CN112494541B - 孔源性视网膜脱离复位术用制剂的制备工艺及其应用 - Google Patents

孔源性视网膜脱离复位术用制剂的制备工艺及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，属于视网膜疾病技术领域，包括：工序1)，利用乙醇溶液提取茯苓粉末获得茯苓提取物；工序2)，利用乙醇溶液提取半枝莲粉末获得半枝莲提取物；以及工序3)，将茯苓提取物和半枝莲提取物混合获得孔源性视网膜脱离制剂。其中，茯苓提取物中至少含有80wt％三萜类物质，半枝莲提取物中至少含有60wt％黄酮类物质；茯苓提取物和半枝莲提取物的重量比为1:0.2‑0.7。本发明制备工艺获得的制剂能降低视网膜脱离复位术难度，促进视网膜脱离复位术后视功能的恢复。

Description

孔源性视网膜脱离复位术用制剂的制备工艺及其应用
技术领域
本发明属于视网膜疾病技术领域，具体涉及孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺。
背景技术
视网膜脱离(Retinal Detachment，RD)指视网膜神经上皮层与视网膜色素上皮层的分离，包括孔源性、增生性及渗出性三种类型，是眼科常见病和多发病，如果病情延误或治疗不当，也是常见致盲性眼底疾病之一。孔源性视网膜脱离(Rhegmatogenous RetinalDetachment，RRD) 是视网膜脱离中最为常见的一种，发生的基本原理为视网膜变性或退行性改变后视网膜裂孔形成，液化的玻璃体经视网膜裂孔进入视网膜下聚积，使视网膜神经上皮层与色素上皮层分离。临床上RRD是视网膜脱离的最常见类型，其发病急，发展快，一旦发生，患病眼视力迅速下降，如未经及时有效的治疗，其致盲率几乎为100％，且RRD是我国重要的急性而复杂的致盲性眼病。
目前，我们常用的治疗RRD的方法包括：玻璃体切除术(Pars Plana Vitrectomy，PPV) 和巩膜扣带术(Scleral Buckling，SB)。玻璃体切割术联合气体填充治疗孔源性视网膜脱离，主要目的是解除玻璃体及增殖膜对视网膜的牵拉，防止液体经视网膜裂孔持续进入视网膜下。巩膜扣带术主要是通过巩膜外加压将视网膜裂孔周围的巩膜和脉络膜压陷，形成垫压嵴，顶压裂孔，缓解或消除玻璃体牵拉，再辅以冷冻或视网膜光凝，使视网膜和脉络膜相互接触、粘连并最终复位。治疗单纯的孔源性视网膜脱离的病例首选方式是巩膜扣带术，如单个裂孔或脱离范围局限的视网膜脱离；治疗复杂的孔源性视网膜脱离如存在玻璃体积血，明显的视网膜增殖和裂孔巨大或靠近后极部的病例则需选择玻璃体切割术。随着近年来对疾病认识的加深和手术设备的发展，如今，孔源性视网膜脱离一次手术后视网膜复位率逐渐提高，虽然两种手术方式均有良好的手术成功率，但是术后患者的视觉质量不佳。一般认为，术前和术后某些因素与术后视觉质量有关，术前因素：视力、视网膜脱离时间、视网膜脱离的高度以及增殖性玻璃体视网膜病变等级等。术后因素：视网膜前膜，视网膜皱褶，黄斑囊样水肿及 OCT揭示的视网膜微结构的改变(光感受器和外界膜损伤、持续视网膜下积液等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能降低视网膜脱离复位术难度，促进视网膜脱离复位术后视功能的恢复的含有茯苓提取物和半枝莲提取物的制剂。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种含有茯苓提取物和半枝莲提取物的制剂，其中，茯苓提取物含有三萜类物质，半枝莲提取物含有黄酮类物质。
本发明制剂能提高视网膜脱离后视网膜组织中ATP含量和GSH-Px活性，降低MDA含量，改善视网膜脱离后视网膜组织的能量代谢以及线粒体的功能，增强其抗氧化的能力，缓解缺血缺氧造成的损害，因此，在视网膜脱离复位术前使用本发明制剂，可以减轻视网膜脱离程度，达到促进视网膜复位、降低手术难度、提高治愈率的目的。本发明制剂能提高视网膜脱离复位术后视网膜组织中ATP含量和GSH-Px活性，降低MDA含量，改善视网膜脱离复位术后视功能的恢复；本发明制剂还能改善视网膜脱离复位术后视网膜血液供应，提高视网膜色素上皮细胞吸收视网膜下积液的功能，使得视网膜下积液能够快速从视网膜下空间去除，使视网膜色素上皮重新附着视网膜，使视网膜尽快复位，同时为视网膜的营养供给提供条件，从而促进视网膜脱离复位术后视功能的恢复。
