CN107628981B - 一种肉桂酰基吲哚啉化合物及其制备青光眼药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于眼科疾病治疗药物领域，具体涉及一种肉桂酰基吲哚啉类化合物在制备治疗或改善青光眼病变的药物中的用途。本发明通过体外细胞培养实验和体内动物实验结果表明，一定浓度的肉桂酰基吲哚啉类化合物能促进体外培养的视网膜神经节细胞存活和提高其轴突的延伸能力，促进视网膜神经节细胞存活，以及减轻RGCs的损伤。通过动物模型试验验证其对大鼠闭角型青光眼具有一定的保护作用，进一步，可作为活性成份制备治疗青光眼病变的药物；本发明将对青光眼的临床治疗产生重要的应用价值和良好的社会经济效益。

Description

一种肉桂酰基吲哚啉化合物及其制备青光眼药物的应用

技术领域

本发明涉及一类治疗青光眼的肉桂酰基吲哚啉类化合物，属药物制剂技术领域。

背景技术

青光眼是一种危害全世界人类健康的眼部疾病，所谓“青光”眼之名称，系自古罹患此病者以光线照射可见瞳孔有青色的反光而得名。青光眼发病机制是因房水产生过多或排出受阻，导致眼内压增高，使得视网膜血管受到压迫，进而使视神经萎缩，视网膜缺血，导致视力损害甚至失明。

青光眼可分为先天性、原发性和继发性三型，也可分为闭角型和开角型两种。全球有大约七千万青光眼病患者，其中约一半在亚洲，而中国的青光眼患者接近一千万。世界卫生组织已将青光眼列为第二位致盲眼病，青光眼是我国主要致盲眼病之一。我国青光眼患者中有约55.0％为单眼盲，约18.1％为双眼盲。随着角膜白内障手术的广泛开展和感染性致盲眼疾的不断减少，青光眼所致失明人数的比例还将逐渐增加，青光眼病日益引起人们的广泛关注。降低眼内压是目前临床唯一证实较为有效的途径。治疗可通过两种途径：药物和手术。抗青光眼的药物主要通过减少房水生成和促进房水排出两种机制降低眼内压。目前临床情况是：手术治标不治本，痛苦大易复发，而药物治疗损伤小，但是治疗效果欠佳。

寻找和研究疗效好、副作用小的抗青光眼药物，对青光眼病的防治具有重要的现实意义，本发明人经过多年的临床前药物筛选，制备并获得了一系列具有肉桂酰基吲哚啉类结构的化合物，经动物实验研究，发现其具有良好的治疗青光眼作用，可作为候选药物进一步开发，具有广阔的应用前景。

发明内容

鉴于以上现有技术的缺陷，本发明的技术方案如下：一种治疗青光眼和控制眼内压的肉桂酰基吲哚啉类化合物，其结构通式如下：

其中R选自H，卤素，烷基，烷氧基，三氟甲基，三氟甲氧基，硝基，氰基，芳香基和杂环基。

优选地，选自下面的化合物：

本发明的一种肉桂酰基吲哚啉类化合物的制备方法，包括如下步骤：

第一步、以肉桂酸为起始原料，在第一溶剂和酰化剂条件下，得肉桂酸酰氯化合物；

第二步、肉桂酸酰氯化合物在第二溶剂和碱性条件下与吲哚啉反应，得到相应的肉桂酰吲哚啉类化合物；

其反应方程式如下：

进一步，本发明的一种优选方案为：所述的第一步中：第一溶剂为：四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、C3-8脂肪酮、苯、甲苯、乙腈或C1-8烷烃，优选溶剂为二氯甲烷或甲苯；

