CN106727611A

CN106727611A - 用于预防和治疗血管性疾病的化合物及其制剂

Info

Publication number: CN106727611A
Application number: CN201510836778.0A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Chengdu Easy Access Technology Co Ltd
Current assignee: Chengdu Easy Access Technology Co Ltd
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明涉及一种具有环戊烷并多氢菲骨架结构的呋甾烷类化合物在预防和治疗血管性疾病药物中的用途。本发明提及的化合物具有良好的血管新生抑制活性，可有效抑制眼部新生血管异常增生以及预防和治疗血栓、白内障、血管性痴呆。本发明同时公开了一种治疗眼部新生血管异常增生的自聚集纳米粒滴眼液，其含有环戊烷并多氢菲骨架结构的呋甾烷类化合物作为活性组分。本发明的滴眼液克服了现有治疗眼底新生血管异常增生的药物侵入性治疗的缺点，该滴眼剂是治疗眼部新生血管异常增生疾病的理想药物。

Description

用于预防和治疗血管性疾病的化合物及其制剂

技术领域

本发明涉及具有预防和治疗血管性疾病(包括眼部新生血管、血栓、白内障、血管性痴呆)、具有环戊烷多氢菲骨架结构的化合物，以及以环戊烷多氢菲骨架化合物为活性组分的、用于预防和治疗眼部及其全身血管相关性疾病的制剂。

背景技术

环戊烷多氢菲衍生物广泛存在于动植物体内，并在动植物生命活动过程中起着重要的作用，以环戊烷多氢菲为基本结构的类固醇药物多数具有消炎及免疫的作用，对于炎性疾病、过敏性疾病、自体免疫性疾病有较高的医学价值。具有生物活性的环戊烷多氢菲类化合物一直是研究的热点领域之一，该类化合物至今对社会仍然发挥着重要作用，有着巨大的社会效益和经济效益。

新生血管是机体的一个正常生理过程，但在慢性炎症、恶性肿瘤和视网膜病变等病理过程中也会出现局部的新生血管异常增生。眼部新生血管形成是多种眼病(包括角膜新生血管病变、新生儿视网膜病变、糖尿病性黄斑变性以及年龄相关性黄斑变性等)的共同病理改变及重要临床表现，是诱导视力丧失的主要原因。湿性年龄相关性黄斑变性是50岁以上人群人明的首要原因。随我国人口老龄化的加剧，未来几十年内患有年龄相关性黄斑变性疾病的患者将急剧增加。目前临床上用于治疗年龄相关性黄斑变性等眼部疾病的雷珠单抗、贝伐单抗、康柏西普等大分子多肽类药物，只能通过“玻璃体腔注射”给药方式治疗，治疗周期长、治疗费用高、多并发症、风险大限制了它们在临床上应用，也给患者在经济上和精神上带来了双重压力，同时仍有三分之一的患者对此类药物治疗无效，近六分之一的患者最终仍会丧失视力。然而迄今尚未发现有效治疗年龄相关性黄斑变性等眼部疾病的小分子化合物，更无经济、方便、有效的“滴眼给药”方式治疗相关眼病的药物。

血管新生与肿瘤密切相关，在肿瘤生长过程中，新生血管快速增生同时向肿瘤表面及内部延伸，为肿瘤的生长提供持续的氧气和营养物质，肿瘤的生长和转移依赖于血管新生。因此，抑制肿瘤血管新生是肿瘤治疗的有效策略。已有研究发现，具有环戊烷多氢菲结构的螺甾烷化合物(专利申请号：201310325252.7，命名为EDA-H6系列化合物)在体外对结肠癌、乳腺癌、肝癌细胞具有一定的生长抑制作用。本发明人在对具有环戊烷多氢菲结构另一类的呋甾烷化合物(专利申请号：201410146063.8，命名为EDA-H9系列化合物)的体外的研究中发现，EDA-H9系列化合物对乳腺纤维瘤、卵巢囊腺瘤、食管平滑肌瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、结肠癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、淋巴瘤等肿瘤细胞均具有较好的抑制作用；体内肿瘤模型实验结果显示，EDA-H9系列化合物可以显著抑制体内接种的肿瘤组织的增长，同时病理切片显示肿瘤组织中的血管数量明显减少，效果显著优于EDA-H6系列化合物。本发明人在研究中发现，EDA-H9通过抑制肿瘤组织中新生血管的生成抑制肿瘤的生长，效果优于EDA-H6系列化合物，表明EDA-H9系列化合物是一类潜在的抗血管生成抑制剂，具有治疗乳腺纤维瘤、卵巢囊腺瘤、食管平滑肌瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、结肠癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、淋巴瘤等肿瘤疾病的潜力。

