CN110420173A

CN110420173A - 葛根素凝胶滴眼液在制备治疗黄斑变性疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN110420173A
Application number: CN201910374225.6A
Authority: CN
Inventors: 张银娣; 沈建平; 姚进; 刘璟禹; 蒋沁; 朱延勤; 冯鲁中; 张辰官; 吴建伟; 胡正国; 陈德康
Original assignee: Zhejiang Shapuaisi Pharmaceutical Co ltd; Eye Hospital Nanjing Medical University
Current assignee: Zhejiang Shapuaisi Pharmaceutical Co ltd; Eye Hospital Nanjing Medical University
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2019-11-08

Abstract

本发明公开了葛根素凝胶滴眼液在制备治疗黄斑变性疾病药物中的应用，该应用可作为静注葛根素治疗眼底视网膜疾病的另一种有效的给药途径，或作为临床常用的抗血管内皮生长因子治疗AMD的补充选择给药途径；另外，减少大剂量静注葛根素带来的全身的不良反应及玻璃腔内反复注射血管内皮生长因子给眼带来的伤害，而且滴眼给药方便，用药量小，特别是葛根素的多靶点作用，可进一步发挥中医中药优势。

Description

葛根素凝胶滴眼液在制备治疗黄斑变性疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于中成药技术领域，涉及一种中成药的新应用，具体为葛根素凝胶滴眼液在制备治疗黄斑变性疾病药物中的应用。

背景技术

黄斑变性为致盲疾病之一,发病率较高。其病因尚未明确,但多数发生在老年人，故又称为年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)又称为老年性黄斑变性；此外，也可能与罗患全身疾病有关，如：2011年5月至2013年5月在收集湿性AMD497例患者中，伴高血压的患者占35.01％；伴有糖尿病者占29.18％；伴有高血脂的患者占24.75％；同时伴有颈椎病的患者占17.10％。其中，尤其糖尿病是AMD的重要相关危险因素，长期糖代谢紊乱可造成机体组织损伤，改变眼底血流动力学、增加氧化应激及加速糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)的累积等均可影响AMD的疾病进程。【马超等，AMD与全身性疾病及其它眼底疾病的相关因素分析，中国中医眼科杂志2014；8月24卷第(4):266】。

AMD是全世界第三位不可逆性致盲眼病，仅次于白内障和青光眼；虽然目前AMD尚未成为我国人群致盲的首要原因，但随着人口日趋老龄化，AMD在我国的发病率也逐渐升高【Jiangyuan Gao，NLRP3Inflammasome:Activation and Regulation in Age-RelatedMacular Degeneration。Mediators of Inflammation vol.2015；article ID690243.p.1-11】。

根据临床表现和眼底病理改变将AMD分为萎缩型和渗出型两种类型，依据病程及对视力影响的程度又分为早、中和进展期3个阶段。萎缩性AMD起病较缓，目前提出的可能机制主要与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)的损害有关，最常见的症状为轻度视力模糊，视力缓慢下降或视物变形；早期眼底改变表现为后极部可见大小不一的黄白色类圆形的玻璃膜疣，可以融合，色素上皮增生或萎缩，中心凹光反射消失，后极部色素紊乱，进一步出现边界清晰的地图样萎缩区，发展至晚期可见该区内脉络膜毛细血管萎缩，即可见到裸露的脉络膜大血管，早期发现采取有效手段使萎缩消失是挽救患者视力的关键。渗出性AMD的分子机制与脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成密切相关，常表现为突然单眼视力下降、视物变形或出现中央暗点，主要病理特点黄斑部视网膜下脉络膜新生血管的生成，由于形成后的新生管壁的通透性高于正常血管，极易引起出血和渗出等病理学改变，继而可形成疤痕，造成黄斑部损伤，严重影响中心视力，甚至致盲，故渗出性AMD虽然仅占AMD的10-20％，但却是AMD患者失明的主要原因。新生血管可生长在视网膜、视神经、或虹膜上引起患者视觉模糊或完全失去视觉。

近年来，国内外学者对AMD进行了大量深入的研究，其确切病因尚不明，可能与年龄、吸烟、环境、家族遗传、代谢、营养失调、外伤、感染、炎症以及视网膜黄斑长期慢性光损伤等多种因素有关，上述多种因素影响视网膜色素上皮层、感光细胞层和脉络膜多层组织从而导致不可逆性的中心视力下降或丧失。视网膜呈现正常视觉的前提条件是有视网膜与脉络膜血管供应充足的氧气，并且及时带走代谢废物。视网膜是高耗氧、高代谢的组织，其外丛状层以内由视网膜血管供血，外丛状层以外由脉络膜血管供血。在衰老、氧化损伤等始动因素的作用下，光感受器细胞-RPE-Bruch's膜-脉络膜毛细血管复合体发生严重的功能障碍，不能维持视网膜脉络膜组织的正常代谢，视网膜脉络膜局部缺血缺氧，再加上代谢废物堆积产生的毒性反应，促使Bruch's膜变性损伤断裂，脉络膜毛细血管穿过损伤的Bruch's膜向视网膜下生长，进而形成脉络膜新生血管。美国Beaver Dam眼科研究组调查了威斯康星州近5000个老年人，评估了光照暴露与AMD之间的横向及纵向联系，结果表明两者之间有正相关联系。已有大量研究表明光损伤启动了视细胞凋亡的发生机制，细胞凋亡是年龄相关性黄斑变性中感光细胞死亡的一个重要机制。

