EA027782B1 - Ингибитор киназ - Google Patents

Ингибитор киназ Download PDF

Info

Publication number
EA027782B1
EA027782B1 EA201591907A EA201591907A EA027782B1 EA 027782 B1 EA027782 B1 EA 027782B1 EA 201591907 A EA201591907 A EA 201591907A EA 201591907 A EA201591907 A EA 201591907A EA 027782 B1 EA027782 B1 EA 027782B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
formula
cells
compounds
pharmaceutically acceptable
Prior art date
Application number
EA201591907A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201591907A1 (ru
Inventor
Мэттью Колин Тор Файф
Original Assignee
Респайверт Лимитед
Топайверт Фарма Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB201305945A external-priority patent/GB201305945D0/en
Priority claimed from GBGB1322678.2A external-priority patent/GB201322678D0/en
Priority claimed from GB201402647A external-priority patent/GB201402647D0/en
Application filed by Респайверт Лимитед, Топайверт Фарма Лимитед filed Critical Респайверт Лимитед
Publication of EA201591907A1 publication Critical patent/EA201591907A1/ru
Publication of EA027782B1 publication Critical patent/EA027782B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C317/00—Sulfones; Sulfoxides
    • C07C317/44—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C317/48—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/444—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring heteroatom, e.g. amrinone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
    • A61K31/541—Non-condensed thiazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/553—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having at least one nitrogen and one oxygen as ring hetero atoms, e.g. loxapine, staurosporine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/02—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C311/08—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C317/00—Sulfones; Sulfoxides
    • C07C317/26—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C317/28—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton with sulfone or sulfoxide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/80—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/84—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/86—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/72—Nitrogen atoms
    • C07D213/74—Amino or imino radicals substituted by hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/66—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D233/90—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/47—One nitrogen atom and one oxygen or sulfur atom, e.g. cytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Предложено соединение формулы (I)которое обладает противовоспалительной активностью (например, через ингибирование одного или нескольких членов из числа: семейства ферментов р38 митоген-активируемой протеинкиназы; Syk-киназы и Src семейства тирозинкиназ) и находит применение при лечении, в том числе в фармацевтических комбинациях, особенно при лечении воспалительных заболеваний, включая воспалительные заболевания легких, глаз и желудочно-кишечного тракта.