酰化剂为：二氯亚砜或草酰氯，优选酰化剂为二氯亚砜；

肉桂酸：酰化剂的摩尔投料比为1.0：1.0～10.0，优选摩尔投料比为1.0：1.0～5.0；

反应温度为25～150℃，优选反应温度为25～100℃；

反应时间为1～20小时，优选反应时间为1～10小时。

进一步地，本发明的一种优选方案为：所述的第二步中：碱性条件所用碱为：碱金属或碱土金属碳酸盐、碱金属或碱土金属碳酸氢盐、C1-8醇的碱金属盐、三乙胺、三丁胺、三辛胺、吡啶、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、三乙烯二胺和四丁基氢氧化铵一种或者一种以上的混合物，优选碱为碳酸氢钾、碳酸氢钠和三乙胺一种或者一种以上的混合物；

第二溶剂为乙醚、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、C3-8脂肪酮、苯、甲苯、乙腈和C5-8烷烃一种或一种以上的混合物，优选反应溶剂为二氯甲烷、甲苯、乙腈和氯仿一种或者一种以上的混合物；肉桂酰氯化合物：吲哚啉：碱的摩尔投料比为1.0:1.0～10.0:1.0～10.0，优选摩尔投料比为1.0:1.0～5.0:1.0～5.0；反应温度为25～150℃，优选反应温度为25～100℃；反应时间为1～72小时，优选反应时间为1～24小时。

上式化合物或其可药用盐可以制备成经局部给药，胃肠道给药或是非胃肠道给药的各种制剂。所述制剂包括普通制剂、控释制剂、靶向制剂等。所述的局部给药制剂为经过眼部给药的粉针剂、水针剂、微球制剂、纳米制剂、脂质体制剂、树枝状高分子制剂、聚乙二醇修饰制剂、水凝胶制剂等。所述的非胃肠道给药制剂为适宜静脉注射、肌肉注射、皮下注射、骨髓注射、透皮给药、粘膜给药以及吸入给药的剂型。

本发明也公开了一种药物组合物包括治疗有效量的肉桂酰吲哚啉类化合物，该药物组合物可进一步含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。所述“治疗有效量”是指引起研究者或医生所针对的组织、系统或动物的生物或医药反应的药物或药剂的量；所述“组合物”是指通过将一种以上物质或组份混合而成的产品；所述“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的物质、组合物或载体，如：液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊物质，它们携带或转运某种化学物质。本发明所提供的药物组合物其理想的比例是，肉桂酰吲哚啉类化合物作为活性成分占总重量比10％～99.5％，其余部分为占总重量比90％以下。

本发明人研究发现此类化合物可有效缓解青光眼症状，从药效学实验的结果看，此类化合物的效果优于目前临床应用的药物。此新化合物的开发将对青光眼的群体的恢复起到很大作用，对于解除病患和其家庭的痛苦具有重大的意义。

具体实施方式

下面将结合本发明具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1-11

一种肉桂酰基吲哚啉类化合物的制备方法，包括以下步骤：

第一步、在反应瓶中加入肉桂酸、第一溶剂、催化量DMF和酰化剂，催化剂的加入量为肉桂酸重量的0.05％，升温回流搅拌反应，减压蒸除溶剂，得肉桂酸酰氯化合物；

第二步、将上述肉桂酸酰氯化合物全部溶于第二溶剂中，加入碱性条件所用碱和乙醇，搅拌反应，反应进程用TLC跟踪；反应结束后，减压蒸除溶剂，残余物中加入第二溶剂，依次用饱和碳酸钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层经无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸除溶剂，残余物经柱层析纯化(洗脱液：氯仿)，得相应的肉桂酰吲哚啉类化合物，其化学结构均经¹H-NMR和ESI-MS确证。

表1第一步工艺条件和结果

由表1可知工艺条件对产物的收率具有严重的影响，选择合适的工艺条件对产物收率具有重要的意思。由表1可知第一溶剂采用二氯甲烷：甲苯的体积比2:1，酰化剂采用二氯亚砜，摩尔投料比为1:3，反应温度为80℃，反应时间为8h的条件下，收率为91.7％，收率很高。

