CN106265622B - 益母草碱在制备视网膜视神经保护药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属制药领域，具体涉及益母草碱在制备视网膜、视神经保护作用药物中的用途，尤其是在制备治疗视网膜血管性病变和视神经炎症及退行性病变药物中的用途。本发明中，经前房生理盐水灌注诱导视网膜缺血再灌注损伤模型实验，结果表明益母草碱能减少缺血再灌注损伤后RGCs凋亡数量，提高RGCs存活率，减轻缺血再灌注损伤后视网膜变薄程度，且对视网膜各层均具有保护作用；所述的益母草碱可制成治疗视网膜损伤疾病药物，用于治疗视网膜缺血再灌注损伤，视网膜、视神经退行性疾病，以及通过调节眼部炎症反应用于治疗视网膜炎症性疾病，本发明为临床上述眼部疾病提供了新的治疗药物。

Description

益母草碱在制备视网膜视神经保护药物中的用途

技术领域

本发明属制药领域，涉及中药单体成分益母草碱在制药中的新的用途，具体涉及益母草碱在制备视网膜、视神经保护作用药物中的用途，尤其是在制备治疗视网膜血管性病变和视神经炎症及退行性病变药物中的用途。

背景技术

视觉是人体感知外界刺激最重要的功能之一，视觉障碍直接影响到人类的生存质量，而维持良好的视觉有赖于正常眼球的光路通透和视路灵敏。目前临床实践中针对造成视觉障碍的大多数光路系统病变，如白内障、屈光不正等已经有了相对完善的治疗措施，由此凸现的是视路系统神经变性性疾病难以防治的现状。随着社会老龄化等问题而日益严重，使得不可逆性进展的视路疾病成为失明的主要危险，其中，青光眼已成为全球第一位不可逆致盲性眼病，据统计，全球约有7000万青光眼患者，估计至2020年将达到8000万，因青光眼引起双眼失明者将占全球盲人总数的50％。糖尿病视网膜病变是另一常见的不可逆性致盲性眼病，在西方国家它是成人视力损害的首要原因，世界卫生组织预计在2030年全球将有36600万人患糖尿病(4.4％)，每三个糖尿病患者中就有一个发生糖尿病视网膜病变。另外视网膜血管阻塞、眼外伤、缺血性神经病变等眼科疾病均可导致视力不可逆性损害。上述眼病的一个共同病理特征是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的不可逆性凋亡。越来越多的证据表明在以上述眼科疾病的发生、发展过程中，视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)参与到了其主要病理机制中。视网膜中央动脉和它的分支是营养视网膜内层唯一的血管系统，而且属于终末动脉，各分支相互之间无毛细血管前的吻合支，因此视网膜内层对极微小的血流循环障碍都非常敏感。研究表明缺血再灌注损伤能够导致神经元退行性变；另外，视网膜光感受器细胞对缺血缺氧也非常敏感，视网膜缺血短时间即可发生光感受器不可逆性死亡。有研究以视网膜缺血再灌注损伤动物模型探究视网膜、视神经退行性疾病，如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性等，结果表明，能对抗缺血再灌注损伤的药物，往往同时也能同于治疗视网膜、视神经退行性疾病。研究显示，造成缺血再灌注损伤的主要机制是细胞在缺血缺氧时能量障碍、自由基生成、线粒体功能障碍、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸释放等，更为重要的是再灌注后大量的氧自由基以及炎症因子生成并释放到组织内，进一步加重了视网膜细胞损伤。研究还显示，炎症反应对视网膜、视神经具有着损伤与保护两个相反的效应，因此可以通过干预眼部炎症反应以达到保护视网膜、视神经的目的，其中，TNF-α和IL-1β两个促炎细胞因子在疾病的发生发展过程中起着重要的作用，当前两者与细胞表面死亡受体相结合后，细胞内蛋白凋亡酶被激活，进而导致细胞凋亡；另外，这两个炎症因子还可以促进白细胞与内皮细胞黏附，血管内皮损伤，造成血视网膜屏障破坏，最终导致视网膜各层细胞受损。一些眼部炎症性疾病，如葡萄膜炎、视神经炎、视网膜血管炎等，由于长期的炎症刺激破坏视网膜屏障，也会导致视网膜神经元不可逆凋亡。