Description

Данное изобретение в числе прочего относится к соединению, которое является противовоспалительным средством (например, через ингибирование одного или нескольких членов из семейства ферментов р38 митоген-активируемой протеинкиназы (именуемых здесь как ингибиторы р38 МАР киназы), например, их подтипа альфа-киназ; Бук киназы; и Бгс-семейства тирозинкиназ). Изобретение также относится к применению такого соединения в терапии, в том числе в моно- и комбинированной терапии, особенно при лечении воспалительных заболеваний, включая воспалительные заболевания легких (такие как астма и хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ (СОРИ)), глаз (такие как увеит или сухой кератоконъюнктивит (сухость глаз)) и желудочно-кишечного тракта (такие как болезнь Крона и неспецифический язвенный колит).
Перечисление или обсуждение несомненно ранее опубликованных документов в этом описании не следует обязательно рассматривать, как подтверждение, что документ является частью современного состояния в данной области техники или представляет собой обычные общедоступные знания.
Идентифицировано четыре изоформы р38 МАРК (альфа, бета, гамма и дельта, соответственно), каждая из которых проявляет разные модели экспрессии в тканях. Альфа- и бета-изоформы р38 МАРК обнаружены повсеместно во всем организме, присутствуют во многих типах разных клеток и ингибируются рядом ранее описанных низкомолекулярных соединений. Ранние классы ингибиторов были высокотоксичными вследствие широкого распространения в тканях этих изоформ, что приводило к побочным эффектам соединений. Некоторые из недавно идентифицированных ингибиторов проявляют улучшенную селективность для альфа- и бета-изоформ р38 МАРК и имеют более широкие пределы безопасности.
Как полагают, р38 МАР-киназа играет ключевую роль во многих путях передачи сигнала, которые вовлечены в инициирование и поддержание хронического, трудноизлечимого воспаления при заболевании человека, например, при тяжелой астме, ХОЗЛ или воспалительном заболевании кишечника (ВЗК (ΙΒΌ)). В настоящее время существует обширная литература, в которой демонстрируется, что р38 МАРкиназу активирует целый ряд провоспалительных цитокинов и что ее активация приводит к рекрутингу и высвобождению дополнительных провоспалительных цитокинов. Действительно, данные некоторых клинических исследований показывают благоприятные изменения в заболевании у пациентов во время лечения с помощью ингибиторов р38 МАР-киназы. Например, Смит описывает ингибирующий эффект ингибиторов р38 МАР-киназы на высвобождение ΤΝΕα (но не 1Ь-8) из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК (РВМС)) человека (БтйЬ, δ. I., Вг. I. РЬагтасо1., 2006, 149:393-404).
Также предложено использование ингибиторов р38 МАР-киназы при лечении ХОЗЛ и ВЗК. Низкомолекулярные ингибиторы, нацеленные на р38 ΜΑΡΚα/β, как подтверждено, эффективны при снижении различных показателей воспаления в:
клетках и тканях, полученных от больных ХОЗЛ, которые обычно являются кортикостероиднечувствительными (διηΠίτ δ. 1., Вг. 1. РЬагтасок, 2006, 149:393-404);
биопсии от больных ВЗК (Эосепа, С. е! а1., 1. Тгапк. 1ттипо1., 2010, 162:108-115); и ίη у1уо животных моделях (Ипбетеооб, Ό. С. е! а1. , Ат. 1. РЬу8ю1., 2000, 279:Ь895-902; Νηΐΐι. Р. е!
а1., Еиг. 1. РЬагтасок, 2006, 544:160-167).
1ги8еп и соавторы также подтверждают вероятность вовлечения р38 МАРКа/β в кортикостероидную нечувствительность через уменьшение связующего сродства глюкокортикоидного рецептора (СК) в ядре клетки (1ги8еп, Е. е! а1. , 1. А11егду С1ш. 1ттипо1., 2002, 109:649-657). Клинические исследования при воспалительных заболеваниях с целым рядом ингибиторов р38 МАР-киназы, включая АМС548, ΒΙΚΒ 796, УХ702, 8СЮ469 и 8СЮ323, описаны в публикации Ьее, М. К., Эоттдие/, С, Сиггеп! Меб. Сйет., 2005, 12:2979-2994. Однако основной помехой, препятствующей применению ингибиторов р38 МАРкиназы при лечении хронических воспалительных заболеваний человека, является токсичность, отмеченная у пациентов. Токсичность была достаточно тяжелой, чтобы привести к отклонению от клинических испытаний многих предложенных соединений, в том числе всех соединений, конкретно упомянутых выше.
ХОЗЛ представляет собой состояние, при котором лежащее в основе воспаление, как сообщают, является по существу устойчивым к противовоспалительным эффектам ингаляционных кортикостероидов. Следовательно, необходима лучшая стратегия лечения ХОЗЛ, чтобы выработать вмешательство, которое проявляет как собственные противовоспалительные эффекты, так способность повышать чувствительность тканей легкого у больных ХОЗЛ к ингаляционным кортикостероидам. Недавняя публикация Мегсабо е! а1. (2007; Атепсап ТЬогасю 8ос1е1у АЬз!гас! А56) показывает, что выключение р38 МАРКу обладает потенциалом для восстановления чувствительности к кортикостероидам. Таким образом, может иметь место двойная польза для пациентов при использовании ингибитора р38 МАР-киназы в ходе лечения ХОЗЛ.
Большое число больных с диагностированной астмой или ХОЗЛ продолжают страдать от неконтролируемых симптомов и от обострений их болезненного состояния, что может привести к госпитализации. Это происходит несмотря на применение наиболее перспективных, доступных в настоящее время схем лечения, включающих комбинированные лекарства из ингаляционных кортикостероидов и длительно действующих β-агонистов. Данные, накопленные за последнее десятилетие, показывают, что не- 1 027782 удача в сдерживании развития лежащего в основе воспалительного компонента заболевания в легких наиболее вероятно является причиной того, что происходит обострение. С учетом установленной эффективности кортикостероидов в качестве противовоспалительных средств и, в частности, ингаляционных кортикостероидов, при лечении астмы, эти открытия спровоцировали интенсивные исследования. Проведенные исследования показали, что некоторые факторы окружающей среды инициируют кортикостероид-нечувствительность воспалительных изменений в легких больных. Примером является реакция, возникающая из-за опосредуемых вирусом инфекций верхних дыхательных путей (ОРВИ (ИКТ1)), которые имеют особое значение в увеличении смертности, связанной с астмой и ХОЗЛ.
Ранее было раскрыто, что соединения, которые ингибируют активность как с-8гс. так и §ук каназ, являются эффективными средствами против репликации риновируса (Скаггоп, С.Е. с1 а1., νθ 2011/158042), и что соединения, которые ингибируют р59-НСК, являются эффективными против репликации вируса гриппа (Скаггоп, С.Е. е1 а1., νθ 2011/070369). Вместе с ингибированием р38 МАРК такие свойства являются особенно привлекательными свойствами для соединений, которые предназначены для лечения больных с хроническими респираторными заболеваниями.
Некоторые ингибиторы р38 МАРК описаны как ингибиторы репликации респираторного синцитиального вируса (Са88 Ь. е1 а1., νθ 2011/158039).
Точная этиология ВЗК не ясна, но, как полагают, она управляется генетическими факторами и факторами окружающей среды, которые взаимодействуют, стимулируя избыточную или плохо контролируемую воспалительную реакцию слизистых, направленную против компонентов внутриполостной микрофлоры. Эта реакция опосредуется инфильтрацией воспалительных нейтрофилов, дендритными клетками и Т-клетками с периферии. р38 становится очевидной мишенью для исследования в моделях ВЗК вследствие с ее повсеместной экспрессии в воспалительных клетках. Исследования эффективности ингибиторов р38 в животных моделях ВЗК и биопсиях человека от больных, показали, что р38 могли бы быть мишенью в случае лечения ВЗК (Ноуе, Т. 1еп е1 а1., Ои1, 2002, 50:507-512, Иосепа, О. е1 а1., 1. Тгапз. 1ттипо1,. 2010, 162:108-115). Однако такие открытия не полностью соответствуют другим группам, сообщающим об отсутствии эффекта с помощью ингибиторов р38 (Ма1ати1 О. е1 а1. , Όίβ. Όίδ. δα, 2006, 51:1443-1453). Клинические исследования на пациентах с болезнью Крона с использованием ингибитора р38-альфа ΒΙΚΒ796 показали потенциальную клиническую пользу с улучшением уровней С-реактивного белка. Однако улучшение было временным, возвращаясь к начальному уровню к 8 неделе. ^скге&ег, δ. е1 а1., СПп. Оаδί^о. Нера1о1оду, 2006, 4:325-334). Немногочисленные клинические исследования эффективности СИ1-1493, ингибитора р38 и 1пк, у пациентов с серьезной болезнью Крона показывали значительное улучшение клинического показателя на протяжении 8 недель (Ноттеδ, И. е1 а1. Оаδΐ^оеηΐе^о1о§у. 2002 122:7-14).
Как известно, Т-клетки играют ключевую роль при опосредовании воспаления желудочнокишечного тракта. Уникальная работа Ро\гпе с коллегами показала, что перенос нативных СИ4+ клеток в животных с тяжелой комбинированной иммунонедостаточностью (ТКИН (δί'.ΊΌ)) приводит к развитию колита, который зависит от присутствия условно-патогенных бактерий (Ромгге Р. е1 а1. 1п1 1ттипо1. 1993 5:1461-71). Кроме того, изучение мукозных мембран от больных ВЗК показало повышающую регуляцию СИ4+ клеток, которая является или ТЫ (ΙΡΝ§/ΙΤ-2) или Тк2 (1Ь5/ТОРЬ) смещенной в зависимости от того, болен ли пациент болезнью Крона или неспецифическим язвенным колитом (Ρπδδ II. е1 а1. 1 1ттипо1. 1996 157:1261-70.). Аналогично, Т-клетки, как известно, играют ключевую роль в воспалительных нарушениях глаз, причем ряд исследований сообщает о повышенных уровнях ассоциированных с Тклетками цитокинов (16-17 и 1Ь-23) в сыворотке больных с синдромом Бехчета (СЫ V. е1 а1. Iηνеδΐ Орк1ка1то1 νίδ δα. 2008 49:3058-64). В поддержку этих наблюдений ^^^еδкеηеI^ с коллегами показал, что больные с синдромом Бехчета имеют повышенные уровни клеток Тк17 и пониженные уровни клеток Тгед в их периферической крови (ΟίϊΌδΙ^ι^Η Н. е1 а1. 1 А11егду Скп 1ттипо1. 2011 128:665-6).
Один из приемов ингибирования активации Т-клеток включает киназы-мишени, которые вовлечены в активацию сигнального комплекса Т-клеточного рецептора. Киназы семейства δук и δκ, как известно, играют ключевую роль в этом метаболическом пути, где киназы семейства δπο Руп и Ьск, представляют собой первые сигнальные молекулы, которые должны быть активированы ниже Т-клеточного рецептора (ВагЬег ЕК. е1 а1. ΡΝΑδ 1989, 86:3277-81). Они инициируют фосфорилирование тирозина Т-клеточного рецептора, приводя к рекрутингу киназы семейства δук, Ζ АР-70.
Исследования на животных показали, что выключение ΖΑΡ-70 приводит к клиническому проявлению ТКИН (Скап АС. е1 а1. δс^епсе. 1994, 10;264 (5165) :1599-601).
Клинические испытания на больных ревматоидным артритом с применением ингибитора δук, фостаматиниба (Роδΐатаΐ^η^Ь), показали возможности δук в качестве противовоспалительной мишени, причем больные проявили улучшенные клинические результаты и пониженные уровни в сыворотке 1Ь-6 и ММР-3 (ЩетЫаО МЕ. е1 а1. ΑΓίΗΓίΙίδ Ркеит. 2008 58:3309-18). δук киназа широко экспрессирует с клетках кроветворной системы, наиболее заметно в В-клетках и зрелых Т-клетках. Через взаимодействие с иммунорецепторными тирозиновыми активирующими мотивами (ИТАМ (1ТАМ)) она играет важную роль при регуляции Т-клеток и росте В-клеток, также опосредуя передачу сигнала иммунорецептора в воспалительных клетках. Активация δук приводит к высвобождению 1Ь-6 и ММР - медиаторов воспале- 2 027782 ния, обычно считаемых повышающими регуляцию при воспалительных заболеваниях, включая ВЗК и ревматоидный артрит (Жапд ΥΌ. е! а1 Жог1б I Саз!гоеп!его1 2007; 13: 5926-5932, ЬШпзку I е! а1. Су!окте. 2006 1ап 33:106-10).
Помимо ключевой роли в системах клеточных сигналов, которые контролируют провоспалительные пути метаболизма, киназные ферменты, как также установлено в настоящее время, регулируют активность целого ряда клеточных функций, включая поддержание целостности ДНК (8Ы1о, Υ. Ыа!иге НеУ1е^з Сапсег,. 2003, 3: 155-168) и координацию сложных процессов деления клеток. Действительно, некоторые ингибиторы киназ (так называемых киназ О1аНагзк1), как было найдено, меняют частоту образования микроядер т νιΐΐΌ (О1аНагзк1, А. I. е! а1., РЬо8 Сотри!. Вю1., 2009, 5(7), е1000446; бог 10.1371/]оигпа1.рсЫ.1000446). Образование микроядер вовлечено в, или связано с, нарушением митотических процессов и, следовательно, нежелательно. Ингибирование глюкоген-синтаза-киназы 3α (Ο8Κ3α), как установлено, является особенно значимым фактором, который повышает вероятность появления ингибитора киназы, стимулирующего образование микроядер. Кроме того, ингибирование киназы Ο8Κ3β с помощью ΡΝΑΐ, как сообщается, стимулирует образование микроядер (Т1§Не, А. е! а1., ВМС Се11 Вю1о§у, 2007, 8:34).
Хотя возможно смягчение отрицательных эффектов ингибирования киназ О1аНагзкц таких как Ο8Κ3α, за счет оптимизации дозы и/или за счет изменения пути введения молекулы, было бы целесообразно идентифицировать другие терапевтически полезные молекулы с низким или незначительным ингибированием киназ О1аНагзкц таких как Ο8Κ 3α, и/или иметь низкое или незначительное нарушение митотических процессов (например, которые измеряют при оценке митоза).
Различные соединения, в том числе производные мочевины, раскрыты как ингибирующие одну или несколько киназ. Примеры таких соединений можно найти в публикациях ЖО 99/23091, ЖО 00/041698, ЖО 00/043384, ЖО 00/055139, ЖО 01/36403, ЖО 01/4115, ЖО 02/083628, ЖО 02/083642, ЖО 02/092576, ЖО 02/096876, ЖО 2003/005999, ЖО 2003/068223, ЖО 2003/068228, ЖО 2003/072569, ЖО 2004/014870, ЖО 2004/113352, ЖО 2005/005396, ЖО 2005/018624, ЖО 2005/023761, ЖО 2005/044825, ЖО 2006/015775, ЖО 2006/043090, ЖО 2007/004749 и ЖО 2007/053394. Другие примеры можно найти в статьях, опубликованных в Сигг. Орт. Бги§ ^еνе1. (2004, 7(5), 600-616); I. Меб. СНет. (2007, 50, 4016-4026; 2009, 52, 3881-3891; апб 2010, 53, 5639-5655); Вюог§. Меб. СНет. ЬеП. (2007, 11, 354-357; 2008, 18, 32513255; 2009, 19, 2386-2391; и 2010, 20, 4819-4824); Сигг. Тор. Меб. СНет. (2008, 8, 1452-1467); Вюог§. Меб. СНет. (2010, 18, 5738-5748); Еиг. I. РНагтасо1. (2010, 632, 93-102) и I. СНет. 1п£. Мобе1. (2011, 51, 115-129).
Тем не менее остается потребность в идентификации и разработке новых ингибиторов киназ, точнее альтернативных ингибиторов р38 МАР-киназы, которые приемлемы для лечения воспаления. Особенно существует потребность в таких ингибиторах, которые обладают улучшенным терапевтическим потенциалом в сравнении с современными доступными способами лечения, или, в частности, которые проявляют превосходный терапевтический индекс (например, ингибиторы, которые, по меньшей мере, являются такими же эффективными и с одной или нескольких точек зрения являются менее токсичными при соответствующей терапевтической дозе, чем предыдущие средства).
В настоящее время неожиданно установлено, что анилин-замещенная диарилмочевина ингибирует одну или несколько киназ из числа р38 МАР-киназы, семейств киназ 8ук и 8гс, и, следовательно, обладает хорошими противовоспалительными свойствами.
Таким образом, в соответствии с первым аспектом изобретения предложено соединение формулы I или его фармацевтически приемлемые соль, сольват или изотопное производное, и это соединение в дальнейшем может называться соединением изобретения.
Фармацевтически приемлемые соли, которые могут быть упомянуты, включают кислотноаддитивные соли и основно-аддитивные соли. Такие соли могут быть получены обычными способами, например, реакцией соединения формулы I в форме свободной кислоты или свободного основания с одним или несколькими эквивалентами подходящей кислоты или подходящего основания, необязательно в растворителе или в среде, в которых соль нерастворима, после чего следует удаление указанного растворителя или указанной среды с использованием стандартных методик (например, в вакууме, сушкой вымораживанием или фильтрованием). Соли также могут быть получены обменом противоиона соединения формулы I в форме соли с другим противоионом, например, с использованием подходящей ионообменной смолы.
Примеры фармацевтически приемлемых солей включают кислотно-аддитивные соли, полученные
- 3 027782 из минеральных кислот и органических кислот, а также соли, полученные из металлов.
Для исключения неоднозначности толкования следует уточнить, что соединение формулы I может содержать указанные атомы в любых их природных или неприродных изотопных формах. В этой связи варианты осуществления настоящего изобретения, которые могут быть упомянуты, включают варианты, в которых:
(a) соединение формулы I не является изотопно-обогащенным или меченым относительно какихлибо атомов соединения; и (b) соединение формулы I является изотопно-обогащенным или меченым относительно одного или нескольких атомов соединения.
В данном случае ссылки на изотопное производное относятся ко второму из этих двух вариантов осуществления. В конкретных вариантах осуществления изобретения соединение формулы I является изотопно-обогащенным или меченым (относительно одного или нескольких атомов соединения) одним или несколькими стабильными изотопами. Следовательно, соединения изобретения, которые могут быть упомянуты, включают, например, соединения формулы I, которые являются изотопно-обогащенными или мечеными одним или несколькими атомами, такими как дейтерий или другие.
Соединения формулы I могут проявлять таутомеризм. Все таутомерные формы и их смеси включены в объем изобретения.
Соединение формулы I имеет название 3-((4-((4-(3-(5-(трет-бутил)-2-метокси-3-(метилсульфонамидо)фенил)уреидо)нафталин-1-ил)окси)пиримидин-2-ил)амино)-5-этинил-М-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид. Однако оно также может быть названо 3-[[4-[[4-[[5-трет-бутил-3-(метансульфонамидо)-2 -метоксифенил] карбамоиламино] -1 -нафтил] окси] пиримидин-2-ил] амино] -5 -этинил-Ν[2-[2-(2-метоксиэтокси)этокси]этил]бензамидом.
Таким образом, в одном варианте изобретение относится к 3-((4-((4-(3-(5-(трет-бутил)-2-метокси-3(метилсульфонамидо)фенил)уреидо)нафталин-1-ил)окси)пиримидин-2-ил)амино)-5-этинил-^(2-(2-(2метоксиэтокси)этокси)этил)бензамиду.
Примеры солей соединения формулы I включают все фармацевтически приемлемые соли, такие как, но без ограничения, кислотно-аддитивные соли сильных минеральных кислот, например, соли НС1 и НВг, и кислотно-аддитивные соли сильных органических кислот, таких как метансульфоновая кислота.
В данном описании ссылки на соединение изобретения (соединение формулы I), как подразумевают, включают ссылки на соединение и на все фармацевтически приемлемые соли, сольваты и/или таутомеры указанных соединений, если в контексте конкретно не указано другое. В этой связи сольваты, которые могут быть упомянуты, включают гидраты.
Соединение изобретения (соединение формулы I) является ингибитором р38 МАР-киназы (особенно подтипа альфа) и, следовательно, полезны в медицине, в частности для лечения воспалительных заболеваний. Таким образом другие аспекты изобретения, которые могут быть упомянуты, включают приведенные ниже аспекты.
(a) Фармацевтический препарат, содержащий соединение формулы I, которое определено выше, или его фармацевтически приемлемые соль, сольват или изотопное производное, в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
(b) Комбинированное лекарственное средство, содержащее:
(A) соединение формулы I, которое определено выше, или его фармацевтически приемлемые соль, сольват или изотопное производное, (B) другое терапевтическое средство, где каждый из компонентов (А) и (В) составлен в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
В этом аспекте изобретения комбинированное лекарственное средство может представлять собой или один (комбинированный) фармацевтический препарат или набор из частей.
Таким образом, этот аспект изобретения охватывает фармацевтический препарат, включающий соединение формулы I, которое определено выше, или его фармацевтически приемлемые соль, сольват или изотопное производное, и другое терапевтическое средство в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем (и этот препарат далее называют комбинированным препаратом).
Изобретение также охватывает набор из частей, содержащий компоненты:
(ί) фармацевтический препарат, включающий соединение формулы I, которое определено выше, или его фармацевтически приемлемые соль, сольват или изотопное производное в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем; и (ίί) фармацевтический препарат, включающий другое терапевтическое средство, в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем, и эти компоненты (ί) и (ίί) каждый представлен в форме, которая приемлема для введения в сочетании с другим.
Компонент (ί) набора из частей, таким образом, представляет собой компонент (А), описанный выше, в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем. Аналогично,
- 4 027782 компонент (ίί) представляет собой компонент (В), описанный выше, в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
(с) Способ получения фармацевтического препарата аспекта (а), описанного выше, причем указанный способ включает стадию смешения соединения формулы I, которое определено выше, или его фармацевтически приемлемых соли, сольвата или изотопного производного, с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
Варианты осуществления этого аспекта изобретения, которые могут быть упомянуты, включают варианты, в которых фармацевтически приемлемый адъювант, разбавитель или носитель, представляет собой адъювант, разбавитель или носитель, приемлемый для локального применения, (и/или где способ предназначен для получения локального фармацевтического препарата, то есть, фармацевтического препарата, который адаптирован для локального применения).
(ά) Соединение формулы I, которое определено выше, или его фармацевтически приемлемые соль, сольват или изотопное производное для применения в медицине (или для применения в качестве лекарственного средства или в качестве фармацевтического средства).
(е) Соединение формулы I, которое определено выше, или его фармацевтически приемлемые соль, сольват или изотопное производное, или фармацевтический препарат или комбинированное лекарственное средство, которые определены выше в связи с аспектом (а) или (Ь) изобретения, для применения при лечении или для профилактики воспалительного заболевания.
(ί) Применение соединения формулы I, которое определено выше, или его фармацевтически приемлемых соли, сольвата или изотопного производного, или фармацевтического препарата или комбинированного лекарственного чредства, которые определены в связи с аспектом (а) или (Ь) изобретения, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики воспалительного заболевания.
(д) Способ лечения или профилактики воспалительного заболевания, включающий введение субъекту эффективного количества соединения формулы I, которое определено выше, или его фармацевтически приемлемых соли, сольвата или изотопного производного, или фармацевтического препарата или комбинированного лекарственного средства, которые определены в связи с аспектом (а) или (Ь) изобретения.
(Ь) Способ сенсибилизации субъекта к противовоспалительным эффектам кортикостероида, включающий введение субъекту эффективного количества соединения формулы I, которое определено выше, или его фармацевтически приемлемых соли, сольвата или изотопного производного, или фармацевтического препарата или комбинированного лекарственного средства, которые определены в связи с аспектом (а) или (Ь) изобретения.
Варианты осуществления этого аспекта изобретения, которые могут быть упомянуты, включают варианты, где субъектом является субъект, который стал невосприимчивым к противовоспалительным эффектам кортикостероида.
Препараты
Что касается описанных выше аспектов (а) и (Ь), то разбавители и носители, которые могут быть упомянуты, включают разбавители и носители, приемлемые для парентерального, перорального, локального, мукозального и ректального введения.
Фармацевтические препараты и комбинированные лекарственные средства описанных выше аспектов (а) и (Ь) могут быть получены, например, для парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, интраартикулярного, интравитриального, периокулярного, ретробульбарного, субконъюктивального, субтенонового, местного офтальмологического или перисуставного введения, в частности, в форме жидких растворов, эмульсий или суспензий; для перорального введения, в частности, в форме таблеток или капсул, и особенно с использованием методик, направленных на достижение высвобождения лекарства в толстой кишке (РаГе1, Μ. М. Ехрег! Ορίη. Эгид ЭеИм. 2011, 8 (10), 1247-1258); для локального, например, ингаляционного или интраназального введения, в частности, в форме порошков, назальных капель или аэрозолей, и трансдермального введения; для местного офтальмологического введения, в частности, в форме растворов, эмульсий, суспензий, мазей, имплантатов/вставок, гелей, желе или препаратов липосомальных микрочастиц (СЬа!е, Ό.; ЕбеШаикет, Η. Р. Ехрег! Ορίη. Эгид ЭеИм. 2006, 3 (2), 275-287); для офтальмологического введения, в частности, в форме биоразрушаемых и небиоразрушаемых имплантатов, липосом и наночастиц (Τ1ιπιη;·ι\νί11ι;·ιη;·ι. Т.К. е! а1. Эгид Όίδοον. Тобау 2011, 16 (5/6), 270-277); для мукозального введения, например, на слизистые оболочки щеки, под язык или вагинально, и для ректального введения, например, в форме свечей или клизмы.
Фармацевтические препараты и комбинированные лекарственные средства описанных выше аспектов (а) и (Ь) обычно могут быть введены в стандартной дозированной лекарственной форме и могут быть приготовлены способами, хорошо известными в фармацевтической области, например, описанными в публикации КетшдФп'к РЬаттасеиИса1 8с1епсе5, 17!Ь еб., Маек РиЬЬкЫпд Сотрапу, Еак1оп, РА., (1985). Препараты для парентерального введения могут содержать в качестве наполнителей стерильную воду или физиологический раствор, алкиленгликоли, такие как пропиленгликоль, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрированные нафталины и т.д. Препараты для назального введения могут быть твердыми и могут содержать наполнители, например, лактозу
- 5 027782 или декстрин, или они могут представлять собой водные или масляные растворы для применения в форме назальных капель или дозированных спреев. В случае буккального введения местные наполнители включают сахара, стеарат кальция, стеарат магния, прежелатинизированный крахмал и другие.
Фармацевтические препараты и комбинированные лекарственные средства, приемлемые для перорального введения, могут содержать один или несколько физиологически совместимых носителей и/или наполнителей и могут находиться в твердой или жидкой форме. Таблетки и капсулы могут быть получены со связующими агентами, например, с сиропом, аравийской камедью, желатином, сорбитом, трагакантом или поливинилпирролидоном; наполнителями, такими как лактоза, сахароза, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит или глицерин; смазывающими веществами, такими как стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль или диоксид кремния; и поверхностно-активными веществами, такими как лаурилсульфат натрия. Жидкие композиции могут содержать обычные добавки, такие как суспендирующие агенты, например, сироп сорбита, метилцеллюлозу, сахарный сироп, желатин, карбоксиметилцеллюлозу или пищевые жиры; эмульгирующие агенты, такие как лецитин или аравийская камедь; растительные масла, такие как миндальное масло, кокосовое масло, рыбий жир или арахисовое масло; консерванты, такие как бутилированный гидроксианизол (ВНА) и бутилированный гидрокситолуол (ВНТ). Жидкие композиции могут быть инкапсулированы, например, в желатине, с получением стандартной дозированной лекарственной формы.
Твердые пероральные дозированные лекарственные формы включают таблетки, капсулы из состоящей из двух частей твердой оболочки и мягкие эластичные желатиновые капсулы (8ЕО). Такие капсулы из состоящей из двух частей твердой оболочки могут быть изготовлены, например, из желатина или гидроксипропилметил-целлюлозы (ГПМЦ (НРМС)).
Рецептура сухой оболочки, как правило, содержит приблизительно от 40 до 60% масс./масс. желатина, приблизительно от 20 до 30% пластификатора (такого как глицерин, сорбит или пропиленгликоль) и приблизительно от 30 до 40% воды. Другие материалы, такие как консерванты, красители, замутнители и вкусо-ароматизирующие вещества, также могут присутствовать. Жидкий наполняющий материал содержит твердое лекарство, которое растворено, солюбилизировано или диспергировано (с помощью суспендирующих агентов, таких как пчелиный воск, гидрированное касторовое масло или полиэтиленгликоль 4000), или жидкое лекарство в носителях или в комбинации носителей, таких как минеральное масло, растительные масла, триглицериды, гликоли, полиолы и поверхностно-активные агенты.
Соединение настоящего изобретения может быть введено локально (например, на легкие, глаза или стенки кишечника). Таким образом, варианты осуществления описанных выше аспектов (а) и (Ь), которые могут быть упомянуты, включают фармацевтические препараты и комбинированные лекарственные средства, которые приспособлены для локального введения. Такие препараты включают препараты, в которых наполнители (в том числе любой адъювант, разбавитель и/или носитель) являются локально приемлемыми.
Локальное введение в легкие может быть осуществлено путем использования аэрозольного препарата. Аэрозольные препараты, как правило, содержат активный ингредиент, суспендированный или растворенный в подходящем аэрозольном пропелленте, таком как хлорфторуглерод (ХФУ (СРС)) или гидрофторуглерод (ГФУ (НРС)). Подходящие ХФУ пропелленты включают трихлормонофторметан (пропеллент 11), дихлортетрафторэтан (пропеллент 114) и дихлордифторметан (пропеллент 12). Подходящие ГФУ пропелленты включают тетрафторэтан (НРС-134а) и гептафторпропан (НРС-227). Пропеллент, как правило, составляет от 40 до 99,5%, например, от 40 до 90% масс, всей ингаляционной композиции. Препарат может содержать наполнители, в том числе со-растворители (например, этанол) и поверхностноактивные вещества (например, лецитин, сорбитан триолеат и подобные вещества). Другие возможные наполнители включают полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, глицерин и др. Аэрозольные препараты упаковывают в емкости и подходящие дозы доставляют посредством дозирующего клапана (например, поставляемого Векрак, Уа1о18 или 3М, или, с другой стороны, Ар!ат, Со81ет или Уап).
