CN104688672B - 葛根素凝胶滴眼液在制备治疗眼底缺血性疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

一种葛根素凝胶滴眼液在制备治疗眼底缺血性疾病药物中的应用，该滴眼液由葛根素、EDTA、焦亚硫酸钠、冰片、苯扎溴铵、泊洛纱姆407、透明质酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸和注射用水制成，用HPLC‑UV法，经家兔眼内药物代谢动力学证明：1.2%葛根素凝胶滴眼液在视网膜，脉络膜内的吸收量分别大于葛根素普通滴眼液的70%和62%;按房水，玻璃体比重折算，眼内葛根素含量脉络膜>视网膜>房水>玻璃体，揭示葛根素在眼底吸收能进入眼底达到足够含量。经观察1.2%葛根素凝胶滴眼液在兔视网膜，脉络膜上1‑6小时葛根素时量曲线各时间点上的药物平均含量（ng/g）均不低于视网膜血流动力学测定时的家兔有效地引起眼底血流速度增强时所测到的含量（ng/g）；从而证实葛根素凝胶滴眼液可作为静注葛根素治疗眼底缺血性疾病。

Description

葛根素凝胶滴眼液在制备治疗眼底缺血性疾病药物中的应用

一.技术领域：

本发明涉及中医学技术领越，具体地说是涉及葛根素凝胶滴眼液在制备治疗眼底缺血性疾病药物中的应用。

二.背景技术:

葛根为豆科多年生落叶藤本植物葛的根，归脾、胃经，具有升阳、活血、通络的作用。《本草纲目》记载，葛根味甘辛，性平，无毒，具有解诸毒、开腠理等作用。葛根素是从葛根中提取出来的有效成分之一，它是一种异黄酮类化合物，英文名为puerarin，PUE，故又名普乐林。葛根素(Puerarin)为豆科植物野葛Puera.ria lobata(Wi1ld.)Ohwi的干燥根中提取，化学名：8-β-D-葡萄吡喃糖-4＇，7-二羟基异黄酮,分子式：C21H20O9，分子量：416.38，分子化学结构式如下：

药理和临床研究证明葛根素具有扩张冠状血管、降低外周血管阻力、降血压、降血糖、β-受体阻滞等作用，因其疗效好，副反应少，广泛用于治疗多种内科疾病，据文献报道葛根素注射液现在也被用于治疗多种眼科疾病，如青光眼、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、视网膜缺血性病变、糖尿病性视网膜病变等，具有较好的治疗效果。(张莉丽等中国中医眼科杂志2011；(21)2：122-124)

近年来，葛根的研究与开发逐渐受到关注，其药理作用和作用机制日益成为人们研究的热点。

葛根素治疗视网膜动、静脉阻塞的药理机制概括为以下几方面：

1扩张血管，改善微循环

在眼部缺血早期解除血管痉挛，葛根素具有扩张血管，改善微循环作用，可促进血液回流，减少静脉内淤血，亦可使毛细血管扩张，改善微循环中的氧浓度，减少酸性代谢产物的生成，稳定缺血区的血管活性物质，使它保持在正常范围，有利于解除缺血导致的血管痉挛，恢复正常血管舒缩功能，促进侧支循环的建立，通过改善血流来缓解视神经缺血的状况，营养末梢神经。程凯尧、蔡敏敏等〔中华医药杂志2003；(21)1:106〕对葛根素治疗视网膜中央静脉阻塞前后彩色多普勒超声成像技术进行的检测结果进行了报道，显示视网膜中央静脉阻塞患者的收缩期峰值血流速度(PSV)和视网膜中央静脉血流速度(CRV)均明显低于正常对照组，而应用葛根素注射液治疗后，PSV和CRV则明显高于治疗前，说明葛根素对视网膜中央动静脉血流速度和血液流变学均有积极的影响。杜红艳〔临状眼科杂志2003；11(1)；77-78〕对葛根素治疗缺血性视神经病变的疗效进行了临床观察，结果显示应用葛根素后视网膜中央静脉血流速度和视网膜中央动脉平均收缩期峰值血流速度均显著提高。刘爱琴等〔眼科新进展2008；28(7):547-549)〕利用彩色多普勒血流显像技术对葛根素在缺血性视神经病变中对血流的影响进行了分析，结果显示，葛根素治疗组的有效率明显高于对照组，治疗组睫状后短动脉的收缩期峰值速度和舒张末期速度、视网膜中央动脉的收缩期峰值速度和舒张末期速度明显增加。

