CN105408315B - 激酶抑制剂 - Google Patents

激酶抑制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN105408315B
CN105408315B CN201480031577.7A CN201480031577A CN105408315B CN 105408315 B CN105408315 B CN 105408315B CN 201480031577 A CN201480031577 A CN 201480031577A CN 105408315 B CN105408315 B CN 105408315B
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
formula
cell
added
pharmaceutically acceptable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201480031577.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105408315A (zh
Inventor
M.C.T.法伊夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ausula Acquisition Ltd
Original Assignee
Respivert Ltd
TopiVert Pharma Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB201305945A external-priority patent/GB201305945D0/en
Priority claimed from GBGB1322678.2A external-priority patent/GB201322678D0/en
Priority claimed from GB201402647A external-priority patent/GB201402647D0/en
Application filed by Respivert Ltd, TopiVert Pharma Ltd filed Critical Respivert Ltd
Publication of CN105408315A publication Critical patent/CN105408315A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105408315B publication Critical patent/CN105408315B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C317/00—Sulfones; Sulfoxides
    • C07C317/44—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C317/48—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/444—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring heteroatom, e.g. amrinone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
    • A61K31/541—Non-condensed thiazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/553—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having at least one nitrogen and one oxygen as ring hetero atoms, e.g. loxapine, staurosporine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/02—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C311/08—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C317/00—Sulfones; Sulfoxides
    • C07C317/26—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C317/28—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton with sulfone or sulfoxide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/80—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/84—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/86—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/72—Nitrogen atoms
    • C07D213/74—Amino or imino radicals substituted by hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/66—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D233/90—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/47—One nitrogen atom and one oxygen or sulfur atom, e.g. cytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Abstract

提供式(I)的化合物，所述化合物具有抗炎活性(例如通过抑制以下家族的一个或多个成员：p38促分裂原活化蛋白激酶家族；Syk激酶；和酪氨酸激酶的Src家族的成员，例如Src和Lck)和具有治疗用途，包括在药物组合中的用途，特别是在治疗炎性疾病(包括肺、眼和肠的炎性疾病)中的用途。