鉴于目前临床治疗效果有限，最终上述疾病会导致视功能不可逆性损害甚至失明。尽管某些药物在实验条件下能够对抗缺血再灌注损伤，但由于给药方式、给药剂量、次数、药物副作用等多方面的原因，进入临床应用还存在有若干限制。因此，目前临床实践中尚无系统的、有效的对抗视网膜缺血再灌注损伤的方法。目前临床实践中主要治疗方案通常是针对原发疾病，如降低急性期青光眼患者眼压、调节糖尿病视网膜病变者的血糖及抑制视网膜新生血管生成、降低高血压、减轻外伤后眼局部组织水肿等；除此之外一些抗氧化药物，如维生素C、维生素E、己酮可可碱和银杏叶提取物等一些中药，以及抑制细胞内钙的药物，如尼莫地平、倍他洛克等是目前临床最为常用的对抗视网膜缺血再灌注损伤的干预措施。其中，尤其对视网膜、视神经退行性病变的治疗措施更为有限，例如目前为止，临床上并没有一个对黄斑变性中视网膜神经元有确切治疗效果的药物，研究认为长期联合服用维生素C、维生素E和叶黄素可以在一定程度上延缓少部分患者的病程进展，但是也只能作为辅助治疗措施，效果并不理想。因此寻找有效的视网膜、视神经保护药物尤其是能够调节炎症反应的药物显得特别重要。

已有报道的具有保护视网膜、视神经功能的中药包括：葛根、丹参、枸杞子、黄芪、刺蒺藜、银杏叶、灯盏细辛等，方剂有补阳还五汤，中成药有复方血栓通、复方丹参注射液、青光安颗粒等，但由于传统中药成分复杂，全身给药后存在副作用，药物作用机制复杂不清等，在临床上应用存在有争议，未被国际广泛认可。

益母草碱提取自传统中药益母草，属于生物碱类，其具有清热解毒、活血调经，水淤互结、治疗水肿、小便不畅，疮痈肿毒、皮肤瘾疹等作用；传统医学将益母草及其制剂应用于妇产科疾病，如痛经、产后出血等；也有研究发现益母草可以增加肾血流量，治疗肾水肿，大剂量的益母草还能抑制皮肤真菌，临床用于治疗皮肤瘙痒、荨麻疹等皮肤病变；近年来研究者发现其主要有效成分益母草碱能够降低血液粘滞度、增加冠脉血流量、保护心肌细胞，抑制心肌纤维化、降低心肌梗塞面积等，被用于治疗心血管系统疾病和血液系统疾病。

迄今为止，尚未见益母草碱用于治疗眼部疾病的报道。

发明内容

本发明的目的是提供益母草碱在制药中的新用途，具体涉及益母草碱在制备视网膜、视神经保护药物中的用途，尤其是在制备治疗视网膜血管性病变和视神经炎症及退行性病变药物中的用途。

本发明所述益母草碱分子式为C₁₆H₂₁N₂O₅，分子量为311.33，熔点为238℃。

本发明中，采用益母草碱进行了前房生理盐水灌注急性高眼压诱导视网膜缺血再灌注损伤模型的实验，造模前1小时腹腔注射给药，并以银杏叶提取物作为阳性对照药物，分别比较损伤后RGCs密度，测量视网膜厚度，检测损伤后第1和3天RGCs凋亡率，以及进一步检测缺血再灌注损伤后视网膜内炎症因子TNF-α、IL-1β；

