CN108348543A - 促进肝再生的方法 - Google Patents

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CN108348543A CN201680062384.7A CN201680062384A CN108348543A CN 108348543 A CN108348543 A CN 108348543A CN 201680062384 A CN201680062384 A CN 201680062384A CN 108348543 A CN108348543 A CN 108348543A
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斯特凡努斯·韦利布罗杜斯·玛丽亚·奥尔德达明克
弗朗西斯库斯·格拉尔杜斯·沙普
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Abstract

本发明涉及通过使用具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐加速、促进或增加受试者中肝再生或增加肝脏质量的方法，并且其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、m、和n是如本文中所述的。

Description

促进肝再生的方法
背景技术
肝衰竭发生在许多慢性和急性临床病症中，包括药物诱导的肝脏毒性、病毒感染、血管损伤、自身免疫性疾病和外伤。此外，患有遗传性代谢缺陷的患者可能有发生肝衰竭的风险。由于这些临床病症而发生的肝衰竭的症状包括例如急性肝炎、慢性肝炎或肝硬化。
慢性肝病的标志是随着时间的推移，肝组织的逐渐破坏。几种肝病属于这一类，包括肝硬化和纤维化，后者通常是肝硬化的前兆。慢性丙型肝炎病毒感染和非酒精性脂肪性肝炎是慢性肝病的两个主要病因。一旦肝脏已经出现肝硬化或纤维化，通常认为它是不可逆的。常规治疗目前集中于预防肝脏中的肝硬化的任何进一步进展，并减轻肝硬化可能引起的并发症。在更严重的肝硬化阶段，唯一已知的治疗是肝移植。
在急性肝病中，肝脏受伤后能够再生。如果疾病进展超过了肝脏再生新细胞的能力，那么体重的整个新陈代谢就会受到严重影响。肝功能丧失可能导致代谢不稳定，连同基本身体机能的破坏(即能量供应、酸碱平衡和体温调节)。在巨大肝损伤后，肝组织失去了其再生和代谢功能，并且肝移植是常用的治疗策略。
然而，肝移植的临床应用受到人类肝细胞、肝组织和可以一次安全移植的肝细胞数量的限制。
患者在大部分肝切除后恢复术前肝脏质量的能力是熟知的。已知多种介体在体外和体内都是肝丝裂原，但涉及肝再生的确切机制仍有待确定(Michalopoulos等人，Science[科学],1997,276,60-66)。努力促进肝再生的重要问题在于许多治疗剂在体内具有有限的效力。因此，促进足够功能性肝脏质量的再生的药理学治疗的可用性将是一个重大进展，其可以防止许多因肝衰竭而造成的死亡。
在临床环境中促进或增加肝细胞增殖的能力有几个重要的应用。通过增加健康肝组织的数量并防止患者在术后期间因由于剩余的功能性肝脏质量不足而引起的肝衰竭的死亡，将允许切除先前无法切除的肝恶性肿瘤。此外，如果天然肝脏能够以在肝衰竭之前恢复足够肝功能的速率诱导再生，那么患有由毒性、代谢性或病毒性病因引起的肝衰竭的患者可以免于死亡或肝移植。
尽管正在进行研究工作，仍然需要促进肝再生和修复的改进的方法。需要开发促进肝细胞增殖以治疗由一系列肝毒剂、疾病或病理状态引起的肝损伤的治疗策略。本发明解决了此类需求。
附图说明
图1是一张图表，其描绘了用于计算机断层扫描(CT)和门静脉造影测量以及兔门静脉栓塞(本文中称为“PVE研究兔”)的研究概要或实验方法和时间表。
图2是一幅图，其指示PVE研究兔的体重(克)与时间(天)。
图3是一幅图，其指示PVE研究兔(n＝11/组)的非栓塞性叶的尾部肝体积(CLV，％)的增加与时间(天)。
图4是一幅图，其指示计算机断层扫描体积(CT，mL)与肝重(克)。
图5是一幅图，其指示PVE研究兔(n＝11/组)的栓塞性叶的颅内肝叶体积(CrLV，％)水平的降低与时间(天)。
图6A是一个条形图，其指示PVE后7天的PVE研究兔的肥大性和萎缩性肝部分中增殖细胞核抗原(PCNA)的相对表达。
图6B是一个条形图，其指示PVE后7天的PVE研究兔的肥大性和萎缩性肝部分中肝细胞生长因子(HGF)的相对表达。
图6C是一个条形图，其指示在PVE后7天PVE研究兔的肥大性和萎缩性肝部分中叉头盒m1b(Foxm1b)的相对表达。
图6D是一个条形图，其指示PVE后7天PVE研究兔的肥大性和萎缩性肝部分中细胞分裂周期25B(Cdc25b)的相对表达。
图6E是一个条形图，其指示PVE后7天PVE研究兔的肥大性和萎缩性肝部分中胆固醇7α-羟化酶(Cyp7a1)的相对表达。
图6F是一个条形图，其指示PVE研究兔的肥大性和萎缩性肝部分中甾醇12α-羟化酶(Cyp8b1)的相对表达。
图6G是一个条形图，其指示PVE研究兔的肥大性和萎缩性肝部分中有机溶质转运蛋白β(OSTB)的相对表达。
图6H是一个条形图，其指示PVE研究兔的肥大性和萎缩性肝部分中小异二聚体配偶体(SHP)的相对表达。
图7A是一个条形图，其指示PVE研究兔的回肠中法尼醇X受体(FXR)的相对表达。
图7B是一个条形图，其指示PVE研究兔的回肠中小异二聚体配偶体(SHP)的相对表达。
图7C是一个条形图，其指示PVE研究兔的回肠中增殖细胞核抗原(PCNA)的相对表达。
图7D是一个条形图，其指示PVE研究兔的回肠中有机溶质转运蛋白β(OSTB)的相对表达。
图7E是一个条形图，其指示PVE研究兔的回肠中早期生长应答蛋白1(EGR1)的相对表达。
图7F是一个条形图，其指示PVE研究兔的回肠中叉头盒m1b(Foxm1b)的相对表达。
图7G是一个条形图，其指示PVE研究兔的回肠中细胞分裂周期25b(cdc25b)的相对表达。
图8是一张图，其指示PVE研究兔(n＝5/组)中的血清胆汁盐总浓度(μmol/L)与时间(小时和天)。
图9是通过CT体积分析确定的与处死时尾部肝叶重量相关的CLV的图。
图10显示了所有连续扫描下单只兔子的肝胆闪烁扫描图像。
图11A是一个条形图，其显示预处理阶段中的TLV/千克体重的。
图11B是一个条形图，其显示PVE后CLV的增加。
图11C是一个条形图，其显示PVE后CrLV的减小。
图11D是通过肝胆闪烁扫描术而确定的99mTc-甲溴苯宁的总肝摄取的条形图。
图11E是一个条形图，其显示从在第-7天基线测量中尾部肝叶对99mTc-甲溴苯宁摄取的份额的增加。
图11F显示了在Ki67阳性肝细胞的100倍放大率和量化下Ki67染色的肝部分的图像。
图11G是一张图，其显示相对于第-7天的值，体重百分比变化。
图12A显示了PVE之前和之后的血浆ALT(丙氨酸转氨酶)水平。
图12B显示了PVE之前和之后的血浆AST(天冬氨酸转氨酶)水平。
图12C显示了PVE之前和之后的血浆γGT(γ-谷氨酰转移酶)水平。
图12D显示了PVE之前和之后的血浆ALP(碱性磷酸酶)水平。
图12E显示了尾部肝叶的H&E染色部分的定量评分。
图13A-B显示了奥贝胆酸对回肠和肝基因表达的作用。
图14显示了循环胆汁盐的水平。
图15显示了胆汁盐稳态/增殖相关的转录物水平。
图16A-E显示了实质性肝病对部分肝切除术后再生的影响。
图17A显示了对照(假手术)和7天具有OCA处理的rBDL后的总肝重(表示为体重的百分比)。
图17B显示了对照(假手术)和7天具有OCA处理的rBDL后的总肝重(表示为干重/300g体重)。
图17C显示了代表性Ki67染色的肝部分。
图17D显示了对Ki67阳性的定量评估。
图17E显示了肝脏中增殖相关基因和FXR相关基因的表达水平。
图17F显示了回肠中增殖相关基因和FXR相关基因的表达水平。
图18显示了肝生长和肝胆损伤参数的相关性分析。
图19A显示了健康大鼠(顶线)、胆汁淤积后的大鼠(rBDL，中线)和用奥贝胆酸处理的rBDL大鼠(OCA，底线)的部分(70％)肝切除术(PHx)后的肝再生长。
图19B显示了PHx后立即(左)和5天(右)时残余肝脏的干重。
图19C显示了PHx后第1天(左)和第5天(右)增殖的肝细胞的数量。
图19D显示了各种增殖相关基因和FXR相关基因的肝表达。
图20显示了苏木精和伊红(H&E，左)、天狼猩红(PSR，右上)和Ki67染色的肝载玻片的代表性图像。
图21显示了OCA通过Bsep介导的胆汁酸对胆汁淤积性损伤的作用。
图22显示了阻塞性胆汁淤积和奥贝胆酸处理对大鼠血浆、肝脏和胆汁中胆汁酸池组成的影响。
发明内容
本发明的目的是提供加速、促进或增加肝再生并增加肝脏质量的方法。在一方面，本发明涉及一种在患有肝功能降低的受试者中加速、促进或增加肝再生的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的具有式(A)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是氢或C1-C6烷基；
R2、R3、R5、和R6各自独立地是氢或羟基；
R4是CO2H、C(O)NH(CH2)mSO3H、C(O)NH(CH2)nCO2H、或OSO3H；并且
m和n各自独立地是1、2、或3。
本发明进一步涉及具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐在生产用于在患有肝功能降低的受试者中加速、促进或增加肝再生的药物中的用途，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、m、和n是如本文所定义的。
本发明还涉及用于在患有肝功能降低的受试者中加速、促进或增加肝再生的具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、m、和n是如本文所定义的。
在另一方面，本发明涉及一种在患有肝功能降低的受试者中增加肝脏质量的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的具有式(A)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是氢或C1-C6烷基；
R2、R3、R5、和R6各自独立地是氢或羟基；
R4是CO2H、C(O)NH(CH2)mSO3H、C(O)NH(CH2)nCO2H、或OSO3H；并且
m和n各自独立地是1、2、或3。
本发明进一步涉及具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐在生产用于在患有肝功能降低的受试者中增加肝脏质量的药物中的用途，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、m、和n是如本文所定义的。
本发明还涉及用于在患有肝功能降低的受试者中增加肝脏质量的具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、m、和n是如本文所定义的。
本发明进一步涉及包含具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物，用于在患有肝功能降低的受试者中加速、促进或增加肝再生，或增加肝脏质量，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、m、和n是如本文所定义的。
本发明进一步涉及包含具有式(A)的化合物的试剂盒，用于在患有肝功能降低的受试者中加速、促进或增加肝再生或增加肝脏质量的方法中使用，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、m、和n是如本文所定义的。