Description

激酶抑制剂
本发明尤其涉及作为抗炎剂的化合物(例如，通过抑制以下家族的一个或多个成员：p38促分裂原活化蛋白激酶家族(在本文中称为p38 MAP激酶抑制剂)，例如其α激酶亚型；Syk激酶；和酪氨酸激酶的Src家族)。本发明还涉及这样的化合物在疗法中的用途，包括在单一疗法和组合疗法中的用途，尤其是在治疗炎性疾病中的用途，所述炎性疾病包括肺(例如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD))、眼(例如葡萄膜炎和干燥性角结膜炎(干眼))和胃肠道(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)的炎性疾病。
本说明书中明显在先公布的资料的列表或论述不应必然被认为承认所述资料是现有技术的一部分，或者是共知常识。
已鉴定了四种p38 MAPK同种型(分别为α、β、γ和δ)，各自显示不同的组织表达模式。发现p38 MAPK α和β同种型普遍存在于整个身体中，存在于许多不同的细胞类型，和受许多先前描述的小分子量化合物抑制。由于这些同种型的广泛的组织分布(其导致所述化合物的脱靶作用)所致，早期类型的抑制剂是高度毒性的。一些更近期鉴定的抑制剂显示对p38 MAPK α和β同种型改进的选择性和具有更宽的安全限度。
认为p38 MAP激酶在许多信号转导途径中起关键作用，所述信号转导途径参与引发和维持人类疾病的慢性、持续性炎症，所述疾病例如严重哮喘、COPD和炎性肠病(IBD)。目前有大量文献证实，p38 MAP激酶被许多促炎细胞因子活化，并且其活化导致更多促炎细胞因子的募集和释放。事实上，来自一些临床研究的数据证实在用p38 MAP激酶抑制剂治疗期间患者的疾病活动的有益改变。例如，Smith描述了p38 MAP激酶抑制剂对TNFα (而不是IL-8)从人PBMC释放的抑制作用(Smith, S. J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149:393-404)。
还提出了p38 MAP激酶抑制剂在治疗COPD和IBD中的用途。靶向p38 MAPKα/β的小分子抑制剂已证明在以下中有效减少炎症的各种参数：
- 获自COPD患者的细胞和组织，所述患者通常是皮质类固醇不敏感的(Smith, S.J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149:393-404)；
- 来自IBD患者的活检(Docena, G.等, J. Trans. Immunol., 2010, 162:108-115)；和
- 体内动物模型(Underwood, D. C.等, Am. J. Physiol., 2000, 279:L895-902; Nath, P.等, Eur. J. Pharmacol., 2006, 544:160-167)。
Irusen和其同事还提示了p38 MAPKα/β通过降低细胞核中的糖皮质激素受体(GR)的结合亲和力而参与皮质类固醇不敏感性的可能性(Irusen, E.等, J. Allergy Clin. Immunol., 2002, 109:649-657)。已描述了用许多p38 MAP激酶抑制剂(包括AMG548、BIRB796、VX702、SCIO469和SCIO323)对炎性疾病的临床研究(Lee, M. R.和Dominguez, C.,Current Med. Chem., 2005, 12:2979-2994.)。然而，妨碍p38 MAP激酶抑制剂在治疗人类慢性炎性疾病中的效用的主要障碍是在患者中观察到的毒性。其足够严重而导致已进行的许多化合物(包括上文具体提到的那些)从临床开发中撤出。
COPD是这样的病况，其中据报道，基础炎症显著抵抗吸入的皮质类固醇的抗-炎性作用。因此，治疗COPD的较好的策略是开发同时具有内在抗-炎性作用和增加COPD患者的肺组织对吸入的皮质类固醇的敏感性的能力的干预。Mercado等的近期出版物(2007;American Thoracic Society Abstract A56)证实，沉默p38 MAPK γ具有恢复对皮质类固醇的敏感性的潜力。因此，在使用p38 MAP激酶抑制剂以治疗COPD时，可存在对患者的双重益处。
诊断患有哮喘或COPD的许多患者持续遭受不受控制的症状和其医学病况的恶化，可能导致住院。尽管使用最先进的目前可用的治疗方案(包括吸入皮质类固醇和长效β-激动剂的组合产品)，但这仍发生。在过去十年中积累的数据表明，未能有效管控肺中疾病的基础炎性组分是发生恶化的最可能的原因。鉴于皮质类固醇和特别是吸入皮质类固醇作为治疗哮喘中的抗炎剂的确立的功效，这些发现引起强烈的研究。得到的研究结果确定，一些环境刺激引起患者的肺中的皮质类固醇-不敏感的炎性改变。实例是自病毒介导的上呼吸道感染(URTI)产生的应答，其在增加与哮喘和COPD相关的发病率中具有特殊的意义。
先前已经公开了抑制c-Src和Syk激酶两者的活性的化合物是抗鼻病毒复制的有效作用剂(Charron, C.E.等, WO 2011/158042)，和抑制p59-HCK的化合物有效对抗流感病毒复制(Charron, C.E.等, WO 2011/070369)。与p38 MAPK的抑制一起，这些是意欲治疗慢性呼吸疾病的患者的化合物所具有的特别有吸引力的性质。
某些p38 MAPK抑制剂还描述为呼吸道合胞病毒的复制的抑制剂(Cass L.等, WO2011/158039)。
IBD的准确病因学是不确定的，但认为受相互作用以促进针对腔内微生物群组分的过度但弱控制的粘膜炎性应答的遗传和环境因素的支配。该应答通过来自外周的炎性嗜中性粒细胞、树突细胞和T-细胞的浸润介导。因为其在炎性细胞中普遍存在的表达，p38已成为IBD模型的明显的研究靶标。在IBD的动物模型和来自IBD患者的人活检中研究p38抑制剂的功效的结果表明，p38可能是用于治疗IBD的靶标(Hove, T. ten等, Gut, 2002,50:507-512, Docena, G.等, J. Trans. Immunol,.2010, 162:108-115)。然而，这些发现与报告用p38抑制剂没有作用的其它组不完全一致(Malamut G.等, Dig. Dis. Sci, 2006,51:1443-1453)。在克罗恩患者中使用p38 α抑制剂BIRB796的临床研究证实具有C-反应蛋白水平改善的潜在临床益处。然而该改善是暂时的，第8周时返回基线(Schreiber, S.等, Clin. Gastro. Hepatology, 2006, 4:325-334)。在严重克罗恩病的患者中研究CNI-1493(一种p38和Jnk抑制剂)的功效的小型临床研究显示在8周期间临床评分的显著改善(Hommes, D.等 Gastroenterology. 2002 122:7-14)。
已知T细胞在介导胃肠道的炎症中起重要作用。Powrie和其同事的先驱工作证实，幼稚CD4+细胞转移至严重缺乏免疫力的免疫缺陷(SCID)动物中导致发生依赖于共生细菌的存在的结肠炎(Powrie F.等 Int Immunol. 1993 5:1461-71)。此外，来自IBD患者的粘膜的研究显示CD4+细胞的增量调节，所述细胞为Th1 (IFNγ/IL-2)或Th2 (IL5/ TGFβ)偏好的，这取决于患者患有克罗恩病还是溃疡性结肠炎(Fuss IJ.等 J Immunol. 1996 157:1261-70.)。类似地，已知T细胞在眼的炎性病症中起重要作用，数个研究结果报告了在贝切特(BeÇhets)患者的血清中T细胞相关细胞因子(IL-17和IL-23)的水平增加(Chi W.等Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 49:3058-64)。支持这些观察结果，Direskeneli和其同事证实，在贝切特患者的外周血中Th17细胞增加和Treg细胞减少(Direskeneli H.等 JAllergy Clin Immunol. 2011 128:665-6)。
一种抑制T细胞活化的方法是靶向参与T细胞受体信号转导复合物的活化的激酶。已知Syk和Src家族激酶在该途径中起重要作用，其中Src家族激酶Fyn和Lck是在T细胞受体下游待活化的第一个信号转导分子(Barber EK.等 PNAS 1989, 86:3277-81)。它们启动T细胞受体的酪氨酸磷酸化，导致Syk家族激酶ZAP-70的募集。动物研究显示，ZAP-70敲除产生SCID表型(Chan AC.等 Science. 1994, 10;264(5165):1599-601)。
用Syk抑制剂Fostamatinib的类风湿性关节炎患者的临床试验证实Syk作为抗炎靶标的潜力，其中患者显示临床结果改善和IL-6和MMP-3的血清水平降低(Weinblatt ME.等Arthritis Rheum. 2008 58:3309-18)。Syk激酶在造血系统的细胞中广泛表达，最显著是在B细胞和成熟T细胞中。通过与基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)相互作用，它在调节T细胞和B细胞扩大以及在炎性细胞中介导免疫-受体信号转导中起重要作用。Syk活化导致IL-6和MMP释放 – 通常发现在炎性病症包括IBD和类风湿性关节炎中增量调节的炎性介质(Wang YD.等World J Gastroenterol 2007; 13: 5926-5932, Litinsky I等Cytokine. 2006 Jan 33:106-10)。
除了在控制促-炎性途径的活性的细胞信号转导事件中起重要作用之外，目前还认识到，激酶调节多种细胞功能的活性，包括DNA完整性的保持(Shilo, Y. Nature Reviews Cancer, 2003, 3: 155-168)和细胞分裂的复杂过程的共协调。事实上，已发现某些激酶抑制剂(所谓的“Olaharski激酶”)改变体外微核形成的频率(Olaharski, A. J.等, PLoS Comput. Biol., 2009, 5(7), e1000446; doi: 10.1371/journal.pcbi.1000446)。微核形成涉及有丝分裂过程的中断或与之相关，因此是不合需要的。发现糖原合酶激酶3α(GSK3α)的抑制是特别重要的因素，其增加激酶抑制剂促进微核形成的可能性。此外，已报道用RNAi抑制激酶GSK3β促进微核形成(Tighe, A.等, BMC Cell Biology, 2007, 8:34)。
尽管有可能通过将剂量最优化和/或通过改变分子的给药途径来减弱Olaharski激酶例如GSK3α的抑制的不良作用，但鉴定其它在治疗上有用的分子将是有利的，所述分子具有低的或可忽略的Olaharski激酶例如GSK 3α的抑制和/或具有低的或可忽略的有丝分裂过程的中断(例如，在有丝分裂测定法中所测量)。
公开了抑制一种或多种激酶的多种化合物，包括脲衍生物。这样的化合物的实例可见于WO 99/23091、WO 00/041698、WO 00/043384、WO 00/055139、WO 01/36403、WO 01/04115、WO 02/083628、WO 02/083642、WO 02/092576、WO 02/096876、WO 2003/005999、WO2003/068223、WO 2003/068228、WO 2003/072569、WO 2004/014870、WO 2004/113352、WO2005/005396、WO 2005/018624、WO 2005/023761、WO 2005/044825、WO 2006/015775、WO2006/043090、WO 2007/004749和WO 2007/053394。其它实例可见于在以下中公开的论文：
- Curr. Opin. Drug Devel. (2004, 7(5), 600-616)；
- J. Med. Chem. (2007, 50, 4016-4026; 2009, 52, 3881-3891；和2010, 53,5639-5655)；
- Bioorg. Med. Chem. Lett. (2007, 17, 354–357; 2008, 18, 3251-3255；2009, 19, 2386-2391；和2010, 20, 4819-4824)；
- Curr. Top. Med. Chem. (2008, 8, 1452-1467)；
- Bioorg. Med. Chem. (2010, 18, 5738-5748)；
- Eur. J. Pharmacol. (2010, 632, 93-102)和
- J. Chem. Inf. Model. (2011, 51, 115-129)。
尽管如此，对鉴定和开发新的激酶抑制剂仍存在需要，特别是适合治疗炎症的替代的p38 MAP激酶抑制剂。尤其需要这样的抑制剂，其相对于目前可用的治疗具有改进的治疗潜力，或者具体而言，其显示优良的治疗指数(例如，至少同样有效的抑制剂，和在一个或多个方面，与之前的药剂相比在相关治疗剂量下具有更少毒性的抑制剂)。
出人意料的是，目前我们发现苯胺-取代的二芳基脲抑制p38 MAP激酶、Syk和Src家族激酶中的一种或多种，因此具有良好的抗-炎性质。
因此，根据本发明的第一方面，提供式I的化合物，
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，
所述化合物在下文中可称为"本发明的化合物"。
可提及的药学上可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。这样的盐可通过常规方式形成，例如通过将式I的化合物的游离酸或游离碱形式与一个或多个当量的合适的酸或碱任选地在溶剂中或在介质中(其中所述盐为不溶的)反应，接着使用标准技术(例如在真空中、通过冷冻干燥或通过过滤)除去所述溶剂或所述介质。盐还可通过交换呈盐形式的式I的化合物的反荷离子为另一反荷离子，例如使用合适的离子交换树脂制备。
药学上可接受的盐的实例包括源自无机酸和有机酸的酸加成盐，和源自金属的盐。
为避免疑惑，式I的化合物可含有呈任一种其天然或非天然同位素形式的规定的原子。在该方面，可提及的本发明的实施方案包括这样的实施方案，其中：
(a) 关于式I的化合物的任何原子，所述化合物不是同位素富集或标记的；和
(b) 关于式I的化合物的一个或多个原子，所述化合物是同位素富集或标记的。
本文对"同位素衍生物"的提及，涉及这两个实施方案的第二个。在本发明的具体的实施方案中，式I的化合物是用一种或多种稳定同位素进行同位素富集或标记的(关于化合物的一个或多个原子)。因此，可提及的本发明的化合物包括，例如用一个或多个原子例如氘等进行同位素富集或标记的式I的化合物。
式I的化合物可显示互变异构现象。所有互变异构形式和其混合物包括在本发明的范围内。
式I的化合物具有名称3-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-5-乙炔基-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺。然而，其也可称为3-[[4-[[4-[[5-叔丁基-3-(甲烷磺酰胺基)-2-甲氧基-苯基]氨基甲酰基氨基]-1-萘基]氧基]-嘧啶-2-基]氨基]-5-乙炔基-N-[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基]苯甲酰胺。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及3-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-5-乙炔基-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺。
式I的化合物的盐的实例包括所有药学上可接受的盐，例如而不限于，强无机酸的酸加成盐例如HCl和HBr盐，和强有机酸例如甲磺酸的加成盐。
本文对本发明的化合物(式I的化合物)的提及意欲包括提及所述化合物和所述化合物的所有药学上可接受的盐、溶剂合物和/或互变异构体，除非上下文明确另外说明。在该方面，可提及的溶剂合物包括水合物。
本发明的化合物(式I的化合物)是p38 MAP激酶(尤其是α亚型)、Syk激酶和Src家族激酶，例如Src和Lck的抑制剂，因此可用于医学，特别是用于治疗炎性疾病。因此，可提及的本发明的进一步的方面包括以下内容。
(a) 药物制剂，包含与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的前文定义的式I的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物。
(b) 组合产品，包含
(A) 前文定义的式I的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，和
(B) 另一治疗剂，
其中组分(A)和(B)各自与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合配制。
在本发明的该方面，组合产品可以是单一(组合)药物制剂或分部药盒(kit ofparts)。
因此，本发明的该方面包括药物制剂，其包含与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的前文定义的式I的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物和另一治疗剂(所述制剂在下文称为“组合制剂”)。
还包括分部药盒，其包含以下组分：
(i) 药物制剂，包含与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的前文定义的式I的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物；和
(ii) 药物制剂，包含与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的另一治疗剂，
所述组分(i)和(ii)各自以合适于彼此联合给予的形式提供。
因此，分部药盒的组分(i)是上文与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的组分(A)。类似地，组分(ii)是上文与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体混合的组分(B)。
(c) 用于制备上文方面(a)的药物制剂的方法，所述方法包括混合前文定义的式I的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物与药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体的步骤。
可提及的本发明该方面的实施方案包括这样的实施方案，其中药学上可接受的辅剂、稀释剂或载体是局部可接受的辅剂、稀释剂或载体(和/或其中所述方法用于制备局部药物制剂，即适合于局部给予的药物制剂)。
(d) 前文定义的式I的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，其用于医学用途(或用作药物或药剂)。
(e) 前文定义的式I的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品，其用于治疗或预防炎性疾病。
(f) 前文定义的式I的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或
关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品，
在制备用于治疗或预防炎性疾病的药物中的用途。
(g) 治疗或预防炎性疾病的方法，所述方法包括给予受试者有效量的
前文定义的式I的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或者
关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品。
(h) 敏化受试者对皮质类固醇的抗炎性作用的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的
前文定义的式I的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物，或者
关于本发明的方面(a)或(b)定义的药物制剂或组合产品。
可提及的本发明该方面的实施方案包括这样的实施方案，其中所述受试者是已变得对皮质类固醇的抗炎性作用不应的受试者。
制剂
关于上文的方面(a)和(b)，可提及的稀释剂和载体包括合适于胃肠外、口服、局部、粘膜和直肠给药的那些。
上文的方面(a)和(b)的药物制剂和组合产品可经制备用于例如胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、玻璃体内、眼周、眼球后、结膜下、囊下(sub-Tenon)、局部眼或关节周围给药，特别是呈液体溶液剂、乳剂或混悬剂的形式；用于口服给药，特别是呈片剂或胶囊剂的形式，和尤其包括目的为提供结肠靶向的药物释放的技术(Patel, M. M. Expert Opin. Drug Deliv.2011, 8 (10), 1247–1258)；用于局部例如经肺或鼻内给药，特别是呈粉剂、鼻滴剂或气雾剂的形式，和经皮给药；用于局部眼给药，特别是呈溶液剂、乳剂、混悬剂、软膏剂、植入物/插入物、凝胶剂、胶冻剂或脂质体微粒制剂的形式(Ghate, D.; Edelhauser,H. F. Expert Opin. Drug Deliv.2006, 3 (2), 275–287)；用于眼给药，特别是呈可生物降解的和不能生物降解的植入物、脂质体和纳米粒的形式(Thrimawithana, T. R.等 Drug Discov. Today2011, 16 (5/6), 270–277)；用于粘膜给药至例如颊、舌下或阴道粘膜，和用于直肠给药，例如呈栓剂或灌肠剂的形式。
上文的方面(a)和(b)的药物制剂和组合产品可合适地以单位剂型给予，并且可通过制药领域众所周知的任何方法制备，例如描述于Remington's PharmaceuticalSciences, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985)。用于胃肠外给予的制剂可包含作为赋形剂的无菌水或盐水、亚烷基二醇例如丙二醇、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等。用于经鼻给予的制剂可以是固体，和可以包含赋形剂，例如乳糖或葡聚糖，或可以是以鼻滴剂或计量喷雾剂的形式使用的水性或油性溶液剂。对于经颊给药，典型的赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等。
合适于口服给予的药物制剂和组合产品可包含一种或多种生理学上相容的载体和/或赋形剂和可以呈固体或液体形式。片剂和胶囊剂可用以下制备：结合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、西黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；和表面活性剂，例如月桂基硫酸钠。液体组合物可包含常规添加剂，例如助悬剂，例如山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、糖浆、明胶、羧甲基-纤维素或食用脂；乳化剂，例如卵磷脂或阿拉伯胶；植物油，例如杏仁油、椰子油、鱼肝油或花生油；防腐剂，例如丁羟基茴香醚(BHA)和丁羟基甲苯(BHT)。液体组合物可包封在例如明胶中以提供单位剂型。
固体口服剂型包括片剂、双片硬壳胶囊剂和软弹性明胶(SEG)胶囊剂。这样的双片硬壳胶囊剂可自例如明胶或羟丙基甲基纤维素(HPMC)制备。
干壳制剂通常包含约40%-60% w/w浓度的明胶、约20%-30%浓度的增塑剂(例如甘油、山梨糖醇或丙二醇)和约30%-40%浓度的水。其它材料例如防腐剂、染料、遮光剂和矫味剂也可存在。液体填充材料包括已经溶解、增溶或分散的固体药物(用助悬剂例如蜂蜡、氢化蓖麻油或聚乙二醇4000)或在载体或载体的组合(例如矿物油、植物油、甘油三酯、二醇、多元醇和表面活性剂)中的液体药物。
本发明的化合物可局部给予(例如至肺、眼或肠)。因此，上文可提及的方面(a)和(b)的实施方案包括适合于局部给予的药物制剂和组合产品。这样的制剂包括其中赋形剂(包括任何辅剂、稀释剂和/或载体)为局部可接受的那些。
局部给予至肺可通过使用气雾剂制剂实现。气雾剂制剂通常包含悬浮或溶解于合适的气雾剂抛射剂(例如氟氯化碳(CFC)或氢氟化碳(HFC))中的活性成分。合适的CFC抛射剂包括三氯一氟甲烷(抛射剂11)、二氯四氟乙烷(抛射剂114)和二氯二氟甲烷(抛射剂12)。合适的HFC抛射剂包括四氟乙烷(HFC-134a)和七氟丙烷(HFC-227)。抛射剂通常包含总吸入组合物重量的40%-99.5% (例如40%-90%)。制剂可包含赋形剂，其包括共-溶剂(例如乙醇)和表面活性剂(例如卵磷脂、去水山梨糖醇三油酸酯等)。其它可能的赋形剂包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等。气雾剂制剂包装在罐中，合适的剂量通过剂量阀(例如由Bespak、Valois或3M提供或由Aptar、Coster或Vari提供)来递送。
