CN115998758B - 甲钴胺及药物组合物在制备用于治疗肝衰竭药物中的应用 - Google Patents

甲钴胺及药物组合物在制备用于治疗肝衰竭药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115998758B
CN115998758B CN202310186711.1A CN202310186711A CN115998758B CN 115998758 B CN115998758 B CN 115998758B CN 202310186711 A CN202310186711 A CN 202310186711A CN 115998758 B CN115998758 B CN 115998758B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mecbl
liver failure
gsdme
mecobalamin
ctx
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310186711.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115998758A (zh
Inventor
郝海平
曹丽娟
许万峰
崔青青
张川
林杨昊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Pharmaceutical University
Original Assignee
China Pharmaceutical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Pharmaceutical University filed Critical China Pharmaceutical University
Priority to CN202310186711.1A priority Critical patent/CN115998758B/zh
Publication of CN115998758A publication Critical patent/CN115998758A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115998758B publication Critical patent/CN115998758B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了甲钴胺(MeCbl)及药物组合物在制备用于治疗肝衰竭药物中的应用，首次提出MeCbl通过与GSDME蛋白直接结合并抑制其活化，进而抑制由GSDME引起的细胞焦亡，并首次提出MeCbl或者含MeCbl的组合物及其医药用途，MeCbl可通过静脉注射和口服给药两种途径治疗肝衰竭或者MeCbl/CTX组合药物可通过静脉注射和口服给药两种途径协同增效治疗肝衰竭。本发明中甲钴胺或其组合物对肝衰竭的治疗具有强效作用，为临床上这类难治性肝病提供新的治疗药物。本发明为老药新用，组合药物分子的药代动力学资料较为详尽，安全可靠且副作用很轻，新适应症的开发很快就能进入临床评估，缩短研发周期，节约开发成本。

Description

甲钴胺及药物组合物在制备用于治疗肝衰竭药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及甲钴胺及其组合药物在制备用于治疗肝衰竭药物中的应用。
背景技术
细胞死亡作为组织器官衰竭进程中的重要病理事件，是介导心肌梗死、慢性肾衰竭和急慢性肝衰竭等多种疾病的共同病因(LncRNA FAF attenuates hypoxia/ischaemia-induced pyroptosis via the miR-185-5p/PAK2 axis in cardiomyocytes.J Cell MolMed,2022.00:1–13.Caspase-11-mediated tubular epithelial pyroptosis underliescontrast-induced acute kidney injury.Cell Death Dis,2018.9:983)。尤其感染、滥用药物等因素引起的肝细胞大范围不可逆坏死引发的肝失代偿、急性肝衰竭等危重症状导致患者致死率居高不下，而临床上缺乏对因治疗药物，异甘草酸镁、乙酰半胱氨酸等主流保肝药物难以根治，目前只能通过人工肝或肝移植等手术方案进行治疗(Acute liverfailure.Lancet,2019.394:869-881.Liver failure-future challenges and remainingquestions.Ann Transl Med,2021.9:734.Liver transplantation in acute liverfailure:Dilemmas and challenges.World J Transplant,2021.11:187-202)。虽然上述手术治疗极大缓解部分肝衰竭患者危重症状，降低患者死亡率，但也存在治疗成本高、需长期服用免疫抑制剂和排异反应等缺陷。肝衰竭病理机制复杂多样，各类感染、药物、自身免疫等因素是诱发肝脏过度炎症反应、进而导致肝细胞大量死亡的主要诱因，同时，疾病进程中伴随产生的多种并发症如胆汁淤积可进一步加剧肝损伤程度(Farnesoid X ReceptorRegulation of the NLRP3 Inflammasome Underlies Cholestasis-AssociatedSepsis.Cell Metab,2017.25,856–867.)。因此，从肝细胞死亡这一共性病理特征入手，开发有效干预细胞死亡途径的治疗药物对于肝衰竭乃至多器官衰竭的防治具有重要意义。