优选地，茯苓提取物为茯苓醇提物。更优选地，茯苓提取物中至少含有80wt％三萜类物质。
优选地，半枝莲提取物为半枝莲醇提物。更优选地，半枝莲提取物中至少含有60wt％黄酮类物质。
优选地，茯苓提取物和半枝莲提取物的重量比为1:0.2-0.7。该重量比范围内的茯苓提取物和半枝莲提取物，各个技术效果都能得到充分发挥。更优选地，茯苓提取物和半枝莲提取物的重量比为1:0.4-0.5。该重量比范围内的茯苓提取物和半枝莲提取物，药效发挥作用最大，使得视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织中ATP含量和GSH-PX活性最高，同时使视网膜脱离复位术后视网膜下积液去除速率最大，更有助于视网膜脱离复位术后视功能的恢复。
优选地，制剂中还含有沙苑子提取物，沙苑子提取物含有皂苷类物质。沙苑子提取物的加入能够和茯苓提取物和半枝莲提取物的制剂共同作用，通过抑制ROS和AIF的释放以减少视网膜脱离后光感受器细胞的坏死，保护视网膜且对视网膜的形态以及外核层厚度无不良影响，同时进一步提高视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织中ATP含量，进一步促进视网膜脱离复位术后视功能的恢复。
优选地，沙苑子提取物为沙苑子醇提物。更优选地，沙苑子提取物至少含有30wt％皂苷类物质。
更优选地，茯苓提取物、半枝莲提取物和沙苑子提取物的重量比为1:0.4-0.5:0.1-0.3。
本发明还公开了含有茯苓提取物和半枝莲提取物的制剂在作为辅助视网膜脱离复位术药物中的用途。
优选地，制剂在促进视网膜脱离复位术后视功能恢复中的用途。更优选地，制剂在改善视网膜脱离复位术后视网膜组织的能量代谢和/或抗氧化性中的用途。更优选地，制剂在改善视网膜脱离复位术后视网膜血液微循环中的用途。
优选地，制剂在降低视网膜脱离复位术难度中的用途。更优选地，制剂在减轻视网膜脱离程度中的用途。
本发明还公开了含有茯苓提取物、半枝莲提取物和沙苑子提取物的制剂在作为辅助视网膜脱离复位术药物中的用途。
优选地，制剂在促进视网膜脱离复位术后视功能恢复中的用途。更优选地，制剂在改善视网膜脱离复位术后视网膜组织的能量代谢和/或抗氧化性中的用途。更优选地，制剂在改善视网膜脱离复位术后视网膜血液微循环中的用途。
优选地，制剂在抑制视网膜脱离后ROS和AIF的释放中的用途。
优选地，制剂在减少视网膜脱离后光感受器细胞坏死中的用途。该制剂能够使光感受器细胞坏死率至少降低8％。
优选地，制剂在视网膜层厚度减少保护中的用途。
优选地，制剂在降低视网膜脱离复位术难度中的用途。更优选地，制剂在减轻视网膜脱离程度中的用途。
本发明还公开了孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，包括：
工序1)，利用乙醇溶液提取茯苓粉末获得茯苓提取物；
工序2)，利用乙醇溶液提取半枝莲粉末获得半枝莲提取物；以及
工序3)，将茯苓提取物和半枝莲提取物混合获得孔源性视网膜脱离制剂。
优选地，工序1)具体为：按固液比为1g:3-10mL将茯苓粉中加入90-98％乙醇溶液，回流提取2-5次，每次2-4h，抽滤，合并滤液，浓缩，干燥，获得茯苓提取物。
优选地，茯苓提取物中至少含有90wt％三萜类物质。
优选地，工序2)具体为：按固液比为1g:3-7mL将半枝莲粉中加入90-98％乙醇溶液，回流提取2-4次，每次0.5-1.5h，抽滤，合并滤液，浓缩，通过聚酰胺柱色谱分离，依次用水、 20％乙醇溶液、70％乙醇溶液洗脱，70％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，获得半枝莲提取物。
优选地，工序2)具体为：按固液比为1g:8-15mL将半枝莲粉中加入75-92％乙醇溶液，回流提取2-5次，每次1-3h，抽滤，合并滤液，浓缩，通过聚酰胺柱色谱分离，依次用水、20％乙醇溶液、70％乙醇溶液洗脱，70％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，获得半枝莲提取物。
优选地，半枝莲提取物中至少含有65wt％黄酮类物质。
优选地，茯苓提取物和半枝莲提取物的重量比为1:0.2-0.7。更优选地，茯苓提取物和半枝莲提取物的重量比为1:0.4-0.5。
优选地，孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，包括：