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域技术人员所通常理解的相同含义。虽然类似或等同于本文所述的那些的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但以下描述了适合的方法和材料。这些材料、方法、和实例仅是说明性的并且不旨在具有限制性。
根据以下具体实施方式，本发明的其他特征和优点将是清楚的。
具体实施方式
定义
在此收集了在说明书和权利要求书中所使用的某些术语。
如本文所使用的术语“肝病”是指肝脏障碍。一般来说，肝病可能由导致身体肝脏的形态学和/或功能完整性紊乱的任何病症引起。肝病的病因和治疗例如描述于OxfordTextbook of Medicine[牛津医学教科书]中(Warrell,Oxford Textbook of Medicine[牛津医学教科书],David A.Warrell,Timothy M.Cox,John D.Firth，牛津大学出版社(Oxford University Press)，美国；第五版(2010年7月22日))。
如本文所使用的术语“慢性肝病”是指涉及导致纤维化和肝硬化的肝实质的进行性破坏和再生的肝脏的疾病过程。慢性肝病的病因可以是导致组织细胞随着身体肝脏逐渐降解和更新的任何病症。这个过程通常导致纤维化或肝硬化，并且在慢性肝衰竭的情况下可能是致命的。慢性肝病来源的分类分为五类：(i)病毒性病因，如乙型肝炎和丙型肝炎或巨细胞病毒或EB病毒(Epstein Barr virus)；(ii)代谢性病因，如血色病、非酒精性脂肪肝病或威尔逊氏病，(iii)自身免疫应答病因，如自身免疫性慢性肝炎、原发性胆汁性肝硬化或原发性硬化性胆管炎，(iv)毒素相关病因，如酒精性肝病或呋喃妥因、胺碘酮或甲氨蝶呤，以及(v)其他混杂病因，如右心衰竭。慢性肝病的主要原因是过度使用酒精，导致肝硬化和肝炎。因此，风险最高的群体是容易酗酒的人。与慢性肝病相关的症状取决于肝内变性的水平。
如本文所使用的术语“急性肝病”是指在肝病的第一迹象(如黄疸)之后迅速出现严重并发症，并且指示肝脏具有持续性损伤。并发症是例如肝性脑病和蛋白质合成受损，例如通过血液中血清白蛋白水平和凝血酶原时间所测量的。1993年的分类定义了超急性为在1周内，急性为8-28天，以及亚急性为4-12周(Williams等人，Lancet[柳叶刀]，1993,342,273)。这反映了疾病演变的步伐严重影响预后这一事实。潜在的病因是结果的另一个重要决定因素(Grady等人，Postgrad Med J[研究生医学杂志]，2005,81,148)。当肝脏迅速失去其运行的能力时，会发生“急性肝衰竭”。急性肝衰竭是一种复杂的多系统疾病，其在肝脏发生导致脑病发展的灾难性损害后迅速演变。然而，更常见的是，肝衰竭在数年内缓慢发展，在急性肝衰竭中，肝衰竭在几天内发展。
如本文所使用的“移植的肝脏”是指移植到受试者中的肝脏，并且还包括所谓的“部分肝脏移植体”，其对应于由供体的肝脏的部分组成的移植物。肝移植还指将肝细胞(基因修饰的或被刺激以增殖或分化)注射到门静脉。门静脉栓塞(PVE)可用于增加预定进行大部分肝切除的患者中的未来残余肝脏体积。
如在肝移植背景下所使用的术语“肝再生”是指其中失去的肝组织被肝移植体或部分肝移植体的肝细胞生长代替的形态学变化，但也包括生物化学变化，如改进、恢复或正常化肝功能。由本发明的组合物治疗的特定受试者包括，例如，在完全切除肝脏后接受部分肝移植体用于治疗由肝病(如肝炎，酒精、病毒、药物或未知病因的肝硬化，或肝癌)引起的肝衰竭的患者。
如本文所使用的短语“加速肝再生”、“促进肝再生”和“增加肝再生”是通过以下来证明的：与未经处理的对照相比，以最终质量的增加和达到该质量的速率的增加达到最终肝脏质量或增加的最终肝脏质量(例如，如通过计算机断层扫描所确定的)或两者所需的较短时间。
具有式(A)的化合物的“治疗有效量”是一种或多种化合物的量(数量或浓度)。有待给予至受试者的化合物的量取决于特定的肝损伤阶段、给予方式、共同-给予的化合物(如果有的话)、以及受试者的特征，例如总体健康状况、其他疾病、年龄、性别、基因型、体重和对药物的耐受性。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。
如本文所使用的“受试者”是指人或动物(在动物的情况下，更典型地是哺乳动物)。在一方面，该受试者是人。
如本文所使用的术语“C1-C6烷基”是指具有1、2、3、4、5、或6个碳原子的直链或支链烃部分。“C1-C4烷基”是指具有1、2、3、或4个碳原子的直链或支链烃部分。C1-C6烷基部分的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文所使用的术语“代谢物”是指具有式(A)的化合物的葡糖醛酸化和硫酸化的衍生物，其中一个或多个葡糖醛酸或硫酸部分连接至本发明的化合物。葡糖醛酸部分可以通过与这些化合物的羟基基团(例如3-羟基、7-羟基、11-羟基、和/或12-羟基)的糖苷键连接至这些化合物。这些化合物的硫酸化的衍生物可以通过羟基基团(例如3-羟基、7-羟基、11-羟基、和/或12-羟基)的硫酸化而形成。代谢物的实例包括但不限于本文所述的化合物的3-O-葡糖苷酸、7-O-葡糖苷酸、11-O-葡糖苷酸、12-O-葡糖苷酸、3-O-7-O-二葡糖苷酸、3-O-11-O-二葡糖苷酸、3-O-12-O-二葡糖苷酸、7-O-12-O-二葡糖苷酸和3-O-7-O-12-O-三葡糖苷酸，以及本文所述的化合物的3-硫酸酯、7-硫酸酯、11-硫酸酯、12-硫酸酯、3,7-二硫酸酯、3,11-二硫酸酯、3,12-二硫酸酯、7,12-二硫酸酯、3,7,11-三硫酸酯、和3,7,12-三硫酸酯。
如本文所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的衍生物，其中母体化合物通过形成其酸或碱的盐来修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(如胺)的矿物盐或有机酸盐、酸性残基(如羧酸)的碱盐或有机盐等。药学上可接受的盐包括常规的无毒盐或例如由无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的季铵盐。例如，这样的常规的无毒盐包括但不限于来源于无机酸和有机酸的那些，这些无机酸和有机酸选自2-乙酰氧基苯甲酸的、2-羟基乙磺酸的、乙酸的、抗坏血酸的、苯磺酸的、苯甲酸的、碳酸氢酸的、碳酸的、柠檬酸的、依地酸的、乙二磺酸的、富马酸的、葡庚糖酸的、葡糖酸的、谷氨酸的、乙醇酸的、乙二醇氨苯胂酸的、己基间苯二酚酸的、海巴酸的(hydrabamic)、氢溴酸的、盐酸的、氢碘酸的、羟基马来酸的、羟萘甲酸的、羟乙磺酸的、乳酸的、乳糖酸的、月桂基磺酸的、马来酸的、苹果酸的、扁桃酸的、甲烷磺酸的、萘磺酸的、硝酸的、草酸的、扑酸的、泛酸的、苯乙酸的、磷酸的、聚半乳糖醛酸的、丙酸的、水杨酸的、硬脂酸的、亚醋酸的、琥珀酸的、氨基磺酸的、对氨基苯磺酸的、硫酸的、鞣酸的、酒石酸的、以及甲苯磺酸的。
短语“药学上可接受的载体”是本领域认可的，并且包括例如涉及从身体的一个器官或部分携带或转运任何主题组合物到身体的另一个器官或部分的药学上可接受的物质、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。每种载体在与主题组合物的其他成分相容并且对患者无害的意义上是“可接受的”。在一些实施例中，药学上可接受的载体是非热原性的。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素以及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡类；(9)油，如花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)药物配制品中所用的其他无毒可相容物质。
如本文所使用的“药物组合物”是指含有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐的配制品。在一个实施例中，所述药物组合物处于散装形式或单位剂型。所述单位剂型是任何各种形式，包括例如胶囊、IV包、片剂、气溶胶吸入器上的单泵、或小瓶。单位剂量组合物中的活性成分(例如，本发明的化合物或其盐的配制品)的数量是有效量，且根据所涉及的具体治疗而变化。本领域的技术人员将理解，取决于患者的年龄和病症，可以有必要对剂量做出常规变化。该剂量也将取决于给予途径。考虑了各种途径，包括口服、眼部、眼用、肺部、直肠、肠胃外、透皮、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内等。用于局部或经皮给予本申请的化合物的剂型包括粉末、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。在另一个实施例中，在无菌条件下将活性化合物与药学上可接受的载体以及需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
“组合疗法”(combination therapy或co-therapy)是指给予本发明的化合物和至少第二药剂作为特定治疗方案的一部分，旨在提供来自这些治疗剂(即，本发明的化合物和至少第二药剂)的共同作用的有益效果。该组合的有益作用包括但不限于由治疗剂的该组合引起的药代动力学和药效学共同作用。典型地在限定的时间段内(通常是数分钟、数小时、数天或数周，取决于选择的组合)以组合方式给予这些治疗剂。“组合疗法”可以，但通常并非，旨在涵盖给予这些治疗剂中的两种或更多种作为单独的单一治疗方案的一部分，所述单一治疗方案偶然并任意地产生本申请的组合。“组合疗法”旨在包括以顺序方式给予这些治疗剂，也就是说，其中在不同时间给予每种治疗剂，以及以基本上同时的方式给予这些治疗剂或这些治疗剂中的至少两种。可以例如通过向受试者给予具有固定比率的每种治疗剂的单一胶囊或以针对这些治疗剂中的每种的多个单一胶囊来完成基本上同时给予。顺序地或基本上同时给予每一治疗剂可通过任何适当的途径来实现，包括但不限于口服途径、静脉途径、肌肉内途径、以及通过粘膜组织直接吸收。可以通过相同途径或通过不同途径给予这些治疗剂。例如，可以通过静脉注射给予选定组合的第一治疗剂，同时可以口服地给予该组合的其他治疗剂。可替代地，例如，可以口服地给予所有治疗剂或可以通过静脉注射给予所有治疗剂。给予治疗剂的顺序并不是非常关键。
“组合疗法”还包括给予如上文所述的治疗剂进一步与其他生物活性成分和非药物疗法(例如，手术或机械治疗)组合。当组合疗法进一步包括非药物治疗时，非药物治疗可在任何适合时间进行，只要实现治疗剂与非药物治疗的组合的共同作用的有益效果即可。例如，在适当情况下，当非药物治疗暂时从治疗药剂的给予中移除时(可能数天或甚至数周)，仍实现有益效果。
本发明的方法
本发明提供在患有肝功能降低的受试者中加速、促进或增加肝再生或增加肝脏质量的方法，该方法包括向受试者给予治疗有效量的具有式(A)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是氢或C1-C6烷基；
R2、R3、R5、和R6各自独立地是氢或羟基；
R4是CO2H、C(O)NH(CH2)mSO3H、C(O)NH(CH2)nCO2H、或OSO3H；并且
m和n各自独立地是1、2、或3。