实验结果显示，实验大鼠RIRI后第7天假灌注组(进行前房穿刺，但不进行前房生理盐水灌注)RGCs存活率为63％，银杏叶提取物组RGCs存活率提高到89％，益母草碱15mg/kg、30mg/kg两个剂量组RGCs存活率分别为97％、91％，分别较损伤组提高了34％和28％；RIRI后第14天RGCs存活率为64％，银杏叶提取物组RGCs存活率提高到85％，益母草碱15mg/kg、30mg/kg两个剂量组RGCs存活率分别为87％、82％；且益母草碱15mg/kg、30mg/kg两个剂量组相互之间RGCs存活率无显著差异(如表1所示)。

表1是视网膜缺血再灌注损伤后第7、14天各组RGCs平均密度。

表1

视网膜厚度的测量结果如表2-4所示，缺血再灌注后7天，相对假灌注组视网膜全层厚度，损伤组为81％,银杏叶组为87％，益母草碱15mg/kg、30mg/kg组分别为97％、92％；14天时损伤组为75％,银杏叶组为87％，益母草碱15mg/kg、30mg/kg组分别为97％、92％；21天时损伤组为71％,银杏叶组为84％，益母草碱15mg/kg、30mg/kg组分别为93％、93％；分别对视网膜各层进一步分析发现，内丛状层在损伤后第7天出现了变薄的现象，相对于假灌注组厚度，损伤组为72％，银杏叶组为80％，益母草碱15mg/kg组为91％；损伤后第14天，损伤组为66％，益母草碱15mg/kg组为83％；损伤后第21天，损伤组为63％，银杏叶组为72％，益母草碱15mg/kg组为80％；损伤后第7天各组视网膜外核层无显著差异；损伤后14天外核层显著变薄，相对于假灌注组，损伤组为69％，益母草碱15mg/kg组为88％；损伤后21天，相对于假灌注组，损伤组为62％，银杏叶组为79％，益母草碱15mg/kg组为90％；结果表明，益母草碱具有较好的、长期持续的视网膜保护作用，能减轻前房灌注对视网膜内丛状层的损伤作用，另外，在缺血再灌注损伤后14、21天视网膜外核层变薄，而益母草碱同时能改善外核层厚度，表明益母草碱对视网膜各层细胞均有保护作用。

表2显示损伤后第7、14、21天各组视网膜全层厚度。

表3显示损伤后第7、14、21天各组视网膜内从状层厚度。

表4显示损伤后第7、14、21天各组视网膜外核层厚度。

表2

表3

表4

本发明中对损伤后第1和3天RGCs凋亡率检测结果显示，在RIRI急性期(损伤后第3天)益母草碱对视网膜缺血再灌注损伤后RGCs的保护作用显著优于银杏叶提取物，益母草碱组RGCs凋亡比例显著低于银杏叶组(如表5所示)。

表5

进一步，本发明对缺血再灌注损伤后视网膜内炎症因子TNF-α、IL-1β进行检测，结果显示，益母草碱能降低缺血再灌注损伤后急性期视网膜内TNF-α、IL-1β表达量，其通过减轻炎症反应、抗凋亡、减轻血-视网膜屏障损伤实现对视网膜的保护作用。

本发明提供了益母草碱在制备治疗视网膜损伤药物中的新的用途，尤其是在制备治疗视网膜缺血再灌注损伤和视神经退行性变疾病药物中的用途。所述的益母草碱可作为治疗药物用于治疗视网膜损伤及视网膜神经退行性疾病；所述的视网膜缺血再灌注损伤包括视网膜动脉阻塞、视网膜经脉阻塞、糖尿病视网膜病变、高血压视网膜病变、青光眼急性大发作、眼外伤或前部缺血性视神经病变；所述的视网膜、视神经退行性变疾病包括青光眼、年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性或高度近视眼视网膜变性；

本发明还提供了益母草碱对眼部炎症的调节作用，进一步，所述的益母草碱可作为治疗药物用于治疗视网膜、视神经炎症性疾病包括巨细胞病毒视网膜炎或眼内其它部位炎症累及视网膜的疾病，如视网膜静脉周围炎、葡萄膜炎、视神经炎等。

