CN103690535A - 盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了如式(I)所示的盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。

Description

盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防或治疗肝纤维化药物中的应用。

背景技术

肝纤维化是多种慢性肝炎的共同病理特点及其慢性肝炎向肝硬化发展的必经之路，研究表明，肝纤维化患者中的20％-40％最终发展为肝硬化乃至肝癌。20世纪50年代，国际肝病学术权威Hans Popper教授首先提出“谁将阻止或延缓肝纤维化的发生，谁就将治愈大多数慢性肝病”，因此防治肝纤维化是慢性肝病的重要治疗策略，探讨肝纤维化的病理机制与防治措施一直是肝病学领域研究的热点。由于获取人体肝组织样本的困难性，建立一个与人类疾病相似的动物模型极为重要。

硫代乙酰胺(TAA)是一种对肝具有很高亲和性的毒性物质，摄入后可经肝细胞内细胞色素P450混合功能氧化酶代谢为TAA硫氧化合物，干扰RNA从细胞核到细胞质的转运过程，影响蛋白质的合成和酶活力，从而导致肝细胞代谢紊乱而坏死。单次腹腔注射TAA可引起急性肝炎，反复注射可使间质内结缔组织生成增多，引起纤维组织在局部的沉积而引发肝纤维化甚至肝硬化。

TAA诱导的肝纤维化模型在血流动力学、形态学和代谢变化方面均与人肝纤维化最相似，而且形成的肝纤维化模型稳定，重复性较好，不易逆转，模型组内个体差异小，纤维化程度一致。因此TAA诱导的肝纤维化是用于肝纤维化机制研究、肝纤维化血清学标志物评价的理想模型。

现代医学尚无安全、高效、廉价的抗肝纤维化药物问世，临床用药有干扰素、单味中药及中药复方等。这些药物有的价格昂贵，有的长期服用有毒副作用，有的效果不显著，重现性差，有的成分复杂，不利于深入研究药物的作用机制。因此，研发安全有效的治疗肝纤维化药物已成为当前药物研究的热点领域之一。

盐酸去亚甲基小檗碱，如式(I)所示，又名去亚甲基小檗碱盐酸盐或脱亚甲基小檗碱盐酸盐。

盐酸去亚甲基小檗碱(式I)的英文名为Demethyleneberberine Hydrochloride或Demethyleneberberine Chloride。本发明专利将它简称为DMB。式(I)中的骨架结构为去亚甲基小檗碱，它是盐酸去亚甲基小檗碱的活性成份。国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)将式(I)中的有机结构部分去亚甲基小檗碱命名9，10-dimethoxy-5,6-dihydroisoquinolino[2，1-b]isoquinolin-7-ium-2,3-diol，其中文名为9，10-二甲氧基-5，6-二氢异喹啉[2，1-b]异喹啉-7-鎓-2，3-二羟基。它的分子式：C19H18NO4+，分子量为：324.35。化学文摘号(CAS)为：25459-91-0。去亚甲基小檗碱可以与无机酸或有机酸形成多种盐，如氯化盐、硫酸盐、磷酸盐、溴化盐、碘化盐、枸橼酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐等分子形式存在。

去亚甲基小檗碱存在于天然药用植物芸香科植物黄柏(Cortex Phellodendri Chinensis)中，由于含量较低，相关活性研究很少。有报道认为它在体外对多种革兰阳性及阴性菌均具有抑菌作用。近年来人们对小檗碱研究非常活跃，发现小檗碱除抗菌活性外，还具有降血糖、降血脂、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等药理作用。人们在研究小檗碱体内代谢过程中，发现小檗碱在体内经肝脏代谢亦可产生去亚甲基小檗碱，但对该代谢产物的药理治疗作用研究和应用未见报道。

迄今为止，现有技术中没有关于盐酸去亚甲基小檗碱或去亚甲基小檗碱对肝纤维化预防和/或治疗作用的记载和报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种预防或治疗肝纤维化的化合物，特别是提供了如式(I)所示的盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)作为预防或治疗肝纤维化药物的应用。

本发明通过建立TAA诱导的急性肝炎、慢性肝纤维化动物模型，观察盐酸去亚甲基小檗碱对急性肝炎、慢性肝纤维化的预防与治疗作用并探讨其作用机理。研究结果表明，盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对TAA诱导的急性肝炎、慢性肝纤维化具有预防保护和治疗作用。