在一个实施例中，该方法涉及促进或增加肝再生。在另一个实施例中，该方法涉及促进肝再生。在又另一个实施例中，该方法涉及增加肝再生。在一个实施例中，该方法涉及加速肝再生。在另一个实施例中，该方法涉及增加肝脏质量。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R1是氢。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R1是未被取代的C1-C6烷基。在一个另外的实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R1是未被取代的C1-C3烷基。在一个另外的实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R1选自甲基、乙基以及丙基。在一个另外的实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R1是乙基。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R2是氢。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R1是羟基。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R3是氢。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R3是羟基。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R4是CO2H。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R4是C(O)NH(CH2)mSO3H。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R4是C(O)NH(CH2)nCO2H。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R4是OSO3H。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R4是CO2H或OSO3H。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R5是氢。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R5是羟基。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R6是氢。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R6是羟基。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R6是α-羟基。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R6是β-羟基。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R1是甲基、乙基或丙基，并且R5是氢。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R1是甲基、乙基或丙基，并且R6是氢。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R1是甲基、乙基或丙基，并且R5和R6各自是氢。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中R2是氢，并且R3是羟基。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中m是1。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中m是2。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中m是3。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中n是1。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中n是2。在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中n是3。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中该化合物是
或其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中该化合物是
或其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中该化合物是药学上可接受的盐。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是具有式(A)的化合物，其中该盐是钠盐或三乙基铵盐。
在一个实施例中，在本发明中使用的化合物是
在另一个实施例中，在本发明中使用的化合物是
在又另一个实施例中，具有式(A)的化合物是FXR激动剂。
在患有由例如化疗、脂肪变性或胆汁淤积引起的实质性病理的患者中肝再生严重受损[DeMeijer 2010；Farges 2013；Hubert 2015]。
具体地，几十年前就已认识到在患有阻塞性胆汁淤积症的患者中进行大部肝脏分切除的风险[Dixon 1983]，并且已经形成了患有胆恶性肿瘤的黄疸患者的目前手术治疗。胆汁淤积性肝脏的再生能力差促进了侵入性程序的引入，如术前胆汁引流(van derGaag等人，N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2010,362(2):129-37)、门静脉栓塞(PVE)[VanGulik 2008]、以及ALPPS(Oldhafer等人，Ann Surg.[外科年鉴]2016,263(5):839-41)，以在切除之前减轻胆汁淤积或增加肝脏大小。
在一些实施例中，具有式(A)的化合物用于再生受损肝脏、增加受损肝脏的质量或改进受损肝脏的功能、或其组合。
在将肝或肝部分植入受试者中以替换受试者的受损肝脏或功能障碍肝脏的情况下，可能需要增强的肝再生和/或肝脏质量的增加和/或功能的改进。在一个实施例中，该受试者具有移植的肝脏。在一个实施例中，该受试者具有切除的肝脏。在一个实施例中，该肝功能降低是外科手术、疾病、病理状态或损伤的结果。在另一个实施例中，肝功能降低是外科手术的结果。在一个实施例中，该外科手术是肝动脉栓塞或门静脉操作。在一个实施例中，该外科手术是经动脉化疗栓塞(TACE)。在一个实施例中，该外科手术是部分肝切除术。在一个实施例中，该化合物在外科手术之前或之后或组合给予。
为了促进肝再生或增加移植的肝脏或肝脏部分的质量，具有式(A)的化合物可以直接施用于待植入的肝脏，同时该肝脏在肝脏接受者手术过程中立即和/或手术后几天仍是离体的。在由于通过手术计划移除一部分肝脏(例如由于肝中的肿瘤)或由于肝炎而需要肝再生的情况下，给予的时期可分为手术前和手术后给予期。例如，在给予持续4-5天的情况下，在手术前1-2天和手术后另外3-4天给予具有式(A)的化合物是可能的。
需要肝再生的条件包括由于手术移除一部分肝脏、由于创伤而使肝脏受损、或由于引起显著程度急性肝功能障碍的疾病过程(没有被除去例如肝炎)而使肝脏受损的情况。
在一个实施例中，可能是肝脏损伤病因的疾病或病症选自暴露于酒精引起的急性肝损伤，例如，脂肪变性、酒精性肝炎或肝硬化；急性病毒性肝炎，如甲型肝炎；导致铜异常存储的代谢性疾病，如威尔逊氏病，或铁异常存储的代谢性疾病(血色素沉积症)；由暴露于药物或毒素引起的急性肝损伤；由自身免疫过程引起的急性肝炎，如自身免疫性肝炎；或由肥胖或急性脂肪性肝炎的其他病因引起的急性肝损伤。
在一个单独的实施例中，可能是肝脏损伤原因的疾病或病症选自由乙型或丙型肝炎病毒感染或由酒精引起的慢性肝损伤。包括慢性乙型肝炎、肝硬化以及非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。NAFLD是一个术语，被选择用于描述跨越从简单脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)范围的临床和病理综合征。
在一个实施例中，肝功能降低是选自以下的疾病或病理状态的结果：脑腱黄瘤病(CTX)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、药物引起的胆汁淤积、妊娠肝内胆汁淤积症、肠外营养相关的胆汁淤积(PNAC)、细菌过度生长或败血症相关的胆汁淤积、自身免疫性肝炎、慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、肝移植相关的移植物抗宿主病、先天性肝纤维化、胆总管结石病、肉芽肿性肝病、斯耶格伦氏综合征(Sjogren's syndrome)、结节病、威尔逊氏病、高歇氏病(Gaucher's disease)、血色素沉积症、和α1-抗胰蛋白酶缺乏症。
肝再生应该是功能性的，与未处理的对照相比，导致由肝脏产生的蛋白质(例如各种凝血因子)在血清中的更高水平所证明的肝功能的改进。具体而言，肝功能或完整性可以通过测量本领域熟知的多种参数中的任何一种来评估；例如，血清凝血酶原时间(凝血)延长是肝脏受损的征象；慢性肝病中白蛋白水平下降；血浆中碱性磷酸酶水平升高伴随胆管大梗阻、肝内胆汁淤积或肝脏浸润性疾病；总胆红素增加可能是肝脏问题的迹象；γ谷氨酰转肽酶(GGT)可能升高甚至伴有轻微的亚临床水平的肝功能障碍；5'核苷酸酶水平反映胆汁淤积或对肝内或肝外胆管系统的损害；或损伤的肝脏中肝脏葡萄糖产量降低。
药物组合物
“药物组合物”是含有一种或多种具有式(A)的化合物的配制品，该配制品处于适合于向受试者给予的形式。在一个实施例中，所述药物组合物处于散装形式或单位剂型。以易于给予和实现剂量均匀性的剂量单位形式配制组合物可以是有利的。剂量单位形式的规格由活性试剂的独特特性和欲实现的特定治疗效果决定，且直接取决于它们。
可能的配制品包括适合于口服、舌下、口腔、肠胃外(例如，皮下、肌肉内或静脉内)、直肠、局部(包括透皮、鼻内和吸入)给予的那些。对于特定患者最适合的给予方式将取决于所治疗疾病的性质和严重程度或所用疗法的性质以及活性化合物的性质，但在可能的情况下，口服给予可用于预防和治疗FXR介导的疾病和病症。适合于口服给予的配制品可以按以下提供：离散单元，如片剂、胶囊、扁囊剂、锭剂，各自含有预定量的活性化合物；粉末或颗粒；处于水性或非水性液体的溶液或悬浮液；或者水包油或油包水乳液。
适合于舌下或口腔给予的配制品包括锭剂，所述锭剂包含活性化合物和典型的调味基底(如糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)；以及软锭剂，所述软锭剂在惰性基底(如明胶和甘油或蔗糖阿拉伯胶)中包含活性化合物。
适合于肠胃外给予的配制品通常包含含有预定浓度的活性化合物的无菌水性溶液；该溶液可以与预期接受者的血液是等渗的。适合于肠胃外给予的另外配制品包括含有生理学上适合的共溶剂和/或络合剂(如表面活性剂和环糊精)的配制品。水包油乳液也是肠胃外配制品的适合配制品。虽然这类溶液可以静脉内给予，但它们还可以通过皮下或肌内注射而给予。
适合于直肠给予的配制品可作为单位剂量的栓剂提供，所述单位剂量的栓剂包含形成栓剂基质的一种或多种固体载体中的活性成分，例如可可脂。
适合于局部或鼻内施用的配制品包括软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂和油。这类配制品的适合载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇及其组合。
本发明的配制品可以通过任何适合的方法制备，典型地通过将活性化合物与液体或细碎的固体载体或两者以所需的比例均匀且密切地混合，并且然后如果需要，使所得混合物成形为所希望的形状。
例如，可以通过压制包含活性成分的粉末或颗粒和一种或多种任选成分(如粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂或表面活性分散剂)的均匀混合物，或者通过模塑粉状的活性成分和惰性液体稀释剂的均匀混合物来制备片剂。通过吸入给予的适合配制品包括可通过各种类型的定量加压气雾剂、喷雾器或吹入器产生的细颗粒粉剂或雾剂。
