ES2904277T3 - Productos intermedios útiles en la preparación de derivados de naftilurea útiles como inhibidores de quinasa - Google Patents

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ES2904277T3 ES14715106T ES14715106T ES2904277T3 ES 2904277 T3 ES2904277 T3 ES 2904277T3 ES 14715106 T ES14715106 T ES 14715106T ES 14715106 T ES14715106 T ES 14715106T ES 2904277 T3 ES2904277 T3 ES 2904277T3
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Abstract

Un compuesto de fórmula XVI, **(Ver fórmula)** en donde LG1 representa imidazolilo, cloro o ariloxi.

Description

DESCRIPCIÓN
Productos intermedios útiles en la preparación de derivados de naftilurea útiles como inhibidores de quinasa
Esta invención se refiere, inter alia, a un compuesto que es un agente antiinflamatorio (p. ej., a través de la inhibición de uno o más de los miembros de: la familia de enzimas de la proteína quinasa activadas con mitógeno p38 (referidos aquí como inhibidores de MAP quinasa p38), por ejemplo su sub-tipo quinasa alfa; Syk quinasa; y la familia Src de tirosina quinasas). La invención también se refiere tal compuesto para su uso en la terapia, incluso en monoterapia y combinación de terapias, especialmente en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, incluyendo las enfermedades inflamatorias del pulmón (como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD)), ojo (como uveítis y queratoconjuntivitis seca (ojo seco)) y tracto gastrointestinal (como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa).
El anuncio o la discusión de un documento aparentemente publicado antes en esta memoria descriptiva no debe necesariamente tomarse como un reconocimiento de que el documento es parte del estado de la técnica o es de conocimiento general común.
Cuatro isoformas MAPK p38 (alfa, beta, gamma y delta, respectivamente) se han identificado, cada una mostrando diferentes patrones de expresión de tejido. Las isoformas MAPK p38 alfa y beta se encuentran de forma ubicua en todo el cuerpo, están presentes en muchos tipos de células diferentes y son inhibidas por un número de compuestos previamente descritos de peso molecular pequeño. Las primeras clases de inhibidores fueron altamente tóxicas debido a la distribución amplia de tejido de estas isoformas que dio lugar a efectos fuera del objetivo de los compuestos. Algunos de los inhibidores más recientemente identificados muestran mejor selectividad de isoformas MAPK p38 alfa y beta y tienen márgenes de seguridad más amplios.
Se cree que la MAP quinasa p38 desempeña un papel fundamental en muchas de las vías de señalización que participan en iniciar y mantener la inflamación crónica y persistente en las enfermedades humanas, por ejemplo, en asma grave, COPD y enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). Ahora hay una abundante bibliografía que demuestra que MAP quinasa p38 es activada por un intervalo de citoquinas pro-inflamatorias y que su activación resulta en el reclutamiento y la liberación de citoquinas pro-inflamatorias adicionales. De hecho, los datos de algunos estudios clínicos demuestran cambios beneficiosos en la actividad de la enfermedad en los pacientes durante el tratamiento con inhibidores de MAP quinasa p38. Por ejemplo, Smith describe el efecto inhibitorio de inhibidores de MAP quinasa p38 en la liberación de (pero no IL-8) TNFa de PBMCs humanas (Smith, S. J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149:393-404).
También se ha propuesto el uso de inhibidores de MAP quinasa p38 en el tratamiento de COPD e IBD. Los inhibidores de molécula pequeña que fijan como objetivo MAPK p38 a/p han demostrado ser eficaces en la reducción de diversos parámetros de inflamación en:
- células y tejidos obtenidos de pacientes con COPD, que son corticosteroides generalmente insensibles (Smith, S. J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149:393-404);
- biopsias de pacientes con IBD (Docena, G. et al., J. Trans. Immunol., 2010, 162:108-115); y
- modelos de animales in vivo (Underwood, D. C. et al., Am. J. Physiol., 2000, 279:L895-902; Nath, P. et al., Eur. J.
Pharmacol., 2006, 544:160-167).
Irusen y colaboradores también sugieren la posibilidad de involucrar a MAPK p38 a/p en la insensibilidad de corticosteroides vía la reducción de la afinidad de unión del receptor de glucocorticoides (GR) en núcleos (Irusen, E. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2002, 109:649-657). Se han descrito investigaciones clínicas en enfermedades inflamatorias con un intervalo de inhibidores de MAP quinasa p38, incluyendo AMG548, BIRB796, VX702, SCIO469 y SCIO323 (Lee, M. R. y Domínguez, C., Current Med. Chem., 2005, 12:2979-2994). Sin embargo, el mayor obstáculo que obstaculiza la utilidad de los inhibidores de MAP quinasa p38 en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas humanas ha sido la toxicidad observada en los pacientes. Esto ha sido lo suficientemente grave como para dar lugar a la retirada del desarrollo clínico de muchos de los compuestos progresados, incluyendo todos aquellos específicamente mencionados anteriormente.
La COPD es una afección en la cual la inflamación subyacente se reporta que es sustancialmente resistente a los efectos anti-inflamatorios de los corticosteroides inhalados. En consecuencia, una estrategia superior para tratar la COPD sería desarrollar una intervención que tiene efectos anti-inflamatorios inherentes y la capacidad de aumentar la sensibilidad de los tejidos pulmonares de pacientes con COPD a los corticosteroides inhalados. La reciente publicación de Mercado et al. (2007; American Thoracic Society Abstract A56) demuestra que el silenciamiento de MAPK p38 y tiene el potencial para restaurar la sensibilidad a corticosteroides. Por lo tanto, puede haber un doble beneficio para los pacientes en el uso de un inhibidor de MAP quinasa p38 para el tratamiento de COPD.
Muchos pacientes diagnosticados con asma o con COPD continúan sufriendo síntomas incontrolados y exacerbaciones de su condición médica que puede ocasionar la hospitalización. Esto ocurre a pesar del uso de los regímenes de tratamiento más avanzados disponibles actualmente, que comprenden productos de combinación de un corticosteroide inhalado y un p-agonista de acción duradera. Datos acumulados durante la última década indican que la imposibilidad de gestionar eficazmente el componente inflamatorio subyacente de la enfermedad en el pulmón es la razón más probable de que se produzcan exacerbaciones. Dada la eficacia establecida de corticosteroides como agentes anti-inflamatorios y, en particular, de los corticosteroides inhalados en el tratamiento del asma, estos hallazgos han provocado una intensa investigación. Los estudios resultantes han identificado que algunos insultos medioambientales invocan cambios inflamatorios insensibles a corticosteroides en los pulmones de los pacientes. Un ejemplo es la respuesta derivada de infecciones del tracto respiratorio superior mediadas viralmente (URTI), que tienen especial importancia en el aumento de la morbilidad asociada con asma y COPD.
Se ha descrito previamente que los compuestos que inhiben la actividad de c-Src y Syk quinasas son agentes efectivos contra la replicación de rinovirus (Charron, C.E. et al., documento WO 2011/158042) y que los compuestos que inhiben p59-HCK son efectivos contra la replicación del virus de la gripe (Charron, C.E. et al., documento WO 2011/070369). Tomado junto con la inhibición de p38 MAPK, éstas son propiedades particularmente atractivas para los compuestos que las poseen que están destinados a tratar a los pacientes con enfermedades respiratorias crónicas.
Ciertos inhibidores de MAPK p38 también se han descrito como inhibidores de la replicación del virus sincitial respiratorio (Cass L. et al., documento w O 2011/158039).
La etiología exacta de IBD es incierta, pero se cree que es gobernada por factores genéticos y medioambientales que interactúan para promover una respuesta inflamatoria excesiva y mal controlada de la mucosa dirigida contra los componentes de la microflora luminal. Esta respuesta es mediada a través de la infiltración de neutrófilos inflamatorios, células dendríticas y células T de la periferia. p38 se ha convertido en un blanco obvio para la investigación en modelos de IBD como consecuencia de su expresión ubicua en las células inflamatorias. Estudios que investigaron la eficacia de los inhibidores de p38 en modelos animales de IBD y biopsias humanas de pacientes con iBd indican que p38 podría ser un blanco para el tratamiento de IBD (Hove, T. ten et al., Gut, 2002, 50:507-512, Docena, G. et al., J. of Trans. Immunol.
2010, 162:108-115). Sin embargo, estos resultados no son totalmente consistentes con otros grupos que no reportan efecto alguno con inhibidores de p38 (Malamut G. et al., Dig. Dis. Sci, 2006, 51:1443-1453). Un estudio clínico en pacientes de Crohn usando el inhibidor p38 alfa BIRB796 ha demostrado un potencial beneficio clínico con una mejoría en los niveles de proteína C-reactiva. Sin embargo, esta mejoría fue transitoria, volviendo a los valores basales en la semana 8 (Schreiber, S. et al., Clin. Gastro. Hepatology, 2006, 4:325-334). Un estudio clínico pequeño que investiga la eficacia de CNI-1493, una p38 e inhibidor Jnk, en pacientes con enfermedad de Crohn severa mostraron una mejoría significativa en la puntuación clínica durante 8 semanas (Hommes, D. et al. Gastroenterology. 2002122:7-14).
Las células T son conocidas por jugar un papel clave en la mediación de la inflamación del tracto gastrointestinal. El trabajo pionero por Powrie y colaboradores demostraron que la transferencia de células CD4+ sin tratamiento previo en animales inmunodeficientes seriamente comprometidos (SCID) resultó en el desarrollo de colitis que es dependiente de la presencia de bacterias comensales (Powrie F. et al. Int Immunol. 1993 5:1461-71). Además, la investigación de membranas de la mucosa de pacientes con IBD mostraron una sobrerregulación de células CD4+ que fueron desplazadas por Th1 (IFNg/IL-2) o Th2 (IL5/TGFP), dependiendo de si el paciente tenía la enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa (Fuss IJ. et al. J. Immunol. 1996, 157:1261-70). Del mismo modo, las células T son conocidas por jugar un papel clave en trastornos inflamatorios del ojo con varios estudios que informaron los niveles incrementados de citoquinas asociadas con células T (IL-17 e IL-23) en sueros de pacientes Beghets (Chi W. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2008, 49:3058-64). En soporte a estas observaciones, Direskeneli y colaboradores demostraron que pacientes Beghets tienen células Th17 incrementadas y células Treg disminuidas en su sangre periférica (Direskeneli H. et al. J Allergy Clin Immunol. 2011 128:665-6).
Un enfoque para inhibir la activación de las células T es fijar como objetivo quinasas que estén implicadas en la activación del complejo de señalización del receptor de células T. Las quinasas de las familias Syk y Src son conocidas por jugar un papel clave en esta vía, donde las quinasas de las familias Src, Fyn y Lck son las primeras moléculas de señalización que son activadas aguas abajo del receptor de células T (Barber Ek . et al. PNAs 1989, 86:3277-81). Inician la fosforilación de tirosina del receptor de células T, conduciendo al reclutamiento de la quinasa de la familia Syk, ZAP-70. Estudios con animales han mostrado que la inactivación de ZAP-70 resulta en un fenotipo SCID (Chan AC. et al. Science. 1994, 10;264(5165):1599-601).
Un ensayo clínico en pacientes con artritis reumatoide con el inhibidor de Syk Fostamatinib demostró el potencial de Syk como un objetivo anti-inflamatorio en pacientes que muestran mejora en los resultados clínicos y reduce los niveles séricos de IL-6 y MMP-3 (Weinblatt ME. et al. Arthritis Rheum. 200858:3309-18). La quinasa Syk se expresa ampliamente en las células del sistema hematopoyético, principalmente en células B y células T maduras. A través de la interacción con motivos de activación basada en el inmuno-receptor tirosina (ITAM) juega un papel importante en la regulación de células T y la expansión de células B, así como en la mediación de la señalización del receptor inmune en las células inflamatorias. La activación de Syk conduce a la liberación de IL-6 y MMP - mediadores inflamatorios comúnmente encontrados sobre­ regulados en trastornos inflamatorios, incluyendo IBD y artritis reumatoide (Wang YD. et al World J Gastroenterol 2007; 13: 5926-5932, Litinsky I et al. Cytokine. Enero de 200633:106-10).
Además de realizar funciones claves en eventos de señalización de células que controlan la actividad de las vías pro­ inflamatorias, las enzimas quinasa ahora son reconocidas también por regular la actividad de un intervalo de funciones celulares, incluyendo el mantenimiento de la integridad de ADN (Shilo, Y. Nature Reviews Cancer, 2003, 3: 155-168) y coordinación de los procedimientos complejos de la división celular. De hecho, se ha encontrado que ciertos inhibidores de quinasa (la denominada "quinasas Olaharski") alteran la frecuencia de formación de micronúcleos in vitro (Olaharski, A. J. et al., pLoS Comput. Biol., 2009, 5(7), e1000446; doi: 10.1371/journal.pcbi.1000446). La formación de micronúcleos está implicada en, o asociada con, la interrupción de los procedimientos mitóticos y por lo tanto, es indeseable. Se encontró que la inhibición de glucógeno sintasa quinasa 3a (GSK3a) es un factor particularmente importante que aumenta la probabilidad de que un inhibidor de quinasa promueva la formación de micronúcleos. También, se ha informado que la inhibición de la quinasa GSK3|3 con ARNi promueve la formación de micronúcleos (Tighe, A. et al., BMC Cell Biology, 2007, 8:34).
Mientras que sea posible atenuar los efectos adversos de la inhibición de quinasas Olaharski como GSK3a por optimización de la dosis y/o cambiando la ruta de la administración de una molécula, sería ventajoso identificar además moléculas terapéuticamente útiles con baja o despreciable inhibición de quinasas Olaharski, tales como GSK 3a y/o tienen baja o despreciable interrupción de los procesos mitóticos (por ejemplo, como se mide en un ensayo de mitosis).
Diversos compuestos, incluidos los derivados de urea, se describen como inhibidores de una o más quinasas. Ejemplos de tales compuestos se pueden encontrar en los documentos WO 99/23091, WO 00/041698, WO 00/043384, WO 00/055139, WO 01/36403, WO 01/04115, WO 02/083628, WO 02/083642, WO 02/092576, WO 02/096876, WO 2003/005999, WO 2003/068223, WO 2003/068228, WO 2003/072569, WO 2004/014870, WO 2004/113352, WO 2005/005396, WO 2005/018624, WO 2005/023761, WO 2005/044825, WO 2006/015775, WO 2006/043090, WO 2007/004749 y WO 2007/053394. Ejemplos adicionales se pueden encontrar en los artículos publicados en:
- Curr. Opin. Drug Devel. (2004, 7(5), 600-616);
- J. Med. Chem. (2007, 50, 4016-4026; 2009, 52, 3881-3891; y 2010, 53, 5639-5655);
- Bioorg. Med. Chem. Lett. (2007, 17, 354-357; 2008, 18, 3251-3255; 2009, 19, 2386-2391; y 2010, 20, 4819-4824); - Curr. Top. Med. Chem. (2008, 8, 1452-1467);
- Bioorg. Med. Chem. (2010, 18, 5738-5748);
- Eur. J. Pharmacol. (2010, 632, 93-102) y
- J. Chem. Inf. Model. (2011,51, 115-129).
Sin embargo, sigue existiendo una necesidad para identificar y desarrollar nuevos inhibidores de quinasas, específicamente inhibidores de MAP quinasa p38 alternativos que sean adecuados para el tratamiento de la inflamación. Es particularmente necesario que tales inhibidores tengan mayor potencial terapéutico sobre los tratamientos disponibles en la actualidad o, en particular, que exhiban un índice terapéutico superior (por ejemplo, inhibidores que sean al menos igualmente eficaces y, en uno o más aspectos, menos tóxicos en la dosis terapéutica relevante que los agentes anteriores).
Los autores de la invención han descubierto ahora, de forma sorprendente, que una diarilurea sustituida con anilina inhibe una o más de MAP quinasa p38, quinasas de la familia Syk y Src y, por lo tanto, poseen buenas propiedades anti­ inflamatorias.
La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula XVI según se define en las reivindicaciones adjuntas. También se describe aquí un compuesto de fórmula I,
Figure imgf000005_0001
o una sal, solvato o derivado isotópico farmacéuticamente aceptable del mismo.
Sales farmacéuticamente aceptables que pueden mencionarse incluyen sales por adición de ácidos y sales por adición de bases. Sales de este tipo se pueden formar por medios convencionales, por ejemplo por la reacción de una forma de ácido libre o de base libre de un compuesto de fórmula I con uno o más equivalentes de un ácido o base apropiado, opcionalmente en un disolvente, o en un medio en el que la sal es insoluble, seguido por la eliminación de dicho disolvente, o dicho medio, usando técnicas estándar (por ejemplo in vacuo, por liofilización o por filtración). Las sales también pueden prepararse mediante el intercambio de un contra-ion de un compuesto de fórmula I en la forma de una sal con otro contra­ ion, por ejemplo usando una resina de intercambio iónico adecuada.
Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales por adición de ácidos derivadas de ácidos minerales y ácidos orgánicos, y sales derivadas de metales.
Para evitar cualquier duda, el compuesto de fórmula I puede contener los átomos indicados en cualquiera de sus formas isotópicas naturales o no naturales. En este sentido, compuestos particulares de fórmula I que se pueden mencionar incluyen aquellos en los que:
(a) el compuesto de fórmula I no está isotópicamente enriquecido o marcado con respecto a cualquiera de los átomos del compuesto; y
(b) el compuesto de fórmula I está isotópicamente enriquecido o marcado con respecto a uno o más átomos del compuesto.