最新研究表明，细胞焦亡是一种程序性细胞死亡途径，参与多种疾病发生发展进程中，包括病毒性肺炎、药物性肝损伤和梗阻性肾病等。其中，gasdermin家族蛋白gasdermin D(GSDMD)和gasdermin E(GSDME)两种亚型是介导细胞焦亡的关键执行蛋白，二者可在活性caspase的剪切作用下活化产生具有膜穿孔毒性的活性蛋白片段进而引发细胞焦亡。感染因素可通过激活免疫细胞中GSDMD诱导免疫细胞过度炎症和炎性坏死，而药物、胆淤等因素可通过激活GSDME诱导实质细胞、上皮细胞发生快速焦亡，进而导致器官功能障碍(Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of agasdermin.Nature,2017.547:99-103；Apaf-1 Pyroptosome Senses MitochondrialPermeability Transition.Cell Metab,2021.33,424–436)。上述两种通路是诱发炎症性病变、坏死性病变的重要基础，且敲除该类基因可显著缓解上述疾病模型小鼠病理症状，提示GSDMD和GSDME可能是治疗焦亡相关疾病的新靶标(IL-6Prevents Lung MacrophageDeath and Lung Inflammation Injury by Inhibiting GSDME-and GSDMD-MediatedPyroptosis during Pneumococcal Pneumosepsis.Microbiol Spectr,2022.02049-21.Drug induced liver injury:an update.Arch Toxicol,2020.94:3381-3407)。
目前针对gasdermin蛋白特异性抑制剂研究仍处于起步阶段，如FDA批准的富马酸二甲酯(Dimethylfumarate,DMF)、双硫仑(disulfiram，DSF)可通过结合GSDMD和GSDME蛋白半胱氨酸位点抑制其活化和细胞焦亡。但由于DMF本身属于微毒物质，研究还发现除gasdermin家族蛋白外DMF和DSF还作用于焦亡通路中多个关键节点(如caspase-1)，因而作用选择性较差(Succination inactivates gasdermin D and blockspyroptosis.Science,2020.369:1633-1637)。综上，随着细胞焦亡与疾病之间关联的进一步清晰，然而靶向抑制gasdermin的药物研究较少，亟需筛选、设计更多高效、低毒和靶向性好的gasdermin抑制药物用于治疗诸如肝衰竭、肝炎/肝硬化等疾病，以及用于研究与细胞焦亡有关疾病的机理和药物开发。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了靶向抑制细胞焦亡的药物分子及组合药物，本发明中提供了甲钴胺在制备GSDME抑制药物中的应用，甲钴胺通过抑制GSDME进而抑制GSDME介导的细胞焦亡；进一步地，甲钴胺在制备治疗各类急性、慢性组织器官损伤或衰竭中的应用。本发明提供了更多的低毒和靶向性好的gasdermin抑制药物用于治疗诸如肝衰竭、肝炎/肝硬化等疾病。
本发明还提供一种含甲钴胺用于治疗肝衰竭的药物组合物。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述甲钴胺在制备Gasdermin E(GSDME)抑制药物中的应用。
其中，所述甲钴胺可与GSDME蛋白在分子水平产生直接相互作用，抑制GSDME的活化及其介导的细胞焦亡。
本发明所述甲钴胺在制备治疗由GSDME介导的疾病的药物中的应用。
其中，所述疾病包括肝衰竭、肾衰竭、肺衰竭和心衰竭。
进一步地，所述肝衰竭包括急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭以及感染合并肝衰竭。
本发明所述甲钴胺在制备治疗急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭以及感染合并肝衰竭药物中的应用。
本发明所述含有甲钴胺的药物组合物在制备治疗急性肝衰竭、慢加急肝衰竭、慢性肝衰竭以及感染合并肝衰竭药物中的应用。
其中，所述药物组合物是一种包含甲钴胺和Gasdermin D(GSDMD)抑制药物的组合物，所述的GSDMD抑制药物为舒布硫铵、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵、头孢曲松钠其中的一个或多个组合。
其中，所述药物组合物为甲钴胺和头孢曲松钠组合物，经静脉注射或口服用于治疗各型肝衰竭，所述药物组合物中：甲钴胺和头孢曲松钠质量组成比范围为(0.1～3)：50。
其中：所述组合物包括各种以组合物制备而成的药物制剂，具体包括胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
本发明通过研究发现三种抑制GSDME的药物分子甲钴胺(MeCbl，式I)、头孢唑兰(Cefozopran，式II)和头孢噻利(Cefoselis，式III)，所述药物分子化学结构式如下所示：
进一步的，所述抑制GSDME的药物分子还包括药学上可接受的衍生物，包括但不局限于：药学上可接受的前药、盐、酯类盐，或者能直接或间接根据动物需求给药的其他任何衍生物。
进一步地，所述三种抑制GSDME的药物分子甲钴胺、头孢唑兰和头孢噻利可在分子水平直接干预GSDME活化介导的脂质体膜损伤。
优选地，MeCbl可与GSDME蛋白在分子水平产生特异性、直接相互作用，抑制GSDME活化产生具有细胞毒性的片段和下游生物学效应，抑制肝细胞焦亡。
进一步地，在胆汁淤积性(胆管结扎，BDL)肝衰竭动物模型中，MeCbl可通过静脉注射和口服给药两种途径治疗急性肝衰竭。
本发明通过研究发现，三种抑制GSDMD药物分子头孢曲松钠(CTX，式IV)、舒布硫铵(SUL，式V)、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC，式VI)：
进一步地，所述三种GSDMD抑制分子还包括药学上可接受的衍生物，包括但不限于：药学上可接受的前药、盐、酯类盐，或者能直接或间接根据动物需求给药的其他任何衍生物。
进一步地，所述三种GSDMD抑制分子可与GSDMD蛋白在分子水平产生特异性、直接相互作用，抑制GSDMD活化产生具有细胞毒性的片段。
进一步地，所述三种GSDMD抑制分子可抑制GSDMD活化的下游生物学效应，抑制免疫细胞焦亡。
本发明重点还提供一种含有MeCbl的药物组合物，所述组合物由MeCbl与上述三种GSDMD抑制分子中的一种或多种进行组合而成。
进一步地，所述含有MeCbl的药物组合物可用于制备抗细胞焦亡相关工具分子或试剂、抗细胞焦亡或组织器官坏死相关疾病药物。
进一步地，所述细胞焦亡或组织器官坏死相关疾病包括与细胞焦亡相关的各类急性、慢性组织器官损伤或衰竭病症。
更为关键地，MeCbl和CTX组合药物，可通过同步抑制GSDME和GSDMD两个蛋白的活化、产生协同抑制细胞焦亡的效果。
进一步地，在胆管结扎联合LPS诱导(BDL+LPS)的复合型肝衰竭小鼠模型中，通过静脉注射、口服两种给药途径，均证实了组合药物协同药效，即MeCbl和CTX联用显著增强了单一药物对肝衰竭的治疗效果。