工序1)，利用乙醇溶液提取茯苓粉末获得茯苓提取物；
工序2)，利用乙醇溶液提取半枝莲粉末获得半枝莲提取物；
工序3)，利用乙醇溶液提取沙苑子粉末获得沙苑子提取物；以及
工序4)，将茯苓提取物、半枝莲提取物和沙苑子提取物混合获得孔源性视网膜脱离制剂。
更优选地，工序3)具体为：按固液比为1g:8-15mL将沙苑子粉中加入75-92％乙醇溶液，回流提取2-5次，每次1-3h，抽滤，合并滤液，浓缩，通过大孔树脂柱色谱分离，依次用水、 20％乙醇溶液、70％乙醇溶液洗脱，70％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，获得沙苑子提取物。
更优选地，沙苑子提取物至少含有30wt％皂苷类物质。
更优选地，茯苓提取物、半枝莲提取物和沙苑子提取物的重量比为1:0.4-0.5:0.1-0.3。
本发明由于采用了茯苓提取物和半枝莲提取物制备孔源性视网膜脱离制剂，因而具有如下有益效果：本发明制剂在视网膜脱离复位术前使用，可以减轻视网膜脱离程度，达到促进视网膜复位、降低手术难度、提高治愈率的目的；本发明制剂能改善视网膜脱离复位术后视功能的恢复；本发明制剂还能改善视网膜脱离复位术后视网膜血液供应，提高视网膜色素上皮细胞吸收视网膜下积液的功能，使得视网膜下积液能够快速从视网膜下空间去除，使视网膜色素上皮重新附着视网膜，使视网膜尽快复位，同时为视网膜的营养供给提供条件，从而促进视网膜脱离复位术后视功能的恢复。
附图说明
图1为本发明大鼠视网膜脱离图；
图2为本发明视网膜组织Na+-K+转运ATP酶活性；
图3为本发明视网膜组织中GSH-Px活性；
图4为本发明视网膜组织中MDA含量；
图5为本发明视网膜组织中ROS和AIF表达；
图6为本发明光感受器细胞的坏死率；
图7为本发明视网膜外核层的标准厚度比。
具体实施方式
本发明下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，包括：
工序1)，按固液比为1g:10mL将茯苓粉中加入92％乙醇溶液，回流提取3次，每次3h，抽滤，合并滤液，浓缩，干燥，获得茯苓提取物；
工序2)，按固液比为1g:10mL将半枝莲粉中加入90％乙醇溶液，回流提取3次，每3h，抽滤，合并滤液，浓缩，通过聚酰胺柱色谱分离，依次用水、20％乙醇溶液、70％乙醇溶液洗脱，70％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，获得半枝莲提取物；
工序3)，将茯苓提取物和半枝莲提取物按重量比为1:0.4混合获得孔源性视网膜脱离制剂。
实施例2：
孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，包括：
工序1)，按固液比为1g:4mL将茯苓粉中加入98％乙醇溶液，回流提取4次，每次2h，抽滤，合并滤液，浓缩，干燥，获得茯苓提取物；
工序2)，按固液比为1g:15mL将半枝莲粉中加入75％乙醇溶液，回流提取4次，每次2h，抽滤，合并滤液，浓缩，通过聚酰胺柱色谱分离，依次用水、20％乙醇溶液、70％乙醇溶液洗脱，70％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，获得半枝莲提取物；
工序3)，将茯苓提取物和半枝莲提取物按重量比为1:0.4混合获得孔源性视网膜脱离制剂。
实施例3：
孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，包括：
工序1)，按固液比为1g:6mL将茯苓粉中加入95％乙醇溶液，回流提取2.5h，过滤，滤渣重复提取2次，抽滤，合并滤液，浓缩，干燥，获得茯苓提取物；
工序2)，按固液比为1g:12mL将半枝莲粉中加入80％乙醇溶液，回流提取4次，每次1h，抽滤，合并滤液，浓缩，通过聚酰胺柱色谱分离，依次用水、20％乙醇溶液、70％乙醇溶液洗脱，70％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，获得半枝莲提取物；
工序3)，将茯苓提取物和半枝莲提取物按重量比为1:0.4混合获得孔源性视网膜脱离制剂。
实施例4：
孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，包括：
工序1)，同实施例3；
工序2)，同实施例3；
工序3)，将茯苓提取物和半枝莲提取物按重量比为1:0.5混合获得孔源性视网膜脱离制剂。