CNV的形成包括多种细胞与多种因子的参与如白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)，缺氧诱导因子-1a(hypoxia-inducible factor，HIF-1a)，血管内皮生长因子(vascularendothelium growth factor，VEGF)是目前已知促进CNV形成的最重要的因子之一。VEGF是一种多功能的细胞因子，其主要作用一是特异性地作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞増殖、刺激其增殖及移行，诱发新生血管形成，二是增加血管通透性，损伤视网膜光感受器细胞及视网膜色素上皮细胞，从而进一步诱导CNV的形成，形成恶性循环。

因此，目前对AMD有关的治疗方法，均是为了消除脉络膜新生血管膜，如:放射疗法、激光光凝疗法、经瞳孔温热疗法、手术治疗、激素、玻璃体内注射抗血管内皮生长因子等疗法，故减少新生血管的生成、减缓进入增殖期是AMD基础和临床研究的关键点，也是目前治疗AMD最有效疗法。临床上常用的有雷珠单抗(ranibizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、阿柏西普(aflibercept)和康柏西普(conbercept)等，其中Aflibercept与Conbercept是多靶点的抗VEGF类药物。它们都是通过玻璃体内注射抑制血管内皮细胞生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)从而抑制新生血管的形成，以维持视力稳定。虽然抗VEGF治疗是目前湿性AMD的一线治疗方法，但在临床实际工作中，此治疗方法尚有不足之处，如有效性与安全性、给药频率、联合治疗方案的选择、治疗周期长、治疗费用昂贵，尤其反复玻璃体内注射对眼组织的创伤等问题，尚需要进一步完善【吉祥，年龄相关性黄斑变性的治疗研究进展Int J Ophthalmol 2011；11(2):279-281】。

葛根素(Puerarin，PUE)是从葛根中分离出来的有效成分之一，它是一种异黄酮类化合物。通过对现代药理和医学研究证明：葛根素具有多种药理作用，如降低血糖、血脂、抑制血小板聚集、改善血液流变学、改善微循环、特异性阻断Ages与其受体(RAGE)结合，减少糖化蛋白形成，抑制腺苷环化酶、阻滞β受体，提高超氧歧化酶活性、增强抗氧化应激反应产生的氧自由基等作用。现代临床医学研究上也证明：葛根素通过静脉注射除广泛用于治疗多种内科疾病，也被用于治疗多种眼科疾病，如青光眼、眼底缺血性疾病，视网膜新生血管病变及视神经疾病等，具有一定的治疗效果【王晓霞，中药联合葛根素治疗脉络膜新生血管的临床观察，黑龙江中医药大学2008年硕士学位论文；柏春伟，葛根素治疗脉络膜新生血管的临床观察，2009年黑龙江中医学大学硕士学位论文；张超然，葛根素对糖尿病视网膜病变的临床研究及机理探讨，广州中医药大学硕士学位论文2011年4月】。

近年来，在多种整体动物不同病理模型均证明葛根素有抑制视网膜细胞VEGF的表达【Chen F et al.Puerarin enhances superoxide dismutase activity and inhibitsRAGE and VEGF expression in retinas of STZ–induced early diabetic rats.AsianPac J Trop Med.2012Nov；5(11):891-6；岳丽菁，中药单体葛根素对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子、蛋白激酶的影响，中国中医眼科杂志2013；23(1)：13-16；Teng Y，etal.Protective effect of puerarin on diabetic retinopathy in rats.Mol BiolRep.2009May；36(5):1129-33；岑璐莎，葛根素对氧诱导大鼠视网膜新生血管模型PECAM-1及VEGF表达的影响，浙江中西医结合杂志2017；27(10)：850-852；吴葛玮，葛根素抑制视网膜新生血管的实验研究，2000年青岛大学硕士学位论文】。同时在离体RPE细胞试验上也得到同样证明：低氧诱导因子-1α低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在视网膜新生血管形成过程中起着重要作用，凝胶图像分析免疫组织化学染色结果显示:葛根素有效抑制了CoCl₂诱导致人RPE细胞产生HIF-1α,提示抑制HIF-1α的表达可能是抑制缺血性视网膜病变新生血管形成的新策略,【李雯霖等，葛根素抑制缺氧状态下人视网膜色素上皮细胞表达，眼科新进展2006；26(7):504-507】。此外，通过对芪灯明目胶囊中各组分拆分，分别从整体试验用鸡胚尿裹膜微血管生成实验、VEGF转基因斑马鱼血管生成实验，证实葛根素具有显著抑制血管计数；从器官组织试验用大鼠动脉环实验，证实葛根素可使其微血管密度明显减少。从细胞试验用人脐静脉内皮细胞増殖、迁移实验、证实葛根素有显著性抑制脐静脉内皮细胞增殖和迁移的作用；并认为葛根素这种作用可能是通过阻断STAT3和EGFR(内皮生长因子受体)等信号转导通路，从而下调VEGF等血管生成因子的表达，最终起到抑制新生血管的作用。【陶铮等，芪灯明目胶囊有效成分抗血管生成作用及其机制研究，成都中医药大学2016年博士研究生学位论文】。此外，葛根素对大鼠视网膜缺血再灌注致视网膜细胞超微结构的损伤有保护作用，并对此损伤引起视网膜电流图b波振幅下降的恢复时间也比模型组明显要快。【陈捷等，葛根素对大鼠视网膜缺血再灌注损伤中细胞超微结构的影响中国现代医学杂志2008:；18(24)：3592-3597】。