局部给予至肺还可通过使用非增压制剂例如水性溶液剂或混悬剂实现。这可通过喷雾器给予，例如可手持和便携式的喷雾器，或家用或医院用的喷雾器(即非便携式)。制剂可包含赋形剂，例如水、缓冲液、张度调节剂、pH调节剂、表面活性剂和共-溶剂。混悬液体剂和气雾剂制剂(无论是增压还是非增压的)将通常包含呈细粉形式的本发明的化合物，例如D50为0.5-10 μm，例如约1-5 μm。粒径分布可使用D10、D50和D90值表示。粒径分布的D50中位值定义为以微米计的将分布分成两半的粒径。源自激光衍射的测量更准确地描述为体积分布，因此使用该程序获得的D50值更有意义地称为Dv50值(体积分布的中位值)。本文所用的Dv值称为使用激光衍射测量的粒径分布。类似地，在激光衍射的情况下使用的D10和D90值意指Dv10和Dv90值，指的是这样的粒径，其中分别地，10%的分布在D10值之下而90%的分布在D90值之下。
局部给予至肺还可通过使用干粉制剂实现。干粉制剂将含有呈细粉形式的本公开内容的化合物，通常具有1-10 µm的总气体动力学中位数直径(MMAD)或0.5-10 μm例如约1-5 μm的D50。呈细粉形式的本发明的化合物的粉剂可通过微粉化过程或类似的尺寸减小过程制备。微粉化可使用气流粉碎机例如由Hosokawa Alpine制造的那些来进行。得到的粒径分布可使用激光衍射测量(例如用Malvern Mastersizer 2000S仪器)。制剂将通常含有局部可接受的稀释剂，例如乳糖、葡萄糖或甘露醇(优选乳糖)，通常具有大的粒径，例如50 µm或更大、例如100 µm或更大的MMAD，或40-150 µm的D50。本文所用的术语“乳糖”是指含乳糖的组分，包括α-乳糖一水合物、β-乳糖一水合物、无水α-乳糖、无水β-乳糖和无定形乳糖。乳糖组分可通过微粉化、筛分、研磨、压制、团聚或喷雾干燥加工。还包括呈各种形式的市售可得形式的乳糖，例如Lactohale® (吸入级乳糖；DFE Pharma)、InhaLac®70 (用于干粉吸入器的筛分乳糖；Meggle)、Pharmatose® (DFE Pharma)和Respitose® (筛分吸入级乳糖；DFEPharma)产品。在一个实施方案中，乳糖组分选自α-乳糖一水合物、无水α-乳糖和无定形乳糖。优选地，乳糖是α-乳糖一水合物。
干粉制剂还可包含其它赋形剂，例如硬脂酸钠、硬脂酸钙或硬脂酸镁。
干粉制剂通常使用干粉吸入器(DPI)装置来递送。干粉递送系统的实例包括旋转式吸入器(SPINHALER)、DISKHALER、TURBOHALER、DISKUS和CLICKHALER。干粉递送系统的其它实例包括ECLIPSE、NEXT、ROTAHALER、HANDIHALER、AEROLISER、CYCLOHALER、BREEZHALER/NEOHALER、MONODOSE、FLOWCAPS、TWINCAPS、X-CAPS、TURBOSPIN、ELPENHALER、MIATHALER、TWISTHALER、NOVOLIZER、PRESSAIR、ELLIPTA、ORIEL干粉吸入器、MICRODOSE、PULVINAL、EASYHALER、ULTRAHALER、TAIFUN、PULMOJET、OMNIHALER、GYROHALER、TAPER、CONIX、XCELOVAIR和PROHALER。
在一个实施方案中，本发明的化合物以微粉化的干粉制剂提供，例如进一步包含合适级别的乳糖，任选地连同硬脂酸镁一起，填充入单剂量装置例如AEROLISER或填充入多剂量装置例如DISKUS。
本发明的化合物还可经直肠给予，例如呈栓剂或灌肠剂的形式，其包括水性或油性溶液剂以及混悬剂和乳剂。这样的组合物按照本领域技术人员众所周知的标准程序制备。例如，栓剂可通过将活性成分与常规栓剂基质(例如可可脂或其它甘油酯，例如Suppocire)混合制备。在该情况下，将药物与合适的非刺激性赋形剂混合，所述赋形剂在常温下是固体，但在直肠温度下是液体，因此将在直肠中熔化以释放药物。这样的材料是可可脂和聚乙二醇。
一般而言，对于意欲局部给予至眼的呈眼滴剂或眼软膏剂形式的组合物，抑制剂的总量将为约0.0001至低于4.0% (w/w)。
优选地，对于局部眼给药，按照本发明给予的组合物将被配制为溶液剂、混悬剂、乳剂和其它剂型。根据配制的容易性以及患者通过将1-2滴溶液滴入受累的眼睛里容易地给予这样的组合物的能力，水性溶液剂通常是优选的。然而，组合物也可以是混悬剂、粘稠或半粘稠凝胶剂或其它类型的固体或半固体组合物。对于难溶于水的化合物，混悬剂可为优选的。
根据本发明给予的组合物还可包括各种其它成分，包括但不限于，张度剂、缓冲剂、表面活性剂、稳定聚合物、防腐剂、共-溶剂和粘度构造剂。本发明的优选的药物组合物包括具有张度剂和缓冲剂的抑制剂。本发明的药物组合物还可任选地包括表面活性剂和/或姑息剂和/或稳定聚合物。
可使用各种张度剂以调节组合物的张度，对于眼用组合物，优选地调节至天然眼泪的张度。例如，氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、单糖例如葡萄糖、果糖、半乳糖和/或简单多元醇例如糖醇甘露醇、山梨醇、木糖醇、拉克替醇、异麦芽糖醇、麦芽糖醇和氢化淀粉水解产物可加入至组合物中以接近生理张度。这样的张度剂的量将根据待加入的具体作用剂而改变。然而，一般而言，组合物具有足以导致最终组合物具有眼用可接受的渗透压(通常约150-450 mOsm，优选地250-350 mOsm和最优选地大约290 mOsm)的量的张度剂。一般而言，本发明的张度剂将以2-4% w/w的范围存在。本发明的优选的张度剂包括单糖或糖醇，例如D-甘露醇。
合适的缓冲剂系统(例如，磷酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或硼酸)可加入至组合物中以阻止在贮存条件下pH改变。具体的浓度将根据所用的作用剂而改变。然而，优选地，选择缓冲剂以维持靶pH在pH 5-8的范围内，和更优选地靶pH为pH 5-7。
表面活性剂可任选地用于递送更高浓度的抑制剂。表面活性剂起增溶抑制剂和稳定胶体分散液(例如胶束溶液、微乳液、乳液和混悬液)的作用。可任选使用的表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯、泊洛沙姆、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚乙二醇蓖麻油、泰洛沙泊、triton和脱水山梨醇单月桂酸酯。用于本发明的优选的表面活性剂具有范围为12.4-13.2的亲水/亲脂/平衡"HLB"和对于眼用是可接受的，例如TritonX114和泰洛沙泊。
可加入本发明的眼用组合物的其它作用剂是缓和剂，其起稳定聚合物的作用。稳定聚合物应该是优先用于局部眼用的离子的/带电荷的实例，更特别地，在其表面上带负电荷的聚合物，其可显示(–)10–50 mV的ζ-电势而提供物理稳定性并且能够在水中形成分散液(即水溶性的)。本发明的优选的稳定聚合物是0.1–0.5% w/w的一种或多种(如果超过一种)聚电解质，其来自交联聚丙烯酸酯家族，例如卡波姆、聚卡波非和Pemulen(R)，特别是卡波姆974p (聚丙烯酸)。
其它化合物也可加入至本发明的眼用组合物以增加载体的粘度。粘度增强剂的实例包括但不限于：多糖例如透明质酸和其盐、硫酸软骨素和其盐、葡聚糖、纤维素家族的各种聚合物、乙烯基聚合物和丙烯酸聚合物。
局部眼用产品通常以多剂量形式包装。因此需要防腐剂以防止在使用时的微生物污染。合适的防腐剂包括：苯扎氯铵、氯丁醇、苯扎溴铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯基乙基醇、乙二胺四乙酸二钠、山梨酸、聚季铵盐-1或本领域技术人员已知的其它防腐剂。这样的防腐剂通常以0.001-1.0% w/v的水平使用。本发明的单位剂量组合物是无菌的，但通常是不防腐的。因此，这样的组合物通常不含防腐剂。
医学从业者或其它技术人员将能够确定本发明的化合物的合适的剂量，因此能够确定应包括在任何特定药物制剂中的本发明的化合物的量(无论是呈单位剂型还是其它形式)。
结合上文(b)中所述的组合产品可提及的本发明的实施方案包括这样的实施方案，其中其它治疗剂是本领域技术人员已知的合适于治疗炎性疾病(例如下文提及的特定疾病)的一种或多种治疗剂。
例如，对于治疗呼吸病症(例如COPD或哮喘)，其它治疗剂是选自以下的一种或多种药剂：
- 类固醇(例如布地奈德、二丙酸氯地米松、丙酸氟替卡松、糠酸莫米松、糠酸氟替卡松；另一实例是环索奈德)；
- β激动剂，特别是β2激动剂(例如特布他林、沙丁胺醇、沙美特罗、福莫特罗；另一实例是维兰特罗、奥达特罗、瑞普特罗和非诺特罗)；和
- 黄嘌呤(例如茶碱)。
例如，对于治疗呼吸病症(例如COPD或哮喘)，其它治疗剂是选自以下的一种或多种药剂：
- 毒蕈碱拮抗剂(例如tiotropium、umeclidinium、glycopyrronium、aclidinium和daratropium，这些的任何一种例如作为溴化物盐)；和
- 磷酸二酯酶抑制剂。
此外，对于治疗胃肠病症(例如克罗恩病或溃疡性结肠炎)，其它治疗剂可以是例如选自以下的一种或多种药剂：
- 5-氨基水杨酸或其前药(例如柳氮磺吡啶、奥沙拉嗪或bisalazide)；
- 皮质类固醇(例如泼尼松龙、甲基泼尼松龙或布地奈德)；
- 免疫抑制剂(例如环孢菌素、他克莫司、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤)；
- 抗-TNFα抗体(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗)；
- 抗-IL12/IL23抗体(例如，ustekinumab)或小分子IL12/IL23抑制剂(例如，apilimod)；
- 抗-α4β7抗体(例如，vedolizumab)；
- MAdCAM-1阻滞剂(例如，PF-00547659)；
- 针对细胞粘附分子α4-整联蛋白的抗体(例如，那他珠单抗)；
- 针对IL2受体α亚基的抗体(例如，达珠单抗或巴利昔单抗)；
- JAK3抑制剂(例如，托法替尼或R348)；
- Syk抑制剂和其前药(例如，fostamatinib和R-406)；
- 磷酸二酯酶-4抑制剂(例如，tetomilast)；
- HMPL-004；
- 益生菌；
- 德沙拉秦(Dersalazine)；
- 塞马莫德(semapimod)/CPSI-2364；和
- 蛋白激酶C抑制剂(例如AEB-071)。
对于治疗眼病症(例如葡萄膜炎和干燥性角结膜炎(干眼))，其它治疗剂可以是例如选自以下的一种或多种药剂：
- 皮质类固醇(例如地塞米松、泼尼松龙、曲安奈德、二氟泼尼酯或氟轻松)；
- 糖皮质激素激动剂(例如，mapracorat)；
- 免疫抑制剂(例如环孢菌素、voclosporin、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酸莫酯或他克莫司)；
- 抗-TNFα抗体(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、ESBA-105或戈利木单抗)；
- 抗-IL-17A抗体(例如，secukinumab)；
- mTOR抑制剂(例如，西罗莫司)；
- VGX-1027；
- 腺苷A3受体激动剂(例如，CF-101)；
- lifitegrast；
- JAK3抑制剂(例如，托法替尼或R348)；和
- 蛋白激酶C抑制剂(例如AEB-071)。
在具体的实施方案中，对于治疗眼病症(例如葡萄膜炎和干燥性角结膜炎(干眼))，其它治疗剂可以是例如选自以下的一种或多种药剂：
- 皮质类固醇(例如地塞米松、泼尼松龙、曲安奈德、二氟泼尼酯或氟轻松)；
- 免疫抑制剂(例如环孢菌素、voclosporin、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酸莫酯或他克莫司)；
- 抗-TNFα抗体(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、ESBA-105或戈利木单抗)；
- 抗-IL-17A抗体(例如，secukinumab)；
- mTOR抑制剂(例如，西罗莫司)；
- VGX-1027；
- JAK3抑制剂(例如，托法替尼或R348)；和
- 蛋白激酶C抑制剂(例如AEB-071)。
医学用途
本发明的化合物可用作炎性疾病的单一疗法，或所述疾病的组合疗法。
因此，上文可提及的方面(e)-(g)的实施方案包括这样的实施方案，其中式I的化合物(或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物)是治疗中使用的唯一的药理学活性成分。
然而，在上文方面(e)-(g)的其它实施方案中，将式I的化合物(或其药学上可接受的盐、溶剂合物或同位素衍生物)给予受试者，还给予所述受试者一种或多种其它治疗剂(例如，其中所述一种或多种其它治疗剂如上文关于组合产品所定义)。
当用于本文时，术语"炎性疾病"特别包括提及以下的任何一种或多种：
(i) 具有炎性组分的肺疾病或病症，例如囊性纤维化、肺动脉高压、肺结节病、特发性肺纤维变性，或者特别地，COPD (包括慢性支气管炎和肺气肿)、哮喘或儿科哮喘；
(ii) 具有炎性组分的皮肤疾病或病症，例如特应性皮炎、变应性皮炎、接触性皮炎或银屑病；
(iii) 具有炎性组分的鼻疾病或病症，例如变应性鼻炎、鼻炎或鼻窦炎；
(iv) 具有炎性组分的眼疾病或病症，例如结膜炎、过敏性结膜炎、青光眼、糖尿病视网膜病、黄斑水肿(包括糖尿病黄斑水肿)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、干性和/或湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、术后白内障炎症，或者特别地，干燥性角结膜炎(干眼)、葡萄膜炎(包括后葡萄膜炎、前葡萄膜炎和泛葡萄膜炎)、角膜移植和缘细胞移植排斥；和
(v) 具有炎性组分的胃肠疾病或病症，例如谷蛋白敏感性肠病(腹部疾病)、嗜酸性食管炎、肠移植物对抗宿主病，或者特别地，克罗恩病或溃疡性结肠炎。
本文对具有炎性组分的疾病的提及包括对涉及炎症的疾病的提及，无论是否存在所述疾病的其它(非-炎性)症状或后果。
根据本发明的进一步的方面，提供制备式I的化合物的方法，所述方法包括：
(a) 将式II的化合物，
与式III的化合物，
其中Z1和Z2之一是式IV的结构片段
和Z1和Z2的另一个是式V的结构片段
例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在环境温度(例如15-30℃)至约110℃的温度下，在合适的有机溶剂(例如极性非质子溶剂，例如DMF、THF、1,4-二噁烷或其混合物)的存在下反应；
(b) 将式IIa的化合物，
其中Z1如上文所定义，与合适的叠氮化物形成剂(即离去基团和活化的叠氮化物离子的合适来源，例如叠氮磷酸二苯酯；参见例如，Tetrahedron 1974, 30, 2151–2157)在本领域技术人员已知的条件下，例如在亚环境温度至环境温度(例如自约-5至5℃的起始温度至反应后的环境温度)下在胺碱(例如三乙基胺或空间位阻碱例如N,N-二异丙基乙基胺)和合适的有机溶剂(例如极性非质子溶剂，例如DMF、THF、1,4-二噁烷或其混合物)的存在下反应，该反应之后无需分离，接着中间体酰叠氮化物(具有式Z1-C(O)-N3)的热重排(例如在加热下)，例如在环境温度(例如15-30℃)下，以原位提供式II的化合物，该化合物然后与上文定义的式III的化合物反应，提供式I的化合物；
(c) 将式IIb的化合物，
其中LG1表示合适的离去基团(例如咪唑基、氯或芳基氧基例如苯氧基)和Z1如上文所定义，与如上文定义的式III的化合物，例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在环境温度(例如自环境温度至80℃，例如在约60℃)下，任选地在胺碱(例如三乙基胺或空间位阻碱例如N,N-二异丙基乙基胺)和合适的有机溶剂(例如非质子溶剂，例如二氯甲烷或酯，例如乙酸异丙酯)的存在下反应；
(d) 将式VI的化合物，
其中LG2表示合适的离去基团(例如卤素基团例如氯或溴)，与式VII的化合物，
例如在本领域技术人员已知的条件下(例如描述于J. Am. Chem. Soc.2011,133, 15686–15696)，例如在升高的温度(例如50-110℃)下在合适的有机溶剂(例如极性非质子溶剂，例如DMF、THF、1,4-二噁烷或其混合物)和任选酸性催化剂(例如磺酸，例如对甲苯磺酸)的存在下反应；或通过包括钯催化剂和合适的配体例如BrettPhos的Buchwald偶联(Surry, D. S.; Buchwald, S. L. Chem. Sci.2011, 2, 27–50)反应；或者
(e) 将式VIIa的化合物
其中R4'表示H或C1-3烷基(例如甲基)，与式VIIb的化合物，
H2N-[CH2CH2-O]2-CH2CH2-OCH3　　　VIIb
例如在本领域技术人员已知的条件下反应，例如(i)当R4'表示C1-3烷基时，在环境温度下在合适的Lewis酸性催化剂(例如三烷基铝试剂例如三甲基铝)和非质子有机溶剂(例如THF)的存在下反应，(ii)当R4'表示H时，在叔胺碱(例如三烷基胺例如三乙基胺或二异丙基乙基胺或环胺例如N-甲基吡咯烷或N-甲基吗啉)、酰胺(肽)偶联试剂(例如T3P、HATU、CDI、BOP、PyBOP、HOAt、HOBt或碳二亚胺例如DCC或二异丙基碳二亚胺)和非质子有机溶剂(例如氯化溶剂例如DCM、酯例如乙酸乙酯、二甲基胺的酰胺例如DMF或任何这样的溶剂的混合物)的存在下反应，或(iii)在与式VIIb的化合物反应之前，将式VIIa的化合物转化成其中OR4’被卤素(例如氯，所述化合物可例如通过其中R4’表示H的式VIIa的化合物与卤化剂例如亚硫酰氯例如在升高的温度下，例如50-70℃反应制备)置换的相应的化合物，接着将得到的酸性卤化物与式VIIb的化合物反应，所述反应可例如在非质子有机溶剂(例如氯化溶剂例如DCM)的存在下进行。
式II的化合物可按照本领域技术人员已知的方法或与其类似的方法制备，例如通过将上文定义的式IIa的化合物与叠氮化物形成剂反应，接着将中间体酰叠氮化物重排(如上文(b)中所述；参见例如Tetrahedron 1974, 30, 2151–2157)。
式IIb的化合物可如下制备：将式VIII的化合物，
其中LG1如前文定义，与式IX的化合物反应，
其中Z1如前文定义，例如在本领域技术人员已知的条件下。
式IX的胺可自式IIa的羧酸通过上文(b)中所述的路线制备，其中中间体异氰酸酯II用水水解产生氨基甲酸，其失去二氧化碳得到IX。同理，中间体异氰酸酯II可与醇例如叔丁醇反应，产生受保护形式的IX。
式III的化合物(其中Z2表示式V的结构片段)或式IX的化合物(其中Z1表示式V的结构片段)可使用流程1中概述的路线合成(参见例如：WO 2003/072569;和WO 2008/046216)，其中LG3和LG4表示离去基团，例如卤素或甲烷磺酰基，和FG表示真实的或潜在的NH2基团，即容易转化成NH2基团的基团，例如硝基或受保护的变体NH–PG2，其中PG2是典型的保护基(参见例如：Greene, T. W.; Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis;Wiley, 第四次修订版, 2006; ISBN-10: 0471697540)，例如，氨基甲酸酯或甲酰胺。顺序开始于XI中的LG3经碱介导的SNAr置换为当X被碱处理以产生醚XII时形成的aroxide。然后，醚XII的剩余的卤素或甲烷磺酰基取代基(LG4) i) 在第二个SNAr反应中被置换为式VII的胺；或(ii) 通过Buchwald偶联(参见例如WO 2009/017838)被置换为式VII的胺以得到所需的化合物(当FG为NH2时)或XIII (当FG是硝基或NH–PG2时)。当在XIII中FG为硝基时，NH2基团可通过还原反应而显露，通常使用合适的催化剂例如披钯碳或使用溶解金属条件例如用在冰乙酸中的铁通过氢化进行。或者，当FG是保护基时，NH2基团可通过脱保护反应显露。尽管仅描述为在所述顺序的最后步骤中发生，但应注意，由FG表示的潜在NH2基团的暴露可在流程1所示的合成路线的任何阶段中发生。
流程1
以类似的方式，其中Z1表示式IV的结构片段的式IX的胺可通过将在式XIIIa的化合物中潜在的NH2基团转化成真实的NH2基团来合成，
其中FG’如上文对FG所定义，除了其不表示NH2。
其中Z2表示式V的结构片段的式III的化合物，或其中Z1表示式V的结构片段的式IX的化合物，可通过类似于本文描述的用于制备式I的化合物(见上文方法(e))和其它式III的化合物(见例如上文流程1)的方法制备，例如通过将XIIIb的化合物
其中FG和R4'为前文定义的，与前文定义的式VIIb的化合物在本领域技术人员已知的条件下(例如上文关于方法(e)中描述的肽偶联条件)反应，接着将(如果需要)FG转化为NH2，例如在上文关于流程1所述。
式VI的化合物可类似于式I的化合物合成(见例如，上文备选的方法(a)-(c))。例如，式VI的化合物可通过将式IIx的化合物与式IIIx的化合物反应制备，其中式IIx和IIIx的化合物采用与式II和III的化合物相同的定义，不同之处在于Z1和Z2之一表示前文定义的式IV的结构片段，和Z1和Z2的另一个表示式Va的结构片段，
。
式VII的化合物可根据或类似于本领域技术人员已知的程序制备，例如通过将式XIV的化合物
其中FG为前文定义的，与前文定义的式VIIb的化合物在本领域技术人员已知的条件下(例如上文关于方法(e)中描述的肽偶联条件)反应，接着
当FG表示NH–PG2时，除去PG2保护基，或者
当FG表示NO2时，将NO2还原为NH2。
本领域技术人员将理解，式II、IIx和IIb表示的化合物通常为反应中间体。这些中间体可原位形成和无需分离与式III的化合物直接反应，以提供式I的化合物。此外，本领域技术人员将理解，对于具有化学敏感性官能团例如羟基或氨基官能的任何基团Z1和Z2，使用合适的保护基团可能在上文描述的方法期间是需要的。
流程中说明的许多化合物是市售可得的，或可使用引用的程序获得，或由本领域技术人员通过常规方法可容易制备。参见例如Regan, J.等; J. Med. Chem.2003, 46,4676–4686、WO 2000/043384、WO 2007/053346、WO 2007/087448、WO 2007/089512、WO2009/117080和WO 2014/027209。
本发明的具体实施方案涉及用于制备式I的化合物的方法，所述方法包括将式XV的化合物
与式XVI的化合物
其中LG1为前文定义的(例如苯氧基)，例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在升高的温度下(例如40-80℃，例如在约60℃)，在胺碱(例如三乙基胺)和非质子有机溶剂(例如酯，例如乙酸异丙酯)的存在下反应。
式XV的化合物可通过将式Xva的相应的化合物脱保护制备，
其中PG2为前文定义的(例如PG2为叔丁氧羰基)，例如在本领域技术人员已知的条件下，例如当PG2表示叔丁氧羰基时，与强酸(例如烷基或芳基磺酸(例如p-甲苯磺酸和/或特别是，三氟乙酸)在非质子有机溶剂(例如氯化溶剂例如DCM)的存在下反应。
式Xva的化合物可通过将前文定义的式VII的化合物与前文定义但其中FG表示NH-PG2 (例如NH-C(O)O-C(CH3)3)的式XII的化合物(例如其中LG4表示氯的式XII的化合物)，例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在升高的温度下(例如40-80℃，例如60-70℃)，在非质子溶剂(例如THF)和任选地酸催化剂(例如磺酸，例如对甲苯磺酸)的存在下反应制备。
式VII的化合物可通过例如上述的方法制备。例如，式VII的化合物可通过将式VII(P)的化合物脱保护，
其中R'、R''和R'''独立地表示C1-4烷基(例如R'、R''和R'''全都表示异丙基)，例如在本领域技术人员已知的条件下制备，例如在环境温度下在极性非质子溶剂(例如乙腈)中与氟离子源例如TBAF或氟化铯反应。
式VII(P)的化合物可通过式XVII的化合物(例如Sonogashira偶联；参见Chem. Soc. Rev.2011, 40, 5084–5121)
其中LG5表示卤素例如溴，与式XVIII的化合物
其中R'、R''和R'''为前文定义的，例如在本领域技术人员已知的条件下偶联制备，例如在升高的温度下(例如50-80℃或特别是60-70℃)在CuI和Pd(0)催化剂(例如Pd(PPh3)4)和反应惰性有机溶剂例如THF的存在下反应。
式XVII的化合物可通过将式XIX的化合物
其中LG5为前文定义的，例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在升高的温度下(例如约50-70℃)在氢气氛下(例如在H2下在压力约3 Mpa下)在合适的催化剂(例如Pt/C)、反应惰性溶剂(例如THF)和酸(例如乙酸)的存在下还原制备，或者在酸性介质(例如盐酸)中在水和乙醇中用铁还原制备。
式XIX的化合物可通过将式XX的化合物
其中LG5为前文定义的，与卤化剂(例如亚硫酰氯，例如在60-70℃)反应，接着将中间体酸性卤化物与前文定义的式VIIb的化合物，例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在25℃或更低在非质子有机溶剂(例如DCM)和碱例如三乙基胺、DIPEA或NaHCO3的存在下反应制备。或者，该转化可通过在叔胺碱(例如三烷基胺，例如三乙基胺或DIPEA，或环胺例如N-甲基吡咯烷或N-甲基吗啉)、酰胺(肽)偶联试剂(例如T3P、HATU、CDI、BOP、PyBOP、HOAt、HOBt或碳二亚胺例如DCC或二异丙基碳二亚胺)和非质子有机溶剂(例如氯化溶剂例如DCM、酯例如乙酸乙酯、二甲基胺的酰胺例如DMF或任何这样的溶剂的混合物)的存在下缩合实现。