Las referencias aquí a un "derivado isotópico" se refieren a la segunda de estas dos alternativas. En particular, el compuesto de fórmula I puede estar isotópicamente enriquecido o marcado (con respecto a uno o más átomos del compuesto) con uno o más isótopos estables. Así, compuestos de fórmula I que pueden mencionarse incluyen, por ejemplo, aquellos que están isotópicamente enriquecidos o marcados con uno o más átomos, tales como deuterio.
El compuesto de fórmula I pueden exhibir tautomerismo.
El compuesto de fórmula I tiene el nombre 3-((4-((4-(3-(5-(terc.-butil)-2-metoxi-3-(metilsulfonamido)fenil)ureido)naftalen-1-il)oxi)pirimidin-2-il)amino)-5-etinil-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)benzamida. Sin embargo, también se puede denominar 3-[[4-[[4-[[5-terc.-butil-3-(metanosulfonamido)-2-metoxi-fenil]carbamoilamino]-1-naftil]oxi]-pirimidin-2-il]amino]-5-etinil-N-[2-[2-(2-metoxietoxi)etoxi]etil]benzamida.
Ejemplos de sales del compuesto de fórmula I incluyen todas las sales farmacéuticamente aceptables, tales como, sin limitación, sales por adición de ácidos de ácidos minerales fuertes tales como sales de HCl y HBr y sales por adición de ácidos orgánicos fuertes tales como ácido metanosulfónico.
Las referencias aquí a un compuesto de fórmula I pretenden incluir referencias al compuesto y a todas las sales, solvatos y/o tautómeros farmacéuticamente aceptables de dicho compuesto, a menos que el contexto indique específicamente lo contrario. En este sentido, los solvatos que pueden mencionarse incluyen hidratos.
El compuesto de fórmula I es un inhibidor de quinasa MAP p38 (especialmente del subtipo alfa), Syk quinasa y quinasas de la familia Src, por ejemplo, Src y Lck y, por lo tanto, son útiles en medicina, en particular para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
También se divulga aquí un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I, procedimiento que comprende:
(a) reacción de un compuesto de fórmula II,
r1
N = C = 0
con un compuesto de fórmula III
Figure imgf000006_0001
en donde uno de Z1 y Z2 es un fragmento estructural de fórmula IV
Figure imgf000006_0002
IV
y el otro de Z1 y Z2 es un fragmento estructural de fórmula V
Figure imgf000006_0003
por ejemplo, en condiciones conocidas para aquellos expertos en la técnica, por ejemplo a una temperatura de ambiente (por ejemplo 15 a 30 °C) a cerca de 110 °C en presencia de un disolvente orgánico adecuado (por ejemplo, un disolvente aprótico polar tal como DMF, THF, 1,4-dioxano, o sus mezclas);
(b) reacción de un compuesto de fórmula IIa,
Figure imgf000006_0004
lia
en donde Z1 es como se definió antes, con un agente de formación de azida adecuado (es decir, una fuente adecuada de un grupo saliente y una azida activada, tal como fosforazidato de difenilo; véase, por ejemplo, Tetrahedron 1974, 30, 2151 — 2157) bajo condiciones conocidas por los expertos en la técnica, tal como a temperatura de sub-ambiente a ambiente (por ejemplo, desde una temperatura inicial de cerca de -5 a 5 °C a temperatura ambiente después de la reacción) en presencia de una amina base (por ejemplo, trietilamina o una base impedida estéricamente tal como A/,A/-diisopropiletilamina) y un disolvente orgánico adecuado (por ejemplo un disolvente aprótico polar tal como DMF, THF, 1,4-dioxano, o sus mezclas), cuya reacción es seguida, sin aislamiento, por reordenamiento térmico (por ejemplo con calentamiento) del intermedio azida de acilo (de fórmula Z1-C(O)-N3) por ejemplo a temperatura ambiente (tal como de 15 a 30 °C) para proporcionar, in situ, un compuesto de fórmula II, compuesto el cual entonces reaccionó con un compuesto de fórmula III, según lo definido anteriormente, para proporcionar el compuesto de fórmula I;
(c) reacción de un compuesto de fórmula IIb,
Figure imgf000007_0001
en donde LG1 representa un grupo saliente apropiado (por ejemplo imidazolilo, cloro o ariloxi, tal como fenoxi) y Z1 es como se definió anteriormente, con un compuesto de fórmula III, como se definió anteriormente, por ejemplo bajo condiciones conocidas para los entendidos en la materia, tal como a temperatura ambiente (por ejemplo, de ambiente a 80 °C, tal como a aproximadamente 60 °C), opcionalmente en presencia de una base amina (por ejemplo, trietilamina o una base impedida estéricamente tal como A/,W-diisopropiletilamina) y un disolvente orgánico adecuado (por ejemplo, un disolvente aprótico tal como diclorometano, o un éster tal como acetato de isopropilo);
(d) reacción de un compuesto de fórmula VI,
Figure imgf000007_0002
en donde LG2 representa un grupo saliente adecuado (por ejemplo un grupo halo, tal como cloro o bromo), con un compuesto de fórmula VII,
Figure imgf000007_0003
por ejemplo bajo condiciones conocidas por aquellos con experiencia en la técnica (por ejemplo como se describe en J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 15686-15696), tal como a temperatura elevada (por ejemplo de 50 a 110 °C) en presencia de un disolvente orgánico adecuado (por ejemplo, un disolvente aprótico polar, tal como DMF, THF, 1,4-dioxano, o sus mezclas) y, opcionalmente, un catalizador ácido (por ejemplo, un ácido sulfónico tal como ácido para-toluenosulfónico) o a través de un acoplamiento de Buchwald (Surry, D. S.; Buchwald, S. L. Chem. Sci. 2011, 2, 27-50) que involucra un catalizador de paladio y un ligando apropiado, por ejemplo, BrettPhos; o
(e) reacción de un compuesto de fórmula VIIa,
Figure imgf000007_0004
en donde R4' representa H o grupo alquilo C1-3 (por ejemplo metilo), con un compuesto de fórmula VIIb,
H2N-[CH2CH2-O]2-CH2CH2-OCH3 VIIb
por ejemplo bajo condiciones conocidas por aquellos con experiencia en la técnica, tal como (i) cuando R4' representa un grupo alquilo C1-3, la reacción a temperatura ambiente en presencia de un catalizador de ácido de Lewis adecuado (por ejemplo un reactivo de trialquilaluminio tal como trimetilaluminio) y un disolvente orgánico aprótico (por ejemplo THF), (ii) cuando R4' representa H, la reacción en presencia de una base de amina terciaria (por ejemplo una trialquilamina tal como trietilamina o diisopropiletilamina o una amina cíclica tal como N-metilpirrolidina o N-metilmorfolina), un reactivo de acoplamiento de amida (péptido) (por ejemplo T3P, HATU, CDI, BOP, PyBOP, HOAt, HOBt o una carbodiimida tal como DCC o diisopropilcarbodiimida) y un disolvente orgánico aprótico (por ejemplo un disolvente clorado tal como DCM, un éster tal como acetato de etilo, una amida de dimetilamina tal como DMF, o una mezcla de cualquiera de tales disolventes) o (iii) antes de la reacción con el compuesto de fórmula VIIb, la conversión del compuesto de fórmula VIIa a un compuesto correspondiente en que OR4’ es reemplazado por halo (por ejemplo cloro, cuyo compuesto puede, por ejemplo, prepararse por la reacción de un compuesto de fórmula VIIa en donde R4’ representa H con un agente de halogenación tal como cloruro de tionilo, por ejemplo a temperatura elevada tal como 50 a 70 °C), seguido de la reacción del haluro de ácido resultante con el compuesto de fórmula VIIb, cuya reacción puede, por ejemplo, llevarse a cabo en presencia de un disolvente aprótico orgánico (por ejemplo, un disolvente clorado tal como DCM).
Compuestos de fórmula II se pueden preparar según o por analogía con los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo por reacción de un compuesto de fórmula IIa, según lo definido anteriormente, con un agente formador de azida, seguido de reordenamiento de la azida de acilo intermedia (como se describió en (b) anterior; véase, por ejemplo, Tetrahedron 1974, 30, 2151-2157).
Compuestos de fórmula IIb se pueden preparar por la reacción de un compuesto de fórmula VIII,
Figure imgf000008_0001
en donde LG1 es como se definió antes aquí, con un compuesto de fórmula IX,
Figure imgf000008_0002
en donde Z1 es como se definió antes aquí, por ejemplo bajo condiciones conocidas por aquellos con experiencia en la técnica.
Aminas de fórmula IX se pueden preparar a partir de ácidos carboxílicos de la fórmula IIa a través de la ruta descrita en (b) anterior, donde el isocianato II intermedio se hidroliza con agua para dar un ácido carbámico que pierde dióxido de carbono para dar IX. De la misma manera, el isocianato II intermedio puede reaccionar con un alcohol, tal como í-butanol, para generar una versión protegida de IX.
Compuestos de fórmula III, en donde Z2 representa un fragmento estructural de fórmula V, o compuestos de fórmula IX en donde Z1 representa un fragmento estructural de fórmula V, se pueden sintetizar empleando la ruta resumida en el Esquema 1 (véanse, por ejemplo: el documento WO 2003/072569; y el documento WO 2008/046216), en donde LG3 y LG4 representan grupos salientes, por ejemplo, halógeno o metanosulfonilo, y FG representa un grupo NH2 real o latente, es decir, un grupo que se transforma fácilmente en un grupo NH2 tal como nitro o una variante protegida NH-PG2, donde PG2 es un grupo protector típico (véase, por ejemplo: Greene, T. W.; Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis; Wiley, 4a edición revisada, 2006; ISBN-10: 0471697540), por ejemplo, un éster carbamato o carboxamida. La secuencia se inicia con el desplazamiento de SNAr mediado por base de LG3 en XI por los aróxidos formados cuando X se trata con una base para generar éteres XII. El sustituyente de halógeno o metanosulfonilo (LG4) restante del éter XII es desplazado entonces i) por una amina de fórmula VII en una segunda reacción SNAr o (ii) vía un acoplamiento de Buchwald (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/017838) con una amina de fórmula VII para producir el compuesto deseado (cuando FG es NH2), o XIII (cuando FG es nitro o NH-PG2). Cuando FG es nitro en XIII, el grupo NH2 puede ser revelado por una reacción de reducción, que típicamente se hace a través de hidrogenación empleando un catalizador adecuado, por ejemplo, paladio sobre carbono, o empleando condiciones de metal de disolución tal como con hierro en ácido acético glacial. Alternativamente, cuando FG es un grupo protector, el grupo NH2 puede ser revelado por una reacción de desprotección. Aunque sólo se representa como teniendo lugar en la etapa final de la secuencia, cabe señalar que el desenmascaramiento del grupo NH2 latente representado por FG puede ocurrir en cualquier etapa de la ruta de síntesis que se muestra en el Esquema 1.
Esquema 1
Figure imgf000009_0001
De una manera similar, aminas de fórmula IX, en donde Z1 representa un fragmento estructural de fórmula IV se puede sintetizar por conversión de un grupo NH2 latente o uno real en un compuesto de fórmula XIIIa,
Figure imgf000009_0002
en donde FG’ es como se definió para FG antes, excepto que no representa NH2.
Compuestos de fórmula III, en donde Z2 representa un fragmento estructural de formula V, o compuestos de fórmula IX, en donde Z1 representa un fragmento estructural de fórmula V, se pueden preparar por analogía con los procedimientos descritos aquí para preparar el compuesto de fórmula I (véase el procedimiento (e) anterior) y otros compuestos de fórmula III (véase, por ejemplo, el Esquema 1 anterior), por ejemplo por la reacción de un compuesto de XIIIb
en donde FG y R4' son como se definieron antes aquí, con un compuesto de fórmula VIIb, como se definió antes aquí, bajo condiciones conocidas por aquellos con experiencia en la técnica (por ejemplo las condiciones de acoplamiento de péptido descritas con respecto al procedimiento (e) anterior), seguido de la conversión (si es necesario) de FG en NH2 , por ejemplo como se describió antes en relación con el Esquema 1.
Compuestos de fórmula VI se pueden sintetizar por analogía con el compuesto de fórmula I (véanse, por ejemplo, los procedimientos alternativos (a) a (c) anteriores). Por ejemplo, compuestos de fórmula VI se pueden preparar por la reacción de un compuesto de fórmula IIx con un compuesto de fórmula IIIx, en donde los compuestos de fórmulas IIx y IIIx adoptan las mismas definiciones que los compuestos de fórmulas II y III, con la excepción de que uno de Z1 y Z2 represente un fragmento estructural de fórmula IV, como se definió antes aquí, y el otro de Z1 y Z2 represente un fragmento estructural de fórmula Va,
Figure imgf000010_0001
Va
El compuesto de fórmula VII se puede preparar según o por analogía con los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo por la reacción de un compuesto de fórmula XIV,
Figure imgf000010_0002
en donde FG, es como se define antes aquí, con un compuesto de fórmula VIIb, como se definió antes aquí, bajo condiciones conocidas por aquellos con experiencia en la técnica (por ejemplo las condiciones de acoplamiento de péptidos descritas con respecto al procedimiento (e) anterior), seguido de
cuando FG representa NH-PG2, eliminación del grupo protector de PG2 o,
cuando FG representa NO2, reducción de NO2 a NH2.
Se entenderá por personas expertas en la técnica que los compuestos representados por las fórmulas II, IIx y IIb son generalmente productos intermedios reactivos. Estos productos intermedios se pueden formar in situ y pueden reaccionar directamente, sin aislamiento, con compuestos de fórmula III para proporcionar el compuesto de fórmula I. Además, se entenderá por aquellos expertos en la técnica que puede ser necesario el uso de grupos protectores apropiados durante los procedimientos descritos anteriormente para cualquiera de los grupos Z1 y Z2 que poseen grupos funcionales químicamente sensibles, por ejemplo, un grupo hidroxilo o una función amino.
Muchos de los compuestos que se ilustran en los Esquemas están disponibles en el comercio, o pueden obtenerse mediante los procedimientos citados, o se pueden preparar fácilmente por métodos convencionales por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Regan, J. et al.; J. Med. Chem. 2003, 46, 4676-4686, documentos WO 2000/043384, WO 2007/053346, WO 2007/087448, WO 2007/089512, WO 2009/117080 y WO 2014/027209.
También se divulga aquí un procedimiento para la preparación del compuesto de fórmula I, cuyo procedimiento comprende la reacción de un compuesto de fórmula XV,
Figure imgf000010_0003
con un compuesto de fórmula XVI,
Figure imgf000011_0003
en donde LG1 es como define antes aquí (por ejemplo, fenoxi), por ejemplo bajo condiciones conocidas por los expertos en la técnica, tal como a temperatura elevada (por ejemplo, de 40 a 80 °C, tal como a aproximadamente 60 °C), en presencia de una base amina (por ejemplo, trietilamina) y un disolvente orgánico aprótico (por ejemplo, un éster tal como acetato de isopropilo).
El compuesto de fórmula XV se puede preparar por la desprotección de un compuesto correspondiente de fórmula XVa,
Figure imgf000011_0001
en donde PG2 es como se definió antes aquí (por ejemplo PG2 es íerc.-butoxicarbonilo), por ejemplo bajo condiciones conocidas por aquellos con experiencia en la técnica, tal como cuando PG2 representa íerc-butoxicarbonilo, reacción con un ácido fuerte (por ejemplo, un alquilo o ácido arilsulfónico (por ejemplo, ácido p-toluenosulfónico y/o, particularmente, ácido trifluoroacético) en presencia de un disolvente orgánico aprótico (por ejemplo, un disolvente clorado tal como DCM).
El compuesto de fórmula XVa puede ser preparado por la reacción de un compuesto de fórmula VII, tal como se define antes aquí, con un compuesto de fórmula XII (por ejemplo, un compuesto de fórmula XII, en donde LG4 representa cloro), como se define antes aquí, pero en donde FG representa NH-PG2 (por ejemplo NH-C(O)O-C(CH3)3), por ejemplo bajo condiciones conocidas para los entendidos en la técnica, tal como a temperatura elevada (por ejemplo de 40 a 80 °C, tal como entre 60 y 70 °C), en presencia de un disolvente aprótico (por ejemplo, THF) y, opcionalmente, un catalizador ácido (por ejemplo, un ácido sulfónico, tal como ácido para-toluenosulfónico).
El compuesto de fórmula VII se puede preparar por métodos como los descritos arriba. Por ejemplo, el compuesto de fórmula VII se puede preparar por desprotección de un compuesto de fórmula VII(P),
Figure imgf000011_0002
donde R', R'' y R''' independientemente representan alquilo C1-4 (por ejemplo, R', R'' y R''' representan todos isopropilo), por ejemplo bajo condiciones conocidas para los expertos en la técnica, tal como una reacción a temperatura ambiente en un disolvente aprótico, polar (por ejemplo, acetonitrilo) con una fuente de iones fluoruro, tal como TBAF o fluoruro de cesio.
