietnamensis) 및 미국삼(Panax quinquefolium)으로 이루어진 군중에서 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 진토닌은 125 내지 1000 μg/ml 농도 일 수 있다.을 특징으로 하는 안과 질환의 예방 또는 치료용 조성물.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 진토닌은 250 내지 750 μg/ml 농도인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 점안용 액제 또는 주사제인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 안과 질환은 각막질환, 안구 건조증, 결막염, 트라코마(Trachoma), 상공막염, 포도막염, 녹내장, 백내장, 황반변성증, 비문증, 망막혈관 폐쇄증, 유리체 출혈, 망막박리, 및 중심성 망막증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 각막질환은 각막미란, 각막궤양 또는 각막손상인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 진토닌은 세포에서 LPA 수용체들을 활성시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 진토닌은 세포질내의 유리 칼슘(Ca^{2 +}) 농도를 높이는 것일 수 있다.

또한, 진토닌(gintonin)을 유효성분으로 포함하는 안과 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 안구에 진토닌(gintonin)을 처리하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 안과 질환의 치료방법을 제공한다.

또한, 시험관 내에서 각막세포에 진토닌을 처리하는 단계를 포함하는, 각막세포의 손상을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 각막세포는 human corneal epithelial세포일 수 있다.

또한, 인삼분말에 알콜을 가하여 추출하여 알콜추출물을 제조는 단계; 상기 알콜추출물을 음이온 교환수지를 이용하여 회수하는 단계; 공극크기(pose size) 6,000~8,000의 투석막으로 분획하는 단계;를 포함하는 진토닌(gintonin)을 유효성분으로 포함하는 안과 질환의 예방 또는 치료용 조성물 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 알콜추출물은 환류냉각추출하는 것일 수 있다.

본 발명의 인삼에서 분리한 진토닌은 여러 원인에 의한 손상된 세포를 빠르게 재생시키는 기작을 통해 각막 손상의 치유, 감염으로 인한 각막염, 결막염, 상공막염, 포도막염 등을 효과적으로 치료하여 눈의 정상적인 기능을 발휘하도록 하는 효과가 있다.

또한 당지질단백질이 풍부하여 안구 건조증, 황반변성증, 비문증 등의 치료효과가 있으며, 칼슘채널의 조절을 통해 녹내장, 백내장, 망막혈관 폐쇄증, 유리체 출혈, 망막박리, 및 중심성 망막증의 치료를 위한 의약품으로 인간이나 동물에서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 진토닌이 human corneal epithelial-T (HCE-T) cells를 이용한 실험에서 in vitro 상처 치유 (cell migration)를 촉진하는지 나타낸 사진이다. 이때 (A) 다양한 농도의 진토닌이 HCE-T 세포 이동에 미치는 영향. (B) 진토닌에 대한 LPA receptor 길항제의 영향 및 PRP에 의한 cell migration 영향. (C) Cell migration에 대한 진토닌 및 PRP의 영향을 요약한 것이다 (^* p < 0.01, compared to 대조군 (con)).
도 2는 진토닌이 human corneal epithelial-T (HCE-T) cells에서 세포질내 칼슘 농도를 일시적으로 증가시킬 수 있는지 나타낸 사진이다. 이때 (A) 농도 의존적 영향 (B) LPA receptor 길항제인 Ki16425의 영향. (C) PRP에 의한 세포질내 칼슘 농도 변화 측정한 것이다.
도 3은 토끼를 이용한 실험으로 각막 손상 치료에 가장 적절한 진토닌의 농도를 확인한 사진이다.
도 4은 토끼를 이용한 실험에서 진토닌 (500 μg/ml)에 의한 각막 손상 치료 효과에 대한 사진이다.
도 5은 진토닌 (500 μg/ml) 처리에 따른 각막염 치료 효과를 확인한 사진이다.
도 6는 진토닌(500 μg/ml)을 사용한 증례와 진토닌을 사용하지 않은 증례의 비교를 통해 진토닌 처리에 따른 각막 궤양 치료 효과를 확인한 사진이다.
도 7은 진토닌 (500 μg/ml) 처리로 인해 각막외피의 재생이 기존의 방법보다 촉진된다는 것을 확인한 사진이다.
도 8는 진토닌 (500 g/ml) 처리에 따른 각막외피의 재생이 기존의 방법보다 촉진된다는 것을 확인한 사진이다.
도 9는 진토닌(500 μg/ml)을 사용한 증례와 진토닌을 사용하지 않은 증례의 비교를 통해 진토닌 처리에 따른 각막 궤양 치료 효과를 확인한 사진이다.

본 발명은 진토닌(gintonin)을 유효성분으로 하는 조성물을 안과 질환에 사용하기 위한 것에 그 특징이 있다.

종래 안과 질환에 다양한 치료제가 있으나, 안과 질환에는 그 원인이 불명하고 대증요법이 대부분을 차지하며, 치료에 장시간이 소요되어 치료 후에 시력이 저하되는 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은 진토닌을 포함하는 조성물을 눈과 관련된 세포에 처리하는 경우 손상이 일어난 세포를 빠르게 재생하며 동시에 후유증을 최소화할 수 있음을 발견하였다.

본 발명에서 진토닌(gintonin)이란 인삼에서 분리한 당지질단백질로서 본 발명자들은 최근 연구에서 종래 인삼의 특징들이 진세노사이드가 아닌 단백질, 탄수화물 및 지방으로 구성된 새로운 당지질단백질(glycolipoprotein)에 기인한다는 것을 증명하였으며, 상기 당지질단백질을 인삼으로부터 순수 분리 동정하여 이를 진토닌(gintonin)으로 명명하였다(국내특허출원 제2009-0110662호 참조).