式XVI的化合物可通过将式XXI的化合物(US2003/0065034)
与式XXII的化合物
其中LG1和LG2表示离去基团(例如LG1表示苯氧基和LG2表示卤素例如氯)，例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在低于约20℃下在碱(例如NaHCO3)和反应惰性有机溶剂(例如THF、DCM或特别是其混合物)的存在下反应制备。
式XXI的化合物可通过将式XXIII的化合物
例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在氢气氛下(例如在H2下在压力约0.3-0.4 Mpa下)在合适的催化剂(例如Pd/C)和溶剂(例如甲醇)的存在下还原制备。
式XXI的化合物可通过将式XXIV的化合物
与甲烷磺酰基氯，例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在25-40℃下在碱(例如吡啶)和反应惰性有机溶剂(例如甲苯)的存在下反应制备。
式XXIV的化合物可通过将式XXV的化合物
例如在本领域技术人员已知的条件下，例如在升高的温度下(例如70-80℃)在氢源(例如4-甲基-1-环己烯)、合适的催化剂(例如Pd/C)和溶剂(例如醇，例如甲醇、乙醇或其混合物，例如工业级甲基化酒精)的存在下部分还原制备。
在具体的实施方案中，本发明涉及用于制备式I的化合物的方法，所述方法包括：
(a) 本文所述的用于制备式XV的化合物的方法；和/或
(b) 本文所述的用于制备式XVI的化合物的方法。
关于本发明的这些实施方案，用于制备式I的化合物的方法可包括本文所述的用于制备式XVa、VII(P)、VII、XVII、XIX、XXI、XXIII和XXIV的化合物的任何一种或多种的方法。
本文所述的新的中间体构成本发明的一个方面。在该方面中，本发明的其它方面涉及前文定义的式XVI的化合物(例如其中LG1表示苯氧基的式XVI的化合物)。
本文描述的本发明的各方面(例如上述化合物、组合、方法和用途)可在治疗本文所述病况中具有优势，与现有技术中已知用于治疗这些病况的类似的化合物、组合、方法(治疗)或用途或其它方面相比，它们可更适合于医师和/或患者，更有效，具有较少毒性，具有更好的选择性，具有更广范围的活性，更有效力，产生较少的副作用，具有更好的药代动力学和/或药效学特征，具有更合适的固态形态学，具有更好的长期稳定性或可具有其它有用的药理学性质。
另外地(或备选地)，本发明的化合物可：
- 显示长的作用持续时间和/或作用持久性(例如，与其它之前公开的p38 MAP激酶抑制剂例如BIRB796相比)；
- 不强烈抑制GSK 3α；
- 靶向激酶(kinome)的较小部分，即具有改进的选择性，如通过降低的KinomeScan选择性评分所示；
- 在给药之间保持相对高的局部药物浓度(例如，相对于其它之前公开的p38 MAP激酶抑制剂例如BIRB796高的局部浓度)；
- 显示特别适合于局部给药的性质(例如在局部给药后，产生高的靶组织浓度但低的血浆浓度的式(I)的化合物，和/或从血浆快速清除式(I)的化合物，例如因为高的肾或肝提取)；
- 细胞显示很少或没有β-联蛋白诱导和/或有丝分裂抑制；
- 在人淋巴细胞体外微核试验中不产生含有微核的双核细胞的增加；
- 对细胞色素P450超家族的成员显示很少或没有时间依赖性抑制；
- 与之前公开的p38 MAP激酶抑制剂例如BIRB796相比，在水的存在下显示改进的化学稳定性(例如，在含水混合物中在升高的温度下对水解的稳定性)；
- 在给予患者后，产生伴随很少或没有安全性(例如毒性)顾虑的代谢产物；
- 显示良好的溶解度和/或细胞渗透性；
- 具有高度的结晶性；和/或
- 在固体时显示很少或没有吸湿性。
实验方法
通用程序
所有原料和溶剂自市售来源获得，或根据引用的文献制备。除非另外说明，否则所有反应经搅拌。有机溶液经无水硫酸镁常规干燥。微波反应在CEM Discover和Smithcreator微波反应器中进行，使用可变功率微波辐射加热至恒定温度。
正相柱色谱在自动化快速色谱系统例如CombiFlash Companion或CombiFlash RF系统上使用预填装的二氧化硅(230-400目，40-63 µm)柱常规进行。SCX购自Supelco，在使用前用1M盐酸处理。除非另外说明，否则待纯化的反应混合物首先用MeOH稀释，和用几滴AcOH调成酸性。将该溶液直接负载到SCX上，用MeOH洗涤。然后通过用含1% NH3的MeOH洗涤，洗脱所需材料。
分析方法
分析型HPLC使用Waters Xselect CSH C18, 2.5 µm, 4.6x30 mm柱进行，用含MeCN的0.1%甲酸水溶液的梯度洗脱，或使用Waters Xbridge BEH C18, 2.5 µm, 4.6x30mm柱进行，用含MeCN的10 mM碳酸氢铵水溶液的梯度洗脱。使用二极管阵列或Agilent 1100系统上的可变波长检测器测量洗脱峰的UV谱。
分析型LCMS使用Waters Xselect CSH C18, 2.5 µm, 4.6x30 mm柱进行，用含MeCN的0.1%甲酸水溶液的梯度洗脱，或使用Waters Xbridge BEH C18, 2.5 µm, 4.6x30mm柱进行，用含MeCN的10 mM碳酸氢铵水溶液的梯度洗脱。洗脱峰的UV和质谱使用Agilent1200或Agilent Infinity 1260 LCMS上的可变波长检测器与具有正离子和负离子电喷射的6120单个四极质谱仪测量。
制备型HPLC使用Waters Xselect CSH C18, 5 µm, 19x50 mm柱使用含MeCN的0.1%甲酸水溶液的梯度或含MeCN的10 mM碳酸氢铵水溶液的梯度进行，或使用WatersXbridge BEH C18, 5 µm, 19x50 mm柱使用含MeCN的10 mM碳酸氢铵水溶液的梯度进行。在Gilson 215制备型HPLC或Varian PrepStar制备型HPLC上通过可变波长检测器测量的单波长UV而检测后，或通过具有正离子和负离子电喷射的ZQ单个四极质谱仪和在WatersFractionLynx LCMS上的双波长检测器测量的质量和单波长UV而检测后，收集流分。
1 H NMR波谱：报告的1H NMR波谱数据在Bruker Avance III波谱仪上以400 MHz获得。氯仿-d、二甲基亚砜-d 6或四甲基甲硅烷的内部标准的中央峰用作参考。
实施例
实施例1
3-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基) 氧基)嘧啶-2-基)氨基)-5-乙炔基-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺(化合物I)
(i) 3-溴-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-5-硝基苯甲酰胺
将含50 wt% T3P的EtOAc (25 mL, 42.0 mmol)缓慢加入3-溴-5-硝基苯甲酸(7.05 g, 28.7 mmol)、2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙胺(4 g, 24.25 mmol)和Et3N(12 mL, 86 mmol)在EtOAc (50 mL)中的溶液，同时浸入冰浴中。一旦加入完成，除去冰浴，将反应物在室温下搅拌2 h。将混合物在饱和NaHCO3水溶液(100 mL)和EtOAc (100 mL)之间分配。有机层用K2CO3水溶液(10 g，100 mL)和盐水(100 mL)洗涤，然后经干燥(MgSO4)、过滤和真空浓缩，得到小标题化合物(8.23 g)，为棕色油状物。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.02 (t, 1H), 8.65-8.64 (m, 1H), 8.53 (t,1H), 8.46 (t, 1H), 3.57-3.43 (m, 10H), 3.41-3.38 (m, 2H), 3.21 (s, 3H).
LCMS m/z 391/393 (M+H)+ (ES+); 389/391 (M-H)- (ES-)。
(ii) 3-氨基-5-溴-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺
将铁粉(5.90 g, 106 mmol)加入至来自上文步骤(i)的产物(8.24 g, 20.43mmol)和浓HCl (2 mL, 23.40 mmol)在EtOH (65 mL)和水(15 mL)中的溶液。将混合物在75℃ (加热块温度)加热1 h。然后将反应冷却至室温，然后用水(30 mL)稀释、过滤和真空浓缩。将残余物碱化(NaHCO3)，然后在EtOAc (350 mL)和水(275 mL)之间分配。有机层经干燥(MgSO4)，过滤和真空浓缩，得到橙色油状物，其通过硅胶色谱纯化(220 g柱, 含0-5% MeOH的DCM)，得到小标题化合物(5.25 g)，为橙色油状物。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.36 (t, 1H), 7.07 (t, 1H), 7.00-6.99(m, 1H), 6.84 (t, 1H), 5.57 (s, 2H), 3.52-3.48 (m, 8H), 3.42-3.39 (m, 2H),3.35 (q, 2H), 3.22 (s, 3H).
LCMS m/z 361/363 (M+H)+ (ES+)。
(iii) 3-氨基-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((三异丙基甲硅烷 基)乙炔基)苯甲酰胺
向来自上文步骤(ii)的产物(5.06 g, 13.31 mmol)、乙炔基三异丙基甲硅烷(4.5mL, 20.06 mmol)、Cu(I)I (130 mg, 0.683 mmol)和Et3N (8 mL, 57.4 mmol)在DMF (45mL)中的脱气溶液加入Pd(PPh3)4 (770 mg, 0.666 mmol)。将反应物在85℃加热3 h，然后冷却至室温，在EtOAc (250 mL)和盐水(250 mL)之间分配。水相用EtOAc (250 mL)进一步萃取，然后合并的有机萃取物用水(3 x 200 mL)和盐水(200 mL)洗涤，然后经干燥(MgSO4)，过滤和真空浓缩，得到深棕色油状物。将粗产物通过硅胶色谱纯化(220 g柱, 含0-3% MeOH的DCM)，得到小标题化合物(5.4 g)，为橙色油状物。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.39 (t, 1H), 7.06-7.03 (m, 2H), 6.79-6.78 (m, 1H), 5.43 (s, 2H), 3.54-3.49 (m, 8H), 3.41-3.33 (m, 4H), 3.21 (s,3H), 1.10 (s, 21H).
LCMS m/z 463 (M+H)+ (ES+)。
(iv) 3-氨基-5-乙炔基-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺
向来自上文步骤(iii)的产物(5.33 g, 11.40 mmol)在EtOAc (75 mL)中的搅拌溶液加入含1M TBAF的THF (11.40 mL, 11.40 mmol)。将反应物在室温下搅拌1h，然后在水(300 mL)和EtOAc (400 mL)之间分配，水相用EtOAc (300 mL)进一步萃取。合并的有机萃取物用盐水(400 mL)洗涤，然后经干燥(MgSO4)、过滤和浓缩，得到橙色油状物。将粗产物溶于最小量的MeOH和装载至SCX上。柱用MeOH (3个柱体积)接着用含1% NH3的MeOH (3个柱体积)洗脱。含产物部分经真空浓缩，得到小标题化合物(3.27 g)，为棕色油状物。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.38 (t, 1H), 7.06-7.04 (m, 2H), 6.75-6.74 (m, 1H), 5.46 (s, 2H), 4.09 (s, 1H), 3.53-3.48 (m, 8H), 3.41-3.39 (m,2H), 3.37-3.33 (m, 2H), 3.21 (s, 3H).
LCMS m/z 307 (M+H)+ (ES+)。
(v) (4-((2-((3-乙炔基-5-((2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰 基)苯基)-氨基)嘧啶-4-基)氧基)萘-1-基)氨基甲酸叔丁酯
向来自上文步骤(iv)的产物(1 g, 3.13 mmol)和(4-((2-氯嘧啶-4-基)氧基)萘-1-基)氨基甲酸叔丁酯(参见例如, Ito, K.等, WO 2010/067130, 17 Jun 2010; 777 mg,2.090 mmol)在DMF (60 mL)中的搅拌溶液加入pTSA一水合物(200 mg, 1.051 mmol)。将得到的溶液在60℃搅拌72 h。将反应冷却至室温，然后在EtOAc (150 mL)和饱和NaHCO3水溶液(100 mL)之间分配。水层用EtOAc (2 x 150 mL)进一步萃取，然后合并的有机萃取物用水(3 x 200 mL)和盐水(200 mL)洗涤，然后经干燥(MgSO4)，过滤和浓缩，得到橙色油状物(1.17 g)。将粗产物通过硅胶色谱纯化(80 g柱, 含0-5% MeOH的EtOAc)，得到小标题化合物(552 mg)，为浅棕色泡沫。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.73 (s, 1H), 9.29 (s, 1H), 8.46-8.43(m, 2H), 8.11-8.09 (m, 2H), 7.92-7.88 (br m, 1H), 7.83-7.80 (m, 1H), 7.62-7.53 (m, 3H), 7.56-7.55 (m, 1H), 7.42 (d, 1H), 6.57 (d, 1H), 4.14 (s, 1H),3.54-3.48 (m, 8H), 3.40-3.35 (m, 4H), 3.20 (s, 3H), 1.52 (s, 9H).
LCMS m/z 642 (M+H)+ (ES+)。
(vi) 3-((4-((4-氨基萘-1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-5-乙炔基-N-(2-(2-(2- 甲氧基-乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺
向来自上文步骤(v)的产物(540 mg, 0.825 mmol)在DCM (8 mL)中的搅拌溶液加入TFA (3.2 mL, 41.5 mmol)。将反应物在室温下搅拌1 h。将溶液真空浓缩，将得到的油状物溶于最少的MeOH和装载至SCX上。柱用MeOH (3个柱体积)，然后用含1% NH3的MeOH (3个柱体积)洗脱。将含产物部分经真空浓缩，得到小标题化合物(405 mg)，为浅棕色泡沫。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.73 (s, 1H), 8.45 (t, 1H), 8.36 (d,1H), 8.14-8.10 (m, 1H), 8.07-8.05 (br m, 1H), 7.94-7.92 (br m, 1H), 7.65-7.61(m, 1H), 7.47-7.40 (m, 3H), 7.15 (d, 1H), 6.72 (d, 1H), 6.37 (d, 1H), 5.87(br s, 2H), 4.17 (s, 1H), 3.54-3.48 (m, 8H), 3.40-3.36 (m, 4H), 3.20 (s, 3H).
LCMS m/z 542 (M+H)+ (ES+)。
(vii) (5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)氨基甲酸苯酯
将氯甲酸苯酯(0.5 mL, 3.99 mmol)加入至N-(3-氨基-5-(叔丁基)-2-甲氧基苯基)甲烷磺酰胺(参见例如Cirillo, P. F.等, WO2002/083628, 2002年10月24日; 1 g,3.67 mmol)和NaHCO3 (620 mg, 7.38 mmol)在THF (10 mL)和DCM (10 mL)中的搅拌溶液。将混合物搅拌2 h，然后加入水(20 mL)。有机层经分离，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发，得到棕色泡沫，将其在环己烷(20 mL)中搅拌，得到小标题化合物(1.4 g)，为无色固体。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.49 (s, 1H), 9.14 (s, 1H), 7.56 (s, 1H),7.50-7.37 (m, 2H), 7.31-7.13 (m, 4H), 3.77 (s, 3H), 3.06 (s, 3H), 1.25 (s,9H)
LCMS m/z 393 (M+H)+ (ES+); 391 (M-H)- (ES-)。
(viii) 3-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)- 萘-1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-5-乙炔基-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯 甲酰胺
将(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)-氨基甲酸苯酯(参见上文步骤1(vii); 95 mg, 0.239 mmol)、来自上文步骤(vi)的产物(120 mg, 0.217 mmol)和Et3N(6 µL, 0.043 mmol)在i-PrOAc (3 mL)中的搅拌混合物在70℃加热过夜。将反应冷却至室温和真空浓缩。将剩余物通过硅胶色谱纯化(40 g柱, 含0-5% MeOH的EtOAc)，得到油状物，其用乙醚研磨得到浅褐色固体。将粗产物通过制备型HPLC纯化(Varian, 碱性(10 mM碳酸氢铵), Waters X-Bridge Prep-C18, 5 µm, 19x50 mm柱, 含35-70% MeCN的水)，得到标题化合物(69 mg)，为灰白色固体。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.74 (s, 1H), 9.32 (s, 1H), 9.13 (s,1H), 8.89 (s, 1H), 8.46-8.43 (m, 2H), 8.26 (d, 1H), 8.17 (d, 1H), 8.09-8.07(m, 2H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.69-7.65 (m, 1H), 7.61-7.57 (m, 1H), 7.45-7.43(m, 2H), 7.02 (d, 1H), 6.55 (d, 1H), 4.11 (s, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.53-3.47(m, 8H), 3.40-3.35 (m, 4H), 3.20 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 1.26 (s, 9H).
LCMS m/z 840 (M+H)+ (ES+); 838 (M-H)- (ES-)。
实施例2
3-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基) 氧基)嘧啶-2-基)氨基)-5-乙炔基-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺(化合物I)
(i) 3-溴-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-5-硝基苯甲酰胺
在氮气下向配备有洗涤器的10 L烧瓶中加入3-溴-5-硝基苯甲酸(2686 g, 10.91mol)和亚硫酰氯(5.37 L, 75.8 mol)。将反应物加热至68℃ [放出气体]，然后在60℃搅拌过夜，之后LC分析显示完全反应。将反应冷却至室温和真空浓缩，得到3.2 kg的物质，该量显示存在亚硫酰氯(100%收率 = 2.88 kg)。混合物自甲苯(2 x 3 L)浓缩以除去所有痕量的亚硫酰氯。得到总共3370 g的酰基氯，其中甲苯解释了过量的收率。
在氮气下向20 L烧瓶中加入2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙胺(890 g, 5.45mol)和DCM (3.5 L)。这之后加入8% NaHCO3水溶液(9 L)。然后将酰基氯(1373 g有效量,4.89 mol)加入至混合物，同时保持温度低于25℃ [放热和气体放出]。将混合物搅拌30分钟，然后LC显示完全反应。将有机物分离和用1 M HCl (4.5 L)和8% NaHCO3水溶液(4.5 L)洗涤，然后经干燥、过滤和真空浓缩，得到总共1956 g的小标题化合物(95%收率)。通过1HNMR分析显示产物纯度>95%。
(ii) 3-氨基-5-溴-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺
将来自上文步骤(i)的产物(1 kg, 2.56mol)溶于THF (3.5 L)和AcOH (500 mL)，并在3 MPa (30巴) H2下在至多60℃下用5% Pt/C (30 g的JM型18 MA, 55%水)氢化。5小时后分析显示1:1比率的ArNHOH和ArNH2。在放置过夜后反应达到完成，1H NMR分析显示3%脱溴副产物。将催化剂滤出，然后残余物用乙酸乙酯(3 L)稀释和用20%碳酸钾溶液(3.5 L)洗涤。然后有机物经干燥，过滤和真空浓缩，得到残余物，然后将其在5倍体积的乙醚中制浆过夜，以减少脱溴物类的水平(在制浆后<2%)。以90%收率获得小标题化合物，LC纯度为86%。
(iii) 3-氨基-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((三异丙基甲硅烷 基)乙炔基)苯甲酰胺
在氮气下向10 L烧瓶中加入来自上文步骤(ii)的产物(700 g, 1.93 mol)和THF(5.59 L)。这之后加入CuI (19.2 g, 0.1 mol)、三乙基胺(1.29 L, 9.27 mol)和乙炔基三异丙基甲硅烷(389 g, 2.13 mol)。将反应物脱气和用氮气吹扫三次。加入Pd(PPh3)4(125.5 g, 0.198 mol)，将反应物脱气和用氮气吹扫。将反应物加热至65℃过夜，然后LC显示91%产物和<1%原料。反应混合物经真空浓缩，然后将残余物溶于乙酸乙酯(2 L)和通过二氧化硅塞(2 kg)，用另外的乙酸乙酯(30 L)洗脱。将含产物部分经真空浓缩，然后将粗产物溶于TBME (5 L)和用6 N HCl (5 L)萃取。含水HCl相用TBME (2 x 5 L)洗涤，然后用6 NNaOH碱化至pH 9-10。然后产物用TBME (2 x 5 L)萃取，有机物经干燥，过滤和真空浓缩，得到635g的小标题化合物，1H NMR (排除溶剂)纯度>95%。
(iv) 3-氨基-5-乙炔基-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺
向含来自上文步骤(iii)的产物(1200 g, 2.59 mol)的MeCN (8.8 L)加入CsF(433.6 g, 2.85 mol)。将反应物在室温下搅拌过夜，然后HPLC分析显示1.7%产物、97.4%原料。加入另外的CsF (420 g, 2.76 mol)，将反应物在室温下搅拌过夜，之后HPLC分析显示91.0%产物、4.4%原料。将混合物过滤，将滤液真空浓缩，得到物质，通过HPLC其为92.5%产物、0.7%原料。将残余物溶于DCM (3 L)和EtOAc (3 L)，然后分成两等份。将各部分通过二氧化硅垫(1.6 kg)，用EtOAc (50 L)洗脱。将滤液合并和真空浓缩。粗物质用庚烷(2 x 4L)洗涤以除去甲硅烷基杂质。分离总共719 g的小标题化合物(通过1H NMR分析83%，75%有效收率，597 g有效量)。
(v) (4-((2-((3-乙炔基-5-((2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰 基)苯基)-氨基)嘧啶-4-基)氧基)萘-1-基)氨基甲酸叔丁酯