Локальное введение в легкие также может быть достигнуто за счет использования не находящегося под давлением препарата, такого как водный раствор или суспензия. Он может быть введен посредством распылителя, например, распылителя, который может быть ручным и портативным или предназначенным для использования дома или в больнице (то есть, не портативным). Препарат может содержать наполнители, такие как вода, буферные растворы, регулирующие тоничность агенты, рН-регулирующие агенты, поверхностно-активные вещества и со-растворители. Суспензионные жидкие и аэрозольные препараты (или под давление или не находящиеся под давлением), как правило, будут содержать соединение изобретения в тонкоизмельченной форме, например, с Ό50 0,5-10 мкм, например, около 1-5 мкм. Распределение частиц по размерам может быть представлено с использованием значений ϋ10, Ό50 и Ό90. Медианное значение Ό50 распределений частиц по размерам определяют, как размер частиц в микронах, который делит распределение пополам. Значение, полученное при лазерной дифракции, более точно описывается как объемное распределение, и, следовательно, значение Ό50, полученное с использованием этой методики, более достоверно относится к значению Όν50 (медианное для распределения по объему). Как используется в данном случае, значения Όν относятся к распределениям частиц по размерам, измеренным с использованием лазерной дифракции. Аналогично, значения Ό10 и Ό90, используемые в контек- 6 027782 сте лазерной дифракции, как считают, дают значения Όνι0 и Όν90 и относятся к размеру частиц, при котором 10% распределения лежит ниже значения Ό10, а 90% распределения лежит ниже значения Ό90, соответственно.
Локальное введение в легкие также может быть достигнуто за счет использования сухого порошкового препарата. Сухой порошковый препарат будет содержать соединение изобретения в тонкоизмельченной форме, как правило, с масс-медианным аэродинамическим диаметром (ММАД (ΜΜΑΌ)) 1-10 мкм или Ό50 0,5-10 мкм, например, около 1-5 мкм. Порошки соединения изобретения в тонкоизмельченной форме могут быть приготовлены с помощью процесса микронизации или аналогичного процесса уменьшения размера. Микронизация может быть осуществлена с использованием струйной мельницы, такой как мельницы, производимые Нококате А1рше. Полученное распределение частиц по размерам может быть измерено с использованием лазерной дифракции (например, с помощью прибора МаКети МакЮгА/ег 20008). Препарат, как правило, будет содержать приемлемый для локального применения разбавитель, такой как лактоза, глюкоза или маннит (предпочтительно лактоза), обычно с большим размером частиц, например, со значением ММАД 50 мкм или больше, например, 100 мкм или больше, или с Ό50 40-150 мкм. Как используется в данном случае, определение лактоза относится к содержащему лактозу компоненту, включая моногидрат α-лактозы, моногидрат β-лактозы, безводную α-лактозу, безводную β-лактозу и аморфную лактозу. Лактозные компоненты могут быть переработаны микронизацией, просеиванием, помолом, прессованием, агломерацией или распылительной сушкой. Коммерчески доступные формы лактозы в различных формах также охватывают, например, препараты Ьае1оЬа1е® (лактоза для ингаляций; ΌΡΕ Рбатта), 1ибаЕае®70 (просеянная лактоза для сухого порошкового ингалятора; Медд1е), РЬатта1оке® (ΌΡΕ Рбатта) и КекрИоке® (просеянная лактоза для ингаляций; ΌΡΕ Рбатта). В одном варианте осуществления компонент лактозы выбирают из группы, включающей моногидрат αлактозы, безводную α-лактозу и аморфную лактозу. Предпочтительной лактозой является моногидрат αлактозы.
Сухие порошковые препараты также могут содержать другие наполнители, такие как стеарат натрия, стеарат кальция или стеарат магния.
Сухой порошковый препарат, как правило, доставляют с использованием сухого порошкового ингалятора (ЮР!). Примеры систем доставки сухого порошка включают СПИНХАЛЕР, ДИСКХАЛЕР, ТУРБОХАЛЕР, ДИСКУС и КЛИКХАЛЕР. Другие примеры систем доставки сухого порошка включают ЕСЬ1Р8Е, ΝΕΧΤ, РОТАХАЛЕР, ХАНДИХАЛЕР, АЭРОЛАЙЗЕР, ЦИКЛОХАЛЕР, БРИЗХАЛЕР/ ΝΕΟIΕΑΕΕΚ. ΜΟΝΟΌΟ8Ε, ЕЕС)\АСАР8. ТАШСАР8, Х-САР8, ТУРБОСПИН, ΕΙ.ΙΈΝΙΙΑΙ.ΕΚ. Α1ΕΑΤΙΕΑΕΕΚ. ТВИСТХЕЙЛЕР, НОВОЛАЙЗЕР, ПРЕССЭЙР, ЭЛЛИПТА, ингалятор сухого порошка ΟΚΙΕΕ, М1СЮΌΟ8Ε, ПУЛВИНАЛ, ИЗИХЕЙЛЕР, УЛЬТРАХАЛЕР, ТАЙФУН, ПУЛЬМОДЖЕТ, ΟΜΝΙΙ ΕΑΕΕΚ. ΟΥΚΟΙ ΕΑΕΕΚ. ΤΑРΕΚ, ΟΟΝΙΧ, XСΕ^ΟVΑIК и ΚΚΟΙ ΚΑΙ ,ΕΚ.
В одном варианте осуществления соединение настоящего изобретения представлено в микронизированном сухом порошковом препарате, например, также содержащем лактозу подходящего качества необязательно вместе со стеаратом магния, которым заполнено одноразовое устройство, такое как АЭРОЛАЙЗЕР, или которым заполнено многоразовое устройство, такое как ДИСКУС.
Соединения настоящего изобретения также могут быть введены ректально, например, в форме свечей или клизм, которые включают водные или масляные растворы, а также суспензии и эмульсии. Такие композиции готовят, следуя стандартным методикам, хорошо известным специалисту в данной области техники. Например, свечи могут быть получены смешением активного ингредиента с обычной суппозиторной основой, такой как масло какао или другие глицериды, например, Зирроште. В этом случае лекарство смешивают с подходящим не раздражающим наполнителем, который является твердым при обычных температурах, но жидким при ректальной температуре, и поэтому будет плавиться в прямой кишке с высвобождением лекарства. Такие материалы представляют собой масло какао и полиэтиленгликоли.
Как правило, в случае композиций, предназначенных для введения локально в глаза в форме глазных капель или глазных мазей, общее количество ингибитора будет составлять приблизительно от 0,0001 и до менее чем 4,0% (мас./мас.).
Предпочтительно в случае локального офтальмологического введения композиции, вводимые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть приготовлены в виде растворов, суспензий, эмульсий и других дозированных лекарственных форм. Водные растворы обычно являются предпочтительными, исходя из простоты препарата, а также из-за возможности для больного легко вводить такие композиции путем закапывания одной-двух капель растворов в пораженные глаза. Однако композиции также могут представлять собой суспензии, вязкие или полу-вязкие гели, или другие типы твердых или полутвердых композиций. Свечи могут быть предпочтительными для соединений, которые умеренно растворимы в воде.
Композиции, вводимые в соответствии с настоящим изобретением, также могут включать различные другие ингредиенты, в том числе, но без ограничения, регулирующие тоничность агенты, буферы, поверхностно-активные вещества, стабилизирующие полимеры, консерванты, со-растворители и структурообразующие агенты. Предпочтительные фармацевтические композиции настоящего изобретения
- 7 027782 включают ингибитор с регулирующим тоничность агентом и буфером. Фармацевтические композиции настоящего изобретения также необязательно могут включать поверхностно-активное вещество и/или успокоительное средство и/или стабилизирующий полимер.
Различные регулирующие тоничность агенты могут быть использованы для корректировки тоничности композиции, предпочтительно до тоничности естественных слез в случае офтальмологических композиций. Например, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, хлорид кальция, простые сахара, такие как декстроза, фруктоза, галактоза, и/или простые полиолы, такие как сахароспирты, маннит, сорбит, ксилит, лактит, изомальтит, мальтит и гидролизаты гидрированного крахмала, могут быть добавлены к композиции до приблизительно физиологической тоничности. Такое количество регулирующего тоничность агента будет меняться в зависимости от конкретного добавляемого агента. В общем случае, однако, композиции будут содержать регулирующий тоничность агент в количестве, достаточном, чтобы получить конечную композицию, которая имеет офтальмологически приемлемую осмоляльность (обычно приблизительно 150-450 мОсм, предпочтительно 250-350 мОсм и наиболее предпочтительно приблизительно 290 мОсм). В общем случае регулирующие тоничность агенты настоящего изобретения будут присутствовать в интервале от 2 до 4% мас./мас. Предпочтительными регулирующими тоничность агентами являются простые сахара или сахароспирты, такие как Ό-маннит.
Соответствующие буферные системы (например, фосфат натрия, ацетат натрия, цитрат натрия, борат натрия или борная кислота) могут быть добавлены к композициям, чтобы предупредить смещение рН в условиях хранения. Конкретные концентрации будут меняться в зависимости от используемого агента. Предпочтительно, однако, буфер будут выбрать так, чтобы сохранить целевое значение рН в интервале рН от 5 до 8 и более предпочтительно при целевом значении рН от 5 до 7.
Поверхностно-активные вещества необязательно могут быть использованы, чтобы создать более высокие концентрации ингибитора. Функция поверхностно-активных веществ состоит в солюбилизации ингибитора и стабилизации коллоидной дисперсии, такой как мицеллярный раствор, микроэмульсия, эмульсия и суспензия. Примеры поверхностно-активных веществ, которые необязательно могут быть использованы, включают полисорбат, полоксамер, полиоксил-40-стеарат, полиоксил касторового масла, тилоксапол, тритон и сорбитан монолаурат. Предпочтительные поверхностно-активные вещества, которые используют в настоящем изобретении, имеют гидрофильно/липофильный баланс (ГЛБ) в интервале от 12,4 до 13,2 и являются приемлемыми для офтальмологического применения, например, ТгйоиХ114 и тилоксапол.
Дополнительные агенты, которые могут быть добавлены к офтальмологическим композициям настоящего изобретения, представляют собой уменьшающие раздражение средства, которые функционируют как стабилизирующий полимер. Стабилизирующий полимер должен быть ионообменным полимером с предпочтением для локального офтальмологического применения, более конкретно, полимером, который несет отрицательный заряд на своей поверхности, который может проявлять зета-потенциал (-)10-50 мВ для физической стабильности, и способный давать дисперсию в воде (то есть, водорастворимый). Предпочтительный стабилизирующий полимер изобретения должен быть полиэлектролитом или полиэлектролитами, если присутствует больше чем один, из семейства поперечно сшитых полиакрилатов, таких как карбомеры, поликарбофил и пемулен(К) (Рети1еи(К)), в частности, СагЬошег 974р (полиакриловая кислота), при концентрации 0,1-0,5% мас./мас.
Другие соединения также могут быть добавлены к офтальмологическим композициям настоящего изобретения для повышения вязкости носителя. Примеры повышающих вязкость агентов включают, но без ограничения, полисахариды, такие как гиалуроновая кислота и ее соли, сульфат хондроитина и его соли, декстраны, различные полимеры семейства целлюлозы, виниловые полимеры и полимеры акриловой кислоты.
Типичные офтальмологические препараты, как правило, упаковывают в многоразовую форму. Следовательно, необходимы консерванты, чтобы предупредить микробное заражение во время применения. Подходящие консерванты включают: бензальконийхлорид, хлорбутанол, бензододецинийбромид, метилпарабен, пропилпарабен, фенилэтиловый спирт, динатрия эдентат, сорбиновую кислоту, поликватерний-1 и другие агенты, известные специалисту в данной области техники. Такие консерванты обычно используют на уровне от 0,001 до 1,0% мас./мас. Стандартные дозированные композиции настоящего изобретения будут стерильными, но, как правило, безконсервантными. Такие композиции, следовательно, обычно не будут содержать консерванты.
Практикующий врач или другой квалифицированный специалист будет способен определить подходящие дозировки для соединений изобретения и, следовательно, количество соединения изобретения, которое должно быть включено в любую конкретную фармацевтическую рецептуру (или в стандартную дозированную лекарственную форму или в другую форму).
Варианты осуществления изобретения, которые могут быть упомянуты в связи с комбинированными лекарственными препаратами, описанными выше в пункте (Ь), включают варианты, в которых другое терапевтическое средство представляет собой одно или несколько терапевтических средств, которые, как известно специалисту в данной области техники, являются приемлемыми для лечения воспалительных заболеваний (например, конкретных заболеваний, перечисленных ниже).
- 8 027782
Например, для лечения респираторных нарушений (таких как ХОЗЛ или астма) другое терапевтическое средство представляет собой одно или несколько средств, выбираемых из списка, включающего:
стероиды (например, будесонид, беклометазона дипропионат, флутиказона пропионат, мометазона фуроат, флутиказона фурорат; другим примером является циклесонид);
бета-агонисты, в частности, бета2-агонисты (например, тербуталин, салбутамол, салметерол, формотерол; другими примерами являются вилантерол, олодатерол, репротерол и фенотерол); и ксантины (например, теофиллин).
Например, для лечения респираторных нарушений (таких как ХОЗЛ или астма) другое терапевтическое средство представляет собой одно или несколько средств, выбираемых из списка, включающего:
мускариновые антагонисты (например, тиотропий, умеклидиний, гликопирроний, аклидиний и даротропий, любой из этих антагонистов, например, в виде бромид-соли); и ингибиторы фосфодиэстеразы.
Например, для лечения желудочно-кишечных нарушений (таких как болезнь Крона или неспецифический язвенный колит) другое терапевтическое средство представляет собой одно или несколько средств, выбираемых из списка, включающего:
5-аминосалициловую кислоту или ее пролекарство (например, сульфасалазин, олсалазин или бисалазид (ЬЬаЫ/Лс));
кортикостероиды (например, преднизолон, метилпреднизолон или будесонид); иммуносупрессанты (например, циклоспорин, такролимус, метотрексат, азатиоприн или 6меркаптопурин);
анти-ТХРа антитела (например, инфликсимаб, адалимумаб, цертолизумаб пегол или голимумаб); анти-1Ь12/1Ь23 антитела (например, устекинумаб) или низкомолекулярные ингибиторы 1Ь12/1Ь23 (например, апилимод);
анти-а4в7 антитела (например, ведолизумаб); блокаторы МА6САМ-1 (например, РР-00547659);
антитела к а4-интегрину молекулы клеточной адгезии (например, натализумаб); антитела к α-субединице рецептора 1Ь2 (например, даклизумаб или базиликсимаб); ингибиторы 1АК3 (например, тофацитиниб или К348);
ингибиторы §ук и их пролекарства (например, фостаматинид и К-406); ингибиторы фосфодиэстеразы-4 (например, тетомиласт);
НМРЬ-0 04;
пробнотики;
дерсалазин;
семапимод/СР31-2364; и ингибиторы протеинкиназы С (например, АЕВ-071).
Для лечения глазных нарушений (таких как увеит и сухой кератоконъюнктивит (сухость глаз)), другое терапевтическое средство может представлять собой, например, одно или несколько средств, выбираемых из списка, включающего:
кортикостероиды (например, дексаметазон, преднизолон, триамцинолона ацетонид, дифлупреднат или флуоцинолона ацетонид); агонисты глюкокортикоидов (например, мапракорат);
иммуносупрессанты (например, циклоспорин, воклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолата мофетил или такролимус);
анти-ΤΝΡα антитела (например, инфликсимаб, адалимумаб, цертолизумаб пегол, Е8ВА-105 или голимумаб);
анти-1Ь-17А антитела (например, секукинумаб); ингибиторы тТОК (например, сиролимус);
УСХ-1027;
агонисты А3 рецептора аденозина (например, СР-101); лифитеграст;
ингибиторы 1АК3 (например, тофацитиниб или К348); и ингибиторы протеинкиназы С (например, АЕВ-071).
В конкретных вариантах осуществления для лечения глазных нарушений (таких как увеит и сухой кератоконъюнктивит (сухость глаз)), другое терапевтическое средство может представлять собой, например, одно или несколько средств, выбираемых из списка, включающего:
кортикостероиды (например, дексаметазон, преднизолон, триамцинолона ацетонид, дифлупреднат или флуоцинолона ацетонид);
иммуносупрессанты (например, циклоспорин, воклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолата мофетил или такролимус);
анти-ΤΝΡα антитела (например, инфликсимаб, адалимумаб, цертолизумаб пегол, Е8ВА-105 или голимумаб);
- 9 027782 анти-1Ь-17А антитела (например, секукинумаб); ингибиторы тТОК (например, сиролимус);
УОХ-102 7;
ингибиторы 1ЛК3 (например, тофацитиниб или К348); и ингибиторы протеинкиназы С (например, АЕВ-071).
Медицинское применение
Соединение настоящего изобретения может быть использовано в качестве монотерапии в случае воспалительных заболеваний или при комбинированной терапии в случае таких заболеваний.
Таким образом, варианты осуществления описанных выше аспектов (е)-(д), которые могут быть упомянуты, включают варианты, в которых соединение формулы I (или его фармацевтически приемлемые соль, сольват или изотопное производное) представляет собой единственный фармакологически активный ингредиент, используемый при лечении.
Однако в других вариантах осуществления описанных выше аспектов (е)-(д) соединение формулы I (или его фармацевтически приемлемые соль, сольват или изотопное производное) вводят субъекту, которому также вводят одно или несколько терапевтических средств (например, где одно или несколько других терапевтических средств представляют собой средства, которые определены выше в связи с комбинированными лекарственными препаратами).
При использовании в данном изобретении определение воспалительное заболевание включает, в частности, ссылки на любое одно или несколько заболеваний из числа следующих:
(ί) легочные заболевания или нарушения, имеющие воспалительный компонент, такие как кистозный фиброз, легочная гипертензия, саркоидоз легких, идиопатический легочный фиброз или, в частности, ХОЗЛ (включая хронический бронхит и эмфизему), астма или детская астма;
(ίί) кожные заболевания или нарушения, имеющие воспалительный компонент, такие как атопический дерматит, аллергический дерматит, контактный дерматит или псориаз;
(ш) назальные заболевания или нарушения, имеющие воспалительный компонент, такие как аллергический ринит, ринит или синусит;
(ίν) глазные заболевания или нарушения, имеющие воспалительный компонент, такие как конъюнктивит, аллергический конъюнктивит, глаукома, диабетическая ретинопатия, макулярный отек (включая диабетический макулярный отек), окклюзия центральной вены клетчатки (СКУО), сухая и/или влажная форма возрастной макулярной дегенерации сетчатки (ΛΜΌ), послеоперационное воспаление после удаления катаракты или, в частности, сухой кератоконъюнктивит (сухость глаз), увеит (включая задний, передний и панувеит), отторжение роговичного и лимбального трансплантата; и (ν) желудочно-кишечные заболевания или нарушения, имеющие воспалительный компонент, такие как глютензависимая энтеропатия (глютеновая болезнь), эозинофильный эзофагит, интестинальная реакция трансплантат против хозяина или, в частности, болезнь Крона или неспецифический язвенный колит.
В данном случае ссылки на заболевания, имеющие воспалительный компонент, включают ссылки на заболевания, которые вызывают воспаление, независимо от того, имеют ли место или нет другие (не воспалительные) симптомы или последствия заболевания.
В соответствии с другим аспектом изобретения предложен способ получения соединения формулы I, и этот способ включает:
(а) взаимодействие соединения формулы II
с соединением формулы III \ 2
Ν—Ζ2 III н
где один из заместителей Ζ1 и Ζ2 представляет собой структурный фрагмент формулы IV:
и другой заместитель из Ζ1 и Ζ2 представляет собой структурный фрагмент формулы V:
например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, при темпе- 10 027782 ратуре от комнатной температуры (например, от 15 до 30°С) до приблизительно 110°С в присутствии подходящего органического растворителя (например, полярного апротонного растворителя, такого как ДМФА, ТГФ, 1,4-диоксан или их смеси);
(Ь) взаимодействие соединения формулы 11а,
О
где Ζ1 имеет значения, определенные выше, с подходящим азидобразующим агентом (то есть, с подходящим источником уходящей группы и активированного азид-иона, таким как дифенилфосфоразидат; см., например, ТеПаЬебгоп 1974, 30, 2151-2157) в условиях, известных специалисту в данной области техники, например, при температуре от пониженной до комнатной температуры (например, от начальной температуры приблизительно от -5 до 5°С до комнатной температуры после реакции) в присутствии аминного основания (например, триэтиламина или пространственно-затрудненного основания, такого как Ν,Ν-диизопропилэтиламин) и подходящего органического растворителя (например, полярного апротонного растворителя, такого как ДМФА, ТГФ, 1,4-диоксан или их смеси), и за этой реакцией следует, без выделения, термическая перегруппировка (например, при нагревании) промежуточного ацилазида (формулы Ζ'-0(0)-Ν3), например, при комнатной температуре (например, от 15 до 30°С), с получением ίη κίίτι соединения формулы II, и это соединение затем вводят в реакцию с соединением формулы III, которое определено выше, с получением соединения формулы I; (с) взаимодействие соединения формулы ПЬ
О н
где ЬО1 представляет собой подходящую уходящую группу (например, имидазолил, хлор или арилокси-группу, такую как феноксигруппа) и Ζ1 имеет значения, определенные выше, с соединением формулы III, которое определено выше, например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, при комнатной температуре (например, при температуре от комнатной температуры до 80°С, например, приблизительно при 60°С), необязательно в присутствии аминного основания (например, триэтиламина или пространственно-затрудненного основания типа Ν,Ν-диизопропилэтиламина) и подходящего органического растворителя (например, апротонного растворителя, такого как дихлорметан или сложный эфир, такой как изопропилацетат);
например, при условиях, известных специалисту в данной области техники (например, как описано в публикации 1. Ат. СЬет. 8ос. 2011, 133, 15686-15696), например, при повышенной температуре (например, от 50 до 110°С) в присутствии подходящего органического растворителя (например, полярного апротонного растворителя, такого как ДМФА, ТГФ, 1,4-диоксан или их смеси) и необязательно в присутствии кислотного катализатора (например, сульфоновой кислоты, такой как паратолуолсульфоновая кислота); или через сочетание Бухвальда (8иггу Ό.8.; ВисЬтеаИ, 8. Ь. СЬет. 8с1. 2011, 2, 27-50) с вовлечением палладиевого катализатора и соответствующего лиганда, например, ВтеЬРЬок; или (е) взаимодействие соединения формулы УПа
где К4' представляет собой Н или С]-3-алкильную группу (например, метил), с соединением формулы УПЬ
Н2Ы-[СН2СН2-О]2-СН2СН2-ОСН3 УИЬ
- 11 027782 например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, (ί) когда К4' представляет собой С1-3-алкильную группу, реакцию при комнатной температуре в присутствии подходящего катализатора, кислоты Льюиса, (например, триалкилалюминиевого реагента, такого как триметилалюминий) и апротонного органического растворителя (например, ТГФ); или (и) когда К4 представляет собой Н, реакцию в присутствии третичного аминного основания (например, триалкиламина, такого как триэтиламин или диизопропилэтиламин, или циклического амина, такого как Ν-метилпирролидин или Ν-метилморфолин), амидного (пептидного) сочетающего реагента (например, Т3Р, НАТИ, СЭ1. ВОР, РуВОР, НОА!, НОВ! или карбодиимида, такого как ДЦК (ЭСС) или диизопропилкарбодиимид) и апротонного органического растворителя (например, хлорированного растворителя, такого как ДХМ (ЭСМ), сложного эфира, такого как этилацетат, амида диметиламина, такого как ДМФА, или смеси любых таких растворителей); или (ίίί) до реакции с соединением формулы УПЪ превращение соединения формулы УПа в соответствующее соединение, в котором группа ОК4' замещена атомом галогена (например, хлором, и это соединение, например, может быть получено по реакции соединения формулы УПа, в котором К4' представляет собой Н, с галогенирующим агентом, таким как тионилхлорид, например, при повышенной температуре, например, от 50 до 70°С), после чего следует реакция полученного галогенангидрида с соединением формулы У11Ъ, и эта реакция, например, может быть проведена в присутствии апротонного органического растворителя (например, хлорированного растворителя, такого как ДХМ).
Соединения формулы II могут быть получены в соответствии с или по аналогии со способами, известными специалисту в данной области техники, например, по реакции соединения формулы 11а, которое определена выше, с азидобразующим агентом, после чего следует перегруппировка промежуточного ацилазида (как описано выше в (Ъ); см., например, Те1гайебгоп 1974, 30, 2151-2157).
Соединения формулы 11Ъ могут быть получены по реакции соединения формулы VIII
1_<3 где ЬО1 имеет определенные выше значения, с соединением формулы IX
О
Λ
КЗ1
VIII
где Ζ имеет определенные выше значения, например, при условиях, известных специалисту в данной области техники.
Амины формулы IX могут быть получены из карбоновых кислот формулы 11а по схеме, описанной выше в пункте (Ъ), где промежуточный изоцианат II гидролизуют водой с получением карбаминовой кислоты, которая теряет диоксид углерода, давая соединение IX. Подобным же образом промежуточный изоцианат II может быть введен в реакцию со спиртом, таким как ΐ-бутанол, с получением защищенного варианта соединения IX.
Соединения формулы III, в котором Ζ2 представляет собой структурный фрагмент формулы У, или соединения формулы IX, в котором Ζ1 представляет собой структурный фрагмент формулы У, могут быть синтезированы с использованием метода, описанного на схеме 1 (см., например: \УО 2003/072569 и \УО 2008/046216), где ЬО3 и ЬО4 представляют собой уходящие группы, например, галоген или метансульфонил, и ГО представляет собой реальную или скрытую ХН2-группу, то есть, группу, которая легко преобразуется в ХН2-группу, такую как нитрогруппа или защищенный вариант ΝΗ-РО2, где РО2 представляет собой типичную защитную группу (см., например: Огеепе, Т.^.; ^и18, Р.О.М. Рго!есйуе Огоирк ίη Огдашс БуШНему ^йеу, 41й геу18еб ебШоп, 2006; ΣδΒΝ-10: 0471697540), например, карбаматный эфир или карбоксамид. Последовательность реакций начинается при содействии основания с δΝΑτ замещения группы ЬО3 в соединении XI ароксидами, полученными, когда соединение X обрабатывают основанием, чтобы получить простые эфиры XII. Оставшийся галогеновый или метансульфонильный заместитель (ЬО4) простого эфира XII затем замещают ί) амином формулы VII во второй δΝΑτ реакции или (ίί) посредством сочетания Бухвальда (см., например, \УО 2009/017838) с амином формулы VII с получением целевого соединения (где ГО представляет собой ΝΗ2) или соединения XIII (где ГО представляет собой нитро-группу или ΝΗ-РО2). Когда ГО представляет собой нитро-группу в соединении XIII, NΗ2-группа может быть высвобождена с помощью реакции восстановления, как правило, проводимой посредством гидрирования с использованием подходящего катализатора, например, палладия на углероде, или путем использования растворяющих металл условий, например, с железом в ледяной уксусной кислоте. С другой стороны, когда ГО представляет собой защитную группу, ХН2-группа может быть высвобождена по реакции снятия защитной группы. Хотя скрытая ХН2-группа показана только как присутствующая на конечной стадии последовательности реакций, необходимо отметить, что высвобождение скрытой ΝΗ2группы, представленной ГО, может иметь место на любой стадии в методе синтеза, показанном на схеме
1.
- 12 027782
Схема 1
Аналогичным образом амины формулы IX, в которой Ζ1 представляет собой структурный фрагмент формулы IV, могут быть синтезированы превращением скрытой группы в реальную ХН2-группа в соединении формулы Х111а
где группа РО' имеет значения, определенные выше для РО, за исключением того, что она не является ΝΗ2.
Соединения формулы III, в которых Ζ2 представляет собой структурный фрагмент формулы V, или соединения формулы IX, в которых Ζ1 представляет собой структурный фрагмент формулы V, могут быть получены по аналогии со способами, описанными в изобретении для получения соединений формулы I (см., выше способ (е)) и других соединений формулы III (см., например, выше схему 1), например, по реакции соединения формулы ХШЬ
где РО и К4' имеют значения, определенные ранее, с соединением формулы νΜ^ которое определено ранее, при условиях, известных специалисту в данной области техники (например, в условиях пептидного сочетания, описанных выше в связи со способом (е)), после чего следует превращение (если необходимо) группы РО в NΗ2-группа, например, как описано выше в связи со схемой 1.
Соединения формулы VI могут быть синтезированы по аналогии с соединением формулы I (см., например, выше альтернативные способы от (а) до (с) ). Например, соединения формулы VI могут быть получены по реакции соединения формулы Их с соединением формулы Шх, где соединения формул Пх и Шх имеют те же определения, что и соединения формул II и III, за исключением того, что один из заместителей Ζ1 и Ζ2 представляет собой структурный фрагмент формулы IV, которая определена выше, и другой из заместителей Ζ1 и Ζ2 представляет собой структурный фрагмент формулы Vа
Соединение формулы VII может быть получено в соответствии с или по аналогии с методиками, известными специалисту в данной области техники, например, по реакции соединения формулы XIV
где РО имеет значения, определенные выше, с соединением формулы VIIЬ, которое определено выше, при условиях, известных специалисту в данной области техники (например, при условиях пептидного сочетания, описанных выше в связи со способом (е)), после чего следует, когда РО представляет
- 13 027782 собой ΝΗ-РО2, удаление РО2 защитной группы, или, когда РО представляет собой ΝΟ2, восстановление ΝΟ2 до ΝΗ2.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что соединения, представленные формулами II, Их и ИЬ, представляют собой, как правило, реакционноспособные промежуточные соединения. Такие промежуточные соединения могут быть образованы ίη 8йи и введены в реакцию напрямую, без выделения, с соединениями формулы III с получением соединения формулы I. Кроме того, специалисту в данной области техники будет понятно, что может быть необходимо применение соответствующих защитных групп во время осуществления способов, описанных выше, для любых групп Ζ1 и Ζ2, которые имеют химически-чувствительные функциональные группы, например, гидроксильную группу или аминную функциональность.
Многие из соединений, представленных на схемах, являются или коммерчески доступными, или могут быть легко получены с использованием процитированных методик, или могут быть легко получены обычными способами, которые известны специалисту в данной области техники. См., например, публикации Редан, I. е! а1.; I. Мей. СЬет. 2003, 46, 4676-4686, АО 2000/043384, АО 2007/053346, АО 2007/087448, АО 2007/089512, АО 2009/117080 апй АО 2014/027209.
Конкретный вариант осуществления изобретения относится к способу получения соединения формулы I, и этот способ включает реакцию соединения формулы XV
где ИО1 имеет определенные выше значения (например, представляет собой фенокси-группу), например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, при повышенной температуре (например, от 40 до 80°С, например, приблизительно при 60°С), в присутствии аминного основания (например, триэтиламина) и апротонного органического растворителя (например, сложного эфира, такого как изопропилацетат).
Соединение формулы XV может быть получено путем снятия защиты с соответствующего соединения формулы XVа,