已有研究结果证实含有环戊烷并多氢菲骨架结构的螺甾烷化合物EDA-H6系列化合物具有抑制眼部病理性新生血管的作用(专利申请号：201310325890.9)。为探索的具有环戊烷多氢菲骨架结构的呋甾烷化合物是否也具有抑制眼部病理性新生血管的作用，本发明人依据专利201410146063.8，以天然甾体苷元(25R)-Spirost-5-en-3β-ol为原料制备合成了呋甾烷衍生物，即EDA-H9系列化合物，经过大量体内外研究发现，该类衍生物能显著抑制眼部异常新生血管的生成，且效果优于专利201310325890.9中所述化合物的活性。

同时，本发明人研究了EDA-H9系列化合物在其它血管性疾病中的作用，包括白内障、血栓、血管性痴呆等，研究结果显示EDA-H9系列化合物在白内障、血栓、血管性痴呆等血管性疾病中也具有一定的保护和治疗作用。

发明内容

本发明人以多种体内外疾病模型经过大量试验证实，以EDA-H9系列化合物为活性组分组成的眼用制剂具有预防和抑制眼部病理性新生血管异常增生的作用。其中，EDA-H9系列化合物自组装形成的纳米滴眼剂效果显著优于具有环戊烷并多氢菲骨架结构的螺甾烷化合物(专利申请号：201310325890.9，命名为EDA-H6系列化合物)。

具体的为，本发明人以具有环戊烷并多氢菲骨架结构的呋甾烷类化合物(EDA-H9系列化合物)或其药学上可接受的盐或酯或化合物组合物为活性组分，制备成具有抑制眼部新生血管异常增生性疾病的眼用制剂。

上述所述的用于预防和抑制新生血管增生性疾病的EDA-H9系列化合物，是指具有环戊烷并多氢菲骨架结构的呋甾烷与亲水基团组成的两亲性化合物。

上述所述的两亲性EDA-H9系列化合物通过处理可在水溶液中自聚集形成纳米粒，其粒径分布5-200nm。

上述所述的用于预防和抑制新生血管增生性疾病的眼用制剂，包括滴眼剂、纳米滴眼剂、眼膏剂、眼用膜剂、凝胶剂、玻璃体注射剂、玻璃体缓释与控释剂。

以新西兰白兔为模型，通过滴眼给药方式检测EDA-H9系列化合物在兔眼各组织中的分布，结果显示EDA-H9系列化合物均能不同程度的透过血眼屏障并富集到兔眼玻璃体、视网膜和脉络膜等组织，且EDA-H9系列化合物较EDA-H6系列化合物更容易富集到眼底各组织，且EDA-H9系列化合物形成的纳米滴眼剂较EDA-H6系列化合物形成的制剂刺激性更小。

为进一步探索EDA-H9系列化合物对眼部病理性新生血管的抑制作用，本发明人分别通过高氧诱导新生小鼠视网膜病变实验、碱烧伤诱导的新西兰兔眼新生血管病变实验和激光诱导恒河猴脉络膜新生血管病变实验，结果显示此类环戊烷多氢菲骨架结构的呋甾烷EDA-H9系列化合物对眼部病理性新生血管异常增生均具有显著的预防和治疗作用，尤其是本专利中EDA-H9化合物为活性成分的纳米滴眼剂，对上述三种血管异常增生性动物模型治疗作用较EDA-H6系列化合物更显著。

本发明人发明的眼用制剂，其给药方式灵活、方便，效果显著，为临床上治疗角膜新生血管疾病、新生儿视网膜病变、湿性年龄相关性黄斑变性等眼部血管增生性疾病提供了新的治疗方向。

本发明提供的以EDA-H9系列化合物为活性组分、用于预防和抑制新生血管增生性疾病的制剂，尤其适用于治疗年龄相关性黄斑变性等眼部疾病，也可用于年龄相关性黄斑变性等眼部疾病术后或玻璃体注射后的巩固、维持用药。