本发明以小鼠为动物试验模型，通过预防性给药治疗，首先考察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对TAA诱导的亚急性肝炎的预防性治疗作用。预防性治疗方案是在腹腔注射TAA造模前，通过腹腔注射给予小鼠DMB，每天一次，共三天，给药组分别设置了5mg/kg(IP)和10mg/kg(IP)两个剂量组。末次给药1h后，腹腔注射60mg/kg的TAA，使小鼠产生亚急性肝炎，禁食18h后，处死小鼠。实验结果分析表明，DMB给药组，无论是低剂量组或高剂量组，均能显著降低小鼠亚急性肝炎引起的ALT和AST升高作用，显示出DMB对TAA诱导的亚急性肝炎具有明显的保护作用。此外，与模型组相比，DMB低剂量和高剂量组的MDA均降低了36.4％，该研究结果表明DMB具有降低脂质过氧化产物MDA水平，起到抗氧化损伤的作用。肝脏病理学研究结果表明：模型组各例肝脏肝细胞均见较严重的变性，细胞核仁边集(核仁肥大靠近核边缘)，胞浆深伊红染，大部分小鼠肝脏细胞坏死，胞核呈溶解状或碎裂状，而盐酸去亚甲基小檗碱预防给药组无论低剂量或高剂量，均能明显减轻上述肝细胞病变，各例均无肝细胞坏死，只出现轻微的嗜酸性变。这些实验结果充分地说明了盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)能有效地预防性治疗TAA诱导的亚急性肝炎。

本发明在预防性治疗成功的基础上，开展治疗性实验研究，考察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对TAA诱导的急性肝炎的直接治疗作用。此方案是先腹腔注射100mg/kg的TAA，使小鼠产生急性肝炎，8h后当小鼠出现肝损伤时，再采用腹腔注射(IP)法给予DMB治疗，每8h注射一次，共注射2次，DMB设置了5mg/kg(IP)和10mg/kg(IP)两个剂量组。TAA腹腔注射18h后，处死小鼠。实验结果表明，经盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)治疗后，与模型组相比，DMB低剂量和高剂量组的ALT分别降低了36.0％和45.8％，AST分别降低了26.1％和41.4％。肝脏病理学研究结果表明：模型组肝脏组织结构不完整，2例脏脏大部分肝细胞灶性坏死，较多炎细胞浸润；4例肝脏小部分肝细胞灶性坏死，个别例伴随较多炎细胞浸润；DMB低剂量组只有1例肝脏呈少部分肝细胞灶性坏死，较多炎细胞浸润，其余各例肝脏少量肝细胞变性，和/或少量肝细胞坏死；个别例伴随较少炎细胞浸润。DMB高剂量组肝脏肝细胞轻微或轻度变性，肝细胞轻微或轻度坏死，个别例伴随较少炎细胞浸润。这些实验结果说明：无论是预防性治疗还是直接治疗，盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)均能有效地预防和/或治疗TAA诱导的急性肝炎。

本发明在预防性治疗和直接治疗均成功的基础上，进一步提高TAA的浓度，建立高浓度TAA诱导的急性重症肝炎模型，考察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对TAA诱导的急性重症肝炎的保护作用。此方案是小鼠腹腔注射250mg/kg的TAA，每天一次，共三天，给药组是在每次注射TAA前1h，腹腔注射10mg/kg的盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)。从给第一针TAA开始的四天内，记录各组小鼠每天的存活率，并观察期间小鼠的精神状态、活动量及体温等。实验结果表明，模型组小鼠从第三天开始存活率急剧下降，四天后无一存活；而盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)组的小鼠三天后无一只死亡，四天后的存活率高达80％。期间模型组小鼠毛发分叉少光泽，精神萎靡，活动减少，身体发冷；而盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)组只有个别小鼠毛发分叉，活动量减少，其它小鼠精神状态均正常，所有小鼠体温未降低。这些实验结果说明：盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)能显著降低TAA诱导的急性重症肝炎的死亡率，使存活率保持在80％。