对于经由口进行的肺部给予，粉末或液滴的粒径通常在0.5-10μm或1-5μm范围内，以确保递送到支气管树中。对于鼻腔给予，可以使用10-500μm范围内的粒径来确保鼻腔内的滞留。
定量吸入器是加压的气雾分配器，通常在液化的推进剂中含有活性成分的悬浮液或溶液配制品。在使用过程中，这些装置将配制品射过经改造适合递送计量体积(通常10至150μl)的阀门，以产生含有活性成分的细颗粒喷雾。适合的推进剂包括某些氯氟化碳化合物，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。配制品可另外地含有一种或多种共溶剂，例如乙醇表面活性剂(如油酸或脱水山梨糖醇三油酸酯)、抗氧化剂和适合的调味剂。
喷雾器是可商购的装置，其通过使压缩气体(通常是空气或氧气)加速穿过狭窄的文丘里管孔口或通过超声搅拌，将活性成分的溶液或悬浮液转化成治疗性气溶胶雾。在喷雾器中使用的适合的配制品由液体载体中的活性成分组成，并且包含高达40％w/w的配制品，优选低于20％w/w。载体通常是水或稀的水性醇溶液，优选通过添加例如氯化钠使其与体液等渗。任选的添加剂包括防腐剂(如果配制品未无菌制备的话)，例如羟苯甲酸甲酯、抗氧化剂、调味剂、挥发油、缓冲剂和表面活性剂。
通过吹入法给予的适合的配制品包括细碎的粉末，所述粉末可利用吹入器递送或以鼻吸药的方式吸入鼻腔。在吹入器中，粉末被包含在通常由明胶或塑料构成的胶囊或药筒中，所述胶囊或药筒可在原位被刺穿或打开，并且粉末通过在吸入时的装置或利用手动泵抽过的空气来递送。用于吹入器的粉末可以只由活性成分组成或由包含活性成分、适合的粉末稀释剂(如乳糖)、和任选的表面活性剂的粉末混合物组成。活性成分通常占配制品的0.1％至100％w/w。
在一个另外的实施例中，本发明提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的本发明的化合物和/或与至少一种药物载体或稀释剂的混合物。这些药物组合物可用于增加肝再生。
该载体是药学上可接受的并且必须与组合物中的其他成分相容，即不对组合物中的其他成分具有有害作用。该载体可以是固体或液体，并且优选配制成单位剂量配制品，例如可以含有按重量计从0.05％至95％的活性成分的片剂。如果需要，也可将其他生理活性成分掺入本发明的药物组合物中。
考虑到配制品的类型的问题，除了上文具体提到的成分以外，本发明的配制品可以包括药学领域的技术人员已知的其他药剂。例如，适合于口服给予的配制品可以包括调味剂，并且适合于鼻内给予的配制品可以包括香料。
实例
实例1.具有式(A)的化合物的合成
具有式(A)的化合物可以由本领域技术人员容易地制备。具体而言，本发明的化合物可以根据美国专利号7,786,102、7,994,352和7,932,244中公开的程序制备。
实例2.化合物1的合成
甲基3α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸酯的制备。
将17.0kg的3α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸、68kg的甲醇以及0.17kg的甲磺酸装入反应器中。然后将反应混合物加热到30℃-60℃持续1小时，并且添加25.5kg的脱矿质水。然后将获得的混合物搅拌，冷却到20℃-25℃直到获得一个良好沉淀，然后进一步冷却到0-15℃。将沉淀物过滤，并且用水和甲醇的混合物洗涤，并且进一步在烘箱中在约40℃下干燥。因此获得15kg的甲基3α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸酯。化学计量产率是85.2％。
甲基3α-三甲基甲硅烷氧基-7-酮基-5β-胆烷酸酯的制备。
将15.0kg的甲基3α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸酯、45kg的甲苯、7.5kg的三乙胺以及7.5kg的三甲基氯硅烷装入反应器中。将混合物加热到70℃-80℃，并且在该温度下保持搅拌约1小时，然后添加37.5kg的水，并且将混合物在15℃-20℃下搅拌。然后将下部水相分离并且排除。将有机相浓缩直到获得一种油性残余物，向其中添加15kg四氢呋喃。将由此获得的含有甲基3α-三甲基甲硅烷氧基-7-酮基-5β-胆烷酸酯的溶液用于下一步骤中。
甲基3α,7α-二-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆烷酸酯的制备。
将30kg的四氢呋喃装在反应容器中，然后使混合物达到-90℃与-60℃之间的一个温度。添加9.8kg的100％二异丙基酰胺锂和9.3kg的三甲基氯硅烷，并且倾倒在(b)中制备的并且含有甲基3α-三甲基甲硅烷氧基-7-酮基-5β-胆烷酸酯的完整四氢呋喃溶液。然后将混合物在-60℃与-90℃之间的一个温度下搅拌约1小时。然后倾倒4.50kg的碳酸氢钠和60kg的水的溶液，并且将混合物在0-10℃下搅拌，并且将下部水相分离并且排除。然后将下部相浓缩直到获得油性残余物，向其中添加45.0kg的二氯甲烷。将由此获得的甲基3α,7α-二-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆烷酸酯的溶液传送到下一阶段。
甲基3α-羟基-6-亚乙基-7-酮基-5β-胆烷酸酯的制备。
将来自前一步骤的甲基3α,7α-二-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆烷酸酯在二氯甲烷中的完整溶液装入反应器中，并且冷却到-90℃与-60℃之间。然后添加1.97kg的乙醛和5.5kg的醚合三氟化硼。将反应混合物保持在搅拌下在以上温度下2-4小时，之后将其加热到30℃-35℃并且保持在那个温度下约2-4小时。然后添加60kg的水。将获得的混合物搅拌，并且将水相分离。将由此获得的含有甲基3α-羟基-6-亚乙基-7-酮基-5β-胆烷酸酯的溶液用于下一步骤中。
3α-羟基-6-亚乙基-7-酮基-5β-胆烷酸的制备。
将前一步骤中获得的甲基3α-羟基-6-亚乙基-7-酮基-5β-胆烷酸酯在二氯甲烷中的溶液装入反应器中。然后将溶剂通过蒸馏去除直到获得一种油性残余物，向其中添加15kg的甲醇。然后将反应混合物加热到45℃-50℃，并且添加7.5kg的30％氢氧化钠，并且将反应混合物保持在以上温度下约1小时。然后添加30kg的水，接着是45.0kg的二氯甲烷和7.5kg的85％磷酸。将下部有机相分离并且随后排除水相。将溶剂通过蒸馏从有机相去除直到获得一种糊状残余物。添加约37.5kg的乙酸乙酯到残余物中，并且将混合物加热到65℃-75℃，然后冷却到10℃-35℃。获得沉淀物，过滤，并且用乙酸乙酯洗涤，并且干燥。获得8.0kg的3α-羟基-6-亚乙基-7-酮基-5β-胆烷酸，针对甲基3α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸酯计算的化学计量产率是51.8％。
3α-羟基-6β-乙基-7-酮基-5β-胆烷酸的制备。
将8.0kg的3α-羟基-6-亚乙基-7-酮基-5β-胆烷酸、48.0kg的水、5.1kg的30％氢氧化钠、0.80kg的5％钯/碳装入反应器中。将反应混合物在1个与3个大气压之间的一个压力下氢化，直到不再注意到氢气吸收。
3α-羟基-6α-乙基-7-酮基-5β-胆烷酸的制备。
以上反应一结束，就将混合物加热到95℃-105℃，并且保持在该温度下几个小时，以使3α-羟基-6β-乙基-7-酮基-5β-胆烷酸转化为所希望的3α-羟基-6α-乙基-7-酮基-5β-胆烷酸的相对应的差向异构体。过滤悬浮液，并且回收催化剂。添加5.1kg的85％磷酸、9.6kg的乙酸乙酯到过滤的溶液中，并且将反应混合物加热到40℃与70℃之间的一个温度。将其冷却到0与30℃之间的一个温度，并且将沉淀物通过过滤回收。在用乙酸乙酯洗涤之后，将沉淀物在烘箱中在65℃下干燥。获得5.0kg的3α-羟基-6α-乙基-7-酮基-5β-胆烷酸。化学计量产率：62.2％。m.p.185℃-188℃。
3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸(化合物1)的制备。
将5.0kg的3α-羟基-6α-乙基-7-酮基-5β-胆烷酸、5.0kg的水、2.50kg的氢氧化钠装在反应器中。然后将混合物加热到70℃-105℃，并且倾倒硼氢化钠溶解于2.50kg水中的混合物，然后将混合物保持温热1小时，冷却到室温，并且添加10.0kg的脱矿质水、15.0kg的二氯甲烷以及3.00kg的85％磷酸。搅拌混合物，分离下部有机相，并且去除水相。通过冷却有机溶液获得粗产物的结晶。将这一产物溶解于50kg的脱矿质水和1.10kg的30％氨水中。然后将混合物搅拌直到获得一种完全溶液。将混合物保持在20℃-50℃下，并且倾倒1.50kg的磷酸。将沉淀的混合物在20℃与50℃之间的一个温度下搅拌，然后将沉淀物通过过滤回收，用水洗涤，并且干燥。4.50kg的3α,7α-二-羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸(化合物1)。化学计量产率：89.6％。
实例3.化合物2、3和4的合成
3α-四氢吡喃基氧基-7-酮基-5β-胆烷-24-酸(2A)的制备。
将在二噁烷(12ml)中的3,4-二氢-2H-吡喃(1.74ml，19mmol)缓慢滴到对甲苯磺酸(115mg，0.6ml)和6α-乙基-7-酮石胆酸(5.0g，12mmol)在二噁烷(55ml)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时。然后添加水(40ml)，并且将混合物在真空下部分浓缩，并且用EtOAc(4次/25ml)萃取。将合并的有机级分用盐水(1次/50ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并且在真空下蒸发，以得到6g的化合物2A。将粗衍生物不经进一步纯化即用于下一步骤。
3α-四氢吡喃基氧基-6α-乙基-7-酮基-24-降-5β-胆烷-23-碘化物(3A)的制备。
在用一个300W钨灯照射下，将在CCl4(75ml)中的碘(5g，20mmol)滴加到2A(5.5g，11mmol)和四乙酸铅(4.9g，11mmol)在CCl4(200ml)中的溶液中。将反应混合物搅拌直到色彩持久(18h)。将混合物冷却并且在上过滤。将有机相用5％Na2S2O3溶液、5％NaOH、盐水(15ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并且在真空下蒸发。将残余物通过使用轻质石油/EtOAc 95/5的混合物作为流动相的硅胶快速色谱进行纯化，以给出4.6g的化合物3A(40％产率)。
3α-羟基-6α-乙基-7-酮基-24-降-5β-胆烷-23-碘化物(4A)的制备。
将化合物3A(2.2g，3.8mmol)在室温下在HCl 37％于THF(50ml)中的溶液中搅拌过夜。将反应混合物用NaHCO3的饱和溶液(20ml)、H2O(20ml)和盐水(20ml)洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空下蒸发，以得到1.4g的化合物4A(80％产率)。将粗衍生物不经进一步纯化即用于下一步骤。
3α-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基-6α-乙基-7-酮基-24-降-5β-胆烷-23-碘化物(5A)的制备。
向4A(1.4g，2.8mmol)在CH2Cl2(30ml)中的溶液中添加叔丁基二甲基氯硅烷(496mg，3.22mmol)和咪唑(230mg，3.36mmol)，并且将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用NaHCO3的饱和溶液(30ml)、盐水(30ml)洗涤，并且经无水Na2SO4干燥。将有机相在真空下蒸发，以得到1.5g的化合物5A(87％产率)。将粗衍生物不经进一步纯化即用于下一步骤。
