CN102218145B - 一种保护青光眼视神经的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属制药领域,涉及一种提高青光眼神经保护疗效的药物组合物及其制备方法。所述的药物组合物由下述剂量配比的:丙戊酸钠为0.1-10ug,携带治疗基因的腺相关病毒载体为1×10e9-1×10e12病毒颗粒制备而成。本药物组合物制成有丙戊酸钠和携带治疗基因的腺相关病毒载体的复方制剂,或者将丙戊酸钠和携带治疗基因的腺相关病毒载体分别制成单独的药物制剂,且将该两种单独的药物制剂包装在同一个药盒中。该药物组合物能克服现有神经保护治疗的不足之处,既能从多个环节保护视网膜神经节细胞RGCs,又能带动腺相关病毒载体携带的治疗基因在视网膜细胞内长期高效表达,对青光眼神经保护治疗起到协同增效作用,能有效提高青光眼神经保护疗效。

Description

一种保护青光眼视神经的药物组合物及其制备方法
技术领域
本发明属制药领域,涉及药物组合物,具体涉及一种保护青光眼视神经的药物组合物及其制备方法。
背景技术
研究报道,青光眼主要表现为特征性视神经损害和视野缺损(视功能损害),其属于全球第一位不可逆性致盲性眼病。研究发现高眼压是引发青光眼视神经病变重要的始动因素,目前临床上抗青光眼的治疗措施主要集中在降低眼压。随着对青光眼临床和基础研究的逐渐深入,国内外学者逐渐形成共识:眼压不是青光眼发病机制中的唯一因素,单纯降低眼压只能从一定程度上缓解病情的发展却不能遏制继发性视网膜神经节细胞(RGCs)死亡及其轴突的溃变,青光眼视神经病变和视野损害的病理基础是RGCs的凋亡;因此,以RGCs为目标开展新的和有效的神经保护治疗措施来阻断或缓解其凋亡过程,或者对已经损伤的RGCs进行修复成为青光眼治疗的根本性解决途径。
在神经保护治疗中,有一系列研究已经证实许多治疗药物如神经营养因子,B族维生素、NMDA受体拮抗剂、热休克蛋白以及传统中医药等对青光眼神经具有保护作用,但临床疗效却不理想,单独应用上述任何一种药物都很难实现对青光眼起到长久的神经保护作用,其主要原因可能有两方面:1、青光眼视神经病变的发病机制复杂,是多种因素交互关联共同作用所致,单纯针对某种致病因素或某一发病环节很难达到预期的治疗效果,例如,青光眼视网膜损伤后氧自由基可以限制神经营养因子对RGCs的保护作用、谷氨酸超负荷和胶质细胞过渡激活引发的RGCs凋亡通路的不可逆性激活也大大降低了神经保护剂对RGCs应有的保护效果;2、许多治疗基因或药物虽然神经保护效果显著,令人振奋,但单次给药在眼内很难长期维持有效的治疗浓度,即使是采用基因治疗方法携带治疗基因,也会由于载体无法维持外源基因在视网膜细胞内长期高水平表达而不能充分发挥其神经保护作用。
丙戊酸钠(Sodium Valproate, VPA)是临床抗癫痫和抗惊厥的一线用药,已在临床上安全使用40余年,其在人体内的药代动力学和可能的副作用已经明确。目前VPA在临床上主要用于癫痫和双向精神障碍的治疗,可迅速透过血脑屏障,疗效确定,而且安全性好。目前国内外尚未见有关VPA和携带治疗基因的腺相关病毒载体联合应用,既针对青光眼的复杂发病机制,从多个环节保护RGCs,又能带动腺相关病毒携带的治疗基因在视网膜细胞内长期高效表达,从而提高青光眼神经保护的实际疗效的报道。 
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的缺陷,提供一种保护青光眼视神经的药物组合物。该药物组合物能克服现有神经保护治疗的不足之处,既能从多个环节保护RGCs,又能带动腺相关病毒载体携带的治疗基因在视网膜细胞内长期高效表达,对青光眼神经保护治疗起到协同增效作用,能有效提高青光眼神经保护疗效。
本发明进一步提供了所述的药物组合物的制备方法和用途。
具体而言,本发明的保护青光眼视神经的药物组合物,其特征在于,含有有效剂量的丙戊酸钠和携带治疗基因的腺相关病毒载体,其中:
丙戊酸钠的质量范围为0.1-10ug,携带治疗基因的腺相关病毒载体为 1×10e9-1×10e12病毒颗粒。
     本发明中,所述的丙戊酸钠(可市购)属于Ⅰ类HDAC抑制剂,是一种分子量很小的短链脂肪酸,其化学名称为2-丙基戊酸钠,分子式为: C8H15NaO2,分子量为: 166.20,具有式(Ⅰ)分子结构式
Figure 521862DEST_PATH_IMAGE001
 