许多视网膜变性疾病,尽管其发病机制和特点不同,但它们致盲的共同通路均为感光细胞的凋亡而引起不可逆的视力丧失，因此，抑制凋亡、保护细胞成了近年来人们研究的热点。现代分子生物学研究表明，葛根素可以从多个环节来抑制细胞凋亡，因此被认为是一种有效的抗视网膜色素上皮细胞凋亡的治疗剂，如：在整体动物不同病理模型上，葛根素腹腔注射可延缓遗传性视网膜色素变性小鼠的视网膜外核层细胞和视网膜光感受器外段损伤；并认为，葛根素抗小鼠光感受器细胞凋亡的可能与它能改善眼局部微循环、提高超氧化物歧化酶活性、增强抗氧化能力、钙离子通道阻滞，抑制钙离子内流，减少钙离子在细胞内蓄积、抗谷氨酸引起的神经毒性、和直接增加视网膜Bcl2的表达等抗凋亡机制有关【邓新国，葛根素对遗传性视网膜色素变性耐小鼠的干预作用及其抗凋亡机制研究中国药理学通报2007；23(2):223-7】。在链脲佐菌素(STZ)致糖尿病模型上观察得出：葛根素组与模型组比：大鼠视网膜电图b波振幅明显上升，透射电镜视网膜超微结构改变明显好转，凋亡指数显著下降以及NF-κB、p65表达也显著下降。故葛根素可抑制NF-κB的活化，抑制视网膜神经细胞的凋亡从而起到保护神经视网膜的作用【陈放等葛根素对糖尿病大鼠视网膜的保护及对NF-κB表达的抑制中国药理学与毒理学杂志2011；25(3):296-300】。葛根素注射液增加了SD大鼠视网膜下腔中被异种移植的C57BL/6小鼠RPE细胞的生存期，这是通过对过氧亚硝酸盐(peroxynitrite，ONOO^-)水平的下调和诱导型一氧化氮合成酶.(inducible nitricoxide synthase i NOS)表达抑制从而减少糖尿病大鼠视网膜色素上皮细胞的凋亡，因此认为葛根素可作为治疗糖尿病视网膜病变的潜在药物【HAO Li--Na et al..Puerarindecreases apoptosis of retinal pigment epithelial cells in diabetic rats byreducing peroxynitrite level and iNOS expression.Sheng Li Xue Bao.2012；64(2):199-206和Int J Ophthalmol.2011；4(3):250–254.】。又在视网膜光损伤模型上提示葛根素注射液具有减轻视网膜光损伤、保护视网膜的功能以及促进光损伤后视网膜的修复的作用，其作用机理可能与增强NF-1CB蛋白表达，减弱TNF-a，Fast和Caspase-3表达，从而抑制视网膜细胞凋亡【张春芳等，葛根素注射液对大鼠视网膜急性光损伤过程中细胞凋亡因子TNF-α、Fast影响的研究成都中医药大学2008年硕士学位论文】。在离体细胞水平研究上，用甲基乙二醛(methylglyoxal)诱导的人RPE凋亡，葛根素通过抑制促炎因子引起的炎症和神经元损伤来保护视网膜【Sook Kim Y et al，Protective effects of puerariae radixextract and its single compounds on-induced apoptosis in human retinalpigment epithelial cells.J Ethnopharmacol.2014Mar 28；152(3):594-8】。Y-79细胞，一种可以分化，以显示原型特性和光感受器特性，被广泛用作体外模型来研究分子光感受器事件，证明葛根素对谷氨酸诱导的分化型Y-79细胞毒性的抑制作用及对ROS(活性氧簇reactive oxygen species,ROS)生成有抑制作用【Wang K，Neuroprotective Effect ofPuerarin on Glutamate-Induced Cytotoxicity in Differentiated Y-79Cells viaInhibition of ROS Generation and Ca²⁺Influx.Int J Mol Sci.2016；17(7).1707-1109】。葛根素对糖尿病视网膜病变(DR)白细胞介素IL-1β诱导TR-iBRB2细胞(一种视网膜毛细血管内皮细胞系，有关血视网膜屏障(BRB)功能)的凋亡有保护作用。【Xue Zhu，et al，The effect of puerarin against IL-1β-mediated leukostasis and apoptosis inretinal capillary endothelial cells(TR-iBRB2)Mol Vis.2014；20:1815–1823】。最近研究指出：淀粉样蛋白(Aβ)是一种促进AMD进展的关键刺激因子。葛根素的作用可能是通过激活Nrf2/HO-1抗氧化信号通路和抑制Aβ1-40诱导的IRE1和PERK磷酸化以及ATF6α的核表达来介导的，这从葛根素分子机制研究上，揭示了葛根素预防AMD的新机制，【Wang K，etal.Puerarin inhibits amyloidβ-induced NLRP3 inflammasome activation inretinal pigment epithelial cells via suppressing ROS-dependent oxidative andendoplasmic reticulum stresses.Exp Cell Res.2017；357(2):335-340]。

