CN110051683B - 知母多糖在制备治疗干眼病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及知母多糖的新用途，具体涉及知母多糖在制备治疗干眼病的药物中的应用，本发明所述的应用。本应用中所述的药物是知母多糖与常规用量的医学上可接受的辅料制成的外用制剂，如滴眼液，眼凝胶。本发明所述的药物具有无色无味、对眼表粘膜无刺激的优点。

Description

知母多糖在制备治疗干眼病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医用配制品，具体涉及含有来自知母属植物多糖的药物。

背景技术

知母为百合科植物知母的干燥根茎，具有有滋阴降火、润燥滑肠、利大小便之功效，知母中知母多糖含量较高，为其主要活性成分之一。药理研究表明知母多糖具有抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗炎、抗血小板聚集等生物活性。目前，知母多糖正逐渐成药理研究及开发新药的热点。

干眼病是因泪液的量或质的异常引起泪膜不稳定和眼表损伤，及由此引起的眼部不适症状，是眼科的常见病和多发病。随着现代生活节奏的加快，各种视屏的频繁使用，以及人口的老龄化，干眼病的发病率有逐年上升的趋势。持续的干眼会导致眼角膜变薄，增加角膜感染、溃疡、穿孔和斑痕的危险性,严重的甚至可最终导致视力丧失。目前流行病学及临床调查显示，美国在65-84岁的人群中，有14.6％患干眼病；加拿大所有验光诊所各30例连续非选择病人的问卷调查表明28.7％的病人有干眼病状；日本8个眼科中心2127例连续门诊病人调查结果，患干眼(泪膜和眼表都异常)有359例(17％)。我国有人对眼科门诊患者5136例进行问卷调查，有干眼病745例(14.52％)。目前认为其病因与用眼工作时间过长、环境污染、配戴角膜接触镜、女性内分泌影响、社会老龄化等因素有关，且发病率呈上升趋势。随着干眼的发病率越来越高，干眼的诊断与治疗越来越受人们的重视，对干眼的研究已经成为国内外眼科研究的热点。

目前已有很多学者采取不同的治疗方法进行研究，但至今尚无特效疗法，用人工泪液制剂减轻症状的治疗是干眼病的主要依靠。虽然人工泪液能不同程度地减轻症状，但都是治标不治本，作用不能持久。

干眼病在中医理论中属于“白涩症”范畴，“肝”开窍于目，肝阴濡养眼睛，泪液属于阴液范围，肝阴不足则会导致目失润泽、目干目涩。现有治疗干眼病的中成药主要为口服制剂，如六味地黄丸等。但内服复方中药起效慢，且对于不同体质的人群难以统一推广应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供知母多糖的新用途，即在制药中的应用。

上述知母多糖在制药中的应用具体是，知母多糖在制备治疗干眼病的药物中的应用。

本发明所述的应用，其中所述的药物是知母多糖与常规用量的医学上可接受的辅料制成的外用制剂，如，滴眼液或凝胶剂。

上述外用制剂，其中，所述滴眼液中知母多糖的浓度0.1mg/ml—100mg/ml；所述凝胶剂中知母多糖的质量百分含量为0.1mg/ml％～100mg/ml％

本发明所述的应用，其中所述知母多糖可按通常从植物中提取多糖的方法提取得到，发明人推荐的方法包括以下步骤：

(1)取知母以水为溶媒进行提取，再将提取液经阳离子树脂脱色除蛋白，收集滤液，调PH至中性，真空浓缩，得知母提取液；

(2)将提取液上DEAE-纤维素色谱柱，并以0.1M～1M不同浓度的NaCl冲洗柱子，然后以考马斯亮蓝法检测蛋白，弃去吸光度大于0.1的洗脱液；

(3)以对留下的洗脱液进行检测，以苯酚硫酸法检测各峰段流出液的多糖含量。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明从知母中提取多糖成分，并制成滴眼液或凝胶剂用于眼睛局部外用，使泪腺分泌明显增多、角膜荧光素染色明显减少，泪腺病变明显减轻，杯状细胞数目明显恢复。其次，知母多糖相较于中药材中其他成份如黄酮、皂苷、生物碱等，具有无色无味、对眼表粘膜无刺激的优点。

附图说明

图1～4为各组荧光素钠染色阳性反应实验结果图，其中，图1为正常组，图2为模型组，图3为阳性对照组，图4为知母多糖组。

图5～8为光学显微镜下观察到的泪腺形态图，其中，图5为正常组，图6为模型组，图7为阳性对照组，图8为知母多糖组。

图9～12为结膜扫描电镜图，其中，图9为正常组，图10为模型组，图11为阳性对照组，图12为知母多糖组。

具体实施方式

实施例1

1、微波萃取法制备知母多糖

(1)取知母2kg，干燥后粉碎至粗粉，依次加入10倍和8倍体积水为溶媒，以1KW～20KW的微波萃取仪微波提取2次，每次5～30分钟，合并2次萃取液，减压浓缩，浓缩至20L，三足离心机初滤，取上清滤液，加入终浓度为0.3％的山梨酸钾防腐；