(Ⅰ)     ,
所述的丙戊酸钠作为一种不含氮的广谱抗癫痫药,已在临床上应用40余年,对多种原因引起的惊厥均有不能程度的对抗作用,可迅速透过血脑屏障,口服吸收快而完全,疗效确定,安全性好。
本发明药物组合物中,所述的丙戊酸钠优选剂量范围为:0.1-0.5ug,腺相关病毒载体的优选剂量范围为1×10e11-1×10e12病毒颗粒;优选二者剂量比例为1ug: 1×10e12~5×10e12病毒颗粒(即每1ug丙戊酸钠与1×10e12~5×10e12个病毒颗粒的腺相关病毒载体配比组合)。
本发明中,所述的腺相关病毒载体的血清型包括但不限于下述血清型:AAV1,AAV2,AAV3, AAV4,AAV5,AAV6,AAV7或AAV8。
本发明中,所述的药物组合物中治疗基因包括所有有利于神经细胞存活的基因或神经保护剂,包括神经营养因子,B族维生素,NMDA受体拮抗剂,热休克蛋白HSP和多种与细胞存活相关的基因,如Bcl-2,Survivin等。
本发明所述的药物组合物可以复方制剂的形式存在,且所述的药物组合物的剂型是药剂学上可接受的任何药物剂型,使用相应的药物辅料和制备工艺可制成不同的复方药物制剂;
其中,所述的复方药物制剂是将所述的丙戊酸钠和腺相关病毒载体作为活性成份制备而成的单独的制剂,是药剂学上可接受的任何药物剂型,优选的剂型是注射剂,如:液体注射剂和注射用粉剂(包括注射用无菌灌装粉剂和冻干粉剂),或者是以磷酸盐缓冲液、氯化钠、葡萄糖、果糖、转化糖或麦芽糖等作为渗透压调节剂的静脉注射使用(包括静脉推注和静脉滴注)的水溶液。
或,
本发明所述的药物组合物可将所述的丙戊酸钠和腺相关病毒载体分别制成单独的药物制剂,所述单独的丙戊酸钠制剂和腺相关病毒载体制剂是药剂学上可接受的任何药物剂型,优选注射剂,如注射用粉剂(包括注射用无菌灌装粉针剂和冻干粉针剂)和液体注射剂;所述的液体注射剂还包括以磷酸盐缓冲液、氯化钠、果糖、转化糖或麦芽糖等作为渗透压调节剂的静脉注射使用(包括静脉推注和静脉滴注)的水溶液;
所述的丙戊酸钠和腺相关病毒载体两种单独制剂的剂型是相同的,或是不同的,如丙戊酸钠注射液和腺相关病毒载体注射粉剂的组合物、丙戊酸钠注射粉剂和腺相关病毒载体注射液的组合物、丙戊酸钠注射液和腺相关病毒载体注射液的组合物,或者是丙戊酸钠注射粉剂和腺相关病毒载体注射粉剂的组合物;
其中,使用时,将所述的两种单独的制剂先后依次用药,或事先将单独的丙戊酸钠制剂和腺相关病毒载体制剂充分混合后同时给药,以最终达到使用本药物组合物的目的;具体而言,使用时可用丙戊酸钠注射液将腺相关病毒载体粉针剂充分溶解成为混合液后一起使用,或者用腺相关病毒载体注射液将丙戊酸钠粉剂充分溶解成为混合液后一起使用,也可使用适量注射用水将丙戊酸钠粉剂和腺相关病毒载体粉剂充分溶解后混合使用,或依次先后使用。需要特殊指出的是,为了方便患者使用和表明药物组合的特征,应将所述的两种单独的丙戊酸钠制剂和腺相关病毒载体制剂放在同一个药盒里,并在药盒说明书中阐明该药物组合物的成份、适应症和使用方法。
本发明的上述药物组合方式和药学上可接受的各种药物剂型中,优选单独的丙戊酸钠制剂和单独的腺相关病毒载体制剂,且剂型均为注射剂。本发明提供的上述优选形式的药物组合物,将各自独立的、含有所述的丙戊酸钠注射剂和腺相关病毒载体注射剂包装在同一药盒中,该形式的药物组合方式对于分别确保丙戊酸钠和携带治疗基因的腺相关病毒载体的稳定性十分有利,避免任何可能导致两种药物稳定性下降、效价降低或产生药物杂质的可能性,更为有利的是,该形式的药物组合,可使医护人员根据患者的病情灵活调配两种药物的配剂比例和用量,更能满足临床上个体化治疗的需要。
本发明中所述的药物组合物的活性成份,即丙戊酸钠和携带治疗基因的腺相关病毒载体,可作为未加工的原材料给药,但由于药品在生产和使用上的必要性,本药物组合物中还可包含药剂学上可接受的药用辅料,使用相应的药用辅料和制备工艺,可将本药物组合物生产成不同的药物剂型,所述的药用辅料是根据不同的药物剂型和药物自身的理化性质来选用的,目的是为了便于生产加工成各种剂型、确保药物的稳定、有效、安全等因素,所述药用辅料的选择使用是制药领域技术人员所熟知的。