实施例5：
孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，包括：
工序1)，同实施例3；
工序2)，同实施例3；
工序3)，将茯苓提取物和半枝莲提取物按重量比为1:0.1混合获得孔源性视网膜脱离制剂。
实施例6：
孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，包括：
工序1)，同实施例3；
工序2)，同实施例3；
工序3)，将茯苓提取物和半枝莲提取物按重量比为1:0.2混合获得孔源性视网膜脱离制剂。
实施例7：
孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，包括：
工序1)，同实施例3；
工序2)，同实施例3；
工序3)，将茯苓提取物和半枝莲提取物按重量比为1:0.7混合获得孔源性视网膜脱离制剂。
实施例8：
孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，包括：
工序1)，同实施例3；
工序2)，同实施例3；
工序3)，将茯苓提取物和半枝莲提取物按重量比为1:0.8混合获得孔源性视网膜脱离制剂。
实施例9：
孔源性视网膜脱离制剂的制备工艺，包括：
工序1)，按固液比为1g:6mL将茯苓粉中加入95％乙醇溶液，回流提取2.5h，过滤，滤渣重复提取2次，抽滤，合并滤液，浓缩，干燥，获得茯苓提取物；
工序2)，按固液比为1g:12mL将半枝莲粉中加入80％乙醇溶液，回流提取4次，每次1h，抽滤，合并滤液，浓缩，通过聚酰胺柱色谱分离，依次用水、20％乙醇溶液、70％乙醇溶液洗脱，70％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，获得半枝莲提取物；
工序3)，按固液比为1g:5mL将沙苑子粉中加入95％乙醇溶液，回流提取3次，每次1h，抽滤，合并滤液，浓缩，通过大孔树脂AB-8柱色谱分离，依次用水、20％乙醇溶液、70％乙醇溶液洗脱，70％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，获得沙苑子提取物；
工序4)，将茯苓提取物、半枝莲提取物和沙苑子提取物按重量比为1:0.4:0.2混合获得孔源性视网膜脱离制剂。
实施例10：
茯苓提取物、半枝莲提取物和沙苑子提取物中各成分含量的测定
1.茯苓提取物中三萜类物质含量的测定
精密吸取熊果酸标准溶液(甲醇为溶剂，0.2mg/mL)0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL于15mL试管中，水浴挥干溶剂，冷却后精密加入0.4mL 5％香草醛冰醋酸溶液和1mL高氯酸，密塞，于60℃恒温水浴中加热15min，取出，冷却至室温，加冰醋酸5mL，摇匀后置于室温，甲醇作为空白对照，在548nm处测定吸光度值，得出熊果酸(三萜)标准曲线为：y＝0.0027x+0.1359，R2＝0.9994。
2.半枝莲提取物中黄酮类物质含量的测定
精密吸取芦丁标准溶液(0.2mg/mL)0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于50mL容量瓶中，加水稀释至12mL，分别加入5％的NaNO2溶液2mL摇匀，静置6min，加10％的Al(NO3)3溶液2mL摇匀，静置6min，加1mol/L的NaOH溶液20mL摇匀，再加最后加水定容至50mL,静置15min，以试剂空白调零，于510nm波长处进行测定，得出芦丁(黄酮)标准曲线为：y＝13.704x-0.0426，R2＝0.9995。然后根据根据标曲计算半枝莲提取物中黄酮类物质含量。
3.沙苑子提取物中皂苷类物质含量的测定
精密吸取人参皂苷Rb1标准溶液(甲醇为溶剂，0.5mg/mL)0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL于15mL试管中，水浴挥干溶剂，冷却后精密加入0.2mL 5％香草醛冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，密塞，于60℃恒温水浴中加热15min，取出，冷却至室温，加冰醋酸定容至6mL，摇匀后置于室温，以香草醛冰乙酸高氯酸为空白对照，在545nm处测定吸光度值，得出人参皂苷(皂苷)标准曲线为：y＝18.352x-0.7001，R2＝0.9992。