또한 기존의 신규 당지질 단백질인 진토닌의 제조방법은 (1) 인삼으로부터 메탄올 추출물을 제조하는 단계; (2) 상기 메탄올 추출물을 물과 n-부탄올의 혼합용매로 분획하는 단계; (3) 상기 물 분획물과 n-부탄올 분획물 중 n-부탄올 분획물을 용출용매로서 클로로포름:메탄올:물의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 8개의 분획으로 분리하는 단계; (4) 상기 8개의 분획물 중 CaCC(Ca^{2 +}-activated Chloride Channel)에 대한 활성이 가장 높은 7번째 분획물을 용출용매로서 에탄올:에틸아세테이트:물의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 2개의 분획으로 분리하는 단계; (5) 상기 2개의 분획물 중 CaCC 활성이 높은 분획물 를 투석하여 최종 생성물을 얻는 단계를 통해서 제조한다(등록특허 10-0973202).

본 특허출원에서 인삼의 뿌리(root), 잎(leaves), 줄기(stem), 열매 및 꽃으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 홍삼, 수삼, 백삼, 재배삼, 장뇌삼, 산삼, 인삼 및 홍삼 부산물 모두가 이용될 수 있다. 특히 인삼은 고려삼(Panax ginseng), 회기삼(P.quiquefolius), 전칠삼(P.notoginseng), 죽절삼(P.japonicus), 삼엽삼(P.trifolium), 히말라야삼(P.pseudoginseng), 베트남삼(P.vietnamensis) 또는 미국삼(Panax quinquefolium)이 사용될 수 있고, 삼의 종류에 한정되지 않는다.

본 특허출원에서 안과 질환 또는 안질환(Eye Disease)이란 망막(retina), 각막(cornea), 결막(conjunctiva), 포도막(uveal tract), 전안부 또는 외안부에 발생하는 질환 및 녹내장(glaucoma), 백내장(cataract) 등을 의미하는 것이다.

각막염(keratitis)이란, 각막에 염증이 생겨 통증, 충혈, 시력 감소, 각막 혼탁 등을 초래하는 질환이며, 안구 건조증이란 눈물이 부족하거나 눈물이 지나치게 증발하거나 눈물 구성성분의 균형이 맞지 않아서, 안구 표면이 손상되고 눈이 시리고 자극감, 이물감, 건조감 같은 자극증상을 느끼게 되는 눈의 질환을 말한다.

각막손상이란 각막에 손상을 입음으로써 투명한 시각의 손상을 야기하는 모든 질환이나 손상을 말하는 것으로서, 각막궤양은 눈 앞부분의 투명한 조직인 각막에 손상이 있을 때 세균이나 바이러스, 진균 또는 여러 가지 원인 등에 의해서 염증이 발생하고 이에 따라 각막의 일부가 움푹 파이는 것이다. 또한 각막미란(Corneal erosion 또는 각막상피박리, 각막상피미란이라고도 함)이란 기계적, 화학적 외상에 의해서 생기는 것 외에 대부분이 부종성염증, 변성성 질환에 자주 발생한다. 상피박리의 부위는 엷은 혼탁을 수반하고 조직결손을 육안적으로 알 수 있는 것. 미세 현미경에 의존하지 않으면 알 수 없는 것이 있다. 0.2% 풀오레세인을 한방울 점안해서 청(靑)필터를 걸어 보면 정상상피는 풀어레세인을 받아들이는 일은 없는데 결손 또는 파괴된 부분에는 들어가 황색의 형광을 발한다.

결막(conjunctiva)은 눈(안구)을 외부에서 감싸고 있는 조직이며 감염성 결막염은 세균, 바이러스, 진균(곰팡이균) 등의 여러 가지 병원균에 감염되어 발생하며, 비감염성 결막염은 외부 물질에 대한 알레르기 반응으로 발생하는 알레르기성 결막염과 같이 비감염성 요인에 의해 발생한다.

포도막이란 안구의 중간층을 형성하는 홍채(눈을 앞에서 봤을 때 검은자로 불리는 각막 안쪽의 갈색 조직), 모양체, 맥락막을 말하는데, 이 곳에 생기는 염증을 포도막염이라고 한다.

녹내장은 안압의 상승으로 인해 시신경이 눌리거나 혈액 공급에 장애가 생겨 시신경의 기능에 이상을 초래하는 질환이며, 백내장은 수정체가 혼탁해져 빛을 제대로 통과시키지 못하게 되면서 안개가 낀 것처럼 시야가 뿌옇게 보이게 되는 질환을 말한다.

녹내장의 치료는 급성인 경우 빨리 안압을 떨어뜨려 시신경을 보존하는 것이 중요하다. 먼저 안압을 내리는 안약을 점안하고, 입을 통해 안압하강제를 복용하고, 고삼투압제를 정맥주사로 투여하는 등의 처치를 통해 신속히 안압을 내린다. 안압이 내려간 후에는 홍채에 레이저를 이용하여 작은 구멍을 뚫어 방수의 순환 및 배출을 돕는다. 또한 만성인 경우에는 더 이상의 시신경 손상을 막기 위해 안압하강제를 점안하며 한 가지 약물이 효과가 없다면 다양한 계열의 약품을 사용한다.

눈의 안쪽 망막의 중심부에 위치한 신경조직을 황반이라고 하는데, 시세포의 대부분이 이곳에 모여 있고 물체의 상이 맺히는 곳도 황반의 중심이므로 시력에 대단히 중요한 역할을 담당하고 있다. 여러 가지 원인에 의해 이 황반부에 변성이 일어나 시력장애를 일으키는 질환을 황반변성증이라 한다. 또한 망막혈관 폐쇄증이란 망막을 흐르는 혈관이 하나둘 막히게 되어 시력감소가 발생하는 증상이며, 중심성 망막증이란 망막에 손상이 생겨서 물이 차는 증상이다.

비문증은 대부분 연령의 증가에 따른 유리체(또는 초자체)의 변화에 의해서 생긴다.