本发明通过研究发现了Gasdermin E(GSDME)抑制药物，包括甲钴胺、头孢唑兰和头孢噻利；以及GSDMD抑制药物，包括头孢曲松钠、舒布硫铵、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵，这些化合物均首次公开上述抑制途径。更为重要的是，本发明研究发现，通过Gasdermin E(GSDME)抑制药物如甲钴胺可以有效用于抑制GSDME的活化及其介导的细胞焦亡，进而发挥甲钴胺治疗急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭以及感染合并肝衰竭中的应用。同时，本发明通过实验发现，通过将甲钴胺(GSDME抑制药物)与头孢曲松钠(GSDMD抑制药物)联用，可以协同抑制细胞焦亡并且显著增强了单一药物对复合型肝衰竭的治疗效果。
本发明提出了一种新的肝衰竭的药物治疗策略，即应用头孢曲松钠(CTX)、舒布硫铵(SUL)或吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)中的任一种与MeCbl组合，可用于治疗肝衰竭，属于老药新用。该组合药与现有的肝衰竭治疗目标与效果完全不同，MeCbl可抑制gasdermin E(GSDME)蛋白介导的细胞焦亡，同步应用CTX、SUL或PDTC等可抑制gasdermin D(GSDMD)介导的免疫细胞焦亡和炎症反应。并且，优选的MeCbl与CTX组合药在感染合并胆汁淤积复合型肝衰竭模型中有显著的协同治疗效果。此外，本发明还发现头孢类抗生素头孢唑兰、头孢噻利可在分子水平抑制GSDME引发的脂质体渗漏。本发明所涉及的药物分子药代动力学及安全性资料较为详尽，在缩短研发周期的同时可有望开发一种全新的肝衰竭、以及其它由GSDME/GSDMD细胞焦亡途径介导的组织器官衰竭的治疗药物。
本发明为老药新用，组合药物分子的药代动力学资料较为详尽，安全可靠且副作用很轻，新适应症的开发很快就能进入临床评估，缩短研发周期，节约开发成本。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明首次公开了抑制GSDME的药物MeCbl、Cefozopran和Cefoselis及其用途，其中MeCbl通过与GSDME蛋白直接结合并抑制其活化，进而抑制由GSDME引起的细胞焦亡，并首次公开了MeCbl或者含MeCbl的组合物及其医药用途，MeCbl可通过静脉注射和口服给药两种途径治疗肝衰竭或者MeCbl/CTX组合药物可通过静脉注射和口服给药两种途径协同增效治疗肝衰竭。特别地，本发明提供的MeCbl/CTX组合物能够使BDL/LPS模型诱发的肝衰竭小鼠血清ALT、AST、IL-1β分别下降57％和45％和81％，证明该组合物对肝衰竭的治疗具有强效作用，可望为临床上这类难治性肝病提供新的治疗药物。本发明为老药新用，组合药物分子的药代动力学资料较为详尽，安全可靠且副作用很轻，新适应症的开发很快就能进入临床评估，缩短研发周期，节约开发成本。
附图说明
图1为在脂质体-蛋白温孵体系中MeCbl(A)、Cefozopran(B)、Cefoselis(C)对GSDME活化引发的脂质体泄露抑制作用。图中横坐标为化合物梯度浓度的log值(0.15、0.3、0.6125、1.25、2.5、5、10μM)，纵坐标为脂质体内Tb3+离子泄露后产生的相对荧光值，红色字体为化合物抑制Tb3+离子泄露的IC50。
图2为利用微热泳动法(MST)研究MeCbl与人重组caspase-3、GSDME和GSDMD蛋白相互作用(A)，进而研究MeCbl对温孵体系中GSDME蛋白活化的影响(B)。A图中Vehicle为溶剂对照，甲钴胺梯度浓度为0.8，1.6，3.2，6.25，12.5，25，50，100，200μM，分子与蛋白孵育30min后基于Nano Temper MST分子互作仪分析二者之间的相互作用，代表性微热泳动曲线图和分析软件计算二者解离常数Kd结果。B图为1μM MeCbl在温孵体系中与GSDME蛋白预孵育30min后对caspase-3作用下GSDME活化的影响。
图3为研究MeCbl对顺铂(DDP)引发的小鼠原代肝实质细胞焦亡的影响。A图中预给肝细胞20μM MeCbl或溶剂对照Vehicle后再利用20μg/mL DDP刺激细胞16h，纵坐标为扣除本底后的LDH释放比例(相对于最大释放量)用于指征细胞焦亡比例。B图为预给小鼠原代肝细胞20μM MeCbl或溶剂对照后对DDP诱发的GSDME蛋白活化的影响。***p＜0.001，vsVehicle。
图4为MeCbl对胆汁酸DCA引发的小鼠原代肝实质细胞焦亡的影响。A图中预给肝细胞20μM MeCbl或溶剂对照Vehicle后再利用200μM DCA刺激细胞6h，纵坐标为扣除本底后的LDH释放比例(相对于最大释放量)用于指征细胞焦亡比例。B图为预给小鼠原代肝细胞20μMMeCbl或溶剂对照后对DCA诱发的GSDME蛋白活化的影响。**p＜0.01，vs Vehicle。
图5为静脉注射(i.v.)或口服(i.g.)MeCbl对小鼠肝衰竭血清生化指标的影响：谷丙转氨酶(ALT)(A)、谷草转氨酶(AST)(B)。(横坐标为给药途径与剂量，溶剂对照为生理盐水，肝衰竭模型为胆管结扎(BDL)，纵坐标为小鼠血清ALT、AST水平)。###p＜0.001，vssham；*p＜0.05，vs Vehicle。
图6为利用微热泳动法(MST)研究CTX、SUL和PDTC三种化合物与人重组GSDMD蛋白相互作用，化合物浓度梯度为0.8，1.6，3.2，6.25，12.5，25，50，100，200μM。分子与蛋白孵育30min后基于Nano Temper MST分子互作仪分析二者之间的相互作用，代表性微热泳动曲线图(A-CTX，B-SUL，C-PDTC)和分析软件计算二者解离常数Kd(D)结果。
图7为CTX、SUL和PDTC三种化合物对LPS诱发的BMDMs巨噬细胞焦亡的影响。梯度浓度化合物(0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50μM)预给细胞2h后利用转染试剂Fugene HD将LPS导入细胞造模16h构建GSDMD介导的细胞焦亡模型。图中横坐标为化合物梯度浓度的log值(A-CTX，B-SUL，C-PDTC)，纵坐标为扣除本底后的LDH释放比例(相对于最大释放量)用于指征细胞焦亡比例，红色为化合物抑制细胞焦亡的IC50。
图8为MeCbl与CTX、SUL、PDTC中任一组合及相应单分子对LPS(GSDMD介导)+DCA(GSDME介导)诱导的复合型BMDMs巨噬细胞焦亡的影响。表中分组栏为各化合物单独或与甲钴胺组合预给细胞浓度与组别，扣除本底后的LDH释放比例(相对于最大释放量)用于指征细胞焦亡比例，化合物组合后的协同指数(CI)用于指征组合药协同抑制细胞焦亡效应强弱。