3α-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基-6α-乙基-7-酮基-24-降-5β-胆烷-23-醇(6A)的制备。
向5A(1.2g，1.96mmol)在丙酮(12ml)中的溶液中添加Ag2CO3(1.1g，3.9mmol)。将反应混合物回流过夜，并且然后冷却到室温，在上过滤，用丙酮洗涤，并且将合并的有机相浓缩，以产生1g的化合物6A。将粗衍生物不经进一步纯化即用于下一步骤。
3α-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基-7α-羟基-6α-乙基-24-降-5β-胆烷-23-醇(7A)的制备。
向6A(1g，1.96mmol)于THF(50ml)和H2O(12.5ml)的混合物中的溶液中添加NaBH4(740mg，19.6mmol)，并且将混合物在室温下搅拌1小时30分钟。将反应溶液在真空下部分浓缩，并且用CHCl3(3次/20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(1次/50ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并且在真空下蒸发。将粗残余物通过使用CH2Cl2:MeOH 99:1的混合物作为流动相的硅胶快速色谱进行纯化，以给出0.8g的7A(81％产率)。
3α-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基-7α-羟基-6α-乙基-24-降-5β-胆烷-23-硫酸三乙基铵盐(化合物2)的制备。
向在-3℃下冷却的7A(0.5g，0.99mmol)在THF(7ml)中的溶液中添加Et3N(0.3ml，2.1mmol)，并且将所得混合物搅拌10分钟。添加ClSO3H(0.1ml，1.5mmol)，并且将混合物在室温下搅拌过夜。然后添加水(10ml)，并且将混合物用CH2Cl2(3次/15ml)萃取，经无水Na2SO4干燥，并且在真空下蒸发。将粗硫酸盐衍生物不经进一步纯化即用于下一步骤。
3α,7α,23-三羟基-6α-乙基-24-降-5β-胆烷-23-硫酸三乙基铵盐(化合物3)的制备。
向化合物2(0.5g，0.77mmol)在丙酮(8ml)中的溶液中添加PdCl2(CH3CN)2(10mg，0.05当量)，并且将混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物过滤，在真空下浓缩，并且通过使用MeOH/H2O 8/2混合物作为流动相的中等压力Lichroprep RP-8进行纯化，以得到0.115g的化合物3(mp 118℃-121℃)。
3α,7α,23-三羟基-6α-乙基-24-降-5β-胆烷-23-硫酸钠盐(化合物4)的制备。
向化合物2(0.4g，0.72mmol)在丙酮(4ml)和H2O(0.08ml)的混合物中的溶液中添加PdCl2(CH3CN)2(10mg，0.05当量)，并且将所得混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物经过滤，并且在真空下浓缩。将所得残余物用10％NaOH的甲醇溶液处理2小时。将所得混合物在真空下浓缩，并且使用CH3OH/H2O(7:3)的混合物作为流动相进行液体中等压力纯化，以得到0.09g的化合物4(25％产率)。
实例4.化合物1(也称为6-ECDCA)对兔门静脉栓塞(PVE)的作用
背景技术
肝肿瘤的完整切除是恶性肝肿瘤的根治疗法的外科手术。然而，残余肝脏可能太小而不能满足适当肝功能和体积的要求。由于这个原因，这些患者的肝脏被认为无法切除。已经开发了各种程序以在术前增加未来残余肝脏(FRL)的大小和功能。增加不可切除的患者中的FRL的一种程序是门静脉栓塞(PVE)。
PVE是一种临床程序，其在另一部分的计划肝切除之前，增加肝脏该部分的肝再生。在该程序中，将针头经皮插入肝脏并进入提供肿瘤最大部分的肝脏部分的血管。将微球体输注到供应血流至栓塞区域的门静脉，从而导致切断血流。栓塞性叶的这种阻塞促使非栓塞性叶生长，实际上促使肝再生。该增长具有扩大手术后患者依赖的残余肝节段的作用。由于残留的少量肝脏，肿瘤先前被认为无法手术的患者现在可以接受手术以去除肿瘤。数周后，肝脏未栓塞的一侧应再生至其中手术是可行的选择的一种水平。
下面的体内动物模型的结果表明6-ECDCA加速肝再生并增加肝脏质量。
材料和方法
动物研究
将平均体重为3.0±0.5kg的雌性新西兰白兔在温控室中在标准实验室条件下适应新环境1周。这些动物单独圈养，可以免费获得标准的实验室食物和水，并且每天经受12小时的光照/黑暗周期。将兔分成接受6-ECDCA的两组和接受媒介物的两个对照组。特别地，将PVE研究兔分成以下几组：
第1组：正常饮食(6-ECDCA 10mg/kg/天，口服强饲法)(N＝6)，在PVE后第7天处死动物。
第2组：正常饮食(媒介物)(N＝6)，在PVE后第7天处死动物。
第3组：正常饮食(6-ECDCA 10mg/kg/天，口服强饲法)(N＝6)，在PVE后第3天处死动物。
第4组：正常饮食(媒介物)(N＝6)，在PVE后第3天处死动物。
图1描述了计算机断层扫描(CT)和门静脉造影测量以及兔门静脉栓塞的研究大纲和时间表。
门静脉栓塞
兔肝由四个肝叶组成，其中三个位于颅内，第四个位于尾部。在兔PVE模型中，占肝总体积的约80％的颅内肝叶是栓塞的。皮下注射0.03mg/kg丁丙诺啡和0.02mg/kg恩诺沙星后，将兔仰卧位放置。术后，将兔每天一次皮下给予恩诺沙星0.02mg/kg，持续3天。通过肌内注射25.0mg/kg氯胺酮和0.2mg/kg右美托咪定来麻醉动物。将异氟烷1％-2％与O2/空气(1:0.7L/分钟)一起用于维持麻醉。在整个程序中通过脉搏血氧仪持续测量心率和动脉血氧饱和度。
为了识别各个门脉分支，进行了门静脉造影术。在通过门脉分支到尾部肝叶后，将微型导管定位到供应颅内肝叶的主要门脉分支中。动物接受对比剂(Visipaque)和90-180μm聚乙烯醇(PVA)颗粒的初始混合物，随后注射300-500μm PVA颗粒，直到停止流动并放置三个铂线圈(6mm)。PVE后直接进行的门静脉造影术确认了栓塞组中颅内门脉血流的完全闭塞。在栓塞之前和栓塞后第3天和第7天，使用CT体积分析来测量尾部和颅内叶的肥大和萎缩应答。
CT体积分析
使用64切片CT扫描(Brilliance 64通道；飞利浦公司(Philips)，埃因霍温(Eindhoven)，荷兰))进行多相CT扫描。将兔子仰卧位放置。在空白系列之后，在对比剂注射(4mL Visipaque)随后注射3mL NaCl之后进行15s(动脉相)、30s(门脉相)和45s(静脉相)的对比增强扫描。使用重建的2mm轴向切片进行肝脏的3D重建。手动描绘总肝脏以及颅内肝叶和尾部肝叶，并计算总肝体积(TLV)和尾部肝体积(CLV)和颅内肝体积(CrLV)。
使用下式将PVE之前的CLV表示为TLV的百分比：
PVE后，使用下式计算％CLV：
使用下式计算CLV的增加：
相应计算CrLV。
统计学分析
采用社会科学统计软件包(SPSS 18.0；SPSS公司(SPSS)，芝加哥(Chicago)，伊利诺伊州(Illinois))和GraphPad Prism(GraphPad软件公司(GraphPad Software)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州)进行统计分析。使用基于分级数据的混合模型分析来比较CT体积分析数据。通过曼-惠特尼(Mann-Whitney)U检验来比较连续的非参数数据。威尔科克森(Wilcoxon)符号秩检验用于组内不同时间点的非参数连续数据。使用皮尔森(Pearson)r相关系数来检验变量间的相关性。所有统计检验均为双尾检验，并且在P值≤0.05时，差异被认为是显著的。将数据表示为平均值±SD，除非另有说明。
进行以下测量：(1)体重，(2)栓塞性和非栓塞性叶的计算机断层扫描，(3)肝脏中细胞周期相关转录物和胆汁盐稳态相关转录物的表达，(4)回肠转录物的表达，和(5)血清总胆汁盐浓度。
体重测量
在研究的每一天测量每只兔的总重量，并且这一数据在图2中提供。数据指示用6-ECDCA或媒介物处理的动物的重量之间的差异没有统计学显著性。
计算机断层扫描
在基线、第6天以及栓塞后第3天和第7天进行计算机断层扫描测量。图3是一幅图，其指示栓塞性叶的尾部肝体积(CLV；％)的增加与时间。图3中的数据表明6-ECDCA加速了非栓塞性叶的肥大。图5是一幅图，其指示PVE研究兔的栓塞性叶的颅内肝叶体积(CrLV，％)水平的降低与时间。图5中的数据指示6-ECDCA不影响栓塞性叶的萎缩。
肝脏中细胞周期相关转录物和BA稳态相关转录物的表达
图6A-6D描述了6-ECDCA对在栓塞后第7天在肝脏的肥大和萎缩部分中细胞周期相关转录物的相对表达的作用。图6E-6H描述了6-ECDCA对在栓塞后第7天在肝脏的肥大和萎缩部分中胆汁盐稳态相关转录物的相对表达的作用。
回肠转录物的表达
图7A-7G描述了6-ECDCA对在栓塞后第7天回肠转录物的作用。
血清胆汁浓度
在基线，3小时以及PVE后第1天、第3天和第7天确定血清胆汁盐浓度。根据制造商的说明书(Diazyme实验室公司(Diazyme Laboratories)，波威(Poway)，加利福尼亚州)通过酶法测定总血清胆汁盐。图8是一张图，其指示PVE研究兔(n＝5/组)中的血清胆汁盐总浓度(μmol/L)与时间(天)。先前，检查血浆胆汁盐作为PVE后再生应答的预测因素。已证明，PVE后早期的血浆胆汁盐水平与PVE兔模型中的再生应答密切相关(Hoekstra等人，J.Surgical Research[外科研究杂志],2012,178,773-778)。
相反，图8中的数据指示，与对照相比，PVE后第1天用6-ECDCA处理的动物中的血清胆汁盐浓度相对较低，尽管相对于对照，6-ECDCA显示加速非栓塞性叶的肥大(参见图3)。
实例5.化合物1(也称为6-ECDCA或OCA或奥贝胆酸)对兔门静脉栓塞(PVE)的作用
门静脉栓塞(PVE)用于增加预定进行大部分肝切除的患者中的未来残余肝脏体积。胆汁盐活化的转录因子法尼醇X受体(FXR)是增殖性胆汁盐信号转导(牵涉部分肝切除术后代偿性肝生长的早期阶段的事件)的关键介质。这项研究的目的是评估有效的FXR激动剂(奥贝胆酸，OCA)对PVE诱导的肝生长的作用。通过CT扫描、肝胆闪烁扫描和图像分析并通过免疫组织化学针对增殖标志物Ki67评估肝生长。通过测量血浆转氨酶和评估肝脏组织学来检查肝损伤。
在PVE之前7天开始，在每日口服强饲OCA(10mg/kg)或媒介物之间随机分配三十六只兔，并持续至PVE后7天。在第0天使用聚乙烯醇颗粒和线圈进行颅内肝叶的PVE。在第-7、-1、+3和+7天通过CT体积分析来分析尾部肝体积(CLV)。使用肝胆闪烁扫描术在动物亚组中定量肝功能(即，甲溴苯宁摄取)。分析的另外参数是血浆转氨酶水平、H&E染色的和Ki67染色的肝部分的组织学评分、以及FXR靶基因表达。
材料和方法
动物
学术医疗中心的动物伦理和福利委员会批准了所有的实验方案(BEX35AC和BEX35AD)。允许平均体重为2941(±267)克的三十六只新西兰白兔(查尔斯河公司(CharlesRiver)，Gennat，法国)适应新环境1周，然后包含在实验中。将兔按组圈养在温控室中，12小时光照/黑暗周期，并且随意获取用水和标准食物。
实验设计
计划六组六只兔进行PVE。将动物随机分配至经由口服强饲(针对3kg动物，1.5mL)的每日奥贝胆酸(Intercept Pharmaceuticals公司)处理(10mg/kg在1％甲基纤维素中)或媒介物(1％甲基纤维素，西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，兹韦恩德雷赫特(Zwijndrecht)，荷兰)。在PVE前7天开始处理，并持续至PVE后第3天或第7天处死。
门静脉栓塞