본 발명에서 LPA란 Lysophosphatidic acid를 의미하며, 포스파티드산의 2위 아실기가 유리하여 히드록실기가 된 형태의 리소체인지질. 수용성이 크며 글리세롤-3-인산으로부터 인지질의 de novo합성에서 최초 중간체였다가 급속하게 포스파티드산으로 변환하기 때문에 생체 내에는 극미량만이 존재한다. 혈소판 등에서자극에 응답하여 만들어낸 것, 배양 섬유아세포에 대하여 증직항진작용이 있는 것, 세포막에 특이적 수용체가 존재할 가능성이 있는 것 등을 시사하여 생리활성지질로서 주목받고 있다. 또한 수용체란 지질성 매개체의 하나인 리소포스파티드산은 G단백질과 공역한 정보전달경로를 활성화하는 것으로 알려져 있어, 최근 2종류의 수용체유전자를 확인하였다. 불사화(不死化)한 마우스뉴런에서 클로닝한 vzg-1은 마우스 내피세포분화유전자로 동정한 Edg-2의 상동유전자이며, Gi단백질과 G12/13단백질에 연결된 정보전달계를 활성화한다.

본 발명의 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어인 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 진토닌은 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 진토닌 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 조성물에는 125 내지 1000 μg/ml의 진토닌이 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 상기 진토닌을 투여하는 것을 포함하는 안과질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 진토닌 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 조성물에 포함되는 진토닌은 250 내지 750 μg/ml 농도를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 진토닌을 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으나, 바람직하게는 점안용 액제 또는 주사제인 것이 바람직 하다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 진토닌을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 천연 탄수화물은 예를 들어, 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올 등이 있다. 또한, 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율을 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 주정 (에탄올)을 이용한 인삼 뿌리에서의 조 진토닌 ( crude gintonin ) 분리

한국인삼공사(대전, 한국)에서 구입한 4년근 백삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 분말 500 g을 80~100%(w/v) 주정 (에탄올) 5 를 가하여 8시간 동안 약 80에서 환류냉각추출하여 여과한 다음(상기 과정을 3회 반복), 진공농축기에서 농축한 후 투석(투석막 공극크기(pose size): 6,000~8,000) 및 동결 건조하여 에탄올 추출물 30 g을 얻었다.

상기 주정 추출물은 50%(w/v) 에탄올을 포함하고 있는 20 mM Tris-HCl(pH 8.2)에 녹인 후 같은 용매로 미리 충진된 DEAE sepharose 음이온 교환수지 컬럼에 로딩(loading)하여 용출용매를 충분히 통과시켰다. 이때 용출용매로는 50% 에탄올을 포함하고 있는 20 mM Tris-HCl(pH 8.2)를 사용하였으며, 컬럼에 결합되지 않은 물질, 즉 음전하는 띠지 않는 진세노사이드(ginsenoside) 등 또는 기타 저분자 물질은 충분히 제거한 다음 1 M HCl과 50%(w/v) 주정 에탄올을 포함하고 있는 20 mM Tris-HCl(pH 8.2)을 통과시켜 음이온 교환수지 컬럼에 결합된 물질을 회수하였다.

컬럼에서 회수한 물질은 공극크기(pose size) 6,000~8,000의 투석막에 넣고 투석하여 함유된 염과 에탄올을 제거한 후, 동결 건조하여 조 진토닌 분획 1,000 수득하였다(수율: 0.2 %).

상기 에탄올 추출물(EtOH ext.)에는 Xenopus oocytes에 내인성으로 존재하는 CaCC(Ca²⁺ activated Chloride Channel)를 약하게 활성시키는 성분(CaCC는 100 μg/㎖로 측정)이 존재하며, 단순한 크로마토그래피를 통하여 에탄올 추출물로부터 CaCC 활성(CaCC는 1 μg/㎖로 측정)이 높은 조 진토닌을 쉽게 분리할 수 있음을 보여주고 있다. 그러나, 음이온 교환수지에 결합되지 않은 성분(unbound components)는 CaCC 활성이 없는 것으로 나타났다 (특허 등록 제 10-1305000호).

< 실험예 1>

1-1. Human corneal epithelial cell -T ( HCE -T) 배양

HCE-T cell (RCB-2280)를 Riken cell bank에서 구입하였다. HCE-T 세포 배양은 DMEM-Ham F12 (1:1)배지에 10% FCS가 포함된 배지에서 배양하였다 (Araki-sasaki et al., Investigative Ophthalmology and Visual Science 36, 614-621, 1995; Araki-sasaki et al., J cellular Physiol. 182, 189-195, 2000).

1-2. scratch wound healing 방법을 이용한 각막 상처 치료

HCE-T (2.5x10⁵/well)을 24-well plate에 심고 24시간 배양한 다음, 다시 0.2% FBS 함유 DMEM 배지에서 6시간 배양했다. 200-L 파이펫 팁으로 세포가 자란 각 well의 중앙에 선을 그어 상처를 낸 다음, 떠오른 세포를 제거하기 위해 1% FBS 함유 DMEM 배지로 2회 세척했다. 이 세포들에 진토닌 (0.03-1 μg/ml)을 처리하고 배양하여, 각 well의 진토닌 처리 이전과 이후의 세포 모양을 Inverted Fluorescence microscope (AxioVert200; Carl Zeiss)로 관찰, 사진 촬영하여 (100x), 진토닌을 처리하지 않은 세포와 비교하였다.

파이펫 팁으로 상처 낸 부분에서 세포가 자라는 정도의 분석에는, AxioVision을 이용하여 세포가 회복되지 않은 상처 부위 면적을 측정했다. 도 1A에 나타난 바와 같이 scratch wound를 낼 경우 약물을 처리하지 않은 그룹은 24시간이 지나도 scratching 부분을 다 메꿔 주지 않지만, 진토닌을 처리할 경우에는 이 메꿰주는 (cell migration) 작용이 투여 농도별로 증가되는 것으로 나타났다.

