CN114191444B - Lc-a在制备治疗和预防增殖性糖尿病性视网膜病变药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了LC‑A在制备治疗和预防增生性玻璃体以及增殖性糖尿病性视网膜病变药物中的应用。LC‑A(Capilliposide A)眼部给药能够分布到视网膜，抑制视网膜病理性新生血管的生成，还能够抑制视网膜上皮细胞胶原收缩和纤维粘连蛋白的表达，具有治疗和预防增生性玻璃体视网膜病变和增殖性糖尿病性视网膜病变的作用。

Description

LC-A在制备治疗和预防增殖性糖尿病性视网膜病变药物中的 应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及Capilliposide A（以下简称LC-A）在制备治疗和预防增殖性糖尿病性视网膜病变药物的应用。

背景技术

视网膜病变（retinopathy）是一类较为复杂的眼科疾病，分类较多，常见的是视网膜脱离，糖尿病性视网膜病，黄斑变性，未成熟儿视网膜病变等。在上述常见眼科疾病当中，增殖性视网膜病变情况最为多见，包括增殖性玻璃体视网膜病变（proliferativevitreoretinopathy，PVR）以及增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabeticretinopathy，PDR）。

增殖性糖尿病型视网膜病变（PDR）是糖尿病的严重并发症。视网膜缺氧、内皮细胞增殖和玻璃体收缩均可导致新生血管的产生。糖尿病视网膜病变基本的病理改变为毛细血管内皮细胞增生、基底膜增厚、内皮细胞损伤、通透性增加、新生血管形成和纤维组织化。目前对于PDR的治疗方法包括全视网膜光凝技术和抗VEGF药物治疗，但两种方式都存在不良反应，因此找到一种新的治疗方式迫在眉睫。

LC-A是具有13,28-环氧结构的齐墩果烷类三萜皂苷，可以由LC-B或LC-C酯键水解制得，相较于LC-B或LC-C，LC-A具有更好的溶解性和更小的刺激性，但对于其能否分布到视网膜并能够对PDR起到治疗作用未见有相关研究。

发明内容

本发明公开了LC-A在制备治疗和预防增殖性糖尿病性视网膜病变药物中的应用。LC-A眼部给药能够分布到视网膜，抑制诱导因素导致的视网膜病理性新生血管的生成，能够抑制视网膜上皮细胞胶原收缩和纤维粘连蛋白的表达，具有治疗和预防增殖性糖尿病性视网膜病变的作用。

本发明采用以下技术方案实现：

Capilliposide A（简称LC-A）在制备治疗和预防增殖性糖尿病性视网膜病变药物中的应用。Capilliposide A的化合物结构如式（1）所示：

式（1）。

本发明所述的LC-A通过小鼠眼部给药，能够进入到眼部的各个部位，尤其能够进入到视网膜部位发挥药效，而且没有明显的眼部刺激；模型小鼠眼部给药后视网膜病理性新生血管的生成得到明显的抑制，还能够抑制人视网膜上皮细胞胶原收缩和纤维粘连蛋白（Fibronectin蛋白）的表达，这些对改善PDR无疑是有益的。

本发明所述的治疗和预防增殖性糖尿病性视网膜病变的药物，是LC-A与临床上可接受的药用辅料制备的制剂，可以是眼用制剂或注射剂。眼用制剂可以是滴眼剂、眼用凝胶剂、眼用膏剂、眼内注射溶液、眼用膜剂。

本发明优选的剂型是眼用制剂，可以是滴眼剂、眼用凝胶剂、眼用膏剂、眼内注射溶液、眼用膜剂。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种原料或潜药，具有较好的溶解性，能够分布到视网膜发挥药效，而且对眼睛的刺激性小，可以制备成眼用的制剂；它不仅能够抑制诱导因素导致的视网膜病理性新生血管的生成，还能够抑制视网膜上皮细胞胶原收缩和Fibronectin蛋白的表达，从多个方面改善增殖性糖尿病性视网膜病变。

附图说明

图1为LC-A在小鼠眼内的分布。

图2为LC-A小鼠视网膜病变OIR模型中病理性新生血管的形成抑制作用；A各组小鼠视网膜扫描图；B各组小鼠视网膜血管簇（tufs）总面积。

图3为LC-A对人视网膜上皮细胞的胶原收缩的抑制作用。

图4为LC-A对Fibronectin蛋白表达的抑制作用。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明。

本发明所述Capilliposide A（简称LC-A）在制备治疗和预防增殖性糖尿病性视网膜病变药物中的应用。

本发明还提供了LC-A的制剂，与临床上可接受的药用辅料制备而成的制剂，可以眼用制剂、注射剂、口服制剂或吸入制剂。所述的眼用制剂可以是滴眼剂、眼用凝胶剂、眼用膏剂、眼内注射溶液、眼用膜剂。所述口服制剂可以是片剂、胶囊、软胶囊、微囊、纳米制剂、颗粒剂。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。

实施例1 ：LC-A在小鼠眼内分布情况

将0.1 mg/ml的LC-A溶液滴于小鼠左侧眼球，一滴，在1 h,3 h,6 h和24 h时间点摘取小鼠眼球，放入生理盐水中清洗，并将小鼠眼球解剖为角膜+虹膜、玻璃体、晶状体和视网膜四部分，分别剪碎，放入装有100 μl甲醇的1.5 ml离心管中，密封，超声30 min后，10000 r/min离心10 min，取上清液，10000 r/min离心10 min，取上清液20 μl在高分辨液相质谱联用仪上进行检测，将得到的结果进行分析，结果见图1，随着药物作用时间的延长，LC-A逐渐从眼球表面渗入到眼球内部，在虹膜、玻璃体、晶状体和视网膜均有分布，图1中，角膜+虹膜、玻璃体、晶状体和视网膜各组中柱状图从左到右依次对应1 h,3 h,6 h和24 h时间点。