综上所述，说明葛根素治疗AMD具有广阔前景。但葛根素口服难以吸收，因此无论实验动物或临床所取得葛根素的各种药理作用或临床疗效通常是通过反复腹腔或静脉注射给药途径取得。AMD为眼底疾病，一般认为滴眼液的疗效仅局限于眼前部疾病(如结膜炎，青光眼和白内障等)，由于所达眼底部位药物浓度甚少；通常眼后部的疾病(眼底缺血性疾病，视网膜新生血管病变等)需要反复静脉注射或直接眼玻璃腔内注射。已报道玻璃腔内反复注射VEGF会给眼带来的伤害，葛根素静脉注射液会带来诸多风险【Xie XS et al，Evaluation on safety of puerarin injection in clinical use,Zhongguo Zhong YaoZa Zhi.2018；43(19):3956-3961.】。由于葛根素注射液至今难以避免的严重不良反应造成葛根素在眼底疾病的临床治疗应用上带来了困惑；但相对地讲，局部眼部给药比全身给药进入眼内达到靶区更具优势与可行性。因此，研制能将葛根素透入眼底部较多，且能证明对AMD实验动物模型上发挥黄斑变性有疗效的的新型葛根素制剂是一个亟需解决的问题。

发明内容

解决的技术问题：本发明目的在于提供葛根素凝胶滴眼液新剂型，克服现有技术的不足，使其在眼底的葛根素浓度，达到能治疗黄斑变性疾病的目的，从而实现葛根素的新应用。

技术方案：葛根素凝胶滴眼液在制备治疗黄斑变性疾病药物中的应用。

优选的，所述黄斑变性疾病为年龄相关性黄斑变性疾病。

通过优选，所述药物中葛根素的质量百分含量为1.2％。

研制及采用在眼底达足够含量引起药效的葛根素滴眼液凝胶剂型采用已公布专利201410836121.X技术来制备1.2％葛根素滴眼液的凝胶剂。已证明该新剂型，能改善药物的生物药剂学特性，加之，该小试样品已经历两年稳定性考察。故现进一步用同法制备1.2％葛根素滴眼液的凝胶剂应用于本研究，测定大鼠眼底视网膜组织内葛根素的含量及判定其在葛根素凝胶滴眼液对大鼠视网膜蓝光损伤的疗效。

病理模型的选用：动物模型是研究其病理过程及防治的基础，蓝光作为短波长，一种近紫外可见光光谱，是导致自然界中视网膜损伤甚至细胞凋亡的主要光线。蓝光诱导的视网膜细胞损伤已被广泛用作视网膜变性的体内和体外研究的模型。(Wan-Ju,EliaJ.Duha,et al,Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stressinduced by blue light,Exp Eye Res.2017；154:151–158)因此本研究用蓝光诱导的大鼠视网膜细胞损伤的病理模型，通过用1.2％葛根素滴眼液的凝胶剂局部滴眼，探究其治疗黄斑变性疾病中应用的可能性。故本实验采用视杆细胞占优势、对光损伤的敏感性高的啮齿类动物SD大鼠作为实验动物。

本发明所述葛根素凝胶滴眼液在制备治疗黄斑变性疾病药物中的应用，其作用原理在于：目前，解决中成药在眼部的停留时间及提供入眼内方式，已具可操作性，眼用原位凝胶系统由于其在眼部给药中独特的优势，无疑是目前有关眼部给药最重要的成果之一。经眼内药动学分布初步研究证明：葛根素凝胶滴眼液在家兔脉络膜和视网膜的吸收高于同浓度葛根素普通滴眼剂的60-70％，改善药物的生物药剂学特性，并导致视网膜血流的动力学增强，并取得相当于临床大剂量，多次静注葛根素的疗效强度(见已公布专利201410836121.X)。

有益效果：本发明所述葛根素凝胶滴眼液在制备治疗黄斑变性疾病药物中的应用，葛根素凝胶滴眼液通过局部滴眼，使葛根素直达眼部，葛根素滴眼给药方便，用药量小，减少大剂量静注葛根素带来的全身的不良反应及VEGF玻璃腔内反复注射抗血管内皮生长因子给眼带来的伤害，特别是葛根素的多靶点作用，除了它有抑制CNV抗RPE细胞凋亡外，还能改善血液流变学、改善眼底微循环、特异性阻断Ages与其受体结合，减少糖化蛋白形成，提高超氧歧化酶活性、增强抗氧化应激反应产生的氧自由基等作用，因为这些因素都与黄斑变性疾病的进展有关，这样可进一步发挥中医中药治疗黄斑变性的优势；有望成为静注葛根素治疗眼底视网膜疾病的另一种有效的给药途径，或作为临床常用的抗血管内皮生长因子治疗AMD的补充选择给药途径。

附图说明

图1是葛根素凝胶滴眼液和葛根素普通滴眼液在和大鼠视网膜上含量的比较图；

图2是1.2％葛根素凝胶滴眼液对抗蓝光对大鼠右眼闪光视网膜电图b波振幅值(μV)的影响图；

图3是1.2％葛根素凝胶滴眼液对抗蓝光对大鼠左眼闪光视网膜电图b波振幅值(μV)的影响图；

图4是1.2％葛根素凝胶滴眼液对抗蓝光对大鼠右眼闪光视网膜电图b波振幅抑制率(％)的影响图；

图5是1.2％葛根素凝胶滴眼液对抗蓝光对大鼠左眼闪光视网膜电图b波振幅抑制率(％)的影响图；

图6是实施例3中空白对照组视网膜切片放大20倍图；

图7是实施例3中空白对照组视网膜切片放大40倍图；

图8是实施例3中光损伤模型组视网膜切片放大20倍图；

图9是实施例3中光损伤模型组视网膜切片放大40倍图；

图10是实施例3中光损伤给药组视网膜切片放大20倍图；

图11是实施例3中光损伤给药组视网膜切片放大40倍图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1葛根素凝胶滴眼液的制备