где РО2 имеет определенные выше значения (например, РО2 представляет собой трет-бутоксикарбонил), например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, когда РО2 представляет собой трет-бутоксикарбонил, реакцией с сильной кислотой (например, алкил- или арилсульфоновой кислотой (например, п-толуолсульфоновой кислотой и/или, в частности, трифторуксусной кислотой) в присутствии апротонного органического растворителя (например, хлорированного растворителя, такого как ДХМ).
Соединение формулы XVа может быть получено реакцией соединения формулы VII, которое определено выше, с соединением формулы XII (например, с соединением формулы XII, в котором ИО4 представляет собой атом хлора), которое определено ранее, но в котором РО представляет собой ΝΗ-РО2 (например, ΝΗ-ΟΌ^-Ο^^Ε), например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, при повышенной температуре (например, от 40 до 80°С, например, между 60 и 70°С), в присутствии апротонного растворителя (например, в ТГФ) и необязательно кислого катализатора (например, сульфоновой кислоты, такой как пара-толуолсульфоновая кислота).
Соединение формулы VII может быть получено способами, такими как описанные выше способы. Например, соединение формулы VII может быть получено путем снятия защитной группы с соединения формулы VII(Р)
где К', К и К' независимо представляют собой С1-4-алкил (например, все заместители К', К и К'
- 14 027782 представляют собой изопропил), например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, взаимодействием при обычной температуре в полярном апротонном растворителе (например, в ацетонитриле) с источником фторид-иона, таким как ТБАФ (ТВЛР) или фторид цезия.
Соединение формулы νΐΙ(Ρ) может быть получено сочетанием (например, по реакции сочетания Соногаширы; см. Сйет. 5ое. Кеу. 2011, 40, 5084-5121) соединения формулы XVII
\ и·—Зг
Р/ где БО5 представляет собой атом галогена, например, атом брома, с соединением формулы XVIII к’\
-н XVIII где К', К и К' имеют определенные выше значения, например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, реакцией при повышенной температуре (например, от 50 до 80°С или, в частности, от 60 до 70°С) в присутствии СШ и катализатора Рй(0) (например, Рй(РРй3)4) и инертного в реакции органического растворителя, такого как ТГФ. Соединение формулы XVII может быть получено восстановлением соединения формулы XIX,
где БО5 имеет определенные выше значения, например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, при повышенной температуре (например, при температуре приблизительно от 50 до 70°С) в атмосфере водорода (например, в атмосфере Н2 при давлении приблизительно 3 МПа) в присутствии подходящего катализатора (например, Р!/С), инертного в реакции растворителя (например, ТГФ) и кислоты (например, уксусной кислоты) или альтернативно с железом в кислой среде (например, в соляной кислоте) в воде и этаноле.
Соединение формулы XIX может быть получено реакцией соединения формулы XX
где БО5 имеет определенные выше значения, с галогенирующим агентом (например, с тионилхлоридом, например, при температуре от 60 до 70°С), после чего следует реакция промежуточного галогенангидрида с соединением формулы νΉΟ, которая определена выше, например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, при 25 °С или ниже в присутствии апротонного органического растворителя (например, ДХМ) и основания, например, триэтиламина, ДИПЭА (БРЕЛ) или ИаНСО3. С другой стороны, такое преобразование может быть выполнено конденсацией в присутствии третичного аминного основания (например, триалкиламина, такого как триэтиламин или ДИПЭА, или циклического амина, такого как Ν-метилпирролидин или Ν-метилморфолин), амидного (пептидного) сочетающего реагента (например, Т3Р, НАТи, СЭР ВОР, РуВОР, НОЛ1, НОВ! или карбодиимид, такой как ЭСС или диизопропилкарбодиимид) и апротонного органического растворителя (например, хлорированного растворителя, такого как ДХМ, сложного эфира, такого как этилацетат, амида диметиламина, такого как ДМФА (ΌΜΕ), или смеси любых таких растворителей).
Соединение формулы XVI может быть получено реакцией соединения формулы XXI (Б52003/0065034) с соединением формулы XXII
XXII
О
А.
ье1 че2 где БО1 и БО2 представляют собой уходящие группы (например, БО1 представляет собой феноксигруппу и БО2 представляет собой атом галогена, такой как атом хлора), например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, при температуре ниже приблизительно 20°С в присутствии основания (например, №НС’О3) и инертного в реакции органического растворителя (напри- 15 027782 мер, ТГФ, ДХМ или, особенно, их смеси).
Соединение формулы XXI может быть получено реакцией соединения формулы XXIII
например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, в атмосфере водорода (например, в атмосфере Н2 при давлении приблизительно от 0,3 до 0,4 МПа) в присутствии подходящего катализатора (например, РП/С) и растворителя (например, метанола).
Соединение формулы XXI может быть получено реакцией соединения формулы XXIV
с метансульфонилхлоридом, например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, при температуре между 25 и 40°С, в присутствии основания (например, пиридина) и инертного в реакции органического растворителя (например, толуола).
Соединение формулы XXIV может быть получено частичным восстановлением соединения формулы XXV
например, при условиях, известных специалисту в данной области техники, например, при повышенной температуре (например, при температуре от 70 до 80°С) в присутствии источника водорода (например, 4-метил-1-циклогексена), подходящего катализатора (например, РП/С) и растворителя (например, спирта, такого как метанол, этанол или их смесь, такая как промышленный денатурат).
В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к способу получения соединения формулы I, и этот способ включает:
(a) способ, описанный в изобретении, для получения соединения формулы XV; и/или (b) способ, описанный в изобретении, для получения соединения формулы XVI.
В связи с этими вариантами осуществления изобретения способ получения соединения формулы I может включать способ, описанный в изобретении, для получения любого одного или нескольких соединений формул XVа, ^(Р), VII, XVII, XIX, XXI, XXIII и XXIV.
Новые промежуточные соединения, описанные в изобретении, образуют аспект изобретения. В этой связи еще один аспект изобретения относится к соединению формулы XVI, которое определено ранее (например, к соединению формулы XVI, в котором ЬО1 представляет собой феноксигруппу).
Аспекты изобретения, описанные в настоящем документе (например, упомянутые выше соединения, комбинации, способы и варианты применения), могут иметь преимущество в том, что при лечении состояний, описанных в изобретении, они могут быть более удобными для врача и/или пациента, более эффективными, менее токсичными, могут иметь лучшую селективность, иметь более широкий спектр активности, быть более сильнодействующими, давать меньше побочных эффектов, иметь улучшенный фармакокинетический и/или фармакодинамический профиль, могут иметь более подходящую морфологию твердого состояния, иметь улучшенную долговременную стабильность или могут иметь другие полезные фармакологические свойства в сравнении с аналогичными соединениями, комбинациями, способами (способами лечения) или вариантами применения, которые известны из предшествующего уровня техники для применения при лечении этих состояний или других состояний.
Соединения настоящего изобретения дополнительно (или альтернативно) могут проявлять длительную продолжительность действия и/или устойчивость действия (например, в сравнении с другими ранее открытыми ингибиторами р38 МАР-киназы, такими как, например, ВЖВ796);
не сильно ингибировать О8К 3 α;
воздействовать на меньшую часть кинома, то есть, действовать с улучшенной селективностью, что иллюстрируется пониженными показателями Кшоте8сап 8е1есй\э1у 8соте§;
поддерживать относительно высокую локальную концентрацию лекарства между приемами доз (например, высокую локальную концентрацию относительно других ранее открытых ингибиторов р38 МАР-киназы, таких как, например, ВIКВ796);
проявлять свойства, которые особенно приемлемы для локального/местного введения (например,
- 16 027782 после локального/местного введения обеспечение высоких концентраций в желаемой ткани, но низких концентраций в плазме, соединений формулы (I) и/или быстрое выведение соединений формулы (I) из плазмы, например, в результате высокого почечного или печеночного выведения);
проявлять незначительную индукцию β-катенина и/или незначительное ингибирование митоза в клетках или их отсутствие;
не продуцировать рост двухъядерных клеток, содержащих микроядра, в лимфоцитах человека в ίη νίίΓΟ микроядерном тесте;
проявлять незначительное зависимое от времени ингибирование членов суперсемейства цитохрома Р450 или его отсутствие;
демонстрировать улучшенную химическую стабильность в присутствии воды (например, устойчивость к гидролизу в водных смесях при повышенных температурах) по сравнению с ранее открытыми ингибиторами р38 МАР-киназы, такими как, например, ВГКВ796);
после введения пациенту вызывать образование метаболитов, незначительно связанных или не ассоциирующихся с проблемой безопасности (например, с токсичностью);
проявлять хорошую растворимость и/или клеточную проницаемость; иметь высокую степень кристалличности; и/или проявлять незначительную гигроскопичность или ее отсутствие в твердом состоянии.
Экспериментальные способы
Общие методики
Все исходные материалы и растворители получены из коммерческих источников или приготовлены в соответствии с цитируемыми литературными источниками. Если не указано другое, все реакции проводят с перемешиванием. Органические растворители сушат в установленном порядке над безводным сульфатом магния. Микроволновые реакции проводят в микроволновом реакторе СЕМ Э^соусг и διηίΐίιсгеаЮг, нагретом до постоянной температуры с использованием микроволнового излучения переменной мощности.
Колоночную хроматографию с нормальными фазами в установленном порядке проводят на автоматизированной системе флэш-хроматографии, такой как СотЫИакЬ Сотрапюп или СотЫИакЬ КР, с использованием набитых силикагелем (230-400 меш, 40-63 мкм) картриджей. Катионообменную смолу 8СХ приобретают у §ире1со и перед использованием обрабатывают 1М соляной кислотой. Если не указано другое, реакционную смесь, которую необходимо очистить, вначале разбавляют МеОН и подкисляют несколькими каплями АсОН. Этот раствор загружают непосредственно на 8СХ и промывают МеОН. Целевой материал затем элюируют путем промывания с помощью 1%-ного раствора ΝΗ3 в МеОН.
Аналитические методы
Аналитическую ВЭЖХ проводят с использованием прибора \Ха1ег5 Х§е1ес1 С8Н С18, 2,5 мкм, колонка 4,6x30 мм, элюируя с градиентом 0,1%-ной муравьиной кислоты в ΜеСN в 0,1%-ной водной муравьиной кислоте, или прибора \Ха1ег5 ХЬп<Це ВЕН С18, 2,5 мкм, колонка 4,6x30 мм, элюируя с градиентом ΜеСN в водном 10 мМ растворе бикарбоната аммония. УФ-спектры элюированных пиков измеряют с использованием или диодно-матричного детектора, или детектора с переменной длиной волны на системе АдПей 1100.
Аналитическую ЖХ-МС проводят с использованием прибора \Ха1ег5 Х§е1ес1 С8Н С18, колонка 2,5 мкм, 4,6x30 мм, элюируя с градиентом 0,1%-ной муравьиной кислоты в ΜеСN в 0,1%-ной водной муравьиной кислоте, или \Ха1ег5 ХЬп<Це ВЕН С18, 2,5 мкм, колонка 4,6x30 мм, элюируя с градиентом ΜеСN в водном 10 мМ растворе бикарбоната аммония. УФ- и масс-спектры получают с использованием детектора с переменной длиной волны или на системе АдПеШ 1200 или на системе АдПеШ ίηΠηίΙν 1260 ЬСМ§ с 6120 одноквадрупольным масс-спектрометром с электрораспылением с регистрацией положительных и отрицательных ионов.
Препаративную ВЭЖХ проводят с использованием прибора \Ха1ег5 Х§е1ес1 С8Н С18, 5 мкм, колонка 19x50 мм, с использованием любого градиента или 0,1%-ной муравьиной кислоты в ΜеСN в 0,1%-ной водной муравьиной кислоте, или градиента ΜеСN в водном 10 мМ растворе бикарбоната аммония, или с использованием прибора \Ха1ег5 ХЬп<де ВЕН С18, 5 мкм, колонка 19x50 мм, с использованием градиента ΜеСN в водном 10 мМ растворе бикарбоната аммония. Фракции собирают, затем детектируют с помощью УФ при одной длине волны, измеренной детектором с переменной длиной волны, на препаративной ВЭЖХ Οί1δοη 215 или препаративной ВЭЖХ Уапап Ргер81аг, или по массе и УФ при одной длине волны, измеренных с помощью ΖΟ одноквадрупольного масс-спектрометра с электрораспылением с регистрацией положительных и отрицательных ионов и двухволнового детектора на приборе \Ха1ег5 РгасЯопЬупх ЬСМ§.
Спектроскопия 'Н ЯМР: Спектры 1Н ЯМР получают на спектрометре Вгикег Ауапсе III при 400 МГц. Любой из центральных сигналов хлороформа-<, диметилсульфоксида-<6 или внутреннего стандарта, тетраметилсилана, используют в качестве стандарта сравнения.
- 17 027782
Примеры
Пример 1. 3-((4-((4-(3-(5-(трет-Бутил)-2-метокси-3-(метилсульфонамидо)фенил)уреидо)нафталин-1ил)окси)пиримидин-2-ил)амино)-5-этинил-Х-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид (соединение I)
(ί) 3-Бром-Х-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)-5-нитро-бензамид.
Медленно добавляют Т3Р, 50 мас.%, в ЕЮАс (25 мл, 42,0 ммоль) к раствору 3-бром-5нитробензойной кислоты (7,05 г, 28,7 ммоль), 2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этанамина (4 г, 24,25 ммоль) и Εΐ3Ν (12 мл, 86 ммоль) в ЕЮАс (50 мл), погруженному при этом в ледяную баню. По окончании добавления ледяную баню убирают и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 2 ч. Смесь распределяют между насыщенным водным раствором №-1НСО3, (100 мл) и ЕЮАс (100 мл). Органический слой промывают водным раствором К2СО3 (10 г в 100 мл) и рассолом (100 мл), затем сушат (М§8О4), фильтруют и концентрируют в вакууме, получают соединение подзаголовка (8,23 г) в виде коричневого масла.
Спектр 'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-а6), δ: 9,02 (т, 1Н), 8,65-8,64 (м, 1Н), 8,53 (т, 1Н), 8,46 (т, 1Н), 3,57-3,43 (м, 10Н), 3,41-3,38 (м, 2Н), 3,21 (с, 3Н). ЖХ-МС т/ζ: 391/393 (м+Н)+ (Е8+); 389/391 (м-Н)- (Е8-) (ίί) 3-Амино-5-бром-Х-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид.
Порошок железа (5,90 г, 106 ммоль) добавляют к раствору продукта со стадии (ί) (8,24 г, 20,43 ммоль) и конц. НС1 (2 мл, 23,40 ммоль) в ЕЮН (65 мл) и воде (15 мл). Смесь нагревают при 75°С (температура блока) в течение 1 ч. Затем реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, разбавляют водой (30 мл), фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток подщелачивают ЩаНСО3), затем распределяют между ЕЮАс (350 мл) и водой (275 мл) . Органический слой сушат (М§8О4), фильтруют и концентрируют в вакууме, получают оранжевое масло, которое очищают хроматографией на силикагеле (колонка 220 г, 0-5% МеОН в ДХМ) получают соединение подзаголовка (5,25 г) в виде оранжевого масла.
'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-66), δ: 8,36 (т, 1Н), 7,07 (т, 1Н), 7,00-6,99 (м, 1Н), 6,84 (т, 1Н), 5,57 (с, 2Н), 3,52-3,48 (м, 8Н), 3,42-3,39 (м, 2Н), 3,35 (кв., 2Н), 3,22 (с, 3Н). ЖХ-МС т/ζ: 361/363 (М+Н)+ (Е8+) (ίίί) 3-Амино-Х-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)-5-((триизопропилсилил)этинил)бензамид.
К обезгаженному раствору продукта со стадии (ίί) (5,06 г, 13,31 ммоль), этинилтриизопропилсилана (4,5 мл, 20,06 ммоль), Си(1)1 (130 мг, 0,683 ммоль) и ЕьХ (8 мл, 57,4 ммоль) в ДМФА (45 мл) добавляют Рй(РРЬ3)4 (770 мг, 0,666 ммоль). Реакционную смесь нагревают при 85°С в течение 3 часов, затем охлаждают до комнатной температуры и распределяют между ЕЮАс (250 мл) и рассолом (250 мл). Водную фазу дополнительно экстрагируют ЕЮАс (250 мл), затем объединенные органические экстракты промывают водой (3x200 мл) и рассолом (200 мл), сушат (М§8О4), фильтруют и концентрируют в вакууме, получают темно-коричневое масло. Сырой продукт очищают хроматографией на силикагеле (колонка 220 г, 0-3% МеОН в ДХМ), получают соединение подзаголовка (5,4 г) в виде оранжевого масла.
'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-а6), δ: 8,39 (т, 1Н), 7,06-7,03 (м, 2Н), 6,79-6,78 (м, 1Н), 5,43 (с, 2Н), 3,543,49 (м, 8Н), 3,41-3,33 (м, 4Н), 3,21 (с, 3Н), 1,10 (с, 21Н). ЖХ-МС т/ζ: 463 (М+Н)+ (Е8+).
(ίν) 3 -Амино-5 -этинил-Х-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид.
При перемешивании к раствору продукта со стадии (ίίί) (5,33 г, 11,40 ммоль) в ЕЮАс (75 мл) добавляют 1М ТБАФ (ТВАР) в ТГФ (11,40 мл, 11,40 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 1 ч, затем распределяют между водой (300 мл) и ЕЮАс (400 мл), водную фазу дополнительно экстрагируют ЕЮАс (300 мл). Объединенные органические экстракты промывают рассолом (400 мл), затем сушат (МдЗО4), фильтруют и концентрируют, получают оранжевое масло. Сырой продукт растворяют в минимальном количестве МеОН и загружают на колонку 8СХ. Колонку элюируют МеОН (3 объема колонки), затем 1%-ным раствором ΝΉ3 в МеОН (3 объема колонки). Содержащие продукт фракции концентрируют в вакууме, получают соединение подзаголовка (3,27 г) в виде коричневого масла.
'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-а6), δ: 8,38 (т, 1Н), 7,06-7,04 (м, 2Н), 6,75-6,74 (м, 1Н), 5,46 (с, 2Н), 4,09 (с, 1Н), 3,53-3,48 (м, 8Н), 3,41-3,39 (м, 2Н), 3,37-3,33 (м, 2Н), 3,21 (с, 3Н). ЖХ-МС т/ζ: 307 (М+Н)+ (Е8+).
(ν) трет-Бутил-(4-((2-((3-этинил-5-((2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)карбамоил)фенил)амино) пиримидин-4-ил)окси)-нафталин-1-ил)карбамат.
К раствору продукта со стадии (ίν) (1 г, 3,13 ммоль) и трет-бутил-(4-((2-хлорпиримидин-4-ил)окси) нафталин-1-ил)-карбамата (см., например, Йо, К. с1 а1. , \УО 2010/067130, 17 июня 2010; 777 мг, 2,090 ммоль) в ДМФА (60 мл) при перемешивании добавляют моногидрат п-ТСК (рТЗА) (200 мг, 1,051 ммоль). Полученный раствор перемешивают при 60°С в течение 72 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, затем распределяют между ЕЮАс (150 мл) и насыщенным водным раствором
- 18 027782
ЫаНСОз (100 мл). Водный слой дополнительно экстрагируют ЕЮЛс (2x150 мл), затем объединенные органические экстракты промывают водой (3x200 мл) и рассолом (200 мл), затем сушат (Мд8О4), фильтруют и концентрируют, получают оранжевое масло (1,17 г). Сырой продукт очищают хроматографией на силикагеле (80 г колонка, 0-5% МеОН в ЕЮЛс) получают соединение подзаголовка (552 мг) в виде светло-коричневой пены.
'II ЯМР (400 МГц, ДМСО-йе), δ: 9,73 (с, 1Н), 9,29 (с, 1Н), 8,46-8,43 (м, 2Н), 8,11-8,09 (м, 2Н), 7,927,88 (уш. м, 1Н), 7,83-7,80 (м, 1Н), 7,62-7,53 (м, 3Н), 7,56-7,55 (м, 1Н), 7,42 (д, 1Н), 6,57 (д, 1Н), 4,14 (с, 1Н), 3,54-3,48 (м, 8Н), 3,40-3,35 (м, 4Н), 3,20 (с, 3Н), 1,52 (с, 9Н). ЖХ-МС т/ζ: 642 (М+Н)+ (Е8+) (νί) 3-((4-((4-Аминонафталин-1-ил)окси)пиримидин-2-ил)амино)-5-этинил-№(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид.
К раствору продукта со стадии (ν) (540 мг, 0,825 ммоль) в ДХМ (8 мл) при перемешивании добавляют ТФУК (3,2 мл, 41,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 1 ч. Раствор концентрируют в вакууме, полученное масло растворяют в минимальном количестве МеОН и загружают на колонку 8СХ. Колонку элюируют МеОН (3 объема колонки), затем 1%-ным раствором ΝΗ3 в МеОН (3 объема колонки). Содержащую продукт часть концентрируют в вакууме, получают соединение подзаголовка (405 мг) в виде светло-коричневого масла.
'II ЯМР (400 МГц, ДМСО-й6), δ: 9,73 (с, 1Н), 8,45 (т, 1Н), 8,36 (д, 1Н), 8,14-8,10 (м, 1Н), 8,07-8,05 (уш. м, 1Н), 7,94-7,92 (уш. м, 1Н), 7,65-7,61 (м, 1Н), 7,47-7,40 (м, 3Н), 7,15 (д, 1Н), 6,72 (д, 1Н), 6,37 (д, 1Н), 5,87 (уш. с, 2Н), 4,17 (с, 1Н), 3,54-3,48 (м, 8Н), 3,40-3,36 (м, 4Н), 3,20 (с, 3Н). ЖХ-МС т/ζ: 542 (М+Н)+ (Е8+).
(νίί) Фенил-(5-(трет-бутил)-2-метокси-3- (метилсульфонамидо)фенил)карбамат.
Фенилхлорформиат (0,5 мл, 3,99 ммоль) при перемешивании добавляют к раствору №(3-амино-5(трет-бутил)-2-метоксифенил)метансульфонамида (см., например, Сш11о, Р. Р. е! а1., \7О 2002/083628, 24 Ос1оЬет 2002; 1 г, 3,67 ммоль) и Ν;·ιΗί'.Ό3 (620 мг, 7,38 ммоль) в ТГФ (10 мл) и ДХМ (10 мл). Смесь перемешивают 2 ч, затем добавляют воду (20 мл). Органический слой отделяют, сушат (Мд8О4), фильтруют и упаривают, получают коричневую пену, которую перемешивают в циклогексане (20 мл), получают соединение подзаголовка (1,4 г) в виде бесцветного твердого вещества.
'II ЯМР (400 МГц, ДМСО-а6), δ: 9,49 (с, 1Н), 9,14 (с, 1Н), 7,56 (с, 1Н), 7,50-7,37 (м, 2Н), 7,31-7,13 (м, 4Н), 3,77 (с, 3Н), 3,06 (с, 3Н), 1,25 (с, 9Н). ЖХ-МС т/ζ: 393 (М+Н)+ (Е8+) ; 391 (м-Н)- (Е8-).
(νίίί) 3-((4-((4-(3-(5-(трет-Бутил)-2-метокси-3-(метилсульфонамидо)фенил)уреидо)нафталин-1-ил) окси)пиримидин-2-ил)амино)-5-этинил-№(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид.
При перемешивании смесь фенил-(5-(трет-бутил)-2-метокси-3-(метилсульфонамидо)фенил)карбамата (см. выше стадию 1(νίί); 95 мг, 0,239 ммоль), продукта со стадии (νί) (120 мг, 0,217 ммоль) и Е1Х (6 мкл, 0,043 ммоль) в ί-РтОЛс (3 мл) нагревают при 70°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографией на силикагеле (колонка 40 г, 0-5% МеОН в ЕЮЛс), получают масло, которое растирают с диэтиловым эфиром, получают светло-бежевое твердое вещество. Сырой продукт очищают препаративной ВЭЖХ (Уапап, основная (10 мМ бикарбонат аммония), ^а1ет8 Х-Впаде Ргер-С18, 5 мкм, колонка 19x50 мм, 35-70% МеСN в воде), получают названное соединение (69 мг) в виде почти белого твердого вещества.
'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-а6), δ: 9,74 (с, 1Н), 9,32 (с, 1Н), 9,13 (с, 1Н), 8,89 (с, 1Н), 8,46-8,43 (м, 2Н),
8,26 (д, 1Н), 8,17 (д, 1Н), 8,09-8,07 (м, 2Н), 7,87-7,83 (м, 2Н), 7,69-7,65 (м, 1Н), 7,61-7,57 (м, 1Н), 7,45-7,43 (м, 2Н), 7,02 (д, 1Н), 6,55 (д, 1Н), 4,11 (с, 1Н), 3,80 (с, 3Н), 3,53-3,47 (м, 8Н), 3,40-3,35 (м, 4Н), 3,20 (с, 3Н), 3,09 (с, 3Н), 1,26 (с, 9Н). ЖХ-МС т/ζ: 840 (М+Н)+ (Е8+) ; 838 (м-Н)- (Е8-).
Пример 2. 3-((4-((4-(3-(5-(трет-Бутил)-2-метокси-3-(метилсульфонамидо)фенил)уреидо)нафталин-1ил)окси)пиримидин-2-ил)амино)-5-этинил-№(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид (соединение I).
(ί) 3-Бром-№(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)-5-нитробензамид.
В колбу объемом 10 л, оборудованную скруббером с атмосферой азота, добавляют 3-бром-5нитробензойную кислоту (2686 г, 10,91 моль) и тионилхлорид (5,37 л, 75,8 моль).
Реакционную смесь нагревают до 68°С (выделение газа) и затем перемешивают при 60°С в течение ночи, после чего анализ с помощью ЖХ указывает на окончание реакции. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме, получают 3,2 кг материала, количество которого указывает на присутствие тионил-хлорида (выход 100%=2,88 кг). Смесь концентрируют из толуола (2x3 л), чтобы удалить все следы тионилхлорида. Получено суммарное количество хлорангидрида 3370 г, причем избыточный выход объясняется наличием толуола.
В колбу объемом 20 л с атмосферой азота добавляют 2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этанамин (890 г, 5,45 моль) и ДХМ (3,5 л). После этого добавляют 8%-ный водный раствор NаНСО3 (9л). Затем к смеси добавляют хлорангидрид (1373 г активного компонента, 4,89 моль), поддерживая при этом температуру ниже 25°С (экзотерма и выделение газа). Смесь перемешивают 30 минут, после чего данные ЖХ указывают на окончание реакции. Органическую часть отделяют и промывают 1М НС1 (4,5 л) и 8%-ным водным рас- 19 027782 твором NаНСΟз (4,5 л), затем сушат, фильтруют и концентрируют в вакууме, получают суммарно 1956 г соединения подзаголовка (выход 95%) . Данные 'Н ЯМР указывают на чистоту продукта >95%.
(ίί) 3-Амино-5-бром^-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид.
Продукт со стадии (ί) (1 кг, 2,56 моль) растворяют в ТГФ (3,5 л) и АсОН (500 мл) и гидрируют при давлении Н2 3 МПа (30 бар) при температуре до 60°С с использованием 5% Ρί/С (30 г, тип ίΜ 18 МА, 55% воды). Данные анализа через 5 ч показывают соотношение 1:1 для ΑτΝΗΟΗ и ΑτΝΗ2. Реакция завершается после выдерживания в течение ночи, причем данные 1Н ЯМР показывают присутствие 3% побочного продукта без брома. Катализатор отфильтровывают, затем остаток разбавляют этилацетатом (3 л) и промывают 20%-ным раствором карбоната калия (3,5 л). Органическую часть затем сушат, фильтруют и концентрируют в вакууме, получают остаток, который затем суспендируют в 5 объемах диэтилового эфира в течение ночи, чтобы уменьшить количество образцов без атома брома (<2% после суспендирования). Получают соединение подзаголовка с выходом 90% с чистотой 86% (по данным ЖХ).
(ίίί) 3-Амино^-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)-5-((триизопропилсилил)этинил)бензамид.
В колбу объемом 10 л в атмосфере азота добавляют продукт со стадии (ίί) (700 г, 1,93 моль) и ТГФ (5,59 л). После этого добавляют Си! (19,2 г, 0,1 моль), триэтиламин (1,29 л, 9,27 моль) и этинилтриизопропилсилан (389 г, 2,13 моль). Реакционную смесь обезгаживают и продувают азотом три раза. Добавляют Ρύ(ΡΡ1ι3,)4 (125,5 г, 0,198 моль) и реакционную смесь обезгаживают и продувают азотом. Реакционную смесь нагревают при 65°С в течение ночи, после чего данные ЖХ указывают на 91% продукта и <1% исходного материала. Реакционную смесь концентрируют в вакууме, затем остаток забирают в этилацетат (2 л) и пропускают через слой диоксида кремния (2 кг), элюируя дополнительным количеством этилацетата (30 л). Содержащие продукт фракции концентрируют в вакууме, затем сырой продукт растворяют в ТВМЕ (5л) и экстрагируют 6н. НС1 (5л). Фазу водной НС1 промывают ТВМЕ (2x5 л), затем подщелачивают 6 н. раствором №ЮН до рН 9-10. Продукт затем экстрагируют ТВМЕ (2x5 л), органические фазы сушат, фильтруют и концентрируют в вакууме, получают 635 г соединения подзаголовка с чистотой >95% (данные 1Н ЯМР, исключая растворители).
(ίν) 3 -Амино-5 -этинил-^(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид.
К продукту со стадии (ίίί) (1200 г, 2,59 моль) в ΜеСN (8,8 л) добавляют СзР (433,6 г, 2,85 моль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, после чего данные ВЭЖХ показывают 1,7% продукта, 97,4% исходного материала. Загружают дополнительное количество СзР (420 г, 2,76 моль) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, после чего данные ВЭЖХ показывают 91,0% продукта, 4,4% исходного материала. Смесь фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме, получают материал, который содержит 92,5% продукта, 0,7% исходного материала (данные ВЭЖХ). Остаток растворяют в ДХМ (3 л) и ЕЮАс (3 л), затем делят на две равные порции. Каждую порцию пропускают через слой диоксида кремния (1,6 кг), элюируя ЕЮАс (50 л). Фильтраты объединяют и концентрируют в вакууме. Сырой материал промывают гептаном (2x4 л) для удаления силильных примесей. Выделяют суммарно 719 г соединения подзаголовка (83% (по данным 1Н ЯМР), выход активного компонента 75%, 597 г).
(ν) трет-Бутил-(4-((2-((3-этинил-5-((2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)карбамоил)фенил)амино) пиримидин-4-ил)окси)нафталин-1-ил)карбамат.
В атмосфере Ν2 загружают продукт со стадии (ίν) (301,2 г, 250,0 г активного компонента, 0,816 моль), трет-бутил-(4-((2-хлорпиримидин-4-ил)окси)нафталин-1-ил)карбамат (см. выше, например, Йо, К. е1 а1. , що 2010/067130, 17 июня 2010; 252,8 г, 0,680 моль), п-ТСК-Н2О (24,7 г, 0,130 моль) и ТГФ (7600 мл). Темно-красный раствор нагревают при кипении с обратным холодильником 6 ч, затем охлаждают до комнатной температуры, после чего данные ВЭЖХ указывают на 0,25% продукта стадии (ίν), 22,24% продукта стадии (νί), 8,98% хлорпиримидинового исходного материала и 64,08% продукта со стадии (ν). Загружают дополнительное количество продукта со стадии (ίν) (27,1 г, 22,5 г активного компонента, 73,4 ммоль), реакционную смесь снова нагревают до кипения с обратным холодильником и кипятят в течение ночи, данные ВЭЖХ в дальнейшем указывают на 0,20% продукта со стадии (ίν), 30,23% продукта со стадии (νί), 4,50% исходного хлорпиримидина и 58,61% продукта со стадии (ν).
Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и гасят реакцию с помощью 20%-ного раствора К2СО3 (735 мл), затем слои разделяют, затем органический слой промывают насыщенным рассолом (880 мл). Органический слой сушат над Μ§δΟ4, фильтруют и концентрируют, выделяют коричневое липкое твердое вещество. Выход=491,2 г (93,8%). Данные ВЭЖХ дают 30,59% продукта стадии (VI) и 59,50% продукта стадии (ν), и данные спектров 1Н ЯМР подтверждают структуру.
(νί) 3-((4-((4-Аминонафталин-1-ил)окси)пиримидин-2-ил)амино)-5-этинил-^(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид.
В атмосфере Ν2 загружают смесь сырых продуктов со стадии (ν) (491,2 г) и ДХМ (3700 мл). По каплям добавляют ТФУК (695 мл, 12,3 эквивалента), при этом температуру поддерживают ниже 20°С. Темно-коричневый раствор перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, после чего данные ВЭЖХ указывают на 86,90% продукта стадии (νί) и 0,94% продукта стадии (ν). Смесь концентрируют и остаток забирают в ЕЮАс (3700 мл), затем промывают насыщенным водным раствором NаΗСΟз (2x2000
- 20 027782 мл), пока не будет достигнуто значение рН 7-8. Органический слой сушат над М§§04, фильтруют и концентрируют, выделяют фиолетовое твердое вещество. Выход = 360,8 г. Чистота 78,58% (данные ВЭЖХ). (νίί) 5-трет-Бутил-2-метокси-3-нитроанилин В атмосфере Ν2 загружают 4-трет-бутил-2,6-динитроанизол (620 г, 2,439 моль), 1М8 (4774 мл) и 10% Рб/С (31,8 г). Реакционную смесь нагревают до кипения с обратным холодильником (78°С) и по каплям в течение 4,5 ч добавляют 4-метил-1-циклогексен (500 мл, 4,159 моль). Реакционную смесь перемешивают при кипении с обратным холодильником в течение ночи, после чего данные ВЭЖХ указывают на 72,13% продукта и 27,17% исходного материала. Дополнительное количество 4-метил-1-циклогексена (160 мл, 1,331 моль) добавляют по каплям в течение 3 ч и реакционную смесь перемешивают при кипении с обратным холодильником 72 ч. Данные ВЭЖХ указывают на 92,72% продукта и 0% исходного материала. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, катализатор удаляют посредством вакуумного фильтрования и промывают 1М8 (500 мл). Растворители концентрируют приблизительно до 1200 мл, получают соотношение 1:4,45 продукта к этанолу (целевое 1:5). К остатку загружают по каплям 2М НС1 (124 мл), поддерживая при этом температуру ниже 23°С. Загружают воду (3100 мл) и полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре 1,5 часа. Твердое вещество отфильтровывают посредством вакуумного фильтрования и промывают водой (2x1000 мл). Полученные оранжевые иголочки сушат в вакууме при 40°С в течение ночи. Выход = 475,2 г (86,9%). Чистота >97% (данные спектров 1Н ЯМР). Чистота 98,8% (данные ВЭЖХ). КР 0,36%.
(νίίί) Ν- (5-трет-Бутил-2-метокси-3-нитрофенил)метансульфонамид.