通过皮下注射氯胺酮(25mg/kg，Nimatek，Eurovet，布拉德尔(Bladel)，荷兰)和美托咪定(0.2mg/kg，Dexdomitor，Orion，埃斯波(Espoo)，芬兰(Finland))来麻醉动物。使用与O2/空气(1:1，3L/分钟)混合的异氟烷2％(Forene；雅培制药公司(AbbottLaboratories)，Kent(肯特)，英国)来维持麻醉。术前镇痛由丁丙诺啡(0.03mg/kg，Temgesic，利洁时医疗保健集团(Reckitt Benckiser Healthcare)，赫尔(Hull)，英国)组成。抗生素预防由皮下注射Baytril(0.2mg/kg体重，拜耳医疗保健公司(BayerHealthcare)，柏林，德国)组成。
如前所述进行PVE(van den Esschert JW等人，Ann Surg[外科年鉴]2012；255(2):311-8)。在中线剖腹手术后，使用18G导管对肠系膜下静脉的分支进行插管(HospiraVenisystems公司，森林湖(Lake Forest)，伊利诺伊州，美国)。在数字扣除门静脉造影术下，将具有Transend-ex 0.36mm×182cm引导线(波士顿科学公司(Boston Scientific))的Renegade 3F微导管(波士顿科学公司，纳蒂克(Natick)，马萨诸塞州)定位在至颅内肝叶的主要门脉分支处。通过导管输注聚乙烯醇颗粒(直径90-180μm和300-500μm，库克公司(Cook)，布卢明顿(Bloomington)，印第安纳州)和2个纤维铂线圈(4.0和6.0mm；波士顿科学公司)，以将至颅内叶的门脉分支封闭。通过门静脉造影术证实PVE，并且将肠系膜静脉使用绷带闭合。以两层闭合腹部。在PVE后每日给予Baytril持续3天。
CT体积分析
在第-7、-1、+3和+7天进行多相CT扫描(Brilliance 64，飞利浦公司，埃因霍温，荷兰)。麻醉动物(n＝18/处理组)，并将22G导管置于侧耳静脉中。进行基线扫描，并注射3mL的造影溶液(Visipaque，GE医疗基团，沃基肖(Waukesha)，威斯康星州)。分别在15、30、45秒后进行动脉相、门脉相和静脉相扫描。使用手动描绘来对5-mm轴向切片的3D重建进行体积分析。确定尾部肝体积(CLV)和总肝体积(TLV)，并使用下式确定CLV的增加：
使用同一公式计算颅内肝体积(CrLV；CrLV＝TLV-CLV)的减少。使用第-1天的值作为基线计算CLV的增加和CrLV的减少。请注意，出于图形目的，CLV和CrLV的变化从第0天(PVE的时间点)开始显示。使用下式计算再生率：
为了验证CT体积数据，处死时的体积分析测量值与处死时的实际肝重(精度标尺，赛多利斯公司(Sartorius)，哥廷根德国)相关(图9；灰色方块代表来自对照组的动物，黑色三角代表用OCA处理的动物；使用斯皮尔曼等级相关系数检验相关性)。
肝胆闪烁扫描术
在第-7、-1、+3和+7天使用具有99mTc-标记的(2,4,6三甲基-3-溴)亚氨基二乙酸(99mTc-甲溴苯宁，Bridatec，GE医疗集团，埃因霍温，荷兰)的肝胆闪烁扫描术(HBS)评估肝功能。将兔(n＝6/处理组)麻醉并置于成像台上，肝脏和心脏置于大视野单光子发射计算机断层扫描(SPECT/CT)照相机(西门子塞班(Siemens Symbia)T16)下。目的区域被绘制在左心室周围用于血池读数，整个肝脏周围用于总肝脏摄取，并且尾部肝叶周围(图10；黄色目的区域(ROI)描绘了左心室，红色ROI描绘了总肝脏并且粉色ROI描绘了尾部肝叶；在门静脉栓塞后，看到颅内肝叶活动明显减少，以及尾部肝叶活动明显增加)。每只兔在开始采集前直接经由侧耳静脉给予50MBq 99mTc-甲溴苯宁的剂量。
使用前照相机和后照相机的几何平均数据集进行分析。计算肝脏99mTc-甲溴苯宁摄取率为两分钟内99mTc-甲溴苯宁摄取的增加，校正灌注。总肝脏摄取由总肝脏99mTc-甲溴苯宁摄取率表示，并计算为每分钟注射剂量的百分比。基于节段性活动的分布计算尾部肝叶的分数99mTc-甲溴苯宁摄取率，并在t＝-7天时对基线测量值进行校正。
组织学
将肝组织(左侧叶和尾叶)在缓冲的福尔马林中固定48小时，并随后脱水并包埋在石蜡中。切下四微米肝组织部分并用标准苏木精和伊红染色剂染色。根据表1，针对小叶和门脉炎症对部分进行评分。另外，肝部分用Ki67抗体染色以定量肝细胞增殖，并且如先前详细描述地进行苏木精复染(van der Loos CM等人J Histochem Cytochem[组织化学与细胞化学杂志]2013；61(1):11-8；Marsman HA等人，Br J Surg[英国外科杂志]2013；100(5):674-83)。由对组分配不知情的血液病理学家(JV)对每只动物总共五个高倍视野的Ki67阳性肝细胞计数。在第3天和第7天评估肝组织学，n＝6/处理组。
表1
临床化学
通过临床化学系(学术医学中心(Academic Medical Center)，阿姆斯特丹，荷兰)使用Cobas 8000模块化分析仪(罗氏公司(Roche)，巴塞尔(Basel)，瑞士)对从每个处理组12只动物获得的样品确定血清丙氨酸转氨酶(ALT)、氨基天冬氨酸转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(γGT)和碱性磷酸酶(ALP)。
PCR(聚合酶链反应)
使用Tri试剂(Ambion)从末端回肠和(非)栓塞性肝叶分离总RNA。用DNAseI(普洛麦格公司(Promega)，莱顿(Leiden)，荷兰)处理后，使用iSCRIPT cDNA合成试剂盒(伯乐公司(BioRad)，费嫩达尔(Veenendaal)，荷兰)将750ng总RNA转化为cDNA。使用SYBR Green化学品(SYBR Green MasterMix，伯乐公司)和相当于7.5ng总RNA的cDNA作为模板在IQ5循环仪上进行定量RT-PCR(实时聚合酶链反应)。使用LinReg软件(Ramakers C等人NeurosciLett[神经科学快报]2003；339(1):62-6)计算表达水平并归一化为Rplp0、Hprt和Gapdh的几何平均数。表2中提供了引物序列。通过琼脂糖凝胶电泳检查预测的产物大小。针对n＝6/处理组，使用在第3天和第7天获得的组织进行PCR分析。
表2：引物序列
统计学分析
使用曼-惠特尼U-检验或克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)检验来检验组间非参数数据的差异。使用曼-惠特尼U-检验对通过曲线下分析的面积获得的值来分析OCA对CLV增加或CrLV减少的影响。使用重复测量值ANOVA来分析血浆实验室值之间的差异。使用斯皮尔曼等级相关系数来检验相关性。所有统计分析均使用Graphpad Prism 6.0(Graphpad公司，拉荷亚(La Jolla)，加利福尼亚州)进行。
结果：奥贝胆酸促进门静脉栓塞后的肝再生。
在进行颅内肝叶栓塞之前，将动物用FXR激动剂奥贝胆酸(OCA)预处理7天。在实验过程中评估了总体积(TLV)、尾叶体积(CLV，在PVE后再生)和颅内叶体积(CrLV，在PVE后萎缩)。在PVE后第三天和第七天处死动物。
选择七天的OCA预处理以确保PVE时足够的组织水平的OCA。24在小鼠中，富含胆酸的饮食以FXR依赖性方式诱导自发性肝生长(Huang W等人，Science[科学]2006；312(5771):233-6)。因此，首先通过在预处理期(第-7天至第-1天)分析TLV(总体积)来评估OCA是否诱导肝生长(Huang W等人，Science[科学]2006；312(5771):233-6)。在这两个时间点，TLV(体重校正)在两组之间是相似的，并且在这两组的各时间点之间是相似的(图11A；用威尔科克森配对符号秩和曼-惠特尼U-检验来分析数据，N＝17/组)。因此，OCA不诱导自发性肝生长。
接下来，检查了OCA对PVE诱导的肝生长的作用。尽管在实验结束前有2只动物由于麻醉诱导期间的技术性并发症和肠系膜静脉插管而死亡，但PVE程序可以很好地耐受。因此，在PVE后长达3天可获得34只兔的体积数据，而PVE后7天可获得22只动物的数据用于肝体积评估。
在PVE后3天和7天评估尾叶的肝肥大并且表示为从第-1天值增加的百分比。在PVE后3天，与媒介物对照相比，OCA组中的尾部非栓塞性肝的体积增加了2.2倍(图11B，56.1±20.3％与26.1±15.4％，P<0.001；值表示在第-1天相对于体积的百分比增加；使用曼-惠特尼U-检验对在各个时间点处的曲线下面积值来分析数据，直到第3天N＝17/组，以及在第7天N＝11/组)。在PVE后第7天，在OCA处理的动物中尾部肝体积增加仍然高出1.5倍(102.0±38.2与67.6±17.7％，P＝0.02)，这指示OCA在前七天加速肝再生。栓塞性节段的肝体积减少在这两组之间是相似的(图11C；值表示在第-1天相对于体积的百分比降低；使用曼-惠特尼U-检验对各个时间点处的曲线下面积值来分析数据，直到第3天N＝17/组，以及在第7天N＝11/组)。不受理论束缚，这些数据表明OCA对再生具有直接影响，并且不影响栓塞性颅内叶的萎缩。
由OCA诱导的体积增加仅在实际肝功能也增加时才是相关的。这通过定量甲溴苯宁摄取来评估，甲溴苯宁摄取是常归用于临床手术实践中的肝脏功能的一种标志。甲溴苯宁总肝摄取在第-1天在这两组中是相似的，均保持稳定(图11D；使用重复测量ANOVA来分析数据，N＝6/组)。在PVE后3天和7天，这两组中非栓塞性尾部肝叶(CLF份额)对总肝脏甲溴苯宁摄取的贡献增加。然而，在PVE后3天，OCA处理的动物的增加更多(44.5±5.4％与36.0±3.7％，P＝0.02)，这指示OCA促进非栓塞性肝叶的功能性能力的增加(图11E；使用重复测量值ANOVA来分析数据，N＝5-6/组)。为了检查OCA处理的动物体积增加是否反映肥大或增生，将肝部分针对增殖标志物Ki67进行染色，所述增殖标志物Ki67在没有症状的肝细胞中不表达。在第+3天，OCA组中的Ki67阳性肝细胞的数量增加是明显的，与第7天组中的数目相似。(图11F；使用曼-惠特尼U-检验来分析数据)。因此，在PVE后第3天，增加的肝细胞增殖基于OCA处理的动物中增强的肝生长。
为了排除体重变化作为肝体积计算中的混杂因素，每天测量动物的体重。这两组在PVE后体重均下降至相似程度(图11G；使用重复测量值ANOVA来分析数据，N＝17/组)。这两组在PVE之前的体重增加是相似的，这指示OCA耐受良好。
在图9A-G中，各组间的*指示p<0.05，**指示P<0.01，并且***指示P<0.001。缩写：OCA，奥贝胆酸；TLV，肝总体积；CLV，尾部肝体积；CrLV，颅内肝体积；TLF，总肝功能；CLF，尾部肝功能。
总结
PVE后三天，OCA组中CLV的增加比对照高出2.2倍(56.1±20.3％与26.1±15.4，P<0.001)，并且这种增加仍然显著高于PVE后的7天(+1.5倍，P＝0.02)。在OCA处理的动物中在第+3天尾部肝功能的增加更大(+1.2倍，P＝0.02)。在PVE后3天，OCA处理的动物中Ki67阳性肝细胞的数量高出1.6倍(P<0.05)。在OCA和媒介物处理的动物中血浆转氨酶水平是相似的，并且这两组中H&E部分的组织学评分也是相似的。转录物分析表明回肠和肝FXR激活。
OCA在兔模型中加速PVE后的肝再生。因此，OCA处理可以提高PVE的功效，并从而预防大部分肝切除后肝衰竭并增加可切除性。
这项研究表明，OCA通过增生作用经PVE后的前3天加速非栓塞性节段的体积增加。OCA具有潜在的药物干预作用，以增强肝再生。
奥贝胆酸不与明显的肝细胞和胆损伤相关。
为了检查OCA处理是否导致肝损伤，在实验过程中测量转氨酶水平。PVE诱导ALT和AST短暂升高，它们在这两组中的水平在第+1天达到顶峰，并且然后返回基线值(图12A-B)。在整个测量值中各组之间的水平是相似的(图12A-B)。在PVE之前，这两组中γGT和ALP也保持稳定。PVE后，在OCA处理的动物中γGT和ALP稍高，然而PVE后两组中的水平均未增加至基线以上。(图12C、D)。这些结果表明，OCA不会导致肝细胞损伤或胆汁淤积。在图12A-D中，数据表示为n＝5-11/组的平均值(±SEM)。使用双向ANOVA来检验各组之间的差异。*指示P<0.05，**指示P<0.01。
