CN115192573A - 盐酸去亚甲基小檗碱在制备治疗肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸去亚甲基小檗碱在制备治疗肺纤维化中的应用。本发明首次发现盐酸去亚甲基小檗碱对肺纤维化有治疗作用；具体而言，通过博来霉素（5U/kg）诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后，分别灌胃给予小檗碱（100mg/kg）、盐酸去亚甲基小檗碱（100mg/kg）和吡非尼酮（300mg/kg），灌胃给药两周。研究结果表明，相同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱相比于小檗碱，能够更为显著的提高小鼠生存率和降低肺系数以及改善小鼠肺部结构损伤和胶原沉积，表明盐酸去亚甲基小檗碱相比于小檗碱具有更好的治疗效果。且相比于吡非尼酮，盐酸去亚甲基小檗碱治疗效果相近而给药剂量更低。此外，正常小鼠灌胃给药DMB两周，小鼠外观、活动、饮食和精神状态等均未改变，心、肝、脾、肾脏器系数也未见任何改变，以上结果表明DMB安全有效，具有较高的生物利用度。

Description

盐酸去亚甲基小檗碱在制备治疗肺纤维化药物中的应用
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸去亚甲基小檗碱在制备治疗肺纤维化中的应用。
背景技术：
肺纤维化(Pulmonary fibrosis,PF)是一种以进行性纤维化组织重塑和肺组织瘢痕为特征的慢性肺疾病。 多种因素如抽烟、感染、环境污染物、辐射和自身免疫反应等都会导致肺组织损伤并发生纤维化。
特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是肺纤维化中最具代表性的病因不明的特别严重 的进行性肺纤维化，诊断后中位生存时间为3-5年。它是一种与年龄相关的疾病，绝大多数人在60岁以上 被诊断出来。IPF的特征是异常的伤口愈合反应，导致肺内细胞外基质(ECM)过度沉积，这个过程通常开 始于肺的基底和周围区域。随着病情恶化，肺部越来越不能促进气体交换,从而导致诸如劳力性呼吸困难、 慢性咳嗽、肺功能下降和生活质量损害等症状。
IPF的发病机制复杂，尚不完全清楚。目前的假设主要集中在慢性炎症、创面异常愈合、细胞衰老、 氧化应激、内质网应激、细胞可塑性、非编码RNA的作用等。根据最近的研究，IPF的发生和发展是由于 肺泡上皮细胞(AECs)的异常损伤和激活，导致促纤维化、凝血剂和炎症细胞因子的分泌控制增殖，成纤维 细胞的激活和分化为肌成纤维细胞，以及随之产生的细胞外基质(ECM)蛋白的分泌和沉积。因此到目前为 止，已经涉及到一系列的过程参与IPF，范围从凝血级联的激活到肌成纤维细胞的激活，甚至辅助过程， 如血管生成和氧化应激。但是，每一进程的参与程度还没有得到充分的说明，这使得开发安全有效的药物特别具有挑战性。
尽管IPF的发病机制尚不完全清楚，但是存在过度的上皮-间充质转化(EMT)在IPF的发展中发挥至关 重要的作用。约1/3的肺纤维化成纤维细胞是鉴定为上皮来源。上皮细胞经EMT转化为肌成纤维细胞后增 殖迅速，并产生过量的细胞外产物。肌成纤维细胞除了来源于上皮间质转化，来自骨髓的成纤维细胞和常 驻成纤维细胞也会增殖并分化为肌成纤维细胞。
从目前研究来看，抑制上皮间质转化、肌成纤维细胞激活和分化、减少氧化应激、清除细胞外基质沉 积等是改善肺纤维化的主要途径。鉴于IPF的发生日益普遍和相关死亡率的不断增加，迫切需要研发安全 有效的治疗肺纤维化的药物。
盐酸去亚甲基小檗碱，如式(Ⅰ)所示，又名去亚甲基小檗碱盐酸盐或脱亚甲基小檗碱盐酸盐。
Figure BDA0003798477860000011
盐酸去亚甲基小檗碱(式Ⅰ)的英文名为Demethyleneberberine Hydrochloride或Demethyleneberberine Chloride。本发明专利将它简称为DMB。式(Ⅰ)中的骨架结构为去亚甲基小檗碱，它是盐酸去亚甲基小 檗碱的活性成份。国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)将式(Ⅰ)中的有机结构部分去亚甲基小檗碱命 名9,10-dimethoxy-5,6-dihydroisoquinolino[2,1-b]isoquinolin-7-ium-2,3-diol，其中文名为9，10-二甲氧基-5， 6-二氢异喹啉[2,1-b]异喹啉-7-鎓-2，3-二羟基。它的分子式：C19H18NO4 +，分子量为：324.35。化学文摘号 (CAS)为：25459-91-0。去亚甲基小檗碱(DMB)可以与无机酸或有机酸形成多种盐，如氯化盐、硫酸 盐、磷酸盐、溴化盐、碘化盐、枸橼酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐等分子形式存在。
迄今为止，现有技术中没有关于盐酸去亚甲基小檗碱对肺纤维化治疗作用的记载和报道。