在N2下加入来自上文步骤(iv)的产物(301.2 g, 250.0 g有效量, 0.816 mol)、(4-((2-氯嘧啶-4-基)氧基)萘-1-基)氨基甲酸叔丁酯(参见例如Ito, K.等, WO 2010/067130, 17 Jun 2010; 252.8 g, 0.680 mol)、pTSA.H2O (24.7 g, 0.130 mol)和THF(7600 mL)。将深红溶液加热至回流6 h，然后冷却至室温，之后HPLC分析显示0.25%步骤(iv)的产物、22.24%步骤(vi)的产物、8.98%氯嘧啶原料和64.08%步骤(v)的产物。加入来自上文步骤(iv)的其它产物(27.1 g, 22.5 g有效量, 73.4 mmol)，将反应物加热至回流和搅拌过夜，随后HPLC分析显示0.20%步骤(iv)的产物、30.23%步骤(vi)的产物、4.50%起始氯嘧啶和58.61%步骤(v)的产物。
将反应冷却至室温和用20% K2CO3 (735 mL)淬灭，然后分离各层，有机层用饱和盐水(880 mL)洗涤。有机层经MgSO4干燥，过滤和浓缩，以分离棕色粘稠固体。收率 = 491.2g(93.8%)。HPLC显示30.59%步骤(vi)的产物和59.50%步骤(v)的产物，1H NMR与结构一致。
(vi) 3-((4-((4-氨基萘-1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-5-乙炔基-N-(2-(2-(2- 甲氧基-乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺
在N2下加入来自上文步骤(v)的粗产物混合物(491.2 g)和DCM (3700 mL)。逐滴加入TFA (695 mL, 12.3当量)，同时保持温度低于20℃。将深棕色溶液在室温下搅拌过夜，接着HPLC分析显示86.90%步骤(vi)的产物和0.94%步骤(v)的产物。将混合物浓缩，将残余物溶于EtOAc (3700 mL)，然后用饱和NaHCO3水溶液(2 x 2000 mL)洗涤直到pH达到7–8。有机层经MgSO4干燥，过滤和浓缩，以分离紫色固体。收率 = 360.8g。HPLC纯度78.58%。
(vii) 5-叔丁基-2-甲氧基-3-硝基苯胺
在N2下加入4-叔丁基-2,6-二硝基茴香醚(620 g, 2.439 mol)、IMS (4774 mL)和10% Pd/C (31.8g)。将反应混合物加热至回流(78℃)，经4.5 h滴加4-甲基-1-环己烯(500mL, 4.159 mol)。将反应物回流搅拌过夜，之后HPLC分析显示72.13%产物和27.17%原料。经3 h滴加另外的4-甲基-1-环己烯(160 mL, 1.331 mol)，将反应物回流搅拌72 h。HPLC分析显示92.72%产物和0%原料。将反应冷却至室温，催化剂经真空过滤除去和用IMS (500 mL)洗涤。将溶剂浓缩至约1200 mL，得到比率为1 : 4.45的产物:乙醇(目标1 : 5)。滴加2 MHCl (124 mL)至剩余物，同时保持温度低于23℃。加入水(3100 mL)，将得到的混悬液在室温下搅拌1.5 h。经真空过滤收集固体，用水(2 x 1000 mL)洗涤。将得到的橙色针状物在真空下在40℃干燥过夜。收率 = 475.2 g (86.9%)。1H NMR纯度>97%。HPLC纯度98.8%。KF0.36%。
(viii) N-(5-叔丁基-2-甲氧基-3-硝基苯基)甲烷磺酰胺
在N2下加入步骤(vii)的产物(471 g, 2.099 mol)、甲苯(1880 mL)和吡啶(471mL)，然后经1 h滴加甲烷磺酰氯(179 mL)同时保持温度低于35℃。将反应物在30-35℃搅拌过夜，然后冷却至低于20℃，然后加入水(1880 mL)和2 M HCl (1880 mL) (达到pH 3)。分离各层，有机相用2.5%盐水(1880 mL)洗涤。然后经0.5 h加入庚烷(3760 mL)至有机层以分离沉淀物。将混合物冷却至0℃和搅拌1 h。经真空过滤收集固体和用庚烷(1880 mL)洗涤，然后真空下在40℃干燥过夜。收率 = 551 g (87%)。HPLC纯度98.5%。1H NMR纯度>97%。
(ix) N-(3-氨基-5-叔丁基-2-甲氧基苯基)甲烷磺酰胺
向5L氢化器加入来自上文步骤(viii)的产物(209.4 g, 0.693 mol)、甲醇(1675mL, 8倍体积)和10% Pd/C (10.2 g)。容器用3 x N2和3 x H2吹扫，然后在0.3447 MPa (50psi) H2下搅拌直到未观察到进一步放热，HPLC表明96.35%产物和1.10%原料。反应物用THF(314 mL)稀释，催化剂经真空过滤除去(Cuno过滤器)，然后用THF (1000 mL)洗涤。将溶剂浓缩以分离浅棕色固体，将其在真空下在40℃干燥过夜。收率 = 167.0 g (88.5%)。HPLC纯度96.7%。1H NMR纯度>95%。
(x) N-[5-叔丁基-3-(甲烷磺酰胺基)-2-甲氧基苯基]氨基甲酸苯酯
在N2下加入上文步骤(ix)的产物(167.0 g, 613 mmol)、NaHCO3 (77.3 g, 920mmol)、THF (870 mL)和DCM (1440 mL)。滴加氯甲酸苯酯(82.6 mL, 659 mmol)，同时保持温度低于20℃，将反应物在室温下搅拌4 h。反应混合物的HPLC分析显示98.6%产物和0.03%原料。将反应混合物过滤，滤饼用THF (~50 mL)洗涤。将滤液浓缩至~900 mL，加入环己烷(2400 mL)，然后将混合物放置搅拌过夜。经真空过滤收集得到的固体，用环己烷(500 mL)洗涤。将产生的浅粉色固体在真空下在40℃干燥4h。收率 = 232.6g (96.7%)。HPLC纯度94.5%。1H NMR纯度>95%。
(xi) 3-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘- 1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-5-乙炔基-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰 胺
在N2下加入上文步骤(vi)的产物(175.5g, 0.324mol)、上文步骤(x)的产物(145.0 g, 0.369 mmol)和iPrOAc (8800 mL)。将得到的溶液加热至60℃，加入一批NEt3(9.3 mL)，然后将混合物放置在60℃搅拌过夜，接着HPLC分析显示25.77%步骤(vi)的产物、3.60%步骤(x)的产物和57.85%步骤(xi)的产物。加入步骤(x)的其它产物(36.0 g, 0.092mol)，然后将反应物放置在60℃搅拌过夜，之后HPLC分析显示5.47%步骤(vi)的产物、3.72%步骤(x)的产物和73.33%步骤(xi)的产物。将反应混合物冷却至室温，然后浓缩以分离深紫色固体(522.9 g)。该固体自乙腈(2615 mL, 5倍体积)再结晶，然后经真空过滤收集和用iPrOAc (2 x 500 mL)洗涤。将得到的粉色固体在真空下在40℃干燥过夜，得到181.1 g(66.5%)的标题化合物，HPLC纯度为99.27%。1H NMR与结构一致。
生物试验：实验方法
酶结合测定法(Kinomescan)
本文公开的化合物的激酶结合活性可使用专有的测定法测定，其测量与固定化配体的活性位点定向的竞争结合(Fabian, M.A.等, Nature Biotechnol., 2005, 23:329-336)。这些测定法可通过DiscoverX (以前的Ambit; San Diego, CA)进行。通过与试验化合物孵育产生的抑制百分比可相对于非-抑制对照计算。
酶抑制测定法
本文公开的化合物的酶抑制活性通过FRET使用用供体和受体荧光团(Z-LYTE,Invitrogen Ltd., Paisley, UK)标记的合成肽测定。
p38 MAPKα酶抑制
以下两个测定法变型可用于测定p38 MAPKα抑制。
方法1
试验化合物针对p38 MAPKα同种型(MAPK14: Invitrogen)的抑制活性通过测定下游分子MAPKAP-K2的活化/磷酸化水平间接评价。将p38 MAPKα蛋白(80 ng/mL, 2.5 µL)与试验化合物(2.5 µL，4 µg/mL、0.4 µg/mL、0.04 µg/mL或0.004 µg/mL)在室温下混合2小时。然后加入p38α无活性靶MAPKAP-K2 (Invitrogen, 600 ng/mL)和FRET肽(8 μM;MAPKAP-K2的磷酸化靶)的混合溶液(2.5 µL)，然后激酶反应通过加入ATP (40 μM, 2.5µL)而开始。将混合物在室温下孵育1小时。加入显色剂(蛋白酶, 5 µL)后1小时，在荧光微板阅读器(Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)上检测。
方法2
该方法按照与上文方法1相同的步骤，但使用更高浓度的p38 MAPKα蛋白(2.5 µL200 ng/mL蛋白代替2.5 µL 80 ng/mL蛋白)，与试验化合物(以1 µg/mL、0.1 µg/mL、0.01 µg/mL或0.001 µg/mL试验)混合。
p38 MAPKγ酶抑制
本发明的化合物对p38MAPKγ (MAPK12: Invitrogen)的抑制活性以与上文描述的类似方式评价。将酶(800 ng/mL, 2.5 µL)与试验化合物(2.5 µL 4 µg/mL、0.4 µg/mL、0.04 µg/mL,或0.004 µg/mL)在室温下孵育2小时。然后加入FRET肽(8 μM, 2.5 µL)和合适的ATP溶液(2.5 μL, 400 μM)至酶/化合物混合物，将全部孵育1小时。加入显色剂(蛋白酶,5 µL)后1小时，在荧光微板阅读器(Varioskan® Flash, Thermo Scientific)上检测。
c-Src和Syk酶抑制
本发明的化合物对c-Src和Syk酶(Invitrogen)的抑制活性以与上文描述的类似方式评价。将相关的酶(分别为3000 ng/mL或2000 ng/mL，2.5 µL)与试验化合物(1 µg/mL、0.1 µg/mL、0.01 µg/mL或0.001 µg/mL，各自2.5 µL)在室温下孵育2小时。然后加入FRET肽(8 μM, 2.5 µL)和合适的ATP溶液(2.5 μL, 800 μM对于c-Src，和60 μM ATP对于Syk)至酶/化合物混合物，将混合物孵育1小时。加入显色剂(蛋白酶, 5 µL)后1小时，在荧光微板阅读器(Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)上检测。
GSK 3α酶抑制
以下两个测定法变型可用于测定GSK 3α抑制。
方法1
本发明的化合物对GSK 3α酶同种型(Invitrogen)的抑制活性通过测定靶肽的活化/磷酸化水平来评价。将GSK3-α蛋白(500 ng/mL, 2.5 µL)与试验化合物(2.5 µL 4 µg/mL、0.4 µg/mL、0.04 µg/mL或0.004 µg/mL)在室温下混合2小时。然后加入FRET肽(8 μM,2.5 µL) (其为GSK3α的磷酸化靶)和ATP (40 μM, 2.5 µL)至酶/化合物混合物，将得到的混合物孵育1小时。加入显色剂(蛋白酶, 5 µL )后1小时，在荧光微板阅读器(Varioskan®Flash, ThermoFisher Scientific)中检测。
在所有情况下，位点特异性蛋白酶仅切割非磷酸化肽和消除FRET信号。各反应的磷酸化水平使用香豆素发射(供体)与荧光素发射(受体)的比率来计算，其中高比率表示高磷酸化而低比率表示低磷酸化水平。各反应的抑制百分比相对于非抑制对照计算，然后自浓度反应曲线计算50%抑制浓度(IC50值)。
方法2
该方法按照与上文方法1相同的步骤，但使用试验化合物(105分钟代替2小时)与GSK3-α蛋白的更短的混合时间。此外，使用的试验化合物的浓度为10 µg/mL、1 µg/mL、0.1µg/mL或0.01 µg/mL。
细胞测定法
本发明的化合物使用以下测定法的一个或多个进行研究。
(a) Jurkat细胞的p38 MAPKα和Lck的抑制
将Jurkat T细胞在饥饿培养基(RPMI 1640 + 5% FBS)中培养24 h，然后进行实验。收获细胞，以10x106个细胞/mL再悬浮于饥饿培养基，然后以1x106个细胞/孔置于圆底96孔板。刺激前2 h，加入连续稀释的试验化合物(1%最终DMSO浓度)。与化合物预孵育后，细胞用H2O2 (0.05%最终)刺激5分钟。通过在2000 rpm离心(3分钟，4℃)终止反应，然后除去上清液，添加100 µL的冷却的固定/透化溶液(BD Fix/Perm kit #554714)。将板在4℃孵育20分钟，然后离心和用提供的1x洗涤培养基(BD Fix/Perm kit #554714)洗涤。细胞针对CellSignalling Technology (9211s)提供的磷酸-p38α (T180/182)或R&D (MAB7500)提供的磷酸-Lck (Y394)染色。将抗体稀释至5 µg/mL (R&D)或1:200 (Cell SignallingTechnology)稀释在洗涤培养基中，然后在4℃在暗室中孵育1 h。用冰冷的洗涤缓冲液3次重复洗涤后，以1:1000的稀释度加入第二抗体(抗-兔-FITC #F1362或抗-小鼠-FITC #F2883，两者都来自Sigma)和在4℃在暗室中孵育1 h。然后将细胞在冷的洗涤缓冲液中洗涤3次，接着最后在冷的PBS中洗涤，重悬于150 µL冷的PBS。通过流式细胞术使用BD AccuriC6分析细胞。
(aa) 在d-U937细胞中LPS-诱导的TNFα / IL-8释放
U937细胞(人单核细胞细胞系)通过与卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA; 100 ng/mL)孵育48-72小时而分化成巨噬细胞型细胞。将细胞与终浓度的试验化合物预孵育2小时，然后用0.1 μg/mL的LPS (来自大肠杆菌: 0111:B4, Sigma)刺激4小时。收集上清液用于通过夹心ELISA (Duo-set, R&D systems)测定TNFα和IL-8浓度。TNFα产生的抑制计算为在各浓度的试验化合物下通过10 μg/mL的BIRB796实现的抑制与溶媒对照相比的百分比。相对50%有效浓度(REC50)从得到的浓度反应曲线测定。IL-8产生的抑制在各浓度的试验化合物下通过与溶媒对照比较而计算。50%抑制浓度(IC50)自得到的浓度反应曲线测定。
(b) 在PBMC细胞中LPS-诱导的TNFα / IL-8释放
使用密度梯度(Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare)从全血分离来自健康受试者的外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC接种在96孔板中和用所需浓度的本发明化合物处理2小时，然后在正常组织培养条件(37℃，5%CO2)下加入1 ng/mL LPS (大肠杆菌0111:B4，来自Sigma Aldrich)达24小时。收获上清液用于通过夹心ELISA (Duo-set, R&D systems)测定IL-8和TNFα浓度，在荧光微板阅读器(Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)上读数。在50%抑制IL-8和TNFα产生时的浓度(IC50)从剂量反应曲线计算。
(c) 在CD3/CD28刺激的PBMC细胞中IL-2和IFN γ释放
来自健康受试者的PBMC自全血使用密度梯度(Lymphoprep, Axis-ShieldHealthcare)分离。将细胞加入用CD3/CD28单克隆抗体的混合物(分别为0.3 µg/mLeBioscience和3 µg/mL BD Pharmingen)预包被的96孔板。然后将所需浓度的化合物加入各孔和在正常组织培养条件下将板放置3天。收获上清液，通过夹心ELISA (Duo-set, R&DSystem)测定IL-2和IFN γ释放。IC50从剂量反应曲线测定。
(d) 在HT29细胞中IL-1β-诱导的IL-8释放
将HT29细胞(人结肠腺癌细胞系)放置在96孔板中(24小时)和用所需浓度的本发明化合物预处理2小时，然后加入5 ng/mL的IL-1β (Abcam)达24小时。收获上清液用于通过夹心ELISA (Duo-set, R&D System)定量IL-8。IC50从剂量反应曲线测定。
(e) 在原代巨噬细胞中LPS-诱导的IL-8和TNFα释放
来自健康受试者的PBMC从全血使用密度梯度(Lymphoprep, Axis-ShieldHealthcare)分离。将细胞孵育2小时，通过洗涤除去非粘附的细胞。为将细胞分化成巨噬细胞，将它们与5 ng/mL的GM-CSF (Peprotech)一起在正常组织培养条件下孵育7天。然后将所需浓度的本发明化合物加入细胞进行2小时预孵育，然后用10 ng/mL LPS刺激24小时。收获上清液，IL-8和TNFα释放通过夹心ELISA (Duo-set, R&D System)测定。IC50从剂量反应曲线测定。
(f) 在BEAS2B细胞中多聚I:C-诱导的ICAM-1表达
多聚I:C作为简单的RNA病毒模拟物用于这些研究。将多聚I:C-Oligofectamine混合物(1 μg/mL多聚I:C, ± 2% Oligofectamine, 25 μL; 分别为Invivogen Ltd., SanDiego, CA和Invitrogen, Carlsbad, CA)转染至BEAS2B细胞(人支气管上皮细胞, ATCC)。细胞用终浓度的试验化合物预孵育2小时，在细胞表面上表达的ICAM1的水平通过基于细胞的ELISA测定。在多聚I:C转染后18小时的时间点，细胞用含4%甲醛的PBS固定，然后内源过氧化物酶通过加入含0.1%叠氮化钠和1%过氧化氢的洗涤缓冲液(100 μL, 含0.05% Tween的PBS: PBS-Tween)淬灭。细胞用洗涤缓冲液(3 x 200 μL)洗涤，在用含5%牛奶的PBS-Tween (100 μL)封闭各孔1小时后，将细胞与含抗-人ICAM-1抗体(50 μL; CellSignalling Technology, Danvers, MA)的1% BSA PBS在4℃孵育过夜。
细胞用PBS-Tween (3 x 200 μL)洗涤并与第二抗体(100 μL; HRP-缀合的抗-兔IgG, Dako Ltd., Glostrup, Denmark)一起孵育。然后将细胞与底物(50 μL)一起孵育2-20分钟，接着加入终止溶液(50 μL, 1N H2SO4)。使用分光光度计，通过读出相对于655 nm的参比波长的450 nm的吸光度，检测ICAM-1信号。然后细胞用PBS-Tween (3 x 200 μL)洗涤，在结晶紫染色(50 μL含2%的PBS溶液)和通过含1% SDS的蒸馏水溶液(100 μL)洗脱后，通过读出595 nm的吸光度检测各孔中的总细胞数。测量的OD 450-655读数通过除以各孔中OD595读数针对细胞数校正。在各浓度的试验化合物下通过与溶媒对照比较，计算ICAM-1表达的抑制。根据得到的浓度反应曲线，测定50%抑制浓度(IC50)。
(g) 细胞有丝分裂测定法
来自健康受试者的外周血单核细胞(PBMC)使用密度梯度(Histopaque®-1077,Sigma-Aldrich, Poole, UK)从全血(Quintiles, London, UK)分离。PBMC (3百万个细胞/样品)随后用2% PHA (植物血细胞凝集素, Sigma-Aldrich, Poole, UK)处理48小时，接着暴露于各种浓度的试验化合物20小时。收集前2小时，PBMC用秋水仙胺(0.1 µg/mL;Invitrogen, Paisley, UK)处理以使细胞停止在分裂中期。为观察有丝分裂的细胞，PBMC通过加入Intraprep (50 µL; Beckman Coulter, France)透化和固定，和用抗-磷酸-组蛋白3 (0.26 ng/L; #9701; Cell Signalling, Danvers, MA)和碘化丙啶(1 mg/mL;Sigma-Aldrich, Poole, UK)染色，如前所述(Muehlbauer P.A.和Schuler M.J.,Mutation Research, 2003, 537:117-130)。使用ATTUNE流式细胞仪(Invitrogen,Paisley, UK)，门控淋巴细胞，观察荧光。对各处理，相对于溶媒(0.5% DMSO)处理，计算有丝分裂的抑制百分比。
(h) 鼻病毒-诱导的IL-8释放和ICAM-1表达
人鼻病毒RV16自美国典型培养物保藏中心(Manassas, VA)获得。通过用HRV感染HeLa细胞直到80%的细胞发生细胞病变，产生病毒贮液。
BEAS2B细胞用HRV以5的MOI感染并在33℃孵育2小时，同时轻轻摇动以促进吸收。然后细胞用PBS洗涤，加入新鲜的培养基和细胞孵育另外72小时。收集上清液用于使用Duoset ELISA显色试剂盒(R&D systems, Minneapolis, MN)测定IL-8浓度。
表达ICAM-1的细胞表面的水平通过基于细胞的ELISA测定。在感染后72小时，细胞用含4%甲醛的PBS固定。在通过加入0.1%叠氮化钠和1%过氧化氢淬灭内源过氧化物酶后，各孔用洗涤缓冲液(含0.05% Tween的PBS: PBS-Tween)洗涤。在用含5%牛奶的PBS-Tween封闭孔1小时后，细胞与含抗-人ICAM-1抗体的5% BSA PBS-Tween (1:500)孵育过夜。各孔用PBS-Tween洗涤，并与第二抗体(HRP-缀合的抗-兔IgG, Dako Ltd.)一起孵育。通过加入底物和使用分光光度计在450 nm与参比波长655 nm读出，检测ICAM-1信号。然后各孔用PBS-Tween洗涤，在结晶紫染色和用1% SDS溶液洗脱后通过读出595 nm的吸光度，检测各孔中的总细胞数。测量的OD450-655读数通过除以各孔中的OD595读数对细胞数进行校正。HRV感染前2小时以及感染后2小时(此时将未感染的HRV洗出)加入化合物。
(i) MRC5细胞中HRV16诱导的细胞病变作用(CPE)的评估
MRC5细胞用HRV16以1的MOI在含5% FCS和1.5 mM MgCl2的DMEM中感染，接着在33℃孵育1小时以促进吸附。吸出上清液，然后加入新鲜的培养基，接着孵育4天。合适时，细胞与化合物或DMSO一起预孵育2小时，在洗出病毒后再次加入化合物和DMSO。
在室温下，吸出上清液和与亚甲基蓝溶液(100 μL, 2%甲醛、10%甲醇和0.175%亚甲基蓝)一起孵育2小时。洗涤后，向各孔加入含1% SDS的蒸馏水(100 μL)，和将板轻轻摇动1-2小时，然后读出660 nm的吸光度。计算各孔的抑制百分比。IC50值从通过连续稀释试验化合物产生的浓度反应曲线计算。
(j) 原代支气管上皮细胞中的体外RSV病毒负载
生长在96孔板中的正常人支气管上皮细胞(NHBEC)用RSV A2 (毒株A2, HPA,Salisbury, UK)以0.001的MOI在含15 mM氯化镁的LHC8培养基:RPMI-1640 (50:50)中感染，和在37℃孵育1小时用于吸附。细胞用PBS (3 x 200 μL)洗涤，然后加入新鲜的培养基(200 μL)和继续孵育4天。合适时，细胞与化合物或DMSO一起预孵育2小时，然后在病毒洗出后再次加入。
细胞用含4%甲醛的PBS溶液(50 μL)一起孵育20分钟，用WB (3 x 200 μL) (洗涤缓冲液，含0.5% BSA和0.05% Tween-20的PBS)洗涤，和与封闭溶液(含5%炼乳的PBS)一起孵育1小时。然后细胞用WB (3 x 200 μL)洗涤和在室温下用含抗-RSV (2F7) F-融合蛋白抗体(40 μL; 小鼠单克隆, lot 798760, Cat. No.ab43812, Abcam)的5% BSA/PBS-tween孵育1小时。洗涤后，细胞与含HRP-缀合的第二抗体溶液(50 μL)的5% BSA/PBS-Tween (lot00053170, Cat.No. P0447, Dako)一起孵育，然后加入TMB底物(50 μL; 底物试剂包, lot269472, Cat. No. DY999, R&D Systems, Inc.)。该反应通过加入2N H2SO4 (50 µL)终止，将得到的信号在微板阅读器(Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)中比色测量(OD: 450 nm与参比波长655 nm)。
然后洗涤细胞，加入2.5%结晶紫溶液(50 μL; lot 8656, Cat. No. PL7000,Pro-Lab Diagnostics)达30分钟。用WB洗涤后，向各孔中加入含1% SDS的蒸馏水(100 μL)，在振荡器上将板轻轻摇动1小时，然后读出595 nm的吸光度。测量的OD450-655读数通过将OD450-655除以OD595读数对细胞数进行校正。计算各孔的抑制百分比，IC50值根据自连续稀释的化合物产生的浓度反应曲线计算。
(k) 细胞成活力测定法：MTT测定
将分化的U937细胞与各试验化合物(终浓度为1 μg/mL或10 μg/mL，在200 μL下文显示的培养基中)一起以两个方案预孵育：第一个方案为在5% FCS RPMI1640培养基中4小时，第二个方案为在10% FCS RPMI1640培养基中24小时。上清液置换为新鲜的培养基(200μL)，向各孔加入MTT贮液(10 μL, 5 mg/mL)。孵育1小时后，除去培养基，向各孔加入DMSO(200 μL)，将板轻轻摇动1小时，然后读出550 nm的吸光度。相对于溶媒(0.5% DMSO)处理，计算各孔的细胞成活力的损失百分比。因此，药物处理相对于溶媒的细胞成活力的明显增加作为负百分比显示。
