RU2315606C2

RU2315606C2 - Способ получения лекарственного средства для лечения миопии и заболеваний склеральной оболочки глаза, а также витреоретинопатии

Info

Publication number: RU2315606C2
Application number: RU2005116188/15A
Authority: RU
Inventors: Игорь Александрович Ямсков; Виктория Петровна Ямскова; Анатолий Васильевич Наговицын; Михаил Сергеевич Краснов
Original assignee: Игорь Александрович Ямсков; Виктория Петровна Ямскова; Анатолий Васильевич Наговицын; Михаил Сергеевич Краснов
Priority date: 2005-05-30
Filing date: 2005-05-30
Publication date: 2008-01-27
Also published as: RU2005116188A

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к офтальмологии. Способ заключается в том, что выделяют из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных ткань центральной области склеральной оболочки, включающей решетчатую пластинку, промывают и выдерживают ее в водно-солевом физиологическом растворе, центрифугируют, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее растворением в 100% растворе сульфата аммония, фильтруют, диализуют до полного удаления ионов сульфата аммония, разделяют методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 часов, после чего собирают фракции кислых белков, объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов, полученный при этом водный раствор белка высушивают до получения сухого вещества, которое очищают методом электрофореза в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,9-0,95, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2-5 дней при 4-7°С, полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 7-10 дней деионизованной водой, отдиализованный раствор регуляторного пептида далее повторно высушивают до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, который затем растворяют в физиологическом водно-солевом растворе. Изобретение обеспечивает повышение процента выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделение высокоочищенных полипептидов с низкой молекулярной массой.

Description

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к офтальмологии.

Техническая задача, решаемая предлагаемым изобретением, заключается в том, что используют центральные области склеральной оболочки глаза позвоночных животных, включающие решетчатую пластинку, содержащие наибольшее количество биохимически и физиологически активных белков и полипептидов, что позволяет повышать процент выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделять высокоочищенные полипептиды с низкой молекулярной массой.

Указанная техническая задача решается тем, что в способе получения лекарственного средства для лечения миопии и заболеваний склеральной оболочки глаза, а также витреоретинопатий из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных выделяют ткань центральной области склеральной оболочки глаза, включающую решетчатую пластинку, разрезают ее и промывают в водно-солевом физиологическом растворе, выдерживают ткань склеры в водно-солевом растворе при 4-7°С в течение 2-4 часов, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее путем растворения в 100% растворе сульфата аммония в течение 5-7 дней при 4-6°С, фильтруют раствор, диализуют его в диализных мешках при 4-7°С до полного удаления ионов сульфата аммония, разделяют его методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 часов, после этого собирают фракции кислых белков, объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках при 4-7°С в течение 10-14 дней. Полученный при этом водный раствор белка высушивают до получения сухого вещества, которое очищают методом электрофореза в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,9-0,95, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2-5 дней при 4-7°С, полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа деионизованной водой при 4-7°С в течение 7-10 дней, отдиализованный раствор регуляторного пептида далее повторно высушивают до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, который затем растворяют в физиологическом водно-солевом растворе. Полученный при этом раствор разбавляют до концентрации 10^-9-10^-11 мг/мл и разливают во флаконы путем холодной стерилизации с использованием мембранных фильтров.

Такие пептиды, обладающие действием на миопию, заболевания склеральной оболочки, а также витреоретинопатии ранее описаны не были.

Способ характеризуется следующими примерами.