最后，本发明在急性肝炎治疗成功的基础上，重点考察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对小鼠慢性肝纤维化的治疗与保护作用。通过长期给予高浓度TAA，制备TAA诱导的小鼠慢性肝纤维化模型，造模共耗时10周。首先，前两周小鼠腹腔注射100mg/kg的TAA，之后八周腹腔注射200mg/kg的TAA，TAA每隔一天注射一次；DMB设置了10mg/kg(IP)和20mg/kg(IP)两个剂量组，每天注射一次；末次注射TAA48h后处死小鼠。从裸眼看，模型鼠的肝脏明显肿大，颜色暗淡，表面粗糙不光滑，质地发实变硬；而盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)组无论低剂量或是高剂量，小鼠肝脏不肿大，表面尚光滑，质地尚软，接近于正常小鼠的肝脏；与正常鼠相比，模型鼠的体重下降了13.5％，肝重及肝重/体重指数分别升高了43.8％和54.5％，经盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)治疗后体重开始回升，肝重恢复到正常水平，肝重/体重指数明显下降。肝功能指标结果表明，经盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)治疗后，与模型组相比，DMB低剂量和高剂量组的ALT分别降低了48.4％和49.3％，AST分别降低了47.6％和38.7％，ALB分别升高了10.4％和22.5％。肝脏病理学研究结果表明，正常鼠肝脏组织结构清楚完整，间质无纤维组织增生；模型鼠肝脏组织结构不完整，较多炎细胞浸润，胶原纤维增生明显，较多假小叶形成；盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)组无论低剂量或高剂量，肝脏组织结构均尚清楚，只有少量炎细胞浸润，胶原纤维略有增生，未形成明显的假小叶。对Masson染色图中胶原分布面积进行半定量分析结果表明，模型鼠肝脏胶原分布较多，纤维较粗，相互交错，其分布面积是盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)低剂量组的16.3倍，高剂量组的17.9倍，而给药组的肝脏只零星分布一些胶原纤维。对肝脏α-SMA进行的免疫组织化学分析结果表明，模型组肝脏的α-SMA较多，表示活化的肝星状细胞分布较多，而给药后显著减少，说明DMB能减少活化的肝星状细胞的数目，抑制纤维增生。这些结果表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对TAA诱导的慢性肝纤维化具有很好的预防作用。

本发明所用盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)产品采用常规化学与分离纯化法制得。本实验室采用高效液相色谱(HPLC)分析检测，其纯度达98％以上，并经化学法、红外色谱法、质谱(MS)法和核磁共振(¹H-NMR)法分析鉴定，表明本研究所用盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)产品化学结构正确。此项研究表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)其纯度和化学结构符合开展体内、外生物学活性和药理作用研究要求。

根据本发明还涉及含有作为活性成份的盐酸去亚甲基小檗碱和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1～95％重量％的盐酸去亚甲基小檗碱。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1～100mg。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂如琼脂粉、干燥粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成份本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、分散剂、渗透压调节剂、增溶剂和pH调节剂。如稀释可选用水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、甘油、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂，还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或香料等。这些辅料是本领域常用的。

本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌过虑器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。

为了达到用药目的，增加治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。当然用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。

对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。

给药剂量是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

去亚甲基小檗碱既是药用植物芸香科植物黄柏中存在的天然产物，又是小檗碱在体内肝脏中的代谢产物，天然环保，无毒高效。本发明提供了盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的作用和用途。

术语

DMB：盐酸去亚甲基小檗碱

TAA：硫代乙酰胺

ALT/AST：谷丙转氨酶/谷草转氨酶

ALB：白蛋白

MDA：丙二醛

IP：腹腔注射

α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白

HSC：肝星状细胞

附图说明

图1盐酸去亚甲基小檗碱的HPLC分析图

图2盐酸去亚甲基小檗碱的质谱图

图3盐酸去亚甲基小檗碱的¹H-NMR图

图4盐酸去亚甲基小檗碱的¹³C-NMR图

图5盐酸去亚甲基小檗碱的红外光谱图(IR)

图6TAA诱导的亚急性肝炎小鼠肝组织病理形态和肝细胞超微结构的变化

A：正常小鼠肝组织HE染色图(×200)；

B：亚急性肝炎模型小鼠肝组织HE染色图(×200)；

C：DMB-5mg/kg组小鼠肝组织HE染色图(×200)；

D：DMB-10mg/kg组小鼠肝组织HE染色图(×200)

图7TAA诱导的急性肝炎小鼠肝组织病理形态和肝细胞超微结构的变化

A：正常小鼠肝组织HE染色图(×200)；

B：急性肝炎模型小鼠肝组.织HE染色图(×200)；

C：DMB-5mg/kg组小鼠肝组织HE染色图(×200)；

D：DMB-10mg/kg组小鼠肝组织HE染色图(×200)

图8TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠肝脏表观形态的变化

图9TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠肝组织病理形态和肝细胞超微结构的变化

A：正常小鼠肝组织HE染色图(×200)；

B：慢性肝纤维化模型小鼠肝组织HE染色图(×200)；

C：DMB-l0mg/kg组小鼠肝组织HE染色图(×200)；

D：DMB-20mg/kg组小鼠肝组织HE染色图(×200)