(l) 人活检测定法
肠粘膜活检自IBD患者的结肠的发炎区域获得。将活检材料切成小块(2–3 mm)，在器官培养室中在37℃在5% CO2/95% O2气氛中在无血清培养基中置于钢网上。向组织加入DMSO对照或所需浓度的试验化合物，在器官培养室中孵育24小时。收获上清液用于通过R&DELISA测定IL-6、IL-8、IL-1β和TNFα水平。相对于对于DMSO对照(100%)测定的细胞因子释放，计算通过试验化合物的细胞因子释放的抑制百分比。
(m) β联蛋白在d-U937细胞中的累积
U937细胞(一种人单核细胞细胞系)通过与PMA (100 ng/mL)一起孵育48-72小时分化成巨噬细胞型细胞。然后将细胞与终浓度的试验化合物或溶媒一起孵育18小时。通过试验化合物诱导β-联蛋白通过置换培养基为4%甲醛溶液来终止。内源过氧化物活性通过与淬灭缓冲液(100 μL, 含0.1%叠氮化钠、1% H2O2的PBS，含0.05% Tween-20)一起孵育20分钟中和。细胞用洗涤缓冲液(200 µL; 含0.05% Tween-20的PBS)洗涤，与封闭溶液(200 µL;含5%牛奶的PBS)一起孵育1小时，用洗涤缓冲液(200 µL)再洗涤，然后与在1% BSA/PBS中的抗-β-联蛋白抗体溶液(50 μL) (BD, Oxford, UK)一起孵育过夜。
用洗涤缓冲液(3 x 200 µL; 含0.05% Tween-20的PBS)洗涤后，将细胞与含HRP-缀合的第二抗体溶液(100 μL)的1% BSA/PBS (Dako, Cambridge, UK)一起孵育，得到的信号使用TMB底物( 50 µL; R&D Systems, Abingdon, UK)比色测定(OD: 450 nm与参比波长655 nm)。该反应通过加入1N H2SO4溶液(50 μL)终止。然后用洗涤缓冲液洗涤细胞，加入2%结晶紫溶液(50 μL)达30分钟。用洗涤缓冲液(3 x 200 µL)洗涤后，向各孔加入1% SDS(100 μL)，将板轻轻摇动1小时，然后测量595 nm的吸光度(Varioskan® Flash, Thermo-Fisher Scientific)。
测量的OD450-655读数通过将OD450-655除以OD595读数对细胞数进行校正。相对于溶媒计算各孔的诱导百分比，并且将诱导比率与通过包含作为整体定义的参比化合物N-(4-(4-(3-(3-叔丁基-1-对甲苯基-1H-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基氧基)吡啶-2-基)-2-甲氧基乙酰胺(1 μg/mL)的标准对照产生的诱导相比进行标准化。
(n) T细胞增殖
来自健康受试者的PBMC使用密度梯度(Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare)从全血分离。按照制造商的说明书(Miltenyi Biotec 130-091-155)，淋巴细胞级分首先针对CD4+ T细胞通过负磁细胞分选进行富集。然后按照制造商的说明书(130-045-901)，幼稚CD4+ T细胞使用正磁筛选CD45RA+细胞，使用微珠进行分离。将细胞以2x105个细胞/孔在100 μL RPMI/10%FBS中置于96孔平底板(Corning Costar)中，将25 μL的试验化合物在正常培养基中稀释至合适的浓度(8x终浓度)和加入至板上的一式两份的孔中，得到0.03 ng/mL – 250 ng/mL的剂量反应范围。加入DMSO作为阴性对照。将板预孵育2小时，然后用1 μg/mL抗-CD3 (OKT3; eBioscience)刺激。72小时后，各孔中的培养基用150 μL含10 μM BrdU(Roche)的新鲜的培养基置换。16小时后，除去上清液，将板干燥，并且按照制造商的说明书(Roche)，通过向各孔中加入100 μL的固定/变性溶液达20分钟使细胞固定。用PBS将板洗涤一次，然后加入抗-BrdU检测抗体和在室温下孵育90分钟。然后用提供的洗涤缓冲液将板轻轻洗涤3次，通过加入100 μL的底物溶液显色。反应通过加入50 μL的1 M H2SO4终止，和在读板仪(Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)上读出450 nm的吸光度。IC50从剂量反应曲线测定。
(o) 在来自IBD患者的CD3/CD28刺激的LPMC细胞中IL-2和IFN γ 释放
固有层单核细胞(LPMC)从手术样本的发炎的IBD粘膜或从手术样本的正常粘膜如下分离和纯化：
粘膜用解剖刀从手术样本的较深层移出，切成大小3-4mm的碎片。通过用含1 mMEDTA (Sigma-Aldrich, Poole, UK)的HBSS (Sigma-Aldrich)洗涤组织碎片三次同时使用磁力搅拌器搅拌而除去上皮，每次洗涤后弃去上清液。接着在37℃用1A型胶原酶(1 mg/mL;Sigma-Aldrich)处理样品1小时，同时搅拌。然后使用100 μm细胞过滤器将得到的细胞混悬液过滤，洗涤两次，再悬浮于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基(Sigma-Aldrich)，和用于细胞培养。
在DMSO对照或合适浓度的化合物的存在下，新分离的LPMC (2x105个细胞/孔)用1µg/mL α-CD3/α-CD28刺激48小时。48小时后，除去上清液和通过R&D ELISA测定TNFα和IFNγ的存在。相对于对DMSO对照(100%)测定的细胞因子释放，计算试验化合物对细胞因子释放的抑制百分比。
(p) 自IBD患者分离的成肌纤维细胞的细胞因子释放的抑制
来自发炎的IBD粘膜的成肌纤维细胞如下分离：
将粘膜切下和弃去，将1 mm大小的粘膜样品在37℃在潮湿的CO2孵育箱中在添加20% FBS、1%非必需氨基酸(Invitrogen, Paisley, UK)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、50 μg/mL庆大霉素和1 μg/mL两性霉素(Sigma-Aldrich)的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM, Sigma-Aldrich)中培养。将建立的成肌纤维细胞集落接种在25-cm2培养烧瓶中，在添加20% FBS和抗生素的DMEM中培养至至少第4代，以提供足够数量用于刺激实验。
以3x105个细胞/孔接种在12孔板中的亚汇合的单层成肌纤维细胞在无血清培养基中在37℃, 5%CO2中饥饿24 h，然后在DMSO对照或合适浓度的化合物的存在下培养24 h。24小时后，除去上清液和通过R&D ELISA测定IL-8和IL-6的存在。相对于对DMSO对照(100%)测定的细胞因子释放，计算试验化合物对细胞因子释放的抑制百分比。
(q) 人嗜中性粒细胞脱粒
嗜中性粒细胞自人外周血如下分离：
通过静脉刺穿收集血液，并通过加入1:1 EDTA:无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS, 无Ca+/Mg+)而抗凝固。加入葡聚糖(3% w/v) (1份葡聚糖溶液对4份血液)，在室温下将血液放置约20分钟。上清液在密度梯度(Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare)上小心分层和离心(15分钟，2000rpm, 无制动)。吸出上清液，将细胞沉淀再悬浮于无菌盐水(0.2%)中不超过60秒(以裂解污染的红细胞)。然后加入10倍体积的PBS，将细胞离心(5分钟, 1200 rpm)。将细胞再悬浮于HBSS+ (含细胞松弛素B (5 μg/mL)和1 mM CaCl2的Hanks缓冲盐溶液(无酚红))，获得5 x 106个细胞/mL。
向V-底96孔板的各孔中加入5 x 104个细胞并与合适浓度的试验化合物(0.3 –1000 ng/mL)或溶媒(DMSO, 0.5%终浓度)一起孵育(30分钟, 37℃)。通过加入fMLP (终浓度1 μM)刺激脱粒。进一步孵育(30分钟, 37℃)后，通过离心(5分钟, 1500 rpm)除去细胞，将上清液转移至平底96孔板。加入等体积的四甲基联苯胺(TMB)，10分钟后，通过加入等体积的硫酸(0.5 M)终止反应，读出450 nm的吸光度(减去655nm的背景)。50%抑制浓度(IC50)从得到的浓度反应曲线测定。
(r) 细胞毒性测定法
在195 µL培养基(补充10%胎牛血清的RPMI)中，将5 x 104个TK6细胞(成淋巴细胞T细胞系)加入至96孔板的合适数量的孔中。将5 µL的DMSO对照(终浓度0.5% v/v)或试验化合物(终浓度5或1 µg/mL)加入至各孔中，并在37℃, 5% CO2中孵育。24小时后，将板以1300rpm离心3分钟和弃去上清液。然后将细胞再悬浮于含7.5 µg/mL碘化丙啶(PI)的PBS中。15分钟后，将细胞通过流式细胞术(BD accuri)分析。%存活力计算为在标准化至DMSO对照的试验孔中为PI阴性的细胞的%。
体内筛选：药效学和抗炎活性
(i) 在小鼠中LPS诱导的嗜中性粒细胞积聚
未禁食的Balb/c小鼠通过气管内途径以指定的次数(在2-8小时范围内)给予溶媒或试验物质，然后通过施用LPS攻击刺激炎性反应。在T = 0时，将小鼠置于暴露室中，暴露于LPS (7.0 mL, 0.5 mg/mL溶液，在PBS中) 30分钟。另外8小时后，将动物麻醉，将它们的气管插管，通过灌注提取BALF，然后从它们的肺中经过气管导管抽出1.0 mL的PBS。在BALF样品中的总白细胞计数和白细胞分类计数使用Neubaur血球计测量。BALF样品的细胞离心涂片通过在室温下以200 rpm离心5分钟制备，并使用DiffQuik染色系统(Dade Behring)染色。使用油浸显微镜将细胞计数。BAL中的嗜中性粒细胞数的数据表示为平均值± S.E.M.(平均值的标准误差)。相对于溶媒处理，计算各处理的嗜中性粒细胞积聚的抑制百分比。
(ii) 香烟烟雾模型
使用用于小动物的Tobacco Smoke Inhalation Experiment System (ModelSIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tokyo, Japan)，将A/J小鼠(雄性, 5周龄)暴露于香烟烟雾(4%香烟烟雾，用空气稀释) 30分钟/天达11天。在最后的香烟烟雾暴露后，将试验物质经鼻内给予(35 μL的溶液，在50% DMSO/PBS中)每天一次达3天。最后给药后12小时，将各动物麻醉，将气管插管，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。使用抗-小鼠MOMA2抗体(巨噬细胞)或抗-小鼠7/4抗体(嗜中性粒细胞)，肺泡巨噬细胞和嗜中性粒细胞的数量通过FACS分析(EPICS® ALTRA II, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)测定。
(iii) 小鼠中DSS诱导的结肠炎
通过用葡聚糖硫酸钠(DSS)处理刺激炎性反应前一天(第-1天)，未禁食的10-12周龄、雄性BDF1小鼠通过口服强饲每日两次给予溶媒、参考物(5-ASA)或试验化合物。在研究的第0天，在饮用水中给予DSS (5% w/v)，接着BID给予溶媒(5 mL/kg)、参考(100 mg/kg)或试验化合物(5 mg/kg)达7天。含DSS的饮用水每3天装满一次。在研究期间，每天对动物称重，进行粪便观察和基于粪便稠度记录作为评分。在第+6天处死时，移出大肠，记录长度和重量。将结肠切片用于MPO分析以测定嗜中性粒细胞浸润，或用于组织病理学评分以确定疾病严重性。
(iv) 小鼠中TNBS诱导的结肠炎
通过用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) (15 mg/mL，在50%乙醇/50%盐水中)处理刺激炎性反应前一天(第-1天)，未禁食的10-12周龄、雄性BDF1小鼠通过口服强饲每日两次给予溶媒(5 mL/kg)、参考物(布地奈德2.5 mg/kg)或试验化合物(1或5 mg/kg)。在研究的第0天，通过塑料导管结肠内给予TNBS (200 µL)，BID给予溶媒、参考或试验化合物持续2或4天。在研究期间，每天对动物称重，进行粪便观察和基于粪便稠度记录作为评分。在第2天(或第4天)处死时，移出大肠，和记录长度和重量。将结肠切片用于组织病理学评分以确定疾病严重性。
(v) 小鼠中的过继转移
在研究第0天，处死雌性Balb/C小鼠，获得脾用于CD45RB高细胞分离(使用SCID IBD细胞分离方案)。然后将大约4X105个细胞/mL CD45RB高细胞经腹膜内注射(100 µL/小鼠)到雌性SCID动物。在研究第14天，对小鼠称重，和基于体重随机分成治疗组。在第14天，化合物在包含玉米油(32.5%)、transcutol (20%)、maisine (12.5%)和cremophor ELP (35%)的确定混合物的溶媒中以下文表6a和6b中概述的剂量水平和5 mL/kg的剂量体积，通过口服强饲BID给予。继续治疗直到研究第42天，在该点在早晨给予后4小时将动物尸检。记录结肠长度和重量，并用作研究的第二终点，作为结肠水肿的测量。然后将结肠分成六个横切片，其中四个用于组织病理学评分(第一终点)，两个经匀浆用于细胞因子分析。显示的数据是在首次用于实验的动物和载体动物之间的诱导窗的%抑制，其中越高的抑制意味着越接近于无疾病的首次用于实验的表型。
(vi) 在大鼠中内毒素诱导的葡萄膜炎
将雄性Lewis大鼠(6-8周龄, Charles River UK Limited)在3个笼中在19-21℃以12小时光/暗周期(07:00/19:00)饲养，饲喂标准的啮齿动物饲料和随意饮用水。对未禁食的大鼠称重，分别在尾部用永久标记鉴别，并接受单次玻璃体内给予100 ng/动物的LPS(大肠杆菌0111:B4，在PBS中制备, Sigma Aldrich, UK)至右玻璃体液(5 µL剂量体积)，使用32-规针头。未治疗的大鼠用PBS注射。在LPS前30分钟、在LPS给予时和LPS给予后1、2和4小时，试验化合物、地塞米松(Dex)或溶媒(20%羟基丙基-β-环糊精、0.1% HPMC、0.01%苯扎氯铵、0.05% EDTA、0.7% NaCl，在去离子水中)通过局部途径给予至动物的右眼(10 µL)。在给予前，将待给予的溶液或混悬液搅拌5分钟以确保均匀的混悬液。LPS给予后6小时，通过过量给予戊巴比妥(i.v.)将动物安乐死。安乐死后，将各动物的右眼摘出，围绕晶状体切成前和后切片。将各切片称重和在500 µL无菌磷酸盐缓冲盐水中匀浆，接着以12000 rpm在4℃离心20分钟。将得到的上清液分成3个等份和贮藏在-80℃直到随后通过R&D DuoSetELISA进行细胞因子分析。
体外和体内筛选结果概述
表1a：选择的激酶的解离常数，通过LeadHunter Discover Services (DiscoveRxCorporation, Fremont, CA)测定，使用KINOMEscanTM技术。
通过LeadHunter Discover Services (DiscoveRx Corporation, Fremont, CA)使用KINOMEscanTM技术进行的研究，确定了实施例的化合物(化合物1)对激酶B-Raf和B-Raf(V600E)与它们的标准配体的结合不具有任何显著影响。此外，与参比化合物N-(4-(4-(3-(3-叔丁基-1-对甲苯基-1H-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基氧基)吡啶-2-基)-2-甲氧基乙酰胺(WO 2010/112936)相比，所述化合物显示显著改进的选择性，如通过较低的选择性评分所证明(表1b)。
表1b：在50和500 nM下的KinomeScan选择性评分数据；S(35) = (%对照<35的未突变激酶数)/(测试的未突变激酶数)；S(10) = (%对照<10的未突变激酶数)/(测试的未突变激酶数)；S(1) = (%对照<1的未突变激酶数)/(测试的未突变激酶数)
表1c：来自体外p38 MAPKα (方法2)、c-Src、Syk和GSK3α (方法2)抑制测定的结果
表1d：来自磷酸流测定的数据，评价细胞p38 MAPKα和Lck抑制
表2：在受刺激的细胞中细胞因子释放的抑制(上文的测定法(b)、(c)和(d))。
如下表3所述，还在细胞测定法(l)，即上文描述的离体人活检模型中筛选化合物I，其中其在来自溃疡性结肠炎(UC)患者的活检中证实了显著的抗炎性作用。与健康志愿者相反，来自UC患者的肠粘膜活检已显示体外自发释放促炎细胞因子(Onken, J.E.等, J Clin Immunol, 2008, 126(3): 345-352)。因此，当以1 μg/mL与来自溃疡性结肠炎患者的活检孵育24小时时，与DMSO对照相比，化合物I显著抑制细胞因子(IL-1β、IL-6和IL-8)释放。
表3：使用患有溃疡性结肠炎(一种形式的IBD)的各种患者的结肠发炎区的肠粘膜活检的测定法的结果概述。
如下文表4a所述，在上文测量对PBMC的细胞分裂(有丝分裂)的影响的测定法(g)中，化合物I具有比参比化合物(N-(4-(4-(3-(3-叔丁基-1-p-甲苯基-1H-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基氧基)吡啶-2-基)-2-甲氧基乙酰胺, WO 2010/112936)显著更低的活性。
表4a：与参比化合物相比，化合物I对PBMC的细胞分裂的作用
a 参见例如WO 2013/050757中报道的值。
如下表4b所述，当在上文测定法(m)中研究时，化合物I未引起任何实质的β-联蛋白诱导。因此，发现化合物增加β-联蛋白的细胞浓度的潜力是阴性的，因为其在各种试验浓度的诱导作用显著低于由1 μg/mL的参比化合物产生的作用。
表4b：与参比化合物相比，化合物I对β-联蛋白诱导的作用(NT = 未测试)
如下表5所示，化合物I还在上文体内测定法(iv)中筛选，如经2天和采用自微乳化药物递送系统(SMEDDS)作为媒介(包含玉米油状物(32.5%)、transcutol (20%)、maisine(12.5%)和cremophor ELP (35%)的确定的混合物)所进行。组织病理学分析揭示，化合物I显示在该结肠炎症的体内模型中的活性。具体而言，当以5 mg/kg口服给予时，化合物I证实与媒介对照相比溃疡等级和上皮修复的显著改进。此外，其在网状和层流层区中产生炎性细胞浸润的显著降低。
表5：化合物I对小鼠中TNBS-诱导的结肠炎的作用。
如下表6a和6b所示，化合物I还在上文体内(过继转移)测定法(v)中筛选。在研究结束时在首次进行实验、对照和经治疗动物中结肠重量与长度的相对比率的分析揭示，化合物I显示在该T细胞驱动的结肠炎症的体内模型中的显著活性。
表6a：过继转移小鼠模型的结果概述
表6b：在过继转移小鼠模型中另外研究的进一步结果概述
如下表6c所示，化合物I还显著降低在过继转移模型中小鼠的结肠组织的样品中促炎细胞因子的水平。
表6c：来自过继转移小鼠模型的细胞因子水平测量的概述
另外研究的简述
药代动力学参数测定
通过Sai Life Sciences (Hinjewadi, Pune, India)进行研究以调查化合物I的血浆药代动力学和总结肠组织分布。具体而言，药代动力学研究如下进行：
- 雄性C57BL/6小鼠，按单次口服给予；和
- 雄性Wistar大鼠，按单次静脉内或口服给予。
数据揭示，化合物I实现实质的结肠浓度，而血浆暴露非常低或可忽略。
表8a：在口服给予5 mg/kg的化合物I至小鼠后获得的中值血浆浓度(ng/mL)
表解
媒介B = 玉米油状物 - Transcutol - Maisine - Cremophor ELP (32.5 : 20: 12.5 : 35)，自微乳化药物递送系统(SMEDDS)。
表8b：在口服给予5 mg/kg的化合物I至小鼠后获得的中值总结肠浓度(ng/g) (媒介B按表8a所述)。
表9a：在静脉内给予在5% DMSO–7.5% Solutol HS15–87.5%正常盐水中的0.25mg/kg的化合物I至大鼠后获得的药代动力学数据
表9b：在口服给予5 mg/kg的化合物I至大鼠后获得的药代动力学数据
表解
媒介B = 如表8a所述。
[‡] 未计算，因为无化合物在血浆中检出。
表9c：在口服给予5 mg/kg的化合物I至大鼠后获得的中值血浆浓度(ng/mL)
表解
媒介B如表8a所述。
ADME参数的测定
化合物I的某些体外ADME (吸收、分布、代谢和排泄)参数的评价通过BioFocus(Saffron Walden, UK)进行。结果揭示，化合物I被人肝细胞快速清除，并且其对于时间-依赖性细胞色素P450抑制具有降低的易感性。
表10：化合物I的人肝细胞稳定性试验的数据
表11a：化合物I的CYP3A4抑制研究概述(报告的结果为两次实验的算术平均值)。
表解
参比化合物A: 1-(4-((2-((7-甲基-1H-吲唑-5-基)氨基)嘧啶-4-基)氧基)-萘-1-基)-3-(3-(2-甲基丁-3-炔-2-基)-1-(p-甲苯基)-1H-吡唑-5-基)脲(Fyfe, M. C. T.,等 WO 2014/033447)。
表11b：化合物I的CYP2C9抑制研究概述(报告的结果为两次实验的算术平均值)。
表解
参比化合物A：如表11a所述。
[†] 在15 µM观察到沉淀，因此代替为报告5 µM时的抑制。
hERG抑制研究
在Essen Bioscience (Welwyn Garden City, England)使用IonWorksTM 膜片钳电生理学，测试化合物I对人ether a go-go (hERG)通道的抑制。
表12：化合物I的hERG抑制数据
代谢物分析
与大鼠、食蟹猴或人肝细胞一起孵育后，通过BioFocus (Saffron Walden, UK)进行研究以确定化合物1的代谢结局。
在37℃，化合物1 (10 µM起始浓度)或DMSO对照与各物种的冷冻保存的肝细胞(0.5百万个细胞/mL)一起进行分别孵育(n=3) 0、60和90分钟，然后终止反应和用乙腈提取化合物。合并重复样品，然后分析。
使用飞行时间(TOF)和三重四极(TQ)质谱仪鉴定潜在的代谢物。
结果显示，化合物1在肝细胞中形成9种代谢物，其中8种因为在酰胺部分的聚乙二醇链上的氧化而产生。另一种代谢物，主要存在于食蟹猴肝细胞中，通过在5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基片段上的氧化产生。因此，未发现有产物可能与萘部分的代谢相关联，该现象产生与p38α抑制剂BIRB796相关的肝毒性(Iwano, S.,等, J. Appl. Toxicol.2011, 31, 671–677)。在人肝细胞孵育中鉴定的所有代谢物也在大鼠或食蟹猴肝细胞孵育中检出。
诱变性评价(细菌逆突变筛选)
在鼠伤寒沙门氏菌的两个组氨酸依赖性营养缺陷型突变株—菌株TA98和TA100中通过Sequani (Ledbury, Herefordshire, UK)进行研究以评价化合物1体外诱导突变的能力。
使用平板掺入方法进行突变筛选，在S-9 mix (源自Aroclor 1254处理的大鼠的肝的肝线粒体后部分)存在和缺失的情况下进行。将细菌暴露于溶于二甲基亚砜的试验化合物，所述二甲基亚砜溶剂还用作阴性对照。使用的剂量水平为0.32、1.6、8、40、200、1000或5000 μg/平板。
试验化合物的可分析的处理水平由不溶性而限制于1000 μg/平板，因为在5000 μg/平板时观察到大量沉淀，其影响了菌落评分。在1000 μg/平板时在S-9 mix存在和缺失的情况下，在两个菌株中也都发现沉淀。
在S-9 mix的存在或缺失的情况下在任一个鼠伤寒沙门氏菌菌株的逆转株菌落中，化合物1产生非剂量相关的或统计学上显著的增加。
水解稳定性研究
在DMSO和水(3:1)的混合物中以1 mg/mL的试验化合物浓度评价化合物1的化学稳定性。
通用HPLC程序
Agilent, Waters X-Select C18, 2.5 μm, 4.6x30 mm柱, 4 min方法, 5-95%MeCN/水(0.1%甲酸)
流速2.5 ml/min
柱烘箱温度40℃
检测254 nm
样品制备
将试验化合物的1.0 mg样品溶于750 μL的DMSO。缓慢加入水(250 μL)，确保无沉淀出现。
记录稳定性
取出50 μL等份的试验溶液和通过5 μL HPLC注射一式两份分析。根据相应UV迹线的手工积分，记录试验化合物的峰面积。
将试验溶液加热至60℃，同时搅拌，在5和24 h时间点取出50 μL等份用于HPLC分析。在所有情况下，使用5 μL注射和样品一式两份分析。
在两个随后的时间点记录试验化合物的峰面积，根据峰面积随时间的%变化计算%分解。
参比化合物B (3-乙炔基-5-((4-((4-(3-(3-异丙基-1-(对甲苯基)-1H-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-N-(2-吗啉代乙基)苯甲酰胺；Cariou, C. A.M.等, WO 2014/027209)包括在各稳定性研究中，作为对照以验证研究。与完全稳定的本发明的化合物相反，该参比化合物在实验的条件下经历显著的分解。
研究结果在下表中报告。
缩写
前缀n-、s-、i-、t-和tert-具有其常用含义：正、仲、异和叔。