处方：

制法：制备工艺

(1)取配料锅一个，称取处方量凝胶剂泊洛纱姆407，放入121℃烘箱中消毒，12分钟后取出密封；

(2)用新鲜沸腾后的注射用水1000g，冷却至室温。

(3)另取配料锅一个，处方量称取缓冲对柠檬酸钠柠檬酸，加入上述700g注射用水，得pH为6.1-6.3.的溶液为1液；

(4)称取处方量透明质酸钠、EDTA、焦亚硫酸钠、苯扎溴铵、冰片，逐一加入1液中，相继搅拌溶解，为2液；

(5)将2液加热至65-75℃，立即加入已称取处方量的葛根素，充分搅拌使其分散溶解后成澄清溶液，称3液；

(6)趁热将3液经0.22μm的水系滤膜过滤后，立即将3液倒入已消毒泊洛沙姆的配料锅中，搅拌混匀成澄清溶液后，定容至1000g，充分搅拌均匀，称4液；

(7)将4液在4℃冰箱静置2小时，pH为5.8-6.2，测定渗透压及含量后灌装，4℃保存。

实施例2葛根素凝胶滴眼液在SD大鼠视网膜中葛根素的含量测定

一、方法学建立

目的：用HPLC-UV法获得葛根素在大鼠视网膜上标准曲线，期望能满足眼球视网膜组织测定葛根素含量的需要。

1.测定条件

1.1仪器日本岛津LC-10A HPLC仪，SPD-10Avp紫外检测器，1N-180柱温箱，Mettmer高精微量分析天平，岛津色谱工作站(LC solution V1.x)，漩涡震荡器，电动匀浆器，Eppendorf微量加样器等

1.2.色谱条件色谱柱：迪马C18(250×4.6mm，￠5μm)，柱温30℃，紫外波长250nm，流动相：乙腈：0.05％甲酸溶液(15：85)，流速0.8ml/min，进样40μl；

2.药品，葛根素对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号0752-9806).葛根素购自四川省玉鑫药业有限公司

3.受试健康的SD大鼠10只，雄性，体重180-250g；由南京医科大学实验动物中心提供。

大鼠许可证号:SCKX(苏)2012-0008，合格证号：0021795。

4.视网膜样品采集处理及其标准曲线的制备与测定。

4.1样品采集处理:大鼠饲养观察3天后处死，取出眼球，在手术显微镜下分离出视网膜组织。

样本在-80℃条件下保存待用。

4.2标准曲线的制备与测定：精密称取正常视网膜组织57μg，加入20μg/10ml葛根素对照溶液50μl(0.1μg)及5倍量0.9％生理盐水，混漩1min，浸泡一夜，第二天加4倍量0.8mol/L的高氯酸超声匀浆，混漩0.5min，高速离心(12600r/min)15min，取上清液，得使模拟成0.1ug/ml的视网膜浓度溶液，然后依次稀释为0.1，0.05，0.025，0.0125，0.0063(μg/ml)的标准溶液；取40μl注入液相色谱仪,外标法峰面积定量测定。以葛根素的平均峰面积(A)为纵坐标，以葛根素的浓度(μg/ml)为横坐标，得葛根素标准曲线的回归方程：见表1。

表1大鼠视网膜葛根素标准曲线测定结果

二、葛根素凝胶滴眼液和葛根素普通滴眼液在大鼠视网膜上含量的比较

目的：通过常规滴眼给药，用HPLC-UV法测定葛根素凝胶滴眼液和葛根素普通滴眼液在大鼠视网膜上含量，通过两者比较，证实葛根素凝胶滴眼液高于葛根素普通滴眼液。

1.仪器，药品，色谱条件，测定方法见上述方法学。

2.药品：1.2％葛根素凝胶滴眼液按实施例1配置，pH6.04，含量98.2％，市售1％葛根素滴眼液，浙江莎普爱思药业股份有限公司生产。

3.动物:健康的SD大鼠36只，雄性，体重160-220g，由南京医科大学动物中心提供，SCKX(苏)2012-0008，合格证号：0021795

4.大鼠饲养观察3天后，平均分为2组，即1.2％葛根素凝胶滴眼液组和1.0％市售葛根素普通滴眼液组；每组大鼠各分别滴不同眼药每天3次，每次1滴，滴眼药时间为每天上午8:00-9:00，下午13:00-14.00，傍晚18.00-19.00，连用3天，估计每次葛根素一滴，剂量约为500μg-600μg,因鼠眼甚小，两组滴眼药均有外溢。第4天两组大鼠清晨滴药后0.5，1.0，2.0，3.0，6.0小时不同时间取眼球，1.2％葛根素凝胶滴眼液组每个时间点用大鼠6只，1.0％市售葛根素普通滴眼液每个时间点用大鼠3只。各鼠在手术显微镜下分离取视网膜膜组织，每一鼠的左右眼视网膜膜组织成为一个样本。称重后，在-80℃条件下保存待测。