Пример 1.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крупного рогатого скота центральную область склеральной оболочки глаза, включающую решетчатую пластинку, путем удаления переднего сектора глаза, включая роговицу, переднюю камеру глаза, затем удаление стекловидного тела, сетчатки, пигментного эпителия сетчатки, и сосудистой оболочки глаза, оставляя одну склеральную оболочку, далее удаляют с внешней поверхности склеры глаз жировой и мышечной ткани, далее разрезают ткань склеры на крупные куски при температуре +25°С и давлении 760 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают куски ткани склеры в водно-солевом растворе (0,15 М NaCI, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂. 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+4°С и давлении 760 мм рт.ст. в течение 4 часов, центрифугируют полученный раствор тканевого экстракта при 3000g 15 мин при Т=+25°С и давлении 760 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее путем растворения в 100% растворе сульфата аммония в течение 7 дней при Т=+4°С, полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу и диализуют его в диализных мешках до полного удаления ионов сульфата аммония в течение 7 дней, при Т=+4°С, давлении 760 мм рт.ст., полученный отдиализованный раствор далее высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое затем растворяют в деионизованной воде и разделяют методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +6°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции кислых белков (рН=3,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 14 дней при Т=+4°С, давлении 760 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в 7,5%-ном полиакриламидном геле при Т=+25°С и давлении 760 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,9, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 5 дней при Т=+4°С, давлении 760 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 2 кДа в течение 7 дней при Т=+4°С, давлении 760 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-8 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, Т=+25°С и давлении 760 мм рт.ст., далее в 100-мл мерную колбу вносят 10 мл р-ра регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-8 мг/мл и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 M NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при Т=+25°С и давлении 760 мм рт.ст., полученный раствор разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 2 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%. Высокоочищенные препараты получают после очистки методом электрофореза и проверяют методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте вода/ацетонитрил на колонке С8: при детекции с длиной волны 280 нм гомогенный препарат элюируется с колонки с временем удержания 3-4 мин.

Пример 2.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крыс центральную область склеральной оболочки глаза, включающую решетчатую пластинку, путем удаления переднего сектора глаза, включая роговицу, переднюю камеру глаза, затем удаление стекловидного тела, сетчатки, пигментного эпителия сетчатки, и сосудистой оболочки глаза, оставляя одну склеральную оболочку, далее удаляют с внешней поверхности склеры глаз жировую и мышечную ткань, далее разрезают ткань склеры на крупные куски при температуре +20°С и давлении 730 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают куски ткани склеры в водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+7°С и давлении 760 мм рт.ст. в течение 2 часов, центрифугируют полученный раствор тканевого экстракта при 3000g 15 мин при Т=+20°С и давлении 730 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее путем растворения в 100% растворе сульфата аммония в течение 5 дней при Т=+6°С, полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу и диализуют его в диализных мешках до полного удаления ионов сульфата аммония в течение 10 дней, при Т=+7°С, давлении 730 мм рт.ст., полученный отдиализованный раствор далее высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое затем растворяют в деионизованной воде и разделяют методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72 часов, собирали фракции кислых белков (рН=1,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 10 дней при Т=+7°С, давлении 730 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле при Т=+20°С и давлении 730 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,95, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 3 дней при Т=+7°С, давлении 730 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания 8 кДа в течение 10 дней при Т=+7°С, давлении 730 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-8 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, Т=+20°С и давлении 730 мм рт.ст., далее в 100-мл мерную колбу вносят 10 мл р-ра регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-8 мг/мл и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 M NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при Т=+20°С и давлении 730 мм рт.ст., полученный раствор разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.

Пример 3.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз 7-, 14-, 19-дневных куриных эмбрионов центральную область склеральной оболочки глаза, включающую решетчатую пластинку, путем удаления переднего сектора глаза, включая роговицу, переднюю камеру глаза, затем удаление стекловидного тела, сетчатки, пигментного эпителия сетчатки, и сосудистой оболочки глаза, оставляя одну склеральную оболочку, далее удаляют с внешней поверхности склеры глаз жировую и мышечную ткань, далее разрезают ткань склеры на крупные куски при температуре 23°С и давлении 745 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают куски ткани склеры в водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+5°С и давлении 745 мм рт.ст. в течение 3 часов, центрифугируют полученный раствор тканевого экстракта при 2500g 15 мин при Т=23°С и давлении 745 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее путем растворения в 100% растворе сульфата аммония в течение 6 дней при Т=+5°С, полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу и диализуют его в диализных мешках до полного удаления ионов сульфата аммония в течение 8 дней, при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., полученный отдиализованный раствор далее высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое затем растворяют в деионизованной воде и разделяют методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +5°С и напряжении 500-2000 В в течение 72 часов, собирают фракции кислых белков (рН=2,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 12 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в 12,5%-ном полиакриламидном геле при Т=+23°С и давлении 745 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,95, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 4 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания 5 кДа в течение 8 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-8 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, Т=+23°С и давлении 745 мм рт.ст., далее в 100-мл мерную колбу вносят 10 мл р-ра регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-8 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при Т=+23°С и давлении 745 мм рт.ст., полученный раствор разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1,5 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.