本发明中,对于注射剂,按照制药领域熟知的方法,所述的药用辅料可选择性的包括赋形剂或稀释剂,例如:微晶纤维素、乳糖、淀粉、糊精、磷酸钙、蔗糖、右旋糖酐、甘露醇、氯化钠、山梨醇、葡萄糖、果糖、水、聚乙二醇、丙二醇、甘油等;还可选择性的包括PH值调节剂或缓冲剂或助溶剂,例如磷酸盐缓冲液、柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸盐缓冲液、稀盐酸、乳酸、碳酸钠、磷酸钠、氢氧化钠、碱性有机化合物如精氨酸、赖氨酸、葡甲胺等;还可选择性的包括防腐剂,如苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸酯、对羟基苯甲酸丙酯等,或者可选择性的包括稳定剂和抗氧化剂,如依地酸钙钠、依低酸二钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、维生素C、维生素E,等。
上文中,所述“可选择性的包括”是指视需要进行选用,而不是必须使用。
本发明中所述药物组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将所述的丙戊酸钠和携带治疗基因的腺相关病毒载体与药学上可接受的药用辅料充分混合制成药剂学上可接受的任何药物剂型;优选的药物剂型是液体注射剂和注射用粉剂(包括注射用无菌灌装粉末、冻干粉剂),其中液体注射剂是以磷酸钠缓冲液、葡萄糖、氯化钠、果糖、转化糖或麦芽糖等作为渗透压调节剂的静脉注射使用(包括静脉推注和静脉滴注)的水溶液;
(2)将所述的丙戊酸钠和携带治疗基因的腺相关病毒载体分别与药学上可接受的药用辅料充分混合制成单独的药物制剂,且将该两种单独的药物制剂放在同一个药盒中,附有使用说明书;优选的药物剂型是液体注射剂或注射粉剂,所述的两种制剂是同一剂型,或是不同剂型的,其中,液体注射剂是以磷酸钠缓冲液、葡萄糖、氯化钠、果糖、转化糖或麦芽糖等作为渗透压调节剂的静脉注射使用(包括静脉推注和静脉滴注)的水溶液。
本发明所述的药物组合物具有以下优点:
(1)给药方式采用局部注射或静脉注射方式;
(2)所述的丙戊酸钠使腺相关病毒载体介导的治疗基因在视网膜神经细胞的长期高水平表达,提高青光眼神经保护疗效;
(3)所述的丙戊酸钠降低青光眼视网膜谷氨酸兴奋性毒性,改善视网膜微环境,与腺相关病毒载体携带的治疗基因共同发挥协同增效的治疗作用;
(4)所述的丙戊酸钠可抑制青光眼胶质细胞过渡激活,改善视网膜微环境,与腺相关病毒载体携带的治疗基因共同发挥协同增效的治疗作用;
(5)所述的丙戊酸钠可抑制青光眼炎症因子的大量释放,改善视网膜微环境,与腺相关病毒载体携带的治疗基因共同发挥协同增效的治疗作用;
(6)本药物组合物与一种或多种降眼压药物同时或依次给予、或者与一种或多种降眼压手术同时或依次给予、或者与一种或多种视神经保护剂同时或依次给予。
本发明所述的药物组合物在青光眼神经保护方面具有良好的药理协同作用,能针对青光眼多个致病环节对RGCs起到协同增效的保护作用,提高青光眼的治疗效果。
本发明通过体外和体内实验证明,本药物组合物可长期提高治疗基因在视网膜细胞内的表达水平,以及本药物组合物在提高青光眼神经保护方面的显著效果和优越性:
(1)丙戊酸钠和携带治疗基因的腺相关病毒载体组合物长期提高治疗基因在视网膜细胞内的表达水平;将丙戊酸钠和携带报告基因GFP或营养因子BDNF的Ⅱ型腺相关病毒载体(rAAV2-GFP/rAAV-BDNF)一起加入体外培养的hRPE细胞株、原代培养的成人RPE细胞、IPE细胞和RGCs、大鼠视网膜神经细胞后,可加快并提高GFP或BDNF在上述细胞中的表达水平,与单独应用rAAV2-GFP/rAAV-BDNF 相比,外源基因表达水平提高了6.1±0.4倍;将丙戊酸钠和rAAV2-LUC一起注射到Balb/c 小鼠玻璃体腔后,可使LUC在视网膜细胞内的表达强度较单独应用rAAV2-LUC时提高4.7±0.6倍。
实验结果表明,丙戊酸钠的浓度与提高基因表达水平之间存在量效关系,终浓度为0.01-1mM或0.1-1ug之间,随着药物浓度的增加,基因表达水平逐渐提高,并不是浓度越高,基因表达水平随之无限增高。
(2)丙戊酸钠和rAAV2-BDNF的药物组合物对大鼠慢性高眼压RGCs具有协同增效的挽救效果;将丙戊酸钠和rAAV2-BDNF单独或联合注射到高眼压大鼠玻璃体后,分别于1、2、3周行视网膜铺片计数存活节细胞数量;与单独注射组相比,联合应用组大鼠视网膜铺片上呈现完整的圆形或卵圆形绿色荧光的细胞数量增多,不规则形态的荧光碎片较少,轴突轮廓相对完整,数量增加,以第3周时差别最为显著(p<0.01)。