图10TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠肝组织Masson胶原染色图

A：正常小鼠肝组织Masson胶原染色图(×200)；

B：慢性肝纤维化模型小鼠肝组织Masson胶原染色图(×200)；

C：DMB-10mg/kg组小鼠肝组织Masson胶原染色图(×200)；

D：DMB-20mg/kg组小鼠肝组织Masson胶原染色图(×200)

图11TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠肝脏α-SMA免疫组织化学图

A：正常小鼠肝组织α-SMA免疫组化图(×400)；

B：慢性肝纤维化模型小鼠肝组织α-SMA免疫组化图(×400)；

C：DMB-10mg/kg组小鼠肝组织α-SMA免疫组化图(×400)；

D：DMB-20mg/kg组小鼠肝组织α-SMA免疫组化图(×400)

具体实施方式

下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

一、理化性质试验

本发明所用盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)为药用级天然提取物，纯度为98％。外观为橙黄色粉末，无臭。熔点220℃-222℃。易溶于DMSO，甲醇，热水，微溶于冷水或乙醇，极微溶于氯仿，乙酸乙酯，不溶于乙醚。为了开展有效的药理学活性研究，本研究首先对DMB纯度与化学结构进行分析鉴定。

实施例1.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)纯度分析

方法：采用HPLC方法分析，将DMB用甲醇溶解，并经0.22um微孔滤膜过滤，配成终浓度为20ng/u1样品准备分析。HPLC色谱仪：Agilent1200高效液相色谱仪。色谱柱：AgilentEclipse XDB-C18(4.6×150mm，5um)。流动相：(A)水(含0.1％的三氟乙酸)，(B)乙腈(含0.1％的三氟乙酸)。HPLC梯度洗脱条件：0min，10％B；0-15min，90％B；15-18min，90％B；18-20min，10％B；20-24min，10％B。检测波长：349nm。柱温：30℃，流速：1.0ml/min，进样体积：10ul。

结果：HPLC分析结果如图1所示，盐酸去亚甲基小檗碱的保留时间为6.639min,纯度大于98.0％以上，符合生物活性和药理学实验研究要求。

实施例2盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)的结构鉴定

方法：分子结构鉴定采用质谱和核磁共振波谱分析法。质谱仪器为Waters Q-TOFMicroTM，离子化方式：ESI(+)，质量扫描范围：m/z80-1000，毛细管电压：2500V，锥孔电压：25V，离子源温度：100℃，雾化气温度：200℃，锥孔气流速：50L/hr，雾化气流速：400L/hr。核磁共振波谱仪(¹H-NMR)为AVANCE AV-300，照射频率为300MHz，所用溶剂：氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)，所用标准物为四甲基硅烷(TMS)。

结果：去亚甲基小檗碱的正离子质谱分析结果如图2所示，ESI-MS(m/z)：分子离子基峰[M-CI]⁺＝324.2和[MH-C1]⁺325.2。这与去亚甲基小檗碱的理论分子量相一致，盐酸去亚甲基小檗碱中的氯离子在质谱ESI(+)中无显示。按中国药典(2010年版，第二部)附录III中有关氯化物的鉴别(1)反应方法鉴定氯离子。取DMB0.1克，加水20ml，缓缓加热溶解后，加硝酸0.5ml,冷却，放置10分钟，过滤，向滤液中滴加硝酸银试液后，生成白色凝乳状沉淀，离心，收集沉淀，沉淀中加氨试液溶解，再加稀硝酸酸化后，沉淀生成。表明本实验样品盐酸去亚甲基小檗碱中含有氯离子。质谱和化学分析法显示盐酸去亚甲基小檗碱分子量正确。

盐酸去亚甲基小檗碱的¹H-NMR(DMSO-d6)氢谱分析结果如图3所示，DMB分子中各种氢的归属见表1。¹H-NMR图谱中去亚甲基小檗碱分子中2，3位的两酚羟基峰显著，分别位于δ9.361和10.165ppm。这是参照品小檗碱的标准氢谱图中所没有的，表明去亚甲基小檗碱结构正确。另外，图3中δ2.501为溶剂峰，δ3.319为水峰。

表1盐酸去亚甲基小檗碱的化学位移和氢归属(1H-NMR，DMSO-d6)