LPA1/3 receptor 길항제 (antagonist)를 처리할 경우 진토닌에 의한 cell migration이 억제되는 것으로 나타났고, platalet rich plasma (PRP)를 500 배 및 5000배 희석할 경우에 cell migration 작용을 유발하여 scratch wound를 치료하는 것으로 나타났다. 또한 진토닌이 HCE-T cell에서 scratch wound를 치료하는 결과를 요약한 것을 도 1C에 나타내었다.

1-3. Fura 2와 HCE -T 세포의 혼합

본 발명에서는 진토닌이 HCE-T 세포의 상처 치유를 위한 migration을 자극하는 것으로 나타나 HCE-T 세포에 진토닌의 처리가 Fura 2-loaded mouse HCE-T 세포 에서 [Ca^{2 +}]_i의 일시적 증가에 효과를 나타내는지를 확인하기 위하여, Fura-2로 전처리한 HCE-T 세포(2~4x10⁶ cell/㎖)를 1.5 mM Ca^{2 +} 함유 완충액(buffer) 또는 Ca^{2 +} 미함유 완충액에 현탁하여 37 ℃에서 10분간 배양한 후 진토닌을 농도별로 첨가하고 HCE-T 세포에서 세포 내 칼슘 농도에 미치는 효과를 확인하였다.

구체적으로, JØrgensen 등의 방법에 따라 NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl₂ 1 mM, CaCl₂ 1.5 mM, 글루코오스 10 mM, 및 HEPES 25 mM로 구성된 Ca^{2 +} 함유 완충액(pH 7.4)과 NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl₂ 1 mM, EGTA 0.2 mM, 글루코오스 10 mM, 및 HEPES 25 mM로 구성된 Ca^{2 +} 미함유 완충액(pH 7.4)을 사용하여 37 배양기에서 30분간 진탕하면서 2.5 M Fura 2-AM에 HCE-T 세포(1~2x10⁶ cell/㎖)를 혼합하고, 과량의 fura-2는 세포를 Ca^{2 +} 완충액 또는 Ca^{2 +} 유리 완충액으로 3번 씻어서 제거하였다.

1-4. 세포 부유물 내 [ Ca ^{2 +} ] _i 의 형광측정

[Ca^{2 +}]_i는 RF-5300PC 세포내 이온 측정 시스템(Intracellular Ion Measurement System; Shimadzu Corporation, Japan)을 사용하여 Fura 2-loaded cell에서 추정하였다. 구체적으로, Fura 2-loaded cell은 최종적으로 2~4x10⁶ cell/㎖ 실험 완충액에서 희석한 후, 폴리스틸렌 큐벳(Elkay Ultra-UV)으로 옮겼다. 세포는 테플론 코팅된 자석을 사용하여 교반하였으며, 큐벳 하우징은 37 ℃로 조절하였다. 여기 파장들(excitation wavelengths)들은 컴퓨터 제어 하에서 340 nm 및 380 nm 사이를 교대하였고, 방출(emission)은 510 nm에서 검출하였다. 이때, 여기 및 방출 틈새 너비는 3 nm로 하였으며, 배경 보정은 JØrgensen 등의 방법에 준하여 실시하되, 디지토닌(digitonin) 및 EGTA는 fura-2가 완전하게 Ca^{2 +}와 화합하고 Ca^{2 +}로부터 해리되는 상태를 만들기 위한 농축 반응 시약(concentration adjustment reagent)으로 사용하였다.

1-5. Fura 2 측정값으로부터 [ Ca ^{2 +} ] _i 의 추정

측정된 340 nm 대 380 nm의 비율값(ratio value)은 Hounsell 등의 식(Hounsell, E.F., Davies, M.J., and Smith, K.D. (1997) Protein protocol handbood , Humanna press, Totawa, 803-804)을 사용하여 [Ca^{2 +}]_i의 값으로 변환하였다.

단, K _d는 해리 상수(224 nM)이며, R은 측정된 340 nm 대 380 nm의 형광비(fluorescence ratio)이고, R_max 및 R_min는 50 ㎍/㎖ 디지토닌을 첨가한 포화 농도에서의 R값 및 20 mM EGTA를 첨가한 유리 배지에서의 R값이다. 또한, S_f380와 S_b380는 디지토닌과 EGTA를 첨가했을 때 380 nm에서의 형광 세기(fluorescene intensity)이고, 비율은 이들 값이 표시될 때의 최대 및 최소값이다(Grynkiewicz, G., M. Poenie, and R. Y. Tsien. (1985) J Biol Chem 260: 3440-3450).

1-6. 칼슘( Ca ^{2 +} ) 농도([ Ca ^{2 +} ] _i ) 조절에 의한 녹내장 치료

녹내장은 안압의 상승으로 발생하며, 안구 내의 안압 조절을 위해서는 칼슘채널이 중요한 역할을 하는 것이 최근 논문 등을 통해서 알려지고 있다. 또한 lysophosphatidic acid (LPA)는 GTP-결합 단백질(GTP-binding protein, G protein)과 연결(coupled)된 수용체들, 특히 G_{q /11} → 인지질분해효소(phospholipase) C → IP₃ → Ca^{2 +} 경로(pathway) → PKC(protein kinase C) 활성으로 이어지는 수용체의 활성이 세포내 유리(free) 칼슘(Ca^{2 +}) 농도([Ca^{2 +}]_i)를 높이는 것으로 보고되고 있다(Hwang et al., Mol Cells. 33(2):151-162, 2012). 또한 일부 정상 안압 녹내장 환자에서 칼슘차단제(calcium Channel blocker)의 사용이 혈관연축(vasospasm)의 완화작용을 통해 병의 진행속도를 늦추었다는 보고가 있었다.