2改善红细胞的变形性和聚集性

姜万嵩等〔华北国防医药；2006；18(1)：16-18)〕在葛根素对人红细胞变形性和聚集性的作用方面进行了研究，将健康献血者血液抗凝后分别用生理盐水和葛根素稀释到一定浓度，用红细胞变形聚集仪测量生理盐水组和葛根素组红细胞的变形性和聚集性，结果显示，葛根素组能降低红细胞的聚集性，同时也降低了红细胞的变形性。红细胞正常的变形能力对保障血液的流动性、红细胞寿命和保证微循环有效灌注起着重要的作用，正常值参考值为0.47～0.55，过高和过低均可引起微循环障碍。一般在血瘀型疾病中，红细胞的变形性会升高，在通过狭小的管腔时容易被挤破，从而发生红细胞破裂。聚集性是红细胞的主要流变学特性之一，增强抗凝和纤溶活性使患者血液的高凝状态得到缓解，对纤溶酶的流动活性有一定的促进作用。

3降低血浆黏度，减少血小板聚集，抑制血栓形成

潘洪平等〔中医中药杂症2003；28(12)1178-1180〕对葛根素注射液在急性血瘀大鼠模型中，对血液流变性的作用进行了研究，结果显示，急性血瘀模型大鼠的全血黏度、血浆黏度均明显升高，血液屈服应力明显增大，模型组红细胞变形指数为0.95±0.10，应用葛根素注射液高、低剂量组均可明显降低急性血瘀大鼠的全血黏度，减小血液屈服应力，降低血小板最大聚集率，高剂量组还可明显降低红细胞聚集指数和红细胞变形指数(0.80±0.12)。

4葛根素治疗糖尿病性视网膜病变的药理机制

葛根素在糖尿病性视网膜病变中的应用，作用机制与葛根素用于视网膜动静脉阻塞的机制相似，主要为促进微循环，改善血液流变学指标；降低血浆黏度，减少血小板聚集，抑制血栓形成。梁庆丰等〔山西医药杂志2001；30(5):396-397〕对使用葛根素治疗的36例糖尿病性视网膜病变患者进行血液流变学指标测定，发现经葛根素治疗后糖尿病性视网膜病变患者的血细胞压积、血浆黏度下降，全血黏度、红细胞刚性、黏附前后血小板数、总胆固醇和甘油三酯均明显下降。宋艳敏等〔陕西中医2006；27(4)472-474〕对照观察了葛根素眼周穴位注射治疗2型糖尿病性视网膜病变的效果，结果该治疗在改善中心视力和视网膜光敏感度、促进视网膜出血渗出吸收、视网膜无灌注区缩小及黄斑水肿消退方面均优于采用维生素B12、胞二磷胆碱注射液交替使用的对照组。但是上述疗效都源出于葛根素注射液。对葛根素凝胶滴眼液治疗眼底缺血性病变至今尚无人报道；

目前临床上治疗眼病应用葛根素滴眼液已取得新药证书(国药证字[X20000247])和生产批文(国药准字[X2000331])的葛根素滴眼液，商品名“达靓”用于治青光眼；

一般认为滴眼液的疗效仅局限于眼前部疾病，认为其局部用药，所达眼底部位药物浓度甚少；通常眼后部的疾病需要反复静脉注或直接眼玻璃腔内注射，另一方面葛根素注射液会带来诸多风险。由于葛根素注射液至今难以避免的严重不良反应和玻璃腔内反复注射给眼带来的伤害，给葛根素在眼底疾病的治疗应用上带来了困惑；但相对地讲，眼部给药比全身给药进入眼内达到靶区更具优势与可行性。因此，研制能穿透进眼底部较多的新的葛根素滴眼液在临床治疗学上是一个十分需要解决的问题。

三.发明内容

1.发明目的:本发明目的在于提供葛根素的新制剂及其新用途,具体地说是葛根素凝胶滴眼液在制备治疗眼底缺血性疾病药物中的应用，

实现本发明应考虑以下的技术问题：

(1)开发理想的眼部给药及其新剂型，通过以葛根素为模型药物改善药物的生物药剂学特性和使药物按预想的途径更多地进入眼底。通常认为滴眼剂由于角膜，结膜和晶状体的屏障作用，药物难以到达眼后部，事实上，甚少研究不同理化性质的药物在眼前，眼后部的浓度的分布，现在，解决中药在眼部的停留时间及提供入眼内方式，已具可操作性，经初步分析综合考虑拟选用葛根素凝胶给药系统。这里着重研究温度敏感型原位凝胶。温度敏感型原位凝胶是指聚合物溶液在室温或冷藏条件下为流动性液体,温度升至体温环境即转变为凝胶。新型眼用原位凝胶是以滴眼液形式滴入眼部后，在眼部生理环境作用下，药物在给药部位发生相转化成凝胶，能够显著的增加药物与角膜的接触时间，或其他眼内途径以提高眼后部生物利用度。制成葛根素原位凝胶新剂型，其中常见的温度敏感型眼用即型凝胶最常用的基质是泊洛沙姆,泊洛沙姆是一类由聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚而得的非离子表面活性剂.是研究最深入的制备热敏型原位凝胶的高分子辅料,也是本文中应用的原位凝胶聚合物材料,常见型号有泊洛沙姆407、泊洛沙姆188。泊洛沙姆407具有高的安全性,毒性低,无刺激过敏性,有良好的生物相容性，有较强缓控释能力，用它制成的眼用凝胶,提高了药物的理化稳定性和生物利用度。由于葛根素在水中的溶解度较小，配制葛根素眼用制剂，尚需加入增溶、助溶等辅料。