В атмосфере Ν2 загружают продукт стадии (νίί) (471 г, 2,099 моль), толуол (1880 мл) и пиридин (471 мл), затем по каплям в течение 1 ч добавляют метансульфонилхлорид (179 мл), поддерживая температуру ниже 35°С. Реакционную смесь перемешивают при 30-35°С в течение ночи, затем охлаждают до температуры ниже 20°С, загружают воду (1880 мл) и 2М НС1 (1880 мл) (до рН 3). Слои разделяют и органическую фазу промывают 2,5%-ным рассолом (1880 мл). Гептан (3760 мл) добавляют к органическому слою в течение 0,5 ч, чтобы выделить осадок. Смесь охлаждают до 0°С и перемешивают 1 ч. Твердое вещество отфильтровывают вакуумным фильтрование и промывают гептаном (1880 мл), затем сушат в вакууме при 40°С в течение ночи. Выход=551 г (87%). Чистота по данным ВЭЖХ 98,5%. Чистота по данным 1Н ЯМР >97%.
(ίχ) №(3-Амино-5-трет-бутил-2-метоксифенил)метансульфонамид.
В аппарат гидрирования объемом 5 л загружают продукт со стадии (νίίί) (209,4 г, 0,693 моль), метанол (1675 мл, 8 объемов) и 10% Рб/С (10,2 г). Аппарат продувают 3χΝ2 и 3хН2 и затем перемешивают при давлении Н2 0,3447 МПа (50 фунт/кв.дюйм) до тех пор, пока больше не будет наблюдаться экзотерма, причем данные ВЭЖХ указывают 96,35% продукта и 1,10% исходного материала. Реакционную смесь разбавляют ТГФ (314 мл) и катализатор удаляют посредством вакуумного фильтрования (фильтр Сипо), затем промывают ТГФ (1000 мл). Растворители концентрируют, выделяют светло-коричневое твердое вещество, которое сушат в вакууме при 40°С в течение ночи. Выход=167,0 г (88,5%). Чистота по данным ВЭЖХ 96,7%. Чистота по данным 'Н ЯМР >95%.
(х) Фенил-Х-[5-трет-бутил-3-(метансульфонамидо)-2-метоксифенил]карбамат.
В атмосфере Ν2 загружают продукт со стадии (ίχ) (167,0 г, 613 ммоль), Ν;·ιΗί.Ό3, (77,3 г, 920 ммоль), ТГФ (870 мл) и ДХМ (1440 мл). По каплям добавляют фенилхлорформиат (82,6 мл, 659 ммоль), при этом температуру поддерживают ниже 20°С, и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 4 ч. Данные ВЭЖХ реакционной смеси указывают на 98,6% продукта и 0,03% исходного материала. Реакционную смесь фильтруют и осадок на фильтре промывают ТГФ (~50 мл). Фильтрат концентрируют до ~900 мл и добавляют циклогексан (2400 мл), затем смесь перемешивают в течение ночи. Полученное твердое вещество отфильтровывают посредством вакуумного фильтрования и промывают циклогексаном (500 мл). Полученное светло-розовое твердое вещество сушат в вакууме при 40°С в течение 4 ч. Выход=232,6 г (96,7%). По данным ВЭЖХ чистота 94,5%. Чистота по данным 1Н ЯМР >95%.
(χί) 3-((4-((4-(3-(5-(трет-Бутил)-2-метокси-3-(метилсульфонамидо)фенил)уреидо)нафталин-1-ил)окси)пиримидин-2-ил)амино)-5-этинил-Х-(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид.
В атмосфере Ν2 загружают продукт стадии (νί) (175,5 г, 0,324 моль), продукт стадии (х) (145,0 г, 0,369 ммоль) и 1Рг0Ас (8800 мл). Полученный раствор нагревают до 60°С и в одну порцию загружают ΝΕΐ3 (9,3 мл), затем смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, после чего данные ВЭЖХ указывают на 25,77% продукта стадии (νί), 3,60% продукта стадии (X) и 57,85% продукта стадии (χί). Загружают дополнительное количество продукта стадии (х) (36,0 г, 0,092 моль), затем реакционную смесь перемешивают при 60°С в течение ночи, после чего данные ВЭЖХ указывают на 5,47% продукта стадии (νί), 3,72% продукта стадии (х) и 73,33% продукта стадии (χί). Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, затем концентрируют, выделяют темно-фиолетовое твердое вещество (522,9 г). Это твердое вещество перекристаллизовывают из ацетонитрила (2615 мл, 5 объемов), затем отфильтровывают посредством вакуумного фильтрования и промывают 1Рг0Ас (2x500 мл). Полученное розовое твердое вещество сушат в вакууме при 40°С в течение ночи, получают 181,1 г (66,5%) названного соединения с чистотой (данные ВЭЖХ) 99,27%. Данные спектров 1Н ЯМР подтверждают структуру.
- 21 027782
Биологические испытания: экспериментальные методы Оценка связывания фермента (Кшошекеап)
Активность связывания с ферментом киназ соединений, раскрытых в изобретении, может быть определена с использованием запатентованного метода оценки, который измеряет направленное на активный сайт конкурентное связывание с иммобилизованным лигандом (РаЫап, М.А. е! а1., Ыа!иге Вю!есНпо1., 2005, 23:329-336). Такие оценки могут быть проведены с помощью ЭРсотегХ (раньше АтЫ!; 8ап 01едо. СА). Процент ингибирования, достигнутый за счет инкубации с испытуемым соединением, может быть рассчитан относительно неингибированного контроля.
Оценка ингибирования фермента
Фермент-ингибирующую активность соединений, раскрытых в изобретении, определяют с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции (РПЭФ (РНЕТ)) с использованием синтетических пептидов, меченых как донором, так и акцептором флуорофоров (Ζ-6ΥΤΕ, ЫтЦгодеп Ь!б., Ра1к1еу, υΚ).
Ингибирование фермента р38 МАРКа.
Для определения ингибирования р38 МАРКа могут быть использованы следующие две разновидности метода оценки.
Метод 1.
Ингибирующую активность испытуемых соединений в отношении изоформы р38 МАРКа (МАРК14: ЫЧйодеп) оценивают опосредованно путем определения уровня активации/ фосфорилирования нисходящей молекулы МАРКАР-К2. Белок р38 МАРКа (80 нг/мл, 2,5 мкл) смешивают с испытуемым соединением (2,5 мкл из раствора или 4 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,04 мкг/мл или 0,004 мкг/мл) в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем добавляют раствор смеси (2,5 мкл) р38а неактивной мишени МАРКАР-К2 (^Игодеп, 600 нг/мл) и пептида РПЭФ (8 мкМ; мишень фосфорилирования для МАРКАРК2), и затем реакцию киназы инициируют путем добавления АТФ (АТР) (40 мкМ, 2,5 мкл). Смесь инкубируют 1 час при комнатной температуре. Проявляющий реагент (протеаза, 5 мкл) добавляют за 1 ч до детектирования в флуоресцентном считывающем устройстве для микропланшета (Уатюккап® Р1акН, ТНегтоР1кНег 8сгеп!тНс).
Метод 2.
Этот метод повторяет те же стадии, что и в описанном выше методе 1, но использует более высокую концентрацию белка р38 МАРКа (2,5 мкл из 200 нг/мл белка вместо 2,5 мкл из 80 нг/мл белка) для смешения с испытуемым соединением (испытываемом или при 1 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,01 мг/мл или 0,001 мг/мл).
Ингибирование фермента р38 МАРКу.
Ингибирующую активность соединений изобретения относительно р38МАР1<у (МАР1<12: ПцЦгодеп) оценивают способом, аналогичным описанному выше. Фермент (800 нг/мл, 2,5 мкл) инкубируют с испытуемым соединением (2,5 мкл из или 4 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,04 мкг/мл или 0,004 мкг/мл) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляют пептиды РПЭФ (8 мкМ, 2,5 мкл) и соответствующий раствор АТФ (2,5 мкл, 400 мкМ) к смесям ферменты/соединение и все инкубируют 1 ч. Проявляющий реагент (протеаза, 5 мкл) добавляют за 1 час до детектирования в флуоресцентном считывающем устройстве для микропланшета (Уапоккап® Р1акН, ТНегто 8с1епИйс).
Ингибирование фермента с-8гс и 8ук.
Ингибирующую активность соединений изобретения относительно ферментов с-8гс и 8ук (КцЧгодеп) оценивают способом, аналогичным описанному выше. Соответствующий фермент (3000 нг/мл или 2000 нг/мл соответственно, 2,5 мкл) инкубируют с испытуемым соединением (или 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,01 мкг/мл или 0,001 мкг/мл, 2,5 мкл каждого) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляют пептиды РПЭФ (8 мкМ, 2,5 мкл) и соответствующие растворы АТФ (2,5 мкл, 800 мкМ в случае с8гс и 60 мкМ АТФ в случае 8ук) к смесям ферменты/соединение и смесь инкубируют 1 ч. Проявляющий реагент (протеаза, 5 мкл) добавляют за 1 час до детектирования в флуоресцентном считывающем устройстве для микропланшета (Уапоккап® Р1акН, ТНегтоИкНег 8с1епййс).
Ингибирование фермента Ο8Κ 3 а.
Для определения ингибирования Ο8Κ 3 а могут быть использованы два следующих варианта метода оценки.
Метод 1.
Ингибирующую активность соединений изобретения относительно изоформы фермента Ο8Κ 3 а (^йгодеп) оценивают путем определения уровня активации/фосфорилирования пептида-мишени. Белок Ο8Κ3-α (500 нг/мл, 2,5 мкл) смешивают с испытуемым соединением (2,5 мкл при или 4 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,04 мкг/мл, или 0,004 мкг/мл) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляют пептид РПЭФ (8 мкМ, 2,5 мкл), который фосфорилирует мишень для Ο8Κ3α, и АТФ (40 мкМ, 2,5 мкл) к смеси фермент/соединение и полученную смесь инкубируют 1 ч. Проявляющий реагент (протеаза, 5 мкл) добавляют в течение 1 ч перед детектированием в флуоресцентном считывающем устройстве для микропланшета (Уапоккап® Р1акН, ТНегтоР1кНег 8с1епййс).
Во всех случаях сайт-специфическая протеаза расщепляет только нефосфорилированный пепид и
- 22 027782 устраняет сигнал РПЭФ. Уровни фосфоририлирования каждой реакции рассчитывают, используя соотношение эмиссии кумарина (донор) по сравнению с эмиссией флуоресцеина (акцептор), для которого высокие соотношения указывают на высокие уровни фосфорилирования, а низкие соотношения указывают на низкие уровни фосфорилирования. Процент ингибирования каждой реакции рассчитывают относительно неингибированного контроля и концентрацию 50%-ного ингибирования (значение 1С50) затем рассчитывают из кривой концентрация-отклик.
Метод 2.
Этот метод повторяет те же стадии, что и описанный выше метод 1, но используют более короткий период смешения испытуемого соединения (105 мин вместо 2 ч) с белком С8К3-а. Кроме того, используют концентрации испытуемого соединения или 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл или 0,01 мкг/мл.
Клеточный анализ
Соединения изобретения изучены с использованием одного или нескольких из приведенных ниже методов оценки.
(a) Ингибирование р38 МАРКа и Ьск в клетках 1игка!.
Перед проведением опыта Т-клетки 1игка! выращивают в обедненной среде (КРМ1 1640+5% ФБС) в течение 24 ч. Клетки собирают и ресуспендируют при концентрации 10х106 клеток/мл в обедненной среде и затем высевают в круглодонных 96-лучночных планшетах при концентрации 1х106 клеток/лунка. Последовательные разведения испытуемого соединения (конечная концентрация ДМСО 1%) добавляют за 2 часа перед стимуляцией. После предварительной инкубации с испытуемым соединением клетки стимулируют с помощью Н2О2 (0,05%, конечная концентрация) в течение 5 мин. Реакцию останавливают центрифугированием при 2000 об/мин (3 мин, 4°С), затем удаляют надосадочную жидкость и добавляют 100 мкл холодного раствора йх/регт (ΒΌ Ρίχ/Регт набор #554714). Планшеты инкубируют 20 минут при 4°С, затем центрифугируют и промывают дополненной 1х средой для отмывки клеток (ΒΌ Ρίχ/Регт набор #554714). Клетки окрашивают или для фосфо-р38а (Т180/182), поставляемого Се11 81дпаШп§ ТесЬпо1оду (92118), или для фосфо-Ьск (Υ394), поставляемого Κ&Ό (ΜΑΒ7500). Антитела разбавляют до 5 мкг/мл (Κ&Ό) или 1:200 (Се11 §1дпаШп§ ТесЬпо1оду) в среде для отмывки клеток, затем инкубируют 1 час при 4°С в темноте. После 3 повторных промывок охлажденным льдом промывочным буфером добавляют вторичное антитело (анти-кроличье Р1ТС-меченое #Ρ1362 или анти-мышиное Р1ТС-меченое #Ρ2883, оба от §1§та) при разбавлении 1:1000 и инкубируют 1 ч при 4°С в темноте. Клетки промывают 3 раза в холодном промывочном буфере, затем следует конечная промывка в холодном ФСБ, ресуспендируют в 150 мкл холодного ФСБ. Клетки анализируют проточной цитометрией с использованием ΒΌ Ассип С6.
(аа) ЛПС-индуцированное высвобождение Т>а/!1-8 В клетках 6-И937.
Клетки И937, человеческая моноцитарная клеточная линия, дифференцируют до клеток макрофагального типа путем инкубации с форболмиристацетатом (ФМА (РМА); 100 нг/мл) в течение от 48 до 72 ч. Клетки предварительно инкубируют с конечными концентрациями испытуемого соединения в течение 2 ч и затем стимулируют с помощью 0,1 мкг/мл ЛПС (из Е. Сой: 0111:В4, §1§та) в течение 4 ч. Собирают надосадочную жидкость для определения концентраций ТОТа и 1Ь-8 с помощью ЕЬ1§А сэндвич-типа (Оио-8е!, Κ&Ό 8у8!ет8). Ингибирование продуцирования ТОТа рассчитывают в виде процента от продуцирования, достигаемого с помощью 10 мкг/мл ΒΙΚΒ796, при каждой концентрации испытуемого соединения при сравнении относительно контроля растворителем. Относительную 50%-ную эффективную концентрацию (КЕС50) определяют из полученной кривой концентрация-отклик. Ингибирование продуцирования 1Ь-8 рассчитывают при каждой концентрации испытуемого соединения при сравнении с контролем растворителем. Определяют 50%-ную ингибирующую концентрацию (1С50) из полученной кривой концентрация-отклик.
(b) ЛПС-индуцированное высвобождение Т>а/Ь-8 в клетках МКПК (РВМС).
Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК (РВМС)) из здоровых субъектов отделяют от цельной крови с использованием градиента плотностей (ЬутрЬоргер, Ах18-8Ые1б Неаййсаге). МКПК высевают в 96-луночных планшетах и обрабатывают соединениями при желаемой концентрации в течение двух часов перед добавлением 1 нг/мл ЛПС (ЬР§) (ЕхсЬепсЫа Сой 0111:В4 от §1§та А1бпсЬ) на 24 ч при нормальных условиях культивирования ткани (37°С, 5% СО2). Надосадочную жидкость собирают для определения концентраций 1Ь-8 и ТОТа с помощью ЕЫ8А сэндвич-типа (Оио-8е!, Κ&Ό 8у8!ет8) и считывают на флуоресцентном считывающем устройстве для микропланшета (Уайо8кап® Р1а8Й, ТЬегтоР18Йег §с1епййс). Концентрацию при 50%-ном ингибировании (1С50) продуцирования 1Ь-8 и ТОТа рассчитывают из кривой доза-отклик.
(c) Высвобождение 1Ь-2 и ΙΡΝ-гамма в СО3/СП28-стимулированных клетках МКПК.
МКПК из здоровых субъектов отделяют от цельной крови с использованием градиента плотностей (ЬутрЬоргер, Ах18-8Ые1б НеаЬЬсаге). Клетки добавляют в 96-луночный планшет, предварительно покрытый смесью моноклональных антител СЭ3/СЭ28 (0,3 мкг/мл еΒ^08С^еηсе и 3 мкг/мл ΒΌ РЬагтшдеп, соответственно). Затем соединение в желаемой концентрации добавляют в лунки и планшет оставляют на 3 дня при нормальных условиях культивирования тканей. Надосадочные жидкости собирают и высвобождение 1Ь-2 и ΙΡΝ-гамма определяют с помощью ЕЫ8А сэндвич-типа (Оио-8е!, Κ&Ό 8у8!ет). Значение
- 23 027782
Ш50 определяют из кривой доза-отклик.
(ά) Ш-1 β-индуцированное высвобождение Ш-8 в клетках НТ29.
Клетки НТ29, клеточная линия аденокарциномы толстой кишки человека, помещают в 96-луночный планшет (24 ч) и предварительно обрабатывают соединениями при желаемой концентрации в течение 2 ч перед добавлением 5 нг/мл [Ц-1 β (АЬеат) на 24 ч. Надосадочные жидкости собирают для количественной оценки Ш-8 с помощью ЕЫ8А сэндвич-типа (Эно-ке!, Κ&Ό 8ук!ет). Значение Ш50 определяют из кривой доза-отклик.
(е) ЛПС-индуцированное высвобождение [Ц-8 и ΤΝΡα в главных макрофагах.
МКПК из здоровых субъектов отделяют от цельной крови с использованием градиента плотностей (ЬутрЬортер, Ах1к-8Ые1б НеаДЬсате). Клетки инкубируют в течение 2 ч и неадгезивные клетки удаляют промывкой. Для дифференциации клеток к макрофагам клетки инкубируют с 5 нг/мл ГМКСФ (СМ-С8Р) (Рерго1есЬ) в течение 7 дней при нормальных условиях культивирования тканей. Затем к клеткам добавляют соединения при желаемой концентрации для 2-часовой предварительной обработки перед стимуляцией с помощью 10 нг/мл ЛПС (ЬР8) в течение 24 ч. Надосадочные жидкости собирают и определяют высвобождение Ш-8 и ΤΝΡα с помощью ЕЫ8А сэндвич-типа (Эно-ке!, К&И 8ук!ет). Значение Ш50 определяют из кривой доза-отклик.
(ί) Ро1у РС-индуцированная экспрессия ШАМ-1 в клетках ВЕА82В.
Ро1у РС используют в этом исследовании в качестве простого миметика РНК вируса. Смесь (Ро1у РС)/олигофектамин (1 мкг/мл Ро1у РС±2% олигофектамина, 25 мкл; ПиАодеп Ыб., 8ап 01едо, СА, и !ηνί1годеп, Саг1кЬаб, СА, соответственно) трансфецируют в клетки ВЕА82В (клетки бронхиального эпителия человека, АТСС). Клетки предварительно инкубируют при конечных концентрациях испытуемого соединения в течение 2 ч и уровень экспрессии ШАМ-1 на поверхности клеток определяют с помощью ЕЫ8А на клеточной основе. При временной точке 18 ч после трансфекции ро1у РС клетки фиксируют 4%-ным формальдегидом в ФСБ и затем эндогенную пероксидазу гасят путем добавления промывочного буфера (100 мкл, 0,05% Туееп в ФСБ: ФСБ-Туееп), содержащего 0,1% азида натрия и 1% пероксида водорода. Клетки отмывают промывочным буфером (3x200 мкл) и после блокировки лунок с помощью 5% молока в ФСБ-Туееп (100 мкл) в течение 1 ч, клетки инкубируют с анти-человеческим ШАМ-1 антителом (50 мкл; Се11 81дпаШпд ТесЬпо1оду, Оапуегк, МА) в 1% БСА ФСБ в течение ночи при 4°С.
Клетки промывают с помощью ФСБ-Туееп (3x200 мкл) и инкубируют со вторичным антителом (100 мкл; НКР-конъюгированное анти-кроличье ЦС, Эако Ыб., С1ок1гнр, Иептатк). Затем клетки инкубируют с субстратом (50 мкл) в течение 2-20 мин, после чего добавляют стоп-реагент (50 мкл, 1н. Η28Ο4). Сигнал ШАМ-1 обнаруживают путем считывания поглощения при 450 нм относительно опорной длины волны 655 нм с использованием спектрофотометра. Затем клетки промывают ФСБ-Туееп (3x200 мкл) и суммарное число клеток в каждой лунке определяют путем считывания поглощения при 595 нм после окрашивания кристаллическим фиолетовым (50 мкл 2%-ного раствора в ФСБ) и элюирования 1%ным раствором ДСН (8Ό8) (100 мкл) в дистиллированной воде. Измеренные показания ОП (ΟΌ) 450-655 корректируют по числу клеток путем деления на показание ОП595 в каждой лунке. Ингибирование экспрессии ШАМ-1 рассчитывают при каждой концентрации испытуемого соединения при сравнении с контролем растворителем. Значение 50%-ной ингибирующей концентрации ^С50) определяют из полученной кривой концентрация-отклик.
(д) Оценка митоза клеток.
Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК (РВМС)) из здорового субъекта отделяют от цельной крови (ЦшпШек, Ьопбоп, ИК) с использованием градиента плотности (Н1к1орацне®-1077, 81дта-А1бтюЬ, Роо1е, ИК). МКПК (3 миллиона клеток на образец) последовательно обрабатывают 2% ФГА (РНА) (фитогемагглютинин, 81дта-А1бтюЬ, Роо1е, ИК) в течение 48 ч, затем 20-ти часовым воздействием переменных концентраций испытуемых соединений. За 2 ч до сбора МКПК обрабатывают демеколцином (0,1 мкг/мл; Пубгодеп, Ра1к1еу, ИК), чтобы остановить клетки в метафазе. Для наблюдения митоза клеток МКПК пермеабилизируют и фиксируют путем добавления БИгаргер (50 мкл; Весктап СоиДет, Ргапсе), и окрашивают с помощью анти-фосфо-гистона 3 (0,26 нг/л; #9701; Се11 81дпа11шд, Иапуегк, МА) и пропидиум иодида (1 мг/мл; 81дта-А1бтюД Роо1е, ИК), как ранее описано в публикации МиеЬ1Ьаиег Р.А. и 8сЬи1ег М.Р, МШайоп КекеагсЬ, 2003, 537:117-130. Флуоресценцию оценивают с использованием проточного цитометра АТТИ№) Д^Дтодеп, Ра1к1еу, ИК) с селекцией лимфоцитов. Процент ингибирования митоза рассчитывают для каждой обработки относительно обработки растворителем (0,5% ДМСО).
(Ь) Индуцированные риновирусом высвобождение Ш-8 и экспрессия ШАМ-1.
Риновирус человека КУ16 получают из Американской коллекции типовых культур (!Ье Атепсап Туре СиДите СоДесДоп, Мапаккак, УА). Исходные растворы вируса получают путем инфицирования клеток НеЬа с помощью ЧРВ (НКУ) до тех пор, пока 80% клеток не будут цитопатическими.
Клетки ВЕА82В инфицируют ЧРВ при множественности заражения (М3 ^ΟΣ)) 5 и инкубируют 2 часа при 33 °С с мягким встряхиваем для стимуляции поглощения. Затем клетки промывают ФСБ, добавляют свежую среду и клетки инкубируют еще 72 ч. Надосадочную жидкость собирают для оценки кон- 24 027782 центраций 1Ь-8 с использованием набора для проявления Эиоке! ЕЫ8Л (Κ&Ό куЛепъ. МтпеароУ. ΜΝ).
Уровень 1САМ-1-экспрессирующей клеточной поверхности определяют с помощью ЕЬ18Л на клеточной основе. Через 72 ч после инфицирования клетки фиксируют с помощью 4%-ного формальдегида в ФСБ. После гашения эндогенной пероксидазы путем добавления 0,1% азида натрия и 1% пероксида водорода, лунки отмывают промывочным буфером (0,05% Т\уееп в ФСБ: ФСБ-Т\уееп). После блокировки лунки 5% молоком в ФСБ-Т\уееп в течение 1 ч клетки инкубируют с анти-человеческим 1САМ-1 антителом в 5% БСА ФСБ-Туееп (1:500) в течение ночи. Лунки промывают ФСБ-Туееп и инкубируют со вторичным антителом (НКР-конъюгированное антикроличье 1§С, Эако Ыб.). Сигнал 1САМ-1 обнаруживают путем добавления субстрата и считывания поглощения при 450 нм с опорной длиной волны 655 нм с использованием спектрофотометра. Затем клетки промывают ФСБ-Туееп и суммарное число клеток в каждой лунке определяют путем считывания поглощения при 595 нм после окрашивания кристаллическим фиолетовым (50 мкл 2%-ного раствора в ФСБ) и элюирования 1%-ным раствором ДСН (8Ό8). Измеренные показания ОП450-655 корректируют по числу клеток путем деления на показание ОП595 в каждой лунке. Соединения добавляют за 2 ч до инфицирования ЧРВ и через 2 ч после инфицирования, когда неинфицированные ЧРВ клетки отмывают.
(ί) Оценка НКУ16-индуцированного цитопатического эффекта (ЦПЭ (СРЕ)) в клетках МКС5.
Клетки МКС5 инфицируют НКУ16 при МЗ 1 в среде ИМЕМ, содержащей 5% ФТС (РС8) и 1,5 мМ МдС12, после чего инкубируют 1 час при 33°С, чтобы стимулировать поглощение. Надосадочные жидкости отсасывают, затем добавляют свежую среду, после чего инкубируют 4 дня. При необходимости клетки предварительно инкубируют с соединением или с ДМСО в течение 2 ч, и соединения и ДМСО добавляют снова после отмывания вируса.
Надосадочные жидкости отсасывают и инкубируют с раствором метиленового синего (100 мкл, 2% формальдегида, 10% метанола и 0,175% метиленового синего) в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки в каждую лунку добавляют 1% ДСН в дистиллированной воде (100 мкл) и планшеты легко встряхивают 1-2 ч перед считыванием поглощения при 660 нм. Рассчитывают процент ингибирования для каждой лунки. Значения 1С50 рассчитывают из кривой концентрация-отклик, полученной за счет последовательных разбавлений испытуемых соединений.
(ί) 1п νίΙΐΌ вирусная нагрузка РСВ в первичных клетках бронхиалвного эндотелия.
Нормальные клетки бронхиального эндотелия человека (ΝΉΒΕΟ), выращенные в 96-луночных планшетах, инфицируют К8У Л2 (Штамм А2, НРА, ЗаЬкЬигу, ИК) при МЗ 0,001 в смеси (среда ЬНС8):КРМ1-1640 (50:50), содержащей 15 мМ хлорида магния, и инкубируют 1 час при 37°С для поглощения. Клетки промывают ФСБ (3x200 мкл), затем добавляют свежую среду (200 мкл) и инкубацию продолжают 4 дня. При необходимости клетки предварительно инкубируют с соединением или с ДМСО в течение 2 ч и затем добавляют снова после отмывки вируса.
Клетки фиксируют с помощью 4%-ного формальдегида в растворе ФСБ (50 мкл) в течение 20 мин, промывают ПБ (^В) (3x200 мкл) (промывочный буфер, ФСБ, содержащий 0,5% БСА и 0,05% Туееп-20) и инкубируют с раствором для блокировки (5% концентрированное молоко в ФСБ) 1 ч. Клетки затем промывают ПБ (3x200 мкл) и инкубируют 1 ч при комнатной температуре с анти-К8У (2Р7) антителом к Р-гибридному белку (40 мкл; мышиное моноклональное, партия 798760, Са1. №.аЬ43812, ЛЬеат) в 5% БСА в ФСБ-Туееп. После промывки клетки инкубируют с раствором НКР-конъюгированного вторичного антитела (50 мкл) в 5% БСА в ФСБ-Туееп (партия 00053170, Сак№. Р0447, Иако) и затем добавляют ТМБ (ТМВ) субстрат (50 мкл; упаковка субстратного реагента, партия 269472, Сак №. ΌΥ999, Κ&Ό 8ук(епъ, 1пс.). Эту реакцию останавливают добавлением 2н. Н28О4 (50 мкл) и полученный сигнал определяют калориметрически (ОП: 450 нм с опорной длиной волны 655 нм) в считывающем устройстве для микропланшета (Уагюккап® Р1а§Ь, ТЬегтоР18Ьег 8с1епбйс).
Затем клетки промывают и применяют 2,5% раствор кристаллического фиолетового (50 мкл; партия 8656, Сак №. РБ7000, Рго-ЬаЬ Ихадпокбск) в течение 30 мин. После промывки с помощью ПБ, в каждую лунку добавляют 1% раствор ДСН в дистиллированной воде (100 мкл), и планшеты легко встряхивают в течение 1 ч перед считыванием поглощения при 595 нм. Измеренные показания ОП450-655 корректируют к числу клеток путем деления значений ОП450-655 на значения ОП595. Рассчитывают процент ингибирования для каждой лунки и значение 1С50 рассчитывают из кривой концентрация-отклик, полученной из последовательных разбавлений соединения.
(к) Анализ жизнеспособности клеток: МТТ-тест.
Дифференцированные клетки И937 предварительно инкубируют с каждым испытуемым соединением (конечная концентрация 1 мкг/мл или 10 мкг/мл в 200 мкл среды, представленной ниже) по двум протоколам: первый - 4 ч в 5% ФТС среда КРМ11640, и второй -в 10% ФТС среда КРМ11640 в течение 24 ч. Надосадочную жидкость заменяют новой средой (200 мкл) и в каждую лунку добавляют исходный раствор МТТ (10 мкл, 5 мг/мл). После инкубации в течение 1 ч среду удаляют, в каждую лунку добавляют ДМСО (200 мкл) и планшеты легко встряхивают в течение 1 ч перед считыванием поглощения при 550 нм. Процент потери жизнеспособности клеток рассчитывают для каждой лунки относительно обработки растворителем (0,5% ДМСО). Таким образом, наблюдаемое повышение жизнеспособности клеток
- 25 027782 в случае обработки лекарством относительно растворителя приведено в таблице в виде отрицательного процента.
(1) Анализ биопсии человека.
Биопсию слизистой оболочки кишечника получают из воспаленных областей толстой кишки у больных ВЗК (ГВИ). Материал биопсии разрезают на мелкие кусочки (2-3 мм) и помещают на стальные решетки в камере для культуры органов при 37°С в атмосфере 5% СО2/95% О2 в бессывороточной среде. К ткани добавляют ДМСО-контроль или испытуемые соединения при целевых концентрациях и инкубируют 24 ч в камере для культуры органов. Собирают надосадочную жидкость для определения уровней Ш-6, Ш-8, !Ю-1 β и ΤΝΒα с помощью К&И ΕΟδΆ. Процент ингибирования высвобождения цитокина испытуемыми соединениями рассчитывают относительно высвобождения цитокина, определенного для ДМСО-контроля (100%).
(т) Накопление β-катенина в клетках Й-И937.
Клетки И937, человеческая моноцитарная клеточная линия, дифференцируют в клетки макрофагального типа путем инкубации с ФМА (РМА) (100 нг/мл) в течение от 48 до 72 ч. Затем клетки инкубируют или с конечными концентрациями испытуемого соединения или с растворителем в течение 18 ч. Индукцию β-катенина испытуемыми соединениями останавливают путем замены среды 4%-ным раствором формальдегида. Активность эндогенной пероксидазы нейтрализуют путем инкубации с гасящим буфером (100 мкл, 0,1% азида натрия, 1% Н2О2 в ФСБ с 0,05% Т\уееп-20) в течение 20 мин. Клетки промывают промывочным буфером (200 мкл; ФСБ, содержащий 0,05% Т\уееп-20) и инкубируют с блокирующим раствором (200 мкл; 5% молока в ФСБ) в течение 1 ч, повторно промывают промывочным буфером (200 мкл) и затем инкубируют в течение ночи с раствором анти-в-катенин антитела (50 мкл) в 1% БСА/ФСБ (ВИ, Ох&гй, ϋΚ).
После промывки промывочным буфером (3x200 мкл; ФСБ, содержащий 0,05% Тетееп-20) клетки инкубируют с раствором НКР-конъюгированного вторичного антитела (100 мкл) в 1% БСА/ФСБ (Иако, СатЬййде, ИК) и получаемый сигнал определяют калориметрически (ОП: 450 нм с опорной длиной волны 655 нм) с использованием ТМБ субстрата (50 мкл; К&И §ук!етк, ЛЬшдйоп, ИК). Эту реакцию останавливают добавлением 1н. раствора Н2§О4 (50 мкл). Затем клетки промывают промывочным буфером и применяют в течение 30 мин 2%-ный раствор кристаллического фиолетового (50 мкл). После промывки промывочным буфером (3x200 мкл) в каждую лунку добавляют 1% раствор ДСН (100 мкл) и планшеты легко встряхивают в течение 1 часа перед измерением поглощения при 595 нм Аапоккап®® Р1акЬ, ТЬегто-ИкЬег §с1епййс).
Измеренные показания ОП450-655 корректируют по числу клеток путем деления значений ОП450-655 на значения ОП595. Процент индукции для каждой лунки рассчитывают относительно растворителя, и отношение индукции нормализуют при сравнении с индукцией, произведенной с помощью стандартного контроля, содержащего справочное соединение ^(4-(4-(3-(3-трет-бутил-1-п-толил-1Н-пиразол-5-ил) уреидо)нафталин-1-илокси)пиридин-2-ил)-2-метокси-ацетат (1 мкг/мл), которую принимают в качестве единицы.
(п) Пролиферация Т-клеток.
МКПК из здоровых субъектов отделяют от цельной крови с использованием градиента плотности (ЪутрЬоргер, Лх1к-8Пе1й НеаИЬсаге). Фракцию лимфоцитов вначале обогащают СИ4+ Т-клетками путем магнитной сортировки клеток согласно инструкциям производителя (Мй1епу1 Вю1ес 130-091-155). Необученные СИ4+ Т-клетки затем отделяют с применением позитивного магнитного отбора СИ45КЛ+ клеток с использованием микробусин согласно инструкциям производителя (130-045-901). Клетки размещают из расчета 2х105 клеток на лунку в 100 мкл среды КРМ!/10% ФБС на 96-луночном плоскодонном планшете (Согшпд Сок!аг). Разбавляют 25 мкл испытуемого соединения до соответствующей концентрации (8х конечная концентрация) в нормальной среде и добавляют в дублирующие лунки на планшете, чтобы получить интервал доза-ответ от 0,03 до 250 нг/мл. Добавляют ДМСО в качестве негативного контроля. Планшеты предварительно инкубируют в течение 2 ч перед стимуляцией с помощью 1 мкг/мл анти-СИ3 (ОКТ3; еВюкаепсе). Через 72 ч среду в каждой лунке заменяют 150 мкл свежей среды, содержащей 10 мкМ БДУ (ВгйИ) (КосЬе). Через 16 ч надосадочную жидкость удаляют, планшет сушат и клетки фиксируют путем добавления в каждую клетку 100 мкл фиксирующего/денатурирующего раствора в течение 20 мин согласно инструкциям производителя (КосЬе). Планшеты промывают один раз с помощью ФСБ перед добавлением анти-Вгйи детекторного антитела и инкубируют 90 мин при комнатной температуре. Планшеты затем осторожно промывают 3 раза промывочным буфером, поддерживают и проявляют добавлением 100 мкл раствора субстрата. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл 1М раствора Н2§О4 и считывают поглощение при 450 нм на считывающем устройстве для планшетов Аапоккап® Р1акЬ, ТЬегтоИкЬег §с1епййс). Значение !С50 определяют из кривой доза-отклик.
(о) Высвобождение Ш-2 и ΓΕΝγ в СИ3/СИ28-стимулированных клетках МКСП от болвных ВЗК.
Мононуклеарные клетки собственной пластинки (МКСП (ЬРМС)) выделяют и очищают из воспаленной слизистой оболочки хирургических препаратов ВЗК или из нормальной слизистой оболочки хирургических препаратов следующим образом.
- 26 027782
Слизистую оболочку удаляют из более глубоких слоев хирургических препаратов с помощью скальпеля и разрезают на фрагменты размерами 3-4 мм. Эпителий удаляют промывкой тканевых фрагментов три раза с помощью 1 мМ ЭДТУК (ЕЭТА) (Ыдта-АИпск Роо1е, ИК) в ΗΒδδ (Ыдта-АИпск) при перемешивании с использованием магнитной мешалки, отбрасывая надосадочную жидкость после каждой промывки. Затем образец обрабатывают коллагеназой типа 1А (1 мг/мл; δ^дта-Α1ά^^ск) в течение 1 ч с перемешиванием при 37°С. Полученную клеточную суспензию затем фильтруют с использованием 100 мкм клеточного сита, промывают дважды, ресуспендируют в среде ΚΡΜΙ-1640 (Ыдта-АИпску содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, и используют для клеточной культуры.
Свежевыделенные МКСП (2х105 клетки/лунка) стимулируют с помощью 1 мкг/мл α-ί'.Ό3/(/.-ί'.Ό28 в течение 48 ч в присутствии или ДМСО-контроля или соответствующих концентраций соединения.
Через 48 ч надосадочную жидкость удаляют и оценивают на присутствие ΊΝΡα и ΙΡΝγ с помощью Κ&Ό ЕЬКА. Процент ингибирования высвобождения цитокинов испытуемыми соединениями рассчитывают относительно высвобождения цитокинов, определенного для ДМСО-контроля (100%).