본 발명자들은 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 얻은 식용 가능한 조 진토닌의 구성 성분 중 생리학적/약리학적 주요 효능을 발휘하는지를 확인하고자 하였으며, 상세한 화학 조성 및 그 역할을 연구하는 과정에서 최초로 인삼에 생리학적/약리학적 활성이 있는 GPCR 리간드인 리소포스파티딘산들(LPAs), 특히 LPA C_{18 :2}이 다량 존재하며, 일시적으로 세포질내 유리 Ca^{2 +}(Free Ca^{2 +})의 증가 활성을 유발하고, 유리 LPA(free LPA)에 비하여 세포질내 유리 Ca^{2 +}(Free Ca^{2 +})의 증가 활성을 오랫동안 유지하여 주는 안정된 형태의 당 및 단백질과 복합체 (complex)로 되어있음을 발견하고 본 발명을 완성하여 특허를 출원하였다 (특허 출원 제 10-2011-0744070호 인삼으로부터 분리 동정한 리소포스파티딘산 및 그 제조 방법).

또한, 본 발명자들은 에탄올을 이용하여 인삼으로부터 얻은 식용 가능한 조 진토닌에 함유되어 있는 진토닌이 여러 종류의 LPA 수용체 subtypes을 높은 친화성 (high affinity)으로 활성시키는 것을 발견하고 본 발명을 완성하여 특허를 출원하였다 (특허 출원 제 10-2011-0094194호 인삼으로부터 분리 동정한 당지질단백질 진토닌의 천연약용 식물 유래 리간드로서의 용도). 진토닌은 LPA 수용체들을 활성시키지는 작용도 있지만, 진토닌 특징들 중의 하나는 LPA C_{18 :2}가 다른 LPAs에 비하여 현저하게 많이 함유되어 있는 것으로 나타났다 (특허 출원 제 10-2011-0744070호 인삼으로부터 분리 동정한 리소포스파티딘산 및 그 제조 방법).

본 발명자들은 진토닌은 세포막에 존재하는 LPA 수용체들을 활성시키며, Gq/11 proteins → PLC → IP₃ 수용체 → ER Ca^{2 +} 저장고 → Ca^{2 +} 방출을 통해 세포내 칼슘을 증가시키는 신호전달 과정으로 연결되어 있는 신호전달 경로를 통하여 이루어지는 것을 확인하였다. 따라서, 진토닌을 함유하는 본 특허 조성물에 의하면 Ca^{2 +} 채널(calcium channel)의 조절이 가능하며 녹내장의 치료에 사용되는 고삼투압제로 사용되어 녹내장의 치료가 가능하다는 것을 확인하였다.

1-7. 칼슘( Ca ^{2 +} ) 농도([ Ca ^{2 +} ] _i ) 조절에 의한 백내장 치료

백내장은 수정체가 혼탁해져 빛을 제대로 통과시키지 못하게 되면서 안개가 낀 것처럼 시야가 뿌옇게 보이게 되는 질환을 말하며, 선천성 백내장은 대부분 원인 불명이며 유전성이거나 태내 감염(자궁 내의 태아에게 발생하는 감염), 대사 이상에 의한 것도 있으며, 후천성 백내장은 나이가 들면서 발생하는 노년 백내장이 가장 흔하며, 외상이나 전신질환, 눈 속의 염증에 의해 생기는 백내장도 있다.

하지만, 칼슘이 백내장 형성에 중요한 역할을 한다는 것은 많은 연구결과로 알려져 있으며, 외부 칼슘농도가 1 mM 농도 이하로 떨어지면 안구의 투명도가 변경된다는 사실이 밝혀져 있다(Duncan G et al., Ciba Found Symp. 1984;106:132-52. Richardson NL et al., The Journal of Nutrition [1985, 115(5):553-567], K.R. Hightower et al., Experimental Eye Research Volume 34, Issue 3, March 1982, Pages 413421). 따라서, 본 발명자들은 Ca^{2 +} 채널(calcium channel)의 조절이 가능하다면 백내장의 치료가 가능하다는 것을 확인하였다.

1-8. 통계

모든 데이터는 Student's t-test를 사용하여 대조군과 실험군 사이의 통계 비교를 수행하였다. 통계학적 유의성은 p<0.05에서 고려되었다. 동물 실험 데이터는 Newman-Keuls test에 이어 일원분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)를 사용하여 분석하였다.

1-9. HCE -T cell 에서 세포이동 촉진 효과

배양한 HCE-T cell에 scratch wounding을 하고 난 다음 진토닌을 농도별로 처리할 경우 진토닌은 낮은 농도 (0.03-0.1 ㎍/㎖)에서 HCE-T cells의 이동을 촉진시키는 것으로 나타났으나, 1 ㎍/㎖에서는 그 효과가 줄어드는 것으로 나타났다 (도 1). 이러한 실험 결과는 진토닌의 작용이 1 ㎍/㎖보다 더 낮은 농도에서 효과적으로 작용함을 보여주고 있다. 진토닌의 작용이 LPA 수용체 활성을 통하여 이루어지는 가를 확인하기 위하여 진토닌 처리전에 LPA1/3 receptor 길항제인 Ki16425를 처리할 경우 진토닌의 작용이 억제되는 것으로 나타나 진토닌에 의한 cell migration 촉진 작용은 LPA receptor를 통하여 이루어짐을 보여주고 있다. 또한 비교실험으로서 희석한 PRP를 처리할 경우에도 세포이동이 촉진되는 것으로 나타났다 (도 1C).