Westernblot结果表明,应用本药物组合物组视网膜内外源基因BDNF、促进细胞存活基因bcl-2、catenin和survivin、以及与降低谷氨酸兴奋性毒性有关的α-synuclein蛋白的表达分别较单独注射rAAV2-BDNF组提高6.3-7.9、2.6-3.7、2.1-4.2、3.4-5.6、3.1-3.8倍,胶质细胞激活的标志蛋白OX42和GFAP在视网膜内的含量也出现下降(P<0.01),此外,Elisa结果显示应用药物组合物组视网膜内炎症因子TNF-α含量显著降低。
此外,实验中观察到应用本药物组合物后治疗基因在视网膜内高表达可以至少维持1年之久。
上述实验结果证实,采用本药物组合物不仅可介导腺相关病毒载体携带的治疗基因在视网膜细胞内长期高水平表达,而且可同时调控视网膜细胞存活基因的表达,改善视网膜微环境,多方位挽救RGCs,对青光眼神经保护起到协同增效的作用。初步的安全性实验发现,应用药物组合物给药对大鼠、小鼠无明显的毒副作用。
本发明所述的药物组合物中,所述的携带治疗基因腺相关病毒载体进行青光眼视神经病变的保护治疗,同时给予丙戊酸钠,不仅能很好的提高并延长治疗基因在视网膜细胞内的表达水平,且可改善青光眼视网膜的微环境,如降级谷氨酸兴奋性毒性、抑制胶质细胞过渡激活和炎症因子的大量释放,起到协同增效的作用,提高了青光眼神经保护的疗效。
以下通过具体实施例的方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明的适用范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1表明本发明中所述的丙戊酸钠提高rAAV2-GFP的基因表达水平,其中,A:100μm VPA提高rAAV2-GFP对体外培养RPE细胞株的基因表达水平;B:100μm VPA提高rAAV2-GFP对体外培养SD大鼠原代RGC的基因表达水平。
图2是本发明中采用流式细胞仪定量分析VPA和rAAV2-GFP的药物组合物在RPE细胞株中的表达效率。
图3是本发明中Luciferase Assay定量检测不同浓度的VPA对rAAV2-LUC基因表达水平的作用。
图4 是本发明中采用Westernblot 方法检测rAAV2-GFP联合不同浓度VPA转染RPE细胞的蛋白表达水平,其中,A:采用Westernblot 方法检测rAAV2-GFP联合不同浓度VPA转染RPE细胞的第7天GFP蛋白表达水平,B:Westernblot 方法检测rAAV2-BDNF联合VPA转染原代培养的RGC细胞后不同时间BDNF蛋白表达水平。
图5表明玻璃腔内应用本发明所述的药物组合物后显著降低高眼压视网膜内的TNF-α含量。
图6是本发明中各组大鼠视网膜铺片计数存活RGCs的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中所述的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1丙戊酸钠和携带治疗基因的腺相关病毒载体组合物长期提高治疗基因在视网膜细胞内的表达水平
一、        材料和方法
1、      药物:丙戊酸钠(VPA),sigma公司产品。
     rAAV2-CMV-GFP(rAAV2-GFP)本实验室包装构建
rAAV2-CMV-LUC(rAAV2-LUC)本实验室包装构建
rAAV2-CMV--BDNF(rAAV2-BDNF)本实验室包装构建
 2、细胞
1)    成人视网膜色素上皮(RPE)细胞(APRE-19)为ATCC产品。
2)    成人原代RPE、IPE细胞由本实验室培养。
3)    原代SD大鼠视网膜神经细胞由本实验室培养。
4)    SD大鼠原代视网膜神经节细胞纯化培养由本实验室完成
3、动物:实验动物选用Balb/c小鼠(由中国科学院上海实验动物中心提供)40只,雄性,鼠龄8周,体重20-25g,健康。饲养于本院动物中心。
4、主要材料及试剂:胎牛血清(Gibco公司产品),牛血清白蛋白(BSA, Sigma公司产品),Neurobasal培养基和B27(Gibco公司产品),木瓜蛋白酶和卵粘蛋白(Sigma公司产品),重组神经营养因子BDNF和 CNNF(Invitrogen公司产品),碱性成纤维生长因子bFGF(Invitrogen公司产品),谷氨酰胺(Sigma公司产品),OX-42单克隆抗体、购自Chemicon公司。GFP单克隆抗体购MBL公司。