Пример 4.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз лягушек Xenopus laevis центральную область склеральной оболочки глаза, включающую решетчатую пластинку, путем удаления переднего сектора глаза, включая роговицу, переднюю камеру глаза, затем удаляют стекловидное тело, сетчатку, пигментный эпителий сетчатки, и сосудистую оболочку глаза, оставляя одну склеральную оболочку, далее удаляют с внешней поверхности склеры глаз жировой и мышечной ткани, далее разрезают ткань склеры на крупные куски при температуре +20°С и давлении 740 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают куски ткани склеры в водно-солевом растворе (0,15 М NaCl. 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+4°С и давлении 740 мм рт.ст. в течение 4 часов, центрифугируют полученный раствор тканевого экстракта при 2000g 15 мин при Т=+20°С и давлении 740 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее путем растворения в 100% растворе сульфата аммония в течение 5 дней при Т=+4°С, полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу и диализуют его в диализных мешках до полного удаления ионов сульфата аммония в течение 10 дней, при Т=+4°С, давлении 740 мм рт.ст., полученный отдиализованный раствор далее высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое затем растворяют в деионизованной воде и разделяют методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +4°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции кислых белков (рН=1,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 14 дней при Т=+4°С, давлении 740 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле при Т=+20°С и давлении 740 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,9, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 5 дней при Т=+4°С, давлении 740 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют против деионизованной воды в диализных мешках с пределом пропускания 3 кДа в течение 7 дней при Т=+4°С, давлении 740 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-8 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, Т=+20°С и давлении 740 мм рт.ст., далее в 100-мл мерную колбу вносят 10 мл р-ра регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-7 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при Т=+20°С и давлении 740 мм рт.ст., полученный раствор разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.

Пример 5.

В качестве экспериментальной модели, отражающей дегенеративные процессы в сетчатке и в сосудистой оболочке, используют культуру заднего отдела глаза крыс. Исследование проводят на крысах линии Wistar, обоего пола, весом 200 г.

Крыс забивают с помощью эфирного наркоза, из энуклеированных глаз под микроскопическим контролем удаляют микрохирургическим путем переднюю камеру глаза (роговица, хрусталик, жидкость передней камеры глаза и ростовую зону сетчатки с радужкой). Изолированные задние отделы глаз культивируют в питательной среде 199 без добавления сыворотки крови в присутствии препарата регуляторного пептида, выделенного из склеральной оболочки глаза позвоночных в конечной концентрации, соответствующей 10^-9 мг/мл. Препарат регуляторного пептида добавляют в питательную среду 199 в соотношении 1:10 (по объему) 1 раз в начале культивирования заднего отдела глаза крыс in vitro.

Культуры инкубируют в стерильных условиях в течение 45-50 часов при температуре 37°С. В качестве контроля изучают задние отделы глаза, культивированные в питательной среде 199, в которую не добавляют препарат. Влияние исследуемого препарата регуляторного пептида, выделенного из склеральной оболочки глаза, оценивают по морфологическому состоянию тканей заднего отдела глаза крысы. Для каждого культивированного образца проводят сравнительный морфологический анализ состояния четырех тканей, составляющих задний отдел глаза: склеральный отдел, сосудистая оболочка, пигментный эпителий сетчатки, нейральная сетчатка (ганглиозный слой, наружный и внутренний сетчатые слои, наружный и внутренний ядерные слои, слой отростков фоторецепторов).

При длительном культивировании заднего отдела глаза взрослых особей позвоночных животных in vitro во всех тканях наблюдают развитие деструктивных явлений, в частности в нейральной сетчатке и пигментном эпителии сетчатки, которые характерны для ряда ретинопатий, а также для пигментного ретинита у человека. В настоящем исследовании на вторые сутки в контрольных культурах наблюдают картину начала развития дегенеративных процессов во всех тканях заднего отдела глаза. Следует отметить, что среди первых в изучаемых тканях идентифицирют нарушения адгезивных межклеточных взаимодействий, топографически тесное взаимодействие между тканями также было нарушено. В контроле наблюдают картину, предшествующую началу разрушения тканей глаза и адгезивных связей между ними. Внутри склеры обнаруживают полости, а в сосудистой оболочке наблюдают местами разрывы и отслоение от склеральной оболочки.