我们还对DMB进行了碳谱(¹³C-NMR)[见图4]，DMB分子中各种碳的归属如表2所示：

表2盐酸去亚甲基小檗碱的化学位移和碳归属(¹³C-NMR，DMSO-d6)

也测定了DMB的红外光谱(IR)[见图5]，各峰对应基团如下所示；

3415.51(V_OH)；3163.16(V＝_CH)；1639.60，1607.42(V_C＝C)；1399.66，1364.00(δ_CH3)；1139.44，1109.56(V_C-O)

以上结果表明本研究所用样品盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)结构正确，符合生物活性和药理学研究要求。

二、药理实验研究

实施例5.DMB预防性治疗对TAA诱导的亚急性肝炎肝功能的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为四组，每组5只，分别为正常对照组(Normal)、TAA模型组(TAA)、DMB低剂量给药组(DMB-5mg/kg，IP)和高剂量给药组(DMB-10mg/kg，IP)。给药组腹腔注射DMB，每天一次，共三天，其余各组给予同体积的赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物腹腔注射60mg/kg的TAA，禁食18h后，摘眼球取血，室温静置30分钟后，于4℃，4000rpm离心10min，取血清，用南京建成试剂盒分析测定血清中ALT和AST的活性。

结果：实验结果如表3所示，小鼠经腹腔注射60mg/kgTAA后，模型组血清ALT和AST均显著升高，分别是正常对照组的14.5倍和3.9倍，而DMB给药组，无论是低剂量组(5mg/kg，IP)或高剂量(10mg/kg，IP)组，均能显著降低亚急性肝炎引起的ALT、AST升高作用。由此可见，DMB具有明显的抗亚急性肝炎和保护肝功能的作用。

表3DMB预防性治疗对TAA诱导的亚急性肝炎小鼠血清ALT和AST的影响

(Values are expressed as mean±SD for5mice.***P＜0.001，compared to TAA group.)

实施例6.DMB预防性治疗对TAA诱导的亚急性肝炎氧化损伤的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为四组，每组5只，分别为正常对照组(Normal)、TAA模型组(TAA)、DMB低剂量给药组(DMB-5mg/kg，IP)和高剂量给药组(DMB-10mg/kg，IP)。给药组腹腔注射DMB，每天一次，共三天，其余各组给予同体积的赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物腹腔注射60mg/kg的TAA，禁食18h后处死动物，不同小鼠取同一部位肝组织，于冰浴上以生理盐水制成10％的肝匀浆液，离心后取上清，按照南京建成试剂盒说明，测定肝组织中脂质过氧化物MDA水平。

结果：如表4所示，与对照组相比，模型组小鼠的肝脏脂质过氧化物MDA升高46.7％，。而DMB给药组，无论是低剂量组(5mg/kg，IP)或高剂量(10mg/kg，IP)组，均能显著降低MDA并恢复至正常水平。研究结果表明DMB具有降低脂质过氧化产物MDA水平，起到抗氧化损伤的作用。

表4DMB预防性治疗对TAA诱导的亚急性肝炎小鼠肝脏MDA的影响

(Values are expressed as mean±SD for5mice.*P＜0.05，**p＜0.01，compared to TAA group.)

实施例7.DMB预防性治疗对TAA诱导的亚急性肝炎病理学改变的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为四组，每组5只，分别为正常对照组(Normal)、TAA模型组(TAA)、DMB低剂量给药组(DMB-5mg/kg，IP)和高剂量给药组(DMB-10mg/kg，IP)。给药组腹腔注射DMB，每天一次，共三天，其余各组给予同体积的赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物腹腔注射60mg/kg的TAA，禁食18h后处死动物，不同小鼠取肝脏大叶同一部位以10％的中性福尔马林液固定，HE染色进行病理学检查。所有形态改变根据轻重评分为“1”“2”“3”“4”：0表示无病变；1表示轻微损伤；2表示轻度损伤；3表示中度损伤；4表示重度损伤。

结果：病理评分如表5所示，肝脏病理学研究表明，模型组各例肝脏肝细胞均见较严重的变性，细胞核仁边集(核仁肥大靠近核边缘)，胞浆深伊红染，大部分小鼠肝脏细胞坏死，胞核呈溶解状或碎裂状，而盐酸去亚甲基小檗碱预防给药组无论低剂量或高剂量，均能明显减轻上述肝细胞病变，各例均无肝细胞坏死，只出现轻微的嗜酸性变，HE染色图见图6所示。

表5DMB预防性治疗对TAA诱导的亚急性肝炎小鼠病理学改变的影响

(Values are expressed as total scores for5mice.*P＜0.05，**p＜0.01，***P＜0.001,compared to TAA group.)