二、        实验方法
1、      成人眼虹膜色素上皮细胞(IPE)、视网膜色素上皮(RPE)的原代培养、SD大鼠视网膜神经细胞的原代培养
将已消毒的成人眼球,用眼科剪刀沿赤道部巩膜环形剪开,分成两部分。取含有虹膜组织的那部分,直接在眼内用0.25%Try-EDTA消化60分钟,然后放到手术显微镜下面,用虹膜恢复器小心刮取虹膜表面细胞,加入含有15%FBS 的 DMEM/F12培养基(Invitrogen Inc)吹打细胞成细胞悬液;显微镜下计数,以每孔2×105的细胞数量分至6孔板中,在37℃、CO2体积分数为5% 的培养箱内培养,每天观察一次,3天换液一次。
原代培养的成人RPE细胞、原代培养的SD大鼠视网膜神经细胞培养方法如下:SD大鼠眼球用75%酒精消毒,庆大霉素及PBS反复冲洗。然后仔细修剪去除眼球周围的脂肪组织,从赤道部将眼球剪成两部分。弃去含有角膜的部分眼球;另外一部分含有视网膜,小心剪除玻璃体腔中的玻璃体;在解剖镜下将视网膜小心取出放入盛有PBS的刻度离心管中,PBS洗3次,加入一倍体积的0.25%Try-EDTA 37℃消化60分钟。成人RPE细胞直接在眼杯内用0.25%Try-EDTA消化60分钟。然后分别吸出0.25%Try-EDTA后加入含有15%FBS 的 DMEM/F12培养基(Invitrogen Inc)吹打细胞成细胞悬液。显微镜下计数。以每孔2×105的细胞数量分至6孔板中。在37℃、CO2体积分数为5% 的培养箱内培养。每天观察一次。神经细胞7天换液一次,RPE细胞3天换液一次。
hRPE细胞株采用含有10%FCS 的 DMEM/F12培养基(Invitrogen Inc)培养,每天观察一次细胞生长情况,3天换液一次。
2、SD大鼠视网膜神经节细胞纯化培养
SD大鼠眼球清洗、消毒及修剪步骤同前所述。从赤道部将眼球剪成两部分,弃去含有角膜的部分眼球;另外一部分含有视网膜,小心剪除玻璃体腔中的玻璃体;在解剖镜下将视网膜小心取出放入盛有PBS的刻度离心管中,PBS洗3次,加入一倍体积的木瓜蛋白酶消化液 37℃消化30分钟;然后加入含有卵粘蛋白(2mg/ml)、DNase(0.004%)和BSA(1mg/ml)的溶液,并小心吹打成细胞悬液。离心机离心800rpm/5min,细胞沉淀经卵粘蛋白(10mg/ml)和BSA(10mg/ml)溶液冲洗后再次离心,加入磷酸缓冲的0.1% BSA制成细胞悬液。然后将细胞悬液加入到OX-41包被的培养瓶中,室温下放置30min,每隔10min轻轻摇动培养瓶,以确保所有的细胞均与培养瓶包被的部位接触。小心吸取未粘附在培养瓶中的细胞,加入到OX-7包被的离心管中,室温下孵育30min;然后以3ml PBS轻轻冲洗离心管5次,再以Neurobasal培养基冲洗粘附细胞,800rpm/5min离心后,收集纯化的RGC细胞。以Neurobasal培养基重悬,按5000cells/孔(500个/cm2)接种到6孔细胞培养板中。RGC用含有谷氨酰胺(1mM),B27(1:50),BDNF(50ng/ml),CNTF(50ng/ml)的Neurobasal胞培养基、37℃、5%CO2培养箱中培养。
3、丙戊酸钠和携带不同基因的腺相关病毒载体(rAAV2-GFP/rAAV-BDNF/rAAV2-LUC)的药物组合物感染成人RPE细胞、IPE细胞、大鼠视网膜神经细胞和RGCs 
细胞贴壁生长至70%融合时用于实验研究。将rAAV2-GFP或rAAV2- LUC或rAAV2-BDNF单独或联合不同浓度的丙戊酸钠加入细胞培养基中。其中,rAAV2- GFP和rAAV2- LUC为1×10e11-1×10e12病毒颗粒。丙戊酸钠的终浓度分别为1uM,10uM,50uM,100uM,1mM,5mM。被rAAV2- GFP感染的细胞在感染后不同时间点通过倒置荧光显微镜观察GFP荧光表达及细胞形态,并采用流式细胞仪检测GFP阳性细胞率和平均荧光亮度。被rAAV2- LUC感染的细胞通过加入相应的底物后定量检测细胞裂解液的荧光强度,来反映rAAV2的转导效率和外源基因表达水平。在感染后第7天收取细胞蛋白,westernblot方法检测GFP和BDNF的蛋白含量。实验设置2组对照:第1组为细胞培养基中仅加入不同浓度的VPA或TSA,第2组为空白对照。