附图说明

图1显示了损伤后第7天，各组视网膜神经节细胞密度，其中，

*表示与损伤组相比有显著差异，*表示P<0.05,**表示P<0.01；##表示两组间有显著差异p<0.01。

图2显示了损伤后第14天，各组视网膜神经节细胞密度，其中，

*表示与损伤组相比有显著差异，P<0.05，**表示P<0.01；#表示两组间有显著差异P<0.05，##表示P<0.01。

图3显示了各组视网膜全层厚度比较结果，其中，

*表示与损伤组相比有差异p<0.05，**表示p<0.01。

图4显示了各组视网膜内丛状层比较结果，其中，

*表示与损伤组相比有差异p<0.05，**表示p<0.01，#表示两组有显著差异p<0.05。

图5显示了各组视网膜外核层厚度比较结果，其中，

*表示与损伤组相比有差异p<0.05，**表示p<0.01，#表示两组有显著差异p<0.05，##p<0.01。

图6显示了视网膜缺血再灌注损伤后第1天，TUNEL检测各组视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡情况，其中，*表示与损伤组相比有显著差异，P<0.05,**表示P<0.01。

图7显示了视网膜缺血再灌注损伤后第3天，TUNEL检测各组视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡情况，其中，**表示与损伤组相比有显著差异，P<0.01，#表示两组间有差异P<0.05。

图8显示了损伤后第12、24、72小时，Western blot检测各组TNF-α表达情况，其中，*表示与损伤组相比有显著差异P<0.05，**P<0.01，#表示两组间有差异P<0.05。

图9显示了损伤后第12、24、72小时，Western blot检测各组IL-1β表达情况，其中，**表示与损伤组相比有显著差异P<0.01，##表示两组间有显著差异P<0.01。

具体实施方式

实施例1：益母草碱提高损伤的RGCs存活率

(1)动物模型建立

a.造模前1小时腹腔注射给药。阳性对照组予以银杏叶提取物100mg/kg，益母草碱组分三个剂量组，分别为7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg，损伤组予以同体积生理盐水；

b.氯胺酮(80mg/kg)甲苯噻嗪(12mg/kg)肌肉注射，全身麻醉动物后，眼周局部清洁消毒，倍诺喜滴眼液局部麻醉，复方托比卡按滴眼液扩瞳，林可霉素滴眼液冲洗眼部；

c.眼科手术显微镜下，对损伤组、阳性对照组以及益母草碱组进行前房灌注。以连接0.9％生理盐水袋的4.5mm头皮静脉针进行前房穿刺，避开3、9点钟血管，将生理盐水袋提至距离大鼠150cm高度，观察到大鼠眼前部苍白，虹膜血供终断，眼底血管闭塞，红光反射消失，且灌注针处无渗漏，迪可罗眼用凝胶覆盖角膜，避免角膜干燥损伤及穿刺孔直接暴露，假灌注组予以前房穿刺，不进行灌注；

d.灌注时间持续60分钟，期间保证大鼠深度麻醉无苏醒，保持体温37℃预防大鼠死亡，60分钟后去除前房灌注针，待眼前节血供恢复、虹膜血管充血、检查眼底无视网膜脱离和出血，并且视网膜血管再通血流恢复，眼底红光反射出现；

e.抗生素眼膏涂眼，回纳眼球，麻醉苏醒后送回，各组造模后每天腹腔注射给药一次。实验中前房灌注时若有损伤虹膜及晶体的个体予以剔除；

(2)上丘逆行标记

a.处死前5天，将SD大鼠固定于立体定位仪头架上，消毒后切开头顶部皮肤，刮除颅骨上骨膜；

b.利用实验动物脑立体定位仪对大鼠双侧上丘定位：距离后囟前2.0mm，双侧旁开1.2mm定位，用动物实验电动颅骨钻(直径1.0mm)钻孔；

c.微量注射器进针3.2mm，双侧分别缓慢注射5μL 3％的荧光金，滞留5分钟后缓慢拔出；

d.缝合后涂抹抗生素，保持体温37℃，麻醉苏醒后送回鼠笼。

(3)视网膜铺片RGCs计数

a.分别于造模后第7天、14天以水合氯醛深度麻醉大鼠后，用过滤后的4％多聚甲醛200ml，经心脏灌注固定后取出眼球，角膜缝线标记颞侧，将眼球浸泡于4％多聚甲醛中固定1小时；