(р) Ингибирование высвобождения цитокинов из миофибробластов, выделенных из болвных ВЗК.
Миофибробласты из воспаленной при ВЗК слизистой оболочки выделяют следующим образом.
Слизистую оболочку рассекают и снимают, образцы слизистой оболочки размерами 1 мм культивируют при 37°С во влажном СО2 инкубаторе в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ОМЕМ, δ^дта-Α1ά^^ск) с добавкой 20% ФБС, 1% неосновных аминокислот Дпуйгодеп, Ρа^δ1еу, ИК), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 50 мкг/мл гентамицина и 1 мкг/мл амфотерицина (δίβίικιА1Фгск). Сформировавшиеся колонии миофибробластов высевают в 25-см2 колбы для культур и культивируют в среде ЭМЕМ, дополненной 20% ФБС и антибиотиками, по меньшей мере, до переноса 4, чтобы обеспечить достаточное количество для использования в опытах по стимуляции.
Субконфлюэнтные монослои миофибробластов, посеянных в 12-луночных планшетах при концентрации 3х105 клеток на лунку, обедняют в бессывороточной среде в течение 24 ч при 37°С, 5% СО2, перед культивированием в течение 24 ч в присутствии или ДМСО-контроля или соответствующих концентраций соединения. Через 24 ч надосадочную жидкость удаляют и оценивают на присутствие ΙΡ-8 и ΙΕ-6 с помощью Κ&Ό ЕЬКА. Процент ингибирования высвобожденных цитокинов испытуемыми соединениями рассчитывают относительно высвобожденных цитокинов, определенных для ДМСО-контроля (100%).
(ц) Дегрануляция нейтрофилов человека.
Нейтрофилы выделяют из периферической крови человека следующим образом.
Кровь собирают венопункцией и предупреждают от свертывания путем добавления смеси (1:1) ЭДТУК: (стерильный фосфатно-солевой буфер) (ФСБ, без Са+/Мд+). Добавляют декстран (3% мас./об.) (1 часть раствора декстрана к 4 частям крови), и крови дают стоять приблизительно 20 минут при комнатной температуре. Надосадочную жидкость осторожно расслаивают по градиенту плотности (Ьутркоргер, А.^А1йе1б Неакксаге) и центрифугируют (15 мин, 2000 об/мин, без торможения). Надосадочную жидкость отсасывают и клеточные пеллеты ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе (0,2%) в течение не более чем 60 с (чтобы лизировать загрязняющие эритроциты). Затем добавляют 10-кратный объем ФСБ и клетки центрифугируют (5 мин, 1200 об/мин). Клетки ресуспендируют в ΗΒδδ+ (сбалансированный солевой раствор Хэнка (без фенолового красного), содержащий цитохалазин В (5 мкг/мл) и 1 мМ СаС12, до достижения концентрации 5х 106 клеток/мл.
В каждую лунку 96-луночного планшета с ν-образным дном добавляют 5х104 клеток и инкубируют (30 мин, 37°С) с соответствующей концентрацией испытуемого соединения (0,3-1000 нг/мл) или с растворителем (ДМСО, конечная концентрация 0,5%). Дегрануляцию стимулируют добавлением ФМЛФ (£МЬР) (конечная концентрация 1 мкМ). После дополнительной инкубации (30 мин, 37°С) клетки удаляют центрифугированием (5 минут, 1500 об/мин) и надосадочную жидкость переносят в плоскодонный 96-луночный планшет. Добавляют равный объем тетраметилбензидина (ТМБ (ТМВ)), через 10 мин реакцию останавливают добавлением равного объема серной кислоты (0,5 М) и считывают поглощение при 450 нм (фон при 655 нм вычитают). Значение 50%-ной ингибирующей концентрации (ΙίΈ0) определяют из полученной кривой концентрация-отклик.
(г) Оценка клеточной цитотоксичности.
Клетки ТК6, 5х104, (линия лимфобластных Т-клеток) добавляют к соответствующему числу лунок 96-луночного планшета в 195 мкл среды (ИРМЕ дополненная 10% фетальной телячьей сыворотки). В лунки добавляют 5 мкл ДМСО-контроля (конечная концентрация 0,5% об./об.) или испытуемого соединения (конечная концентрация или 5 или 1 мкг/мл) и инкубируют при 37°С, 5% СО2.
Через 24 ч планшет центрифугируют при 1300 об/мин в течение 3 мин и надосадочную жидкость отбрасывают. Затем клетки ресуспендируют в 7,5 мкг/мл пропидиум иодида (ПИ (Р^) в ФСБ. Через 15 мин клетки анализируют с помощью проточного цитометра (ΒΌ ассшг). Процент жизнеспособности рассчитывают в виде % клеток, которые являются ПИ негативными в тестовых лунках, нормализованных к ДМСО-контролю.
- 27 027782
Скрининг Ιη νίνο: фармакодинамика и противовоспалительная активность (ί) ЛПС-индуцированное накопление нейтрофилов в мышах.
Не голодавших мышей Ва1Ь/с дозируют путем интратрахеального способа введения или растворителем, или испытуемым соединением в указанное время (в пределах интервала 2-8 ч) перед стимуляцией воспалительной реакции за счет применения провокации ЛПС. При Т=0 мышей помещают в затравочную камеру и подвергают воздействию ЛПС (7,0 мл, раствор 0,5 мг/мл в ФСБ) в течение 30 мин. Еще через 8 ч животных анестезируют, их трахеи канюлируют и ЖБАЛ (ВАЬР) извлекают путем вливания, а затем выводят из их легких 1,0 мл ФСБ через трахеальный катетер. Подсчет всех и отдельных лейкоцитов в образцах ЖБАЛ измеряют с использованием гемоцитометра Нейбауэра. Цитоспиновые клеточные мазки образцов ЖБАЛ готовят центрифугированием при 200 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре и окрашивают с использованием окрашивающей системы Дифф-Квик (БгйОшк) (ОаПе ВеЬппд). Клетки считают с использованием масляно-иммерсионной микроскопии. Данные по числу нейтрофилов в БАЛ (ВАЬ) представляют в виде среднего значения ±8.Е.М. (стандартная ошибка среднего). Процент ингибирования накопления нейтрофилов рассчитывают для каждой обработки относительно обработки контролем.
(ίί) Модель сигаретного дыма.
Мышей АЛ (самцы, возраст 5 недель) подвергают воздействию сигаретного дыма (4%-ный сигаретный дым, разбавленный воздухом) в течение 30 мин в день в течение 11 дней с использованием экспериментальной системы вдыхания табачного дыма (ТоЬассо 8токе !пЬа1а11оп ЕхрептеШ 8уЧет) для небольших животных (МоПе1 8Т8-С8; 81Ьа1а 8с1епбйс ТесЬпо1оду, Токуо, .Гараи). Испытуемые вещества вводят интраназально (35 мкл раствора в 50% ДМСО/ФСБ) один раз в день в течение 3 дней после финального воздействия сигаретным дымом. Через 12 ч после последнего дозирования каждое из животных анестезируют, трахеи канюлируют и собирают жидкость бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ (ВАЬР)). Число альвеолярных макрофагов и нейтрофилов определяют с помощью РАС8 анализа (ЕРГС8® АЬТКА II, Весктап СоиИет, Гис.. Ри11ет1оп, СА, И8А) с использованием антимышиного МОМА2 антитела (макрофаг) или антимышиного 7/4 антитела (нейтрофил).
(ш) И88-индуцированные колиты у мышей.
Не голодавших, 10-12-недельного возраста, самцов мышей ВИР1 дозируют с помощью орального желудочного зонда дважды в день или растворителем, или справочным веществом (5-А8А), или испытуемым соединением за один день до (день - 1) стимуляции воспалительной реакции путем обработки декстрансульфатом натрия (Ό88). На 0 день исследования Ό88 (5% масс./об.) вводят в питьевой воде, затем следует дозирование дважды в день растворителем (5 мл/кг), справочным веществом (100 мг/кг) или испытуемым соединением (5 мг/кг) в течение 7 дней. Питьевую воду с Ό88 пополняют каждые 3 дня. Во время исследования животных взвешивают каждый день, проводят наблюдения за калом и результаты записывают в виде балов, исходя из консистенции кала. На время умерщвления на день +6 толстый кишечник извлекают и записывают длину и массу. Участки прямой кишки отбирают или для анализа миелопероксидазы (МПО (МРО)), чтобы определить нейтрофильную инфильтрацию, или для выставления баллов гистопатологии для определения тяжести заболевания.
(ίν) ТНБС-индуцированный колит у мышей.
Не голодавших, 10-12-недельного возраста, самцов мышей ВИР1 дозируют с помощью орального желудочного зонда дважды в день или растворителем (5 мл/кг), или справочным веществом (будесонид, 2,5 мг/кг), или испытуемым соединением (1 или 5 мг/кг) за один день до (Иау - 1) стимуляции воспалительной реакции путем обработки 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ТНБС (ТИВ8)) (15 мг/мл в смеси 50% этанол/50% физиологический раствор). На день 0 исследования ТНБС (200 мкл) вводят внутрь толстой кишки через пластиковый катетер с дозированием дважды в день растворителем, справочным веществом или испытуемым соединением, которое продолжается в течение 2 или 4 дней. Во время исследования животных взвешивают каждый день, проводят наблюдения за калом и результаты записывают в виде балов, исходя из консистенции кала. На время умерщвления толстый кишечник извлекают и записывают длину и массу. Участки прямой кишки отбирают для выставления баллов гистопатологии, чтобы определить тяжесть заболевания.
(ν) Адоптивный перенос у мышей.
На день исследования 0 самок мышей Ва1Ь/С умерщвляют и получают селезенки для выделения клеток СИ45КБЬ18Ь (с использованием протокола разделения клеток 8ί'.ΊΝ ГВЭ (ТКИН ВЗК)). Затем приблизительно 4х105 клеток/мл клеток 0045^111211 впрыскивают интраперитонеально (100 мкл/мышь) в самок животных с ТКИН. На 14 день мышей взвешивают и случайным образом распределяют на обрабатываемые группы на основе массы тела. На 14 день соединения вводят дважды в день через оральный желудочный зонд в растворителе, арахисовом масле, при уровнях доз, приведенных ниже в таблицах 6а и 6Ь, и при объеме дозы 5 мл/кг. Обработку продолжают до 42 дня исследования, и на этом этапе животных вскрывают через 4 часа после утреннего введения. Записывают длину и массу толстой кишки и используют как вторичную конечную точку исследования в качестве критерия эдемы толстой кишки. Толстую кишку затем делят на шесть поперечных срезов, четыре из которых используют для бальной оцен- 28 027782 ки гистопатологии (основная конечная точка) и два гомогенизируют для проведения оценки цитокинов. Показанные результаты представляют собой % ингибирования окна индукции между не использовавшимися в опытах животными и животными, обрабатываемыми растворителем, где более высокое ингибирование означает приближение к не болеющему, не подвергавшемуся обработке фенотипу.
(νί) Индуцированный эндотоксином увеит у крыс Самцов крыс Ье\У15 (возраст 6-8 недель, Сйайез КУег ИК Ышйеф содержат в клетках по 3 при 19-21°С с 12-ти часовым циклом свет/темнота (07:00/19:00), кормят стандартной пищей для грызунов и дают воду без ограничения. Не голодавших крыс взвешивают, по отдельности идентифицируют на хвосте с помощью несмываемого маркера и проводят однократное интравитреальное введение в правое стекловидное тело (объем дозы 5 мкл) из расчета 100 нг/животное ЛПС (ЕзсйепсЫа сой 0111:В4, приготовленный в ФСБ, §1§та АИпск ИК) с использованием иглы калибра 32. Необработанным крысам впрыскивают ФСБ. Испытуемое соединение, дексаметазон (Иех) или носитель (20% гидроксипропил-в-циклодекстрина, 0,1% ГПМЦ (НРМС), 0,01% бензалконийхлорида, 0,05% ЭДТУК, 0,7% №С1 в деионизированной воде) вводят локально на правый глаз (10 мкл) животного за 30 мин до введения ЛПС, во время введения ЛПС и через 1, 2 и 4 ч после введения ЛПС. Перед введением раствор или суспензию, которые должны быть введены, перемешивают 5 минут, чтобы гарантировать однородность суспензии. Через 6 часов после введения дозы ЛПС животных подвергают эвтаназии с помощью сверхдозы пентабарбитона (в/в.). После эвтаназии правый глаз каждого животного вытаскивают и рассекают на фронтальный (передний) и тыльный (задний) участки вокруг линз. Каждый участок взвешивают и гомогенизируют в 500 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера после чего центрифугируют 20 мин при 12000 об/мин при 4°С. Полученную надосадочную жидкость делят на 3 аликвоты и хранят при -80°С до последующего анализа цитокинов с помощью К&И Иио8е! ЕЫ8А.
Обобщение результатов скрининга Ιη Уйго и Ιη νΐνο
Таблица 1а. Константа диссоциации для выбранных киназ, определенная с помощью ЬеабНиПег Иксотег 8е1Уюе5 (ИксотеКх Согрогайоп, Ггетоп!, СА) с использованием технологии КГИОМЕзсап™
Испытуемый препарат Константа диссоциации (нМ)
Ьск р38 МАРКа Зук
Соединение 1 4,1 9 21
Исследования, проведенные с помощью ЬеабНийсг Иксотег 8ег\'1сез (ИксотеК.х Согрогайоп, Ггетоп!, СА) с использованием технологии КГИОМЕзсап™, показывают, что соединение примеров (соединение I) не оказывает никакого существенного влияния на связывание киназ В-КаГ и В-КаГ (У600Е) с их стандартными лигандами. Более того, это соединение показывает существенно улучшенную селективность по сравнению со справочным соединением ^(4-(4-(3-(3-трет-бутил-1-п-толил-1Н-пиразол-5ил)уреидо)нафталин-1-илокси)пиридин-2-ил)-2-метоксиацетамидом (\УО 2010/112936), о чем свидетельствуют более низкие показатели селективности (Табл. 1Ъ).
Таблица 1Ъ. Показатели селективности в соответствии с Ктпоте8сап при 50 и 500 нМ;
8(35) = (число немутантных киназ с % от контроля <35)/(число испытанных немутантных киназ);
8(10) = (число немутантных киназ с % от контроля <10)/(число испытанных немутантных киназ);
8(1) = (число немутантных киназ с % от контроля <1)/(число испытанных немутантных киназ).
Соедин. Показатель селективности К1поте5сап/число поражений отдельных киназ
50 нМ 500 нМ
3(35) 3(10) 3(1) 3 (35) 3(10) 3 (1)
Справоч-
ное 0,174/ 0,083/ 0,018/ 0, 370/ 0,272/ 0,117/
соеди- нение 67 32 7 143 105 45
Соеди- 0,068/ 0,023/ 0,000/ 0, 197/ 0,129/ 0,038/
нение 1 27 9 0 78 51 15
Таблица 1с. Результаты оценки ш т11го ингибирования р38 МАРКа (метод 2), с-8гс, 8ук и О8К3а (МеШой 2)
Испытуемое соединение Значения для ингибирования фермента (нМ)
р38 МАРКа с-5гс Зук С5КЗа
Соединение 1 224 24 591 411
- 29 027782
Таблица 1б. Данные оценок фосфопотока, характеризующие ингибирование клеточных р38 МАРКа и Ьск
Испытуемый препарат Значения 1Сзо (нг/мл)
фосфо-р38 МАРКа фосфо-Ьск
Соединение 1 20 6
Таблица 2. Ингибирование высвобождения цитокинов в стимулированных клетках (описанные выше способы оценки (Ь), (с) и (б))
Испытуемый препарат Значения 1Сьо для ингибирования высвобождения цитокинов (НМ)
Клетки аиэз7 МКПК Клетки НТ29
1Ь-8 ΤΝΓα 1Ь-8 ТЫ Га 11,-2 ΙΓΝγ 11,-8
Соединение 1 - - 1,5 - 74,0 7,3 8, 0
Как показано ниже в табл. 3, соединение I также проверено при оценке на клетках, например, в описанной выше модели ех-νίνο биопсии человека, где оно проявило значительные противовоспалительные эффекты в биопсии от больных неспецифическим язвенным колитом (НЯК (ИС)). В отличие от здоровых добровольцев биопсии слизистой оболочки кишечника от больных НЯК, как показано, спонтанно высвобождают провоспалительные цитокины ίη νίίτο (Опкеп ЕЕ. е! а1., ί άίη Iттиηο1, 2008, 126(3): 345352). Таким образом, соединение I значительно ингибирует высвобождение цитокинов (4-1 β, 4-6 и 48) по сравнению с ДМСО-контролем при инкубации при концентрации 1 мкг/мл в течение 24 ч с биопсиями от больных неспецифическим язвенным колитом.
Таблица 3. Обобщенные результаты оценки с использованием биопсии слизистой оболочки кишечника из воспаленных областей толстой кишки различных больных, страдающих неспецифическим язвенным колитом (форма ВЗК)
Группа обработки Высвобождение цитокинов из биопсий больных НЯК
η Высвобождение 1Ь-1р η Высвобождение 1Ь-б п Высвобождение 1Ъ-3
Контроль ДМСО 100% 100% 100%
Соединение 1 (1 мкг/мл) 4 5±8 4 17±23 2 9±15
Как показано ниже в табл. 4а, соединение I является значительно менее активным, чем справочное соединение Щ-(4-(4-(3-(3-трет-бутил-1-п-толил-1Н-пиразол-5-ил)уреидо)нафталин-1-ил-окси)пиридин-2ил)-2-метоксиацетамид; АО 2010/112936), при описанном выше анализе (д), в котором измеряют воздействие на деление клеток (митоз) в МКПК.
Таблица 4а. Влияние соединения I на деление клеток в МКПК в сравнении со справочным соединением
Испытуемое соединение Ингибирование митоза, %, при 5 мг/мл
Справочное соединение 87, 8а
Соединение 1 20, 5
См., например, значение, указанное в публикации АО 2013/050757.
Как показано ниже в табл. 4Ь, соединение I не вызывает какой-либо значительной индукции βкатенина при изучении описанным выше способом оценки (т). Таким образом, потенциал этого соединения для повышения клеточных концентраций β-катенина, как установлено, является отрицательным в том, что индуктивный эффект при различных испытанных концентрациях существенно меньше, чем эффект, производимый справочным соединением при концентрации 1 мкг/мл.
- 30 027782
Таблица 4Ь. Влияние соединения I на индукцию β-катенина в сравнении со справочным соединением
Испытуемое соединение Индукция β-катенина, %
Концентрация испытуемого соединения
1 мкг/мл 5 мкг/мл 10 мкг/мл
Справочное соединение 100 НИ НИ
Соединение I 21 14 26
НИ - не испытано.
Как показано ниже в табл. 5, соединение I также проверено в описанном выше методе оценки ίη νίνо (ίν), который проводят в течение 2 дней и с использованием само-микроэмульгирующеся системы доставки лекарства (8ΜΕΌΌ8) в качестве носителя, содержащей определенную смесь кукурузного масла (32,5%), транскутола (20%), маизина (12,5%) и кремофора (сгеторбог 666) (35%). Анализ гистопатологии обнаруживает, что соединение I проявляет существенную активность в такой ίη νί\Ό модели воспаления толстой кишки. В частности, это соединение при дозировании перорально при 5 мг/кг демонстрирует заметное улучшение в выраженности язвы и регенерации эпителия в сравнении с контролем растворителем. Кроме того, оно продуцирует заметное уменьшение инфильтрата воспалительных клеток и зон собственного слоя.
Таблица 5. Влияние соединения I на ТНБС-индуцированный колит у мышей
Группа обработки ТНБС (ТЫБ5)
η Выраженность язвы Воспаление ЬР
Не болеющие 6 0,0±0,0 0, 2±0, 2
ТНБС + Носитель 24 4,4±0,4 4, 8±0, 4
ТНБС + Соединение I 12 3, б±0, 5 3, 5+0, 4
Как показано ниже в таблицах 6а и 6Ь, соединение I также проверено в описанном выше способе оценки ίη νί\Ό (адоптивный перенос) (ν). Анализ относительных соотношений массы к длине толстой кишки у необработанных, контрольных и обработанных животных в конце исследования показывает, что соединение I проявляет значительную активность в такой управляемой Т-клетками ίη νί\Ό модели воспаления толстой кишки.
Таблица 6а. Обобщенные результаты, полученные в мышиной модели адоптивного переноса
Группа обработки Доза Масса:длина толстой кишки Ингибирование %
Не обработанные Нет 0,022±0,001 100
Циклоспорин А 75 мг/кг 0,029±0,001 64
Контроль растворителем Нет 0,042±0,005 0
Соединение I 0,3 мг/кг 0,024±0,003 90
Таблица 6Ь. Другие обобщенные результаты дополнительного исследования на мышиной модели адоптивного переноса
Группа обработки п Масса:длина толстой кишки
Не болеющие 4 0,021±0,001
Контроль растворителем 12 0,047±0,004
Соединение I (3 мг/кг) 12 0,034±0,003
Соединение I (0,3 мг/кг) 12 0,041±0,005
Соединение I (0,03 мг/кг) 12 0,033±0,002
Как показано ниже в табл. 6с, соединение I также значительно снижает уровни провоспалительных цитокинов в образцах ткани толстой кишки из мышей в модели адоптивного переноса.
- 31 027782
Таблица 6с. Обобщенные данные измерения уровня цитокинов, полученные в мышиной модели адоптивного переноса
Не болеющие 4 1,3±0,6 7,9±0,9
Контроль растворителем 12 117,7+36,6 1064,9±239,6
Соединение I (3 мг/кг) 12 10,8±3,3 70,8±22,0
Обобщенные результаты дополнительных исследовании Определение фармакокинетических параметров
Исследования проведены §а1 ПГе §аепсе8 (ШщетаФ, Рипе, [пШа) для изучения фармакокинетики в плазме и общего распределения в ткани толстой кишки соединения I. В частности, фармакокинетические исследования проведены на:
самцах мышей С57ВЬ/6 после однократного перорального введения; и самцах крыс \У15(аг после однократного внутривенного или перорального введения.
Полученные данные показывают, что соединение I создает значительные концентрации в толстой кишке, тогда как содержание в плазме является очень низким или пренебрежимо низким.
Таблица 8а. Медианные концентрации в плазме (нг/мл), полученные после перорального введения соединения I мышам при 5 мг/кг
(32,5:20:12,5:35), само-микроэмультирующаяся система доставки лекарства (δΜΕΌΌδ).
Таблица 8Ь. Медианные суммарные концентрации в толстой кишке (мг/г), полученные после перорального введения соединения I мышам при 5 мг/кг (растворитель В тот же, что и в табл. 8а)
крысам при 0,25 мг/кг в 5% ДМСО, 7,5% δοϊνιΐοΐ Н§15 и 87,5% нормального физиологического раствора
Испытуемый препарат Со (нг/мл) Αυθι33ί (час*нг/ мл) АиСшг (час*нг/ мл) Τΐ/2 (час) С1 (мл/мин/ кг) ν33 (л/кг)
Соединение I 6536 869 871 0, 1 4, 8 0,03
Таблица 9Ь. Фармакокинетические данные, полученные после перорального введения соединения I крысам при 5 мг/кг
Испыту- емый препарат Раство- ритель Тщах (час) Стах (нг/мл) Аис1азЬ (час*нг/ мл) Аис1ИГ (час*нг/ мл) Гро. (%)
Соединение I в НР1*’ НР1*’ НР1*’ НР1*’ 0, 0
Примечание: растворитель В = как и в табл. 8а.
ί * 1 - не рассчитано (НР), так как в плазме соединение не обнаружено.
- 32 027782
Таблица 9с. Медианные концентрации в плазме (нг/мл), полученные после перорального введения различных соединений крысам при 5 мг/кг
Примечание: растворители В и С те же, что и в табл. 8а. Определение параметров ПДМВ (ΑΌΜΕ).
Оценка некоторых ίη νίίτο параметров ПДМВ (поглощение, распределение, метаболизм и выделение (ΑΌΜΕ)) для соединения I проведена ВюРосик (ЗаГГгоп Аа1беп, иК). Результаты указывают, что соединение I быстро выводится гепатоцитами человека и что оно имеет пониженную предрасположенность для зависящего от времени ингибирования цитохрома Р450.
Таблица 10. Данные испытаний на стабильность в гепатоцитах человека для соединения I
Испытуемый препарат Τΐ/2 (мин) Средний собственный клиренс (мкл/мин/миллион клеток) Средний печеночный коэффициент очищения
Соединение I 34 41 0,85
Таблица 11а. Обобщенные результаты исследований ингибирования СУР3А4 соединения I (представленные результаты являются средним арифметическим по двум опытам)
0 мин прединкубации 30 мин прединкубации
Испытуемый 1С50 15 мкМ, ς. 1С50 15 мкМ, £
препарат (мкМ) ингибирования (мкМ) ингибирования
Справочное соединение А >15 41 0,4 92
Соединение I >15 31 7,8 54
Примечание: справочное соединение А: 1-(4-((2-((7-метил-1Н-индазол-5-ил)амино)пиримидин-4ил)окси)нафталин-1-ил)-3-(3-(2-метилбут-3-ин-2-ил)-1-(п-толил)-1Н-пиразол-5-ил)мочевина (РуГе, Μ. С. Т., е! а1. АО 2014/033447).
Таблица 11Ь. Обобщенные результаты исследований ингибирования СУР2С9 соединения I (представленные результаты являются средним арифметическим по двум опытам)
0 мин преинкубации 30 ми: преинкубации
Испытуемый препарат 1С50 (мкМ) 15 мкМ, % инги биро в ани я 1С50 (мкМ) 15 мкМ, % ингибирования
Справочное соединение А >5 31й1 1, 4
Соединение I >15 21 >15 37
Примечание: справочное соединение А: как и в табл. 11а.
при 15 мкМ наблюдается осадок, поэтому указано ингибирование при 5 мкМ.
Исследования ингибирования йЕКО
Соединение I испытывают на ингибирование специфических калиевых каналов человека (йЕКО) с использованием метода электрофизиологии пэтч-кламп ФпАогкк™ при Еккеп Вюкиепсе (Ае1\\уп Оагбеп СИу, Епд1апб).
- 33 027782
Таблица 12. Результаты ингибирования ΗΕΚΟ для соединения I
Испытуемыи препарат 1С5с (мкМ) Ингибирование при 3 мкМ, %
Соединение I >3, 0 -12±4
Анализ метаболитов
Исследования проведены ВюРосик (8аЛЛгои Аа1йен. иК) для определения метаболизма соединения I после инкубации с крысой, яванской макакой (Суното1дик тасас|ие) или гепатоцитами человека.
Проводят отдельные инкубации (η=3) соединения I (начальная концентрация 10 мкМ) или ДМСОконтроля с криоконсервированными гепатоцитами из каждого вида (0,5 миллиона клеток/мл) при 37°С в течение 0, 60 и 90 мин перед остановкой реакций, и соединение экстрагируют ацетонитрилом. Перед проведением анализа копии образца объединяют.
Потенциальные метаболиты идентифицируют с использованием времяпролетного (ΤΟΡ) и тройного квадрупольного (ТО) масс-спектрометров.
Результаты показывают, что соединение I образует 9 метаболитов в гепатоцитах, 8 из которых являются результатом окисления полиэтиленгликолевой цепочки амидного остатка. Другой метаболит, наблюдаемый преимущественно в гепатоцитах яванской макаки, возникает через окисление на 5-(третбутил)-2-метокси-3-(метилсульфонамидо)фенильном фрагменте. Таким образом, не было отмечено никаких продуктов, которые могли бы быть связаны с метаболизмом при нафталиновом остатке, с явлением, которое приводит к гепатотоксичности, ассоциирующейся с р38а ингибитором ВШВ796 (Итано, 8., е1 а1., 1. Арр1. Тох1со1. 2011, 31, 671-677). Все метаболиты, идентифицированные при инкубации гепатоцитов человека, также обнаружены при инкубациях или в крысе, или с гепатоцитами яванской макаки.
Оценка мутагенности (Испытание на обратные мутации у бактерий)
Исследования проведены 8едиаш (ЬейЬиту, ^теЛо^кИте, ИК) с целью оценки соединения I по его способности вызывать мутации двух гистидин-зависимых ауксотрофных мутантов 8а1тоηе11а 1ур1ититшт, линии ТА98 и ТА100, ίη νίΙΐΌ.
Отбор мутаций проводят с использованием метода внесения в чашки как в присутствии, так и в отсутствие микса 8-9 (постмитохондриальная фракция печени, полученная из печени крыс, обработанных Агос1ог 1254). Бактерий подвергают воздействию испытуемого соединения, растворенного диметилсульфоксиде, и этот растворитель также используют в качестве негативного контроля. Уровни используемых доз составляют 0,32, 1,6, 8, 40, 200, 1000 или 5000 мкг/чашка.
Подвергаемые анализу уровни обработки испытуемого соединения ограничены от нерастворимости до 1000 мкг/чашка, так как при концентрации 5000 мкг/чашка наблюдают обильный осадок, мешающий выставлению бального показателя колониям. Осадок также отмечен в обеих линиях при концентрации 1000 мг/чашка в присутствии и в отсутствии микса 8-9.
Соединение I продуцирует не зависящее от дозы или статистически значимое повышение в ревертантных колониях в каждой линии 8а1тоηе11а 1урЫтитшт в присутствии или в отсутствие микса 8-9.
Изучение гидролитической стабильности
Химическую стабильность соединения I оценивают в смеси ДМСО и воды (3:1) при концентрации испытуемого соединения 1 мг/мл.
Общая методика ВЭЖХ.
АдПеШ, Аа1егк Х-8е1ес1 С18, 2,5 мкм, колонка 4,6x30 мм, 4-х минутный способ, 5-95% ΜеСN/вода (0,1%-ная муравьиная кислота).
Скорость потока 2,5 мл/мин.
Температура колоночного термостата 40°С.
Детектирование 254 нм.
Приготовление образца.
Образец испытуемого соединения (1,0 мг) растворяют в 750 мкл ДМСО. Медленно добавляют воду (250 мкл), обеспечивая отсутствие образования осадка.
Регистрация стабильности.
Аликвоту 50 мкл испытуемого раствора отбирают и анализируют в двух параллельных опытах путем ввода 5 мкл пробы ВЭЖХ. Записывают площадь пика для испытуемого соединения после ручного интегрирования соответствующих УФ-следовых количеств.
Испытуемый раствор нагревают при перемешивании при 60°С и отбирают аликвоту 50 мкл для анализа ВЭЖХ через временные точки 5 и 24 ч. Во всех случаях используют введение 5 мкл пробы и образцы анализируют в двух параллельных опытах.
Площади пиков для испытуемых соединений записывают при двух последовательных временных точках и рассчитывают % разложения из % изменения площади пика во времени.
Справочное соединение В (3-этинил-5-((4-((4-(3-(3-изопропил-1-(п-толил)-Ш-пиразол-5-ил)уреидо) нафталин-1-ил)-окси)пиримидин-2-ил)амино)-^(2-морфолиноэтил)бензамид) включают в каждое исследование стабильности в качестве контроля, чтобы подтвердить достоверность исследования. В отличие от соединений настоящего изобретения это справочное соединение подвергается значительному разложению при условиях опыта.
- 34 027782
Результаты исследования представлены ниже в таблице.
Сокращения
Ас ОН Ледяная уксусная кислота
ау водн. водный
5-АЗА 5-АСК 5-Аминосалицило в а я кислота
АТР АТФ Аденозин-5'-трифосфат
ВАЬЕ ЖВАЛ Жидкость бронхоальвеолярного лаважа
В1Э Дважды в сутки (два раза в день)
ΒΙΝΑΡ 2/2'-бис(дифенилфосфино)—1,1' — бинафтил- (бензотриазол-1-
ВОР илокси)трис(диметиламино)-фосфония
гексафторфосфат
Ьг уж. уширенный
в гаи ЕДУ 5-бром-2'-деоксиуредин
В5А БСА Бычий сывороточный альбумин
СаССагС® Каталитический картридж
СР1 кди 1,1-карбонилдиимидазол
СОРР ХОЗЛ хроническое обструктивное заболевание легких
а Д дублет
аьа дибензилиденацетон
рви дву 1,3-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен
РСС дцк дициклогексилкарбодиимид
РСМ ДХМ дихлорметан
ΡΙΑΡ ДИАД Диизопропилазодикарбоксилат
ΌΙΡΕΑ ДИПЭА диизопропилэтиламин
ΌΜΑΡ ДМАП 4-диметиламинопиридин
РМЕМ модифицированная по способу Дульбекко
среда Игла
ΌΜΕ ДМФА Ν,Ν-диметилформамид
ΌΜ3Ο ДМСО диметилсульфоксид
ΌΡΡΑ ДФФА дифенилфосфонилазид
а-и937 се11з Клетки иэз7 6- ФМА-дифференцированные клетки и-937
ЕРТА ЭДТУК Этилендиаминтетрауксусная кислота
ЕЫ5А Ферментный иммуносорбентный анализ
(Е3~) Ионизация электрораспылением.
отрицательная мода
(Е5+) Ионизация электрораспылением,
положительная мода
ЕС этил
Εί3Ν триэтиламин
ЕСОАс этилацетат
ЕСОН этанол
ГАС 5 Сортировка клеток с активацией флуореценцией
ЕВЗ ФБС фетальная бычья сыворотка
ЕСЗ ФТС Фетальная телячья сыворотка
РМЬР ФМЛФ формил-метионил-лейцил-фенилаланин
- 35 027782
Резонансный перенос энергии флуоресценции
Глюкоген-синтаза-киназа За первичные клетки бронхиального эндотелия человека сбалансированный солевой раствор Хэнка
Высокоэффективная жидкостная хроматография гидроксипропилметилцеллюлоза Час (часы)
2- (1Н-7-азабензотриазол-1-ил)1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат
1-гидрокси-7-азабензотриазол гидроксибензотриазол Пероксидаза хрена Человеческий риновирус Молекула межклеточной адгезии 1 интерферон-γ
Интерлейкин изопропилацетат с-^ип Ν-терминальная киназа Жидкостная хроматография Лимфоцит-специфичная протеинтирозинкиназа липополисахарид мультиплет
Протонированный молекулярный ион Митоген-активируемая
Митоген-активируемая протеинкиназаактивируемая протеинкиназой-2 мета-хлорнадбензойная кислота Метил ацетонитрил метанол мегагерц минута(ы)
Масс-медианный аэродинамический диаметр
Множественность заражения миелопероксидаза
3- (4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенил-тетразолийбромид Масс-спектрометрия Отношение заряда к массе Ν-метилпирролидон
Ядерный магнитный резонанс (спектроскопия)
Оптическая плотность
Мононуклеарные клетки периферической крови
Фосфатно-солевой буфер фенил фитогемагглютидин
Форболмиристатацетат
4- метилбензолсульфоновая кислота (лара-толуолсульфоновая кислота) (бензотриазол-1илокси)трипирролидинфосфония гексафторфосфат
Квартет
Комнатная температура
Обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография Обороты в минуту Розме11 Рагк Метог1а1 ФпзбИзибе Респираторно-синцитиальный вирус синглет насыщенный
- 36 027782
Тяжелая комбинированная
зсю ТКИН иммунонедостаточность
зсх Твердая катионообменная (смола)
3Ώ5 ДСН Додецилсульфат натрия
ЗмАг Нуклеофильное ароматическое замещение
Зук Тирозинкиназа селезенки
б т триплет
ТЗР 1-циклический ангидрид пропанфосфоновой кислоты
ТВАГ ТБАФ тетрабутиламмонийфторид
твшз трет-бутилдиметилсилил
ТС1Щ0 50%-ная инфицирующая доза культуры ткани
ТЕА ТЭА триэтиламин
ТНГ ТГФ тетрагидрофуран
ТЕА ТФУК Трифторуксусная кислота
тсгр Трансформирующий ростовой фактор бета
ΤΙΡ5 триизопропилсилил
ТМВ 3,3',5,5'-тетраметилбензилиден
ТМЗ-С1 триметилсилилхлорид
ΤΝΓα Фактор некроза опухолей альфа
Префиксы η-, 8-, ί-, ΐ- и 1ег1- имеют свои обычные значения: нормальный, вторичный, изо-, и третичный.