发明内容：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗肺纤维化的化合物，特别是提供了如式 (Ⅰ)所示的盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)作为治疗肺纤维化药物的应用。
本发明通过建立肺纤维化动物模型，观察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对小鼠肺纤维化的治疗作用。 研究结果表明，盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对肺纤维化具有良好的治疗作用。
本发明通过博来霉素(5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后，肺纤 维化开始形成，盐酸去亚甲基小檗碱开始给药，分别灌胃给予小鼠50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg，给 药两周。研究结果表明，盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)不同剂量对肺纤维化均具有不同程度的改善作用。 博来霉素诱导后，小鼠死亡率明显增加，肺部肿大，肺系数升高，肺泡结构破坏，大量胶原沉积在肺部， 导致肺组织致密紧实，而经过盐酸去亚甲基小檗碱给药治疗后，小鼠生存率明显延长，肺系数明显减小， 肺部组织结构损伤明显改善，肺胶原沉积明显减少，同时去亚甲基小檗碱能够明显减轻小鼠肺组织氧化应激，以上这些结果充分表明盐酸去亚甲基小檗碱能够有效治疗肺纤维化。
本发明通过A549细胞研究不同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱的毒性作用，通过CCK-8检测不同浓度、 不同孵育时间后细胞增殖情况。
本发明通过TGF-β1诱导A549细胞，加入不同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱，采用DCFH-DA探针检 测ROS水平，采用荧光显微镜拍照观察。
本发明通过TGF-β1诱导A549细胞，加入不同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱，采用DCFH-DA探针检 测ROS水平，采用流式细胞仪检测。
本发明通过TGF-β1诱导A549细胞，加入不同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱，分别通过细胞划痕和 Transwell研究不同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱对上皮细胞迁移的抑制作用；
本发明通过TGF-β1诱导A549细胞，加入不同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱，提取细胞蛋白，Western blot 检测vimentin蛋白表达。
本发明通过TGF-β1诱导人肺成纤维细胞MRC-5，加入不同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱，提取细胞蛋 白，Western blot检测Fibronectin蛋白表达。
本发明通过TGF-β1诱导人肺成纤维细胞MRC-5，加入不同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱，采用免疫荧 光(IF)检测α-SMA表达。
本发明所用盐酸去亚甲基小檗碱产品采用常规化学与分离纯化制得。本实验室采用高效液相色谱 (HPLC)分析检测，其纯度达99％以上，并经过化学法、质谱法和核磁共振法分析鉴定，表明本实验室 所用的盐酸去亚甲基小檗碱产品化学结构正确。此项研究表明盐酸去亚甲基小檗碱其纯度和化学结构符合 开展体内、体外生物学活性和药理作用研究要求。
根据本发明还涉及含有作为活性成份的盐酸去亚甲基小檗碱和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。 通常本发明药物组合物含有0.1～95％重量％的盐酸去亚甲基小檗碱。在单元剂型中本发明化合物一般含量 为0.1～100mg。
本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化 合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或 剂量形式。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、 肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。
本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下 注射、皮内注射和穴位注射等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、 混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓 剂、冻干粉针剂等。