1-10. HCE -T cell 에서 세포질내 칼슘증가 작용 효과

세포질내 칼슘의 증가는 상처 치유 및 상처 치유를 위한 세포이동 (cell migration)에 필수적인 요소로 알려져 있다 (Chi and Trinkaus-Randall, J Cell Physiol. 228(5):925-929, 2013). 따라서 진토닌이 HCE-T cell에서의 세포질내 농도 변화를 측정한 결과, 진토닌은 처리 농도별로 HCE-T의 세포질내 칼슘 농도를 증가시키는 것으로 나타났다. 진토닌에 의한 cell migration 촉진 효과를 나타내는 농도에서 세포질내 칼슘 농도를 증가시키는 것으로 나타났다. 1 ㎍/㎖의 진토닌을 처리할 경우 더 낮은 농도의 진토닌 처리시보다 세포질내 칼슘 농도가 줄은 것은 아마도 LPA receptor의 탈감작에 기인한다.

진토닌에 의한 세포질내 칼슘 증가 작용은 LPA1/3 receptor 길항제인 Ki16425에 의하여 차단되는 것으로 나타나 진토닌에 의한 세포질내 칼슘 증가는 LPA 수용체 활성을 통하여 이루어짐을 보여주고 있다. PRP의 경우 cell migration에 영향을 미치는 희석 농도 (1:500)에서는 세포질내 칼슘 농도를 증가시키지 않은 것으로 나왔고, 더 높은 농도에서만 진토닌의 경우보다 낮지만 세포질내 칼슘농도를 증가시키는 것으로 나타났다 (도 2).

진토닌에 의한 scratch wounding healing (상처 치유)는 세포질내 칼슘 농도 증가에 기인하는 것으로 예상되지만, PRP의 경우에는 세포질내 칼슘 농도 변화와 관계없는 경로를 통하여 이루어질 수 있는 가능성을 보여주고 있다. 이러한 결과로부터 진토닌이 녹내장 치료에 효과적인 것을 확인하였다.

< 실험예 2>

2-1. 실험동물 준비

1.6-2 kg의 웅성 뉴질랜드화이트 토끼 25마리를 주문함. 수컷. 건국대학교 실험동물윤리위원회의 승인을 받은 후 실험을 다음과 같이 실시함. 사용한 시약은 다음과 같다; saline 30 ml (대한 멸균생리식염수 100ml, 대한약품공업주식회사), 30cc 주사기 2개, 100% alcohol, 멸균된 면봉, Telbit eye drop 3 mg/ml (oflxacin 3mg/ml, 6ml, 점안 항생제, 대우제약), Alcaine eye drop 0.5% (proparacaine Hydrochloride 5mg/ml, 15ml, 점안 마취액, 한국알콘), Fluorescein sodium ophthalmic strips (1 Strip/Pouch, 10 Pouches, 안과용 형광 염색시약 strip, Tianjin Jingming New Technological Development Co., Ltd, China), 세극등 현미경(Hawk eye, Dioptrix, France), Amolis epithelial scrubber, 면봉, 솜거즈, 안약용 진토닌, 기존에 사용하고 있는 Solcorin eye drops 0.4ml (한림제약).

2-2. 토끼눈 각막 상피 손상 유도를 이용한 안약으로써의 진토닌의 농도분석

실험군은 다음과 같이 5 가지 그룹으로 나눈다. 각막 손상후 진토닌을 처리하지 않은 그룹, 각막 손상후 125 ㎍/㎖ 농도의 진토닌을 처리한 그룹, 각막 손상 후 250 ㎍/㎖ 농도의 진토닌을 처리한 그룹, 500 ㎍/㎖ 농도의 진토닌을 처리한 그룹, 그리고 1000 ㎍/㎖ 농도의 진토닌을 처리한 그룹으로 5개의 그룹으로 나눈다. 눈의 국소마취 후 100 % 알코올을 각막에 20초 적용한 후, Amolis epithelial scrubber을 이용하여 각막의 epithelium을 모두 제거해 버린다. 이후 각막에 형광염색 (fluorescein test)을 하여서 각막의 epithelium이 벗겨져 버린 부위를 확인한 후 cobalt blue light하에서 세극등 현미경을 이용하여 형광염색이 된 부위의 사진을 찍어 영상을 확보하였다. 6시간마다 한번 씩으로 총 4번 안약(약물)투여 후 30시간 후에 다시 눈에 형광염색을 하여 각막의 epithelium이 재생된 정도를 확인한 후 cobalt blue light하에서 세극등 현미경으로 사진을 찍어 치료된 각막의 영상 또한 확보하였다. 이 사진을 근거로 형광염색이 된 각막의 면적을 Image Pro Plus program (Version 4.5.0.29, Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD)를 이용해서 측정하였다. 각막의 epithelium이 치유된 면적은 각막에서 처음 형광염색이 되었던 면적에서 약물을 적용한 후 각막에서 형광염색이 되었던 면적을 뺀 것으로해서 면적을 구하였다. 이렇게 형광사진을 찍고 난 뒤에 토끼는 프로바이브 주 1% 20ml (propofol 10mg/ml, 정맥용 전신마취제, 명문제약(주)로 마취를 한 후에 KCl (KCl-40 inj., Dainhan Pharm Co.Ltd, Korea)로 안락사를 실시한 후 눈을 적출하여 고정하였다.

2-3. 토끼눈 각막 상피 손상 유도를 이용한 각막 상피재생 능력에 대한 비교

실험군은 다음과 같이 3가지 그룹으로 나눈다. 각막 손상후 진토닌을 처리하지 않은 그룹, 각막 손상후 진토닌을 처리한 그룹, 각막 손상 후 진토닌과 비교 약물로서 시판되고 있는 솔크린을 처리한 그룹으로 나눈다. 각막 상피의 제거방법과 상피의 재생정도를 보는 방법은 위의 2-1과 같은 방법을 사용하였고, 각막상피 제거후 안약은 6시간마다 한번 씩으로 총 12번 안약(약물)을 투여 후 72시간 후에 각막재생정도를 위의 2-1과 같이 형광염색을 하여 cobalt blue light하에서 세극증 현미경 사진을 찍어 확인하였다. 또한 형광사진을 찍고 난 뒤에 토끼는 프로바이브주 1% 20ml (propofol 10 mg/ml, 정맥용 전신마취제, 명문제약(주)로 마취를 한 후에 KCl (KCl-40 inj., Dainhan Pharm Co.Ltd, Korea)로 안락사를 실시한 후 눈을 적출하여 고정하였다.