El compuesto de fórmula VII(P) se puede preparar por acoplamiento (por ejemplo por acoplamiento de Sonogashira; véase Chem. Soc. Rev. 2011, 40, 5084-5121) de un compuesto de fórmula XVII,
Figure imgf000012_0001
en donde LG5 representa halo, tal como bromo, con un compuesto de fórmula XVIII,
Figure imgf000012_0002
en donde R', R" y R'" son como se definió antes aquí, por ejemplo, en condiciones conocidas para los expertos en la técnica, tal como una reacción a temperatura elevada (por ejemplo, 50 a 80 °C o, particularmente, 60 a 70 °C) en presencia de CuI y un catalizador de Pd(0) (por ejemplo, Pd(PPh3)4) y un disolvente orgánico inerte a la reacción, tal como THF.
El compuesto de fórmula XVII se puede preparar por reducción de un compuesto de fórmula XIX,
Figure imgf000012_0003
en donde LG5 es como se definió antes aquí, por ejemplo bajo condiciones conocidas por los expertos en la técnica, tal como a temperatura elevada (por ejemplo, de aproximadamente 50 a 70 °C) bajo una atmósfera de hidrógeno (por ejemplo bajo H2 a una presión de aproximadamente 3 MPa) en presencia de un catalizador adecuado (por ejemplo, Pt/C), un disolvente inerte a la reacción (por ejemplo, THF) y un ácido (por ejemplo, ácido acético) o alternativamente con hierro en un medio ácido (por ejemplo, ácido clorhídrico) en agua y etanol.
El compuesto de fórmula XIX se puede preparar por la reacción de un compuesto de fórmula XX,
Figure imgf000012_0004
XX
en donde LG5 es como se define antes aquí, con un agente de halogenación (por ejemplo, cloruro de tionilo, por ejemplo de 60 a 70 °C), seguido por la reacción del haluro de ácido intermedio con el compuesto de fórmula VIIb, como se definió antes aquí, por ejemplo, en condiciones conocidas por los expertos en la técnica, tal como a 25 °C o por debajo en presencia de un disolvente aprótico orgánico (por ejemplo, DCM) y una base, por ejemplo, trietilamina, DIPEa o NaHCO3. Alternativamente, esta transformación se puede efectuar por condensación en presencia de una base de amina terciaria (por ejemplo una trialquilamina tal como trietilamina o DIPEA o una amina cíclica tal como N-metilpirrolidina o N-metilmorfolina), un reactivo de acoplamiento de amida (péptido) (por ejemplo T3P, HATU, CDI, BOP, PyBOP, HOAt, HOBt o una carbodiimida, tal como DCC o diisopropilcarbodiimida) y un disolvente orgánico aprótico (por ejemplo, un disolvente clorado tal como DCM, un éster tal como acetato de etilo, una amida de dimetilamina tal como DMF, o una mezcla de cualquiera de tales disolventes).
El compuesto de fórmula XVI se puede preparar por la reacción de un compuesto de fórmula XXI (documento US2003/0065034),
Figure imgf000013_0001
con un compuesto de fórmula XXII,
Figure imgf000013_0002
en donde LG1 y LG2 representan grupos salientes (por ejemplo LG1 representa fenoxi y LG2 representa halo, tal como cloro), por ejemplo, en condiciones conocidas para los expertos en la técnica, tal como por debajo de 20 °C, en presencia de una base (por ejemplo, NaHCO3) y un disolvente orgánico inerte a la reacción (por ejemplo, THF, DCM o, particularmente, una mezcla de estos).
El compuesto de fórmula XXI se puede preparar por la reducción de un compuesto de fórmula XXIII,
Figure imgf000013_0003
por ejemplo, en condiciones conocidas por los expertos en la técnica, tal como en una atmósfera de hidrógeno (por ejemplo, bajo H2 a una presión de aproximadamente 0,3 a 0,4 MPa) en presencia de un catalizador adecuado (por ejemplo, Pd/C) y un disolvente (por ejemplo, metanol).
El compuesto de fórmula XXI se puede preparar por la reacción de un compuesto de fórmula XXIV,
Figure imgf000013_0004
con cloruro de metanosulfonilo, por ejemplo bajo condiciones conocidas por los expertos en la técnica, tal como entre 25 y 40 °C en presencia de una base (por ejemplo, piridina) y un disolvente orgánico inerte a la reacción (por ejemplo, tolueno).
El compuesto de fórmula XXIV se puede preparar por reducción parcial de un compuesto de fórmula XXV,
Figure imgf000014_0001
por ejemplo, en condiciones conocidas por los expertos en la técnica, tal como a temperatura elevada (por ejemplo de 70 a 80 °C) en presencia de una fuente de hidrógeno (por ejemplo, 4-metil-1-ciclohexeno), un catalizador adecuado (por ejemplo, Pd/C) y un disolvente (por ejemplo, un alcohol tal como metanol, etanol o una mezcla de los mismos, tal como alcohol metilado industrial).
También se divulga en esta memoria un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula I, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) un procedimiento como se describe en esta memoria para la preparación de un compuesto de fórmula XV; y/o (b) un procedimiento como se describe en esta memoria para la preparación de un compuesto de fórmula XVI.
En relación con estas divulgaciones, el procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I puede comprender un procedimiento como se describe en esta memoria para la preparación de uno o más de los compuestos de fórmulas XVa, VII(P), VII, XVII, XIX, XXI, XXIII y XXIV.
También se divulgan productos intermedios novedosos como se describen aquí. Sin embargo, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula XVI como se define en las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, un compuesto de fórmula XVI, en donde LG1 representa fenoxi).
El compuesto de fórmula I antes mencionado puede tener la ventaja de que en el tratamiento de las afecciones descritas antes aquí, puede ser más conveniente para el médico y/o el paciente, ser más eficaz, ser meno tóxico, tener mejor selectividad, tener un intervalo más amplio de la actividad, ser más potente, producir menos efectos secundarios, tener un perfil farmacocinético y/o farmacodinámico mejor, tener morfología de estado sólido más adecuada, tener mejor estabilidad o tener otras propiedades farmacológicas útiles sobre compuestos, combinaciones, métodos (tratamientos) o usos similares conocidos en la técnica anterior para su uso en el tratamiento de esas afecciones o de otro tipo.
El compuesto de fórmula I puede adicionalmente (o alternativamente):
- exhibir una larga duración de acción y/o persistencia de la acción (por ejemplo, en comparación con otros inhibidores de MAP quinasa p38 previamente descritos tal como, por ejemplo, BIRB796);
- no inhibir fuertemente GSK3a;
- fijar como objetivo una porción más pequeña de la quinoma, es decir, con selectividad mejorada, como se ilustra por puntuaciones de selectividad KinomeScan;
- mantener una concentración relativamente alta local del fármaco entre las dosis (por ejemplo, una alta concentración local respecto de los otros inhibidores de MAP quinasa p38 previamente descritos, tales como, por ejemplo, BIRB796); - exhibir propiedades que son particularmente adecuadas para la administración tópica/local (por ejemplo tras la administración tópica/local, la generación de las altas concentraciones de tejido objetivo, pero las bajas concentraciones en plasma del compuesto de fórmula (I) y/o separación rápida del compuesto de fórmula (I) del plasma, por ejemplo como un resultado de extracción renal o hepática alta);
- exhibir poca o ninguna inducción y/o inhibición de p-catenina de mitosis en células;
- no produce aumentos en células binucleadas que contienen micronúcleos en la prueba de micronúcleos de linfocitos humano in vitro;
- exhibir poca o ninguna inhibición dependiente del tiempo de miembros de la superfamilia del citocromo P450;
- mostrar estabilidad química mejorada en presencia de agua (por ejemplo, estabilidad a la hidrólisis de mezclas acuosas a temperaturas elevadas) en comparación con inhibidores de m Ap quinasa p38 previamente descritos tal como, por ejemplo, BIRB796;
- después de la administración a un paciente, da lugar a metabolitos asociados con problemas de poca o ninguna seguridad (por ejemplo, toxicidad);
- exhibir buena solubilidad y/o permeabilidad celular;
- tener un alto grado de cristalinidad; y/o
- exhibir poca o ninguna higroscopicidad en estado sólido.
Métodos experimentales
Procedimientos Generales
Todos los materiales de partida y disolventes fueron obtenidos de fuentes comerciales o preparados de acuerdo a la citación de la bibliografía. Salvo que se indique lo contrario todas las reacciones se agitaron. Las soluciones orgánicas se secaron rutinariamente sobre sulfato de magnesio anhidro. Las reacciones en microondas fueron realizadas en un reactor de microondas CEM Discover y Smithcreator, calentando a una temperatura constante mediante irradiación de microondas de potencia variable.
La cromatografía de columna en fase normal se llevó a cabo de forma rutinaria en un sistema automatizado de cromatografía de resolución instantánea como un sistema CombiFlash Companion o CombiFlash RF usando cartuchos de sílice pre-empaquetados (malla 230-400, 40-63 pm). SCX se adquirió de Supelco y se trató con ácido clorhídrico 1M antes de usarlo. Salvo que se indique lo contrario, la mezcla de reacción a purificar se diluyó primero con MeOH y se hizo ácida con unas pocas gotas de AcOH.
Esta solución fue cargada directamente sobre el SCX y lavada con MeOH. El material deseado se eluyó entonces al lavar con NH3 al 1 % en MeOH.
Métodos analíticos
La HPLC analítica se llevó a cabo utilizando una columna Waters Xselect CSH C18, 2.5 pm, 4.6 x 30 mm eluyendo con un gradiente de ácido fórmico al 0,1% en MeCN en ácido fórmico acuoso al 0,1 % o una columna Waters Xbridge BEH C18, 2,5 pm, 4,6 x 30 mm eluyendo con un gradiente de MeCN en bicarbonato de amonio 10 mM acuoso. Los espectros UV de los picos eluídos se midieron con una matriz de diodos o un detector de longitud de onda variable en un sistema Agilent 1100.
La LCMS analítica se llevó a cabo utilizando una columna Waters Xselect CSH C18, 2.5 pm, 4.6 x 30 mm eluyendo con un gradiente de ácido fórmico al 0,1 % en MeCN en ácido fórmico acuoso al 0,1 % o una columna Waters Xbridge BEH C18, 2,5 pm, 4,6 x 30 mm eluyendo con un gradiente de MeCN en bicarbonato de amonio acuoso 10 mM. UV y los espectros de masas de los picos eluídos se midieron usando un detector de longitud de onda variable en un Agilent 1200 o un Agilent Infinity 1260 LCEM con espectrómetro de masas cuadrupolo único 6120 con electroproyección de iones positivos y negativos.
La HPLC preparativa se llevó a cabo utilizando una columna Waters Xselect CSH C18, 5 pm, 19 x 50 mm utilizando ya sea un gradiente de ácido fórmico al 0,1 % en MeCN en ácido fórmico acuoso al 0,1 % o un gradiente de MeCN en bicarbonato de amonio 10 mM acuoso o utilizando una columna Waters Xbridge BEH C18, 5 pm, 19 x 50 mm con un gradiente de MeCN en bicarbonato de amonio acuoso 10 mM. Las fracciones se recolectaron tras la detección por UV en una sola longitud de onda medida por un detector de longitud de onda variable en una HPLC preparativa Gilson 215 o HPLC preparativa PrepStar Varian o por masa y UV en una sola longitud de onda medida por un espectrómetro de masas cuadrupolo único ZQ, con electroproyección de iones positivos y negativos y un detector de longitud de onda dual en un LCMS de FractionLynx de Waters.
Espectroscopia1H RMN: Los datos de espectros 1H RMN informados se adquirieron en un espectrómetro Bruker Avance III a 400 MHz. Los picos centrales de cloroformo-c/, dimetilsulfóxido-afe o un patrón interno de tetrametilsilano se usaron como referencia.
Ejemplos
Ejemplo 1 (ejemplo que utiliza un compuesto de fórmula XVI según se define en las reivindicaciones adjuntas) 3-((4-((4-(3-(5-(terc.-butil)-2-metoxi-3-(metilsulfonamido)fenil)ureido)naftalen-1-il)oxi)pirimidin-2-il)amino)-5-etinil-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)benzamida
(Compuesto I)
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(i) 3-bromo-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)-5-nitrobenzamida
T3P, 50 % en peso en EtOAc (25 mL, 42.0 mmol) se añadió lentamente a una solución de ácido 3-bromo-5-nitrobenzoico (7,05 g, 28,7 mmol), 2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etanamina (4 g, 24,25 mmol) y Et3N (12 mL, 86 mmol) en EtOAc (50 mL) mientras se sumerge en un baño de hielo. Una vez que la adición se completó, el baño de hielo se retiró y la reacción se dejó agitar a ta durante 2 h. La mezcla se repartió entre solución ac. sat. de NaHCO3 (100 mL) y EtOAc (100 mL). La capa orgánica se lavó con solución ac. de K2CO3 (10 g en 100 mL) y salmuera (100 mL), antes de secarse (MgSO4), se filtró y concentró en vacío para proporcionar el compuesto del subtítulo (8,23 g) en forma de un aceite marrón.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) ó 9,02 (t, 1H), 8,65-8,64 (m, 1H), 8,53 (t, 1H), 8,46 (t, 1H), 3,57-3,43 (m, 10H), 3,41-3,38 (m, 2H), 3,21 (s, 3H).
LCMS m/z 391/393 (M+H)+ (ES+); 389/391 (M-H)-(ES-)
(ii) 3-amino-5-bromo-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)benzamida
Polvo de hierro (5,90 g, 106 mmol) se agregó a una solución del producto de la etapa (i) anterior (8,24 g, 20,43 mmol) y HCl concentrado (2 mL, 23,40 mmol) en EtOH (65 mL) y agua (15 mL). La mezcla se calentó a 75 °C (temperatura de bloque) durante 1 h. Luego, la reacción se enfrió a temperatura ambiente, antes de ser diluida con agua (30 mL), se filtró y se concentró en vacío. El residuo se basificó (NaHCO3) y luego se dividió entre EtOAc (350 mL) y agua (275 mL). La capa orgánica se secó (MgSO4), se filtró y concentró en vacío para proporcionar un aceite naranja que se purificó por cromatografía en gel de sílice (columna de 220 g, MeOH al 0-5 % en DCM) para proporcionar el compuesto del subtítulo (5,25 g) en forma de un aceite naranja.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) ó: 8,36 (t, 1H), 7,07 (t, 1H), 7,00-6,99 (m, 1H), 6,84 (t, 1H), 5,57 (s, 2H), 3,52-3,48 (m, 8H), 3,42-3,39 (m, 2H), 3,35 (q, 2H), 3,22 (s, 3H).
LCMS m/z 361/363 (M+H)+ (ES+)
(iii) 3-amino-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)-5-((triisopropilsilil)etinil)benzamida
A una solución desgasificada del producto de la etapa (ii) anterior (5,06 g, 13,31 mmol), etiniltriisopropilsilano (4,5 mL, 20,06 mmol), Cu(I)I (130 mg, 0,683 mmol) y Et3N (8 mL, 57,4 mmol) en DMF (45 mL) se añadió Pd(PPh3)4 (770 mg, 0,666 mmol). La reacción se calentó a 85 °C durante 3 h, antes de ser enfriada a ta y repartida entre EtOAc (250 mL) y salmuera (250 mL). La fase acuosa se extrajo además con EtOAc (250 mL), luego los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (3 x 200 mL) y salmuera (200 mL), antes de que se secaran (MgSO4), se filtraran y se concentraran en vacío para producir un aceite marrón oscuro. El producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (columna de 220 g, MeOH al 0-3 % en DCM) para proporcionar el compuesto del subtítulo (5,4 g) en forma de un aceite naranja.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) ó: 8,39 (t, 1H), 7,06-7,03 (m, 2H), 6,79-6,78 (m, 1H), 5,43 (s, 2H), 3,54-3,49 (m, 8H), 3,41­ 3,33 (m, 4H), 3,21 (s, 3H), 1,10 (s, 21H).
LCMS m/z 463 (M+H)+ (ES+)
(iv) 3-amino-5-etinil-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)benzamida
A una solución agitada del producto de la etapa (iii) anterior (5,33 g, 11,40 mmol) en EtOAc (75 mL) se agregó TBAF 1M en THF (11,40 mL, 11,40 mmol). La reacción se agitó a ta durante 1 h, antes de ser repartida entre agua (300 mL) y EtOAc (400 mL), la fase acuosa que se extrajo adicionalmente con EtOAc (300 mL). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (400 mL), antes de secarse (MgSO4), se filtraron y concentraron para proporcionar un aceite naranja. El producto bruto se disolvió en la mínima cantidad de MeOH y se cargó sobre SCX. La columna se eluyó con MeOH (3 volúmenes de columna) seguido por NH3 al 1 % en MeOH (3 volúmenes de columna). El producto que contiene la fracción se concentró en vacío para proporcionar el compuesto del subtítulo (3,27 g) en forma de un aceite marrón.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) ó: 8,38 (t, 1H), 7,06-7,04 (m, 2H), 6,75-6,74 (m, 1H), 5,46 (s, 2H), 4,09 (s, 1H), 3,53-3,48 (m, 8H), 3,41-3,39 (m, 2H), 3,37-3,33 (m, 2H), 3,21 (s, 3H).