(2)要制成能达到稳定性至少维持两年的葛根素凝胶滴眼液并能应用于眼底缺血性疾病中的新应用本技术方案分四步走:

1)首先要能达到稳定性至少维持两年的葛根素普通滴眼液，为此要解决生产过程中遇到的因各种原因引起氧化所致pH的不断下降，色泽变黄等问题；

2)在上述基础上研制稳定性至少维持两年葛根素凝胶滴眼液；

3)葛根素滴眼液的凝胶剂和其普通剂在家兔脉络膜和视网膜上含量的比较。证明前者的生物利用度高于后者；

4)葛根素滴眼液的凝胶剂用彩色多普勒血流显像技术对家兔血流的影响进行了分析。证明葛根素滴眼液的凝胶剂用于治疗眼底缺血性疾病中应用的可能性。

2.技术方案：解决葛根素普通滴眼液因各种原因引起氧化致pH的不断下降，色泽变黄等问题。能达到稳定性至少维持两年的葛根素滴眼液，在此基础上，开发眼部给药的新剂型，通过以葛根素为模型药物改善药物的生物药剂学特性和使药物按预想的途径更准确地进入眼底。

(1)葛根素凝胶滴眼液的制备方法

处方

制备工艺

(1)1.用新鲜沸腾后的注射用水1000g，冷却至室温；

2.按处方量称取柠檬酸钠，柠檬酸，加入上述注射用水于配料锅中，得pH为6.1-6.4.为1液；

3.另用配料锅取1液700g加入处方量泊洛沙姆407，泊洛沙姆188，搅拌使其溶解，分散，静置2小时-3小时后得到澄清溶液，为2液；

4.在2液中，按处方量，加入乙二胺四乙酸钠，焦亚硫酸钠，苯扎氯铵，冰片，为3液；

5.按处方量加入葛根素逐加逐搅拌到3液中，超声搅拌使其充分溶解后成澄清溶液，得4液，再定容至1000g，充分搅拌均匀，得pH为5.8--6.2,测定含量后，用0.45μm的水系滤膜过滤后灌装.冷藏保存。

(2)

1.取配料锅一个，称取处方量泊洛沙姆407,放入121℃烘箱中消毒，125分钟后取出密封；

2.用新鲜沸腾后的注射用水1000g，冷却至室温；

3.另取配料锅一个，处方量称取柠檬酸钠，柠檬酸，加入上述注射用水700g，得pH为6.1--6.4.为1液；

4.称取处方量玻璃酸钠,乙二胺四乙酸钠，焦亚硫酸钠，苯扎溴铵，冰片，加入1液中，搅拌溶解，为2液；

5.将2液加热至65-75℃，立即加入已称取处方量的葛根素，充分搅拌使其分散溶解后成澄清溶液，称3液；

6.趁热将3液经0.22μm的水系滤膜过滤后，立即将3液倒入已消毒泊洛沙姆407的配料锅中，搅拌混匀成澄清溶液后，定容至1000g，充分搅拌均匀，称4液；

7.将4液在4℃冰箱静置2小时，pH为5.8--6.2，测定渗透压及含量后灌装，冷藏保存。

4.有益效果：

(1).经1.2％葛根素凝胶滴眼液处方组成和制备了一种稳定的新型的滴眼液，药动学证明，

1.2％葛根素凝胶滴眼液在视网膜，脉络膜内的吸收量分别大于葛根素普通滴眼液的70％和62％；又经药效学-彩色多普勒血流显像技术证明:除对照组外，1.2％葛根素凝胶滴眼液对眼动脉(OA)和视网膜中央动脉(CRA)的收缩期血流速度(peak systolicvelocity,Vs)、舒张期血流速度(end dias-tolic velocity,Vd)均有显著增加；血管阻抗指数(resistanceindex,RI)均有降低。其血流增强至少不差于静注组,也就是说两种给药途径要取得相近的眼底流速(-x±s)cm·s^-1上升百分率的药效,滴眼掖有可能只需要静注剂量的1/20即可；结合药代动力学-药效动力学初步分析,1.2％葛根素凝胶滴眼液在在兔视网膜，脉络膜上1-6小时葛根素时量曲线各时间点上的药物平均含量(ng/g)均不低于视网膜血流动力学测定时的家兔有效含量(ng/g)；