本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如 稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶 土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖 浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡 咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙 烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘 油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化 硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣 片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释 剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、 滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂如琼脂粉、 干燥粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成份本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱与上述的各种载体混 合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混 悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如，将本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干 粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润 滑剂、防腐剂、表面活性剂、分散剂、渗透压调节剂、增溶剂和pH调节剂。如稀释可选用水、乙醇、聚 乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。渗透 压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、甘油、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、 卵磷脂、羟丙基β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂， 还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或香料等。这些辅 料是本领域常用的。
本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通 过经由细菌过虑器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热灭菌。 还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。
为了达到用药目的，增加治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。当然 用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特 征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于 这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。
对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病 的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此 本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且 在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。
给药剂量是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分 的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数 量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式 给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗 手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂 量。
有益效果
本发明首次发现盐酸去亚甲基小檗碱对肺纤维化有治疗作用；具体而言，通过博来霉素(5U/kg)诱 导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后，分别灌胃给予小檗碱(100mg/kg)、盐酸去 亚甲基小檗碱(100mg/kg)和吡非尼酮(300mg/kg)，灌胃给药两周。研究结果表明，相同剂量的盐酸去 亚甲基小檗碱相比于小檗碱，能够更为显著的提高小鼠生存率和降低肺系数以及改善小鼠肺部结构损伤和 胶原沉积，表明盐酸去亚甲基小檗碱相比于小檗碱具有更好的治疗效果。且相比于吡非尼酮，盐酸去亚甲 基小檗碱治疗效果相近而给药剂量更低。此外，正常小鼠灌胃给药DMB两周，小鼠外观、活动、饮食和 精神状态等均未改变，心、肝、脾、肾脏器系数也未见任何改变，以上结果表明DMB安全有效，具有较 高的生物利用度。
附图说明
图1盐酸去亚甲基小檗碱改善BLM诱导的肺纤维化小鼠生存率
图2盐酸去亚甲基小檗碱降低BLM诱导的肺纤维化小鼠肺系数
图3盐酸去亚甲基小檗碱改善BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织病理损伤
图4盐酸去亚甲基小檗碱降低BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中Collagen I和α-SMA表达(IHC)
图5盐酸去亚甲基小檗碱降低BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中Collagen I和α-SMA表达(western blot)
图6盐酸去亚甲基小檗碱降低BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸和转化生长因子含量
其中a为羟脯氨酸(HYP)含量；b为转化生长因子(TGF-β1)含量
图7盐酸去亚甲基小檗碱抗氧化活性
其中a为谷胱甘肽(GSH)含量；b为丙二醛(MDA)含量
图8盐酸去亚甲基小檗碱细胞毒性检测
图9盐酸去亚甲基小檗碱抑制TGF-β1诱导的上皮间质转化
图10盐酸去亚甲基小檗碱抑制TGF-β1诱导的上皮细胞迁移(划痕)
图11盐酸去亚甲基小檗碱抑制TGF-β1诱导的上皮细胞迁移(transwell)
图12免疫荧光检测A549细胞活性氧(ROS)水平
图13流式细胞术检测A549细胞活性氧(ROS)水平
图14盐酸去亚甲基小檗碱抑制TGF-β1诱导的肌成纤维细胞转化
图15免疫荧光检测肌成纤维细胞α-SMA表达
图16盐酸去亚甲基小檗碱相比于小檗碱和吡非尼酮对肺纤维化小鼠生存率的改善
图17盐酸去亚甲基小檗碱相比于小檗碱和吡非尼酮对肺纤维化小鼠肺系数的降低
图18盐酸去亚甲基小檗碱相比于小檗碱和吡非尼酮降低collagen I和α-SMA表达
图19盐酸去亚甲基小檗碱相比于小檗碱和吡非尼酮对肺纤维化小鼠肺病理损伤的改善
图20正常小鼠灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱的毒性检测
具体实施方式
术语
DMB：盐酸去亚甲基小檗碱
BBR:盐酸小檗碱
Pirfenidone：吡非尼酮
MDA：丙二醛
GSH:谷胱甘肽
TGF-β1：转化生长因子β1
BLM：博来霉素
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1.盐酸去亚甲基小檗碱改善BLM诱导的肺纤维化小鼠生存率
方法：通过博来霉素(BLM，5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后， 肺纤维化开始形成，开始灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg，给药两周，期 间统计正常组、博来霉素诱导组以及博来霉素后分别灌胃三种剂量盐酸去亚甲基小檗碱组的小鼠生存率。
结果：如图1所示，50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg盐酸去亚甲基小檗碱均能不同程度改善肺纤维 化小鼠生存率，其中100mg/kg和200mg/kg效果更为显著。
实施例2.盐酸去亚甲基小檗碱降低BLM诱导的肺纤维化小鼠肺系数
方法：通过博来霉素(BLM，5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后， 肺纤维化开始形成，开始灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg，给药两周，取 正常组、博来霉素诱导组以及博来霉素后分别灌胃三种剂量盐酸去亚甲基小檗碱组的小鼠肺组织，称重， 统计肺系数。
结果：如图2所示，100mg/kg和200mg/kg盐酸去亚甲基小檗碱能显著降低肺纤维化小鼠肺系数。
实施例3.盐酸去亚甲基小檗碱改善BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织病理损伤