5.分析和统计：待测样品用上述方法学测定，每次测定样品作随行标准曲线，得回归方程，用外标法峰面积定量测定。

5.结果和讨论：结果见表2，图1。

表2大鼠多次给药后视网膜内葛根素含量

从表2，图1可见：虽小鼠1.0％葛根素市售普通滴眼液组比1.2％葛根素凝胶滴眼液药物接受葛根素少约100μg，由于前者所测得视网膜内含量已低于测定条件的最低阈值，虽两组大鼠均受到滴眼药时药液外溢影响，但两者比较，可以说明用凝胶滴眼液大鼠的视网膜内可以测到，且在给药后上述四个时间点内，其平均葛根素含量在50ng/g左右。在专利2014.1.0836121.x中家兔一次用1.2％葛根素凝胶滴眼液在0.5-6h间测得的视网膜内平均峰含量/谷含量(ng/g)之比约为350ng/50ng(7倍)，在大鼠约为100ng/50ng(2倍)，大鼠的峰值浓度较低，峰、谷含量(ng/g)波动较小，这可能与大鼠眼眶较兔小，滴眼药易外溢有关，或与家兔是一次给药测定，而大鼠是在多次给药后测定，此时，小鼠视网膜组织内含量可能已趋向稳态有关。

实施例3药理试验葛根素凝胶滴眼液对大鼠视网膜蓝光损伤防的治作用

目的：在大鼠视网膜蓝光损伤的模型上，用1.2％葛根素凝胶滴眼液滴眼，以说明其可能用于治疗人黄斑变性疾病。

原理：短波蓝光波长范围在435-450nm之间，具有相对较高能量的光线，长时间的光损伤会在视网膜上产生累积效应，通过诱导产生自由基及脂质过氧化物、激发视脂褐素、损伤细胞色素氧化酶以及诱导视网膜细胞凋亡，从而引起视网膜损伤，导致包括老年性黄斑变性在内的多种黄斑损伤。

方法：全视野闪光视网膜电图(Flash-Electro retino gram，F-ERG)作为一项客观评价视网膜功能的手段已经在实验室和临床应用一百多年的历史。由于鼠类和灵长类动物眼之间有极强的相似性，并且大鼠相对猴子价格便宜得多，因此大鼠也成为研究各类眼病的常用模型。SD大鼠的视网膜不含色素，无任何保护，直接接受来自外界的光辐射，因此对光损伤敏感，F-ERG是使用一定的强闪光刺激从角膜表面记录到的视网膜综合电反应。该综合电反应波由a波、b波及最新发现的明视(Photopic negative response，Ph NR)波组成，它主要由一个负向的a波和一个正向的b波组成，叠加在b波上的一组小波为振荡电位(oscillatorypotentials，Ops)，a波和b波反映了神经节细胞以前的视网膜细胞功能状态。a波表达了光感受器的超极化活动，b波产生于视网膜内层Müller细胞和双极细胞的共同电活动，大鼠含有的视锥细胞很少，一般是不产生一个显著的a波；b波的波幅可反映视网膜光损伤的功能状态,是评价视网膜光损伤的一个较客观、准确的指标。故本实验主要指标是观察比较空白对照组，光损伤给药组与光损伤模型组等三组大鼠在兰光照射前后b波振幅及其抑制％率的变化，以判断其模型是否成功及葛根素的疗效。

1.实验材料

1.1.实验动物健康雄性清洁级SD大鼠60只，体重160-220g，由南京医科大学动物中心提供，SCKX(苏)2012-0008，合格证号：0021795。

1.2.试剂和仪器

眼电生理记录EP1000Pro(日本Tomey公司)，-80℃冰箱(REVCO公司)，-30冰箱(SANYO公司)，4℃冰箱(海尔公司)，显微手术器械(苏州显微手术器械厂)，手术显微镜型号yz20ps(苏州六六生产)，载玻片、盖玻片、一次性注射器等。

1.3.药品

1.2％葛根素凝胶滴眼液按实施例1配制，溶剂凝胶滴眼液，即无葛根素，但其所含辅料，配制方法与葛根素凝胶滴眼凝胶滴眼液相同。托品卡胺滴眼液、奥布卡因滴眼液、10％水合氯醛等。

2.动物分组及实验步骤：

大鼠经动物饲养室内饲养3天，观察活动能力完好，选无异常行为如刻板行为、震颤等，视觉无损伤的大鼠后进行实验。动物室内12小时明暗循环，采用普通饲料喂饲，自由获取饮水。根据体重将动物随机分为3组,空白对照组在正常条件下饲养，不用药,不光照，不予特殊处理。光损伤溶剂组，光损伤给药组，见表3。每组大鼠在照光前正常测定闪光视网膜电图，踢除b波振幅<40μv的鼠眼。行兰光照射12小时后，除正常对照组外，光损伤溶剂组和光损伤给药组每天3次滴眼，时间为上午8:00-9:00，下午13:00-14：00，傍晚18：00-19：00，按分组分别给溶剂凝胶滴眼液或1.2％葛根素凝胶滴眼液眼药。根据照光后连续给药的天数分两批，即第一批大鼠在照光后经连续给药7天进行F-ERG重复测定，第二批在照光后经连续给药14天再次测定F-ERG；空白对照组大鼠也相应分两批和光损伤溶剂模型组、光损伤给药组大鼠随同测定。