实施例1-3、实施例9获得茯苓提取物、半枝莲提取物和沙苑子提取物中各成分含量如表 1，可以看出各实施例中茯苓提取物中至少含有80wt％三萜类物质，半枝莲提取物中至少含有 60wt％黄酮类物质，沙苑子提取物至少含有30wt％皂苷类物质。
表1茯苓提取物、半枝莲提取物和沙苑子提取物中各成分含量
Figure GDA0003489621010000081
实施例11：
孔源性视网膜脱离制剂的对视网膜脱离术的影响
1.实验材料
1.1动物
健康成年雄性SD大鼠，体质量(250±20)g，清洁级动物，雌雄不拘，经裂隙灯、直接检眼镜检查眼前节及眼底均无异常，购自上海中医药大学动物实验中心。
1.2药物
孔源性视网膜脱离制剂，实施例1-9所制。
1.3试剂
10％水合氯醛，购自武汉协和医院药剂科。
可乐必妥，复方托吡卡胺滴眼液，购自苏州参天有限公司。
医用透明质酸钠凝胶(15mg/mL，0.5mL/支)，购自上海建华精细生物制品有限公司。
ATP测试盒、GSH-Px测试盒、MDA测试盒，购自南京建成生物工程研究所。
BCA蛋白定量试剂盒，购自赛默飞公司。
ROS试剂盒，购自贝博公司。
AIF抗体、羊抗兔IgG，购自北京博奥森生物技术有限公司。
1.4分组与造模
1.4.1分组
将大鼠按随机数字表法分为A组-正常对照组(无视网膜脱离组)、B组-模型组、C组- 孔源性视网膜脱离制剂治疗组，其中，C组-制剂治疗组还分为C1组-实施例1制剂治疗组、 C2组-实施例2制剂治疗组、C3组-实施例3制剂治疗组、C4组-实施例4制剂治疗组、C5组-实施例5制剂治疗组、C6组-实施例6制剂治疗组、C7组-实施例7制剂治疗组、C8组- 实施例8制剂治疗组、C9组-实施例9制剂治疗组。
1.4.2视网膜脱离模型的制备
术前生理盐水和可乐必妥清洗结膜囊，10％水合氯醛行腹腔注射麻醉大鼠(0.3mL/100g)， 0.5％托吡卡胺散瞳，散瞳后，丙美卡因表麻眼药水点眼。用1mL注射器沿鼻侧角膜缘处前房穿刺，放出房水以降眼压。于角膜缘后2mm行板层巩膜切口，角膜表面涂些许玻璃酸钠以防止角膜水肿浑浊，用盖玻片轻压角膜，减少角膜曲率。大鼠瞳孔扩开后，用显微镜观察大鼠视网膜，将30G圆形针头沿切口斜形插入，能在显微镜下看到针头进入视网膜下腔，然后向内注入透明质酸钠50μL，可见视网膜呈球形隆起，视网膜色灰白，表面的血管走形清晰可见，脱离范围约占整个视网膜的1/2并将脱离范围于结膜面用10-0缝线做标记，以备取材时定位用(如图1)。手术完毕后，左氧氟沙星滴眼液点眼。所有大鼠中仅在左眼创建视网膜脱离模型。
1.4.3给药方式
造模后第2天开始给药，其中：
A组-正常组与B组-模型组给予温开水灌胃，5mg/kg，每日1次；
C1组-实施例1制剂治疗组给予实施例1制剂灌胃，5mg/kg，每日1次；
C2组-实施例2制剂治疗组给予实施例2制剂灌胃，5mg/kg，每日1次；
C3组-实施例3制剂治疗组给予实施例3制剂灌胃，5mg/kg，每日1次；
C4组-实施例4制剂治疗组给予实施例4制剂灌胃，5mg/kg，每日1次；
C5组-实施例5制剂治疗组给予实施例5制剂灌胃，5mg/kg，每日1次；
C6组-实施例6制剂治疗组给予实施例6制剂灌胃，5mg/kg，每日1次；
C7组-实施例7制剂治疗组给予实施例7制剂灌胃，5mg/kg，每日1次；
C8组-实施例8制剂治疗组给予实施例8制剂灌胃，5mg/kg，每日1次；
C9组-实施例9制剂治疗组给予实施例9制剂灌胃，5mg/kg，每日1次。
1.5标本采集方法
连续灌胃3天、1周和5周后(视网膜自动复位的平均时间为4周)，各组随机抽取6只大鼠，用10％水合氯醛行腹腔注射麻醉(0.3mL/100g)，即刻摘除眼球，在解剖显微镜下剥离脱离部位视网膜(正常组取相应部位)，用滤纸吸干水分，电子天平称其湿重，再用双蒸水按照湿重:体积＝1:19配制成5％的视网膜匀浆液。
1.6观察指标和方法
1.6.1视网膜组织中ATP含量、GSH-Px活性、MDA含量测定
取视网膜匀浆液，用无机磷测定法测ATP含量、用硫代巴比妥酸法测MDA含量、用黄嘌呤氧化酶法测GSH-Px活性。操作严格按照试剂盒说明书进行。
1.6.2视网膜组织中ROS、AIF表达测定
将灌胃3天后大鼠的视网膜匀浆液置于低温高速离心机中，在1000g、4℃离心10min，弃沉淀，取上清。在96孔板中分别加入190μL匀浆上清液，10μL D02探针，移液器吹打使之充分混匀。37℃避光孵育30min，之后立即置于CLARIOstar酶标仪中，于激发波长530nm、发射波长610nm检测荧光强度。另取20μL上清液匀浆液行蛋白定量，蛋白定量检测方法同前。结果以荧光强度/蛋白浓度(μg/μL)表示组织活性氧强度。