(2)将滤液经阳离子树脂脱色除蛋白，收集洗脱滤液，调PH至中性，真空浓缩，得知母提取液；

(3)将提取液上DEAE-纤维素柱，并以0M-1M不同浓度的NaCl洗柱子，然后以考马斯亮蓝法检测蛋白，弃去吸光度大于0.1的洗脱液；

(4)对留下的洗脱液进行在线检测，以苯酚硫酸法检测各峰段流出液的多糖含量。

2、多糖含量和分子量鉴定

苯酚硫酸法检测知母多糖含量为90％，以分子筛树脂层析方式确定知母多糖分子量分布范围为200Da—200万Da，以葡聚糖标准品为对照。

实施例2

1、常规水提法取制备知母多糖

(1)取知母2kg，干燥后粉碎至粗粉，依次加入10倍和8倍水，煎煮2次，每次1h；合并2次煎取液，减压浓缩，浓缩至20L，三足离心机初滤，取上清滤液，并加入山梨酸钾终浓度0.3％防腐；

步骤(2)至(4)同实施例1

2、多糖含量和分子量鉴定

采用实施例1相同的方法测得本例所得到的知母多糖含量为90％.，知母多糖的分子量为200Da—200万Da。

实施例3

1、超声萃取法制备知母多糖

(1)取知母2kg，干燥后粉碎至粗粉，依次加入10倍和8倍的水，以超声萃取仪提取2次，每次5～30分钟，合并2次煎取液，减压浓缩，浓缩至20L，三足离心机初滤，取上清滤液，加入0.3％山梨酸钾防腐。

(2)步骤(2)至(4)与实施例1相同。

2、多糖含量和分子量鉴定

采用实施例1相同的方法测得本例所得到冻干粉知母多糖含量为30.21％，分子量为200Da—200万Da。

实施例4(滴眼液)

1、取实施例1得到知母多糖2.0g、尼泊金乙酯0.1g，用0.9％氯化钠注射用水150mL和50mL纯水，以冰点渗透压仪测定渗透压为等渗；

2、以0.22μm微孔滤膜过滤除菌，灌装成1％知母多糖滴眼液，10ml一瓶。

实施例5(凝胶剂)

取实施例2得到的知母多糖50g，溶于800ml纯水冷却至4℃左右，加入250g泊洛沙姆P407和42g泊洛沙姆P188,4℃下放置24h，使泊洛沙姆充分溶解，后加入尼泊金乙酯至终浓度0.1％，用适量纯水补至1000ml，调节pH至6.2，渗透压为290mOSM/L，形成凝胶体，无菌分装，即得。

实施例6(药效学实验)

1仪器与试药、动物

1.1药品与试剂

药品：知母多糖滴眼液为实施例4的滴眼液。重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液(批号：1603252)、盐酸消旋山莨菪注射液(杭州民生药业集团有限公司，批号：1603252)。

1.2实验动物

SPF级小鼠，均由广州中医药大学实验动物中心提供，体重18～22g，40只，雌雄各半。

1.3实验仪器

LYL-1裂隙灯显微镜(凤凰光学集团有限公司)、光学显微镜、组织切片及染色设备、扫描电镜。

1.4实验环境

广州中医大学实验动物中心，小鼠笼具、小鼠饲料及饮用水均经高压灭菌。

2.方法

2.1实验性干眼病小鼠模型的建立及分组治疗

取40只实验小鼠(雌雄各半)，共分为4组，各组分别为：正常组、模型组、阳性对照组、知母多糖组。除正常组外，其他三组小鼠颈背部皮下注射盐酸消旋山莨菪碱注射液以抑制小鼠泪腺分泌泪液，每次用量为0.3ml，含硫酸阿托品0.6mg，每日三次(9am，14pm，19pm)，使小鼠全天均处于泪腺分泌抑制状态，一直持续三周。在实验的第七天，给予阳性对照组小鼠右眼给予重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液滴眼，每日三次，正常组的小鼠右眼均给予生理盐水，实验组小鼠右眼给予知母多糖滴眼液(10am，15pm，20pm)。在实验的第7、21天进行泪液分泌量测定和角膜荧光染色测定，并记录数据。

2.2观察指标及测试方法

2.2.1Schirmer I试验

检查泪液基础分泌情况。方法：考虑到小鼠眼睛较小，取5mm×35mm泪液检测滤纸对折减半，剪平反折一端,轻轻放入被测眼下结膜囊中外1/3处，3min后取出滤纸，观察滤纸条湿润长度。