图9为小鼠静脉注射(i.v.)或口服(i.g.)给予MeCbl、CTX、MeCBl+CTX优选组合药对肝衰竭血清生化指标的影响，包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)和炎症因子(IL-1β)。表中分组栏为各化合物给药途径与剂量，肝衰竭模型为BDL(GSDME介导)+LPS(GSDMD介导)复合模型，ALT、AST、TBIL和IL-1β水平用于指征小鼠肝衰竭发病程度，组合药物的协同指数(CI)用于指征组合药干预肝衰竭病理发展的协同效应强弱。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明不受到这些实施例的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售获得。实验方法为常规的方法。
1.实验材料
1.1仪器与设备
MST分子互作仪(NanoTemper，德国)、Synergy TM2多功能酶标仪(BioTek,美国)、电泳所需设备包括Mini-Protean Tetra System以及Trans-Blot Turbo System(Bio-Rad，美国)、Synergy TM2多功能酶标仪(BioTek,美国)、iBright CL1000 System(Invitrogen，美国)、Milli-Q Gradient A10超纯水器(Millipore，美国)、Forma-86C超低温冰箱、HERAcell 150i CO2培养箱以及MSC 1.2型生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，美国)、细胞计数仪Cellometer Mini(Nexcelom，美国)、Soniprep150超声破碎仪(SANYO，日本)、5810R型高速离心机(Eppendorf，德国)、岛津AW120型电子分析天平(Shimadzu,日本)、岛津AUW 120D型电子分析天平(Shimadzu,日本)。
1.2试剂
MeCbl、DDP、CTX、SUL、PDTC、cefozopran、cefoselis、DPA(MCE，美国)，DCA、LPS(Sigma，美国)，含Tb3+脂质体(上海研诺生物科技有限公司)，GAPDH抗体(AbwaysTechnology)、GSDME抗体(Abcam，英国)，重组人GFP-caspase-3、GFP-GSDMD、GFP-GSDME蛋白(南京德泰生物科技有限公司)，乳酸脱氢酶LDH释放检测试剂盒、BCA法蛋白定量试剂盒(碧云天生物科技有限公司)，谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，IL-1β检测试剂盒(上海依科赛生物科技有限公司)，MST专用Monolith TM NT RED-MALEIMIDE蛋白荧光标记试剂盒(NanoTemper，德国)，其他实验相关溶剂、盐、化学试剂等(南京化学试剂股份有限公司)。
1.3实验动物
25g 6周龄左右SPF级C57/BL6J雄性小鼠，购买自南京大学模式动物研究所。
2.实验方法
2.1溶液与药物配制
MeCbl、CTX、PDTC、cefozopran、cefoselis：使用生理盐水稀释MeCbl、CTX成工作浓度用于小鼠灌胃和尾静脉注射给药，使用脂质体温孵缓冲液稀释MeCbl、CTX、PDTC、cefozopran、cefoselis成工作浓度用于分子水平给药，使用1640培养基稀释MeCbl、CTX、PDTC成工作浓度用于细胞给药。
SUL：使用DMSO溶液制备储备液，使用1640培养基稀释SUL成工作浓度用于细胞给药。
DCA、DDP：使用DMSO溶液制备储备液，使用1640培养基稀释成工作浓度用于细胞造模。
MeCbl/CTX混合：使用生理盐水稀释MeCbl、CTX成工作浓度并直接混合用于小鼠灌胃和尾静脉注射给药。
使用PBS缓冲液稀释MeCbl、CTX、SUL、PDTC成工作浓度用于MST互作分析，使用生理盐水稀释LPS用于小鼠感染性肝衰竭造模。
脂质体温孵缓冲液配方：20mM HEPES，150mM NaCl和50μM DPA溶于超纯水置于磁力搅拌器上充分搅拌，调节pH至7.5，置于4℃中备用。
PBS缓冲液配方：0.20g KCl，8.00g NaCl，0.20g KH2PO4，2.080g Na2HPO4·12H2O，精密称取置于烧杯中，使用去离子水定容至1L，置于磁力搅拌器上充分搅拌，调节pH至7.5，置于常温中备用。
2.2 BDL胆汁淤积性肝衰竭模型建立
本实验采用胆管结扎方法构建肝衰竭模型：C57BL/6J雄性小鼠(6周龄)随机分组，每组9只，对照组实施假手术，造模组小鼠麻醉后，将小鼠四肢固定在手术热板上，使用手术剪将小鼠腹腔正中切开，找到胆总管，一般位于肝脏后方。小心地用7-0缝合线结扎胆管，并同时在假手术中只打开腹腔不结扎胆管，然后用酒精棉签擦拭切口，并在切口上注入0.5mL，0.9％的生理盐水以提高恢复和生存率。使用5-0缝合线小心的将切口表皮层和真皮层缝合好，并在缝合伤口处滴加0.5mL 1×青霉素-链霉素双抗生素溶液以排除非必须的细菌感染。
2.3 BDL/LPS复合型肝衰竭模型建立
本实验采用小鼠胆管结扎24h后再腹腔注射小鼠LPS构建复合型肝衰竭模型：在上述胆管结扎手术24h后，小鼠腹腔注射20mg/kg LPS，6h后处死并收集样本。
2.4原代小鼠肝细胞分离培养方法
本实验采用异氟烷麻醉小鼠后将小鼠腹部向上固定，消毒小鼠腹部后用剪刀从下腹部剪开表皮和肌肉层并直线开腹直到肝门静脉和下腔静脉充分暴露。启动蠕动泵，待套管针前端有冲洗液体流出后将套管针插入门静脉中。插管成功后立即剪断下腔静脉释放压力并将灌流速度加大到约8mL/min，缓冲液以1-2mL/s的速度递增通过肝脏进行灌注。当HBSS缓冲液即将耗尽时，向容器中补加70mL消化液，按压下腔静脉5-10次，每次按压约5s。当肝脏开始膨胀后进行1-3min的灌注消化后关闭蠕动泵。立即将肝脏浸入含有消化液的培养皿中并转移至生物安全柜中，利用剪刀和镊子将肝脏撕开后，夹住肝脏的中央部位并轻轻摇动以分散残留的细胞。丢弃残留的固体颗粒，用25mL移液器在原培养皿中吹打悬浮液三次。通过70-75μm滤网过滤细胞悬浮液。50g、4℃离心2min。用无菌巴氏管吸走上清，加入25mL冷培养基。轻轻吹打几次以溶解底部的细胞团块并重悬。重复此步骤两次以上，洗涤3次。最后一次离心完成后，弃上清并加入25-45mL冷培养基，铺板备用。
2.5原代小鼠单核巨噬细胞(BMDMs)分离培养方法