表3.试验大鼠分组分批表

3.闪光视网膜电图(Flash-Electroretinogram，F-ERG)测定

清醒大鼠测定前先暗适应6小时，在大鼠搬动过程中仍要保持避光，测定F-ERF全过程在暗室红灯光下进行。大鼠用托品卡胺滴眼液散瞳，用10％水合氯醛250mg/kg腹腔注射麻醉，待动物的眼睑反射和疼痛反射消失、呼吸平稳、进入麻醉状态后，用盐酸奥布卡因滴眼液行双眼角膜表面麻醉。室温保持26℃将大鼠固定在实验台上,分别记录大鼠左右眼闪光全视野F-ERG。先遮盖左眼，安放大鼠右眼电极，作用电极为角膜电极，参考电极和地电极均使用皮肤电极分别置于大鼠同侧面颊皮下和尾部。大鼠置于平台上，头部伸出，将平台推入Ganzfeld全视野刺激器内部，大鼠眼睛保持睁开状态，以保证给予的刺激有效。

F-ERG将发光二极管(light-emitting diode,LED)置于大鼠右眼前方15cm处进行闪光刺激。刺激参数采用全视野,白闪光刺激,刺激强度程序：4cd·m-2·s-1档/0.2cd·m-2·s-1档/1cd·m-2·s-1档/4cd·m-2·s-1档顺序进行。每个程序档：单次闪光刺激,共刺激20次,单通道记录,刺激频率为20Hz,每次采样时间50ms。评价标准b波的标识依据是国际视觉电生理协会(Clinical Electrophysiology of Vision，ISCEV)的最新标准ERG中第一个向下的波为记a波，第一个向上的波为记b波,b波振幅的计算方法是从基线测到a波的波谷测到b波的波峰，单位均为微伏(u V)，采用原装电生理记录软件EP-1000进行F-ERG实验控制、数据采集及记录，每眼每次至少作3次,记录到的数据通常先存储在计算机里，实验结束后进行分析、统计，也可以在线观察和分析。

4.兰光损伤模型

三个组的大鼠F_-ERG b波正常值测定后，除空白对照组不进行照光外，大鼠按给药组和模型组按号码顺次序各取2只共4只准备光照，光照前用缝線将大鼠吊起上眼睑，以保持打開眼睛接受光照。光照前后均进行暗适应。光照前先将大鼠放入暗室中适应4小时，然而放入蓝光损伤仪中接受光照。

蓝光损伤仪長1米，寬1米的籠子，高度為0.5米，使用玻璃板将4只大鼠分離，以免老鼠躲避照光。光损伤参数:蓝光波长450nm，强度850-1010VW/cm²。有5個藍色熒光燈設置在內表面上(除底部)籠中的溫度為24±2℃。光照箱顶部装有排风扇，保持通风。水和少量鼠食置于鼠笼侧面，可在光照箱内自由活动。

大鼠在蓝光损伤仪中，連續曝光12小時後，记录特殊反应,并立即將大鼠上眼睑縫合线剪去，再置於黑暗中12小時後送回动物饲养。

5.视网膜组织病理学检查

大鼠经光照后给药14天，或对照大鼠第一次F-ERG测定后第14天，均经最后一次F-ERG测定，用腹腔注射过量乌拉坦处死，取眼球做组织学分析。快速摘除眼球，于角膜12:00处缝线做标记，将手术剥离黄色的视网膜组织，经逐级酒精脱水、浸蜡包埋，制作0.1μm的視網膜切片，H-E染色，在光学显微镜下观察及拍攝照片，然而通过读片和对各组和各批的視網膜病理变化进行评价。

6.统计和分析

F-ERG的b波数据均采用同一大鼠作照光前和照光后自身对比，各组各批大鼠空白对照在不照光前后，或其余两组用照光前后测得的b波振幅值均用平均值(X)±标准差(SD)表示，并将各组同一批在照光前后所测得的b波振幅值的变化值按下述公式计算其抑制率，

抑制率(％)＝(照光前值-照光后值/照光前值)×100％

多组数据(各组、各批大鼠测定时间点比较)比较采用方差分析(ANOVA)，两组间比较采用t检验(T test)，以不同符号表示不同组或不同批间的比较如：^●，◇，*P>0.05为差异不显著，^{▲▲，◆◆，}**P＜0.05为差异显著^{▲▲▲，▲▲▲，●●●，}***P＜0.01为差异极显著。

7.结果和结论

7.1 1.2％葛根素凝胶滴眼液对抗兰光对大鼠闪光视网膜电图b波振幅的影响

表4，图2、3、4、5可见：

(1)光损伤溶剂组，光损伤给药组，和空白对照组左右眼的各正常b波振幅值之间无明显差异，*P>0.05。说明试验前所采集的各组，各批的b波振幅值是均衡的，符合试验要求的。

(2)光损伤溶剂组左右眼照光后7天和14天的b波的振幅抑制％率值和空白对照组左右眼未照光后7天和14天的波动值间之比，均^●●●P＜0.01，其差异是非常显著的,说明兰光致视网膜电图b波振幅损伤的模型是成功的。