方法：通过博来霉素(BLM，5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后， 肺纤维化开始形成，开始灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg，给药两周，取 正常组、博来霉素诱导组以及博来霉素后分别灌胃三种剂量盐酸去亚甲基小檗碱组的小鼠肺组织，4％多聚 甲醛固定，通过HE染色和MASSON染色检测肺组织病理学变化。
结果：如图3所示，小鼠肺组织病理切片表明，博来霉素诱导后小鼠肺组织肺泡结构破坏，肺泡壁增 厚，肺部胶原纤维沉积，灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg后，肺组织均出 现不同程度改善。
实施例4.盐酸去亚甲基小檗碱降低BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中Collagen I和α-SMA表达(IHC)
方法：通过博来霉素(BLM，5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后， 肺纤维化开始形成，开始灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg，给药两周，取 正常组、博来霉素诱导组以及博来霉素后分别灌胃三种剂量盐酸去亚甲基小檗碱组的小鼠肺组织，4％多聚 甲醛固定，采用抗Collagen I和α-SMA蛋白抗体进行免疫组织化学(IHC)染色。
结果：如图4所示，博来霉素诱导后小鼠肺组织Collagen I和α-SMA蛋白表达升高，灌胃给药盐酸去 亚甲基小檗碱50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg后，Collagen I和α-SMA表达均下调。
实施例5.盐酸去亚甲基小檗碱降低BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中Collagen I和α-SMA表达(western blot)
方法：通过博来霉素(BLM，5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后， 肺纤维化开始形成，开始灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg，给药两周，取 正常组、博来霉素诱导组以及博来霉素后分别灌胃三种剂量盐酸去亚甲基小檗碱组的小鼠肺组织，提取总 蛋白，western blot检测Collagen I和α-SMA表达。
结果：如图5所示，博来霉素诱导后小鼠肺组织Collagen I和α-SMA蛋白表达升高，灌胃给药盐酸去 亚甲基小檗碱50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg后，α-SMA表达均下调；100mg/kg和200mg/kg能显著降 低Collagen I表达。
实施例6.盐酸去亚甲基小檗碱降低BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸和转化生长因子含量
方法：通过博来霉素(BLM，5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后， 肺纤维化开始形成，开始灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg，给药两周，取 正常组、博来霉素诱导组以及博来霉素后分别灌胃三种剂量盐酸去亚甲基小檗碱组的小鼠肺组织，检测羟 脯氨酸(HYP)和转化生长因子(TGF-β1)含量。
结果：如图6所示，博来霉素诱导后小鼠肺组织羟脯氨酸(HYP)和转化生长因子(TGF-β1)升高， 灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg后，就能不同程度降低羟脯氨酸(HYP) 和转化生长因子(TGF-β1)含量，100mg/kg和200mg/kg效果更为显著。
实施例7.盐酸去亚甲基小檗碱抗氧化活性
方法：通过博来霉素(BLM，5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后， 肺纤维化开始形成，开始灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg，给药两周，取 正常组、博来霉素诱导组以及博来霉素后分别灌胃三种剂量盐酸去亚甲基小檗碱组的小鼠肺组织，检测谷 胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量。
结果：如图7所示，博来霉素诱导后小鼠肺组织谷胱甘肽(GSH)含量降低，灌胃给药100mg/kg和 200mg/kg能显著升高谷胱甘肽(GSH)含量；博来霉素诱导后小鼠肺组织丙二醛(MDA)含量升高，灌 胃给药100mg/kg和200mg/kg能显著降低丙二醛(MDA)含量。
实施例8.盐酸去亚甲基小檗碱细胞毒性检测