LCMS m/z 307 (M+H)+ (ES+)
(v) (4-((2-((3-etinil-5-((2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)carbamoil)-fenil)amino)pirimidin-4-il)oxi)naftalen-1-il)carbamato de terc.-butilo
A una solución agitada del producto de la etapa (iv) anterior (1 g, 3,13 mmol) y (4-((2-cloropirimidin-4-il)oxi)naftalen-1-il)carbamato de terc.-butilo (véase, por ejemplo, Ito, K. et al., documento WO 2010/067130, 17 de junio de 2010; 777 mg, 2,090 mmol) en DMF (60 mL) se añadió pTSA monohidrato (200 mg, 1,051 mmol). La solución resultante se agitó a 60 °C durante 72 h. La reacción se enfrió a ta y repartió entre EtOAc (150 mL) y NaHCO3 acuoso saturado (100 mL). La capa acuosa se extrajo además con EtOAc (2 x 150 mL), luego los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (3 x 200 mL) y salmuera (200 mL), antes de secarse (MgSO4), se filtraron y concentraron para proporcionar un aceite naranja (1,17 g). El producto bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (columna de 80 g, MeOH al 0,5 % en EtOAc) para proporcionar el compuesto del subtítulo (552 mg) en forma de una espuma marrón clara.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) ó: 9,73 (s, 1H), 9,29 (s, 1H), 8,46-8,43 (m, 2H), 8,11-8,09 (m, 2H), 7,92-7,88 (m br, 1H), 7,83-7,80 (m, 1H), 7,62-7,53 (m, 3H), 7,56-7,55 (m, 1H), 7,42 (d, 1H), 6,57 (d, 1H), 4,14 (s, 1H), 3,54-3,48 (m, 8H), 3,40­ 3,35 (m, 4H), 3,20 (s, 3H), 1,52 (s, 9H).
LCMS m/z 642 (M+H)+ (ES+)
(vi) 3-((4-((4-aminonaftalen-1-il)oxi)pirimidin-2-il)amino)-5-etinil-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)benzamida
A una solución agitada del producto de la etapa (v) anterior (540 mg, 0,825 mmol) en DCM (8 mL) se agregó TFA (3,2 mL, 41,5 mmol). La reacción se agitó a ta durante 1 h. La solución se concentró en vacío y el aceite resultante se disolvió en el mínimo de MeOH y se cargó en SCX. La columna se eluyó con MeOH (3 volúmenes de columna) y luego NH3 al 1 % en MeOH (3 volúmenes de columna). La porción que contiene el producto se concentró en vacío para proporcionar el compuesto de subtítulo (405 mg) en forma de una espuma marrón clara.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) ó: 9,73 (s, 1H), 8,45 (t, 1H), 8,36 (d, 1H), 8,14-8,10 (m, 1H), 8,07-8,05 (m br, 1H), 7,94-7,92 (m br, 1H), 7,65-7,61 (m, 1H), 7,47-7,40 (m, 3H), 7,15 (d, 1 h), 6,72 (d, 1H), 6,37 (d, 1H), 5,87 (s br, 2H), 4,17 (s, 1H), 3,54­ 3,48 (m, 8H), 3,40-3,36 (m, 4H), 3,20 (s, 3H).
LCMS m/z 542 (M+H)+ (ES+)
(vii) (5-(terc.-butil)-2-metoxi-3-(metilsulfonamido)fenil)carbamato de fenilo (un compuesto de fórmula XVI según se define en las reivindicaciones adjuntas)
Cloroformiato de fenilo (0,5 mL, 3,99 mmol) se añadió a una solución de N-(3-amino-5-(terc.-butil)-2-metoxifenil)metanosulfonamida (véase, por ejemplo, Cirillo, P. F. et al., documento WO 2002/083628, 24 de octubre de 2002; 1 g, 3,67 mmol) y NaHCO3 (620 mg, 7,38 mmol) en THF (10 mL) y DCM (10 mL). La mezcla se agitó durante 2 h y luego se agregó agua (20 mL). La capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y evaporó para dar una espuma marrón, que se agitó en ciclohexano (20 mL) para proporcionar el compuesto del subtítulo (1,4 g) en forma de un sólido incoloro.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) ó 9,49 (s, 1H), 9,14 (s, 1H), 7,56 (s, 1H), 7,50-7,37 (m, 2H), 7,31-7,13 (m, 4H), 3,77 (s, 3H), 3,06 (s, 3H), 1,25 (s, 9H)
LCMS m/z 393 (M+H)+ (ES+); 391 (M-H)-(ES-)
(viii) 3-((4-((4-(3-(5-(terc.-butil)-2-metoxi-3-(metilsulfonamido)fenil)ureido)-naftalen-1-il)oxi)pirimidin-2-il)amino)-5-etinil-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)-etil)benzamida
Una mezcla agitada de (5-(terc.-butil)-2-metoxi-3-(metilsulfonamido)fenil)-carbamato de fenilo (véase la etapa 1 (vi) anterior; 95 mg, 0,239 mmol), el producto de la etapa (vi) anterior (120 mg, 0,217 mmol) y Et3N (6 pL, 0,043 mmol) en i-PrOAc (3 mL) se calentó a 70 °C durante la noche. La reacción se enfrió a ta y se concentró en vacío. El resto se purificó por cromatografía en gel de sílice (columna de 40 g, MeOH al 0-5 % en EtOAc) para proporcionar un aceite, el cual se trituró con dietil éter para proporcionar un sólido beige claro. El producto bruto se purificó por HPLC preparativa (Varian, Basic (bicarbonato de amonio 10 mM), columna X-Bridge Prep-C18, 5 pm, 19 x 50 mm de Waters, MeCN al 35-70 % en agua) para proporcionar el compuesto del título (69 mg) en forma de un sólido blancuzco.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) ó: 9.74 (s, 1H), 9.32 (s, 1H), 9.13 (s, 1H), 8.89 (s, 1H), 8.46-8.43 (m, 2H), 8.26 (d, 1H), 8.17 (d, 1H), 8.09-8.07 (m, 2H), 7.87-7.83 (m, 2H), 7.69-7.65 (m, 1H), 7.61-7.57 (m, 1H), 7.45-7.43 (m, 2H), 7.02 (d, 1H), 6.55 (d, 1 h), 4.11 (s, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.53-3.47 (m, 8H), 3.40-3.35 (m, 4H), 3.20 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 1.26 (s, 9H).
LCMS m/z 840 (M+H)+ (ES+); 838 (M-H)-(ES-)
Ejemplo 2 (ejemplo que utiliza un compuesto de fórmula XVI según se define en las reivindicaciones adjuntas) 3-((4-((4-(3-(5-(terc.-butil)-2-metoxi-3-(metilsulfonamido)fenil)ureido)naftalen-1-il)oxi)pirimidin-2-il)amino)-5-etinil-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)benzamida (Compuesto I)
(i) 3-bromo-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)-5-nitrobenzamida
A un matraz de 10 L, equipado con un purificador bajo nitrógeno, se añadió ácido 3-bromo-5-nitrobenzoico (2686 g, 10,91 mol) y cloruro de tionilo (5,37 L, 75,8 mol). La reacción se calentó a 68 °C [DESPRENDIMIENTO DE GAS] y luego se agitó a 60 °C durante la noche, después de lo cual el análisis de LC indicó la reacción completa. La reacción se enfrió a ta y se concentró en vacío para proporcionar 3,2 kg de material, una cantidad que indicó la presencia de cloruro de tionilo (100 % de rendimiento = 2,88 kg). La mezcla se concentró en tolueno (2 x 3 L) para eliminar todas las trazas de cloruro de tionilo. Se obtuvo un total de 3370 g de cloruro de ácido, con tolueno que cuenta para el rendimiento en exceso.
A un matraz de 20 L bajo nitrógeno se añadió 2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etanamina (890 g, 5.45 mol) y DCM (3,5 L). Esto fue seguido de la adición de NaHCO3 acuoso al 8 % (9 L). El cloruro de ácido (1373 g activo, 4,89 mol) se agregó luego a la mezcla mientras la temperatura se mantenía por debajo de 25°C [EXOTERMIA Y DESPRENDIMIENTO DE GAS]. La mezcla se agitó durante 30 min, después de lo cual la Lc indicó la reacción completa. Los componentes orgánicos se separaron y se lavaron con HCl 1 M (4,5 L) y NaHCO3 ac. al 8 % (4,5 L), antes de que se secaran, se filtraran y se concentraran en vacío para dar un total de 1956 g del compuesto del subtítulo (95 % de rendimiento). El análisis por 1H RMN indicó una pureza del producto > 95 %.
(ii) 3-amino-5-bromo-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)benzamida
El producto de la etapa (I) anterior (1 kg, 2,56 mol) se disolvió en THF (3,5 L) y AcOH (500 mL) y se hidrogenó a 3 MPa (30 bares) de H2 hasta 60 °C con Pt al 5 %/C (30 g del tipo JM 18 MA, 55 % de agua). El análisis después de 5 h mostró una relación 1:1 de ArNHOH y ArNH2. La reacción alcanzó la compleción después de dejarse durante la noche, mostrando el análisis de 1H RMN 3 % de producto secundario des-bromo. El catalizador se separó por filtración, después el residuo se diluyó con acetato de etilo (3 L) y se lavó con solución de carbonato de potasio al 20 % (3,5 L). Los componentes orgánicos se secaron entonces, se filtraron y concentraron en vacío para proporcionar un residuo que luego se suspendió en 5 volúmenes de dietil éter durante la noche para reducir el nivel de especies des-bromo (< 2 % después de la suspensión). El compuesto del subtitulo se obtuvo en un 90 % de rendimiento con una pureza de 86 % por LC.
(iii) 3-amino-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)-5-((triisopropilsilil)etinil)benzamida
A un matraz de 10 L bajo nitrógeno se agregó el producto de la etapa (II) anterior (700 g, 1,93 mol) y THF (5,59 L). Esto fue seguido por la adición de CuI (19,2 g, 0,1 mol), trietilamina (1,29 L, 9,27 mol) y etiniltriisopropilsilano (389 g, 2,13 mol). La reacción se desgasificó y se purgó con nitrógeno tres veces. Se añadió Pd(PPh3)4 (125,5 g, 0,198 mol) y la reacción se desgasificó y purgó con nitrógeno. La reacción se calentó a 65 °C durante la noche, después de lo cual la LC indicó 91 % de producto y < 1 % de material de partida. La mezcla de reacción se concentró en vacío, luego el residuo se recogió en acetato de etilo (2 L) y se colocó a través de un tapón de sílice (2 kg), eluyendo con acetato de etilo adicional (30 L). Las fracciones que contenían el producto se concentraron en vacío y luego el producto bruto se disolvió en TBME (5 L) y se extrajo con HCl 6 N (5 L). La fase acuosa de HCl se lavó con TBME (2 x 5 L), antes de ser basificada con NaOH 6 N a pH 9-10. El producto se extrajo entonces con TBME (2 x 5 L), los componentes orgánicos se secaron, se filtraron y concentraron en vacío para dar 635 g del compuesto del subtítulo con una pureza de > 95 % por 1H RMN (excluyendo los disolventes).
(iv) 3-amino-5-etinil-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)benzamida
Al producto de la etapa (III) anterior (1200 g, 2,59 mol) en MeCN (8,8 L) se agregó CsF (433,6 g, 2,85 mol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, después de lo cual el análisis por HPLC mostró 1,7 % de producto y 97,4 % de material de partida. Se cargó CsF adicional (420 g, 2,76 mol) y la reacción se agitó a TA durante la noche, tras lo cual el análisis por HPLC reveló 91,0 % de producto y 4,4 % de material de partida. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró en vacío para dar el material que era 92,5 % de producto, 0,7 % de material de partida por HPLC. El residuo se disolvió en DCM (3 L) y EtOAc (3 L), antes de ser dividido en dos porciones iguales. Cada una de las porciones se hizo pasar a través de una almohadilla de sílice (1,6 kg), eluyendo con EtOAc (50 L).
Los filtrados se combinaron y concentraron en vacío. El material bruto se lavó con heptano (2 x 4 L) para eliminar impurezas de sililo. Se aisló un total de 719 g del compuesto del subtítulo (83 % de ensayo por 1H r Mn , 75 % de rendimiento activo, 597 g de activo).
(v) (4-((2-((3-etinil-5-((2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)carbamoil)-fenil)amino)pirimidin-4-il)oxi)naftalen-1-il)carbamato de terc.-butilo
Bajo N2 se cargó el producto de la etapa (IV) anterior (301,2 g, 250,0 g de activo, 0,816 mol), (4-((2-cloropirimidin-4-il)oxi)naftalen-1-il)carbamato de terc.-butilo (véase, por ejemplo, Ito, K. et al., documento WO 2010/067130, 17 de junio de 2010; 252,8 g, 0,680 mol), PTSA.H2O (24,7 g, 0,130 mol) y THF (7600 mL). La solución rojo oscura se calentó a reflujo durante 6 h y luego se enfrió a temperatura ambiente, después de lo cual el análisis por HPLC indicó 0,25 % de producto de la etapa (iv), 22,24 % de producto de la etapa (VI), 8,98 % de material de partida de cloropirimidina y 64,08 % del producto de la etapa (v). Se cargó el producto adicional de la etapa (iv) anterior (27,1 g, 22,5 g de activo, 73,4 mmol) y la reacción se calentó nuevamente a reflujo y se agitó durante la noche, revelando posteriormente el análisis por HPLC 0,20 % del producto de la etapa (iv), 30,23 % del producto de la etapa (vi), 4,50 % de cloropirimidina de partida y 58,61 % de producto de la etapa (v).
La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se extinguió con K2CO3 al 20 % (735 mL), luego las capas se separaron, lavándose la capa orgánica con salmuera saturada (880 mL). La capa orgánica se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró para aislar un sólido viscoso marrón. Rendimiento = 491,2 g (93,8 %). La HPLC reveló 30,59 % del producto de la etapa (VI) y 59,50 % del producto de la etapa (v), confirmando 1H RMN la estructura.
(vi) 3-((4-((4-aminonaftalen-1-il)oxi)pirimidin-2-il)amino)-5-etinil-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)benzamida
Bajo N2 se cargó la mezcla del producto bruto de la etapa (v) anterior (491,2 g) y DCM (3700 mL). Se añadió gota a gota TFA (695 mL, 12,3 equivalentes), mientras la temperatura se mantenía por debajo de 20 °C. La solución marrón oscura se agitó a temperatura ambiente durante la noche, después de lo cual el análisis por HPLC indicó 86,90 % de producto de la etapa (vi) y 0,94 % de producto de la etapa (v). La mezcla se concentró y el residuo se recogió en EtOAc (3700 mL), antes de ser lavado con NaHCO3 sat. ac. (2 x 2000 mL) hasta que se alcanzó un pH de 7-8. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró para aislar un sólido púrpura. Rendimiento = 360,8 g. Pureza por HPLC 78.58 %.
(vii) 5-terc.-butil-2-metoxi-3-nitroanilina
Bajo N2 se cargó 4-íerc.-butil-2,6-dinitroanisol (620 g, 2,439 mol), IMS (4774 mL) y Pd al 10 %/C (31,8 g). La mezcla de reacción se calentó a reflujo (78 °C) y se añadió gota a gota a lo largo de 4,5 h 4-metil-1 -ciclohexeno (500 mL, 4,159 mol). La reacción se agitó a reflujo durante la noche, tras lo cual el análisis por HPLC indicó 72,13 % de producto y 27,17 % de material de partida. Se añadió gota a gota a lo largo de 3 h 4-metil-1 -ciclohexeno adicional (160 mL, 1,331 mol) y la reacción se agitó a reflujo durante 72 h. El análisis por HPLC indicó 92,72 % de producto y 0 % de material de partida. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y el catalizador se eliminó vía filtración en vacío y se lavó con IMS (500 mL). Los disolventes se concentraron a aprox. 1200 mL para dar una relación de 1:4,45 de producto:etanol (objetivo 1 : 5). HCl 2 M (124 mL) se cargó gota a gota al resto mientras la temperatura se mantenía por debajo de 23 °C. Se cargó agua (3100 mL) y la suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h. El sólido se recogió via filtración en vacío y se lavó con agua (2 x 1000 mL). Las agujas naranja resultantes se secaron, en vacío, a 40 °C durante la noche. Rendimiento = 475,2 g (86,9 %). Pureza > 97 % por 1H RMN. Pureza por HPLC 98,8 %. KF 0,36 %.
(viii) N-(5-terc.-butil-2-metoxi-3-nitrofenil)metanosulfonamida
Bajo N2 se cargó el producto de la etapa (vii) (471 g, 2,099 mol), tolueno (1880 mL) y piridina (471 mL), luego se añadió gota a gota a lo largo de 1 h cloruro de metanosulfonilo (179 mL) mientras la temperatura se mantenía por debajo de 35 °C. La reacción se agitó a 30-35 °C durante la noche, antes de ser enfriada por debajo de 20 °C y luego se cargaron agua (1880 mL) y HCl 2 M (1880 mL) (pH 3 alcanzado). Se separaron las capas y la fase orgánica se lavó con 2,5 % de salmuera (1880 mL). Luego se cargó heptano (3760 mL) a la capa orgánica a lo largo de 0,5 h para aislar un precipitado. La mezcla se enfrió a 0 °C y se agitó durante 1 h. El sólido se recogió via filtración en vacío y se lavó con heptano (1880 mL), antes de secar, en vacío, a 40 °C durante la noche. Rendimiento = 551 g (87 %). Pureza HPLC 98,5 % Pureza > 97 % por 1H RMN.