(2).证实葛根素凝胶滴眼液可作为静注葛根素治疗眼底缺血性疾病的另一种有效选择，因为可以不仅减少大剂量静注葛根素带来的全身的不良反应，而且给药方便；

(3).揭示葛根素在眼底通过其化学结构有关的吸收途径及与其成为凝胶的特殊剂型后使其能进入眼底达到足够含量导致视网膜血流的动力学增强，此点对研究不同化学结构的化合物在眼内的不同分布极有价值。

四.附图说明：

图1.葛根素普通滴眼液一次给药后在兔视网膜，脉络膜，房水及玻璃体上葛根素时量曲线的比较；

时量曲线上各时间的对应含量值为12只家兔的平均值；

附图标记：1.视网膜---●---,脉络膜-----■----,房水---◆--,玻璃体----▲----

图2.葛根素凝胶滴眼液一次给药后在兔视网膜，脉络膜，房水及玻璃体上葛根素时量曲线的比较；

时量曲线上各时间的对应含量值为12只家兔的平均值；

附图标记：1.视网膜---●---,脉络膜-----■----,房水---◆--,玻璃体----▲----.

图3.葛根素凝胶滴眼液和普通剂一次给药后在兔脉络膜上葛根素时量曲线的比较；时量曲线上各时间的对应含量值为12只家兔的平均值；

附图标记：1.2％葛根素普通滴眼液---◆--,1.2％葛根素凝胶滴眼液----▲

图4.葛根素凝胶滴眼液和普通剂一次给药后在兔视网膜上葛根素时量曲线的比较；时量曲线上各时间的对应含量值为12只家兔的平均值；

附图标记：葛根素普通滴眼液---◆--,葛根素凝胶滴眼液----▲----.

图5.葛根素凝胶滴眼液对兔CRA-Vs血流动力学影响；

各组的第1柱为给药前的对照值，第2柱静注组为给药后10分钟值，余两组为给药后1小时的值，第3柱为给药后2小时的值.静注组作用已不明显；

图6葛根素凝胶滴眼液对兔CRA-Vd血流动力学影响；

各组的第1柱为给药前的对照值，第2柱静注组为给药后10分钟值，余两组为给药后1小时的值,第3柱为给药后2小时的值；

图7.葛根素凝胶滴眼液对兔OA-Vs血流动力学影响；

各组的第1柱为给药前的对照值，第2柱静注组为给药后10分钟的值，余两组为给药后1小时的值，第3柱为给药后2小时的值；

图8.葛根素凝胶滴眼液对兔OA-Vd血流动力学影响；

各组的第1柱为给药前的对照值，第2柱静注组为给药后10分钟值，余两组为给药后1小时值,第3柱为给药后2小时值；

五.具体实施方式：

实施例1.葛根素凝胶滴眼液的制备

处方：

制法:

1.取配料锅一个，称取处方量凝胶剂泊洛纱姆407，放入100℃烘箱中消毒，5分钟后取出密封；

2.用新鲜沸腾后的注射用水1000g，冷却至室温；

3.另取配料锅一个，处方量称取缓冲对柠檬酸钠柠檬酸，加入上述700g注射用水，得pH为6.1--6.3.的溶液为1液；

4.称取处方量玻璃酸钠,乙二胺四乙酸钠，焦亚硫酸钠，苯扎溴铵，冰片等逐一加入1液中，相继搅拌溶解，为2液.；

5.将2液加热至70-75℃，立即加入已称取处方量的葛根素，充分搅拌使其分散溶解后成澄清溶液，称3液；

6.趁热将3液经0.22μm的水系滤膜过滤后，立即将3液倒入已消毒泊洛沙姆的配料锅中，搅拌混匀成澄清溶液后，定容至1000g，充分搅拌均匀，称4液；

7.将4液在4℃冰箱中静置2小时，pH为5.8--6.2，测定渗透压及含量后灌装,4℃保存。

实施例2.葛根素凝胶滴眼液的制备

处方：

制备工艺

1.用新鲜沸腾后的注射用水1000g，冷却至室温；

2.按处方量称取柠檬酸钠，柠檬酸，加入上述注射用水于配料锅中，得pH为6.1-6.4，为1液；

3.另用配料锅取1液700g加入处方量泊洛沙姆407,泊洛沙姆188，搅拌使其溶解，分散，静置2小时-3小时后得到澄清溶液，为2液；

4.在2液中，按处方量，加入乙二胺四乙酸钠，焦亚硫酸钠，苯扎氯铵，冰片，为3液；

5.按处方量加入葛根素逐加逐搅拌到3液中，超声搅拌使其充分溶解后成澄清溶液，得4液，再定容至1000g，充分搅拌均匀，得pH为5.8--6.2,测定含量后，用0.45μm的水系滤膜过滤后灌装.冷藏保存。