上述实验重复3次,每次同一条件设立3个复孔。
4、实验动物分组和玻璃体腔注射
健康Balb/c小鼠(18-20g)共10只,雌雄不限,随机分成对照组(1只)和实验组(9只)。 实验组的小鼠每只眼均接受玻璃体腔注射。右眼:rAAV2- LUC 1×109,左眼:rAAV2-LUC1×109联合0.1ug丙戊酸钠。对照组小鼠右眼不注射,左眼注射PBS。注射体积均为2μl/眼。
小鼠称重后以0.1%戊巴比妥钠腹腔麻醉。双眼滴美多丽以充分散瞳,倍诺喜滴眼作角膜表面麻醉;在角膜表面放置一直径约2-3mm的塑料圈,在圈内滴入适量的1%羧甲基纤维素钠模拟前置镜;然后在手术显微镜直视下自角巩膜缘外1mm处直接将微量加样器刺入玻璃体,针头在晶体下方的玻璃体腔内行进约2-3mm,尽量不触及晶体;选择视乳头颞侧2视乳头直径处的玻璃体腔位置推注2μl液体;然后缓慢退出显微加样器,在巩膜表面上留下针孔大小的自闭性隧道。术后用0.1%金霉素眼膏涂双眼,以防止感染和角膜干燥。观察小鼠呼吸情况至其苏醒。
结果显示:
1、  丙戊酸钠和rAAV2-GFP/LUC 的组合物提高GFP/LUC 在体外培养的视网膜细胞的转导效率和表达水平
单独使用rAAV2-GFP感染hRPE细胞株、原代培养的成人RPE细胞、IPE细胞、大鼠视网膜神经细胞和RGCs时,第5天才能观察到GFP绿色荧光表达,使用0.01-5mM 丙戊酸钠和rAAV2-GFP的药物组合物时可以不同程度的提高rAAV2在人RPE细胞系、原代培养的成人RPE细胞、IPE细胞和原代培养的SD大鼠RGCs、视网膜神经细胞内的转导效率和基因表达水平,并且在这个浓度范围内未见细胞凋亡。
如图1所示,荧光显微镜观察GFP荧光直观的反映TSA和VPA在提高rAAV2对视网膜细胞转导及基因表达的作用。此外,通过流式细胞仪定量分析rAAV2-GFP或药物组合物转染hRPE细胞后GFP阳性率和平均荧光亮度,进一步证实药物组合物的作用(见图2)。
进一步定量分析药物组合物中丙戊酸钠的浓度和基因表达水平提高之间是否存在剂量效应关系,采用不同浓度的丙戊酸钠和rAAV2-LUC共同感染hRPE细胞,72小时后采用Luciferase Assay方法检测细胞内荧光强度。
如图3所示,结果表明,VPA的浓度与提高rAAV2基因表达的水平之间存在量效关系,但只是在0.01-1mM VPA范围内,随着药物浓度的增加,基因表达水平逐渐增高,并不是浓度越高,基因表达水平随之无限增高。
2、  westernblot方法证实丙戊酸钠和腺相关病毒载体的药物组合物可以提高腺相关病毒载体介导的外源基因在视网膜细胞内的蛋白表达
Western blot检测rAAV2-GFP/BDNF单独或丙戊酸钠与rAAV2-GFP/BDNF的药物组合物感染视网膜细胞后GFP/BDNF蛋白表达。
如图4所示,结果显示,单独应用rAAV2-GFP/BDNF时,GFP/BDNF阳性条带信号很弱,而应用药物组合物后GFP/BDNF阳性信号增强,条带变宽,蛋白表达量分别提高1.2-7.5倍和1.1-8.4倍。
3、  丙戊酸钠和rAAV2-LUC的药物组合物可以长期提高LUC在小鼠活体视网膜内的基因表达水平
如图5所示,rAAV2-LUC或rAAV2-LUC与丙戊酸钠的药物组合物注射到Balb/c 小鼠玻璃体腔后第1、3、7天,小动物活体成像观察丙戊酸钠和rAAV2-LUC的药物组合物加快并提高LUC在小鼠视网膜的表达水平,并且可使LUC在视网膜细胞内高水平表达长达1年之久。
结果表明,所述的丙戊酸钠和携带外源基因的腺相关病毒载体的药物组合物不仅显著,且能够长期提高外源基因在视网膜细胞内的表达水平,最大限度的发挥了外源基因的作用。
实施例2丙戊酸钠和rAAV2-BDNF的药物组合物对大鼠慢性高眼压RGCs协同增效的挽救作用
一、材料和方法
1、药物:丙戊酸钠(VPA),sigma公司产品。
         rAAV2-BDNF,由本实验室包装构建
2、动物:实验动物选用健康SD大鼠(由中国科学院上海实验动物中心提供),雄性,鼠龄8周,体重180~200g,饲养于本院动物中心(光照12小时,黑暗12小时)。
3、主要材料及试剂
荧光金:Invitrogen公司产品。