Claims (14)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ или его фармацевтически приемлемая соль, или его изотопное производное, которое является изотопно-обогащенным или меченным одним или несколькими атомами дейтерия.
  2. 2. Соединение по п.1, которое представляет собой 3-((4-((4-(3-(5-(трет-бутил)-2-метокси-3-(метилсульфонамидо)фенил)уреидо)нафталин-1-ил)окси)пиримидин-2-ил)амино)-5-этинил-^(2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил)бензамид.
  3. 3. Фармацевтический препарат, содержащий соединение по п.1, или его фармацевтически приемлемую соль, или изотопное производное, являющееся изотопно-обогащенным или меченным одним или несколькими атомами дейтерия, в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
  4. 4. Применение соединения по п.1, или его фармацевтически приемлемой соли, или его изотопного производного, которое является изотопно-обогащенным или меченным одним или несколькими атомами дейтерия, для лечения или предупреждения воспалительного заболевания.
  5. 5. Применение по п.4, где воспалительное заболевание выбирают из перечня, включающего кистозный фиброз, легочную гипертензию, саркоидоз легких, идиопатический легочный фиброз, ХОЗЛ (СОРЭ) (включая хронический бронхит и эмфизему), астму, детскую астму, атопический дерматит, аллергический дерматит, контактный дерматит или псориаз, аллергический ринит, ринит, синусит, конъюнктивит, аллергический конъюнктивит, сухой кератоконъюнктивит (сухость глаза), глаукому, диабетическую ринопатию, макулярный отек (включая диабетический макулярный отек), окклюзию центральной вены сетчатки (ОЦВС (СКУО)), сухую и/или влажную форму возрастной макулярной дегенерации (ВМД (АМЭ)), послеоперационное воспаление после удаления катаракты, увеит (включая задний, передний и панувеит), отторжение роговичного и лимбального трансплантата, глютензависимую энтеропатию (глютеновая болезнь), эозинофильный эзофагит, желудочно-кишечные проявления реакции трансплантат против хозяина, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит.
  6. 6. Применение по п.4 или 5, где воспалительным заболеванием является увеит, сухой кератоконъюнктивит (сухость глаз), болезнь Крона или неспецифический язвенный колит.
  7. 7. Применение соединения по п.1 или его фармацевтически приемлемой соли или его изотопного производного, которое является изотопно-обогащенным или меченным одним или несколькими атомами дейтерия, для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения воспалительного заболевания, определенного в любом из пп. 4-6.
    - 37 027782
  8. 8. Способ лечения или предупреждения воспалительного заболевания, определенного в любом из пп.4-6, включающий введение субъекту эффективного количества соединения по п.1 или его фармацевтически приемлемой соли или его изотопного производного, которое является изотопно-обогащенным или меченым одним или несколькими атомами дейтерия.
  9. 9. Способ получения соединения формулы I, включающий взаимодействие соединения формулы II с соединением формулы III где один из заместителей Ζ1 и Ζ2 представляет собой структурный фрагмент формулы IV и другой из заместителей Ζ1 и Ζ2 представляет собой структурный фрагмент формулы V
    На
  10. 10. Способ получения соединения формулы I, включающий взаимодействие соединения формулы где Ζ1 имеет значения, определенные в п.9, с подходящим азидобразующим агентом, с последующей без выделения термической перегруппировкой промежуточного ацилазида (формулы Х-С(О)-К3) с образованием ш кйи соединения формулы II ζ!.
    N=0=0 которое затем вводят в реакцию с соединением формулы III которое определено в п.9.
  11. 11. Способ получения соединения формулы I, включающий взаимодействие соединения формулы
    ПЬ где ЬО1 представляет собой уходящую группу и Ζ1 имеет значения, определенные в п.9, с соединением формулы III НХ 2 .Ν-Ζ2 III н которое определено в п.9.
  12. 12. Способ получения соединения формулы I, включающий взаимодействие соединения формулы VI где ЬО представляет собой уходящую группу, с соединением формулы VII
    - 38 027782
  13. 13. Способ получения соединения формулы Ι, включаюций взаимодействие соединения формулы
    УПа где К4 представляет собой Н или С1-3-алкильную группу, с соединением формулы УПЬ
    Н2ЩСН2СН2-О]2-СН2СН2-ОСН3 (УПЬ).
  14. 14. Способ по п.11, который включает взаимодействие соединения формулы ХУ где ЬС1 имеет значения, определенные в п.11. 15. Соединение формулы XV!
    где ЬС1 представляет собой имидазолил, хлор или арилокси.
EA201591907A 2013-04-02 2014-04-01 Ингибитор киназ EA027782B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB201305945A GB201305945D0 (en) 2013-04-02 2013-04-02 New compounds
GBGB1322678.2A GB201322678D0 (en) 2013-12-20 2013-12-20 New compounds
GB201402647A GB201402647D0 (en) 2014-02-14 2014-02-14 New compounds
PCT/GB2014/051018 WO2014162122A1 (en) 2013-04-02 2014-04-01 Kinase inhibitor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201591907A1 EA201591907A1 (ru) 2016-02-29
EA027782B1 true EA027782B1 (ru) 2017-08-31