实施例3.葛根素凝胶滴眼液的制备：

处方：

实施例4.药代动力学试验

目的：用HPLC-UV法达到常规测定葛根素凝胶滴眼液和其普通剂在家兔脉络膜和视网膜上的含量，能满足眼球各组织测定葛根素含量需要。

(1).方法学建立

1.测定条件

1.1仪器日本岛津LC-10A HPLC仪，SPD-10Avp紫外检测器，1N-180柱温箱，Mettmer高精微量分析天平，岛津色谱工作站(LC solution V1.x)；

1.2药品，葛根素对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号0752-9806).葛根素购自四川省玉鑫药业有限公司

1.3色谱条件色谱柱：迪马C18(250×4.6mm，￠5μm)，柱温30℃，紫外波长250nm，流动相：乙腈：0.05％甲酸溶液(15：85)，流速0.8ml/min，进样40μl；

1.4受试兔健康的新西兰白兔20只，雄性，体重2-3.0kg，由本校动物中心提供，合格证号：家兔许可证号:SCKX(苏)2012-0008，合格证号：0021795；

2.测定方法。

2.1样品采集:家兔饲养观察一周后，分别经可卡因局麻眼后取房水，然后处死家兔，取角膜，晶体，虹膜、睫状肌，玻璃体，视网膜，脉洛膜等眼组织.样本置-40℃条件下保存待测；

2.2样品处理与测定

(1)取房水180μl,加入4mol/L的高氯酸20μl，混漩0.5min，高速离心(12600r/min)15min，取上清液40μl注入液相色谱仪,外标法峰面积定量测定；

(2)取视网膜称重后，加4倍量的0.9％生理盐水浸泡一夜，第二天加等量的0.8mol/L的高氯酸超声匀浆，混漩0.5min，高速离心(12600r/min)15min，取上清液40μl注入液相色谱仪,外标法峰面积定量测定；

(3)取脉洛膜称重后，加4倍量的生理盐水浸泡一夜，第二天加等量的0.8mol/L的高氯酸超声匀浆，混漩0.5min，高速离心(12600r/min)15min，取上清液40μl注入液相色谱仪,外标法峰面积定量测定；

(4)取虹膜称重后，加4倍量的0.9％生理盐水浸泡一夜，第二天加等量的0.8mol/L的高氯酸超声匀浆，混漩0.5min，高速离心(12600r/min)15min，取上清液40μl注入液相色谱仪,外标法峰面积定量测定；

结果：

3.1房水标准曲线的制备

取兔正常空白房水(经0.4mol/L的高氯酸处理后的)，加入葛根素对照溶液，混漩1min，得浓度为0.535(ug/ml)，使模拟成房水浓度.然后依次稀释为0.535，0.268，0.134，0.067，0.0335，0。0167(ug/ml)；以葛根素的平均峰面积为纵坐标，以葛根素的浓度(ug/ml)为横坐标得标准曲线的回归方程：见表1

表1.房水标曲测定结果

3.2视网膜标准曲线的制备

取兔正常视网膜精密称取，加入葛根素对照溶液，及4倍量0.9％生理盐水，混漩1min，浸泡一夜，第二天加4倍量0.8mol/L的高氯酸超声匀浆，混漩0.5min，高速离心(12600r/min)15min，取上清液，得0.104(ug/ml)的溶液，使模拟成视网膜浓度.然后依次稀释为0.104，0.052，0.026，0.0130，0065(ug/ml)；以葛根素的平均峰面积为纵坐标，以葛根素的浓度(ug/ml)为横坐标得标准曲线的回归方程：见表2

表2视网膜标曲测定结果

3.3脉络膜标准曲线的制备

取兔正常脉络膜精密称取，加入葛根素对照溶液，及4倍量0.9％生理盐水，混漩1min，浸泡一夜，第二天加4倍量0.8mol/L的高氯酸超声匀浆，混漩0.5min，高速离心(12600r/min)15min，取上清液，得0.119(ug/ml)的溶液，使模拟成脉络膜浓度.然后依次稀释为0.119，0.0595，0.02975，0.01488，0.00744(ug/ml)。以葛根素的平均峰面积为纵坐标，以葛根素的浓度(ug/ml)为横坐标得标准曲线的回归方程：见表3