b.将眼球浸于0.01MPBS液中，沿角膜缘后1mm剪除眼前节和玻璃体组织，分离视网膜，将视网膜平铺于防脱片化的载玻片上，在视网膜边缘做4个切口将视网膜分为上、下、鼻、颞四个象限后将视网膜铺平，以不含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片；

c.荧光显微镜下观察，对每个象限距离视乳头1mm、2mm、3mm处拍摄200倍照片各1张；

d.结合ImageJ软件及人工手动方法对每张照片中RGCs进行计数，求RGCs密度平均值(个/mm²)，利用SPSS软件进行数据统计学分析。

结果如图1-2所示：损伤后第7天，双上丘逆行标记RGC计数：假灌注组视网膜铺片平均RGCs密度为1842.75±119.71(个/m㎡)。其他各组视网膜神经节细胞密度分别为：损伤组1164.33±21.94、银杏叶提取物组1645.75±91.69、益母草碱(Leo)7.5mg/kg1431.6±198.61、Leo15mg/kg1795.4±93.28、Leo30mg/kg1693±149.92，损伤组与假灌注组有差异P＝0.000，损伤组与银杏叶提取物组、益母草碱7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg组存在差异，分别P＝0.002、0.046、0.001、0.034，益母草碱组15mg/kg与7.5mg组、30mg组有差异，分别P＝0.002、0.001；

损伤后第14天，各组视网膜神经节细胞密度分别为：损伤组1187±61.59、银杏叶提取物组1578.25±147.3033、Leo7.5mg/kg1401.75±326.06、Leo15mg/kg1619.5±102.5882、Leo30mg/kg1511.5±183.6346，损伤组与假灌注组有差异P＝0.000，损伤组与银杏叶提取物组、益母草碱15mg/kg、30mg/kg均有差异，分别P＝0.006、0.003、0.02。