本发明人提供的EDA-H9系列化合物滴眼液具有抑制异常新生血管生成的作用。本发明人首次发现并提出该类化合物通过VEGF和1,25D₃-MARRS双靶点调控血管新生的作用机制。目前临床上使用的眼底血管抑制剂多为VEGF拮抗剂，仅能通过玻璃体注射方式给药。EDA-H9系列化合物分子量小，易自组装形成纳米粒，能够快速渗透、富集到眼底组织，并具有缓释功能，可通过滴眼液给药方式治疗眼部异常血管增生疾病，克服了目前临床上使用的VEGF拮抗剂无法自由穿透血眼屏障的缺点，并能有效减少现有药物玻璃体腔注射隐藏的风险。

本发明人提供的EDA-H9系列化合物可以有效抑制晶状体蛋白的异常解聚，改善晶状体透明度，降低糖尿病性白内障患病率。

本发明人提供的EDA-H9系列化合物可通过抑制血小板活化和调控凝血酶功能抑制血栓形成，并可以降低肺栓塞诱导的死亡。

本发明人提供的EDA-H9系列化合物可以抑制淀粉样蛋白沉淀、聚集，增强记忆能力，改善和修复脑缺血损伤致血管性痴呆的症状。

本发明人提供的用于预防和治疗眼部新生血管异常增生作用的EDA-H9系列化合物，具体的为具有下式结构的化合物或其药学上可接受的盐或酯：

其特征在于，所述化合物是由亲脂性的环戊烷多氢菲母核(Ⅰ)与亲水性的基团(R1、R2)组成的两亲性化合物。

其中，R1、R2为取代的或未取代的(C1-C18)脂肪醇、取代的或未取代的(C1-C18)脂肪酸、肽类(由常见的α-氨基酸、β-氨基酸、N-甲基氨基酸以及其它氨基取代的脂肪酸组成的肽链或杂肽链)、含氮杂环、糖类(葡萄糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、核糖、脱氧核糖、葡萄糖醛酸、2-氨基葡萄糖以及由这些单糖组成的的双糖或多糖)、多元醇(甘油、聚乙烯醇)。

具体的可以是以下化合物或其药学可接受的盐或酯，但不限于以下化合物：

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 4-aminobutyrate (1)

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 6-aminohexanoate (2)

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 2,6-diaminohexanoate (3)

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl2-bis-(2-chloroethyl)-amino-6-aminohexanoate (4)

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 8-aminooctanoate (5)

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 12-aminolaurate (6)

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl 4-aminobutyrate (7)

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl 6-aminohexanoate (8)

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl 2,6-diaminohexanoate (9)

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl2-bis-(2-chloroethyl)-amino-6-aminohexanoate (10)

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl 8-aminooctanoate (11)

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl 12-aminolaurate (12)

(25R)-furost-5-en-3β-acetoxy-26-yl 4-aminobutyrate (13)

(25R)-furost-5-en-3β-acetoxy-26-yl 6-aminohexanoate (14)

(25R)-furost-5-en-3β-acetoxy-26-yl 2,6-diaminohexanoate (15)

(25R)-furost-5-en-3β-acetoxy-26-yl2-bis-(2-chloroethyl)-amino-6-aminohexanoate (16)

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 8-aminooctanoate (17)

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 12-aminolaurate (18)

Cholest-5-en-3β-yl 6-aminohexanoate (19)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-(4-aminobutyrate) (20)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-(6-aminohexanoate) (21)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-(2,6-diaminohexanoate) (22)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-[2-di-(2-chloroethyl)-amino-6-aminohexanoate] (23)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-(8-aminooctanoate) (24)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-(12-aminolaurate) (25)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(6-aminohexanoate)26-(2,6-diaminohexanoate) (26)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(2,6-diaminohexanoate)26-(6-aminohexanoate) (27)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(6-aminohexanoate)26-(2,6-di-acetamido-hexanoate) (28)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(6-aminohexanoate)26-(2-acetamido-6-aminohexanoate)(29)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(2,6-di-acetamido-hexanoate)26-(6-aminohexanoate) (30)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(2-acetamido-6-amino-hexanoate)26-(6-aminohexanoate)(31)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(6-acetaminohexanoate)26-(2,6-di-aminohexanoate) (32)

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(2,6-di-aminohexanoate)26-(6-acetaminohexanoate) (33)