表3脉络膜标曲测定结果

3.4玻璃体标准曲线的制备

取兔正常虹膜精密称取，加入葛根素对照溶液，及4倍量0.9％生理盐水，混漩1min，浸泡一夜，第二天加4倍量0.8mol/L的高氯酸超声匀浆，混漩0.5min，高速离心(12600r/min)15min，取上清液，得0.1075(ug/ml)的溶液，使模拟成玻璃体浓度.然后依次稀释为0.1075，0.05376，0.02688，0.01344，0.00672(ug/ml)。以葛根素的平均峰面积为纵坐标，以葛根素的浓度(ug/ml)为横坐标得标准曲线的回归方程：见表4

表4玻璃体标曲测定结果

3.5讨论：上述HPLC方法学试验说明鉴于此方法学灵敏，检测限可达10ng/ml，峰形完整，标准曲线稳定，能满足眼球各组织测定葛根素含量需要；

(2).葛根素凝胶滴眼液和其普通剂在家兔脉络膜和视网膜上含量的比较

目的：通过葛根素凝胶滴眼液和其普通剂在家兔脉络膜和视网膜上含量的比较，证实葛根素凝胶滴眼液高于葛根素普通滴眼液。

1.仪器，药品，色谱条件，测定方法见上述方法学.1.2％葛根素普通滴眼液按市售1％葛根素滴眼液处方配置；

2.动物健康的新西兰白兔120只，雄性，体重2-3.0kg，由本校动物中心提供，SCKX(苏)2012-0008，合格证号：0021795，饲养观察一周后，平均分为2组，1.2％葛根素凝胶滴眼液组和1.2％葛根素普通滴眼液组；

3.试验方法

每兔滴眼药一次，1滴，估计剂量均为600μg，于滴药后0.5，1.0，2.0，3.0，6.0，每个时间点用兔12只，分别经眼可卡因局麻后取房水，然后处死家兔，取角膜，晶体，虹膜、睫状肌，玻璃体，视网膜，脉洛膜置-40℃条件下保存待测；

4.分析和统计：待测样品用上述方法学测定，每次测定样品作随行标准曲线，得回归方程，用外标法峰面积定量测定。将测得各组织的平均含量制作1-6h时量曲线，将每条1-6h时量曲线上每时间点各兔实测值的平均值用药动学和药效学结合模型软件包(简称CAPP软件包)非房室模型估算其时量曲线下面积，即AUC 0-6,用ng/g/h.ng/ml/h,代表眼部各组织的吸收量；

5.结果和讨论：结果见图1,2,3,4,及表5。

表5.1.2％葛根素滴眼液的凝胶剂及普通剂一次各滴入600μg后在眼内各组织的吸收比较

注：*玻璃体的比重为1.007房水的比重为1.006

本实验用120只新西兰兔，用葛根素两种滴眼液，即1.2％葛根素凝胶滴眼液和1.2％葛根素普通滴眼液，两者经滴兔眼后，眼球各组织经分离提取，用HPLC-UC法测定葛根素的含量，用曲线上各时间的平均含量，制作眼内各组织葛根素1-6小时的药时曲线，根据其各曲线各时间的实测平均值，绘制曲线下面积，从而对两种剂型葛根素滴眼液在眼各组织中葛根素的含量作比较；

1.图1,2证明；1.2％葛根素凝胶制剂滴眼液或1.2％葛根素普通制剂滴眼后，结果相仿，即葛根素平均含量脉络膜>视网膜,房水>玻璃体,由于玻璃体的比重为1.007,房水的比重为1.006,可视为脉络膜>视网膜(除0.5h)>房水>玻璃体；

2.图3,4证明：1.2％葛根素凝胶滴眼液或1.2％葛根素普通滴眼液的脉络膜和视网膜的药时曲线，两者形状不同，前者达峰时间延迟，下降速度较缓，示有缓释作用外,各时间点(除0.5h外)的平均值含量均高于后者；

3.表5.证明：通过CAPP软件包示非房室模型拟合估算1.2％葛根素凝胶滴眼液或1.2％葛根素普通滴眼液用药后，将两种滴眼剂各组织的时量曲线下面积进行比较说明了在脉络膜，1.2％葛根素凝胶滴眼液中葛根素的吸收面积要高出葛根素普通滴眼液60％；在视网膜，1.2％葛根素凝胶滴眼液要高出葛根素滴眼液普通剂70％。两种制剂葛根素在房水和玻璃体的吸收面积不仅均低于脉络膜和视网膜，而且两种制剂吸收面积未见明显差别。

以上说明，1.2％葛根素凝胶滴眼液这种新剂型，能改善药物的生物药剂学特性，使1.2％葛根素凝胶滴眼液在眼底的含量高于1.2％葛根素普通滴眼液，这样使葛根素更准确地进入眼底。传统的观点认为滴眼剂由于角膜，结膜和晶状体的屏障作用，药物难以到达眼后部，事实上，在目前尚甚少研究不同理化性质的药物在眼前,眼后部的浓度的分布及其规律，本研究通过滴眼液对房水，玻璃体，视网膜，脉洛膜含量测定，证明：