OX-42单克隆抗体、 survivin单克隆抗体购自Chemicon公司,Bcl-2单克隆抗体、GFAP多克隆抗体购自Neomarker公司,α-synuclein和catenin单克隆抗体购自R&D公司。
TNF-α免疫酶联反应试剂盒(Elisa)为Invitrogen公司产品。
二、实验方法
1、       SD大鼠慢性高眼压动物模型的制作及分组
大鼠建立模型前早晚各测眼压一次,连续测量1周。10%水合氯醛腹腔麻醉后将大鼠俯卧位固定于手术台上,0.4%倍诺喜眼液行眼表面麻醉,左眼为实验眼,右眼为对照眼。距上方角巩膜缘1-2mm处剪开球结膜,钝性分离筋膜,大鼠眼球颞侧和颞上各有一条浅层静脉,呈Y字型,走行较为笔直。轻轻将静脉分离并9-0无损伤缝线结扎。以近角巩膜缘段血管怒张,远角巩膜缘段血流消失,同时没有出血作为结扎成功的标志。对照眼只分离巩膜外静脉,不作结扎。术后以8-0无损伤医用缝线连续缝合结膜,双眼涂迪可罗眼膏,待大鼠苏醒后放回笼内。术后即刻、术后30 min,l h,12 h,l d,1 wk,2 wk,4 wk,8 wk分别测量各组眼压,测量时间分别为上午10点钟和下午4点钟。并观察术眼的局部表现。大鼠眼压用TONO-PEN测量,每只眼至少测得6个平均值(每个平均值是4次眼压读数的均数),当这些数值的可信区间≥95%时,即作为有效数据用于统计分析。
选取成功建模的60只大鼠随机分成4组:丙戊酸钠组,rAAV2-BDNF组,丙戊酸钠和rAAV2-BDNF药物组合物组,PBS对照组。给药方式为玻璃体腔注射,药物体积为2ul/眼。每组15只大鼠。
2、       大鼠玻璃体腔注射
SD大鼠称重后麻醉用药和步骤同前。双眼滴美多丽以充分散瞳,倍诺喜滴眼作角膜表面麻醉。然后在角膜表面放置一直径约4-5mm的塑料圈,在圈内滴入适量的1%羧甲基纤维素钠模拟前置镜。然后在手术显微镜直视下自角巩膜缘外1mm处直接将微量加样器刺入玻璃体,针头在晶体下方的玻璃体腔内行进约2-3mm,尽量不触及晶体。选择视乳头颞侧2视乳头直径处的玻璃体腔位置推注2μl液体。然后缓慢退出显微加样器,在巩膜表面上留下针孔大小的自闭性隧道。术后用0.1%金霉素眼膏涂双眼,以防止感染和角膜干燥。观察大鼠呼吸情况至其苏醒。
3、给药剂量
丙戊酸钠玻璃体腔给药组的剂量:丙戊酸钠用PBS稀释成终浓度为0.1mM的溶液,每只眼注射量为2ul,相当于生药量是0.34ug/眼。rAAV2-BDNF玻璃体腔给药组的剂量:rAAV2-BDNF是1×10e11病毒颗粒/眼,注射体积为2ul。丙戊酸钠和rAAV2-BDNF药物组合物组玻璃体腔给药的剂量:用PBS将0.34或0.5或1.0ug的丙戊酸钠分别与1×10e11病毒颗粒的rAAV2-BDNF充分混合成终体积为2ul的药物混合液,然后以2ul混合液/ 眼的剂量注射到玻璃体腔内。对照组大鼠玻璃体腔内注射等体积(2ul)的PBS。各组均为一次给药。
4、荧光金逆行标记大鼠RGC
分别取正常和慢性高眼压动物,麻醉方法同前。将大鼠固定在立体定位仪上,常规消毒,沿颅顶正中线切开皮肤,钝性分离组织,暴露颅骨矢状缝和人字缝,30 %双氧水涂抹骨膜,辨认Bregma 点。根据Paxinos大鼠脑立体定位图谱,以Bregma 点为零点,后移6. 3 ±0. 2mm ,旁开1. 40 ±0. 2mm,深度3.50mm定位,分别用牙科电钻造2个直径约1mm 的骨孔。用10μL 微量注射器吸取荧光金(150mg/ml, 溶剂为二甲基酰胺 ),缓慢注入双侧上丘 ,每孔注射5μL,并留针10min 。分层缝合筋膜和皮肤。伤口处涂抹迪可罗眼膏。术毕继续喂养。
5、全视网膜铺片和RGCs 计数 
大鼠麻醉和心脏灌注方法同前所述。取出眼球,剪去眼前节,去除玻璃体,放入4 %多聚甲醛后固定1h ,再移至0.01MPBS,眼科显微镜分离视网膜,在视网膜周边做4处垂直于视盘的切口,使其基本划分为四个大小相近的象限,将视网膜神经纤维层面朝上,平铺于载玻片上,75 %缓冲甘油封片,每个象限中从视网膜边缘至视乳头的平均距离 荧光显微镜下观察并拍照。在每个象限距视乳头约1/ 6 、1/ 2 、5/ 6处各随机选取视野,供12个视野,对每个视野中标记的RGCs 进行计数,求RGCs 密度的平均值 (个/mm2 )。
6、ELISA方法检测各组视网膜中TNF-α含量,western blot方法检测各组视网膜BDNF、Bcl-2、survivin、catenin和α-synuclein表达,以及胶质细胞激活特异性标志物ox-42和GFAP的表达。