Family

ID=50434228

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201591906A EA030483B1 (ru) 2013-04-02 2014-04-01 Производные мочевины, полезные в качестве ингибиторов киназы
EA201591907A EA027782B1 (ru) 2013-04-02 2014-04-01 Ингибитор киназ

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201591906A EA030483B1 (ru) 2013-04-02 2014-04-01 Производные мочевины, полезные в качестве ингибиторов киназы

Country Status (14)

Country Link
US (5) US8927563B2 (ru)
EP (2) EP2981526B1 (ru)
JP (2) JP6464384B2 (ru)
KR (3) KR102283883B1 (ru)
CN (2) CN105408315B (ru)
AU (2) AU2014246866B2 (ru)
BR (2) BR112015024671A2 (ru)
CA (1) CA2907663A1 (ru)
DK (2) DK2981535T3 (ru)
EA (2) EA030483B1 (ru)
ES (2) ES2904277T3 (ru)
MX (2) MX363949B (ru)
TW (1) TWI641592B (ru)
WO (2) WO2014162122A1 (ru)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008337286B2 (en) 2007-12-19 2014-08-07 Cancer Research Technology Limited Pyrido[2,3-b]pyrazine-8-substituted compounds and their use
EP2531502B1 (en) 2010-02-01 2014-04-02 Cancer Research Technology Limited 1-(5-tert-butyl-2-phenyl-2h-pyrazol-3-yl)-3-[2-fluoro-4-(1-methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1h-imidazo[4,5-b]pyridin-7-yloxy)-phenyl]-urea and related compounds and their use in therapy
EP2578582A1 (en) 2011-10-03 2013-04-10 Respivert Limited 1-Pyrazolyl-3-(4-((2-anilinopyrimidin-4-yl)oxy)napththalen-1-yl)ureas as p38 MAP kinase inhibitors
WO2013050757A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 Respivert Limited 1-pyrazolyl-3- (4- ( (2 -anilinopyrimidin- 4 - yl) oxy) napththalen- 1 - yl) ureas as p38 map kinase inhibitors
GB201214750D0 (en) 2012-08-17 2012-10-03 Respivert Ltd Compounds
US9783556B2 (en) 2012-08-29 2017-10-10 Respivert Limited Kinase inhibitors
EP2890460B1 (en) 2012-08-29 2017-02-22 Respivert Limited Kinase inhibitors
US20150225373A1 (en) 2012-08-29 2015-08-13 Respivert Limited Kinase inhibitors
US9732063B2 (en) 2012-11-16 2017-08-15 Respivert Limited Kinase inhibitors
EP2970190A1 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Respivert Limited Kinase inhibitors
TWI641592B (zh) * 2013-04-02 2018-11-21 英商瑞斯比維特有限公司 激酶抑制劑
EP2981534B1 (en) 2013-04-02 2017-07-19 Topivert Pharma Limited Kinase inhibitors based upon n-alkyl pyrazoles
GB201320729D0 (en) 2013-11-25 2014-01-08 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds and their use
GB201320732D0 (en) 2013-11-25 2014-01-08 Cancer Rec Tech Ltd Methods of chemical synthesis
AU2014369449B2 (en) 2013-12-20 2018-07-05 Oxular Acquisitions Limited Urea derivatives useful as kinase inhibitors
KR102413704B1 (ko) 2014-02-14 2022-06-24 레스피버트 리미티드 항염증성 화합물로서의 방향족 헤테로사이클릭 화합물
MA40774A (fr) 2014-10-01 2017-08-08 Respivert Ltd Dérivés de diaryle-urée en tant qu'inhibiteurs de kinase p38
WO2017108737A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Chiesi Farmaceutici S.P.A. 1-(3-tert-butyl-phenyl)-3-(4-([1,2,4]triazolo[4,3-a]pyridin-6-yloxy)-1,2,3,4-tetrahydro- naphthalen-1-yl)-urea derivatives and their use as p38 mapk inhibitors
BR112018067552A2 (pt) * 2016-04-06 2019-01-08 Topivert Pharma Ltd inibidores de cinase
US10342786B2 (en) 2017-10-05 2019-07-09 Fulcrum Therapeutics, Inc. P38 kinase inhibitors reduce DUX4 and downstream gene expression for the treatment of FSHD
WO2019071147A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Fulcrum Therapeutics, Inc. INHIBITORS OF KINASE P38 REDUCING EXPRESSION OF DUX4 GENE AND DOWNSTREAM GENES FOR THE TREATMENT OF FSHD
CN110878055B (zh) * 2018-09-06 2021-02-05 中国科学院化学研究所 一种制备羰基杂环类化合物的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004014870A1 (en) * 2002-08-08 2004-02-19 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Fluorinated phenyl-naphthalenyl-urea compounds as inhibitors of cytokines involved in inflammatory processes
WO2011158042A2 (en) * 2010-06-17 2011-12-22 Respivert Limited Methods

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998052558A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Bayer Corporation INHIBITION OF p38 KINASE ACTIVITY BY ARYL UREAS
JP2001521934A (ja) 1997-11-03 2001-11-13 ベーリンガー インゲルハイム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 抗炎症薬としての芳香族ヘテロ環式化合物
CA2359244C (en) 1999-01-13 2013-10-08 Bayer Corporation .omega.-carboxy aryl substituted diphenyl ureas as p38 kinase inhibitors
EP1140840B1 (en) 1999-01-13 2006-03-22 Bayer Pharmaceuticals Corp. -g(v)-carboxyaryl substituted diphenyl ureas as raf kinase inhibitors
UA73492C2 (en) 1999-01-19 2005-08-15 Aromatic heterocyclic compounds as antiinflammatory agents
WO2000055139A2 (en) 1999-03-12 2000-09-21 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic urea and related compounds useful as anti-inflammatory agents
ATE312823T1 (de) 1999-07-09 2005-12-15 Boehringer Ingelheim Pharma Verfahren zur herstellung heteroarylsubstituierter ureaverbindungen
US6492393B1 (en) 1999-11-16 2002-12-10 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as anti-inflammatory agents
US6525046B1 (en) 2000-01-18 2003-02-25 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Aromatic heterocyclic compounds as antiinflammatory agents
US6492529B1 (en) 2000-01-18 2002-12-10 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Bis pyrazole-1H-pyrazole intermediates and their synthesis
EP1381592A1 (en) * 2001-04-13 2004-01-21 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. 1,4-disubstituted benzo-fused compounds
CA2490819A1 (en) 2001-04-13 2002-10-24 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as anti-inflammatory agents
WO2002092576A1 (en) 2001-05-16 2002-11-21 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Diarylurea derivatives useful as anti-inflammatory agents
CA2448626A1 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Carbamate and oxamide compounds as inhibitors of cytokine production
DE60219793T2 (de) 2001-07-11 2008-01-24 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., Ridgefield Verfahren zur Behandlung von Cytokin-Vermittelten Erkrankungen
US20040023961A1 (en) 2002-02-11 2004-02-05 Bayer Corporation Aryl ureas with raf kinase and angiogenisis inhibiting activity
DK1478358T3 (da) 2002-02-11 2013-10-07 Bayer Healthcare Llc Sorafenibtosylat til behandling af sygdomme kendetegnet ved unormal angiogenese
EP1480973B1 (en) 2002-02-25 2008-02-13 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. 1,4-disubstituted benzofused cycloalkyl urea compounds useful in treating cytokine mediated diseases
AR037647A1 (es) 2002-05-29 2004-12-01 Novartis Ag Derivados de diarilurea utiles para el tratamiento de enfermedades dependientes de la cinasa de proteina
US20050014753A1 (en) 2003-04-04 2005-01-20 Irm Llc Novel compounds and compositions as protein kinase inhibitors
WO2004113352A1 (en) 2003-06-19 2004-12-29 Amedis Pharmaceuticals Ltd. Silylated heterocyclylurea derivatives as cytokine-inhibitors
CN1812975A (zh) 2003-06-30 2006-08-02 贝林格尔·英格海姆药物公司 制备二芳基脲化合物的方法
CN1838958A (zh) 2003-08-22 2006-09-27 贝林格尔·英格海姆药物公司 治疗慢性阻塞性肺病和肺动脉高血压的方法
SG146624A1 (en) 2003-09-11 2008-10-30 Kemia Inc Cytokine inhibitors
WO2005044825A1 (en) 2003-10-21 2005-05-19 Amedis Pharmaceuticals Ltd. Silicon compounds and their use
EP1689376A2 (en) 2003-11-28 2006-08-16 Novartis AG Diaryl urea derivatives in the treatment of protein kinase dependent diseases
US20060035893A1 (en) 2004-08-07 2006-02-16 Boehringer Ingelheim International Gmbh Pharmaceutical compositions for treatment of respiratory and gastrointestinal disorders
GB0423554D0 (en) 2004-10-22 2004-11-24 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds
TW200740820A (en) 2005-07-05 2007-11-01 Takeda Pharmaceuticals Co Fused heterocyclic derivatives and use thereof
AR056582A1 (es) 2005-10-28 2007-10-10 Lilly Co Eli COMPUESTOS DE PIRAZOLIL UREA CON ACTIVIDAD INHIBITORIA DE CINASA P38 Y FORMULACIoN FARMACÉUTICA QUE LO COMPRENDE
US7790756B2 (en) 2006-10-11 2010-09-07 Deciphera Pharmaceuticals, Llc Kinase inhibitors useful for the treatment of myleoproliferative diseases and other proliferative diseases
GB0818033D0 (en) 2008-10-02 2008-11-05 Respivert Ltd Novel compound
NZ591427A (en) 2008-10-02 2012-12-21 Respivert Ltd P38 map kinase inhibitors
WO2010067131A1 (en) * 2008-12-11 2010-06-17 Respivert Limited P38 map kinase inhibitors
GB0905955D0 (en) 2009-04-06 2009-05-20 Respivert Ltd Novel compounds
LT3345903T (lt) 2009-06-10 2019-12-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Tetracikliniai junginiai
GB0921731D0 (en) 2009-12-11 2010-01-27 Respivert Ltd Theraputic uses
GB0921730D0 (en) 2009-12-11 2010-01-27 Respivert Ltd Method of treatment
JP5708637B2 (ja) 2010-03-15 2015-04-30 宇部興産株式会社 アミド化合物の製造方法
GB201005589D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Respivert Ltd Novel compounds
WO2011124930A1 (en) 2010-04-08 2011-10-13 Respivert Limited P38 map kinase inhibitors
WO2011124923A2 (en) 2010-04-08 2011-10-13 Respivert Limited Novel compounds
GB201009731D0 (en) 2010-06-10 2010-07-21 Pulmagen Therapeutics Inflamma Kinase inhibitors
GB201010193D0 (en) 2010-06-17 2010-07-21 Respivert Ltd Medicinal use
EP2582700B1 (en) 2010-06-17 2016-11-02 Respivert Limited Respiratory formulations containing p38 mapk inhibitors
WO2012044090A2 (ko) * 2010-09-29 2012-04-05 크리스탈지노믹스(주) 단백질 키나제 억제 활성을 갖는 신규한 아미노퀴나졸린 화합물
WO2013050757A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 Respivert Limited 1-pyrazolyl-3- (4- ( (2 -anilinopyrimidin- 4 - yl) oxy) napththalen- 1 - yl) ureas as p38 map kinase inhibitors
EP2578582A1 (en) 2011-10-03 2013-04-10 Respivert Limited 1-Pyrazolyl-3-(4-((2-anilinopyrimidin-4-yl)oxy)napththalen-1-yl)ureas as p38 MAP kinase inhibitors
ES2612259T3 (es) 2011-12-09 2017-05-16 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Inhibidores de cinasa
GB201214750D0 (en) 2012-08-17 2012-10-03 Respivert Ltd Compounds
US9783556B2 (en) 2012-08-29 2017-10-10 Respivert Limited Kinase inhibitors
US20150225373A1 (en) 2012-08-29 2015-08-13 Respivert Limited Kinase inhibitors
EP2890460B1 (en) 2012-08-29 2017-02-22 Respivert Limited Kinase inhibitors
GB201215357D0 (en) 2012-08-29 2012-10-10 Respivert Ltd Compounds
US9732063B2 (en) 2012-11-16 2017-08-15 Respivert Limited Kinase inhibitors
EP2970190A1 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Respivert Limited Kinase inhibitors
TWI641592B (zh) * 2013-04-02 2018-11-21 英商瑞斯比維特有限公司 激酶抑制劑
EP2981534B1 (en) 2013-04-02 2017-07-19 Topivert Pharma Limited Kinase inhibitors based upon n-alkyl pyrazoles
AU2014369449B2 (en) 2013-12-20 2018-07-05 Oxular Acquisitions Limited Urea derivatives useful as kinase inhibitors
KR102413704B1 (ko) 2014-02-14 2022-06-24 레스피버트 리미티드 항염증성 화합물로서의 방향족 헤테로사이클릭 화합물
MA40774A (fr) 2014-10-01 2017-08-08 Respivert Ltd Dérivés de diaryle-urée en tant qu'inhibiteurs de kinase p38
BR112018067552A2 (pt) * 2016-04-06 2019-01-08 Topivert Pharma Ltd inibidores de cinase

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004014870A1 (en) * 2002-08-08 2004-02-19 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Fluorinated phenyl-naphthalenyl-urea compounds as inhibitors of cytokines involved in inflammatory processes
WO2011158042A2 (en) * 2010-06-17 2011-12-22 Respivert Limited Methods

Also Published As

Publication number Publication date
EP2981535B1 (en) 2020-12-16
BR112015024678B1 (pt) 2023-02-23
CN105246884A (zh) 2016-01-13
ES2856902T3 (es) 2021-09-28
AU2014246870C1 (en) 2018-09-13
AU2014246866B2 (en) 2018-05-10
EP2981535A1 (en) 2016-02-10
AU2014246866A1 (en) 2015-10-01
EP2981526A1 (en) 2016-02-10
KR102283883B1 (ko) 2021-07-29
CN105408315A (zh) 2016-03-16
WO2014162126A1 (en) 2014-10-09
MX363949B (es) 2019-04-08
KR20210096313A (ko) 2021-08-04
JP2016515606A (ja) 2016-05-30
EA201591906A1 (ru) 2016-03-31
DK2981526T3 (da) 2022-02-07
BR112015024678A2 (pt) 2017-07-18
TW201529556A (zh) 2015-08-01
MX363950B (es) 2019-04-08
US20150166483A1 (en) 2015-06-18
US20160376232A1 (en) 2016-12-29
US9481648B2 (en) 2016-11-01
AU2014246870A1 (en) 2015-10-01
CN105408315B (zh) 2018-09-14
WO2014162122A1 (en) 2014-10-09
JP6464384B2 (ja) 2019-02-06
EA201591907A1 (ru) 2016-02-29
MX2015013944A (es) 2015-12-11
KR20150136536A (ko) 2015-12-07
KR102340654B1 (ko) 2021-12-16
JP6495238B2 (ja) 2019-04-03
US8927563B2 (en) 2015-01-06
CN105246884B (zh) 2018-05-22
DK2981535T3 (da) 2021-03-01
US20180044288A1 (en) 2018-02-15
EA030483B1 (ru) 2018-08-31
JP2016519680A (ja) 2016-07-07
EP2981535B8 (en) 2021-03-10
AU2014246870B2 (en) 2018-05-24
KR20150138855A (ko) 2015-12-10
TWI641592B (zh) 2018-11-21
EP2981526B1 (en) 2021-11-03
US9790174B2 (en) 2017-10-17
BR112015024671A2 (pt) 2017-07-18
KR102283876B1 (ko) 2021-07-29
US10435361B2 (en) 2019-10-08
MX2015013945A (es) 2015-12-11
US20140296208A1 (en) 2014-10-02
CA2907663A1 (en) 2014-10-09
ES2904277T3 (es) 2022-04-04
US20140296271A1 (en) 2014-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA027782B1 (ru) Ингибитор киназ
US20210179584A1 (en) INHIBITOR OF p38 MAP KINASE
US9790209B2 (en) Kinase inhibitors
AU2014369449B2 (en) Urea derivatives useful as kinase inhibitors
JP6662863B2 (ja) Ｐ３８キナーゼ阻害剤としての４−（４−（４−フェニルウレイドナフタレン−１−イル）オキシピリジン−２−イル）アミノ安息香酸誘導体
WO2016051186A1 (en) N-phenyl-3-quinazolin-6-yl-benzamide derivatives as p38 kinase inhibitors

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG TJ TM