2.2.2眼表损伤的检查

荧光素钠染色阳性反应角膜上皮细胞缺损。实验方法：用滴管滴2％荧光素钠溶液于小鼠结膜囊内，5min后用注射器吸取生理盐水轻轻清洗眼部。在裂隙灯显微镜钴蓝光下观察着色情况。评分方法：将角膜分为4个象限，为颞上方、颞下方、鼻上方、鼻下方等4个象限，每个象限按照0～3分评分，每个角膜评分为4个象限评分之和。每次检查各组均测量小鼠右眼，记录数据。规定无染色为0，有染色则分轻、中、重3级，因此共0～12分。

2.2.3组织病理学观察

电镜标本制作与取材：先将小鼠断颈处死，然后剪下小鼠头部，顺着矢状线剪开两半放入组织固定液中浸泡两周。然后再解剖，取出小鼠眼穹隆部分，使用扫描电子显微镜观察其右眼结膜上皮细胞与杯状细胞。

3.0统计学方法：本实验所有数据均采用均值±标准差

表示，组间差异性分析采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，以P<0.05作为统计学差异参考标准。

3实验结果

3.1 Schirmer I、荧光素钠染色阳性反应实验结果

正常组与模型组、中药治疗组和阳性对照组的Shirmer I试验结果、角膜荧光素染色结果比较差异均有显著性意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组Schirmer I试验结果、荧光素钠染色阳性反应实验比较(平均数±标准差，各组n＝10)

与正常组相比，△＜0.05，▲P＜0.01。与模型组相比，●P＜0.01。与阳性对照组相比，▲＜0.05

各组荧光素钠染色阳性反应实验结果见图1～4，其中，正常组角膜无荧光素钠染色阳性反应；模型组角膜荧光素钠染色阳性反应明显，可见绿色荧光物质充满角膜4个象限，说明造模成功且时间持久；知母多糖治疗组角膜荧光素钠染色阳性反应微弱，与正常组差异不大，说明知母多糖可恢复角膜完整性；与知母多糖组相比，阳性对照组角膜中绿色反应物质减少，但依旧可见绿色荧光物质多于知母多糖组。

3.2在光学显微镜下观察泪腺形态观察

结果见图5～8，其中，

正常组：泪腺小叶结构排列整齐，泪腺上皮细胞为高柱状，腺上皮细胞腔间有大量的分泌泡状粘液，腺泡腔内可见泡状粘液。

模型组：上皮细胞排列相对整齐，腺泡腔可见泡状黏液，可见大量空泡融合。

知母多糖和阳性药对照组：泪腺结构完整未见明显异常，腺腔上皮结果完整，可见分泌泡状黏液。

3.3结膜扫描电镜检测

通过扫描电镜观察(见图9～12)，可发现正常组具有较多完好的杯状细胞，而模型组几乎没有杯状细胞，且伴有炎性细胞浸润。知母多糖组和阳性对照组滴眼液组杯状细胞明显多于模型组，炎性细胞浸润明显减轻，其中知母多糖组疗效更为显著。

本实验选择皮下注射阿托品类药物：盐酸消旋山莨菪碱制作小鼠干眼模型，通过竞争抑制毒蕈碱型乙酰胆碱受体，从而引起泪液分泌减少产生干眼症状。泪液由浆液和粘液组成，其中浆液性泪占全泪的98％。本实验结果发现知母多糖能明显增加泪液分泌量。

给药治疗后，阳性组、知母多糖组泪液分泌量明显增加，知母多糖组和阳性对照组，与正常组无明显差异性，说明了知母多糖能增加泪液分泌量。泪膜最内层为粘液层,粘液层粘附于角膜微绒毛、微皱壁上,使泪膜能均匀地覆盖于眼表,并可降低眼表面张力。粘液主要由结膜杯状细胞产生,其主要成分为各种分子量的糖蛋白(粘蛋白),粘蛋白能将疏水性角膜表面转化为亲水性，使泪液扩散在角膜表面，形成光滑的光学平面，对保持角膜的湿润和维持泪膜的稳定有重要作用。干眼病时结膜杯状细胞数量减少，所分泌的粘液量不足以在角膜上皮形成完整的薄膜，而使浆液性泪液不能很好地吸附着，泪膜稳定性降低。研究中通过扫描电镜发现知母多糖滴眼液能恢复结膜杯状细胞数。

Claims (2)

1.知母多糖在制备治疗干眼病的滴眼液中的应用；其中所述的知母多糖由以下方法制得：

（1）将知母药材烘干，打粉，以水为溶媒进行提取，再将提取液经阳离子树脂脱色除蛋白，收集滤液，调pH 至中性，真空浓缩，得知母多糖提取液；

（2）将提取液上DE-52纤维素柱，并以0 M～1M不同浓度的NaCl洗柱子，然后以考马斯亮蓝法检测蛋白，弃去吸光度大于0.1的洗脱液；

（3）对留下的洗脱液进行检测，以苯酚硫酸法检测各峰段流出液的多糖含量，截留吸光度大于0.1的流出液，合并作为知母多糖纯化组分。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的滴眼液由知母多糖与常规用量的医学上可接受的辅料制成。

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