三、实验结果
1、丙戊酸钠和rAAV2-BDNF药物组合物显著提高对慢性高眼压SD大鼠RGCs的挽救作用
如图6所示,各组大鼠视网膜铺片计数存活RGCs的结果表明,0.34-1ug丙戊酸钠和rAAV2-CMV-BDNF药物组合物可以显著提高慢性高眼压SD大鼠RGCs的存活数量,铺片上显示大量具有完整形态的RGCs表达绿色荧光;与单独应用丙戊酸钠组和rAAV2-CMV-BDNF组相比较,差异具有统计学意义,其中以第3-8周时差别最为明显(p<0.01)。
2、丙戊酸钠和rAAV2-BDNF药物组合物显著提高对慢性高眼压SD大鼠视网膜BDNF表达水平
玻璃体腔注射后4和8周,分别取各实验组大鼠视网膜,westernblot方法检测BDNF表达水平;结果显示,丙戊酸钠和rAAV2-BDNF药物组合物组视网膜内BDNF含量显著高于rAAV2-BDNF组;所述的丙戊酸钠和rAAV2-BDNF药物组合物玻璃体腔注射后可显著提高慢性高眼压视网膜内外源基因BDNF的表达水平,充分发挥其治疗和保护RGCs的潜力。
3、丙戊酸钠和rAAV2-BDNF药物组合物显著改善慢性高眼压视网膜微环境,有利于充分发挥治疗基因的作用,对RGCs起到协同增效的保护作用
与玻璃体腔内注射rAAV2-BDNF组相比,丙戊酸钠和rAAV2-BDNF药物组合物组视网膜内α-synuclein蛋白的表达上调,该蛋白表达提高可以降低谷氨酸兴奋性毒性,缓解对视网膜神经节细胞的损伤。见图4.  同时,视网膜内OX--42和GFAP蛋白表达降低。见图4。因OX--42和GFAP分别是视网膜胶质细胞激活的特异性标记物,所以该结果提示丙戊酸钠和rAAV-BDNF药物组合物可以抑制青光眼视网膜胶质细胞的过渡激活,从而减少有害物质的释放。此外,我们通过ELISA方法发现,药物组合物还可以有效的降低慢性高眼压视网膜中炎症因子TNF-α的释放。TNF-α在正常视网膜内平均含量为30.4±5.7 ng/mg蛋白,高眼压时显著升高,约为正常的16倍。玻璃腔内应用本发明所述的药物组合物后显著降低高眼压视网膜内的TNF-α含量(如图5所示)。
实验均表明,本发明所述的药物组合物可显著提高青光眼神经保护的疗效,本药物组合物通过其所含的两种药物可同时针对青光眼复杂发病机制和多环节致病因素,对RGCs进行多方位、多靶点治疗和保护,既能使治疗基因在视网膜内长期高水平表达,达到有效的治疗浓度并持续足够的时间,又能改善视网膜微环境,充分发挥治疗基因的作用,起到1+1>2的作用,对青光眼神经保护起到一种协同增效的效果,能有效提高青光眼神经保护疗效。

Claims (7)

1.一种保护青光眼视神经的药物组合物,其特征在于,含有有效剂量的丙戊酸钠和携带治疗基因的腺相关病毒载体,其中:丙戊酸钠的剂量范围为0.1-10μg,携带治疗基因的腺相关病毒载体为1×10e9~1×10e12病毒颗粒;
所述的腺相关病毒载体的血清型是AAV2;
所述的治疗基因选自神经营养因子。
2.按权利要求1所述的保护青光眼视神经的药物组合物,其特征在于,
所述的丙戊酸钠的剂量范围为:0.1-0.5μg,腺相关病毒载体的剂量范围为1×10e11~1×10e12病毒颗粒;
所述的丙戊酸钠与腺相关病毒载体的剂量比例为1μg:1×10e12~5×10e12病毒颗粒。
3.按权利要求1或2所述的保护青光眼视神经的药物组合物,其特征在于,所述的丙戊酸钠和腺相关病毒载体制成复方制剂。
4.按权利要求3所述的保护青光眼视神经的药物组合物,其特征在于,所述的复方制剂的剂型为注射液或注射用粉剂。
5.按权利要求4所述的药物组合物,其特征是给药方式采用局部注射或静脉注射方式。
6.一种制备权利要求1或2中任何一项所述药物组合物的方法,其特征在于将所述丙戊酸钠和腺相关病毒载体与药学上可接受的药用辅料充分混合制成药剂学上可接受的药物制剂。
7.权利要求1或2中任何一项所述药物组合物在制备提高青光眼视神经保护疗效的药物中的用途。
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高凯 等.不同血清型腺相关病毒载体组织表达差异的研究进展.《中国肿瘤生物治疗杂志》.2007,第14卷(第4期),388-392.

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