为了检查OCA对肝脏组织学的潜在影响，对H&E染色的尾叶部分以盲法方式进行评分。在所有动物中观察到轻微的门脉和小叶炎症以及轻微的窦状扩张，其中组间没有差异(图12E；数据表示为n＝5-6/组的中值(范围)；在100×放大率下用H&E染色的在第3天和第7天两组代表性肝部分)。在总共四只动物中观察到由尾叶中的一些栓塞材料的回流引起的异物反应，其中对照组中的两只在第3天处死，OCA组中的一只在第3天处死并且OCA组中的一只在第7天处死。这在组间没有差异，并且栓塞材料的回流似乎不影响肝脏肥大。在第3天和第7天在两组中都观察到小滴大泡性脂肪变性，其中组间没有差异，这与之前对部分肝切除术的小鼠模型中的轻度脂肪变性的观察结果一致(Dai G等人，Hepatology[肝脏病学]2008；47(4):1277-87)。
OCA激活回肠和肝FXR
为了评估OCA的转录效果，分析在PVE后3天和7天收获的末端回肠和肝脏中的FXR靶基因表达。FXR在末端回肠和肝脏两者中表达，并且可以想到都有助于兔中肝脏再生(Borude等人，Hepatology[肝脏病学]2012；56(6):2344-52；Zhang等人，Hepatology[肝脏病学]2012；56(6):2336-43)。
OCA对Fxr本身的回肠表达没有影响，但在第+3天导致回肠Shp的诱导(图13A；用奥贝胆酸(OCA)预处理动物7天并对颅内肝叶进行栓塞。在PVE后三天和七天处死时收获末端回肠(图A)和尾部肝脏(图B)。通过RTqPCR分析基因表达。与媒介物组相比，数据表示为倍数表达。数据表示为n＝5-6/组的平均值(±SEM)。各组间的*指示P<0.05并且**指示P<0.01)。这与Shp是Fxr的靶基因相一致。然而，Ostβ的回肠表达，据报道受啮齿动物和人类中的Fxr调控(Landrier等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol[美国生理学杂志-胃肠与肝脏生理学]2006；290(3):G476-85；Zollner等人，Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol[美国生理学杂志-胃肠与肝脏生理学]2006；290(5):G923-32)，不受OCA的影响。胆汁盐合成酶Cyp7a1的肝表达在第+3天在OCA处理的动物中被强烈抑制(图13B)。这发生在没有阻遏物Shp的转录诱导的情况下，表明Shp独立的Fgf19信号转导可能负责观察到的Cyp7a1的阻遏。Fgf19的肝受体由Fgfr4和βKlotho形成。Fgfr4的表达不受OCA处理的影响，三天后观察到βKlotho的转录水平下轻微下调(图13B)。这些发现与通过OCA介导的回肠Fgf19诱导来下调Cyp7a1一致。
OCA处理导致在第+7天肝Fxr表达降低。在第+3天在OCA处理的动物中，Ostβ在肝脏中的表达是升高的。相反，虽然回肠Shp表达由OCA诱导，但在肝脏中未观察到。持续的OCA剂量和处死之间的时期范围在9-12小时之间，并且对于观察长期一致的转录效果可能不是最理想的。尽管如此，来自基因表达分析的总体发现指示，OCA处理导致回肠和肝FXR的激活。
讨论
在这项研究中，检查了有效FXR激动剂OCA对PVE兔模型中肝再生的作用。OCA在PVE后的7天中加速肝再生，如通过以下所证明的：与媒介物对照相比，在OCA处理的动物中在PVE后的第3天CLT增加2.2倍和第7天CLV增加1.5倍。此外，肝胆闪烁扫描揭示在OCA处理的动物中在PVE后的3天尾部肝叶的摄取能力增强(1.2倍，P＝0.02)。这伴随着Ki67+肝细胞数量的增加，指示PVE加OCA引起比没有OCA的PVE更强的增生性应答。OCA诱导的肝脏再生加速具有巨大的临床潜力。
目前的数据显示，有效FXR激动剂OCA在标准化兔模型中在PVE后的3天大幅增加了尾叶的体积增加。体积增加归因于从增殖性标志物Ki67的增强的肝细胞阳性所推断的增生。这些结果指示，OCA可能能够减少从PVE到肝切除的时间，这可能有几个优点，例如避免PVE后需要化疗。此外，OCA可能会改进肝脏对PVE的生长应答，这可以增加具有非常小的FLR的患者的可切除性。此外，当这些结果外推到肝切除术时，通过OCA增加的肝脏再生可防止切除后的肝衰竭。在延长的肝切除术后的前些天患者最易发生肝衰竭(Etra JW等人，HPB(牛津(Oxford))2014；16(10):875-83)，并且肝再生的早期开始与肝衰竭的较低发生率有关(Shirabe K等人，Scand J Surg[斯堪地纳维亚外科杂志]2013；102(2):101-5)。通过在这些前些天中增强肝再生，OCA有利于降低肝衰竭的风险以及随之而来的发病率和死亡率。
体积以及功能增加和Ki67+肝细胞数量的增加指示加速的再生，这在PVE后3天最为明显。我们之前已经表明，PVE后患者中的FRL功能增加先于体积增加(de Graaf W等人，Br J Surg[英国外科杂志]2011；98(6):825-34)。因此，在第+3天评估肝功能之前，在PVE后的初始阶段，OCA处理的动物可能已经具有比对照动物增加的摄取能力。与兔中较高代谢率相一致，兔中肝脏再生与人类相比以更快速度发生，而在小鼠和大鼠中代谢甚至高于兔(West GB等人，J Exp Biol[实验生物学杂志]2005；208(Pt 9):1575-92)。PVE后的7天媒介物处理的兔中，CLV中值增加为67％-71％(van den Esschert等人，Ann Surg.[外科年鉴]2012；255(2):311-8)。
相当于在进行PVE(包括节段4)的一系列所选患者中平均34天后未来残余肝脏体积的62％增加(Shindoh J等人，J Am Coll Surg[美国外科学会杂志]2013；217(1):126-33；讨论133-4)。在ALPPS的环境中，在PVE后的7天的CLV增加与ALPPS第一阶段后的平均时间9天后的FRL体积增加74％相一致(Shindoh J等人，J Am Coll Surg[美国外科学会杂志]2013；217(1):126-33；讨论133-4)。因此，兔中的7天类似于人类4周至5周的PVE和ALPPS后9天。在这些时间间隔内，OCA可能会加速人的再生过程。
OCA可以用作有效增强肝再生的药理学干预。在PVE的兔模型中使用OCA，可以显示的是，可以实现如通过组织学和血浆转氨酶所评估的肝体积、肝功能和肝细胞增殖方面的肝生长加速，没有肝损伤迹象。OCA在提高PVE的功效和减少从PVE到肝切除的时间，以及预防大部分肝切除术后的切除后肝衰竭方面具有潜力[Olthof等人，2016年提交出版]。
实例5a.奥贝胆酸对兔门静脉栓塞(PVE)的作用
胆汁盐信号转导是肝组织手术失败后代偿性肝再生长所必需的。胆汁盐受体FXR在这个过程中起着重要的作用。在这项研究中，我们探索了FXR是否参与门静脉栓塞(PVE)后的再生应答，所述门静脉栓塞是一项增加预定进行延长肝脏手术的患者中的未来残余肝脏体积的干预措施。
方法
成年雌性兔在颅内肝叶栓塞(第0天)之前和之后7天接受媒介物或FXR激动剂奥贝胆酸(OCA；10mg/kg，每日口服强饲)。通过门静脉造影术证实PVE的有效性，并且在第-7、-1、+3和+7天通过CT体积分析来分析尾部肝体积(CLV)。在第+3天和第+7天处死兔(n＝5-6/组)。
结果
在PVE后第3天，OCA诱导CLV的较大增加(59.3±19.2％与对照中的29.7±16.1％，P＝0.001)，这两组在7天后获得相似的体积增加。在这两组中，PVE导致血清胆汁盐升高的类似模式，其中3小时后水平增加，并且第+3天正常化。对第+3天收获的组织的分析揭示，在OCA处理的动物的肥大节段中肝胆汁盐含量降低(60.1[IQR 16.0]与在对照中的100.1[IQR75.1]nmol/g；P＝0.016)(图14)。胆汁盐合成酶Cyp7a1的表达降低(-7.1倍；P＝0.004)以及基底外侧胆汁盐外排泵亚单位Slc51b的表达增强(+6.5倍；P＝0.004)可能导致这种降低。进入有丝分裂所需的磷酸酶Cdc25b的表达在OCA处理的动物的肥大(+1.6倍；P＝0.006)但不萎缩(+1.1倍；P＝0.52)的肝脏节段中升高。在非栓塞性节段中的Cdc25b表达与FXR靶基因Slc51b(ρ＝+0.80，P＝0.002)和Cyp7a1(ρ＝-0.62，P＝0.033)相关，并且倾向于与第+3天的CLV的百分比增加相关(ρ＝+0.57，P＝0.055)(图15)。
OCA通过增生作用加速了PVE诱导的尾叶的体积增加。OCA降低了扩大的尾叶中的胆汁盐含量。胆汁盐合成降低(Cyp7a1)和胆汁盐外排增强(Ostb)可能有助于尾部胆汁盐含量降低。OCA增强Cdc25b在尾叶中的表达，Cdc25b是进入有丝分裂所需的磷酸酶。这与FXR-调节基因的表达相关，并倾向于与CLV增加相关。
结论
OCA在兔中在PVE后的前3天加速肝再生，其中对照和OCA处理的动物在7天后在非栓塞性节段中具有相似的体积增加。改进的胆汁盐稳态和增殖基因(例如Cdc25b)的诱导可能基于PVE后初始阶段中增加的生长速率。
OCA处理在扩大肝脏病灶的可切除性和预防切除后肝衰竭方面具有潜力。
实例6.FXR激动剂奥贝胆酸诱导患有阻塞性胆汁淤积症的大鼠的肝生长
材料和方法
动物
成年雄性威斯达(Wistar)大鼠(300-325g)购自Harlan公司(霍斯特(Horst)，荷兰)，适应新环境一周，并且在标准化实验室条件下(12小时光照-黑暗周期，室温＝21℃±2℃，湿度＝50％±10％)圈养，无限制地使用水和食物(希望农场(Hope Farms)，武尔登(Woerden)，荷兰)。在每次外科手术之前，动物皮下接受0.025mg/kg的丁丙诺啡作为镇痛剂，之后诱导全身麻醉并用空气/O2(1:1体积比，2L/分钟)和2％-3％异氟烷(Forene，雅培制药公司(Abbott Laboratories)，芝加哥，伊利诺伊州)的混合物维持。在该程序中，用加热垫和加热灯将所有大鼠的核心体温维持在37.0℃±0.2℃[NRC 2011]。
实验设计
适应期后，大鼠继续常规食物饮食或转为甲硫氨酸和胆碱缺乏(MCD)饮食(HarlanTeklad，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)持续3周，以诱导中度肝脂肪变性[Heger 2011a]。在第二个饮食周开始时，大鼠要么进行假手术，要么进行可逆性胆管结扎(rBDL)。对于rBDL，将肝外胆管插有与具有闭合远侧尖端(长度＝±7.5cm，内径＝0.8mm，外径＝1.4mm，道康宁公司(Dow Corning)，米德兰(Midland)，密歇根州)的Silastic Tubing连接的聚乙烯导管(长度＝±1.5cm，内径＝0.4mm，外径＝0.9mm，博朗公司(Braun)，梅尔松根(Melsungen)，德国)[Kloek 2008]。将假手术的动物进行腹部手术(包括胆管活动化)，而不诱导胆道阻塞。将rBDL大鼠的各组不进行处理或在7:30和9:00AM之间每日口服强饲FXR激动剂奥贝胆酸(OCA，10mg/kg，在0.5％甲基纤维素中，1.5mL/300g体重)。
BDL或假手术后的七天，所有大鼠经受70％PHx[DeGraaf 2011]。在所有rBDL大鼠中，通过移除闭合的套管尖端并将套管插入十二指肠，直接在PHx之前恢复肠道胆汁流动。PHx后，所有处理组的动物都被喂食常规食物。PHx后继续进行OCA处理直至处死。如方案1所描绘的，该研究由五个实验组(n＝4-6只动物/组/时间点)组成：对照(假)、脂肪变性(MCD)、胆汁淤积(rBDL)、组合型脂肪变性和胆汁淤积(rBDL+MCD)、以及胆汁淤积+OCA(rBDL+OCA)。
方案1.研究设计