(ix) N-(3-amino-5-terc.-butil-2-metoxifenil)metanosulfonamida
A un hidrogenador de 5 L se cargó el producto de la etapa (viii) anterior (209,4 g, 0,693 mol), metanol (1675 mL, 8 volúmenes) y Pd al 10 %/C (10,2 g). El recipiente se purgó con 3 x N2 y 3 x H2 y luego se agitó bajo 0,3447 MPa (50 psi-3,45 bares) de H2 hasta que no se observó exoterma adicional, indicando la HPLC un 96,35 % de producto y 1,10 % de material de partida. La reacción se diluyó con THF (314 mL) y el catalizador se eliminó vía filtración en vacío (filtro Cuno), antes de que se lavara con THF (1000 mL). Los disolventes se concentraron para aislar un sólido marrón claro, que se secó en vacío a 40 °C durante la noche. Rendimiento = 167,0 g (88,5 %). Pureza por HPLC 96,7 % Pureza > 95 % por 1H RMN.
(x) N-[5-terc.-butil-3-(metanosulfonamido)-2-metoxifenil1carbamato de fenilo (un compuesto de fórmula XVI según se define en las reivindicaciones adjuntas)
Bajo N2 se cargó el producto de la etapa (ix) anterior (167,0 g, 613 mmol), NaHCO3 (77,3 g, 920 mmol), THF (870 mL) y DCM (1440 mL). Se añadió gota a gota cloroformiato de fenilo (82,6 mL, 659 mmol), mientras la temperatura se mantenía por debajo de 20 °C, y la reacción se agitó a temperatura ambiente para durante 4 h. El análisis por HPLC de la mezcla de reacción indicó 98,6 % de producto y 0,03 % de material de partida. La mezcla de reacción se filtró y la torta se lavó con THF (~50 mL). El filtrado se concentró a ~900 mL y se agregó ciclohexano (2400 mL) y luego la mezcla se dejó agitar durante la noche. El sólido resultante se recogió vía filtración en vacío y se lavó con ciclohexano (500 mL). El sólido rosa pálido producido se secó, en vacío, a 40 °C durante 4 h. Rendimiento = 232,6 g (96,7 %). Pureza por HPLC 94,5 % Pureza por 1H RMN > 95%.
(xi) 3-((4-((4-(3-(5-(terc.-butil)-2-metoxi-3-(metilsulfonamido)fenil)ureido)naftalen-1-il)oxi)pirimidin-2-il)amino)-5-etinil-N-(2-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)etil)benzamida
Bajo N2 se cargó el producto de la etapa (vi) anterior (175,5 g, 0.324 mol), el producto de la etapa (x) anterior (145,0 g, 0,369 mmol) e /PrOAc (8800 mL). La solución resultante se calentó a 60 °C y NEt3 (9,3 mL) se cargó en una porción, luego la mezcla se dejó agitar a 60 °C durante la noche, tras lo cual el análisis por HPLC indicó un 25,77 % de producto de la etapa (vi), 3,60 % de producto de la etapa (x) y 57,85 % de producto de la etapa (xi). Se cargó producto adicional de la etapa (x) (36,0 g, 0,092 mol) y luego la reacción se dejó agitar a 60 °C durante la noche, tras lo cual el análisis por HPLC indicó 5,47 % de producto de la etapa (vi), 3,72 % de producto de la etapa (x) y 73,33 % de producto de la etapa (xi). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, antes de ser concentrada para aislar un sólido púrpura oscuro (522,9 g). Este sólido se recristalizó en acetonitrilo (2615 mL, 5 volúmenes), antes de recogerse vía filtración en vacío y se lavó con /PrOAc (2 x 500 mL). El sólido rosa obtenido se secó, en vacío a 40 °C durante la noche, produciendo 181,1 g (66,5 %) del compuesto del título con pureza por HPLC de 99,27,%. La 1H RMN se conformó a la estructura.
Pruebas Biológicas: Métodos Experimentales
Ensayos de Unión de Enzima (Kinomescan)
Actividades de enlace de enzima quinasa de compuestos descritos aquí pueden determinarse usando un ensayo patentado que mide la unión de competencia activa dirigida al sitio a un ligando inmovilizado (Fabian, M.A. et al., Nature Biotechnol., 2005, 23:329-336). Estos ensayos pueden realizarse por DiscoverX (antes Ambit; San Diego, CA). El porcentaje de inhibición producido por incubación con un compuesto de prueba puede calcularse con respecto al control no inhibido.
Ensayo de Inhibición de Enzima
Las actividades inhibitorias enzimáticas de compuestos descritos aquí se determinan por FRET utilizando péptidos sintéticos marcados con fluoróforos donantes y aceptores (Z-LYTE, Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido).
Inh/b/c/ón de la enz/ma MAPKa p38
Las siguientes dos variantes de ensayo se pueden usar para la determinación de la inhibición de MAPKa p38.
Método 1
Las actividades inhibidoras de compuestos de prueba contra la isoforma MAPKa p38 (MAPK14: Invitrogen) se evalúan indirectamente al determinar el nivel de activación/fosforilación de la molécula aguas abajo, MAPKAP-K2. La proteína MAPKa p38 (80 ng/mL, 2,5 pL) se mezcla con el compuesto de prueba (2,5 pL de 4 pg/mL, 0,4 pg/mL, 0,04 pg/mL o 0,004 pg/mL) durante 2 h a TA. La solución mezclada (2,5 pL) de MAPKAP-K2 objetivo inactivo p38a (Invitrogen, 600 ng/mL) y péptido FRET (8 pM; un objetivo de fosforilación de MAPKAP-K2) se agrega entonces y la reacción de quinasa se inicia mediante la adición de ATP (40 pM, 2,5 pL). La mezcla se incuba durante 1 h a TA. Se añade reactivo de desarrollo (proteasa, 5 pL) durante 1 h antes de la detección en un lector de microplacas de fluorescencia (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific).
Método 2
Este método sigue las mismas etapas que el Método 1 anterior, pero utiliza una concentración más alta de la proteína MAPKa p38 (2,5 pL de 200 ng/mL de proteína en vez de 2,5 pL de 80 ng/mL de proteína) para mezclar con el compuesto de prueba (analizado en 1 pg/mL, 0,1 pg/mL, 0,01 pg/mL o 0,001 pg/mL).
Inh/b/c/ón de la enz/ma MAPKy p38
Las actividades inhibidoras del compuesto de fórmula I contra p38MAPKY (MAPK12: Invitrogen) se evalúan de manera similar a la que se describe aquí anteriormente. La enzima (800 ng/mL, 2,5 pL) se incuba con el compuesto de prueba (2,5 pL de 4 pg/mL, 0,4 pg/mL, 0,04 pg/mL o 0,004 pg/mL) durante 2 h a TA. El péptido FRET (8 pM, 2,5 pL) y solución de ATP adecuada (2,5 pL, 400 pM) se añaden luego a las mezclas de enzima/compuesto y el conjunto se incuba durante 1 h. El reactivo de desarrollo (proteasa, 5 pL) se añade durante 1 h antes de la detección en un lector de microplacas de fluorescencia (Varioskan® Flash, Thermo Scientific).
Inhibición de la enz/ma c-Src y Syk
Las actividades inhibidoras del compuesto de fórmula I contra enzimas c-Src y Syk (Invitrogen) se evalúan de manera similar a la que se describe aquí anteriormente. La enzima relevante (3000 ng/mL o 2000 ng/mL, respectivamente, 2,5 pL) se incuba con el compuesto de prueba (1 pg, 0,1 pg, 0,01 pg o 0,001 pg, 2,5 pL cada una) durante 2 h a TA. Los péptidos FRET (8 pM, 2,5 pL) y soluciones de ATP adecuadas (2,5 pL, 800 pM para c-Src y 60 pM ATP para Syk) y después se añaden a las mezclas de enzimas/compuestos y la mezcla se incuba durante 1 h. Se añade el reactivo de desarrollo (proteasa, 5 pL) durante 1 h antes de la detección en un lector de microplacas de fluorescencia (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific).
Inhibición de la enzima GSK 3a
Las siguientes dos variantes de ensayo se pueden usar para la determinación de la inhibición de GSK 3a.
Método 1
Las actividades inhibidoras del compuesto de fórmula I contra la isoforma de enzima GSK 3a (Invitrogen) se evalúan al determinar el nivel de activación/fosforilación del péptido objetivo. La proteína GSK 3a (500 ng/mL, 2,5 mL) se mezcla con el compuesto de prueba (2,5 pL en 4 pg/mL, 0,4 pg/mL, 0,04 pg/mL o 0,004 pg/mL) durante 2 h a TA. El péptido FRET (8 pM, 2,5 pL), que es un objetivo de fosforilación para GSK3a, y ATP (40 pM, 2,5 pL) se añaden entonces a la mezcla de enzima/compuesto y la mezcla resultante se incuba durante 1 h. El reactivo de desarrollo (proteasa, 5 pL) se agrega durante 1 h antes de la detección en un lector de microplacas de fluorescencia (Varioskan ® Flash, ThermoFisher Scientific).
En todos los casos, la proteasa específica de sitio escinde el péptido no fosforilado y elimina la señal de FRET. Los niveles de fosforilación de cada una de las reacciones se calculan utilizando la relación de la emisión de cumarina (donante) sobre la emisión de fluoresceína (receptor), para las cuales las relaciones altas indican alta fosforilación y las relaciones bajas indican niveles bajos de fosforilación. El porcentaje de inhibición de cada una de las reacciones se calcula en relación con el control no inhibido y la concentración inhibidora al 50 %(valor CI50) se calcula después a partir de la curva de concentración-respuesta.
Método 2
Este método sigue las mismas etapas que el Método 1 anterior, pero utiliza un período más corto de la mezcla del compuesto de prueba (105 minutos en lugar de 2 horas) con la proteína GSK3-a. Además, las concentraciones del compuesto de prueba empleadas son de 10 pg/mL, 1 pg/mL, 0,1 pg/mL o 0,01 pg/mL.
Ensayos celulares
El compuesto de fórmula I se estudió usando uno o más de los siguientes ensayos.
(a) Inhibición de MAPKa p38 y Lck en células Jurkat
Células Jurkat T se cultivaron en medio de inanición (RPMI 1640 FBS al 5 %) durante 24 h antes del experimento. Las células se recolectaron y resuspendieron en 10 x 106 células/mL en medio de inanición y luego se colocaron en placas de 96 pocillos de fondo redondo a razón de 1 x 106 células/pocillo. Las diluciones en serie del compuesto de prueba se añadieron (concentración de 1 % de DMSO final) durante 2 h antes de la estimulación. Después de la pre-incubación con el compuesto, las células se estimularon con H2O2 (0,05 % final) durante 5 min. La reacción se detuvo por centrifugación a 2000 rpm (3 min, 4 °C), luego se eliminó el sobrenadante y se añadieron 100 pL de solución fix/perm fría (kit BD Fix/Perm n° 554714). Las placas se incubaron durante 20 min a 4 °C antes de la centrifugación y se lavaron con medio de lavado 1x suministrado (kit BD Fix/Perm n° 554714). Las células se tiñeron para fosfo-p38a (T180/182), suministrado por Cell Signalling Technology (9211 s), o fosfo-Lck (Y394), suministrado por R&D (MAB7500). Los anticuerpos se diluyeron a razón de 5 pg/mL (R&D) o 1:200 (Cell Signalling Technology) en medio de lavado, antes de ser incubados 1 h a 4 °C en la oscuridad. Después de 3 lavados repetidos con tampón de lavado enfriado con hielo, se añadió anticuerpo secundario (anti-conejo-FITC n° F1362 o anti-ratón-FITC n° F2883, ambos de Sigma) a una dilución de 1:1000 y se incubó por 1 h a 4 °C en la oscuridad. Las células se lavaron 3 veces en tampón de lavado y luego, después de un lavado final en PBS frío, se resuspendieron en 150 pL de PBS frío. Las células se analizaron por citometría de flujo utilizando BD Accuri C6.
(aa) Liberación de TNFa/IL-8 inducida por LPS en células d-U937
Células U937, una línea celular monocítica humana, se diferencian a células tipo macrófago mediante incubación con acetato miristato de forbol (PMA, 100 ng/mL) durante 48 a 72 h. Las células son previamente incubadas con concentraciones finales del compuesto de prueba durante 2 h y luego son estimuladas con 0,1 pg/mL de LPS (de E. Coli: 0111 :B4, Sigma) durante 4 h. El sobrenadante se recoge para la determinación de las concentraciones de TNFa e IL-8 por ELISA tipo sándwich (Duo-set, R&D systems). La inhibición de la producción de TNFa se calcula como un porcentaje del logrado por 10 pg/mL de BIRB796 para cada una de las concentraciones del compuesto de prueba mediante comparación con el control del vehículo. Se determina la concentración efectiva relativa al 50% (REC50) de la curva de concentración-respuesta resultante. La inhibición de la producción de IL-8 se calcula para cada una de las concentraciones del compuesto de prueba en comparación con el control del vehículo. La concentración inhibidora al 50 % (CI50) se determina a partir de la curva de concentración-respuesta resultante.
(b) Liberación de TNFa/IL-8 inducida con LPS en células PBMC
Células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs) de sujetos sanos son separadas de la sangre entera usando un gradiente de densidad (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare). Las PBMCs se siembran en placas de 96 pocillos y se tratan con el compuesto de fórmula I en la concentración deseada durante 2 horas antes de la adición de 1 ng/mL de LPS (Escherichia Coli 0111 :B4 de Sigma Aldrich) durante 24 horas en condiciones normales de cultivo de tejidos (37 °C, 5 % de CO2). Se recolecta el sobrenadante para la determinación de concentraciones de IL-8 y TNFa por ELISA de tipo sándwich (Duo-set, R&D systems) y se lee con el lector de microplacas de fluorescencia (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific). La concentración al 50% de inhibición (CI50) de producción de IL-8 y TNFa se calcula a partir de la curva de dosis-respuesta.
(c) Liberación de IL-2 e IFN gamma en células PBMC estimuladas con CD3/CD28
PBMCs de sujetos sanos son separadas de la sangre entera usando un gradiente de densidad (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare). Las células se agregan a una placa de 96 pocillos pre-recubierta con una mezcla de anticuerpos monoclonales CD3/CD28 (0,3 pg/mL eBioscience y 3 pg/mL de BD Pharmingen, respectivamente). El compuesto en la concentración deseada se añade entonces a los pocillos y la placa se deja 3 días bajo condiciones de cultivo de tejido normales. Los sobrenadantes se recolectan y la liberación de IL-2 e IFN gamma se determina por ELISA de tipo sándwich (Duo-set, R&D system). La CI50 se determina a partir de la curva de dosis-respuesta.
(d) Liberación de IL-8 inducida por IL-1B en células HT29
Células HT29, una línea celular de adenocarcinoma de colon humano, se siembran en una placa de 96 pocillos (24 h) y se pre-tratan con el compuesto de fórmula I en la concentración deseada durante 2 horas antes de la adición de 5 ng/mL de IL-1 p (Abcam) durante 24 horas. Los sobrenadantes se recolectan para la cuantificación de IL-8 por ELISA de tipo sándwich (Duo-set, R&D system). La CI50 se determina a partir de la curva de dosis-respuesta.
(e) Liberación de TNFa e IL-8 inducida con LPS en macrófagos primarlos
PBMCs de sujetos sanos son separadas de la sangre entera usando un gradiente de densidad (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare). Las células se incuban durante 2 h y las células no adherentes se eliminan por lavado. Para diferenciar las células a macrófagos, las células se incuban con 5 ng/mL de GM-CSF (Peprotech) durante 7 días bajo condiciones de cultivo de tejido normales. El compuesto de fórmula I se agrega entonces a las células a la concentración deseada para un pretratamiento de 2 horas antes de la estimulación con 10 ng/mL de LPS durante 24 horas. Los sobrenadantes se recolectan y la liberación de IL-8 y TNFa se determina por ELISA tipo sándwich (Duo-set, R&D system). La CI50 se determina a partir de la curva de dosis-respuesta.
(f) Expresión ICAM-1 inducida por Poli I:C en células BEAS2B
Poli I:C se utiliza en estos estudios como un imitador de virus de ARN, simple. La mezcla Poli I: C-Oligofectamina (1 pg/mL de Poli I: C, ± Oligofectamina al 2 %, 25 pL; Invivogen Ltd., San Diego, CA e Invitrogen, Carlsbad, CA, respectivamente) es transfectada en células BEAS2B (células epiteliales bronquiales humanas, ATCC). Las células son pre-incubadas con concentraciones finales del compuesto de prueba durante 2 h y el nivel de expresión de ICAM1 en la superficie celular se determina por ELISA basada en células. En un momento de 18 h después de la transfección de Poli I: C, las células se fijan con formaldehído al 4 % en PBS y luego la peroxidasa endógena se enfría bruscamente mediante la adición de tampón de lavado (100 pL, Tween al 0,05 % en PBS: PBS-Tween) que contiene azida de sodio al 0,1 % y peróxido de hidrógeno al 1 %. Las células se lavan con tampón de lavado (3 x 200 pL), y después del bloqueo de los pocillos con 5 % de leche en PBS-Tween (100 pL) durante 1 h, las células se incuban con el anticuerpo ICAM-1 anti-humano (50 pL; Cell Signalling Technology, Danvers, MA) en BSA al 1 % PBS durante la noche a 4 °C.