本实验采用小鼠迅速脱颈致死后，使用75％的乙醇消毒5min。在无菌的生物安全柜内，配合使用无菌手术剪和镊从后腿上剥下皮肤，弃去双脚，在髋关节处切下后腿，将其浸泡在装有无菌75％乙醇的培养皿中2min，然后用无菌PBS涮洗掉乙醇。用镊子和剪刀将肌肉从腿上剥离并打开两端骨头疏通腿部。将20mL注射器插入股骨的骨髓腔中，用无菌PBS冲洗骨腔，直到彻底将骨髓冲洗干净，然后用70μm筛网过滤掉骨髓碎屑。将细胞以500g转速离心10min，使用红细胞裂解缓冲液重悬细胞沉淀5min，再次500g离心5min，最后使用DMEM完全培养基重悬并计数，按照合适的密度点入孔板内，其中DMEM完全培养基包含20％的L-929细胞条件培养基和10％的FBS。每3天更新一次培养基，并在第7天准备用于下一步实验。
2.6 Tb3+脂质体-蛋白溫孵体系测定药物抑制作用
脂质体-蛋白温孵体系总体积为80μL，分四步逐次加入反应各组分。首先将20μL终浓度(均为体系中终浓度)为0.2μM的GSDME蛋白缓冲液与20μL梯度终浓度的药物分子在37℃预孵30min，阴性对照组加入20μL空白缓冲液。再向体系中加入20μL终浓度为0.2μM的caspase-3活性蛋白(用于剪切活化GSDME)，阴性对照组加入20μL空白缓冲液，37℃温孵2h，最终再加入20μL终浓度为200μM的含Tb3+离子的脂质体溶液，避光孵育过夜。最终依靠GSDME蛋白活化后导致脂质体穿孔泄露内部Tb3+与缓冲液中DPA产生共轭荧光(Ex276/Em545)作为膜穿孔检测信号。使用GraphPad prism 8.0软件进行数据处理并拟合成抑制率-log[浓度]抑制曲线，各药物分子的抑制率(％)＝100％-(药物分子组-阴性对照组)/(模型泄露组-阴性对照组)和IC50值。
2.7 SDS-PAGE电泳检测脂质体温孵体系和细胞内GSDME蛋白活化
样本预处理：对于脂质体温孵体系，直接在上述80μL温孵体系中吸取30μL温孵液体加入1/3体积的蛋白变性buffer后煮沸变性待用；对于细胞全蛋白提取：处理时间到后，PBS洗干净培养基，每孔再加入1mL PBS并使用细胞刮将贴壁的细胞刮干净，悬液分装至1.5ml EP管中，4℃离心2500-3000rpm，5min。离心完毕后，弃管中上清，根据细胞量加入适量的RIPA裂解液(预加蛋白酶抑制剂PIC，1：100，即1ml RIPA中加入10μL PIC)，加入后可用枪轻轻吹打使之混匀，冰上裂解15min。15min后，超声破碎细胞至悬液透明，4℃离心13000g，10min，将上清合并转移至新EP管中，吸取部分上清液用于蛋白定量，余下上清根据体积加入体积量1/3体积的蛋白变性buffer，煮沸变性5min。转移出的蛋白上清中取出1-2μL利用PBS进行稀释，BCA法定蛋白浓度。
SDS-PAGE流程：根据所需目的蛋白分子量，制备合适胶浓度的SDS-PAGE胶，吸取适量变性后样本上样于凝胶孔中。在浓缩胶恒压75V，35min，分离胶恒压115V，60min两步法下进行样本压缩与蛋白分离。电泳结束后，根据分子量和泳道数裁剪合适大小的PVDF膜，先置于纯甲醇中活化1min，再放入半干转印缓冲液中备用，平衡10min。平衡结束后，转膜槽内先放入已经在半干转印缓冲液中平衡20min的滤纸，将活化好的膜铺在滤纸上，将切好的分离胶再铺在PVDF膜上，赶尽PVDF膜与滤纸以及膜与胶之间的气泡，再铺上最上一层滤纸，盖上转膜槽盖子，拧紧，插入转印机器抽屉内，设置转印条件为恒压25V，30min。转印过程中，根据抗体所需配置好相应的封闭液(抗体稀释液)，将5％脱脂奶粉/BSA(TBST溶解)置于超声清洗机内10min，5000rpm离心5min尽量去除未溶解的颗粒物。转印完成后，将PVDF膜置于相应的封闭液中在37℃摇床内封闭1h。封闭结束后，按照100μL/cm2 PVDF面积的相对量加入抗体孵育液，抗体稀释的体积需要根据各抗体说明书确定。PVDF膜与抗体稀释液置于4℃孵育过夜。一抗孵育结束后，使用TBST洗涤PVDF膜5次，每次5min。根据一抗的宿主来源配制相应的结合HRP的二抗，二抗于37℃孵育1h。孵育结束后，使用TBST洗涤PVDF膜5次，每次5min。洗涤结束后，先按照1：1的比例配制Bio-Rad化学发光试剂，PVDF膜用滤纸吸干水后，置于发光液中孵育1min，最终置于iBright CL1000 System捕捉灰度条带和半定量比较。
2.8细胞上清LDH和小鼠血清ALT、AST、TBiL、IL-1β测定
细胞上清LDH和小鼠血清ALT、AST、TBiL、IL-1β测定按说明书的步骤进行指标测定。基于Chou-Talalay联合指数法以及CompuSyn软件分析药物组合的协同指数，化合物联用的平均协同效应指数(Combination Index，CI value)值区间及相互作用评价依据如下表所示：
CI值区间 相互作用评价 符号
CI<0.1 协同作用非常强 +++++
0.1<CI<0.3 协同作用强 ++++
0.3<CI<0.7 协同作用较强 +++
0.7<CI<0.85 协同作用中等 ++
0.85<CI<0.9 协同作用轻微 +
0.9<CI<1.1 相加作用 ±
1.1<CI<1.2 拮抗作用轻微 -
1.2<CI<1.45 拮抗作用中等 --
1.45<CI<3.3 拮抗作用较强 ---
3.3<CI<10 拮抗作用强 ----
10<CI 拮抗作用非常强 ------
2.9微热泳动法(MST)测定小分子与蛋白相互作用
配体-受体相互作用使用Nano Temper Technology公司的MST分子互作仪Monolith TM NT.115对分子之间的直接结合作用进行分析。根据说明书流程，使用Monolith TM NT RED-MALEIMIDE蛋白标记试剂盒预先对重组蛋白进行脱盐和荧光标记。MeCbl、CTX、SUL和PDTC梯度浓度均设为0.8，1.6，3.2，6.25，12.5，25，50，100，200μM，在200μl EP管中将梯度浓度化合物分别与终浓度为0.2μM预先标记的重组蛋白在室温下以1：1的体积比孵育30min。利用试剂盒配套的毛细管吸取10μL孵育好的混合物并将毛细管按照梯度浓度顺序放置在Monolith TM NT.115仪器内部检测模块上，开机后选择合适的激发模块并对所有毛细管进行扫描，激发条件为40％ LED功率和80％ MST功率并运行MST实验。运行完毕后，观察MST曲线是否合理。最终使用NT Analyzes 1.5.41软件分析数据，利用非线性拟合曲线自动求解得到解离常数Kd值。
实施例1
Tb3+脂质体-蛋白溫孵体系测定MeCbl和两种头孢类抗生素对GSDME活化介导的膜穿孔功能的抑制作用(图1)
实验方案：将20μL终浓度梯度为0.15、0.3、0.6125、1.25、2.5、5、10μM的MeCbl、头孢类抗生素cefozopran、cefoselis工作液与20μL终浓度为0.2μM的GSDME蛋白37℃预孵30min后，进行后续Tb3+脂质体渗漏模型操作检测和数据分析流程(具体过程采用上述实验2.6节)。