用western blot检测AIF蛋白，用BCA法进行视网膜匀浆液蛋白定量，10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转硝酸纤维素(NC)膜。10％脱脂牛奶封闭NC 膜1h，洗膜缓冲液(TBST)漂洗NC膜10min×3次，加入一抗，按1:500稀释，湿盒中4℃过夜，TBST漂洗同前，加入二抗(羊抗兔IgG)，按1:3000稀释，室温孵育1h，TBST漂洗同前，加入ECL试剂反应5min，保鲜膜包裹，暗室进行X线胶片曝光成像，拍照，ImageJ软件分析求得IOD值。
1.6.3光感受器细胞的坏死率测定
将灌胃3天后大鼠，10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠后摘除眼球，组织立即固定到2.5％戊二醛电镜固定液12h，再取出眼球，沿视神经剖开眼球，再将眼球壁切成lmm×10mm左右的组织块共6-8块，置于新的电镜固定液固定。PBS清洗置换固定液，1％锇酸固定2h，PBS清洗，用浓度梯度的酒精脱水、环氧丙烷浸透、包埋、40℃烤箱12h，60℃烤箱48h。取出包埋块修块后超薄切片，切片厚度0.5～lam，铜网捞片、染色(枸橼酸铅和醋酸双氧铀染)，透射电镜观察拍照。每张切片涵盖200个光感受器细胞，根据形态学来判定其死亡方式。光感受器细胞的凋亡表现为细胞皱缩，核染色质凝集和边移；坏死细胞表现为细胞膜破裂，核固缩溶解。
1.6.4视网膜外核层的厚度测定
将灌胃1周后大鼠，10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠后摘除眼球，置入眼球固定液中固定。从低浓度乙醇到高浓度乙醇依次梯度脱水，二甲苯透明，透明后放入熔化的软石蜡，然后硬石蜡包埋。待石蜡块冷却后，切片机连续4μm切片，放入25℃的温水中展平，再贴到载玻片上。二甲苯脱蜡，经梯度乙醇复水处理后，去离子水浸泡放入苏木素液中10min，水洗，然后入70％和90％酒精中脱水各10min。伊红液(95％乙醇溶液)浸泡2min，染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明，中性树胶，覆盖盖玻片。
内核层的厚度用作对照以确保测量的外核层区域在每个分离的视网膜内的相同位置。数据表示为归一化的外核层厚度比：(外核层/视网膜分离的视网膜总厚度)/(外核层/附着视网膜的视网膜总厚度)。
1.6.5视网膜血流动力学测定
将灌胃5周后大鼠，10％水合氯醛行腹腔注射麻醉大鼠(0.3mL/100g)，采用彩色多谱勒超声诊断仪，15MHz探头检测大鼠左眼CRA，将探头置于大鼠眼睑上，启动彩色多普勒超声诊断仪，在获取5个以上稳定心动周期后，检测峰值血流速度(PSV)、舒张期最低流速(EDV) 和阻力指数(RI)。上述操作重复3次，取各项指标的平均值。
1.7结果分析
1.7.1视网膜组织中ATP含量、GSH-Px活性、MDA含量
视网膜组织Na+-K+转运ATP酶活性如图2所示，可以看出，相较于正常组，模型组视网膜组织中ATP含量明显减少；相较于模型组，制剂治疗组视网膜组织中ATP含量明显升高；这说明本发明实施例1-9制剂能提高视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织中ATP含量，改善视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织的能量代谢以及线粒体的功能，促进视网膜脱离复位术后视功能的恢复。同时，实施例3-4、实施例6-7制剂治疗组视网膜组织中 ATP含量高于实施例5和实施例8制剂治疗组，而实施例3-4制剂治疗组视网膜组织中ATP 含量显著高于实施例6-7制剂治疗组，这说明重量比为1:0.2-0.7的茯苓提取物和半枝莲提取物更有益于改善视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织的能量代谢，尤其在茯苓提取物和半枝莲提取物的重量比为1:0.4-0.5时，药效发挥作用最大，使得视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织中ATP含量最高，更有助于视网膜脱离复位术的进行及术后视功能的恢复。此外，相较于实施例3制剂治疗组，实施例9制剂治疗组视网膜组织中ATP含量显著提升，这说明沙苑子提取物的加入能够进一步提高视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织中ATP含量，进一步促进视网膜脱离复位术后视功能的恢复。