实施例8.DMB治疗对TAA诱导的急性肝炎小鼠肝功能的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为四组，每组6只，分别为正常对照组(Normal)、TAA模型组(TAA)、DMB低剂量给药组(DMB-5mg/kg，IP)和高剂量给药组(DMB-10mg/kg，IP)。除正常对照组外，其余各组动物腹腔注射100mg/kg的TAA，使小鼠产生急性肝炎，8h后当小鼠出现肝损伤时，再采用腹腔注射法给予DMB治疗，每8h注射一次，其余各组给予相同剂量的赋形剂。TAA腹腔注射18h后，小鼠摘眼球取血，室温静置30分钟后，于4℃，4000rpm离心10mn，取血清，用南京建成试剂盒分析测定血清中ALT和AST的活性。

结果：实验结果如表6所示。小鼠经腹腔注射100mg/kgTAA后，模型组血清ALT和AST急剧升高，分别是正常对照组的170倍和5倍。而经盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)治疗后，与模型组相比，DMB低剂量和高剂量组的ALT分别降低了36.0％和45.8％，AST分别降低了26.1％和41.4％。由此可见，DMB具有明显的治疗TAA诱导的急性肝炎作用。

表6DMB治疗对TAA诱导的急性肝炎小鼠血清ALT和AST的影响

(Values are expressed as mean+SD for6mice.**p＜0.01，***P＜0.001，compared to TAA group)

实施例9.DMB治疗对TAA诱导的急性肝炎病理学改变的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为四组，每组6只，分别为正常对照组(Normal)、TAA模型组(TAA)、DMB低剂量给药组(DMB-5mg/kg，IP)和高剂量给药组(DMB-10mg/kg，IP)。除正常对照组外，其余各组动物腹腔注射100mg/kg的TAA，使小鼠产生急性肝炎，8h后当小鼠出现肝损伤时，再采用腹腔注射法给予DMB治疗，每8h注射一次，其余各组给予相同剂量的赋形剂。TAA腹腔注射18h后处死动物，不同小鼠取肝脏大叶同一部位以10％的中性福尔马林液固定，HE染色进行病理学检查。病理改变根据轻重评分为“1”“2”“3”“4”：0表示无病变；

1表示个别肝细胞变性，以核仁边集或水肿的形式；和/或个别肝细胞坏死，胞核浓缩、碎裂或溶解，个别例伴随个别炎细胞浸润；

2表示少量肝细胞变性，以水肿或嗜酸性变的形式，和/或少量肝细胞坏死，个别例伴随少量炎细胞浸润；

3表示少部分肝细胞呈灶性坏死，个别例伴随较多炎细胞浸润；

4表示大部分肝细胞呈灶性坏死，个别例伴随较多炎细胞浸润。

结果：病理评分如表7所示，肝脏病理学研究表明，模型组肝脏组织结构不完整，2例脏脏大部分肝细胞灶性坏死，较多炎细胞浸润；4例肝脏小部分肝细胞灶性坏死，个别例伴随较多炎细胞浸润；DMB低剂量组只有1例肝脏呈少部分肝细胞灶性坏死，较多炎细胞浸润，其余各例肝脏少量肝细胞变性，和/或少量肝细胞坏死；个别例伴随较少炎细胞浸润。DMB高剂量组肝脏肝细胞轻微或轻度变性，肝细胞轻微或轻度坏死，个别例伴随较少炎细胞浸润，HE染色图见图7所示。

表7DMB治疗对TAA诱导的急性肝炎小鼠病理学改变的影响

(Values are expressed as total scores and mean±SD for6mice.**p＜0.01，***P＜0.001，compared to TAAgroup)

实施例10.DMB对TAA诱导的急性重症肝炎的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重25-28克，随机分为三组，每组10只，分别为正常对照组(Normal)、TAA模型组(TAA)、DMB给药组(10mg/kg，IP)。除正常组给予同体积的赋形剂外，其它各组小鼠腹腔注射250mg/kg的TAA，每天一次，共三天，给药组是在每次注射TAA前1h，腹腔注射10mg/kg的盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)。从给第一针TAA开始的四天内，记录各组小鼠每天的存活率，并观察期间小鼠的精神状态、活动量及体温等。

结果：实验结果如表8所示，模型组小鼠从第三天开始存活率急剧下降，四天后无一存活；而盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)组的小鼠三天后无一只死亡，四天后的存活率高达80％。期间模型组小鼠毛发分叉少光泽，精神萎靡，活动减少，身体发冷；而盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)组只有个别小鼠毛发分叉，活动量减少，其它小鼠精神状态均正常，所有小鼠体温未降低。这些实验结果说明：盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)能显著降低TAA诱导的急性重症肝炎的死亡率。

表8DMB对TAA诱导的急性重症肝炎存活率的影响

(^a Numbers of surviving animals in each group at each time point.