实验结果：MeCbl、cefozopran、cefoselis在分子水平可浓度依赖性地抑制GSDME蛋白活化导致的脂质体膜渗漏，IC50分别为0.47μM、2.46μM、0.29μM(图1)。本实施例证明：MeCbl、cefozopran、cefoselis可在分子水平浓度依赖地抑制GSDME蛋白活化及其产生的膜穿孔效应。
实施例2
微热泳动法(MST)测定MeCbl与GSMDE蛋白相互作用并在分子水平测定MeCbl对GSDME活化的抑制作用(图2)
实验方案：将贮备液浓度为10mM的MeCbl用PBS分别稀释至0.8，1.6，3.2，6.25，12.5，25，50，100，200μM工作液。将各浓度MeCbl工作液与0.2μM重组GFP-caspase-3、GFP-GSDME、GFP-GSDMD蛋白按1：1比例等体积混匀，室温静置30min后用Nano Temper MST分子互作仪检测分析。检测结束后绘制拟合曲线测定解离常数Kd值，根据Kd值判断化合物与蛋白的亲和力强弱。将上述温孵体系中梯度浓度MeCbl改成1μM单浓度并进行同样的温孵操作后，取30μL溫孵体系蛋白变性后分析GSDME蛋白活化程度变化(具体过程采用上述实验2.9节)。
实验结果：MeCbl与GSDME蛋白有强结合效应，解离常数Kd为1.8ⅹ10-7M，而与caspase-3或GSDMD蛋白均无明显互作。1μM MeCbl几乎可完全抑制体系中GSDME蛋白活化(图2)。本实施例证明：MeCbl可与GSDME蛋白产生直接相互作用，且具有强亲和力，二者结合后进而在分子水平抑制GSDME蛋白活化。
实施例3
DDP诱导的小鼠肝实质细胞焦亡模型测定MeCbl对GSDME活化与其介导的细胞焦亡的抑制作用(图3)
实验方案：在96孔板中，将终浓度为20μM的MeCbl工作液与小鼠原代肝实质细胞(细胞密度为1万个/孔)37℃预孵2h后，再利用终浓度为20μg/mL DDP刺激细胞16h。取60μL上清和LDH释放检测试剂盒分析各组LDH释放比例用于指征细胞焦亡比例。同样处理方案的足量肝细胞经裂解蛋白变性后用于胞内GSDME蛋白活化分析(具体过程采用上述实验2.7节)。
实验结果：20μM MeCbl在细胞水平可显著抑制DDP诱导的肝细胞焦亡，LDH释放比例(细胞焦亡比例)从模型组的44.182±4.233显著降至给药组的11.747±1.323。同时20μMMeCbl几乎可完全抑制细胞DDP诱导的GSDME蛋白活化(图3)。本实施例证明：甲钴胺可在小鼠原代肝细胞水平显著抑制DDP诱导的GSDME蛋白活化及其介导的肝细胞焦亡。
实施例4
DCA诱导的小鼠肝实质细胞焦亡模型测定MeCbl对GSDME活化与其介导的细胞焦亡的抑制作用(图4)
实验方案：在96孔板中，将终浓度为20μM的MeCbl工作液与小鼠原代肝实质细胞(细胞密度为1个/孔)37℃预孵2h后，再利用终浓度为200μM DCA刺激细胞6h。取60μL上清和LDH释放检测试剂盒分析各组LDH释放比例用于指征细胞焦亡比例。同样处理方案的足量肝细胞经裂解蛋白变性后用于胞内GSDME蛋白活化分析。
实验结果：20μM MeCbl在细胞水平可显著抑制DCA诱导的肝细胞焦亡，LDH释放比例(细胞焦亡比例)从模型组的57.467±6.277显著降至给药组的23.600±1.353。同时20μMMeCbl几乎可完全抑制细胞DCA诱导的GSDME蛋白活化(图4)。本实施例证明：甲钴胺可在小鼠原代肝细胞水平显著抑制DCA诱导的GSDME蛋白活化及其介导的肝细胞焦亡。
实施例5
BDL手术构建的小鼠胆汁淤积性肝衰竭模型测定口服和静注给予MeCbl对小鼠血清转氨酶活性的抑制作用(图5)
实验方案：在BDL手术前2h通过灌胃和尾静脉注射两种给药途径分别给予小鼠1mg/kg和0.3mg/kg MeCbl，对照组给予同等剂量的生理盐水。在BDL手术后造模三天中每天以相同的给药方案对小鼠给药干预。72h后处死小鼠并收集血清测定ALT、AST活性。
实验结果：小鼠口服1mg/kg或静注0.3mg/kg MeCbl均能显著降低BDL模型小鼠血清转氨酶活性，ALT活性(U/L)从模型组的598.623±13.689显著降至给药组的321.634±28.635(静注)和309.756±23.987(灌胃)，AST活性(U/L)从模型组的569.636±40.954显著降至给药组的386.852±38.245(静注)和379.458±39.687(灌胃)(图5)。本实施例证明：甲钴胺可通过静注和口服两种途径显著降低BDL模型小鼠血清ALT和AST转氨酶水平进而干预BDL诱导的胆汁淤积性肝衰竭。
实施例6
微热泳动法(MST)测定CTX、SUL和PDTC与GSDMD蛋白相互作用(图6)
实验方案：将贮备液浓度为200mM的CTX、SUL、PDTC用PBS分别稀释至0.8，1.6，3.2，6.25，12.5，25，50，100，200μM工作液。将各浓度化合物工作液与0.2μM重组GFP-GSDMD蛋白按1：1比例等体积混匀，室温静置30min后用Nano Temper MST分子互作仪检测分析。检测结束后绘制拟合曲线测定解离常数Kd值，根据Kd值判断化合物与蛋白的亲和力强弱(具体过程采用上述实验2.9节)。
实验结果：CTX、SUL、PDTC均与GSDMD蛋白有强结合效应，解离常数Kd分别为1.06ⅹ10-8M、4.67ⅹ10-7M和2.21ⅹ10-7M(图6)。
本实施例证明：CTX、SUL、PDTC均可与GSDMD蛋白产生直接相互作用，且具有强亲和力。
实施例7
LPS转染诱导的小鼠BMDMs巨噬细胞焦亡模型测定CTX、SUL和PDTC对GSDMD介导的细胞焦亡的抑制作用(图7)
实验方案：在96孔板中，将梯度浓度为0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50μM的CTX、SUL、PDTC工作液与小鼠BMDMs细胞(细胞密度为7万个/孔)37℃预孵2h后利用0.3％的Fugene HD转染试剂将5μg/mL LPS导入细胞造模16h构建GSDMD介导的细胞焦亡模型。取60μL上清和LDH释放检测试剂盒分析各化合物作用下LDH释放比例用于指征细胞焦亡比例。
实验结果：CTX、SUL、PDTC在BMDMs细胞中可浓度依赖性地抑制GSDMD蛋白活化介导的细胞焦亡，CTX、SUL、PDTC对GSDMD介导的细胞焦亡IC50分别为15.19μM、7.131μM和15.89μM。(图7)。
本实施例证明：CTX、SUL、PDTC可在BMDMs细胞中浓度依赖地抑制GSDMD蛋白活化介导的巨噬细胞焦亡。