视网膜组织中GSH-Px活性如图3所示，可以看出，相较于正常组，模型组视网膜组织中GSH-Px活性明显降低；相较于模型组，制剂治疗组视网膜组织中GSH-Px活性明显升高；这说明本发明实施例1-9制剂能提高视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织中GSH-Px 活性，增强其抗氧化的能力，缓解缺血缺氧造成的损害，促进视网膜脱离复位术后视功能的恢复。同时，实施例3-4、实施例6-7制剂治疗组视网膜组织中GSH-Px活性高于实施例5和实施例8制剂治疗组，而实施例3-4制剂治疗组视网膜组织中GSH-Px活性显著高于实施例6-7制剂治疗组，这说明重量比为1:0.2-0.7的茯苓提取物和半枝莲提取物更有益于增强其抗氧化的能力，尤其在茯苓提取物和半枝莲提取物的重量比为1:0.4-0.5时，药效发挥作用最大，使得视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织中GSH-Px活性最高，更有助于视网膜脱离复位术的进行及术后视功能的恢复。此外，相较于实施例3制剂治疗组，实施例9制剂治疗组视网膜组织中GSH-Px活性较高，这说明沙苑子提取物的加入能够进一步提高视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织中GSH-Px活性，进一步促进视网膜脱离复位术后视功能的恢复。
视网膜组织中MDA含量如图4所示，可以看出，相较于正常组，模型组视网膜组织中MDA含量明显增加；相较于模型组，制剂治疗组视网膜组织中MDA含量明显降低；这说明本发明实施例1-9制剂能降低视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织中MDA含量，促进视网膜脱离复位术后视功能的恢复。同时，实施例3-4、实施例6-7制剂治疗组视网膜组织中MDA含量低于实施例5和实施例8制剂治疗组，而实施例3-4制剂治疗组视网膜组织中MDA含量显著低于实施例6-7制剂治疗组，这说明重量比为1:0.2-0.7的茯苓提取物和半枝莲提取物更有益于增强其抗氧化的能力，尤其在茯苓提取物和半枝莲提取物的重量比为 1:0.4-0.5时，药效发挥作用最大，使得视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织中MDA 含量最低，更有助于视网膜脱离复位术后视功能的恢复。此外，相较于实施例3制剂治疗组，实施例9制剂治疗组视网膜组织中MDA含量较低，这说明沙苑子提取物的加入能够进一步降低视网膜脱离及视网膜脱离复位术后视网膜组织中MDA含量，进一步促进视网膜脱离复位术后视功能的恢复。
1.7.2视网膜组织中ROS、AIF表达
在gain值为1300的条件下检测探针的荧光强度与ROS蛋白浓度的比值作为最终结果，视网膜组织中ROS和AIF表达如图5，可以看出，相较于正常组，模型组视网膜组织中ROS和AIF表达明显增加；相较于模型组，制剂治疗组视网膜组织中ROS和AIF含量降低，其中，实施例9制剂治疗组视网膜组织中ROS和AIF表达显著低于实施例3制剂治疗组。以上结果说明沙苑子提取物的加入能够与茯苓提取物和半枝莲提取物的制剂共同作用，通过抑制 ROS和AIF的释放，从而减少光感受器细胞的坏死，保护视网膜。
1.7.3光感受器细胞的坏死率
选择坏死作为观察细胞死亡的主要方式，光感受器细胞的坏死率如图6，可见，相较于正常组，模型组光感受器细胞坏死率较高；相较于模型组，实施例3制剂治疗组光感受器细胞坏死率稍有降低，而实施例9制剂治疗组显著低于降低，使光感受器细胞坏死率至少降低8％，且低于实施例3制剂治疗组。以上结果说明沙苑子提取物的加入能够与茯苓提取物和半枝莲提取物的制剂共同作用，减少光感受器细胞的坏死，保护视网膜。
1.7.4视网膜外核层的标准厚度比
视网膜外核层的标准厚度比如图7，可见，相较于模型组，实施例3制剂治疗组视网膜外核层的标准厚度比无明显差异，而实施例9制剂治疗组较高于实施例3制剂治疗组。以上结果说明沙苑子提取物的加入能够与茯苓提取物和半枝莲提取物的制剂共同作用，对视网膜的外核层厚度有显著的保护作用。