^bThe final survival rate on day4.)

实施例11.DMB对TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠肝脏表观形态的改善作用

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为四组，每组8只，分别为正常对照组(Normal))TAA模型组(Model)、DMB低剂量给药组(DMB-10mg/kg，IP)和高剂量给药组(DMB-20mg/kg，IP)。造模共耗时10周，除正常组外，其它各组小鼠前两周腹腔注射100mg/kg的TAA，后八周腹腔注射200mg/kg的TAA，TAA每隔一天注射一次；给药组每天腹腔注射一次相应剂量的DMB；末次注射TAA48h后处死小鼠。取全肝，肉眼观察肝脏体积、颜色和质地等，并拍照。

结果：从裸眼看，模型鼠的肝脏明显肿大，颜色暗淡，表面粗糙不光滑，质地发实变硬；而盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)组无论低剂量或是高剂量，小鼠肝脏不肿大，表面尚光滑，质地尚软，接近于正常小鼠的肝脏。由此可见，DMB能显著改善慢性肝纤维化小鼠肝脏的表观形态，使其接近于正常小鼠。各组小鼠的肝脏图见图8所示。

实施例12.DMB对TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠体重、肝重及肝/体指数的改善作用

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为四组，每组8只，分别为正常对照组(Normal)、TAA模型组(Model)、DMB低剂量给药组(DMB-10mg/kg，IP)和高剂量给药组(DMB-20mg/kg，IP)。造模共耗时10周，除正常组外，其它各组小鼠前两周腹腔注射100mg/kg的TAA，后八周腹腔注射200mg/kg的TAA，TAA每隔一天注射一次；给药组每天腹腔注射一次相应剂量的DMB；末次注射TAA48h后，处死小鼠，取全肝，记录小鼠体重、肝重，并计算肝重/体重比值。

结果：实验结果如表9所示，与正常鼠相比，模型鼠的体重下降了13.5％，肝重及肝重/体重指数分别升高了43.8％和54.5％，经盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)治疗后体重开始回升，肝重恢复到正常水平，肝重/体重指数明显下降。由此可见，DMB对肝纤维化引起的小鼠肝重、体重异常有很好的改善作用。

表9DMB对TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠体重、肝重及肝/体指数的改善作用

(Values are expressed as mean±SD for8mice.**p＜0.01，***P＜0.001，compared to model group.)

实施例13.DMB对TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠肝功能的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为四组，每组8只，分别为正常对照组(Normal)、TAA模型组(Model)、DMB低剂量给药组(DMB-10mg/kg，IP)和高剂量给药组(DMB-20mg/kg，IP)。造模共耗时10周，除正常组外，其它各组小鼠前两周腹腔注射100mg/kg的TAA，后八周腹腔注射200mg/kg的TAA，TAA每隔一天注射一次；给药组每天腹腔注射一次相应剂量的DMB；末次注射TAA48h后，小鼠摘眼球取血，室温静置30分钟后，于4℃，4000rpm离心10min，取血清，用南京建成试剂盒分析测定血清中ALT、AST活性及ALB含量。

结果：实验结果如表10所示，经DMB治疗后，与模型组相比，DMB低剂量和高剂量组的ALT分别降低了48.4％和49.3％，AST分别降低了47.6％和38.7％，ALB分别升高了10.4％和22.5％。由此可见，DMB对TAA诱导的肝纤维化具有很好的保护作用。

表10DMB对TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠血清ALT、AST和ALB的影响

(Values are expressed aS mean±SD for8mice.*p＜0.05，***P＜0.001，compared to model group.)