实施例2：益母草碱减轻缺血再灌注损伤后视网膜全层损伤

(1)按实施例1中的方法对各组进行处理；

(2)制作石蜡切片

a.分别于造模后第7天、14天、21天处死大鼠，取眼球固定于眼球固定液中48小时，冲洗2小时；

b.脱水：50％酒精、70％酒精、85％酒精、95％酒精、100％酒精、100％酒精每级2小时；

c.透明：移入1/2二甲苯+无水乙醇2小时，移入纯二甲苯1.5小时，纯二甲苯1.5小时；

d.浸蜡：将处理的标本置于1/2粉末状石蜡+1/2二甲苯中，置于40℃温箱过夜；

e.包埋：将温箱温度提高至60℃，提存蜡3次，每次1-2小时，将材料倒入置于烫板上的模具中，后置于冷水中，凝固好去出晾干；

f.切片：厚度5μm沿眼球矢状面、通过视神经部位切片，粘片剂粘片，吸出水分置于温箱30-40℃过夜。

(3)H-E染色

a.脱蜡：将载玻片置于二甲苯染缸中2次，每次10分钟；

b.苏木精染液染5分钟，后冲洗，盐水酒精分化15秒，冲洗15分钟，依次移入75％酒精、85％酒精；

c.伊红染色1分钟，于95％酒精脱水2次，每次5分钟，100％酒精脱水2次，每次5分钟，后依次移入二甲苯I、二甲苯II各5分钟；

d.中性树脂封片；

e.每个眼球随机选通过视神经的切片5张，每张切片于视网膜上均匀拍摄200倍照片18张；

f.应用Image-pro-plus软件进行图片分析，SPSS统计学分析。

结果如图3-5所示：

全层视网膜厚度比较：假灌注组视网膜全层厚度156.34±14.25μm。损伤后第7天，各组全层视网膜厚度分别为：损伤组127.02±11.52μm，阳性对照136.63±14.17μm，Leo7.5mg/kg 149.62±11.27μm，Leo15mg/kg 152.19±13.77μm，Leo30mg/kg 144.44±26.47μm，假灌注组与损伤组相比有显著差异P＝0.021，Leo15mg/kg组视网膜全层厚度高于损伤组P＝0.043，其余各组与损伤组相比无显著差异；损伤后第14天，视网膜全层厚度分别为：损伤组118.64±5.94μm，阳性对照136.78±2.22μm，Leo7.5mg/kg 143.23±34.29μm，Leo15mg/kg 153.71±8.71μm，Leo 30mg/kg 145.67±3.49μm，损伤组视网膜厚全层度显著小于假灌注组P＝0.000，阳性对照组与损伤组有差异P＝0.047，Leo7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg组均与损伤组有差异，分别为P＝0.01、0.003、0.005；损伤后第21天，视网膜全层厚度分别为：损伤组112.67±14.25μm，阳性对照132.45±10.64μm，Leo7.5mg/kg 124.32±10.32μm，Leo15mg/kg 146.68±9.31μm，Leo 30mg/kg 146.99±16.52μm，假灌注组显著高于损伤组P＝0.000，阳性对照组与损伤组有差异P＝0.047，Leo15mg/kg/、30mg/kg组均高于损伤组，分别为P＝0.000、0.000；

各组视网膜内丛状层比较：假灌注组视网膜内丛状层厚度为36.6979±2.56μm。损伤后7天，各组视网膜内丛状层厚度分别为：损伤组26.74±1.04μm，阳性对照组29.06±5.17μm，Leo7.5mg/kg 25.41±2.61μm，Leo15mg/kg 33.08±4.29μm，Leo 30mg/kg 31.66±1.88μm，损伤组内从状层厚度低于对照组P＝0.034，益母草碱15mg/kg组显著高于损伤组P＝0.008，且益母草碱7.5mg/kg与15mg/kg组相比有差异P＝0.018；损伤后第14天，各组视网膜内丛状层厚度分别为：损伤组24.77±1.41μm，阳性对照组26.18±0.77μm，Leo7.5mg/kg25.22±10.45μm，Leo15mg/kg 30.74±2.69μm，Leo 30mg/kg 31.24±2.08μm，Leo15mg/kg、30mg/kg组内丛状层均厚于损伤组，分别为P＝0.010、0.031，两组间无显著差异；损伤后第21天：Leo15mg/kg组内丛状层厚于损伤组P＝0.014，阳性对照组与Leo15mg/kg组有差异P＝0.021；

各组视网膜外核层厚度比较：假灌注组外核层厚度为43.75±3.79μm。损伤后7天，各组外核层厚度无显著差异；损伤后14天，各组外核层厚度分别为：损伤组36.59±5.87μm，阳性对照组35.75±5.16μm，Leo7.5mg/kg 35.82±8.19μm，Leo15mg/kg 38.86±0.55μm，Leo 30mg/kg 40.08±2.04μm，损伤组视网膜外核层厚度显著小于假灌注组P＝0.000，阳性对照组与假灌注组有差异P＝0.006，Leo15mg/kg、30mg/kg组显著高于损伤组，分别P＝0.002、0.001，且两组无显著差异；损伤后第21天，各组外核层厚度分别为：损伤组27.78±1.98μm，阳性对照组34.35±1.44μm，Leo7.5mg/kg 30.32±1.60μm，Leo15mg/kg 39.77±9.01μm，Leo 30mg/kg 37.39±1.75μm，损伤组与假灌注组有差异P＝0.000，损伤组与阳性对照、Leo15mg/kg、30mg/kg有差异，分别P＝0.033、0.000、0.003。