方法：采用RPMI 1640(10％FBS，1％P/S)培养A549细胞(37℃，5％CO2)，将A549细胞铺入 96孔板中，待细胞贴壁后，分别加入1.25、2.5、5、10、20、40、80、160μM的盐酸去亚甲基小檗碱，培 养24h后，采用CCK-8检测试剂盒，检测细胞增殖。
结果：如图8所示，细胞给药1.25、2.5、5、10、20、40、80、160μM的盐酸去亚甲基小檗碱，培养 24h后，各剂量均未见有毒性。
实施例9.盐酸去亚甲基小檗碱抑制TGF-β1诱导的上皮间质转化
方法：将A549细胞铺入6孔板中，待细胞贴壁后，分别加入5ng/mL TGF-β1以及5ng/mL TGF-β1 加不同浓度的盐酸去亚甲基小檗碱(10μM、20μM和40μM)，培养24h，吸去培养基，提取总RNA和 总蛋白，Western blot检测vimentin蛋白表达。
结果：如图9所示，TGF-β1诱导A549细胞vimentin表达上调，发生上皮间质转化，10μM、20μM和40μM的盐酸去亚甲基小檗碱均能降低vimentin表达，抑制上皮间质转 化。
实施例10.盐酸去亚甲基小檗碱抑制TGF-β1诱导的上皮细胞迁移(划痕)
方法：将A549细胞铺入6孔板中，待细胞贴壁后，用10μL移液器吸头，垂直板底划痕，PBS洗去 脱落的细胞，分别加入5ng/mL TGF-β1以及5ng/mL TGF-β1加不同浓度的盐酸去亚甲基小檗碱(10μM、 20μM和40μM)，培养24h，显微镜拍照。
结果：如图10所示，TGF-β1能够促进A549细胞迁移，10μM、20μM和40μM的盐酸去亚甲基小 檗碱均能抑制A549细胞迁移。
实施例11.盐酸去亚甲基小檗碱抑制TGF-β1诱导的上皮细胞迁移(transwell)
方法：将A549细胞胰酶消化后，调整浓度为2.5×105个/mL，小室上层加入200μL细胞悬液，并分 别加入5ng/mL TGF-β1以及5ng/mL TGF-β1加不同浓度的盐酸去亚甲基小檗碱(10μM、20μM和40μM)， 下层加入600μL含10％FBS的RPMI1640培养基，培养24h，取出小室，吸去上层培养液，PBS洗涤后， 多聚甲醛固定15min，PBS洗涤后，结晶紫染色15min，PBS洗涤后，用棉棒擦去上层未迁移细胞，显微 镜下拍照。
结果：如图11所示，TGF-β1能够促进A549细胞向小室下层迁移，10μM、20μM和40μM的盐酸 去亚甲基小檗碱均能抑制A549细胞迁移。
实施例12免疫荧光检测A549细胞活性氧(ROS)水平
方法：将A549细胞铺入24孔板中，待细胞贴壁后，分别加入5ng/mL TGF-β1以及5ng/mL TGF-β1 加20μM的盐酸去亚甲基小檗碱，培养24h，吸去培养基，PBS洗涤后，加入DCFH-DA探针染色，PBS 洗涤后，加入DAPI染细胞核，荧光拍照，检测DMB抗氧化能力。
结果：如图12所示，TGF-β1能够诱导A549细胞活性氧(ROS)增多，20μM的盐酸去亚甲基小檗 碱能够显著降低活性氧(ROS)水平。
实施例13流式细胞术检测A549细胞活性氧(ROS)水平
方法：将A549细胞铺入6孔板中，待细胞贴壁后，分别加入5ng/mL TGF-β1以及5ng/mL TGF-β1 加不同浓度的盐酸去亚甲基小檗碱(10μM、20μM和40μM)，培养24h，吸去培养基，PBS洗涤后，胰 酶消化细胞，离心收集，加入DCFH-DA探针孵育，PBS洗涤后重悬细胞，上机检测。
结果：如图12所示，TGF-β1能够诱导A549细胞活性氧(ROS)增多，20μM的盐酸去亚甲基小檗 碱能够显著降低活性氧(ROS)水平。
实施例14盐酸去亚甲基小檗碱抑制TGF-β1诱导的肌成纤维细胞转化
方法：培养人肺成纤维细胞MRC-5，铺入6孔板中，分别加入5ng/mL TGF-β1以及5ng/mL TGF-β1 加不同浓度的DMB(10μM、20μM和40μM)，培养24h，吸去培养基，加入裂解液，提取细胞蛋白， Western blot检测Fibronectin表达。
结果：如图14所示，TGF-β1诱导MRC-5细胞Fibronectin表达上调，转化为肌成纤维细胞，40μM 的盐酸去亚甲基小檗碱均能降低Fibronectin表达。
实施例15免疫荧光检测肌成纤维细胞α-SMA表达
方法：培养人肺成纤维细胞MRC-5，铺入24孔板中，分别加入5ng/mL TGF-β1以及5ng/mL TGF-β1 加40μM的DMB，培养24h，吸去培养基，PBS清洗后，固定10min，通透(含0.5％Triton X-100的PBS) 10min，封闭(含0.05％Triton X-100和5％BSA的PBS)1h，加入α-SMA抗体，4℃过夜孵育，吸去一 抗，洗涤后加入Alexa Fluor 488标记的荧光二抗，室温孵育1h，吸去二抗，洗涤后加入DAPI染细胞核， 荧光显微镜拍照。
结果：如图15所示，TGF-β1诱导MRC-5细胞Fibronectin表达上调，转化为肌成纤维细胞，20μM和 40μM的盐酸去亚甲基小檗碱均能降低Fibronectin表达，40μM效果更显著。
实施例16盐酸去亚甲基小檗碱相比于小檗碱和吡非尼酮对肺纤维化小鼠生存率的改善