表2第二步工艺条件和结果

由表2可知工艺条件对产物的收率具有严重的影响，选择合适的工艺条件对产物收率具有重要的影响。当第二溶剂采用二氯甲烷：甲苯＝2:1，碱性条件所用碱为碳酸氢钠：吡啶为2:1，摩尔投料比为1:1:2，反应温度为40℃，反应时间为10h的条件下，收率为86.9％，收率最高。

实施例12-17

具体工艺条件与实施例1-11相同，区别在于考察不同取代基，具体取代基见表3，所得肉桂酰吲哚啉类化合物，其化学结构均经¹H-NMR和ESI-MS确证。

表3不同取代基实验

以下示出本发明中使用的代表性制剂例。

实施例18

滴眼剂的制备步骤如下：

在灭菌精制水中加入2.5g浓甘油和200mg聚山梨醇酯80后，加入实施例12的化合物10mg并溶解，用灭菌精制水使总量达到100mL，用膜滤器灭菌过滤后，填充到规定的容器中，制得滴眼液。

与上述方法同样操作，可以制备100mL中含有5mg、25mg、100mg实施例12的化合物的滴眼剂等。另外，可以使用本发明其它的肉桂酰吲哚啉类化合物来代替实施例12的化合物得到相应的滴眼剂。

实施例19

粉针剂的制备步骤如下：

①甘露醇、磷脂、甘油、环糊精衍生物、二甲基亚砜和泊洛沙姆共50mg和800mg实施例12化合物在注射用水中混合并使之溶解；

②混匀溶解后待稳定后先用0.45um微孔滤膜粗滤，再用0.2um微孔滤膜过滤；

③分装入小西林瓶，加入其他冻干治疗剂和辅料；

④进行程序性冻干；

⑤进行热原、无菌、可见异物、不溶性微粒等相应检查，均符合要求后待用。

与上述方法同样操作，可以使用本发明其它的肉桂酰吲哚啉类化合物来代替实施例12的化合物制备得到粉针剂。

实施例20

滴丸的制备方法如下：

称取聚乙二醇6000 245g水浴(80℃)加热煮熔，加入实施例12药物组合为11g，充分搅拌均匀，以液体石蜡为冷却剂，置玻璃管(4*8cm)中，冷却温度为5℃，滴口内外径为7.0/2.0(mm/mm)，滴口距液面为2.2cm，滴速以每分钟35滴为最佳，用棉布吸干滴丸表面的冷凝剂，即得到药物组合物滴丸。

与上述方法同样操作，可以使用本发明其它的肉桂酰吲哚啉类化合物来代替实施例12的化合物制备得到滴丸剂。

实施例21

检测实施例12的化合物能否促进体外培养的成年SD大鼠视网膜神经节细胞的存活及其轴突生长

一、材料和方法

1、药物：实施例12的化合物，自制并经结构确认。

2、动物：实验动物选用健康SD大鼠，雄性，鼠龄8周，体重180～200g，饲养于本院动物中心。

3、主要材料及试剂：胎牛血清(Gibco公司产品)，牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司产品)，Neurobasal培养基和B27(Gibco公司产品)，木瓜蛋白酶和卵粘蛋白(Sigma公司产品)，重组神经营养因子BDNF和CNNF(Invitrogen公司产品)，碱性成纤维生长因子bFGF(Invitrogen公司产品)，谷氨酰胺(Sigma公司产品)，OX-42单克隆抗体、survivin单克隆抗体、Bcl-2单克隆抗体购自Chemicon公司，GFAP多克隆抗体购自Neomarker公司，catenin单克隆抗体购自R&D公司。