Во всех слоях сетчатки отмечают нарушения межклеточных контактных взаимодействий. Слой отростков фоторецепторов имеет рыхлую структуру, обнаруживают значительное количество сломанных отростков в интерфоторецепторном матриксе. Ширина интерфоторецепторного матрикса варьируется в участках среза и местами очень велика. Происходит также частичное разрушение пигментного эпителия за счет нарушения межклеточных контактов в пределах монослоя. Таким образом, картина состояния тканей заднего отдела глаза крыс в значительной степени отражает состояние, которое характеризуется как начальный этап развития деструкции тканей глаза. Такую картину состояния тканей заднего отдела глаза наблюдают при различных заболеваниях сетчатки у человека, например при дистрофии и пигментном ретините.

Добавление в среду культивирования препарата регуляторного пептида, выделенного из склеральной оболочки глаза, способствует сохранению пространственной организации тканей заднего отдела глаза. Особенность данного опыта - максимальная сохранность пигментного эпителия сетчатки по сравнению с контролем. Эпителиальный слой пигментных клеток не претерпевает разрушений, а упаковка клеток в нем остается более плотной, чем в контроле. Помимо этого гранулы меланина в слое пигментного эпителия располагаются более компактно на базальной стороне клеток, а также в микровиллях, по сравнению с контролем - где наблюдают смещение пигментных гранул на апикальную сторону клеток, которые в свою очередь теряют или втягивают микровилли, о чем можно свидетельствовать по отсутствию пигмента в соответствующей области. Эти данные указывают на то, что изучаемый регуляторный пептид, выделенный из склеральной оболочки глаза, способствует стабилизации дифференцировки клеток пигментного эпителия. Помимо этого в склеральной оболочке глаза наблюдают более упорядоченное расположение волокон и меньшую деструкцию по сравнению с контролем.

Таким образом, можно отметить протекторное действие изучаемого регуляторного пептида на состояние тканей заднего отдела глаза крысы при длительном культивировании и, особенно, на склеральную оболочку глаза, а также на слой пигментного эпителия.

Пример 6.

Пациент Н., жен., 15 лет. Диагноз: Миопия слабой степени.

Острота зрения до лечения: Vis OD=0,09 с sph-2,5=1,0; OS=0,09 с sph-2,5=1,0.

На фоне курса консервативной сосудистой терапии в течение 1,5 месяцев дополнительно закапывала в оба глаза лекарственное средство, приготовленным как описано в примере 1 по 1 капле 3 раза в сутки.

При выписке после лечения: Vis OD=0,1 с sph-1,5=1,0; OS=0,1 c sph-1,5=1,0.

Стабильная положительная динамика состояния сетчатки.

Предложенный способ позволяет использовать области нейральной сетчатки, содержащие наибольшее количество биохимически и физиологически активных белков и полипептидов, повышать процент выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью и терапевтическим эффектом в сверхмалых дозах, выделять высокоочищенные полипептиды с низкой молекулярной массой.

Claims

Способ получения лекарственного средства для лечения миопии и заболеваний склеральной оболочки глаза, а также витреоретинопатий, характеризующийся тем, что выделяют из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных ткань центральной области склеральной оболочки, включающей решетчатую пластинку, промывают ее в водно-солевом физиологическом растворе, выдерживают ткань склеры в водно-солевом растворе при 4-7°С в течение 2-4 ч, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее растворением в 100%-ном растворе сульфата аммония при 4-6°С в течение 5-7 дней, фильтруют раствор, диализуют его в диализных мешках при 4-7°С до полного удаления ионов сульфата аммония, разделяют его методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0 температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 ч, после чего собирают фракции кислых белков, объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках при 4-7°С в течение 10-14 дней, полученный при этом водный раствор белка высушивают до получения сухого вещества, которое очищают методом электрофореза в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,9-0,95, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2-5 дней при 4-7°С, полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 7-10 дней деионизованной водой, отдиализованный раствор регуляторного пептида далее повторно высушивают до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, который затем растворяют в физиологическом водно-солевом растворе.