实施例8
LPS转染+DCA诱导的小鼠BMDMs巨噬细胞焦亡模型测定MeCbl与CTX、SUL、PDTC中任一组合对GSDMD+GSDME协同介导的细胞焦亡的抑制作用(图8)
实验方案：将MeCbl分别与CTX、SUL、PDTC在1640培养基中混合稀释至终浓度为2.5μM MeCbl+40μM CTX、SUL、PDTC形成药物组合，同等剂量的单药分子作为对照。在96孔板中，单药或组合药与小鼠BMDMs细胞(细胞密度为7万个/孔)37℃预孵2h后首先利用0.3％的Fugene HD转染试剂将5μg/mL LPS导入细胞造模10h构建GSDMD介导的细胞焦亡模型，在此基础上再加入50μM DCA刺激6h激活GSDME(协同激活GSDMD和GSDME)。取60μL上清和LDH释放检测试剂盒分析各单药和组合药作用下LDH释放比例用于指征细胞焦亡比例。
实验结果：MeCbl与CTX、SUL、PDTC中任一种组合均可在BMDMs细胞中协同抑制GSDMD+GSDME蛋白活化介导的细胞焦亡，MeCbl/CTX、MeCbl/SUL、MeCbl/PDTC组合药对GSDMD+GSDME介导的细胞焦亡协同抑制指数分别为0.00728、0.04570、0.06932(图8)。本实施例证明：MeCbl/CTX、MeCbl/SUL、MeCbl/PDTC三种组合药均可在各自单独给药的基础上协同抑制LPS+DCA复合模型诱导的巨噬细胞焦亡，且具有强协同。MeCbl/CTX协同指数最低为0.00728，表明该组合协同抑制细胞焦亡作用最强。
实施例9
BDL/LPS(GSDME+GSDMD介导)复合型肝衰竭模型测定口服和静注给予MeCbl/CTX组合药对小鼠血清转氨酶活性和炎症因子水平的抑制作用(图9)
实验方案：在BDL手术前2h灌胃预给小鼠50mg/kg CTX、0.3～3mg/kg MeCbl和50mg/kg CTX+0.3～3mg/kg MeCbl，平行尾静脉注射预给小鼠50mg/kg CTX、0.1～1mg/kgMeCbl和50mg/kg CTX+0.1～1mg/kg MeCbl，BDL造模22h后，按照上述给药方案再给药一次，给药2h后腹腔注射20mg/kg LPS刺激6h构建BDL/LPS复合型肝衰竭模型。LPS刺激6h后处死小鼠并收集血清测定ALT、AST、TBIL和IL-1β水平。
实验结果：小鼠口服50mg/kg CTX+0.3～3mg/kg MeCbl或静注50mg/kg CTX+0.1～1mg/kg MeCbl均能协同降低BDL/LPS复合模型小鼠血清ALT活性，口服50mg/kg CTX+3mg/kgMeCbl或静注50mg/kg CTX+1mg/kg MeCbl均能协同降低BDL/LPS复合模型小鼠血清AST活性，口服50mg/kg CTX+0.3～3mg/kg MeCbl或静注50mg/kg CTX+0.1～1mg/kg MeCbl均能协同降低BDL/LPS复合模型小鼠血清TBIL水平，口服50mg/kg CTX+0.3～1mg/kg MeCbl或静注50mg/kg CTX+1mg/kg MeCbl均能协同降低BDL/LPS复合模型小鼠血清IL-1β水平，详细指标数值与协同指数见图9。
本实施例证明：小鼠在口服50mg/kg CTX+0.3～3mg/kg MeCbl或静注50mg/kg CTX+0.1～1mg/kg MeCbl剂量范围内均可在不同程度协同降低BDL/LPS复合型肝衰竭模型小鼠血清ALT、AST、TBIL和IL-1β水平进而干预BDL/LPS诱导的肝衰竭。
综上，本发明通过高通量筛选发现的GSDME抑制药物MeCbl可直接与GSDME产生特异性强结合。进而MeCbl通过抑制GSDME活化减轻脂质体膜损伤程度，并显著抑制DDP或DCA所诱发的小鼠肝实质细胞焦亡。进而MeCbl可通过静脉注射和口服给药两种途径治疗胆汁淤积性肝衰竭。本发明还发现头孢类抗生素头孢唑兰，头孢噻利在分子水平也可浓度依赖性地抑制GSDME活化引发的脂质体渗漏。本发明还通过高通量筛选发现CTX，SUL和PDTC作为GSDMD抑制药物可有效抑制LPS引发的BMDMs巨噬细胞焦亡，而将GSDME抑制药物MeCbl与GSDMD抑制药物CTX，SUL，PDTC任一组合均可在细胞水平强协同抑制LPS+DCA复合模型诱导的细胞焦亡。进而优选的MeCbl/CTX组合药物可通过口服和静脉注射两种给药途径协同降低BDL+LPS复合型肝衰竭模型小鼠血清肝衰竭病理和炎症指标。

Claims (3)

1.甲钴胺和头孢曲松钠组合物在制备治疗胆汁淤积性肝衰竭中的应用；所述组合物中甲钴胺和头孢曲松钠质量组成比范围为（0.1~3）：50。
2.甲钴胺和舒布硫铵组合物在制备治疗肝衰竭中的应用；所述组合物按浓度2.5 μM甲钴胺和40 μM舒布硫铵形成药物组合。
3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述组合物包括各种以组合物制备而成的药物制剂，具体包括胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
CN202310186711.1A 2023-03-01 2023-03-01 甲钴胺及药物组合物在制备用于治疗肝衰竭药物中的应用 Active CN115998758B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310186711.1A CN115998758B (zh) 2023-03-01 2023-03-01 甲钴胺及药物组合物在制备用于治疗肝衰竭药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310186711.1A CN115998758B (zh) 2023-03-01 2023-03-01 甲钴胺及药物组合物在制备用于治疗肝衰竭药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115998758A CN115998758A (zh) 2023-04-25
CN115998758B true CN115998758B (zh) 2024-04-19

Family

ID=86027037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310186711.1A Active CN115998758B (zh) 2023-03-01 2023-03-01 甲钴胺及药物组合物在制备用于治疗肝衰竭药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115998758B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007085888A1 (en) * 2006-01-27 2007-08-02 Wockhardt Limited Controlled release formulations of methylcobalamin