附图说明

图1、EDA-H9化合物在水溶液中的粒径分布

图2、EDA-H9化合物抑制HUVEC(A)增殖、(B)迁移、(C)侵袭、(D)成环

图3、EDA-H9化合物诱导HUVEC(A)线粒体膜电势、(B)胞内Ca²⁺浓度、(C)胞内ATP变化

图4、EDA-H9化合物诱导HUVEC自噬

图5、EDA-H9化合物通过VEGF和1,25D₃-MARRS双靶点抑制新生血管生成

图6、A：EDA-H9化合物对小鼠尾出血时间的影响；B：EDA-H9化合物对血小板聚集度的影响；C：EDA-H9化合物对凝血因子VIII的影响

具体实施方式

(一)EDA-H9系列化合物对眼部血管新生的抑制作用研究

实施例1：碱烧伤诱导的新西兰兔眼角膜新生血管病变实验

1.1动物：

新西兰白兔，雄性，体重2-3kg，分为模型组、给药组EDA-H9(化合物1-33)和EDA-H6对照组(后续试验皆以化合物(25R)-Spirost-5-en-3β-yl glycinate为代表，进行对比试验)，每组各3只。

1.2实验方法：

以3％戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，并滴加利多卡因局麻药物，庆大霉素生理盐水冲洗结膜囊，将浸有1mol/L NaOH溶液的滤纸片(直径8mm)，置于家兔双眼角膜正中10s后取下，迅速用20mL生理盐水冲洗角膜及结膜囊，随后滴眼给药，每天3次。模型建立当天起所有兔眼每天滴抗生素眼药水预防感染，滴眼方法与剂量如表1所示。

表1. EDA-H9(化合物1-33)、EDA-H6滴眼方法与给药剂量

注：正常对照组给于生理盐水滴眼，其余各组每次给药体积均为40μL

评价指标如下：

1)眼睛状况

造模后每天观察眼睛情况，记录眼睛水肿、浑浊度情况。

2)角膜新生血管观察与面积计算

选择不同时间点(给药第4、8、12、16天)，于眼睛表面施予局麻药盐酸利多卡因液，在裂隙灯下观察兔眼角膜新生血管，采集兔眼角膜新生血管图片，用于计算角膜新生血管面积。采集的图片用分析软件分别测量各象限内最长的一支血管的长度。

1.3实验结果

研究结果显示，模型组中，碱烧伤显著促进兔角膜新生血管增生，血管的面积随时间的延长而增加。当EDA-H9(化合物1-33)滴眼液干预后，角膜新生血管的面积和长度显著减少，说明化合物EDA-H9(化合物1-33)可以有效抑制碱烧伤诱导的兔角膜新生血管的生长，且效果优于EDA-H6。组织切片显示，与EDA-H6化合物比较，EDA-H9(化合物1-33)可以有效抑制炎性细胞的浸润，同时改善碱烧伤诱导的角膜损伤。部分数据见表2所示：

表2. EDA-H9(化合物1-33，表中仅选取部分化合物2、8、26、27数据列出)滴眼干预后新生血管的面积

注：“-”新生血管分界不清，认为血管消退

实施例2：高氧诱导新生小鼠视网膜病变实验

2.1动物：

C57BL/6J新生乳鼠，7日龄，性别不限，与哺乳母鼠共同饲养。

2.2实验方法：

取健康C57BL/6J新生鼠称重并随机分为正常组、模型组、EDA-H9(化合物1-33)、EDA-H6，每组3只。正常组新生鼠与哺乳母鼠一起在正常空气环境中饲养；实验组新生鼠与哺乳母鼠一起置于(75±2)％氧气浓度环境中(每组实验组包括两只哺乳母鼠，一只在实验密闭环境哺乳，另一只在正常环境中待哺乳，两只母鼠每12h轮流更换一次)。将高氧环境中饲养5d后的乳鼠放回到正常空气环境中继续饲养，实验组小鼠每天腹腔注射化合物EDA-H9(2-10mg/Kg)，正常组和模型组均腹腔给与相同剂量的生理盐水。给药5天后，戊巴比妥钠溶液将小鼠麻醉，多聚甲醛溶液心脏灌注10min，立即取下眼球，进行视网膜铺片，以观察视网膜血管增生情况。

2.3实验结果

研究结果表明，模型组新生小鼠视网膜产生大量新生血管丛，化合物EDA-H9(化合物1-33)干预后，新生血管的数量均有不同程度的减少，说明EDA-H9系列化合物(化合物1-33)可以有效抑制高氧诱导的小鼠视网膜新生血管形成，且效果优于EDA-H6系列化合物。(表3中仅列出部分数据)

表3. EDA-H9(部分数据)滴眼干预后新生血管丛的面积

实施例3：激光诱导恒河猴脉络膜新生血管病变实验

3.1动物：

成年健康恒河猴，体重10.0～30.0kg，4-6岁。饲养条件符合国标GB14925-2001标准，室温(21±5)℃，相对湿度(55±15)％，猴用全价营养颗粒饲料喂养，去离子水装瓶自由饮用。