4、SD大鼠视网膜神经节细胞纯化培养

SD大鼠眼球常规处理，取视网膜放入盛有PBS的刻度离心管中，PBS洗3次，加入一倍体积的木瓜蛋白酶消化液37℃消化30分钟后，加入含有卵粘蛋白(2mg/ml)、DNase(0.004％)和BSA(1mg/ml)的溶液，吹打成细胞悬液，离心800rpm/5min，细胞沉淀经卵粘蛋白(10mg/ml)和BSA(10mg/ml)溶液冲洗后再离心，加入磷酸缓冲的0.1％BSA制成细胞悬液；然后将细胞悬液加入到OX-41包被的培养瓶中，室温下放置30min，每隔10min轻轻摇动培养瓶，以确保所有的细胞均与培养瓶包被的部位接触；小心吸取未粘附在培养瓶中的细胞，加入到OX-7包被的离心管中，室温下孵育30min后，以3ml PBS轻轻冲洗离心管5次，再以Neurobasal培养基冲洗粘附细胞，800rpm/5min离心后，收集纯化的RGC细胞；Neurobasal培养基重悬，按5000cells/孔(500个/cm2)接种到6孔细胞培养板中；RGC用含有谷氨酰胺(1mM)，B27(1:50)，BDNF(50ng/ml)，CNTF(50ng/ml)的Neurobasal胞培养基、37℃、5％CO2培养箱中培养。

5、对体外培养的RGCs细胞的作用

实施例12化合物浓度分别为:1uM，10uM，50uM，100uM，1mM，纯化的RGC于原代培养24小时后，在培养基中分别加入上述不同浓度的实施例12化合物，PBS作为阴性对照。于加入后1d、2d、3d、5d、7d倒置相差显微镜观察并记录RGC的形态、数量和轴突的数量、长度(每个视野选取5个细胞测量)；Westernblot和Real-time PCR方法检测RGCs中与细胞存活相关的基因Bcl-2、survivin的蛋白和mRNA表达。

结果显示：

1、实施例12化合物能促进体外培养的RGCs存活及其轴突生长。当培养基中加入浓度为1μM或10μM的实施例12化合物时，实验组和空白对照组中节细胞数量和轴突长度未见显著差异(P>0.05)。当加入的浓度为50μM、100μM或1mM，节细胞存活数量显著增加，轴突生长速度快，长度增长。其中以浓度为100μM时效果最明显。第3天和第7天观察，当培养基中加入100μM时节细胞数量分别为302±63(n＝24，P<0.01)和389±47(n＝24，P<0.01)；轴突平均长度(μm)为68.4±13.1(P<0.01)、114.6±23.5(P<0.01)；平均轴突生长速率为18.6±5.2(P<0.01)。

2、实施例12化合物提高体外培养RGCs中与存活相关的蛋白Bcl-2和survivin表达

采用Western blot和real-time方法检测了培养基中加入实施例12化合物后1d、2d、3d和7d时RGCs中与存活相关的Bcl-2，survivin、catenin、hsp70和BAX的蛋白和mRNA表达，结果表明，实施例12化合物可以分别提高存活基因的蛋白和mRNA表达水平，降低促进凋亡的BAX基因和蛋白表达。

上述实验结果表明，一定浓度的实施例12化合物可以促进体外培养的RGCs存活，同时也能提高其轴突的延伸能力，其机制可能跟直接上调与细胞存活相关的基因和蛋白表达有关，如Bcl-2、survivin、catenin。

实施例22

实施例12-17化合物对大鼠闭角型青光眼的保护作用

一、实验动物及分组

实验采用成年雄性Wistar大鼠，体重200g-250g。造模前，将动物随机分组：即正常白对照组、模型组、实施例12-17的化合物的口服药组、阳性药组毛果芸香碱滴眼液以及口服阳性对照药组多佐胺。所有药物均在造模后第1，4，7，10天给药，阳性药毛果芸香碱滴眼液组滴眼给药，口服对照药多佐胺采取口服。

二、动物模型的建立

大鼠于实验前腹腔注射4％水合氯醛(200mg.kg^-1)，然后1％利多卡因局部麻醉大鼠角膜。高眼内压(IOP)期间，每隔半小时腹腔注射4％水合氯醛0.1-0.2毫升使动物保持麻醉状态。采用滑轮-缝线系统使大鼠右眼眼内压(IOP)升高，左侧眼球做对照。将70厘米外科缝线两端各系一相同重量祛码，缝线中间系一圆圈用于环绕大鼠眼角巩膜缘后2毫米，两端的祛码通过分别一组滑轮对大鼠眼睛持续稳定施压。砝码施压为15克，持续压力6小时，则造成大鼠闭角型青光眼模型。饲养至第14天处死，观察视乳头周围视网膜各层厚度改变。