Las células se lavan con PBS-Tween (3 x 200 pL) y se incuban con el anticuerpo secundario (100 pL; IgG anti-conejo conjugado con HRP, Dako Ltd., Glostrup, Dinamarca). Las células se incuban entonces con sustrato (50 pL) durante 2-20 min, seguido de la adición de solución de detención (50 pL, H2SO41 N). La señal de ICAM-1 se detecta mediante la lectura de la absorbancia a 450 nm contra una longitud de onda de referencia de 655 nm usando un espectrofotómetro. Las células se lavan luego con PBS-Tween (3 x 200 pl) y un número total de células en cada uno de los pocillos se determina mediante la lectura de absorbancia a 595 nm después de tinción con violeta cristal (50 pL de una solución al 2 % en PBS) y elución por solución al 1 % de SDS (100 pL) en agua destilada. Las lecturas de la DO a 450-655 medidas son corregidas por el número de células al dividir con la lectura de DO595 en cada uno de los pocilios. La inhibición de la expresión de ICAM-1 se calcula en cada una de las concentraciones del compuesto de prueba en comparación con el control del vehículo. La concentración inhibidora al 50 % (CI50) se determina a partir de la curva de concentración-respuesta resultante.
(g) Ensayo de mitosis celular
Mononucleocitos de la sangre periférica (PBMCs) de sujetos sanos se separan de la sangre entera (Quintiles, Londres, Reino Unido) usando un gradiente de densidad (Histopaque®-1077, Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido). Las PBMCs (3 millones de células por muestra) son tratadas posteriormente con PHA al 2% (fitohemaglutinina, Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido) durante 48 h, seguido de una exposición durante 20 h a concentraciones variables del compuesto de prueba. A las 2 h antes de la recolección, las PBMCs se tratan con demecolcina (0,1 pg/mL; Invitrogen, Paisley, Reino Unido) para detener las células en metafase. Para observar las células mitóticas, PBMCs son permeabilizadas y fijadas mediante la adición de Intraprep (50 pL; Beckman Coulter, Francia) y se tiñen con anti-fosfo-histona 3 (0,26 ng/L; n° 9701; Cell Signalling, Danvers, MA) y yoduro de propidio (1 mg/mL; Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido) como se describió previamente (Muehlbauer P.A. y Schuler M.J., Mutation Research, 2003, 537:117-130). Se observa la fluorescencia usando un citómetro de flujo ATTUNE (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), ligando los linfocitos. El porcentaje de inhibición de la mitosis se calcula para cada uno de los tratamientos en relación con el tratamiento del vehículo (DMSo al 0,5 %).
(h) Liberación de IL-8 inducida por Rinovirus y expresión de ICAM-1
El rinovirus humano RV16 se obtuvo de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las soluciones madre virales se generaron infectando células HeLa con HRV hasta que el 80 % de las células son citopáticas.
Células BEAS2B son infectadas con HRV en una MOI de 5 y se incubaron durante 2 h a 33 °C con agitación suave para promover la absorción. Las células se lavan entonces con PBS, se añaden medios recientes y las células se incuban durante 72 h adicionales. El sobrenadante se recolecta para el ensayo de las concentraciones de IL-8 usando un kit de desarrollo de ELISA Duoset (R&D systems, Minneapolis, MN).
El nivel de ICAM-1 que expresa la superficie celular se determina por ELISA basado en células. A las 72 h después de la infección, las células son fijadas con formaldehído al 4 % en PBS. Después de enfriar bruscamente la peroxidasa endógena mediante la adición de azida de sodio al 0,1 % y peróxido de hidrógeno al 1 %, los pocillos se lavaron con tampón de lavado (Tween al 0,05 % en PBS: PBS-Tween). Después de bloquear el pocillo con 5% de leche en PBS-Tween durante 1 h, las células se incubaron con anticuerpo ICAM-1 anti-humano en BSA al 5 % PBS-Tween (1: 500) durante la noche. Los pocillos se lavaron con PBS-Tween y se incubaron con el anticuerpo secundario (IgG anti-conejo conjugado con HRP, Dako Ltd.). La señal de ICAM-1 se detecta mediante la adición de sustrato y la lectura a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 655 nm usando un espectrofotómetro. Los pocillos se lavan entonces con PBS-Tween y se determinan los números totales de células en cada uno de los pocillos mediante la lectura de la absorbancia a 595 nm después de la tinción de violeta cristal y la elución con solución al 1 % de SDS. Las lecturas de DO450-655 medidas son corregidas por el número de células al dividir con la lectura de DO595 en cada uno de los pocillos. Los compuestos se añaden 2 h antes de la infección con HRV y 2 h después de la infección cuando se separa por lavado HRV no infectado.
(i) Valoración del Efecto Citopático (CPE) inducido por HRV16 en células MRC5
Células MRC5 se infectan con HRV16 en una MOI de 1 en DMEM que contiene FCS al 5 % y MgCl21,5 mM, seguido de incubación durante 1 h a 33 °C para promover la adsorción. Los sobrenadantes se aspiran, y luego se añaden los medios recientes seguido de incubación durante 4 días. Cuando sea apropiado, las células se pre-incuban con compuesto o DMSO durante 2 h, y los compuestos y DMSO se agregan otra vez después de la separación por lavado del virus.
Los sobrenadantes se aspiran y se incuban con solución de azul de metileno (100 pL, 2 % de formaldehído, 10 % de metanol y 0,175 % de azul de metileno) durante 2 h a TA. Después del lavado, se añade SDS al 1 % en agua destilada (100 pL) a cada uno de los pocillos, y las placas se agitan suavemente durante 1-2 h antes de la lectura de la absorbancia a 660 nm. Se calcula el porcentaje de inhibición para cada uno de los pocillos. Se calcula el valor de CI50 de la curva concentración-respuesta generada por las diluciones en serie de los compuestos de prueba.
(j) Carga de virus RSV in vitro en células epiteliales bronquiales primarias
Células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBEC) cultivadas en placas de 96 pocillos son infectadas con RSV A2 (Cepa A2, HPA, Salisbury, Reino Unido) en una MOI de 0,001 en medio LHC8:RPMI-1640 (50:50) que contiene cloruro de magnesio 15 mM y se incuba durante 1 h a 37 °C para la adsorción. Las células se lavan entonces con PBS (3 x 200 pL), luego se agrega medio reciente (200 pL) y se continúa la incubación durante 4 días. Cuando sea apropiado, las células se pre-incuban con el compuesto o DMSO durante 2 h, y luego se añaden otra vez después de la separación por lavado del virus.
Las células se fijan con formaldehído al 4% en solución de PBS (50 gL) durante 20 min, se lavan con WB (3 x 200 gL), (tampón de lavado, PBS que incluye BSA al 0,5 % y Tween-20 al 0,05 %) y se incuban con solución de bloqueo (5 % de leche condensada en PBS) durante 1 h. Las células se lavan entonces con WB (3 x 200 gL) y se incuban durante 1 h a TA con anticuerpo de proteína de fusión F anti-RSV (2F7) (40 gL; monoclonal de ratón, lote 798760, Cat. N° ab43812, Abcam) en BSA al 5 % en PBS-tween. Después del lavado, las células se incuban con una solución de anticuerpo secundario conjugado con HRP (50 gL) en BSA al 5 % en PBS-Tween (lote 00053170, Cat. N° P0447, Dako) y luego se añade el substrato TMB (50 gL; paquete de reactivo de sustrato, lote 269472, Cat. N° DY999, R&D Systems, Inc.). Esta reacción se detiene mediante la adición de H2SO42 N (50 pL) y la señal resultante se determina colorimétricamente (DO: 450 nm con una longitud de onda de referencia de 655 nm) en un lector de microplacas (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific).
Las células se lavan después y se aplica solución al 2,5 % de violeta cristal (50 gL; lote 8656, Cat. N° PL7000, Pro-Lab Diagnostics) durante 30 min. Después de lavar con WB, se añade SDS al 1 % en agua destilada (100 gL) se añade a cada uno de los pocillos y las placas se agitan ligeramente en el agitador durante 1 h antes de la lectura de la absorbancia a 595 nm. Las lecturas medidas de la DO450-655 se corrigen al número celular al dividir las lecturas de la DO450-655 por la DO595. Se calcula el porcentaje de inhibición para cada uno de los pocillos y se calcula el valor de CI50 de la curva de concentración-respuesta generada a partir de las diluciones en serie del compuesto.
(k) Ensayo de viabilidad celular: ensayo MTT
Células U937 diferenciadas son pre-incubadas con cada uno de los compuestos de prueba (concentración final 1 gg/mL o 10 gg/mL en 200 gL de los medios indicados más adelante) bajo dos protocolos: el primero durante 4 h en medio FCS al 5 % RPMI1640 y el segundo en medio FCS al 10 % RPMI1640 durante 24 h. El sobrenadante se reemplaza por nuevo medio (200 gL) y se agrega la solución madre de MTT (10 gL, 5 mg/mL) a cada uno de los pocillos. Después de la incubación durante 1 h, los medios se eliminan, se añade DMSO (200 gL) a cada uno de los pocillos y las placas se agitan suavemente durante 1 h antes de la lectura de la absorbancia a 550 nm. El porcentaje de pérdida de la viabilidad celular se calcula para cada uno de los pocillos en relación con el tratamiento con vehículo (DMSO al 0,5 %). Por consiguiente, un aumento aparente en la viabilidad celular para el tratamiento con fármaco con relación al vehículo se tabula como un porcentaje negativo.
(l) Ensayo de biopsia humana
Biopsias de la mucosa intestinal se obtienen de las regiones inflamadas del colon de pacientes con IBD. El material de la biopsia es cortado en trozos pequeños (2-3 mm) y se coloca sobre rejillas de acero en una cámara de cultivo de órganos a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 /95 % de O2 en medio libre de suero. El control de DMSO o compuesto de prueba en la concentración deseada se agregan al tejido y se incuban durante 24 h en la cámara de cultivo de órganos. El sobrenadante se recolecta para la determinación de los niveles IL-6, IL-8, IL-1 p y TNFa por ELISA R&D. El porcentaje de inhibición de la liberación de citoquinas por el compuesto de prueba se calcula con relación a la liberación de citoquinas determinada por el control de DMSO (100 %).
(m) Acumulación de B catenina en células d-U937
Células U937, una línea celular monocítica humana, se diferencian en células tipo macrófago mediante incubación con PMA; (100 ng/mL) durante entre 48 y 72 h. Las células se incuban entonces con concentraciones finales del compuesto de prueba o vehículo durante 18 horas. La inducción de p-catenina por el compuesto de prueba se detiene al reemplazar los medios con solución al 4 % de formaldehído.
La actividad de peróxido endógeno es neutralizada por la incubación con tampón de enfriamiento brusco (100 gL, 0,1 % de azida de sodio, 1 % de H2O2 en PBS con Tween-20 al 0,05 %) durante 20 min. Las células se lavan con tampón de lavado (200 pL; PBS que contiene Tween-20 al 0,05 %) y se incuban con solución de bloqueo (200 pL; 5 % de leche en PBS) durante 1 h, se vuelven a lavar con tampón de lavado (200 pL) y luego se incuban durante la noche con una solución de anticuerpo anti-p-catenina (50 gL) en BSA al 1 %/PBS (Bd , Oxford, Reino Unido).
Después de lavar con tampón de lavado (3 x 200 pL; PBS que contiene Tween-20 al 0,05 %), las células se incuban con una solución de anticuerpo secundario conjugado con HRP (100 gL) en BSA al 1 %/PBS (Dako, Cambridge, Reino Unido) y la señal resultante se determina colorimétricamente (DO: 450 nm con una longitud de onda de referencia de 655 nm) usando el sustrato TMB (50 pL; R&D Systems, Abingdon, Reino Unido). Esta reacción se detiene mediante la adición de solución de H2SO41 N (50 gL). Las células se lavan entonces con tampón de lavado y se aplica solución al 2 % de violeta cristal (50 |jL) durante 30 min. Después de lavar con tampón de lavado (3 x 200 pL), se añade SDS al 1 % (100 j L) a cada uno de los pocillos y las placas se agitan suavemente durante 1 h antes de medir la absorbancia a 595 nm (Varioskan Flash ®, Thermo Fisher Scientific).
Las lecturas de la DO450-655 medidas son corregidas por el número de células al dividir la DO450-655 por las lecturas de la DO595. El porcentaje de inducción para cada uno de los pocillos se calcula en relación con el vehículo, y la relación de inducción normalizada en comparación con la inducción producida por un control estándar que comprende el compuesto de Referencia N-(4-(4-(3-(3-terc.-butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5-il)ureido)naftalen-1-iloxi)piridin-2-il)-2-metoxiacetamida (1 pg/mL), que se define como unidad.
(n) Proflleraclón de células T
PBMCs de sujetos sanos se separan de la sangre entera usando un gradiente de densidad (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare). La fracción de linfocitos se enriquece primero en células CD4+ T mediante la clasificación de células magnética negativa según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec 130-091-155). Células CD4+ T sin tratamiento previo se separan entonces usando la selección magnética positiva de células CD45RA+ usando microesferas según las instrucciones del fabricante (130-045-901). Las células se siembran en placas de 2 x 105 células por pocillo en 100 j L de RPMI/FBS al 10 % en placa de fondo plano de 96 pocillos (Corning Costar). 25 j L del compuesto de prueba se diluyen a la concentración adecuada (8 veces la concentración final) en medio normal y se añade a los pocillos duplicados en la placa para lograr un intervalo de respuesta de dosis de 0,03 ng/mL - 250 ng/mL. Se añade DMSO como un control negativo. Las placas se dejan pre-incubar durante 2 horas antes de la estimulación con 1 pg/mL de anti-CD3 (OKT3; eBioscience). Después de 72 h, el medio en cada uno de los pocillos se reemplaza por 150 j L de medio reciente que contiene BrdU 10 j M (Roche). Después de 16 h, el sobrenadante se elimina, la placa se seca y las células se fijan mediante la adición de 100 j L de solución fijada/desnaturalizada a cada uno de los pocillos durante 20 min según las instrucciones del fabricante (Roche). Las placas se lavan una vez con PBS antes de la adición del anticuerpo de detección anti-BrdU y se incuban durante 90 min a temperatura ambiente. Las placas se lavan entonces suavemente 3 veces con el tampón de lavado suministrado y desarrollado por la adición de 100 j L de solución de sustrato. La reacción se detiene mediante la adición de 50 j L de H2SO41 M y se lee la absorbancia a 450 nm en un lector de placas (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific). La CI50 se determina a partir de la curva de dosis-respuesta.
(o) Liberación de IL-2 e IFNy en células LPMC estimuladas con CD3/CD28 de pacientes con IBD
Células mononucleares de la lámina propia (LPMC) se aíslan y purifican de la mucosa IBD inflamada de muestras quirúrgicas o de mucosa normal de muestras quirúrgicas como sigue: La mucosa es elimina de las capas más profundas de las muestras quirúrgicas con un bisturí y se cortan en fragmentos de un tamaño de 3-4 mm. El epitelio es eliminado por lavado de los fragmentos de tejido tres veces con EDTA 1 mM (Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido) en HBSS (Sigma-Aldrich) con agitación usando un agitador magnético, descartando el sobrenadante después de cada lavado. La muestra se trata posteriormente con colagenasa tipo 1A (1 mg/mL; Sigma-Aldrich) durante 1 h con agitación a 37 °C. La suspensión de células resultante se filtra entonces utilizando un filtro de células de 100 pm, se lava dos veces, se re-suspende en medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) que contiene suero de bovino fetal al 10 %, 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina, y se utiliza para el cultivo celular.
LPMCs aisladas recientemente (2 x 105 células/pocillo) se estimulan con 1 pg/mL de a-CD3/a-CD28 durante 48 h en presencia de concentraciones adecuadas o control de DMSO del compuesto. Después de 48 h, el sobrenadante se elimina y se analiza para detectar la presencia de TNFa e IFNy por ELISA R&D. El porcentaje de inhibición de la liberación de citoquinas por el compuesto de prueba se calcula en relación con la liberación de citoquinas determinada por el control de DMSO (100 %).
(p) Inhibición de la liberación de citoquinas de miofibroblastos aislados de pacientes con IBD
Miofibroblastos de mucosa IBD inflamada se aíslan como sigue:
La mucosa se disecciona y se desecha y muestras de mucosa de un tamaño de 1 mm se cultivan a 37 °C en una incubadora de CO2 humidificada en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich) complementado con FBS al 20 %, 1 % de amino ácidos no esenciales (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 50 pg/mL de gentamicina y 1 pg/mL de anfotericina (Sigma-Aldrich). Las colonias establecidas de miofibroblastos se siembran en matraces de cultivo de 25 cm2 y se cultivan en DMEM complementado con FBS al 20 % y antibióticos a por lo menos el paso 4 para proporcionar una cantidad suficiente para su uso en experimentos de estimulación.
Las monocapas subconfluentes de miofibroblastos se siembran luego en placas de 12 pocillos a razón de 3 x 105 células por pocillo, se inanicionan en medio libre de suero durante 24 h a 37 °C, 5 % de CO2, antes de ser cultivadas durante 24 h en presencia de control de DMSO o concentraciones apropiadas de compuesto. Después de 24 h el sobrenadante se elimina y se analiza en cuanto a la presencia de IL-8 e IL-6 por ELISA R&D. El porcentaje de inhibición de la liberación de citoquinas por el compuesto de prueba se calcula con relación a la liberación de citoquinas determinada por el control de DMSO (100 %).