实施例3：益母草碱降低缺血再灌注损伤后视网膜神经节细胞凋亡率

(1)按实施例1的方法对各组进行处理；

(2)冰冻切片制作

a.分别于造模后第1天、3天，水合氯醛深度麻醉大鼠后，用过滤后的4％多聚甲醛200ml，经心脏灌注固定后取出眼球，浸泡于4％多聚甲醛中固定2小时；

b.依次于10％、20％、30％蔗糖中脱水；

c.待脱水后，于角膜缘1mm处剪去角膜，去除晶状体和玻璃体组织，吸去眼杯内液体，在模具中以OCT包埋剂包埋，后置于-20℃冰箱，待成型后移入-80℃冰箱，冷冻1小时；

d.利用冰冻切片机沿眼球矢状面进行切片，切片厚度为10μm，贴于防脱片载玻片上晾干，置于-20℃冰箱保存备用。

(3)TUNEL染色

a.每组3个眼球，每个眼球选取经过视神经的切片5张，从-20℃冰箱取出后，室温下20分钟晾干；

b.4％多聚甲醛室温固定20分钟；

c.0.01MPBS冲洗30分钟；

d.用4℃新鲜配制的1％Triton X-100(用0.01MPBS配制的0.1％柠檬酸钠进行配制)浸泡2分钟；

e.0.01MPBS冲洗2次，共5分钟；

f.吸去标本边缘载玻片上的液体，加TUNEL混合反应液，于37℃孵育60分钟；

g.0.01MPBS冲洗3次，共10分钟；

h.吸去标本边缘载玻片上的液体后，用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片；

i.荧光显微镜观察、拍照，每张切片拍摄200倍照片4张；

j.用ImageJ软件进行照片分析，SPSS软件进行数据统计分析。

结果如图6-7所示：视网膜缺血再灌注损伤后第1天，TUNEL检测各组视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡情况：损伤组为28.87％±10.34％，银杏叶提取物组(阳性对照组)20.08％±2.43％，益母草碱组13.40％±2.65％。银杏叶提取物组RGCs凋亡比例低于损伤组P＝0.04，益母草碱15mg/kg组显著低于损伤组P＝0.001，银杏叶提取物组与益母草碱组无显著差异P＝0.93；

视网膜缺血再灌注损伤后第3天，TUNEL检测各组视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡情况：损伤组为38.16％±9.62％，银杏叶提取物组24.12％±4.39％益母草碱组16.64％±2.56％。银杏叶提取物组和益母草碱15mg/kg组视网膜神经节细胞凋亡比例显著较损伤组低，分别为P＝0.004，P＝0.000，且益母草碱组RGCs凋亡比例低于银杏叶提取物组，P＝0.02。

实施例4：益母草碱降低缺血再灌注损伤后视网膜内TNF-α、IL-1β表达量

(1)按实施例1的方法对各组进行处理；

(2)蛋白提取

a.分别于造模后12、24、72小时处死大鼠，取眼球，分离视网膜，用预冷的PBS液漂洗3次；

b.每个眼球的视网膜称重后，按照组织净重(g)：裂解液(ml)＝1:10比例加入RIPA组织裂解液，用小梁剪剪碎组织，超声粉碎10秒，间隔5秒，重复超声3次，冰上裂解半小时；

c.低温高速离心机12000rpm离心10分钟，取上清液，置于-80℃冰箱保存。(3)BCA法蛋白浓度测定

a.取1.2ml蛋白标准准配制液加入一管蛋白标准(30mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml蛋白标准液；