3.2实验方法

恒河猴随机分为模型组、EDA-H9滴眼液组(化合物1-33)和EDA-H6滴眼液组，每组3只。戊巴比妥静脉注射麻醉后，美多丽滴眼液散瞳，VISULAS 532s眼底固体激光器以240mW，50ms进行激光眼底照射击穿Bruch膜，围绕黄斑中心凹，每眼照射5～9个直径约50μm损伤点，造模后第7天开始通过滴眼给药方式给药EDA-H9滴眼液：0.2-5mg/mL，每眼50μL，每天2次)。造模后第7、14、21、28、35天分别通过荧光素眼底造影(FFA)和光学相干断层扫描(OCT)检测激光诱导的脉络膜新生血管生成状况。

3.3实验结果

试验结果如下表所示，造模后的第7-21天，模型组眼荧光渗漏面积逐渐增大，第21天后基本稳定。EDA-H9滴眼液(化合物1-33)干预3周后，FFA结果显示眼部荧光渗漏面积逐渐减弱，OCT结果表明脉络膜新生血管CNV病灶面积基本修复，且效果优于EDA-H6。(表4仅列出部分数据)

表4. EDA-H9滴眼干预后荧光素造影血管渗漏面积改善率

(二)眼组织分布

实施例4：EDA-H9系列化合物滴眼剂在兔眼组织中的分布

4.1滴眼给药及样品处理

新西兰白兔，雄性，体重2-3kg，随机分成7个时间点组，每组3只6眼。用微量移液器分别向兔双眼眼表滴入40μL EDA-H9(化合物1-33)滴眼液，闭合眼睑1min，分别于10min、30min、1h、2h、4h、8h和12h耳缘静脉注射戊巴比妥钠溶液麻醉白兔，迅速摘除眼球，生理盐水冲洗，抽取玻璃体，剖开眼球，取视网膜和脉络膜，滤纸吸干表面水分后，放入冻存管于-80℃保存。

玻璃体：取50μL玻璃体样品于1.5mL EP管中加入350μL乙腈溶液，涡旋3min，于13000rpm、4℃离心10min，吸取上清液150μL，以1μL进样。

视网膜和脉络膜：精密称重视网膜和脉络膜于2mL EP管中，按照重量体积比1:9加入乙腈溶液，匀浆2min，超声10min，取匀浆液50μL于1.5mL EP管中加入350μL乙腈溶液，涡旋3min，于13000rpm、4℃离心10min，吸取上清液150μL，以1μL进样。

4.2样品的测定

色谱条件：

分析柱：ACQUITY UPLC-BEH C18,1.7m,2.1×50mm(Waters公司)；流动相：A：0.2％甲酸水溶液B：0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱：A％:％B＝30:70；流速：0.4mL/min；进样量：1μL；柱温：40℃；运行时间：3min；进样盘温度：4℃。

质谱条件：

离子源：电喷雾离子化源(ESI)；毛细管电压(Capillary voltage)：2.50kV；离子源温度(Source Temperature)：150℃；去溶剂化温度(Desolvation Temperature)：600℃；锥孔气体流速(Cone gas flow)：150L/h；去溶剂化气体流速(Desolvation gas flow)：800L/h；雾化气压力(Nebulizer gas pressure)：7.0bar；检测方式：正离子多离子反应监测(MRM)；锥孔电压(Cone voltage)为30V；碰撞电压(Collision energy)为28V。

4.3实验结果

EDA-H9(化合物1-33)单次滴眼给药后部分化合物在眼底组织中的分布结果如表5-9(仅列出部分数据)，EDA-H9类化合物均可快速富集到兔眼的玻璃体、视网膜、脉络膜组织。EDA-H6在视网膜、脉络膜中的浓度极低，低于检测线，在视网膜中几乎检测不到EDA-H6。说明EDA-H9(化合物1-33)在眼底组织中的富集速度和浓度均远远优于EDA-H6组。