Claims (14)

1.式I的化合物或其药学上可接受的盐
。
2.权利要求1中的化合物，其为：
3-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-5-乙炔基-N-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-苯甲酰胺。
3.药物制剂，包含与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐。
4.组合产品，包含
(A) 权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，和
(B) 另一治疗剂，
其中组分(A)和(B)的每个与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合配制。
5.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途。
6.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求3的药物制剂或权利要求4的组合产品在制备用于治疗或预防炎性疾病的药物中的用途。
7.权利要求6的用途，其中所述炎性疾病选自囊性纤维化、肺动脉高压、肺结节病、特发性肺纤维变性、慢性阻塞性肺病、哮喘、特应性皮炎、变应性皮炎、接触性皮炎或银屑病、鼻炎、鼻窦炎、结膜炎、干燥性角结膜炎、青光眼、糖尿病视网膜病、黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞、干性和/或湿性年龄相关性黄斑变性、术后白内障炎症、葡萄膜炎、角膜移植和缘细胞移植排斥、谷蛋白敏感性肠病、嗜酸性食管炎、肠移植物对抗宿主病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。
8.权利要求6的用途，其中所述炎性疾病是慢性支气管炎、肺气肿、儿科哮喘、变应性鼻炎、过敏性结膜炎、糖尿病黄斑水肿、后葡萄膜炎、前葡萄膜炎和泛葡萄膜炎，或腹部疾病。
9.权利要求6或7的用途，其中所述炎性疾病是葡萄膜炎、干燥性角结膜炎、克罗恩病或溃疡性结肠炎。
10.用于制备权利要求1中的式I的化合物的方法，所述方法包括：
(a)将式II的化合物，
与式III的化合物反应，
其中Z1和Z2之一是式IV的结构片段
和Z1和Z2的另一个是式V的结构片段
(b)将式IIa的化合物，
其中Z1如上文定义，与合适的叠氮化物形成剂反应，
所述反应无需分离，接着是具有式Z1-C(O)-N3的中间体酰叠氮化物的热重排，以原位提供式II的化合物，该化合物然后与上文定义的式III的化合物反应；
(c)将式IIb的化合物，
其中LG1表示离去基团和Z1如上文定义，与如上文定义的式III的化合物反应；
(d)将式VI的化合物
其中LG2表示离去基团，与式VII的化合物反应，
；或
(e)将式VIIa的化合物
其中R4'表示H或C1-3烷基，与式VIIb的化合物反应，
H2N-[CH2CH2-O]2-CH2CH2-OCH3 VIIb。
11.权利要求10的方法，所述方法包括将式XV的化合物
与式XVI的化合物反应
其中LG1如权利要求10所定义。
12.如权利要求11所定义的式XVI的化合物。
13.权利要求12的式XVI的化合物，其中LG1表示咪唑基、氯或芳基氧基。
14.权利要求12的式XVI的化合物，其中LG1表示苯氧基。
CN201480031577.7A 2013-04-02 2014-04-01 激酶抑制剂 Expired - Fee Related CN105408315B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1305945.6 2013-04-02
GB201305945A GB201305945D0 (en) 2013-04-02 2013-04-02 New compounds
GB1322678.2 2013-12-20
GBGB1322678.2A GB201322678D0 (en) 2013-12-20 2013-12-20 New compounds
GB1402647.0 2014-02-14
GB201402647A GB201402647D0 (en) 2014-02-14 2014-02-14 New compounds
PCT/GB2014/051018 WO2014162122A1 (en) 2013-04-02 2014-04-01 Kinase inhibitor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105408315A CN105408315A (zh) 2016-03-16
CN105408315B true CN105408315B (zh) 2018-09-14