2-4. 토끼를 이용한 실험에서 진토닌의 농도에 따른 각막손상 치료효과

치료에 가장 효과적인 진토닌의 농도를 확인하기 위해 토끼의 각막을 이용하여 가장 좋은 각막치료효과를 얻을 수 있는 진토닌의 농도를 알아보았다. 토끼의 각막의 외피를 제거해 손상시킨 다음 형광물질을 이용하여 염색을 실시하여 도3에서 보는 바와 같이 안구가 전반적으로 녹색으로 염색됨을 관찰할 수 있다. 이후 진토닌을 농도별로 5개의 그룹으로 나누어 진토닌을 각막에 하루 동안 4번 투여하여 처리하고 24시간 후 다시 형광물질로 염색하여 염색이 되는 면적을 확인하여 처음 염색이 된 부위에서 24시간 후 염색이 되는 면적을 빼어서 각막의 외피화가 이루어진 면적을 확인해 본 결과 500 ㎍/㎖의 농도 그룹에서 가장 치료효과가 좋은 것으로 확인이 되었으며(도 3), 이 결과를 표 1에 요약 정리하였다.

Healing size = pretreatment fluorescein staining area-postoperative fluorescein staining area (Healing size는 image pro에서 설정된 상대적인 면적 값임) (Kim et al. Veterinary Ophthalmology 2009, 12:1, 36-42)

2-5. 토끼를 이용한 실험에서 기존치료제와 효과비교

토끼의 각막을 손상시킨 다음 형광물질을 이용하여 염색을 실시할 경우 도4에서 보는 바와 같이 안구가 전반적으로 녹색을 염색됨을 관찰할 수 있다. 이때 진토닌을 투여하지 않은 생리적 식염수 처리 그룹에 비하여 진토닌을 투여할 경우 3일 뒤에 녹색의 형광물질로 염색되는 면적이 통계학적으로 유의성 있게 현저하게 감소함을 관찰할 수 있었다. 현재 사용하고 있는 각막 손상 치료제인 솔코린을 투여할 경우도 생리적 식염수만 처리한 그룹에 비하여 형광물질에 의하여 염색되는 부위가 줄어드는 것으로 나타났다 (도 4). 토끼를 이용한 실험 결과를 요약한 것을 표 2로 정리하였다.

Healing size = pretreatment fluorescein staining area-postoperative fluorescein staining area (Healing size는 image pro에서 설정된 상대적인 면적 값임) (Kim et al. Veterinary Ophthalmology 2009, 12:1, 36-42)

이러한 실험결과로부터 진토닌을 함유한 조성물을 세포 또는 동물의 눈에 점안하는 경우 손상된 세포의 재생이 빠르게 진행되는 것을 알 수 있었으며, 각막, 결막, 포도막 등 안질환의 치료제로 사용할 수 있는 것을 확인하였다. 또한 진토닌은 당지질단백질로서 안구건조증에 유효하게 사용될 수 있다.

실험예 3.

각막 질환이 있는 개들에서 치료효능 검증.

본 발명자들은 실제로 궤양성 각막염을 포함하는 안과 질환이 있는 개에서 진토닌의 치료 효과를 확인하기 위하여 안과질환이 있어 동물병원에 내원하는 개를 대상으로 하기와 같은 실험을 수행하였다.

3-1. 첫 번째 사례.

순막 (3안검) 돌출 교정 수술후, 수술부작용으로 인한 각막염 (keratitis)이 있는 9살된 cocker spaniel 개에서 진토닌을 사용하기 전 사진과 (위의 오른쪽 및 왼쪽 눈)와 진토닌 (진토닌 500 ㎍/㎖로 인공눈물 (라큐아 5 ml)에 녹임)을 4일간 사용한 후 사진 (아래의 오른쪽 및 왼쪽 눈)을 비교하였다.

도 5에 나타난 바와 같이 day 0에서 보는 바와 같이 심각한 각막염과 각막궤양 상태를 보이고 있다. 3안검에 대한 수술적 치료와 함께 항생제와 진토닌 4일 적용후 각막염 증세가 많이 호전되었고, 각막미란도 사라졌다.

실험결과 진토닌을 사용한 눈에서 치료 효과가 현저하게 나타나는 것을 확인하였다.

3-2. 두 번째 사례.

본 발명자들은 각막궤양이 있는 두 증례에서 진토닌을 사용한 증례와 진토닌을 사용하지 않은 증례를 비교하여 진토닌의 효과를 확인하기 위해 실험을 진행하였다.

진토닌을 사용한 증례는 14살된 잡견 (mix)이며 수정체 탈구로 수정체 제거수술을 받은 후 눈을 비벼 각막미란이 발생하였으며 항생제와 진토닌을 투여하였으며, 진토닌을 사용하지 않은 증례는 샴푸에 의해 각막궤양이 발생한 9년령 Poodle에서 항생제와 인공눈물, 항교원효소(anticollagenase)를 처방하여 사용하였다.

실험결과 도 6 상단 사진에 나타난 바와 같이 진토닌을 사용한 증례는 Day 0에서 형광염색이 되었던 곳이 Day 2에서는 염색되는 곳이 사라져 각막미란이 사라진 것을 확인할 수 있다.