表5. EDA-H9(化合物2)滴眼给药后不同时间点眼组织中药物浓度的分布：

表6. EDA-H9(化合物15)滴眼给药后不同时间点眼组织中药物浓度的分布：

表7. EDA-H9(化合物26)滴眼给药后不同时间点眼组织中药物浓度的分布：

表8. EDA-H9(化合物29)滴眼给药后不同时间点眼组织中药物浓度的分布：

表9. EDA-H9(化合物32)滴眼给药后不同时间点眼组织中药物浓度的分布：

注：“-”浓度低于检测标准，未得到有效数据。

(三)EDA-H9系列化合物对体内外肿瘤模型的抑制作用

实施例5：EDA-H6、EDA-H9系列化合物对体外肿瘤细胞的抑制作用

5.1细胞株：

Hela(人宫颈癌细胞系)、A549(人肺癌上皮细胞系)、HT-29(人结肠癌细胞系)、Hep-2(人喉癌细胞系)、HepG2(人肝癌细胞系)、C26(小鼠结肠癌细胞系)。

5.2实验方法：

待细胞生长至培养皿的80％左右，用胰酶消化细胞，将消化后的细胞重新悬浮在新鲜完全培养基中，以每孔3000-5000个细胞接种于96孔板中；

培养过夜后，按照实验方案给以不同浓度的EDA-H6、EDA-H9化合物，阳性对照药5-氟尿嘧啶(5-FU)；

给药48h后，加入10％的MTT溶液，继续孵育4h，用酶标仪测定570或490nm处的吸光光度值。根据测定的吸光光度值算出细胞的抑制率。

5.3实验结果：

MTT实验结果表明EDA-H9系列化合物(化合物1-33)对6种肿瘤细胞系在体外均有显著的抑制作用。其中大部分EDA-H9系列化合物体外抗肿瘤活性较EDA-H6高，部分数据见表10。

表10. EDA-H9系列化合物对肿瘤细胞的抑制作用

实施例6：EDA-H9系列化合物对体内肿瘤模型的抑制作用

6.1细胞株：C26(小鼠结肠癌细胞系)

6.2实验方法

BALB/c小鼠，雄性，C26细胞皮下接种，7d后挑选造模成功的小鼠，分为模型组、阳性组、给药组EDA-H9(化合物1-33)、EDA-H6。模型组：生理盐水；阳性组：5-氟尿嘧啶20mg/kg；EDA-H9：10-20mg/kg。每天腹腔给药1次，连续给药4周，每3d测定一次肿瘤体积和小鼠的体重，组织病理学检查肿瘤组织中新生血管的生成情况。

6.3实验结果

与空白对照组相比，EDA-H9药物处理后，肿瘤的平均抑制率有25.8-48.2％；组织切片显示化合物EDA-H9均可以显著抑制肿瘤内新生血管的生成，且效果远远优于EDA-H6(抑制率(10.4％)。

(四)用于预防和抑制眼部新生血管增生性疾病的制剂的制备

实施例7：用于预防和抑制新生血管增生性疾病的纳米滴眼剂配方

EDA-H9(化合物1-33)：0.001-20％

丙二醇：0-10％

丙三醇：0-10％

聚乙二醇：0-50％

氯化钠：0-50％

羧甲基纤维素钠：0-50％

水：0-99.99％

EDA-H9滴眼液中化合物粒径分布如图1所示：

(五)EDA-H9抑制眼部新生血管增生的作用机制

实施例8：EDA-H9化合物通过VEGF和1,25D₃-MARRS双靶点抑制新生血管生成

8.1材料：原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及上述动物实验组织。

8.2实验结果

8.2.1 EDA-H9(化合物1-33)抑制HUVEC增殖、迁移、侵袭、成环

EDA-H9系列化合物(化合物1-33)抑制HUVEC细胞的增殖、迁移、侵袭、成环，表明EDA-H9化合物在体外具有抑制血管生成的能力。(以化合物2为代表，仅列出化合物2对HUVEC的作用，如图2所示)。

8.2.2 EDA-H9诱导HUVEC线粒体功能紊乱

如图3所示，EDA-H9系列化合物诱导HUVEC线粒体膜电势下降、胞内Ca²⁺浓度升高、胞内ATP下降。表明EDA-H9化合物具有诱导线粒体功能紊乱的能力。

8.2.3 EDA-H9诱导HUVEC自噬

如图4所示，EDA-H9系列化合物诱导HUVEC自噬，胞内自噬体数量明显增多。

8.2.4 EDA-H9调控VEGF、1,25D₃-MARRS、PI3K/AKT

在前期研究结果基础上，结合图5所示结果，研究结果说明EDA-H9系列化合物激活VEGF-2、1,25D₃-MARRS、PI3K/AKT路径，诱导胞内Ca²⁺稳态失衡，促使线粒体膜电位下降，胞内ATP减少，激活细胞自噬，从而抑制新生血管生成。说明EDA-H9系列化合物可能是通过VEGF-2和1,25D₃-MARRS双靶点来调控内皮细胞功能，抑制血管新生。然而，本发明人在研究EDA-H6化合物抑制血管新生作用机制时，发现EDA-H6并不能像EDA-H9系列化合物同时激活VEGF-2和1,25D₃-MARRS双靶点来调控血管新生功能。说明EDA-H9化合物、EDA-H6化合物抑制血管新生的作用机制不同。