实施例14.DMB对TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠病理学改变的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为四组，每组8只，分别为正常对照组(Normal)、TAA模型组(Model)、DMB低剂量给药组(DMB-10mg/kg，IP)和高剂量给药组(DMB-20mg/kg，IP)。造模共耗时10周，除正常组外，其它各组小鼠前两周腹腔注射l00mg/kg的TAA，后八周腹腔注射200mg/kg的TAA，TAA每隔一天注射一次；给药组每天腹腔注射一次相应剂量的DMB；末次注射TAA48h后处死动物，不同小鼠取肝脏大叶同一部位以10％的中性福尔马林液固定，对常规病理学改变做HE染色，纤维化根据轻重依次评分为“1”“2”“3”“4”：

0表示：正常，无纤维组织增生；

1表示：轻微纤维化，胶原纤维从肝门三联或中央静脉延伸到周边区域；

2表示：轻度纤维化，胶原纤维存在区域扩大，但没有形成纤维间隔；

3表示：中度纤维化，胶原纤维普遍存在，并伴有假小叶形成；

4表示：重度纤维化，假小叶大量形成，部分小室壁加厚。

结果：纤维化评分如表11所示，肝脏病理学研究结果表明，正常鼠肝脏组织结构清楚完整，间质无纤维组织增生；模型鼠肝脏组织结构不完整，胶原纤维增生明显，较多假小叶形成；盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)组无论低剂量或高剂量，肝脏组织结构均尚清楚，胶原纤维略有增生，未形成明显的假小叶。由此可见，DMB能显著抑制胶原纤维增生，对TAA诱导的慢性肝纤维化具有很好的保护作用。HE染色见图9所示。

表11DMB对TAA诱导的肝纤维化小鼠纤维增生的影响

(^aData represent the number of mice rated with a given level of hepatic fibrosis.

^bThe individual severity rates in mice were expressed as mean±SD gor8mice.

***P＜0.001，compared to model group.)

实施例15.DMB对TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠肝脏胶原纤维分布的影响

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为四组，每组8只，分别为正常对照组(Normal)、TAA模型组(Model)、DMB低剂量给药组(DMB-10mg/kg，IP)和高剂量给药组(DMB-20mg/kg，IP)。造模共耗时10周，除正常组外，其它各组小鼠前两周腹腔注射100mg/kg的TAA，后八周腹腔注射200mg/kg的TAA，TAA每隔一天注射一次；给药组每天腹腔注射一次相应剂量的DMB；末次注射TAA48h后处死动物，不同小鼠取肝脏大叶同一部位以10％的中性福尔马林液固定，对胶原纤维做Masson染色。每组切片随机选取5个视野，采用OLYMPUSDP2-BSW图像分析软件定量分析胶原纤维的分布面积。

结果：胶原纤维分布面积百分比如表12所示，Masson胶原染色见图10所示，结果表明，模型鼠肝脏胶原分布较多，纤维较粗，相互交错，其分布面积是盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)低剂量组的16.3倍，高剂量组的17.9倍，而给药组的肝脏只零星分布一些胶原纤维。由此可见，DMB能显著抑制胶原增生，改善肝纤维化。

表12DMB对TAA诱导的肝纤维化小鼠纤维分布面积的影响

(Values are expressed as mean±SD for5random fields.***P＜0.001，compared to model group.)

实施例16.DMB对TAA诱导的慢性肝纤维化小鼠肝脏α-SMA表达的影响

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为四组，每组8只，分别为正常对照组(Normal)、TAA模型组(Model)、DMB低剂量给药组(DMB-10mg/kg，IP)和高剂量给药组(DMB-20mg/kg，IP)。造模共耗时10周，除正常组外，其它各组小鼠前两周腹腔注射l00mg/kg的TAA，后八周腹腔注射200mg/kg的TAA，TAA每隔一天注射一次；给药组每天腹腔注射一次相应剂量的DMB；末次注射TAA48h后处死动物，不同小鼠取肝脏大叶同一部位以10％的中性福尔马林液固定，经石蜡包埋和切片后，采用SABC法对肝脏中α-SMA进行免疫组织化学定位分析。

结果：肝纤维化的核心是肝星状细胞(HSC)活化产生胞外基质蛋白，引起间质胶原纤维增加，纤维束收缩，导致肝小叶结构物理性破坏和肝脏血流模式的继发性破坏。α-SMA是HSC活化的标志，其分布范围可以代表活化的肝星状细胞数目。如图11所示，模型组肝脏的α-SMA分布较多，而给药后显著减少，说明DMB能减少活化的肝星状细胞的数目，抑制纤维增生，改善肝纤维化。

Claims (3)

1.如式(I)所示的盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。

2.一种预防或治疗肝纤维化的药物组合物，其特征在于，含有药物有效剂量的如式(I)所示盐酸去亚甲基小檗碱及药用载体。

3.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释剂及各种微粒给药系统。

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