실험결과 도 6 하단 사진에 나타난 바와 같이 진토닌을 사용하지 않은 증례는 10일이 지난 후에도 각막에 형광염색이 되며 (화살표), 눈에 통증을 보이고 있어 각막미란이 치료되지 않았음 (Day 10)을 보여주고 있으며, 각막궤양은 빨리 치료가 되지 않으면 난시를 비롯하여, 각막혼탁, 각막에 신생혈관형성 등 시력에 막대한 영향을 미칠 수 있으므로 치료가 지연되는 것은 좋은 상태가 아니다.

분석결과 두 증례의 비교에서 알 수 있듯이 각막궤양치료의 기간을 줄이는데 진토닌이 탁월한 효과를 내는 것을 알 수 있다.

3-3. 세 번째 사례.

13살 11개월 된 시츄 (Shih-Tzu) 개에서 각막내피세포 변성으로 인한 각막 부종을 보이는 환자로 만성각막부종으로 인해 2차적으로 재발성의 수포성 각막궤양과 심층각막 궤양을 주증으로 내원한 환자였다. 결막판이식술과 함께 각막열형성술 (Thermokeratoplasty)을 실시하였고, 각막열형성술을 실시하면서 모든 epithelium을 제거를 하였다. 수술후 진토닌과 항생제를 하루 4번씩 점안하였다. 본 사진은 수술 후 4일이 경과한 후의 사진으로 도 7A에서는 결막판이 매우 잘 각막에 이식되어 혈관이 잘 발달된 것이 확인이 되며, 도 7B에서는 형광염색을 실시하였으나 모두 상피화가 잘 이루어져 염색이 안되는 것을 확인할 수 있다. 기존의 연구 (Park et al. J Vet Clin 28, 533-537, 2011)에 따르면 각막열형성술 이후 상피재생은 11일 이후에 이루어진다고 보고되었으나, 본 실험결과에 따르면 4일만에 모두 상피화가 이루어졌다.

3-4. 네 번째 사례.

10 년령의 보스턴 테리어(Bosten teriior) 개로 좌안에 각막내피변성으로 인한 만성각막부종을 보인 환자이며, 만성각막부종은 재발성의 수포성 각막궤양을 주증으로 동물병원에 내원하였다. 이 환자의 눈에는 각막열형성술을 실시하였고, 수술도중에 각막외피를 알콜을 적용하여 모두 제거한 후에 각막열형성술을 적용하였다. 수술후 진토닌과 항생제를 점안제로 적용하였고, 본 사진은 수술 후 6일째 사진이다.

실험결과 형광염색을 하였으나 염색이 되지 않는 것이 확인이 되고 이를 근거로 각막외피가 모두 재생된 것을 알 수 있다. 기존 연구 (Park et al. J Vet Clin 28, 533-537, 2011)에 의하면 이 수술후 각막외피의 완벽한 재생은 11일 이상이 걸린다는 보고되고 있다. 하지만 진토닌을 사용한 후 각막외피의 재생이 많이 앞당겨지는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

3-5. 다섯 번째 사례.

본 발명자들은 각막궤양이 있는 두 환자에게서 진토닌을 사용한 증례와 진토닌을 사용하지 않은 증례를 날짜별로 사진을 찍어 치료경과를 비교하였다.

실험결과 도 9A에 나타난 것처럼, 항생제와 진토닌을 사용한 13 년령의 말티즈 (Maltese)는 각막궤양 치료를 한지 2일째 (Day 2)에 이미 형광염색검사에서 염색이 되지 않아 (흰색화살표) 각막외피재생이 거의 이루어진 것을 확인할 수 있으나,

실험결과 도 9B에 나타난 것처럼, 진토닌을 사용하지 않고 항생제와 항교원효소제만 사용한 5년령의 시츄 (Shih-Tzu)의 사진을 보면 치료 2일째 (Day 2)에 형광염색검사에서 염색이 이루어져 (검은색 화살표) 아직 각막외피재생이 다 이루어지지 않았음을 알 수 있다. 더욱이 이 증례는 각막궤양이 잘 치료되지 않아 치료 10일째 각막궤양이 더욱 심해져 있음을 보여주고 있다.

따라서 진토닌의 각막궤양치료효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다 (도 9).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (20)

1. 인삼으로부터 분리한 당지질 단백질인 진토닌(gintonin)을 유효성분으로 포함하는 각막 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 진토닌은 물, 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 용매로 하여 인삼으로부터 추출된 것을 특징으로 하는, 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   인삼으로부터 추출된 후 음이온 교환수지를 이용하여 저분자 물질이 제거되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 인삼은 인삼의 뿌리(root), 잎(leaves), 줄기(stem), 열매 및 꽃으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 인삼은 홍삼, 수삼, 백삼, 재배삼, 장뇌삼, 산삼, 인삼 및 홍삼 부산물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 인삼은 고려삼(Panax ginseng), 회기삼(P.quiquefolius), 전칠삼(P.notoginseng), 죽절삼(P.japonicus), 삼엽삼(P.trifolium), 히말라야삼(P.pseudoginseng), 베트남삼(P.vietnamensis) 및 미국삼(Panax quinquefolium)으로 이루어진 군중에서 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   상기 진토닌은 125 내지 1000 μg/ml 농도인 것을 특징으로 하는, 조성물.
9. 제1항에 있어서,
   상기 진토닌은 250 내지 750 μg/ml 농도인 것을 특징으로 하는, 조성물.
10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 점안용 액제 또는 주사제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
    
11. 삭제
12. 제1항에 있어서,
    상기 각막 질환은 각막미란, 각막궤양 또는 각막손상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
13. 제1항에 있어서,
    상기 진토닌은 세포에서 LPA(Lysophosphatidic acid) 수용체를 활성시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
14. 제1항에 있어서,
    상기 진토닌은 세포질내의 유리 칼슘(Ca²⁺) 농도를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
15. 진토닌(gintonin)을 유효성분으로 포함하는 각막 질환의 개선용 건강기능식품.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제

Images