1.7.5视网膜血流动力学
视网膜血流动力学测定结果如下表2，可以看出，本发明实施例1-9制剂能改善视网膜脱离复位术后视网膜血流，促进视网膜色素上皮细胞吸收视网膜下积液；同时，实施例3-4、实施例6-7制剂治疗组视网膜血流效果优于实施例5和实施例8制剂治疗组，而实施例3-4制剂治疗组视网膜血流效果优于实施例6-7制剂治疗组，这说明重量比为1:0.2-0.7的茯苓提取物和半枝莲提取物更有益于视网膜脱离复位术后视网膜血流，尤其在茯苓提取物和半枝莲提取物的重量比为1:0.4-0.5时，药效发挥作用最大，更有助于视网膜脱离复位术视功能的恢复。此外，相较于实施例3制剂治疗组，实施例9制剂治疗组视网膜血流效果更佳，这说明沙苑子提取物的加入能够进一步提高视网膜脱离复位术后视功能的恢复。
表2视网膜血流动力学测定结果
PSV(cm/s) EDV(cm/s) RI
A组 14.34±0.45 7.93±0.33 0.45±0.22
B组 7.34±0.25 2.83±0.09 0.61±0.34
C1组 11.15±0.28 6.04±0.35 0.46±0.30
C2组 11.33±0.38 6.11±0.27 0.46±0.18
C3组 13.27±0.44 6.82±0.30 0.49±0.25
C4组 13.46±0.41 7.14±0.35 0.47±0.16
C5组 8.89±0.29 3.75±0.11 0.58±0.25
C6组 10.33±0.37 5.24±0.24 0.49±0.23
C7组 10.27±0.41 5.37±0.32 0.48±0.24
C8组 9.11±0.33 3.89±0.15 0.57±0.31
C9组 13.86±0.42 7.14±0.29 0.48±0.28
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (3)

1.一种含有茯苓提取物和半枝莲提取物的制剂在制备孔源性视网膜脱离复位术用药物中的用途，所述茯苓提取物至少含有80wt%三萜类物质，其制备方法为：按固液比为1g:3-10mL将茯苓粉中加入90-98%乙醇溶液，回流提取2-5次，每次2-4h，抽滤，合并滤液，浓缩，干燥，获得茯苓提取物；所述半枝莲提取物至少含有60wt%黄酮类物质，其制备方法为：按固液比为1g:8-15mL将半枝莲粉中加入75-92%乙醇溶液，回流提取2-5次，每次1-3h，抽滤，合并滤液，浓缩，通过聚酰胺柱色谱分离，依次用水、20%乙醇溶液、70%乙醇溶液洗脱，70%乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，获得半枝莲提取物；所述茯苓提取物和半枝莲提取物的重量比为1:0.2-0.7。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述制剂为重量比为1:0.4-0.5:0.1-0.3的茯苓提取物、半枝莲提取物和沙苑子提取物；所述沙苑子提取物至少含有30wt％皂苷类物质，其制备方法为：按固液比为1g:8-15mL将沙苑子粉中加入75-92％乙醇溶液，回流提取2-5次，每次1-3h，抽滤，合并滤液，浓缩，通过大孔树脂柱色谱分离，依次用水、20％乙醇溶液、70％乙醇溶液洗脱，70％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，获得沙苑子提取物。
3.孔源性视网膜脱离复位术用制剂的制备工艺，包括：
工序1)，按固液比为1g:3-10mL将茯苓粉中加入90-98%乙醇溶液，回流提取2-5次，每次2-4h，抽滤，合并滤液，浓缩，干燥，获得茯苓提取物；
工序2)，按固液比为1g:8-15mL将半枝莲粉中加入75-92%乙醇溶液，回流提取2-5次，每次1-3h，抽滤，合并滤液，浓缩，通过聚酰胺柱色谱分离，依次用水、20%乙醇溶液、70%乙醇溶液洗脱，70%乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，获得半枝莲提取物；以及，
工序3)，按重量比为1:0.2-0.7将所述茯苓提取物和半枝莲提取物混合获得孔源性视网膜脱离复位术用制剂。
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