(q) Desaranulaclón de neutrófllos humanos
Neutrófilos se aíslan de sangre periférica humana como sigue:
La sangre es recogida por venopunción y se anti-coagula mediante la adición de EDTA:solución salina tamponada con fosfato estéril 1:1 (PBS, sin Ca+Mg+). Se añade dextrano (3 % p/v) (1 parte de solución de dextrano a 4 partes de sangre) y la sangre se deja reposar durante aproximadamente 20 minutos a ta. El sobrenadante se estratifica cuidadosamente en un gradiente de densidad (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare) y se centrifuga (15 min, 2000 rpm, sin freno). El sobrenadante se aspira y el sedimento celular se re-suspende en solución salina estéril (al 0,2 %) durante no más de 60 segundos (para lisar los glóbulos rojos contaminantes). Entonces se añade 10 veces el volumen de PBS y las células se centrifugan (5 min, 1200 rpm). Las células se re-suspenden en HBSS+ (solución salina tamponada de Hanks (sin fenol rojo) que contiene citocalasina B (5 pg/mL) y CaCl21 mM) para lograr 5 x 106 células/mL.
5 x 104 células se agregan a cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo en V y se incuban (30 min, 37 °C) con la concentración apropiada del compuesto de prueba (0,3 - 1000 ng/mL) o vehículo (DMSO, concentración final 0,5 %). La desgranulación es estimulada por la adición de fMLP (conc. final 1 pM). Después de una incubación adicional (30 min, 37 °C), las células se eliminan por centrifugación (5 min, 1500 rpm) y los sobrenadantes se transfieren a una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se añade un volumen igual de tetrametilbencidina (TMB) y después de 10 min la reacción se terminada mediante la adición de un volumen igual de ácido sulfúrico (0,5 M) y se lee la absorbancia a 450 nm (fondo en 655 nm restado). La concentración inhibidora al 50 % (CI50) se determina a partir de la curva de concentración-respuesta resultante.
(r) Ensayo de cltotoxlcldad celular
5 x 104 de células TK6 (línea de células T linfoblásticas) se agregan al número apropiado de pocillos de una placa de 96 pocillos en 195 pL de medio (RPMI complementado con suero bovino fetal al 10 %). 5 pL de control DMSO (concentración final 0,5 % v/v) o compuesto de prueba (concentración final de 5 o 1 pg/mL) se añade a los pocillos y se incuba a 37 °C, 5 % de CO2. Después de 24 horas, la placa se centrifuga a 1300 rpm durante 3 minutos y el sobrenadante se desecha. Las células se re-suspenden luego en 7,5 pg/mL de yoduro de propidio (PI) en PBS. Después de 15 minutos, se analizan las células mediante citometría de flujo (BD accuri). El % de viabilidad se calcula como el % de células que son negativas a PI en los pocillos de prueba normalizados para el control de DMSO.
Detección in vivo: Farmacodinámicas y Actividad Anti-inflamatoria
(i) Acumulación de neutrófllos inducida por LPS en ratones
A ratones Balb/c que no han hecho ayuna se les dosifica por vía intra traqueal vehículo, o la sustancia de prueba en las veces indicadas (dentro del intervalo 2-8 h) antes de la estimulación de la respuesta inflamatoria mediante la aplicación de una estimulación con LPS. A T = 0, los ratones se colocan en una cámara de exposición y se exponen a LPS (7,0 mL, solución 0,5 mg/mL en PBS) durante 30 min. Después de 8 h más, los animales se anestesian, sus tráqueas se canulan y BALF se extrae por infusión y luego se retira de sus pulmones 1,0 mL de PBS vía el catéter de la tráquea. Los recuentos de leucocitos totales y diferenciales en las muestras BALF se miden utilizando un hemocitómetro Neubaur. Manchas de citospina de las muestras de BALF se preparan por centrifugación a 200 rpm durante 5 min a TA y se tiñen utilizando un sistema de tinción de DiffQuik (Dade Behring). Las células se cuentan mediante microscopía de inmersión de aceite. Los datos para los números del neutrófilos en BAL se representan como media ± E.E.M (error estándar de la media). El porcentaje de inhibición de la acumulación de neutrófilos se calcula para cada tratamiento en relación con el tratamiento del vehículo.
(ii) Modelo de humo de cigarrillo
Ratones A/J (machos, 5 semanas de edad) se exponen al humo del cigarrillo (4% de humo de cigarrillo, diluido con aire) durante 30 min/día durante 11 días utilizando un sistema de experimento de inhalación de humo de tabaco para pequeños animales (modelo SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tokio, Japón). Las sustancias de prueba se administran por vía intra-nasal (35 pL de solución en DMSO al 50% /PBS) una vez diariamente durante 3 días después de la exposición final al humo del cigarrillo. 12 h después de la última dosis, cada uno de los animales fue anestesiado, la tráquea se canuló y se recolectó el fluido de lavado broncoalveolar (BALF). El número de macrófagos y de neutrófilos alveolares se determina por análisis FACS (EPICS® ALTRA II, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EE.UU.) usando anticuerpo MOMA2 anti-ratón (macrófago) o anticuerpo 7/4 anti-ratón (neutrófilo).
(iii) Colitis inducida por DSS en ratones
Ratones BDF1 macho, de 10-12 semanas de edad, que no han hecho ayuno, son dosificados por sonda oral dos veces al día con cualquier vehículo, elemento de referencia (5-ASA) o compuesto de prueba un día antes (Día - 1) de la estimulación de la respuesta inflamatoria por el tratamiento con sulfato de dextrano sódico (DSS). El día 0 del estudio, se administra DSS (5 % p/v) en el agua potable seguida de dosificación BID (dos veces al día) del vehículo (5 mL/kg), compuesto de referencia (100 mg/kg) o compuesto de prueba (5 mg/kg) durante 7 días. El agua potable con DSS se renueva cada 3 días. Durante el estudio los animales se pesaron cada día y se realizan las observaciones de heces y se registran como una puntuación, basado en la consistencia de las heces. En el momento del sacrificio en el Día 6 el intestino grueso se elimina y se registran la longitud y el peso. Las secciones del colon se toman para cualquier análisis MPO para determinar la infiltración de neutrófilos o para la puntuación histopatología para determinar la gravedad de la enfermedad.
(iv) Colitis inducida por TNBS en ratones
Ratones BDF1 machos, de 10-12 semanas de edad, que no han hecho ayuna, son dosificados por sonda gástrica oral dos veces al día con vehículo (5 mL/kg), producto de referencia (budesonida 2,5 mg/kg) o compuesto de prueba (1 o 5 mg/kg) un día antes (Día -1) de la estimulación de la respuesta inflamatoria por el tratamiento con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS) (15 mg/mL en etanol al 50 %/solución salina al 50 %). En el Día 0 del estudio TNBS (200 gL) se administra por vía intra-colónica vía un catéter plástico seguido por la dosificación BID del vehículo, compuesto de referencia o compuesto de prueba durante 2 o 4 días. Durante el estudio, los animales se pesaron cada día y las observaciones de heces se realizan y se registran como una puntuación, basado en la consistencia de las heces. En el momento del sacrificio en el Día 2 (o Día 4) el intestino grueso se elimina y se registran la longitud y el peso. Las secciones del colon se toman para la puntuación de histopatología para determinar la gravedad de la enfermedad.
(v) Transferencia adoptiva en ratones
En el día de estudio 0, ratones Balb/C hembra son sacrificados y los bazos se obtienen para el aislamiento de células CD45RBalta (utilizando el protocolo de separación de células SCID iBd). Aproximadamente 4 X 105 células/mL CD45RBalta se inyectan luego IP (100 gL/ratón) en animales SCID hembra. En el día de estudio 14, los ratones se pesan y se asignan al azar en grupos de tratamiento basados en el peso corporal. En el Día 14, el compuesto se administra BlD, por sonda vía oral, en un vehículo que comprende una mezcla definida de aceite maíz (32,5 %), transcutol (20 %), maisina (12,5 %) y cremofor ELP (35 %) en los niveles de dosis que se detallan más adelante en las Tablas 6a y 6b y un volumen de dosis de 5 mL/kg. El tratamiento continúa hasta el día de estudio 42, en cuyo momento a los animales se les aplica la necropsia 4 horas después de la administración de la mañana. Se registran la longitud del colon y el peso y se utilizan como un punto final secundario en el estudio como una medida del edema de colon. El colon se divide luego en seis secciones transversales, cuatro de las cuales se utilizan para la puntuación de histopatología (punto final primario) y dos se homogeneizan para análisis de citoquinas. Los datos mostrados es el % de inhibición de la ventana de inducción entre animales sin tratamiento y animales vehículos, en que una mayor inhibición implica más próximo al fenotipo sin tratamiento previo, no enfermo.
(vi) Uveltls inducida por endotoxina en ratas
Ratas Lewis, macho (6-8 semanas de edad, Charles River UK Limited) se alojan en jaulas de 3 a 19-21 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (7:00/19:00) y se alimentan con una dieta estándar de pienso para roedores y agua a placer. Las ratas que no han hecho ayuno se pesan, se identifican individualmente en la cola con un marcador permanente, y reciben una administración intravítrea única en el humor vítreo derecho (volumen de dosis de 5 pL) de 100 ng/animal de LPS (Escherichia coli 0111 :B4 preparado en PBS, Sigma Aldrich, Reino Unido) utilizando una aguja de calibre 32. A las ratas sin tratamiento se las inyecta PBS. El compuesto de prueba, dexametasona (Dex) o vehículo (hidroxipropil-^-ciclodextrina al 20 %, HPMC al 0,1,%, cloruro de benzalconio al 0,01 %, EDTA al 0,05%, NaCl al 0,7 % en agua desionizada) se administraron por vía tópica en el ojo derecho (10 gL) de animales 30 minutos antes de LPS, en el momento de la administración de LPS, y 1, 2 y 4 horas después de la administración de LPS. Antes de la administración, la solución o suspensión a ser administrada se agita durante 5 minutos para asegurar una suspensión uniforme. 6 horas después de la dosificación de LPS, los animales son sacrificados sin dolor por sobredosis con pentobarbitona (i.v.). Después de la eutanasia, el ojo derecho de cada uno de los animales es enucleado y se diseccionan en las secciones frontal (anterior) y atrás (posterior) alrededor de la lente. Cada una de las secciones se pesa y homogeneiza en 500 pL de solución salina tamponada con fosfato estéril, seguido de centrifugación de 20 minutos a 12000 rpm a 4 °C. El sobrenadante resultante se divide en 3 partes alícuotas y se almacena a -80 °C hasta su análisis de citoquina posterior por ELISA R&D Duoset.
Sumario de los Resultados de Detección In Vitro e In Vivo
Tabla 1a: Constantes de disociación para quinasas seleccionadas determinada por LeadHunter Discover Services (DiscoveRx Corporation, Fremont, CA), usando la tecnología KINOMEscan™
A
Compuest
Figure imgf000028_0015
Estudios realizados por LeadHunter Discover Services (DiscoveRx Corporation, Fremont, CA) usando la tecnología de KINOMEscan™ determinaron que el compuesto de los ejemplos (Compuesto I) no tuvo efecto significativo alguno en la unión de las quinasas B-Raf y B-Raf (V600E) a sus ligandos estándar. Además, ese compuesto mostró selectividades sustancialmente mejoradas en comparación con el Compuesto de Referencia A/-(4-(4-(3-(3-terc.-butil-1-p-tolil-1 H-pirazol-5-il)ureido)-naftalen-1 -iloxi)piridin-2-il)-2-metoxiacetamida (documento WO 2010/112936), como se evidencia por las bajas puntuaciones de selectividad (Tabla 1b).
Tabla 1b: Datos de puntuaciones de Selectividad KinomeScan en 50 y 500 nM; S(35) = (número de quinasas no mutantes con % Ctrl < 35)/(número de quinasas no mutantes testadas); S(10) = (número de quinasas no mutantes con % Ctrl < 10)/(número de quinasas no mutantes testadas); S(1) = (número de quinasas no mutantes con % Ctrl < 1)/(número de quinasas no mutantes testadas)
Puntuaciones de selectividad KinomeScan / número de aciertos de quinasa individuales 50 nM 500 nM
Compuesto S(35) S(10) S(1) S(35) S(10) S(1) Compuesto ,174 / 67 0,083 / 32 0,018 / 7 0,370 / 143 0,272 / 105 0,117 / 45 de Referencia Compuesto I
Figure imgf000028_0001
,068 / 27
Figure imgf000028_0002
0,023 / 9
Figure imgf000028_0003
0,000 / 0
Figure imgf000028_0004
0,197 / 78
Figure imgf000028_0005
0,129 / 51
Figure imgf000028_0006
0,038 / 15
Tabla 1c: Resultados de los ensayos de inhibición in vitro de MAPKa p38 (Método 2), c-Src, Syk y GSK3a (Método 2)
Valores de CI 50 para la Inhibición de la Enzima (nM) Compuesto de prueba
MAPKa p38 c-Src Syk GSK3a Compuesto I__________ 224
Figure imgf000028_0007
24
Figure imgf000028_0008
591
Figure imgf000028_0009
411
Tabla 1d: Datos de ensayos de fosfoflujo de evaluación celular MAPKa p38 y la inhibición de Lck
Artículo de prueba Valores CI 50 (ng/mL)
fosfo-MAPKa p38 fosfo-Lck Compuesto I 20
Figure imgf000028_0010
6
Tabla 2:Inhibición de liberación de citoquina en células estimuladas (ensayos (b), (c) y (d) anteriores)
Valores de C*5Q para la inhibición de la Liberación de Citoqumas (nM) Artículo de prueba células dU937 PBMC células HT29
Figure imgf000028_0011
IL-8 TNFa IL-8
Figure imgf000028_0012
IFNy IL-8 Compuesto I - -
Figure imgf000028_0013
1,5 - 74,0 7,3
Figure imgf000028_0014
8,0
Como se ilustra en la Tabla 3, Compuesto I también se detectó en el ensayo celular (l), es decir, el modelo de biopsia humana ex vivo descrito anteriormente, donde demostraron efectos anti-inflamatorios significativos en biopsias de pacientes de colitis ulcerosa (UC). En contraste con voluntarios sanos, las biopsias de la mucosa intestinal de los pacientes UC han demostrado liberar espontáneamente citoquinas pro-inflamatorias in vitro (Onken, J.E. et al., J Clin Immunol, 2008, 126(3): 345-352). Así, Compuesto I inhibe significativamente la liberación de citoquina (IL-1 p, IL-6 e IL-8) en comparación con el control de DMSO cuando se incuban, a razón de 1 pg/mL, durante 24 horas con biopsias de pacientes de colitis ulcerosa.
Tabla 3: Sumario de los resultados de ensayos usando biopsias de la mucosa intestinal de las regiones inflamadas del colon de diversos pacientes que sufren colitis ulcerativa (una forma de IBD)
Grupo de tr
Control DM Compuesto
Figure imgf000029_0001
Como se ilustra en la Tabla 4a que figura a continuación, Compuesto I es acusadamente menos activo que el Compuesto de Referencia (W-(4-(4-(3-(3-ferc.-butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5-il)ureido)naftalen-1-iloxi)piridin-2-il)-2-metoxiacetamida, documento WO 2010/112936) en el ensayo (g) anterior, que mide el impacto en la división celular (mitosis) en PBMC.
Tabla 4a: Efecto de Compuesto I en la división celular en PBMCs en comparación con el compuesto de Referencia
Compuesto de prueba % Inhibición de mitosis en 5 pg/mL
Compuesto de referencia 87,8a
Compuesto I 20.5
a Véase, por ejemplo, el valor informado en el documento WO 2013/050757.
Como se ilustra en la Tabla 4b que figura a continuación, Compuesto I no produce cualquier inducción sustancial de pcatenina cuando se estudia en el ensayo (m) anterior. Por lo tanto, se encontró que el potencial del compuesto para aumentar las concentraciones celulares de p-catenina es negativo, debido a que su efecto inductivo en diversas concentraciones de prueba es sustancialmente menor que el efecto producido por el Compuesto de Referencia en 1 pg/mL.
Tabla 4b: Efecto de Compuesto I en la inducción de p-catenina en comparación con el compuesto de referencia (NT = no testado)
Compuesto de prueba ______________________ % de inducción de p-catenina
Concentración del compuesto de prueba
1 pg/m pg/mL Compuesto de referencia 100 NT
Compuesto I 21
Figure imgf000029_0002
26
Como se ilustra en la Tabla 5 que figura a continuación, Compuesto I se detectó también en el ensayo in vivo (iv) anterior, como se llevó a cabo durante 2 días y al emplear un sistema de suministro de fármacos auto-emulsionante (SMEDDS) como un vehículo que comprende una mezcla definida de aceite de maíz (32,5 %), transcutol (20 %), maisina (12,5 %) y cremofor ELP (35 %). El análisis de histopatología reveló que Compuesto I muestra actividad en este modelo de inflamación de colon in vivo. En particular, cuando se dosifica por vía oral a razón de 5 mg/kg, Compuesto I demostró mejoras acusadas en la calidad de la úlcera y la reparación epitelial en comparación con el control del vehículo. Además, produjo una reducción acusada en el infiltrado de células inflamatorias en las zonas reticular y de la lámina propia.