Family

ID=50434228

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480031577.7A Expired - Fee Related CN105408315B (zh) 2013-04-02 2014-04-01 激酶抑制剂
CN201480031484.4A Expired - Fee Related CN105246884B (zh) 2013-04-02 2014-04-01 用作激酶抑制剂的脲衍生物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480031484.4A Expired - Fee Related CN105246884B (zh) 2013-04-02 2014-04-01 用作激酶抑制剂的脲衍生物

Country Status (14)

Country Link
US (5) US9481648B2 (zh)
EP (2) EP2981535B8 (zh)
JP (2) JP6495238B2 (zh)
KR (3) KR102340654B1 (zh)
CN (2) CN105408315B (zh)
AU (2) AU2014246870C1 (zh)
BR (2) BR112015024678B1 (zh)
CA (1) CA2907663A1 (zh)
DK (2) DK2981535T3 (zh)
EA (2) EA030483B1 (zh)
ES (2) ES2904277T3 (zh)
MX (2) MX363949B (zh)
TW (1) TWI641592B (zh)
WO (2) WO2014162126A1 (zh)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA105763C2 (uk) 2007-12-19 2014-06-25 Кансер Рісерч Текнолоджі Лімітед 8-ЗАМІЩЕНІ ПІРИДО[2,3-b]ПІРАЗИНИ ТА ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ
EP2531502B1 (en) 2010-02-01 2014-04-02 Cancer Research Technology Limited 1-(5-tert-butyl-2-phenyl-2h-pyrazol-3-yl)-3-[2-fluoro-4-(1-methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1h-imidazo[4,5-b]pyridin-7-yloxy)-phenyl]-urea and related compounds and their use in therapy
MY167798A (en) 2011-10-03 2018-09-26 Respivert Ltd 1-pyrazolyl-3- (4- ( (2 -anilinopyrimidin- 4 - yl) oxy) napththalen- 1 - yl) ureas as p38 map kinase inhibitors
EP2578582A1 (en) 2011-10-03 2013-04-10 Respivert Limited 1-Pyrazolyl-3-(4-((2-anilinopyrimidin-4-yl)oxy)napththalen-1-yl)ureas as p38 MAP kinase inhibitors
GB201214750D0 (en) 2012-08-17 2012-10-03 Respivert Ltd Compounds
US20150225373A1 (en) 2012-08-29 2015-08-13 Respivert Limited Kinase inhibitors
WO2014033446A1 (en) 2012-08-29 2014-03-06 Respivert Limited Kinase inhibitors
US9783556B2 (en) 2012-08-29 2017-10-10 Respivert Limited Kinase inhibitors
US9732063B2 (en) 2012-11-16 2017-08-15 Respivert Limited Kinase inhibitors
US20160016934A1 (en) * 2013-03-14 2016-01-21 Respivert Limited Kinase inhibitors
TWI641592B (zh) 2013-04-02 2018-11-21 英商瑞斯比維特有限公司 激酶抑制劑
WO2014162121A1 (en) 2013-04-02 2014-10-09 Topivert Pharma Limited Kinase inhibitors based upon n-alkyl pyrazoles
GB201320729D0 (en) 2013-11-25 2014-01-08 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds and their use
GB201320732D0 (en) 2013-11-25 2014-01-08 Cancer Rec Tech Ltd Methods of chemical synthesis
JP6514703B2 (ja) 2013-12-20 2019-05-15 トピバート ファーマ リミテッド キナーゼインヒビターとして有用な尿素誘導体
PL3105222T3 (pl) 2014-02-14 2018-09-28 Respivert Limited Aromatyczne związki heterocykliczne jako związki przeciwzapalne
MA40774A (fr) * 2014-10-01 2017-08-08 Respivert Ltd Dérivés de diaryle-urée en tant qu'inhibiteurs de kinase p38
WO2017108737A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Chiesi Farmaceutici S.P.A. 1-(3-tert-butyl-phenyl)-3-(4-([1,2,4]triazolo[4,3-a]pyridin-6-yloxy)-1,2,3,4-tetrahydro- naphthalen-1-yl)-urea derivatives and their use as p38 mapk inhibitors
BR112018067552A2 (pt) 2016-04-06 2019-01-08 Topivert Pharma Ltd inibidores de cinase
US10342786B2 (en) 2017-10-05 2019-07-09 Fulcrum Therapeutics, Inc. P38 kinase inhibitors reduce DUX4 and downstream gene expression for the treatment of FSHD
WO2019071144A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Fulcrum Therapeutics, Inc. USE OF P38 INHIBITORS TO REDUCE DUX4 EXPRESSION
CN110878055B (zh) * 2018-09-06 2021-02-05 中国科学院化学研究所 一种制备羰基杂环类化合物的方法

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4344960B2 (ja) 1997-05-23 2009-10-14 バイエル、コーポレイション アリール尿素によるｐ３８キナーゼ活性の阻害
WO1999023091A1 (en) 1997-11-03 1999-05-14 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Aromatic heterocyclic compounds as anti-inflammatory agents
EP1140840B1 (en) 1999-01-13 2006-03-22 Bayer Pharmaceuticals Corp. -g(v)-carboxyaryl substituted diphenyl ureas as raf kinase inhibitors
WO2000041698A1 (en) 1999-01-13 2000-07-20 Bayer Corporation φ-CARBOXY ARYL SUBSTITUTED DIPHENYL UREAS AS p38 KINASE INHIBITORS
UA73492C2 (en) 1999-01-19 2005-08-15 Aromatic heterocyclic compounds as antiinflammatory agents
US6358945B1 (en) 1999-03-12 2002-03-19 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as anti-inflammatory agents
CA2374737C (en) 1999-07-09 2008-02-12 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Novel process for synthesis of heteroaryl-substituted urea compounds
MXPA02004879A (es) 1999-11-16 2002-08-30 Boehringer Ingelheim Pharma Derivados de urea como agentes antiinflamatorios.
US6492529B1 (en) 2000-01-18 2002-12-10 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Bis pyrazole-1H-pyrazole intermediates and their synthesis
US6525046B1 (en) 2000-01-18 2003-02-25 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Aromatic heterocyclic compounds as antiinflammatory agents
JP2005507367A (ja) * 2001-04-13 2005-03-17 ベーリンガー インゲルハイム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド １，４−二置換ベンゾ縮合化合物
CA2490819A1 (en) 2001-04-13 2002-10-24 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as anti-inflammatory agents
JP2004530690A (ja) 2001-05-16 2004-10-07 ベーリンガー インゲルハイム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 抗炎症性薬剤として有用なジアリールウレア誘導体
WO2002096876A1 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Carbamate and oxamide compounds as inhibitors of cytokine production
AU2002316459A1 (en) 2001-07-11 2003-01-29 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cytokine mediated diseases
AU2003210969A1 (en) 2002-02-11 2003-09-04 Bayer Corporation Aryl ureas with raf kinase and angiogenesis inhibiting activity
AU2003209116A1 (en) 2002-02-11 2003-09-04 Bayer Pharmaceuticals Corporation Aryl ureas with angiogenesis inhibiting activity
CA2473634C (en) 2002-02-25 2011-11-29 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. 1,4-disubstituted benzofused cycloalkyl urea compounds useful in treating cytokine mediated diseases
PE20040522A1 (es) 2002-05-29 2004-09-28 Novartis Ag Derivados de diarilurea dependientes de la cinasa de proteina
JP2006504667A (ja) * 2002-08-08 2006-02-09 ベーリンガー インゲルハイム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 炎症過程に関与するサイトカインの抑制剤としてのフッ素化フェニル−ナフタレニル−尿素化合物
US20050014753A1 (en) 2003-04-04 2005-01-20 Irm Llc Novel compounds and compositions as protein kinase inhibitors
WO2004113352A1 (en) 2003-06-19 2004-12-29 Amedis Pharmaceuticals Ltd. Silylated heterocyclylurea derivatives as cytokine-inhibitors
CN1812975A (zh) 2003-06-30 2006-08-02 贝林格尔·英格海姆药物公司 制备二芳基脲化合物的方法
CN1838958A (zh) 2003-08-22 2006-09-27 贝林格尔·英格海姆药物公司 治疗慢性阻塞性肺病和肺动脉高血压的方法
CN102060806A (zh) 2003-09-11 2011-05-18 iTherX药品公司 细胞因子抑制剂
WO2005044825A1 (en) 2003-10-21 2005-05-19 Amedis Pharmaceuticals Ltd. Silicon compounds and their use
TW200529849A (en) 2003-11-28 2005-09-16 Novartis Ag Diaryl urea derivatives in the treatment of protein kinase dependent diseases
US20060035893A1 (en) 2004-08-07 2006-02-16 Boehringer Ingelheim International Gmbh Pharmaceutical compositions for treatment of respiratory and gastrointestinal disorders
GB0423554D0 (en) 2004-10-22 2004-11-24 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds
TW200740820A (en) 2005-07-05 2007-11-01 Takeda Pharmaceuticals Co Fused heterocyclic derivatives and use thereof
PE20070795A1 (es) 2005-10-28 2007-08-24 Lilly Co Eli Compuestos pirazol-urea-heterociclicos como inhibidores de cinasa
US7790756B2 (en) 2006-10-11 2010-09-07 Deciphera Pharmaceuticals, Llc Kinase inhibitors useful for the treatment of myleoproliferative diseases and other proliferative diseases
GB0818033D0 (en) 2008-10-02 2008-11-05 Respivert Ltd Novel compound
CN102256964A (zh) 2008-10-02 2011-11-23 瑞斯比维特有限公司 p38MAP激酶抑制剂
CN102333770B (zh) 2008-12-11 2015-01-28 瑞斯比维特有限公司 P38map激酶抑制剂
GB0905955D0 (en) 2009-04-06 2009-05-20 Respivert Ltd Novel compounds
US9126931B2 (en) 2009-06-10 2015-09-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Tetracyclic compound
GB0921730D0 (en) 2009-12-11 2010-01-27 Respivert Ltd Method of treatment
GB0921731D0 (en) 2009-12-11 2010-01-27 Respivert Ltd Theraputic uses
CN105315213B (zh) 2010-03-15 2018-04-20 宇部兴产株式会社 制备酰胺化合物的方法
GB201005589D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Respivert Ltd Novel compounds
JP5787977B2 (ja) 2010-04-08 2015-09-30 レスピバート・リミテツド Ｐ３８ｍａｐキナーゼ阻害剤
EP2556067B1 (en) 2010-04-08 2016-02-24 Respivert Limited Pyrazolyl ureas as p38 map kinase inhibitors
GB201009731D0 (en) * 2010-06-10 2010-07-21 Pulmagen Therapeutics Inflamma Kinase inhibitors
GB201010193D0 (en) 2010-06-17 2010-07-21 Respivert Ltd Medicinal use
US8933228B2 (en) 2010-06-17 2015-01-13 Respivert, Ltd. Respiratory formulations and compounds for use therein
GB201010196D0 (en) * 2010-06-17 2010-07-21 Respivert Ltd Methods
WO2012044090A2 (ko) * 2010-09-29 2012-04-05 크리스탈지노믹스(주) 단백질 키나제 억제 활성을 갖는 신규한 아미노퀴나졸린 화합물
EP2578582A1 (en) 2011-10-03 2013-04-10 Respivert Limited 1-Pyrazolyl-3-(4-((2-anilinopyrimidin-4-yl)oxy)napththalen-1-yl)ureas as p38 MAP kinase inhibitors
MY167798A (en) 2011-10-03 2018-09-26 Respivert Ltd 1-pyrazolyl-3- (4- ( (2 -anilinopyrimidin- 4 - yl) oxy) napththalen- 1 - yl) ureas as p38 map kinase inhibitors
PL2788349T3 (pl) 2011-12-09 2017-04-28 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Inhibitory kinaz
GB201214750D0 (en) 2012-08-17 2012-10-03 Respivert Ltd Compounds
US9783556B2 (en) 2012-08-29 2017-10-10 Respivert Limited Kinase inhibitors
GB201215357D0 (en) 2012-08-29 2012-10-10 Respivert Ltd Compounds
US20150225373A1 (en) 2012-08-29 2015-08-13 Respivert Limited Kinase inhibitors
WO2014033446A1 (en) 2012-08-29 2014-03-06 Respivert Limited Kinase inhibitors
US9732063B2 (en) 2012-11-16 2017-08-15 Respivert Limited Kinase inhibitors
US20160016934A1 (en) 2013-03-14 2016-01-21 Respivert Limited Kinase inhibitors
WO2014162121A1 (en) 2013-04-02 2014-10-09 Topivert Pharma Limited Kinase inhibitors based upon n-alkyl pyrazoles
TWI641592B (zh) 2013-04-02 2018-11-21 英商瑞斯比維特有限公司 激酶抑制劑
JP6514703B2 (ja) 2013-12-20 2019-05-15 トピバート ファーマ リミテッド キナーゼインヒビターとして有用な尿素誘導体
PL3105222T3 (pl) 2014-02-14 2018-09-28 Respivert Limited Aromatyczne związki heterocykliczne jako związki przeciwzapalne
MA40774A (fr) 2014-10-01 2017-08-08 Respivert Ltd Dérivés de diaryle-urée en tant qu'inhibiteurs de kinase p38
BR112018067552A2 (pt) * 2016-04-06 2019-01-08 Topivert Pharma Ltd inibidores de cinase

Also Published As

Publication number Publication date
EA201591906A1 (ru) 2016-03-31
DK2981535T3 (da) 2021-03-01
WO2014162122A1 (en) 2014-10-09
JP6464384B2 (ja) 2019-02-06
EA027782B1 (ru) 2017-08-31
EP2981526B1 (en) 2021-11-03
ES2856902T3 (es) 2021-09-28
MX2015013945A (es) 2015-12-11
US20160376232A1 (en) 2016-12-29
US9481648B2 (en) 2016-11-01
MX363949B (es) 2019-04-08
KR102340654B1 (ko) 2021-12-16
TWI641592B (zh) 2018-11-21
DK2981526T3 (da) 2022-02-07
AU2014246870C1 (en) 2018-09-13
EP2981535A1 (en) 2016-02-10
KR102283876B1 (ko) 2021-07-29
BR112015024671A2 (pt) 2017-07-18
MX363950B (es) 2019-04-08
TW201529556A (zh) 2015-08-01
US20180044288A1 (en) 2018-02-15
EA201591907A1 (ru) 2016-02-29
CN105246884A (zh) 2016-01-13
US20150166483A1 (en) 2015-06-18
AU2014246866A1 (en) 2015-10-01
AU2014246870B2 (en) 2018-05-24
MX2015013944A (es) 2015-12-11
KR102283883B1 (ko) 2021-07-29
JP2016515606A (ja) 2016-05-30
US9790174B2 (en) 2017-10-17
CA2907663A1 (en) 2014-10-09
US20140296271A1 (en) 2014-10-02
KR20150138855A (ko) 2015-12-10
AU2014246866B2 (en) 2018-05-10
BR112015024678B1 (pt) 2023-02-23
WO2014162126A1 (en) 2014-10-09
EP2981526A1 (en) 2016-02-10
BR112015024678A2 (pt) 2017-07-18
EA030483B1 (ru) 2018-08-31
EP2981535B1 (en) 2020-12-16
JP6495238B2 (ja) 2019-04-03
US20140296208A1 (en) 2014-10-02
JP2016519680A (ja) 2016-07-07
KR20150136536A (ko) 2015-12-07
US10435361B2 (en) 2019-10-08
ES2904277T3 (es) 2022-04-04
AU2014246870A1 (en) 2015-10-01
CN105246884B (zh) 2018-05-22
EP2981535B8 (en) 2021-03-10
US8927563B2 (en) 2015-01-06
CN105408315A (zh) 2016-03-16
KR20210096313A (ko) 2021-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105408315B (zh) 激酶抑制剂
AU2015326543B2 (en) 4-(4-(4-phenylureido-naphthalen-1-yl)oxy-pyridin-2-yl)amino-benzoic acid derivative as p38 kinase inhibitor
US20210179584A1 (en) INHIBITOR OF p38 MAP KINASE
CN106029651A (zh) 用作激酶抑制剂的脲衍生物
EP2981534B1 (en) Kinase inhibitors based upon n-alkyl pyrazoles

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20201009

Address after: England Atsushi

Patentee after: RESPIVERT Ltd.

Address before: British platinum County

Patentee before: RESPIVERT Ltd.

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20201231

Address after: Ushizu gun

Patentee after: Ausula acquisition Ltd.

Address before: England Atsushi

Patentee before: RESPIVERT Ltd.

TR01 Transfer of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180914