CN104490876A (zh) * 2014-11-26 2015-04-08 中国药科大学 盐酸小檗碱在制备预防和/或治疗急性肝衰竭药物中的应用
CN113365513A (zh) * 2018-10-23 2021-09-07 G·E·霍格 用于治疗肺的组合物和方法
WO2021216749A1 (en) * 2020-04-22 2021-10-28 George Edward Hoag Method for treating viral and bacterial infection through inhalation therapy

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007085888A1 (en) * 2006-01-27 2007-08-02 Wockhardt Limited Controlled release formulations of methylcobalamin
CN104490876A (zh) * 2014-11-26 2015-04-08 中国药科大学 盐酸小檗碱在制备预防和/或治疗急性肝衰竭药物中的应用
CN113365513A (zh) * 2018-10-23 2021-09-07 G·E·霍格 用于治疗肺的组合物和方法
WO2021216749A1 (en) * 2020-04-22 2021-10-28 George Edward Hoag Method for treating viral and bacterial infection through inhalation therapy

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cholestatic hepatitis with intravenous ceftriaxone;Inderpal Kaur et al.;《 Indian J Pharmacol.》;第43卷(第4期);参见摘要 *
Effect of Methylcobalamin on Protein Content in Liver and Serum of Partially Hepatectomized Rat;T. KOIZUMI, T. SUEMATSU et al.;《Specialia》;第15卷(第3期);摘要；第283页结论部分 *
组蛋白乙酰化对肝衰竭小鼠模型的调控作用;林列坤;周应生;郑义;卢春生;杨菊红;王一娜;;热带医学杂志;20200228(第02期);第53-56页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115998758A (zh) 2023-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115414397B (zh) 续断源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备预防或治疗骨科疾病药物中的应用
Arashov et al. Treatment of patients with cavity liver formation with a simple and complex subdiagphragmal position
CN108348543A (zh) 促进肝再生的方法
BRPI0814725B1 (pt) Uso da composição antiviral
CN113197981B (zh) 疏清颗粒的应用
CN115998758B (zh) 甲钴胺及药物组合物在制备用于治疗肝衰竭药物中的应用
WO2023217179A1 (zh) 甘露糖抑制细胞焦亡或减轻化疗药物毒副作用的应用
TW201540297A (zh) 蛇床子素用於製備治療局部腎絲球硬化症之組合物的用途
CN101095743B (zh) 治疗妇科疾病的外用药物组合物及其制备方法和用途
CN112107575B (zh) 木脂素化合物联合呋喃香豆素化合物治疗肝纤维化
CN115177608A (zh) 长链酰基肉碱类化合物在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用
EP4056183A1 (en) Use of phosphodiesterase 5 inhibitor in preparation of medicament for resisting fibrotic diseases
CN113925860A (zh) 一种治疗骨关节炎的药物及其应用
CN113648306A (zh) 佛手柑素在预防或治疗骨质疏松和/或骨丢失中的应用
CN111714638A (zh) 致dna损伤化合物联合dna损伤修复抑制剂的组合物及制备方法和应用
CN108969517B (zh) 一种银杏内酯组合物在制备用于肾组织纤维化的药物中的应用
CN114557985B (zh) 一种用于治疗骨性关节炎的贝母兰宁组合物及其应用
CN110141566B (zh) Sglt2抑制剂在调控炎症中的应用
Kong et al. Tibial cortex transverse transport regulates Orai1/STIM1-mediated NO release and improve the migration and proliferation of vessels via increasing osteopontin expression
TWI845441B (zh) 包含脂肪組織分離細胞外囊泡以及生物製劑的醫藥組成物及其用於治療關節炎的用途
CN114560817B (zh) 一种用于抑制纤维化的小分子药物及其应用
CN116098886B (zh) 一种药物组合物及其应用
Ohzono Monoclonal FoxO1 reporter cell lines
WO2024012531A1 (zh) 一种吡啶酮衍生物的应用
TW201023872A (en) Preparation method of longan seed extract and its application

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant