CN104490876A - 盐酸小檗碱在制备预防和/或治疗急性肝衰竭药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了如式(I)所示的盐酸小檗碱在制备预防和/或治疗急性肝衰竭药物中的应用，属于生物医药领域。本发明通过建立D-氨基半乳糖联合LPS诱导的急性肝衰竭小鼠动物模型，考察盐酸小檗碱对急性肝衰竭的预防和治疗作用。通过生药理学和分子生物学等实验分析，结果显示盐酸小檗碱给药不仅明显降低转氨酶，抑制氧化应激损伤、抑制炎症因子释放等作用，而且可以显著性降低急性肝衰竭小鼠的死亡率。因此，本申请专利的研究结果表明盐酸小檗碱可在制备预防和/或治疗急性肝衰竭药物中的得到应用。

Description

盐酸小檗碱在制备预防和/或治疗急性肝衰竭药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸小檗碱在制备预防和/或治疗急性肝衰竭药物中的应用。

背景技术

盐酸小檗碱(Berberine Hydrochloride，BBR)，常用名为黄连素，它是中药黄连中主要的异喹啉生物碱，含量达5％～8％，占黄连总生物碱的40％左右。它的分子式为C₂₀H₁₈ClNO₄，化学名为5，6-二氢-9，10-二甲氧苯并[g]-1，3-苯并二氧戊环[5，6-α]喹嗪盐酸盐，结构如式(I)所式：

盐酸小檗碱早已被中国药典收录，目前临床上用于治疗由细菌感染引起的胃肠道疾病。近年来，大量研究表明小檗碱具有多种生物学功能，除传统抗菌外，它还有抗心律失常、抗传染性原虫、抗氧化、降糖、调脂、降压和强心等作用。有研究证明盐酸小檗碱具有很好的保肝作用，如Janbaz等研究证明小檗碱对乙胺苯酚和四氯化碳引起的化学性肝损伤具有显著的治疗作用。

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是指既往无慢性肝病的患者突然出现大量肝细胞凋亡、坏死，肝功能显著异常，在短期内(8周)迅速进展至肝性脑病的一种可逆性综合征。肝移植是目前临床唯一有效治疗手段，但由于供肝短缺患者需等待时间较长，以及移植后复杂的术后并发症、免疫抑制剂和抗生素的大量使用等问题的存在。虽然近年来，肝移植的开展使急性肝衰竭的整体生存率明显升高，但因肝脏供体不足、严重并发症及高额医疗费用等因素，我国急性肝衰竭的病死率仍居高不下，寻找有效的治疗药物及药物作用靶点已成为肝病研究的重要方向。

D-GalN联合小剂量LPS诱导建立的急性肝衰竭动物模型是筛选保肝药物的理想动物模型，其与HBV所致肝功能衰竭有较高的临床相关性，是目前比较公认的急性肝衰竭动物模型之一。该模型以热毒血瘀证为主，符合临床急性肝衰竭的最主要病机——热毒炽盛和瘀血阻络，因而清解湿热、清热解毒、凉血活血类中药可能是治疗急性肝衰竭的有效中药的主体，其他功效的中药作为必要的补充。甘草酸制剂、水飞蓟素类、多烯磷脂酰胆碱和还原型谷胱甘肽等药物有不同程度的抗氧化、抗炎和保护肝细胞膜及细胞器等作用，临床应用可改善肝脏生物化学指标。这些药物有的价格昂贵，有的效果不显著。因此，研发安全有效的治疗急性肝衰竭的药物已成为当前药物研究的热点领域之一。

迄今为止，现有技术中没有关于盐酸小檗碱及其衍生物对急性肝衰竭预防和/或治疗作用的记载和报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种预防或治疗急性肝损伤的化合物，特别是提供了如式(I)所示的盐酸小檗碱作为预防或治疗急性肝衰竭药物的应用。

本发明通过建立D-GalN联合LPS诱导的急性肝衰竭小鼠模型，观察盐酸小檗碱对急性肝衰竭的预防性治疗作用并探讨其作用机理。研究结果表明，盐酸小檗碱(BBR)对D-GalN联合LPS诱导的急性肝衰竭具有预防性治疗作用。

本发明以ICR小鼠为动物试验模型，通过预防性给药治疗，考察盐酸小檗碱(BBR)对急性肝衰竭的预防性治疗作用。预防性治疗方案是在造模之前，分别通过腹腔注射给与小鼠BBR，给药组分别设置了5mg/kg(i.p.)或10mg/kg(i.p.)两个剂量组，总共给药3天。末次给药1小时后，除对照组外，其他各组小鼠腹腔注射D-GalN(800mg/kg)和LPS(30μg/kg)进行造模。首先，造模后观察盐酸小檗碱对小鼠24小时存活率的影响。然后，重新造模，并分别在造模2小时和6小时两个时间点处理小鼠。2小时时间点检测小鼠血清炎症因子水平，6小时时间点检测小鼠肝损伤指标。实验结果分析表明，24小时存活率，模型组为0，小檗碱低剂量组为28.6％，小檗碱高剂量组为71.4％。运用RT-PCR技术检测造模后2小时小鼠肝组织中TNF-α，IL-1β，IL-18，Caspase-1和NLRP3mRNA表达量。实验结果表明盐酸小檗碱能够显著降低肝脏中TNF-α，IL-1β，IL-18，Caspase-1和NLRP3的mRNA表达量，该结果说明盐酸小檗碱对D-GalN联合LPS诱导的急性肝衰竭引起的炎症因子和炎症小体的升高具有明显的抑制作用，并且可以抑制细胞凋亡。造模后6小时，BBR给药组，无论是低剂量给药组还是高剂量给药组均能显著性降低小鼠急性肝损伤引起的ALT和AST升高作用。此外，与模型组相比，BBR低剂量和高剂量组MDA分别显著性降低，而GSH分别升高约43％和48％。这些研究结果表明BBR具有降低脂质过氧化产物MDA水平，促进GSH再生，增强肝脏自由基的清除能力。肝脏病理学研究结果表明：小鼠急性肝损伤模型组则出现肝组织失去正常肝小叶结构，肝索解离，大面积肝组织溶解，肝细胞弥漫性坏死，见大量嗜酸性坏死，嗜酸性小体形成和炎性细胞浸润，肝窦内可见红色。盐酸小檗碱预防给药组可明显减轻上述肝细胞病变，使之恢复正常或接近于正常水平。这些实验结果充分地说明了盐酸小檗碱(BBR)能有效地预防治疗急性肝衰竭。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂如琼脂粉、干燥粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成份本发明化合物小檗碱与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明化合物小檗碱制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、分散剂、渗透压调节剂、增溶剂和pH调节剂。如稀释可选用水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、甘油、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂，还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或香料等。这些辅料是本领域常用的。

本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌过滤器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。

为了达到用药目的，增加治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。当然用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。

对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量做出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。

给药剂量是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

小檗碱是天然药用植物中的提取物，天然环保，无毒高效。本发明提供了盐酸小檗碱在制备预防和/或治疗急性肝衰竭药物中的作用和用途。

术语

BBR：盐酸小檗碱

D-GalN：D-氨基半乳糖

LPS：脂多糖

i.p.：腹腔注射

ALT：谷丙转氨酶

AST：谷草转氨酶

MDA：丙二醛

GSH：谷胱甘肽

TNF-α：肿瘤坏死因子α

IL-1β：白细胞介素1β

IL-18：白细胞介素18

Caspase-1：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1

NLRP3：NOD样受体蛋白3

mRNA：信使RNA

RT-PCR：实时荧光定量聚合酶链反应

附图说明

图1急性肝损伤小鼠肝脏炎症因子基因表达水平

A：急性肝损伤小鼠肝脏TNF-α基因表达水平

B：急性肝损伤小鼠肝脏IL-1β基因表达水平

C：急性肝损伤小鼠肝脏IL-18基因表达水平

D：急性肝损伤小鼠肝脏NLRP3基因表达水平

图2急性肝损伤小鼠肝脏caspse-1基因表达水平

图3急性肝衰竭小鼠肝组织病理学形态和肝细胞超微结构的变化

A，B：正常小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；

C，D：急性肝衰竭模型小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；

E，F：BBR低剂量组小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；

G，H：BBR高剂量组小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)

具体实施方式

下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

一、小檗碱(BBR)对急性肝衰竭的预防与治疗作用

实施例1.BBR预防性治疗对急性肝衰竭小鼠存活率保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24克，随机分为3组，每组7只。3组分别为模型组、BBR低剂量给药组(5mg/kg)和高剂量给药组(10mg/kg)。给药组连续腹腔注射给药3天，每天一次，模型组给予同体积赋形剂。末次给药1h后，各组动物腹腔注射D-GalN 800mg/kg和LPS 30μg/kg进行造模。记录造模后24h内各组小鼠的存活情况。

结果：实验结果如表1所示，小鼠经造模后24h时存活率，模型组存活率为0，而给药组低剂量和高剂量分别为28.6％和71.4％。由此可见，BBR具有明显的抑制急性肝衰竭导致的小鼠死亡情况。

表1 BBR预防性治疗对小鼠急性肝损伤存活率的影响

实施例2.BBR预防性治疗对急性肝衰竭小鼠肝损伤炎症损伤的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24克，随机分为4组，每组10只。4组分别为正常对照组、模型组、BBR低剂量给药组(5mg/kg)和高剂量给药组(10mg/kg)。给药组连续腹腔注射给药3天，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物腹腔注射D-GalN 800mg/kg和LPS 30μg/kg进行造模。造模后2h处死小鼠，不同小鼠取同一部位肝组织，用Trizol法提取总RNA，运用RT-PCR法检测小鼠肝脏TNF-α、IL-1β和IL-18mRNA的表达水平。

结果：实验结果如表2和图1所示，小鼠腹腔注射D-GalN 800mg/kg和LPS 30μg/kg后2小时，模型组小鼠肝中TNF-α、IL-1β，IL-18和NLRP3的mRNA含量均显著升高，分别是正常对照组的90倍，36，1.5倍，2.4倍和13倍，而BBR预防给药组均能显著降低急性肝衰竭引起的TNF-α、IL-1β，IL-18和NLRP3的mRNA表达水平的升高。由此可见，BBR具有明显的抗急性肝衰竭引起的炎症因子升高，说明BBR对急性肝衰竭引起的炎症反应具有抑制作用。

表2 BBR预防性治疗对急性肝衰竭小鼠肝脏炎症因子表达水平的影响

(Values are expressed as mean±SD for10mice.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared to Model group.)

实施例3.BBR预防性治疗对急性肝衰竭小鼠肝脏Caspase-1表达抑制作用

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24克，随机分为4组，每组10只。4组分别为正常对照组、模型组、BBR低剂量给药组(5mg/kg)和高剂量给药组(10mg/kg)。给药组连续腹腔注射给药3天，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物腹腔注射D-GalN 800mg/kg和LPS 30μg/kg进行造模。造模后2h处死小鼠，不同小鼠取同一部位肝组织，用Trizol法提取总RNA，运用RT-PCR法检测小鼠肝脏Caspase-1mRNA的表达水平。结果：实验结果如表3和图2所示，小鼠腹腔注射D-GalN 800mg/kg和LPS 30μg/kg后2小时，模型组小鼠肝中的Caspase-1mRNA含量显著升高，是正常对照组的2.4倍，而BBR预防给药组均能显著降低急性肝衰竭引起的Caspase-1的mRNA表达水平的升高，说明BBR可有效抑制急性肝衰竭小鼠肝细胞的凋亡。

表3 BBR预防性治疗对急性肝衰竭小鼠肝脏Caspase-1表达水平的影响

(Values are expressed as mean±SD for10mice.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared to Model group.)

实施例4.BBR预防性治疗对急性肝衰竭小鼠肝功能的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24克，随机分为4组，每组10只。4组分别为正常对照组、模型组、BBR低剂量给药组(5mg/kg)和高剂量给药组(10mg/kg)。给药组连续腹腔注射给药3天，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物腹腔注射D-GalN 800mg/kg和LPS 30μg/kg进行造模。造模6h后处死小鼠，摘眼球取血，静置30分钟，离心3000rpm/10min，常规分离血清。用南京建成试剂盒分析测定血清中ALT和AST值。

结果：实验结果如表4所示。小鼠在腹腔注射D-GalN 800mg/kg和LPS 30μg/kg后，与正常组相比模型组小鼠血清ALT、AST升高约8.2倍和5.6倍，而BBR给药组，无论是低剂量组(5mg/kg)或高剂量(10mg/kg)给药组，均能显著降低小鼠急性肝衰竭引起的ALT、AST升高作用。由此可见，BBR具有明显的改善急性肝衰竭引起的肝功能异常作用。

表4 BBR预防性治疗对急性肝衰竭小鼠ALT和AST影响

(Values are expressed as mean±SD for10mice.**P＜0.01，***P＜0.001，comparedto Model group.)

实施例5.BBR预防性治疗对急性肝衰竭小鼠肝氧化损伤的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24克，随机分为4组，每组10只。4组分别为正常对照组、模型组、BBR低剂量给药组(5mg/kg)和高剂量给药组(10mg/kg)。给药组连续腹腔注射给药3天，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物腹腔注射D-GalN 800mg/kg和LPS 30μg/kg进行造模。造模后6h处死小鼠，不同小鼠取同一部位肝组织，于冰浴上以PBS制成10％肝匀浆。按照试剂盒(南京建成)说明测定肝组织中脂质过氧化物MDA水平。DTNB法测定抗氧化物质GSH。

结果：如表5所示，与对照组相比，模型组小鼠肝脏脂质过氧化物MDA升高2倍左右，GSH降低约50％。与模型组相比，BBR低剂量和高剂量组MDA分别降低47％和52％，并且GSH分别升高约45％和48％。研究结果表明，BBR能显著性地抑制急性肝衰竭小鼠肝脏的脂质过氧化升高和GSH耗竭。

表5 BBR预防性治疗对小鼠急性肝衰竭肝脏抗氧化的影响

(Values are expressed as mean±SD for10mice.***P＜0.001，compared to Model group.)

实施例6.BBR预防性治疗对急性肝衰竭小鼠肝损伤病理学改变的影响

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24克，随机分为4组，每组10只。4组分别为正常对照组、模型组、BBR低剂量给药组(5mg/kg)和高剂量给药组(10mg/kg)。给药组连续腹腔注射给药3天，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物腹腔注射D-GalN 800mg/kg和LPS 30μg/kg进行造模。造模后6h处死小鼠，取肝脏大叶同一部位组织以10％甲醛固定，各组随机选取5个样本，随后HE染色进行病理学检查。

结果：病理评分如表6所示，肝脏病理学研究结果表明，小鼠急性肝损伤模型组则出现肝组织失去正常肝小叶结构，肝索解离，大面积肝组织溶解，肝细胞弥漫性坏死，见大量嗜酸性坏死，嗜酸性小体形成和炎性细胞浸润，肝窦内可见红色。盐酸小檗碱预防给药组可明显减轻上述肝细胞病变，使之恢复正常或接近于正常水平。HE染色图见图3所示。

表6 BBR预防性治疗对急性肝衰竭小鼠肝脏病理学改变的影响

(Values are expressed as mean±SD for10mice.*P＜0.05，***P＜0.001，comparedto Model group.)

注：所有形态改变根据轻重评分为“1”“2”“3”“4”，分别表示如下，无病变评分为“0”。

“1”个别肝细胞变性，以核仁边集或空泡变的形式；和/或个别肝细胞坏死，胞核浓缩、碎裂或溶解

“2”少量肝细胞变性，以核仁边集或空泡变的形式；和/或少量肝细胞坏死，胞核浓缩、碎裂或溶解；个别例淤血

“3”少部分肝细胞呈变性、坏死；个别例轻微淤血

“4”大部分肝细胞呈变性、坏死；明显淤血

实施例7.BBR预防性治疗对急性肝衰竭小鼠肝脾指数的改善作用

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24克，随机分为4组，每组10只。4组分别为正常对照组、模型组、BBR低剂量给药组(5mg/kg)和高剂量给药组(10mg/kg)。给药组连续腹腔注射给药3天，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物腹腔注射D-GalN 800mg/kg和LPS 30μg/kg进行造模。造模后分别于2h和6h两个时间点处理小鼠，处死前称小鼠体重并记录，出死后去全肝和脾脏称重记录，并计算肝/体、脾/体的比值。

结果：实验结果如表7所示，造模后2h和8h，与对照组相比，模型组小鼠肝脏和脾脏指数明显升高，给药组无论是低剂量组还是高剂量组，均能改善肝体和脾体指数。由此可见，BBR对D-GalN/LPS引起的小鼠急性肝衰竭的小鼠肝重和脾重异常有很好的改善作用。

表7 BBR对D-GalN/LPS诱导的急性肝衰竭小鼠肝体指数和脾体指数的影响

(Values are expressed as mean±SD for 10mice.*p＜0.05，**p＜0.01，***P＜0.001，compared to model group.)。

Claims (3)

1.如式(I)所示的盐酸小檗碱在制备预防和/或治疗急性肝衰竭药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物包括活性成分盐酸小檗碱，以及药剂学上可接受的辅料。

3.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释剂及各种微粒给药系统。