在此基础上,本试验得出：(1)光损伤给药组鼠左眼照光后7天b波振幅抑制率36％、和光损伤溶剂组7天的为47％和57％，虽前者抑制率有下降,但两组间无明显差异，^◇P>0.05；光损伤给药组鼠右眼在照光后7天给药组b波振幅抑制率26％和光损伤溶剂组7天的47％和57％相比，其P值为p＝0.05,或^◆◆，P＜0.05，表示给药组b波振幅抑制率有下降，几近或已达到明显程度。但总的说来，葛根素干预7天尚不足以对抗所有鼠眼的光损伤。

(2)光损伤给药组鼠左右眼14天b波振幅抑制率28％、23％各分别和光损伤溶剂组鼠左右眼照光后14天的b波振幅抑制率60％、和64％之比，其P值均为^□□□P＜0.01，说明葛根素干预14天可明显对抗鼠左右眼的光损伤。

光损伤给药组鼠左右眼7天b波振幅抑制率36％、26％各分别和光损伤溶剂组鼠左右眼照光后14天的b波振幅抑制率60％、和64％之比，其P值分别为^▲▲P＜0.05，^▲▲▲P＜0.01说明葛根素干预7天即可明显对抗照光对鼠眼的持续损伤。

(3)光损伤给药组左右眼在照光后14天b波振幅抑制率28％、23％，此组鼠左右眼b波振幅抑制％率由7天的36％和26％降至28％和23％，说明葛根素干预天数的增加，光损伤趋势在逐减；而光损伤溶剂组鼠左右眼在照光后14天给药组b波振幅抑制率由7天的47％和57％，增至60％和64％，说明不用葛根素干预的空白组，光损伤趋势随着时间延长在逐增；说明随着葛根素滴药时间的延长，b波振幅抑制％率下降，而不用葛根素滴药随着时间的延长，b波振幅抑制％率有增加趋势，致使两组b波振幅抑制率差距进一步明显。

以上分析充分说明：光损伤溶剂组大鼠光照后1周视网膜电图F-ERG的b波振幅相对于空白对照组大鼠明显低小，说明光损伤模型是成功的，光照后继续给1.2％葛根素凝胶滴眼液一周已显示F-REG b波振幅较光损伤溶剂组大鼠明显增高，若光照后继续两周滴用葛根素凝胶眼药能更有效地对抗大鼠F-ERG中b波振幅的降低。说明1.2％葛根素凝胶滴眼液较长时间滴眼能明显加强对抗兰光对大鼠视网膜的损伤作用，有助于鼠眼对光损伤的恢复。

表4.葛根素凝胶滴眼液对大鼠视网膜蓝光损伤作用

7.2 1.2％葛根素凝胶滴眼液对抗兰光对大鼠视网膜组织病理的影响

人类视网膜厚约0.4μm,由色素上皮，视细胞，双极细胞，节细胞等主要成分组成。它们排列并相互连接，分布在视网膜不同层次，由内向外主要是节细胞层，内网层，内核层，外网层，外核层，视杆和视锥细胞层，色素上皮层。

大鼠视网膜组织因发生凋亡，致正常厚度变薄(正常厚度用“正”。变薄用“-”，程度用“-1,2,3，”表述。内网层和外网层多为神经纤维，正常用“+”，变薄用“-1,2,3，”表述纤维组织崩解。视网膜组织未见环死。也未见炎细胞。

空白对照组：各鼠视网膜切片均显示视网膜各层结构分层清晰，各层细胞排列整齐，细胞结构清楚细胞核密集呈圆形，内核层和外核层层次清楚，内核层细胞较疏松，核染色较淡；外核层细胞较密，核染色较深，核较细小呈园形。见图6和图7。

光损溶剂组：各鼠视网膜切片观察均有不同程度病理变化。可见视网膜内层细胞层神经节细胞明显减少，核层减少，核变小，核呈圆形。内核层和外核层均变薄(-2---3)，内网层和外网层变薄(-1－-2),排列稀疏，内层神经节细胞层呈单层,分散排列,层间分界不清楚，视网膜外充血,出血。较稀疏，部份剥脱。见图8和图9。

光损给药组：未见视网膜明显损伤，各鼠视网膜厚度观察和空白组大鼠的相仿视网膜各层次结构较完整，分层及排列也较清晰，内层细胞层神经节细胞细胞结构清楚，内层核和外核层层次清楚，细胞核呈圆形，内核层细胞较疏松，核染色较淡；外核层细胞较密，核染色较深，核较细小呈圆形。见图10和图11.

由三组各鼠视网膜切片观察进一步佐证：1.2％葛根素凝胶滴眼液对抗兰光对大鼠视网膜组病理的影响。提示葛根素凝胶滴眼液新剂型葛根素滴眼对光损伤大鼠视网膜形态具有保护作用。

本研究结果表明：1.2％葛根素凝胶滴眼液这种新剂型，克服了现有技术的不足，它在眼底所达到的的葛根素浓度能有效保护光损伤造成的视网膜功能下降，同时保存视网膜细胞的形态，延缓病变的进展，达到能治疗黄斑变性疾病的目的，为临床治疗视网膜变性类疾病提供了客观依据，显示了传统中药葛根素在治疗这类疾病具有较好的前景，故1.2％葛根素凝胶滴眼液这种新剂型，对预防和治疗视网膜变性类疾病，具有临床治疗意义。

Claims

1.葛根素凝胶滴眼液在制备治疗黄斑变性疾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄斑变性疾病为年龄相关性黄斑变性疾病。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中葛根素的质量百分含量为1.2％。