实施例2 ：LC-A对OIR模型中病理性新生血管形成的抑制作用

将产后第7天的小鼠放入氧气体积浓度为75% 的氧舱中喂养，并于产后第12天取出，得到小鼠OIR模型，一组小鼠OIR模型双眼给与0.1 mg/ml LC-A生理盐水溶液，一天一次；一组小鼠OIR模型双眼给与0.1 mg/ml LC-A生理盐水溶液，一天三次；一组小鼠OIR模型双眼给与生理盐水溶液，一天一次；于产后第17天处死小鼠，摘取眼球，放入多聚甲醛中固定30 min后，分离出视网膜，放入体积浓度2%山羊血清中封闭30 min，加入3μl IB₄染液，4℃摇床摇晃染色过夜，第二天PBS清洗两次，每次5 min，对视网膜进行封片，使用自动扫片机进行扫描，图像见图2中的A；使用Image J和Adobe Photoshop CS4软件对血管簇（tufs）总面积进行分析处理，所得结果如图2中的B所示。表明OIR模型组小鼠视网膜tufs总面积显著高于正常小鼠，OIR模型组小鼠眼部给予LC-A滴眼液处理后，视网膜tufs总面积较模型组有明显降低，每天三次的效果优于每天一次的效果，说明LC-A有效抑制了视网膜病变模型鼠的视网膜病理性新生血管的生成，且具有浓度依赖性。

实施例3：LC-A对视网膜上皮细胞胶原收缩的抑制作用

将人视网膜ARPE-19细胞消化，用pH=7.2、浓度为1.5mg/ml的中和胶原I重悬细胞，使细胞密度为1x10⁶个细胞/ml。将细胞和凝胶混合物转移到用5mg/ml BSA/PBS孵育过夜的24孔板中，37℃孵育90min后，凝胶变成固体果冻软材料，24孔板分成六组，分别为对照组、10ng/µl TGF-β2处理组、10ng/µl TGF-β2+40µM LC-A处理组、10ng/µl TGF-β2+60µM LC-A处理组、10ng/µl TGF-β2+80µM LC-A处理组和10ng/µl TGF-β2+100µM LC-A处理组；对照组、10ng/µl TGF-β2处理组、10ng/µl TGF-β2+40µM LC-A处理组、10ng/µl TGF-β2+60µMLC-A处理组、10ng/µl TGF-β2+80µM LC-A处理组和10ng/µl TGF-β2+100µM LC-A处理组分别用含有DMEM培基0.5ml、含有10ng/µl TGF-β2的DMEM培基0.5ml、含有10ng/µl TGF-β2+40µM LC-A的DMEM培基0.5ml、含有10ng/µl TGF-β2+60µM LC-A的DMEM培基0.5ml、含有10ng/µl TGF-β2+80µM LC-A的DMEM培基0.5ml和含有10ng/µl TGF-β2+100µM LC-A的DMEM培基0.5ml处理后，继续培养，至第三天测定凝胶直径。所得结果如图3所示，经含有10ng/µlTGF-β2的DMEM培基相比于对照组出现明显的胶原收缩，增加LC-A后胶原收缩情况得到改善，尤其在100µM LC-A的条件下更显著，说明LC-A有抑制视网膜上皮细胞胶原收缩的作用。

实施例4： LC-A对纤维粘连蛋白( Fibronectin）表达的抑制作用

人视网膜ARPE-19细胞接种于12孔板中，贴壁后，加入无血清培基饥饿过夜，分为对照组，10ng/µl TGF-β2组，10ng/µl TGF-β2+60µM LC-A组，10ng/µl TGF-β2+70µM LC-A组和10ng/µl TGF-β2+80µM LC-A组，分别对细胞进行加药处理，48h后加入细胞裂解液和loading buffer，100℃变性10min。样品蛋白质在10%SDS-PAGE中分离，并转移到PVDF膜上，孵育Fibronectin抗体4℃过夜，第二天孵育二抗并进行曝光处理，结果如图4所示，TGF-β2处理后Fibronectin蛋白表达相比于对照组显著升高， LC-A能够抑制TGF-β2导致的Fibronectin蛋白表达增加，随着LC-A浓度的增加，Fibronectin蛋白表达量逐渐降低。表明LC-A能够抑制基底膜纤维粘连蛋白( FN) 的表达。

实施例5： LC-A滴眼剂的制备

取灭菌蒸馏水约900 ml，加入LC-A 500mg，搅拌使溶，加入9克氯化钠，搅拌使溶，灭菌馏水加至1000 ml，除菌过滤，无菌分装，即得。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.LC-A在制备治疗和预防增殖性糖尿病性视网膜病变药物中的应用，LC-A（Capilliposide A）的化合物结构如式（1）所示：

式（1）。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Capilliposide A眼部给药能够分布到视网膜，抑制视网膜病理性新生血管的生成,还能够抑制视网膜上皮细胞胶原收缩和纤维粘连蛋白的表达。

3.根据权利要求1~2任一项所述的应用，其特征在于，治疗和预防增殖性糖尿病性视网膜病变的药物，是Capilliposide A与临床上可接受的药用辅料制备的制剂，为眼用制剂或注射剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，眼用制剂为滴眼剂、眼用凝胶剂、眼用膏剂、眼内注射溶液和眼用膜剂。