(1).1.2％葛根素凝胶滴眼液和1.2％葛根素普通滴眼液在眼底可达到高于房水和玻璃体的浓度揭示了葛根素在眼部的吸收不单是通过角膜，也可能通过其它如巩膜等途径。

(2).1.2％葛根素凝胶滴眼液在视网膜，脉洛膜的含量高于1.2％葛根素普通滴眼液60％-70％，说明1.2％葛根素凝胶滴眼液用于治疗眼底缺血性疾病比1.2％葛根素普通滴眼液更有基础。

实施例5.药理试验

目的：通过用1.2％葛根素凝胶滴眼液的血流动力学测定以证明葛根素凝胶滴眼液可用于治疗人眼底缺血性疾病。

1材料和方法

1.1动物及药品:

健康成年灰兔20只,雌雄不拘,体重2～3kg。实验前检查双眼眼前节及眼底均无异常,每日固定饲料喂养,随机分为3组。检测家兔视网膜血流的动力学用意大利公司生产的mylabfive型彩色多普勒血流仪。1.2％葛根素对照凝胶滴眼液按1.2％葛根素凝胶滴眼液处方配置,但不加葛根素；

1.2方法

取10只家兔按随机分组法分为空白组2只(4眼)，给不含葛根素的凝胶滴眼液1滴,给药组6只(12眼)给1.2％葛根素滴眼液的凝胶剂一次1滴，含葛根素600μg.

静注组2只(4眼),用市售1％葛根素滴眼液1.2Lml(12mg)用生理盐水稀释至5ml,于5min内经兔耳静脉匀速注入。按体表面积折算相当于人用量静注103mg。

2.检测

各兔先后用25％乌拉坦2ml/kg体重进行静脉麻醉。各兔麻醉后，剪去双眼周围兔毛,先测定各兔视网膜血流的正常值。空白组及给药组各兔于滴眼后60,120分,静注组于给药结束后5分时测定视网膜血流；

测定时，固定头部，轻置探头于眼脸外作眼球纵切和横切,显示视神经后,取样范围置于视神经中靠球后壁外缘处,微调探头可得CRA血流频谱。将取样范围移至球后2cm左右、视神经的上下,可得到眼动脉的血流频谱，测眼部血管血流.探头转换器频率为线阵4-13MHz,探查深度4cm左右,取样容积1.5mm3,检测项目有眼动脉(OA)和视网膜中央动脉(CRA)收缩期血流速度(peak systolic velocity,Vs)、舒张期血流速度(end dias-tolicvelocity,Vd)和血管阻抗指数(resistance index,RI)等。在至少3个形态一致的多普勒频谱上分别计算上述各参数值。血流检测由一人完成。于实验结束，滴眼后2.5-3.5小时内取房水后，摘除眼球后分离视网膜和脉络膜后用实施例2法测定葛根素含量；

3统计方法：将各兔测得的给药前后的实验值统计学处理采用t检验；

4.结果

见表6，7，8。图1，2，3,4。

表6葛根素凝胶滴眼液1200ng对6只兔双眼OA及CRA血流动力学测定结果(-x±s)cm·s-1

注：1.剂量：给药组：葛根素凝胶滴眼液600μg，静注组：市售葛根素滴眼液12mg

2.各组给药前后对照：*p＜0.05，**p＜0.01，***P＜0.001

表7.葛根素凝胶滴眼液和静注葛根素12mg对兔OA及CRA血流上升％率比较

注：1.剂量：葛根素凝胶滴眼液600μg，静注葛根素12mg.

3.-号示下降％率.

表8用家兔葛根素凝胶滴眼液,葛根素静注后在视网膜，脉络膜内葛根素的含量

注：1.剂量：葛根素凝胶滴眼液600μg，静注葛根素12mg.