(六)EDA-H9系列化合物在白内障疾病中的应用

实施例9：EDA-H9系列化合物降低糖尿病性白内障发病率

9.1建立糖尿病性白内障大鼠模型：

SD大鼠，雄性，6-8周龄，分为空白组、模型组、EDA-H9(化合物1-33)给药组，每组10只。给药组每天腹腔注射EDA-H9(5-20mg/kg)一次，空白组和模型组给予相同剂量的空白溶剂，连续给药14天。第15天，模型组和EDA-H9给药组腹腔注射链脲佐菌素(80mg/kg)，空白组注射相同体积的生理盐水。链脲佐菌素造模后，给药组每天继续腹腔注射EDA-H9(5-20mg/kg)，空白组和模型组给予相同剂量的空白溶剂，连续给药30天。每3天检测一次大鼠进食后最高血糖浓度和饥饿后空腹血糖浓度，裂隙灯观察眼部晶状体浑浊情况，记录动物死亡情况。

9.2实验结果：

EDA-H9化合物(化合物1-33)可以有效抑制晶状体蛋白异常解聚，缓解晶状体代谢异常，改善晶状体澄清度。如表11部分数据所示，使用链脲佐菌素建造糖尿病性白内障模型时，造模成功率在50％以上，但链脲佐菌素毒性较大，动物死亡率较高。给于EDA-H9化合物(化合物1-33)处理后，动物患有糖尿病和白内障的几率明显降低，同时EDA-H9化合物(化合物1-33)具有保护链脲佐菌素致死的作用。表11仅列出部分化合物数据，其中以化合物2、27为例，表征EDA-H9化合物(化合物1-33)对糖尿病性白内障的作用。

表11. EDA-H9对肿瘤细胞的抑制作用

(七)EDA-H9系列化合物在血栓疾病中的应用

实施例10：EDA-H9系列化合物抑制血栓形成

10.1试验方法：参考Zhang R,et al.Anti-thrombosis effect of diosgenylsaponins invitro and in vivo.Steroids 78(2013):1064–1070.

10.2实验结果：

EDA-H9系列化合物(化合物1-33)均可显著延长小鼠尾部出血时间，图6、表12仅列出部分化合物数据，其中以化合物26为例，表征EDA-H9系列化合物(化合物1-33)对小鼠尾部出血时间的影响(图6.A)。同时EDA-H9系列化合物剂量依赖性的降低血小板聚集(图6.B)、抑制凝血因子VIII的活性(图6.C)。

如表12所示，相比于空白对照组，EDA-H9化合物均可延长APTT、PT、TT，并显著提高肺栓塞诱导的死亡率，部分数据如表12所示：

表12. EDA-H9(化合物2、8、21、29)对APTT、PT、TT和肺栓塞的影响

(八)EDA-H9系列化合物在血管性痴呆疾病中的应用

实施例11：EDA-H9对脑缺血损伤致血管性痴呆的作用

11.1试验方法

SD大鼠，雄性，6-8周龄，分为假手术组、模型组、EDA-H9(化合物1-33)给药组，每组3只。给药组每天腹腔注射EDA-H9(5-20mg/kg)一次，空白组和模型组给予相同剂量的空白溶剂，连续给药14天。术前12h禁食，给药后第15天腹腔注射10％水合氯醛麻醉将大鼠，仰卧固定，消毒，采用颈正中切口纵向切开皮肤及皮下组织，钝性分离双侧颈总动脉。用动脉夹夹闭动脉，阻断血流20min，同时尾静脉抽血0.5mL，建立脑缺血损伤致血管性痴呆模型。手术后缝合皮肤，放回笼中饲养。其中，假手术组仅分离双侧颈总动脉，但不阻断血流，不放血。术后当天30min、6h各腹腔注射EDA-H9或生理盐水一次，其后每日一次，连续7天。然后通过跳台法检测各组动物在给药后第7天的学习训练成绩及第8天的记忆成绩。待跳台实验完毕后，断头取海马组织，按试剂盒说明书方法测定海马组织中乙酰胆碱酯酶活性。