b.取适量以上配置的蛋白标准液，用PBS稀释至最终浓度0.5mg/ml；

c.按BCA试剂A：BCA试剂B＝50:1，配制成BCA工作液；

d.将标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板，加标准品稀释液补至20μl；

e.加适量体积样品到96孔板，加标准液品稀释液到20μl；

f.各孔均加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟；

g.测定A562，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度；

(4)Western Blot

a.裂解好的蛋白样品加入5×loading buffer；

b.仪器block heater干浴器，95℃蛋白变性5min；

c.配制12％分离胶后，加入TEMED后迅速灌胶，ddH₂O封面；

d.静置待分离胶聚合后，倾出上层水，以滤纸吸除残留液体；

e.配制5％浓缩胶后，加入TEMED后迅速灌胶，并插入齿梳，静置等待聚合；

f.组装电泳槽，倒入电泳缓冲液，去掉梳齿；

g.上样及电泳：按照每个孔60ug总蛋白进行上样，预染maker标记蛋白位置，浓缩胶80V，分离胶100V进行SDS-PAGE电泳2小时左右；

h.转膜：将包含待测蛋白条带(TNF-α17kd、IL-1kd)及内参考β-actin的分离胶切下，PVDF膜用甲醇浸泡30秒后转膜液浸泡10分钟，按照阳极、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、阴极的顺序制作“三明治”，0.35A恒流转膜1小时，根据Maker指示将目的蛋白和内参剪开；

i.封闭：转膜结束后，将膜放到T-TBS(含5％脱脂奶粉)，室温封闭1小时，然后T-TBS漂洗3次，每次5分钟；

j.一抗孵育：一抗兔抗鼠anti-TNF-α或者兔抗鼠anti-IL-1β以1:1000溶于T-TBS(含3％脱脂奶粉)，将膜浸泡其中，4℃孵育过夜；然后T-TBS漂洗4次，每次5分钟；

k.二抗结合：二抗小鼠抗兔以1:5000溶于T-TBS(含3％脱脂奶粉)，将膜浸泡其中，室温孵育1小时，然后T-TBS漂洗5次，每次5分钟；

l.显色：配制适量显色液(Thermo SuperSingle West Femoto Trial Kit)，滴于PVDF膜上，将其蛋白面朝下，使PVDF膜与显色液充分接触，反应1分钟，增强30秒，曝光5次；

m.用ImageJ分析灰度值，采用SPSS软件进行数据统计学分析；

结果如图8-9所示：Western blot检测TNF-α表达情况：损伤后12小时，损伤组与益母草碱组TNF-α表达量分别是假灌注组的6.95±1.57倍P＝0.001、4.82±1.08P＝0.005倍，且益母草碱组TNF-α表达较损伤组少P＝0.045；损伤后24小时，损伤组、益母草碱组TNF-α表达分别是假灌注组的6.39±1.52倍P＝0.001、4.13±1.15倍P＝0.013，且益母草碱组TNF-α表达较损伤组少P＝0.046；损伤后72小时，损伤组、益母草碱组表达量仍然高于假灌注组，分别5.11±1.57倍P＝0.002、3.27±0.92倍P＝0.029，两组之间无显著差别P＝0.064；

Western blot检测IL-1β表达情况：损伤后12小时，损伤组与益母草碱组IL-1β表达量分别是假灌注组的8.54±1.23倍P＝0.000、6.40±1.01倍P＝0.001，两组相互间无显著差异P＝0.087；损伤后24小时，损伤组与益母草碱组IL-1β表达量分别是假灌注组的7.67±1.23倍P＝0.000、4.21±0.40倍P＝0.005，且益母草碱组显著少于损伤组P＝0.003；损伤后72小时，损伤组IL-1β表达量是假灌注组的7.16±1.29倍P＝0.000，益母草碱组与假灌注组无显著差异P＝0.106，且显著低于损伤组P＝0.002。

Claims (1)

1.益母草碱在制备治疗视网膜、视神经炎症性疾病的药物中的用途，所述益母草碱分子式为C16H21N2O5，分子量为311.33，熔点为238℃；

所述的视网膜、视神经炎症性疾病是巨细胞病毒视网膜炎、视网膜静脉周围炎。