三、实验结果

模型组与正常对照组相比，视网膜全层厚度、内层厚度均变薄，显示造模成功，药物组(实施例12-17的化合物)与模型组比较，药物组能明显改善由视网膜内层变薄导致的视网膜全层变薄，其中药物组(实施例12-17的化合物)效果好于阳性药组，详见下表。视网膜内层的供血依靠视网膜中央动脉，细胞代谢旺盛，这使该区域的细胞和视网膜外层相比更容易受到损伤，而药物(实施例12-17的化合物)各个组的药物可以明显改善其病理改变，所以药物(实施例12-17的化合物)对闭角型青光眼能起到非常好的保护作用，且治疗作用效果均较阳性药组好。

表4药物对闭角型青光眼大鼠视网膜的影响

组别	全层厚度(μm)	内层厚度(μm)
			正常对照组	215.3±1.1	92.2±0.5
模型组	169.3±3.3	64.2±1.6
			实施例12化合物	202.4±2.6	86.4±1.5
实施例13化合物	206.5±2.3	84.6±1.3
			实施例14化合物	203.9±4.7	83.2±1.3
实施例15化合物	201.5±4.7	82.3±1.3
			实施例16化合物	193.8±4.7	81.3±1.3
实施例17化合物	203.3±4.7	85.3±1.3
			阳性药组	183.8±3.8	75.8±1.4
口服对照药组	181.3±3.3	74.9±1.6

综合上述实验结果得出结论：实施例12-17制备的药物均可以明显降低眼压防治青光眼，缓解青光眼衍生眼部疾病的症状，起到较好的治疗作用，其治疗效果明显好于目前临床效果相对较好的药物。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种治疗青光眼和控制眼内压的肉桂酰基吲哚啉类化合物，其特征在于所述化合物具有下列结构：

2.一种如权利要求1所述的肉桂酰基吲哚啉类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

其中R选自权利要求1中相应化合物上的对应取代基；

第一步、以肉桂酸为起始原料，在第一溶剂和酰化剂条件下，得肉桂酸酰氯化合物；

第二步、肉桂酸酰氯化合物在第二溶剂和碱性条件下与取代的吲哚啉反应，得到相应的肉桂酰基吲哚啉类化合物。

3.根据权利要求2所述的肉桂酰基吲哚啉类化合物的制备方法，其特征在于所述的第一步中：第一溶剂为二氯甲烷或甲苯；酰化剂为：二氯亚砜或草酰氯；肉桂酸：酰化剂的投料摩尔比为1.0：1.0～5.0；反应温度为25～100℃；反应时间为1～10小时。

4.根据权利要求2所述的肉桂酰基吲哚啉类化合物的制备方法，其特征在于所述的第二步中碱性条件所用碱为碳酸氢钾、碳酸氢钠和三乙胺一种或者一种以上的混合物；第二溶剂为二氯甲烷、甲苯、乙腈和氯仿中的一种或者一种以上的混合物；肉桂酸：酰氯化合物：取代的吲哚啉：碱的摩尔投料比为1.0:1.0～5.0:1.0～5.0；反应温度为25～100℃；反应时间为1～24小时。

5.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物的主要成分为权利要求1所述的化合物中的一种或多种，用作制备治疗青光眼或降低眼内压的药物使用。

6.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于该药物组合物用作普通制剂、控释制剂、靶向制剂。

7.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于所述化合物制备成经胃肠道给药或是非胃肠道给药的各种制剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于所述制剂包括滴眼剂、胶囊剂、片剂、粉针剂、滴丸。

9.权利要求1所述化合物在制备治疗青光眼的药物中的用途。