Tabla 5: Efecto de Compuesto I sobre la colitis inducida por TNBS en ratones.
Figure imgf000029_0003
LP
Como se ilustra en las Tablas 6a y 6b que figuran a continuación, Compuesto I también se detectó en el ensayo in vivo (transferencia adoptiva) (v) anterior. El análisis de las relaciones relativas de peso a longitud de colon en animales sin tratamiento, de control y tratados al final del estudio reveló que Compuesto I muestra una actividad significativa en este modelo impulsado por células T in vivo de inflamación de colon.
Tabla 6a: Sumario de los resultados del modelo de ratón de transferencia adoptiva
Grupo de tratamiento Dosis Peso:longitud de colon % de inhibición
Sin tratamiento N/D 0,022 ± 0,001 100
Ciclosporina A 75 mg/k 0,029 ± 0,001 64
Control de veh N/A 0,042 ± 0,005 0
Compuesto I
Figure imgf000030_0001
3 mg/kg
Figure imgf000030_0002
0,024 ± 0,003
Figure imgf000030_0003
90
Tabla 6b: Sumario de otros resultados de un estudio adicional en el modelo de ratón de transferencia adoptiva
Grupo de tratamiento n Peso:longitud de colon
Figure imgf000030_0006
Compuesto I (0,03 mg/kg) 12 0,033 ± 0,002
Como se ilustra en la Tabla 6c que figura a continuación, Compuesto I también reducía significativamente los niveles de citoquinas pro-inflamatorias en las muestras de tejido de colon de ratones en el modelo de transferencia adoptiva.
Tabla 6c:Sumario de mediciones de nivel de citoquina del modelo de ratón de transferencia adoptiva
Grupo de tratamiento n IFN^(pg/mL) IL-8 (pg/ml)
Sin enfermedad 1,3 ± 0,6 7,9 ± 0,9
Control de vehículo
Figure imgf000030_0004
117,7 ± 36,6
Figure imgf000030_0005
1064,9 ± 239,6 Compuesto I (3 mg/kg) 12 10,8 ± 3,3 70,8 ± 22,8
Sumario de Estudios Adicionales
Determinación de Parámetros Farmacocinéticos
Se realizaron estudios por Sai Life Sciences (Hinjewadi, Pune, India) para investigar las farmacocinéticas de plasma y la distribución de tejido de colon total de Compuesto I. En particular, los estudios farmacocinéticos se realizaron en:
- ratones C57BL/6 machos, después de una administración oral única; y
- ratas Wistar machos, después de una administración intravenosa u oral única.
Los datos revelan que Compuesto I logra concentraciones colónicas sustanciales, mientras que las exposiciones de plasma son muy bajas o despreciables.
Tabla 8a: Concentraciones plasmáticas promedio (ng/mL) obtenidas después de la administración oral de Compuesto I a ratones a razón de 5 mg/kg
_____________________________Tiempo (h)_____________________________ Artículo de prueba Vehículo 1_________2________ 4________ 6________ 8________ 12_______ 24_______ Compuesto I________ B__________ 0 ^_______0,0_______0,0_______0 ^_______0,0_______0 ^_______0 ^______ Clave
Vehículo B = Aceite de maíz - Transcutol - Maisina - Cremofor ELP (32,5 : 20 : 12,5 : 35) un sistema de suministro de fármacos auto-microemulsionante (SMEDDS)___________________________________________________________
Tabla 8b: Mediana de las concentraciones de colon totales (ng/g) obtenida después de la administración oral de Compuesto I a ratones a razón de 5 mg/kg (vehículo B es como con respecto a la Tabla 8a)
Tiempo (h)
Artículo de prueba Vehículo 1 2 4 6 8 12 24 Compuesto I B 0,0 10,4 420 3080 1951 126 23
Tabla 9a: Datos farmacocinéticos obtenidos tras la administración intravenosa de Compuesto I a las ratas a razón de 0,25 mg/kg en DMSO al 5 % - Solutol HS15 al 7,5 % - solución salina normal al 87,5 %
Artículo de C0 AUCúltimo AUCinf
prueba (ng/mL) (h*ng/mL) (h*ng/mL) T1/2 (h) Cl (mL/min/kg) Vss (L/kg) Compuesto I
Figure imgf000031_0001
6536 869 871 0.1 4.8 0.03 Tabla 9b: Datos farmacocinéticos obtenidos después de la administración oral de Compuesto I a ratas a razón de 5 mg/kg Artículo de Vehículo Tmax (h) Cmax (ng/mL) AUCúltimo AUCinf Fpo (%) prueba (h*ng/mL) (h*ng/mL)
Compuesto I B NC* NC»1 NC»1 NC»1 0.0
Clave:
Vehículo B = como con respecto a la Tabla 8a.
i*1 No calculado, ya que no se detecta compuesto en el plasma.
Tabla 9c: Concentraciones plasmáticas promedio (ng/mL) obtenidas después de la administración oral de Compuesto I a ratas a razón de 5 mg/kg
Tiempo (h)
Artículo de Vehículo 0,25 0.5 1 2 4 6 8 12 24 prueba
Compuesto I
Figure imgf000031_0002
0,0
Figure imgf000031_0003
0 , 0 Clave:
Vehículo B es como con respecto a la Tabla 8a.
Determinación de Parámetros ADME
La evaluación de ciertos parámetros de ADME in vitro (absorción, distribución, metabolismo y excreción) para Compuesto I se realizó por BioFocus (Saffron Walden, Reino Unido). Los resultados revelan que Compuesto I es rápidamente aclarado por los hepatocitos humanos y que ha reducido la responsabilidad de la inhibición de P450 de citocromo dependiente de tiempo.
Tabla 10: Datos de la prueba de estabilidad de hepatocitos humanos para Compuesto I Artículo de
prueba T1/2 (min) Aclarado medio intrínseco Relación de extracción hepática (pl/min/millones de células) media Compuesto I 34 41 0,85
Tabla 11a: Sumario de los estudios de inhibición de CYP3A4 para Compuesto I (los resultados reseñados son la media aritmética de dos experimentos).
Preincubación 0 min Preincubación 30 min Artículo de prueba CI50 (pM) 15 pM % Inh CI50 (pM) 15 pM % Inh Comp. A de Ref. > 15 41 0,4 92 Compuesto I > 15 31 7,8 54
Clave:
Comp.A de Ref.: 1-(4-((2-((7-metil-1 H-indazol-5-il)amino)pirimidin-4-il)oxi)-naftalen-1-il)-3-(3-(2-metilbut-3-in-2-il)-1-(ptolil)-1 H-pirazol-5-il)urea (Fyfe, M. C. T., et al. documento WO 2014/033447).
Tabla 11b: Sumario de los estudios de inhibición de CYP2C9 para Compuesto I (los resultados reseñados son la media aritmética de dos experimentos).
Preincubación 0 min Preincubación 30 min
Artículo de prueba CI50 (pM) 15 pM % Inh IC50 (pM) 15 pM %Inh Comp. A de Ref. > 5 31 [t] 1,4 66[t] Compuesto I > 15 21 > 15 37 Clave:
Comp. A de Ref.: como con respecto a la Tabla11a.
[tl Precipitación observada en 15 pM, por lo tanto en su lugar se reseñó la inhibición en 5 pM.
Estudios de inhibición hERG
Compuesto I se testó en cuanto a la inhibición del canal de go-go de éter humano (hERG) usando electrofisiología de pinzamiento zonal lonWorks™ en Essen Bioscience (Welwyn Garden City, Inglaterra).
Tabla 12: Datos de inhibición de hERG para Compuesto I
Artículo de prueba CI50 (pM) % de inhibición en 3 pM Compuesto I > 3,0 -12 ± 4
Análisis de Metabolitos
Se realizaron estudios por BioFocus (Saffron Walden, Reino Unido) para determinar el destino metabólico de Compuesto I tras incubación con hepatocitos de rata, macaco Cynomolgus o humanos.
Las incubaciones de separación (n = 3) de Compuesto I (concentración inicial de 10 pM) o control de DMSO, se realizaron con hepatocitos crioconservados de cada una de las especies (0,5 millones de células/mL) a 37 °C durante 0, 60 y 90 minutos antes de la terminación de las reacciones y extracción del compuesto con acetonitrilo. Las repeticiones de la muestra se agruparon antes del análisis.
Se identificaron metabolitos potenciales utilizando el tiempo de vuelo (TOF) y espectrómetros de masas de triple cuadrupolo (TQ).
Los resultados revelan que Compuesto I forma 9 metabolitos en hepatocitos, 8 de los cuales resultan de la oxidación en la cadena del polietilenglicol del radical amida. El otro metabolito, visto principalmente en hepatocitos de macaco Cynomolgus, surge por oxidación en el fragmento 5-(terc.-butil)-2-metoxi-3-(metilsulfonamido)fenilo. Así, se observó que ninguno de los productos podría conectarse al metabolismo en el radical de naftaleno, un fenómeno que resulta en la hepatotoxicidad asociada con inhibidor de p38or BIRB796 (Iwano, S., et al., J. Appl. Toxicol. 2011,31,671-677). Todos los metabolitos identificados en incubaciones de hepatocitos humanos también se detectaron en incubaciones de hepatocitos de macaco Cynomolgus o rata.
Evaluación de Mutagenicidad (Detección de Mutación Inversa Bacteriana)
Los estudios se realizaron por Sequani (Ledbury, Herefordshire, Reino Unido) para evaluar Compuesto I en cuanto a su capacidad de inducir mutaciones en dos mutantes auxotróficos dependientes de histidina de Salmonella typhimurium, cepas TA98 y TA100 in vitro.
La detección de la mutación se realizó utilizando el método de incorporación en placa y se realizó tanto en presencia como en ausencia de la mezcla S-9 (una fracción post-mitocondrial hepática derivada de los hígados de las ratas tratadas con Aroclor 1254). Las bacterias se expusieron al compuesto de prueba disueltas en dimetilsulfóxido, disolvente que también se utilizó como control negativo. Los niveles de dosis utilizados son 0,32, 1,6, 8, 40, 200, 1000 o 5000 pg/placa.
Los niveles de tratamiento analizables del compuesto de prueba se limitaron por insolubilidad a 1000 pg/placa, ya que la precipitación pesada observada a 5000 pg/placa afectó la puntuación de las colonias. La precipitación se observó también en ambas cepas a razón de 1000 pg/placa en presencia y en ausencia de mezcla S-9.
Compuesto I no producía incrementos estadísticamente significativos o no relacionados con dosis en las colonias revertidas en cualquier cepa de Salmonella typhimurium en presencia o ausencia de mezcla S-9.
Estudio de Estabilidad Hidrolítica
La estabilidad química de Compuesto I se evaluó en una mezcla de DMSO y agua (3:1) a una concentración de compuesto de prueba de 1 mg/mL.
Procedimiento de HPLC general
Columna Agilent, Waters X-Select C18, 2,5 pm, 4,6 x 30 mm, método de 4 min, 5-95 % de MeCN/agua (ácido fórmico al 0,5 %).
Caudal 2,5 mL/min.
Temperatura de horno de columna 40 °C.
Detección a 254 nm.
Preparación de la muestra
Una muestra de 1,0 mg de compuesto de prueba se disolvió en 750 pL de DMSO. Se agregó lentamente agua (250 pL), asegurándose que no se produjera una precipitación.
Registro de estabilidad
Una parte alícuota de 50 pL de la solución de prueba se eliminó y se analizó por duplicado mediante inyecciones de HPLC de 5 pL. El área pico para el compuesto de prueba se registró después de la integración manual de la traza correspondiente de UV.
La solución de prueba se calentó a 60 °C, con agitación y se eliminaron partes alícuotas de 50 pL para el análisis por HPLC en momentos de 5 y 24 h. En todos los casos, se utilizaron inyecciones de 5 pL y las muestras se analizaron por duplicado.
Las áreas pico para los compuestos de prueba se registraron en momentos posteriores y el % de descomposición se calculó a partir del % de cambio en el área pico con el tiempo.
Compuesto de Referencia B (3-etinil-5-((4-((4-(3-(3-isopropil-1 -(p-tolil)-1 H-pirazol-5-il)ureido)naftalen-1 -il)oxi)pirimidin-2-il)amino)-A/-(2-morfolinoetil)benzamida; Cariou, C. A. M., et al, documento Wo 2014/027209) se incluyó en cada uno de los estudios de estabilidad como un control para validar el estudio. En contraste con el compuesto de fórmula I, este Compuesto de Referencia experimentó una descomposición sustancial bajo las condiciones del experimento.
Los resultados del estudio se reseñan en la tabla que figura a continuación.
Figure imgf000033_0001
Restante
Abreviaturas
AcOH ácido acético glacial
ac. acuoso
5-ASA ácido 5-aminosalicílico
ATP adenosina-5'-trifosfato
BALF fluido de lavado broncoalveolar
BID bis in die (dos veces al día)
BINAP 2,2'-bis(difenilfosfino)-1, 1 '-binaftilo
BOP Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio br ancho
BrdU 5-bromo-2'-desoxiuridina
BSA albúmina de suero bovino
CatCart® cartucho catalítico
CDI 1,1 -carbonil-diimidazol
COPD enfermedad pulmonar obstructiva crónica
d doblete
dba dibencilidenacetona
DBU 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
DCC diciclohexilcarbodiimida
DCM diclorometano
DIAD azodicarboxilato de diisopropilo
DIPEA diisopropiletilamina
DMAP 4-dimetilaminopiridina
DMEM medio de Eagle modificado por Dulbecco
DMF N,N-dimetilformamida
DMSO dimetilsu lfóxido
DPPA difenilfosforil azida
células d-U937 células U-937 diferenciadas con PMA
EDTA ácido etilendiaminotetraacético
ELISA ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
(ES-) ionización por electroproyección, modo negativo
(ES+) ionización por electroproyección, modo positivo
Et etilo
Et3N trietilamina
EtOAc acetato de etilo
EtOH etanol
FACS clasificación celular activada por fluorescencia
FBS suero bovino fetal
FCS suero de ternera fetal
fMLP formil-metionil-leucil-fenilalanina
FRET transferencia de energía de resonancia fluorescente GSK3a glucógeno sintasa quinasa 3a
HBEC células epiteliales bronquiales humanas primarias
HBSS solución salina equilibrada de Hank
HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento
HPMC hidroxipropilmetilcelulosa
h hora(s)
HATU Hexafluorofosfato de 2-(1 H-7-azabenzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametiluronio HOAt 1 -hidroxi-7-azabenzotriazol
HOBt hidroxibenzotriazol
HRP peroxidasa de rábano picante
HRV rinovirus humano
ICAM-1 molécula de adhesión inter-celular 1
IFNy Interferón y
IL interleuquina
IMS alcohol metilado industrial
iPrOAc acetato de isopropilo
JNK quinasa N-terminal c-Jun
LC cromatografía líquida
Lck proteína tirosina quinasa específica para linfocitos
LPS lipopolisacárido
m multiplete
(M+H)+ ion molecular protonado
MAPK proteína quinasa activada con mitógeno
MAPKAP-K2 proteína quinasa-2 activada con proteína quinasa activada con mitógeno mCPBA ácido meta-cloroperbenzoico
Me metilo
MeCN acetonitrilo
MeOH metanol
MHz megahercios
min minuto(s)
MMAD diámetro aerodinámico mediano en masa
MOI multiplicidad de infección
MPO mieloperoxidasa
MTT bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
MS espectrometría de masas
m/z relación de masa a carga
NMP N-metil pirrolodinona
RMN resonancia magnética nuclear (espectroscopia)
DO densidad óptica
PBMC célula mononuclear de la sangre periférica
PBS solución salina tamponada con fosfato
Ph fenilo
PHA fitohemaglutinina
PMA miristato-acetato de forbol
pTSA ácido 4-metilbencenosulfónico (ácido para-toluenesulfónico) PyBOP hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinofosfonio q cuartete
ta o TA temperatura ambiente
RP HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa rpm revoluciones por minuto
RPMI Roswell Park Memorial Institute
RSV virus sincitial respiratorio
s singlete
sat. o satd. saturado
SCID inmunodeficiencia combinada severa
SCX intercambio de cationes soportado sólido (resina)
SDS dodecilsulfato de sodio
SNAr sustitución aromática nucleofílica
Syk tirosina quinasa de bazo
t triplete
T3P anhídrido cíclico de ácido 1-propanofosfónico
TBAF fluoruro de tetrabutilamonio
TBDMS terc.-butildimetilsililo
TBME íerc.-butil metil éter
TCID50 dosis infecciosa de cultivo de tejido al 50 %
TEA trietilamina
THF tetrahidrofurano
TFA ácido trifluoroacético
TGFP factor de crecimiento beta transformante
TIPS triisopropilsililo
TMB 3,3',5,5'-tetrametilbencidina
TMS-Cl cloruro de trimetilsililo
TNFa factor alfa de necrosis tumoral
Los prefijos n-, s-, i-, t- y terc.- tienen sus significados usuales: normal, secundario, iso, y terciario.
Ċ

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula XVI,
Figure imgf000038_0001
en donde LG1 representa imidazolilo, cloro o ariloxi.
2. Un compuesto de fórmula XVI según la reivindicación 1, en donde LG1 representa fenoxi.
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