5.讨论：

1.本实验用葛根素凝胶滴眼液后1，2小时，静注葛根素12mg后10分钟测定视网膜血流动力学，将测定值经作自身前后对照，由图1，2，3，4,及表6证明：除对照组外，眼动脉(OA)和视网膜中央动脉(CRA)的收缩期血流速度(peak systolic velocity,Vs)、舒张期血流速度(end dias-tolic velocity,Vd)均有显著增加；血管阻抗指数(resistance index,RI)均有降低。其血流增强程度尤以葛根素凝胶滴眼液较静注组为甚，相反，对照组各指标有随实验时间延长呈微下降趋势；

2.表7将静注组和滴眼液组，对照三组测得的OA，CRA的Vs，Vd，RI各值作了给药前后上升变化百分率的比较，证明：葛根素凝胶滴眼液给药后1-2小时内上升百分率其OA，CRA的Vs分别为，32.61-45.22,其OA，CRA的Vd分别40.09-55.74,RI也均有下降；静注用药后10分OA，CRA的Vs分别为31.37-14.61％,其OA，CRA的Vd分别为40.15-22.16。说明葛根素凝胶滴眼液600的μg药物疗效并不差于静注葛根素12mg的疗效,也就是意味着两种给药途径要取得相近的眼底流速(-x±s)cm·s^-1上升百分率的药效,滴眼液有可能只需要静注剂量的1/20即可。两种给药途经均对OA和CRA的Vd血流增强影响要比对Vs大；

两者在发挥疗效时视网膜，脉络膜内的含量，静注葛根素在用药后10-20分取样,平均值为138.3,2420.3ng/g用葛根素凝胶滴眼液600μg在用药后2.5-3.5小时,平均值为61.71,222.07,参考正常兔给凝胶剂后视网膜，脉络膜内葛根素的含量平均值为342.02,1009.56.从此表含量中,虽尚不足以估算正确的有效剂量范围,但可以看出葛根素3表3通过葛根素凝胶滴眼液的药物动力学测定和眼底的眼动脉(OA)和视网膜中央动脉(CRA)的收缩期血流速度(peak systolic velocity,Vs)、舒张期血流速度(end dias-tolicvelocity,Vd)及其血管阻抗指数(resistance index,RI)的测定,并经量效关系的初步分析:静注后视网膜中央动脉流速的上升百分率比滴眼液要底，这可能与葛根素在视网膜内含量较底有关，因为表8示其含量平均值ng/g，静注10分钟是138.3，而滴眼液1-2小时是342。02-189。42。而静注后眼动脉流速的上升百分率与滴眼液相近，而其含量平均值ng/g，静注10分钟与滴眼液1-2小时，前者远高于后者，见表8。这一现象尚待说明。此外，视网膜血流动力学测定兔的12眼在给药后2.5-3.5小时间视网膜，脉络膜内葛根素的含量平均值ng/g分别为61.71和222.07,虽然未能全部测定给药后2.5-3.5小时内眼底血流速度,从整体分析,要增加眼底视网膜，脉络膜血流速度,葛根素的含量平均值应高于61.71和222.07。从1.2％葛根素滴眼液的凝胶剂和普通剂一次给药后在兔视网膜，脉络膜上1-6小时葛根素时量曲线的比较中看出凝胶剂的葛根素含量各时间点平均值(ng/g)不仅高于普通剂，在视网膜，脉络膜内的总吸收量分别大于葛根素普通滴眼液的,70％，62％.且高于61.71和222.07ng/g增强血流速度有效含量范围内。说明葛根素在眼底通过其化学结构有关的途径及与其成为凝胶的特殊剂型后使其能进入眼底达到足够含量导致视网膜血流的动力学增强.这样可以认为用葛根素凝胶滴眼液可作为静注葛根素治疗眼底缺血性疾病的另一种有效选择。

Claims (2)

1.一种葛根素凝胶滴眼液，其特征在于，处方为葛根素12-15g、乙二胺四乙酸钠0.05-2.0g、焦亚硫酸钠0.5-1.0g、冰片0.5-1.0g、苯扎溴铵1-2mL、泊洛沙姆407 180-250g、玻璃酸钠0.3-0.5g、柠檬酸钠3-30g、柠檬酸0.4-2.0g、加水至1000g；所述滴眼液由以下工艺制得：

取配料锅一个，称取处方量泊洛沙姆407，放100℃烘箱中消毒，5分钟后取出密封；

用新鲜沸腾后的注射用水1000 g，冷却至室温；

另取配料锅一个，处方量称取柠檬酸钠，柠檬酸，加入上述注射用水700g，得pH为6.1-6.4. 为1液；

称取处方量玻璃酸钠，乙二胺四乙酸钠，焦亚硫酸钠，苯扎溴铵，冰片，加入1液中，搅拌溶解，为2液；

将2液加热至65-75℃，立即加入已称取处方量的葛根素，充分搅拌使其分散溶解后成澄清溶液，称3液；

趁热将3液经0.22μm的水系滤膜过滤后，立即将3液倒入已消毒泊洛沙姆407的配料锅中，搅拌混匀成澄清溶液后，定容至1000g，充分搅拌均匀，称4液；

将4液在4°C冰箱静置2小时，pH为5.8-6.2，测定渗透压及含量后灌装，冷藏保存。

2.权利要求1所述的葛根素凝胶滴眼液在制备治疗眼底缺血性疾病药物中的应用。