方法：通过博来霉素(BLM，5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后， 肺纤维化开始形成，开始灌胃给药小檗碱100mg/kg、盐酸去亚甲基小檗碱100mg/kg和吡非尼酮300mg/kg， 给药两周，期间统计正常组、博来霉素诱导组以及博来霉素后分别灌胃三种药物的小鼠生存率。
结果：如图16所示，相比于小檗碱(100mg/kg)，相同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱(100mg/kg)能够 更加显著地改善肺纤维化小鼠生存率；相比于吡非尼酮(300mg/kg)，盐酸去亚甲基小檗碱(100mg/kg) 治疗效果与其相近而给药剂量更低。
实施例17盐酸去亚甲基小檗碱相比于小檗碱和吡非尼酮对肺纤维化小鼠肺系数的降低
方法：通过博来霉素(BLM，5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后， 肺纤维化开始形成，开始灌胃给药小檗碱100mg/kg、盐酸去亚甲基小檗碱100mg/kg和吡非尼酮300mg/kg， 给药两周，取正常组、博来霉素诱导组以及博来霉素后分别灌胃三种药物的小鼠肺组织，称重，统计肺系 数。
结果：如图17所示，小檗碱(100mg/kg)未能显著降低肺纤维化小鼠肺系数，而相同剂量的盐酸去 亚甲基小檗碱(100mg/kg)能够显著地降低纤维化小鼠肺系数；相比于吡非尼酮(300mg/kg)，盐酸去亚 甲基小檗碱(100mg/kg)治疗效果与其相近而给药剂量更低。
实施例18盐酸去亚甲基小檗碱相比于小檗碱和吡非尼酮降低collagen I和α-SMA表达
方法：通过博来霉素(BLM，5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后， 肺纤维化开始形成，开始灌胃给药小檗碱100mg/kg、盐酸去亚甲基小檗碱100mg/kg和吡非尼酮300mg/kg， 给药两周，取正常组、博来霉素诱导组以及博来霉素后分别灌胃三种药物的小鼠肺组织，提取总蛋白， western blot检测collagen I和α-SMA表达。
结果：如图18所示，相比于小檗碱(100mg/kg)，相同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱(100mg/kg)能够 更加显著地降低肺纤维化小鼠肺组织collagen I和α-SMA表达；相比于吡非尼酮(300mg/kg)，盐酸去亚甲 基小檗碱(100mg/kg)治疗效果与其相近而给药剂量更低。
实施例19盐酸去亚甲基小檗碱相比于小檗碱和吡非尼酮对肺纤维化小鼠肺病理损伤的改善
方法：通过博来霉素(BLM，5U/kg)诱导C57BL/6小鼠建立肺纤维化模型，在博来霉素诱导一周后， 肺纤维化开始形成，开始灌胃给药小檗碱100mg/kg、盐酸去亚甲基小檗碱100mg/kg和吡非尼酮300mg/kg， 给药两周，取正常组、博来霉素诱导组以及博来霉素后分别灌胃三种药物的小鼠肺组织，4％多聚甲醛固定， 通过HE染色和MASSON染色检测肺组织病理学变化。
结果：如图19所示，小鼠肺组织病理切片表明，博来霉素诱导后小鼠肺组织肺泡结构破坏，肺泡壁 增厚，肺部胶原纤维沉积，相比于小檗碱(100mg/kg)，相同剂量的盐酸去亚甲基小檗碱(100mg/kg)能 够更加显著地改善小鼠肺部病理损伤；相比于吡非尼酮(300mg/kg)，盐酸去亚甲基小檗碱(100mg/kg) 治疗效果与其相近而给药剂量更低。
实施例20正常小鼠灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱的毒性检测
方法：正常的C57BL/6小鼠，灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱(100mg/kg)，灌胃两周，每天1次，给 药结束后，取小鼠心、肝、脾、肾，称重，计算肺系数。
结果：如图20所示，灌胃给药盐酸去亚甲基小檗碱(100mg/kg)，心、肝、脾、肾各脏器系数未出现 明显变化，小鼠饮食、外观、精神状态、活动未见明显变化，表明盐酸去亚甲基小檗碱安全性高。

Claims (3)

1.盐酸去亚甲基小檗碱在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其中盐酸去亚甲基小檗碱如式(Ⅰ)所示的：
Figure FDA0003798477850000011
2.盐酸去亚甲基小檗碱药物组合物在制备治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于，所述的组合物为含有药物有效剂量的如式(Ⅰ)所示盐酸去亚甲基小檗碱及药学可接受的辅料。
3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述药物组合物是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释剂及各种微粒给药系统。
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