11.2试验结果

双侧颈总动脉结扎加放血，在脑低灌流和再灌注的情况下，可致大鼠跳台实验中潜伏缩短，错误次数增加。当EDA-H9(化合物1-33)干预后，可明显延长跳台潜伏期，减少错误次数。说明EDA-H9(化合物1-33)具有保护和修复脑缺血损伤致血管性痴呆的作用。部分数据如表13显示：

表13. EDA-H9对脑缺血损伤致血管性痴呆的作用

Claims

1.一种具有环戊烷并多氢菲骨架结构的呋甾烷类化合物或其药学上可接受的盐或酯或化合物组合物在制备治疗眼部疾病药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，所述的具有环戊烷并多氢菲骨架结构的呋甾烷类化合物为：

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 4-aminobutyrate（1）

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 6-aminohexanoate（2）

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 2, 6-diaminohexanoate（3）

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl2-bis-(2-chloroethyl)-amino-6-aminohexanoate（4）

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 8-aminooctanoate（5）

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 12-aminolaurate（6）

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl 4-aminobutyrate（7）

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl 6-aminohexanoate（8）

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl 2, 6-diaminohexanoate（9）

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl2-bis-(2-chloroethyl)-amino-6-aminohexanoate（10）

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl 8-aminooctanoate（11）

(25R)-furost-5-en-3β-ol-26-yl 12-aminolaurate（12）

(25R)-furost-5-en-3β-acetoxy-26-yl 4-aminobutyrate（13）

(25R)-furost-5-en-3β-acetoxy-26-yl 6-aminohexanoate（14）

(25R)-furost-5-en-3β-acetoxy-26-yl 2,6-diaminohexanoate（15）

(25R)-furost-5-en-3β-acetoxy-26-yl2-bis-(2-chloroethyl)-amino-6-aminohexanoate（16）

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 8-aminooctanoate（17）

(25R)-furost-5-en-26-ol-3β-yl 12-aminolaurate（18）

Cholest-5-en-3β-yl 6-aminohexanoate（19）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-(4-aminobutyrate)（20）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-(6-aminohexanoate)（21）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-(2,6-diaminohexanoate)（22）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-[2-di-(2-chloroethyl)-amino-6-aminohexanoate]（23）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-(8-aminooctanoate)（24）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β,26-bis-(12-aminolaurate)（25）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(6-aminohexanoate) 26-(2,6-diaminohexanoate)（26）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(2,6-diaminohexanoate) 26-(6-aminohexanoate)（27）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(6-aminohexanoate) 26-(2,6-di-acetamido-hexanoate)（28）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(6-aminohexanoate) 26-(2-acetamido-6-aminohexanoate)（29）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(2,6-di-acetamido-hexanoate) 26-(6-aminohexanoate)（30）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(2-acetamido-6-amino-hexanoate) 26-(6-aminohexanoate)（31）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(6-acetaminohexanoate) 26-(2,6-di-aminohexanoate)（32）

(25R)-furost-5-en-3β,26-diol 3β-(2,6-di-aminohexanoate) 26-(6-acetaminohexanoate)（33）。

3.如权利要求1所述的用途，所述的眼部疾病是指眼部新生血管异常增生。

4.如权利要求1所述的用途，所述的眼部疾病是指白内障。

5.一种具有环戊烷并多氢菲骨架结构的呋甾烷类化合物或其药学上可接受的盐或酯或化合物组合物在制备治疗血栓的药物中的用途。

6.一种具有环戊烷并多氢菲骨架结构的呋甾烷类化合物或其药学上可接受的盐或酯或化合物组合物在制备治疗血管性痴呆的药物中的用途。

7.权利要求1-6之一所述的用途，其中所述的化合物，是指具有环戊烷并多氢菲骨架结构的呋甾烷与亲水基团组成的两亲性化合物；上述所述的两亲性EDA-H9系列化合物在水溶液中自聚集形成纳米粒，其粒径分布5-200 nm。

8.权利要求1-7之一所述的化合物，通过VEGF和1,25D₃-MARRS双靶点途径抑制血管新生。

9.一种眼用制剂，它是由权利要求1-8任意一项所述的化合物为活性成分，制备而成的滴眼剂、眼用注射剂或玻璃体注射剂。

10.根据权利要求9所述的眼用制剂，其特征在于：所述眼用制剂的剂型为液体、凝胶、脂质体、溶液、油膏、乳膏、喷雾、气雾剂或液体悬浮剂的形式。