方案1示出了该研究设计的示意性概览。将一百三十只大鼠分成五个研究组。在部分肝切除术之前(PHx，即第0天处死)或PHx后1-5天(n＝4-6/组)处死动物。在rBDL组中，在PHx后直接进行胆汁引流(rBDL＝可逆性胆管结扎；Chol.＝胆汁淤积；MCD＝甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食；OCA＝奥贝胆酸；rBDL＝可逆性胆管结扎；steatochol.＝组合型单纯性脂肪变性和胆汁淤积)。
在基线(即，直接在PHx之前)和PHx后的一至五天，在异氟烷麻醉下通过放血使动物安乐死。在肝素-抗凝血真空采血管(BD公司，富兰克林湖(Franklin Lakes)，新泽西州)中从腔静脉收集血液样品并离心10分钟(3000×g，4℃)。在基线处死的rBDL动物中，用注射器从扩张的肝外胆管抽吸胆汁，称重并储存在-80℃。将肝脏和回肠切下，称重，装载并在10％(体积/体积)中和的福尔马林溶液(马林克罗特贝克有限公司(J.T.Baker)，中央谷(Center Valley)，宾夕法尼亚州)中固定，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃，或收集在RNAlater(Qiagen公司，芬洛(Venlo)，荷兰)中并储存在-20℃。由再生的肝脏质量计算肝再生长，并表示为PHx之前总肝脏质量的百分比。使用切除的肝节段的重量(其占总肝脏质量的70％)计算预计的残余肝脏质量。测量干肝重以校正肝含水量[Kloek2010a]。
组织学
福尔马林固定后，将肝标本脱水，石蜡包埋，并用苏木精和伊红(H&E)、I型和III型胶原蛋白染色剂天狼猩红或增殖标志物Ki67进行染色[Marsman 2013]。对H&E染色的和天狼猩红染色的肝脏组织学的半定量分析由对实验组不知情的经验丰富的肝脏病理学家(JV)使用表1中详述的评分系统进行。在200×放大率下在四个随机选择的显微视野中，由两个观察者(RFG和PBO)手动计数Ki67阳性肝细胞核。
表1.组织学评分系统
定量实时聚合酶链反应
进行转录分析[Olthof 2015]。将肝样品用MagNA Lyser进行均质化，并且将总RNA用高纯RNA组织试剂盒萃取(两者均来自罗氏应用科学公司(Roche Applied Sciences)，潘茨堡(Penzberg)，德国)。根据制造商的说明书，使用SensiFAST cDNA合成试剂盒(比奥立公司(Bioline)，伦敦，英国)将1μg RNA逆转录为cDNA。使用SensiFAST SYBR No-ROX混合仪(比奥立公司)在LightCycler 480(罗氏公司(Roche)，巴塞尔(Basel)，瑞士)上进行定量逆转录酶聚合酶链反应。处理并分析荧光数据，并归一化为回肠样品的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hprt)以及肝样品的泛素C(Ubc)和β-2-微球蛋白(B2m)的几何平均值。这些参考基因证明在各实验组和时间点上最稳定(数据未显示)。使用NCBI引物Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计引物以跨越内含子或外显子-外显子结合部并防止残余基因组DNA的扩增(表2)。使用熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳来验证引物特异性。
表2.qRT-PCR引物
细胞因子测量
在含有蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete ULTRA，罗氏公司)的1400μL5mM NaPi缓冲液(pH＝7.4)中，在冰上，使用Diax 900组织匀浆器(海道夫公司(Heidolph)，施瓦巴赫(Schwabach)，德国)来均质化±100mg的大鼠肝脏。将匀浆以10,000×g(4℃)离心10分钟，并按照试剂盒手册(R&D系统公司(R&D systems)，明尼阿波里斯(Minneapolis)，明尼苏达州)通过ELISA测量上清液中的TNF-α和IL-6水平。将细胞因子浓度归一化为匀浆蛋白质含量(蛋白质测定试剂盒，皮尔斯公司(Pierce)，罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州)。
高效液相色谱法分析胆汁酸池组成
通过反相高效液相色谱法(HPLC)分离并定量胆汁酸[Lionarons2016]。通过添加5体积的乙腈使胆汁或血浆样品(20μL)脱蛋白。离心(在20,000×g下10分钟)后，从上清液蒸发溶剂，并将胆汁盐溶解在200μL的25％甲醇中。对于肝匀浆，将100mg肝组织在500μL水中超声处理30-90秒。添加1mL乙腈进行蛋白质沉淀。随后将样品在20,000×g下离心10分钟，之后将上清液用于分析。针对匀浆蛋白质含量校正结果。将100μL样品应用于20℃下操作的Hypersil C18HPLC柱(赛默科技公司(Thermo Scientific)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州)。起始洗脱液由6.8mM甲酸铵(pH＝3.9)组成，然后用下列浓度的乙腈进行线性梯度或等度洗脱：28％(1分钟)、38％(13分钟)、42％(19分钟)、61％(20分钟)、63％(25分钟)、80％(28分钟)、80％(31分钟)和0％(33分钟)。流速是0.8mL/分钟。使用纳米定量分析物检测器QT-500(定量技术公司(Quant Technologies)，布莱恩(Blaine)，明尼苏达州)进行检测。使用每个种类的单独的校准曲线对胆汁酸进行定量。将胆汁性胆汁酸浓度乘以胆汁的总体积以计算胆汁性胆汁酸输出。
统计学分析
使用遵守0.05的显著性水平(α)的GraphPad Prism(版本6.0，拉荷亚，加利福尼亚州)进行所有的统计学分析。假定所有数值变量(近似)遵循高斯分布，并因此使用学生t检验或具有图基事后校正(Tukey’s post-hoc correction)的单向ANOVA进行分析。使用配对t检验分析成对的变量。使用卡方检验分析组织学评分。采用皮尔逊积矩相关系数(Pearsonproduct-moment correlation coefficient)检验相关性。
结果
阻塞性胆汁淤积损害部分肝切除术后的肝再生
通常在具有健康肝脏的动物中研究肝再生，这与手术实践形成鲜明对比，该手术实践以受化疗、脂肪变性、胆汁淤积或这些因素的组合所影响的肝脏的患者为主。由于这些情况损害肝再生并对术后结局产生负面影响[DeMeijer 2010；Farges 2013；Hubert2015]，所以第一个目标是在各种实质病理条件下研究70％PHx后的肝再生。先前报道了rBDL和MCD处理对PHx之前的实质性炎症的影响[Lionarons 2016]。
图16显示健康大鼠肝脏在PHx后的五天内再生至其最初质量的约90％(图16A，第二条，对照曲线)。患有单纯脂肪变性的大鼠肝脏与未受损肝脏一样有效地再生(图16A，第一条，MCD曲线)，其证实了先前的发现，即脂肪性肝炎(而不是更普遍的单纯脂肪变性)危及肝再生[Marsman 2013；Reiniers 2013；Reddy 2012；Farrell 2002]。相反，在具有和没有单纯脂肪变性的rBDL动物中，肝再生长显著受损(图16A-C)。PHx后的一天，这些组中的肝再生受损已经显现(图16A-B)。rBDL肝脏的生长在PHx后的第2天停滞，并且不超过最初肝脏质量的60％，这比其他研究组要少(图16A和C)。
根据肝再生范例[Fausto 2006；Michalopoulos 1997]，对肝细胞因子Il-6和Tnf-α的水平进行定量以确定不同再生长率是否与PHx后的细胞因子产生相关。固有预先存在的炎症[Lionarons 2016]，但肝细胞因子水平在PHx之前已经在患有实质性肝病的所有动物中升高(图16D-E)。与基线相比，在健康大鼠中在PHx后的第1天Il-6和Tnf-α升高，而在其他研究组中未观察到这种增加(图16D-E)。PHx后细胞因子激增的缺乏可能导致在具有预先存在的实质性肝损伤的大鼠中有缺陷的肝再生长。基于再生曲线(图16A)，剩余的实验集中于改进rBDL动物中PHx后的肝再生。
在肝切除前奥贝胆酸诱导胆汁淤积性大鼠的肝生长
rBDL大鼠的再生潜能减弱(方案1)可能是来自中断的肠道BA递送和与肝内BA累积相关的毒性引起的废止的肠道Fxr信号转导的结果。通过口服给予FXR激动剂OCA来恢复肠道FXR信号转导，可以改善rBDL大鼠中的受损的肝再生。
与对照组相比，两个rBDL组中PHx之前处死的动物的肝脏总重量都较高(图17A)。然而，在校正肝脏含水量(例如，由于炎性水肿)后，仅在OCA处理的动物中观察到增加的肝脏质量(图17B)，这证实了rBDL诱导的胆汁淤积与炎症相关(Lionarons等人，Sci Rep.[科学报告]2016,6:31829)以及OCA刺激肝生长。因此，与未处理的rBDL或非胆汁淤积性动物相比，通过Ki67染色而测量的肝细胞增殖和由Ccnd1编码的细胞周期标志物CyclinD1的表达在rBDL+OCA组中更加显著(图17C-E)。Ki67染色和Ccnd1表达两者也都与干肝脏质量呈正相关(图18A-C)。由于非受损肝脏中的肝细胞处于静息状态(图17C-D)，所以这些结果表明rBDL组中的增殖是旨在修复胆汁淤积性肝损伤的肝稳态应答的一部分。然而，尽管存在增殖信号，但在不存在OCA处理的情况下在七天的rBDL期间没有发生肝增生(图17B)。
据报道OCA诱导的肝细胞增殖经由直接(肝)途径和/或间接肠道途径进行。该直接途径是由肝细胞性Fxr靶基因Foxm1介导的[Zhang 2012]，其介导细胞周期进展并且对于PHx后的有效肝再生是不可或缺的[Huang2006；Chen 2010c；Wang 2002a]。该间接途径涉及肠道Fxr连接的促有丝分裂Fgf15的产生和经由肝Fgfr4的信号转导[PadrissaAltés 2015；Kong 2014；Uriarte 2013]。应该注意的是，关于该间接途径是否也增加肝Foxm1b表达没有共识[Zhang 2012；PadrissaAltés 2015]。
两个rBDL组之间的Fxr和Foxm1的肝表达水平是相当的(图17E)。因此，该直接途径最有可能不负责由OCA诱导的增殖信号转导。相反，在接受OCA的rBDL大鼠中回肠Fgf15转录大幅上调(约20倍)，并且这与Fxr靶基因Shp的显著上调相一致(图17F)。因此，OCA处理导致肠道Fxr激活，而回肠Fxr本身轻微下调。在未经处理的rBDL动物中回肠Fgf15和Shp表达被强烈抑制(图17F)，这可能是由于rBDL后回肠Fxr配体(即BA)的递送失败[Naugler 2014]。Fgf15与肝细胞上的其同源(共)受体Fgfr4和βKlotho结合，这导致通过激活Stat3途径的增殖信号转导[PadrissaAltés 2015]。尽管Fgfr4在转录物水平下调(图17E)，但可能通过负反馈循环[Fong 2003；Wong 2002]，Stat3显著上调(图17E)，这表明通过Fgfr4的信号转导仍然有效。因此，Fgfr4转录物水平与干的肝脏质量呈负相关，而Stat3转录物水平表现出强烈的正相关(图18)。以上发现支持在用OCA处理的rBDL大鼠中肠-肝轴参与肝生长。
图17A-F显示在肝切除之前的胆汁淤积性大鼠中奥贝胆酸诱导肝细胞增殖和肝肿大。特别地，图17A-B显示对照(假手术)和7天具有OCA处理的rBDL后的肝总重量(肝重表示为体重百分比(A)或干重/300g体重的(B))；代表性Ki67染色的肝部分(C)和Ki67阳性的定量评估(D)；以及增殖相关基因和Fxr相关基因在肝(E-J)(E)或回肠(K-M)(F)中的表达水平(其中BW＝体重；FOV＝视野；OCA＝奥贝胆酸；rBDL＝可逆性胆管结扎(胆汁淤积)。*指示p<0.05，**指示p<0.01，并且***指示p<0.001，全部与对照组相比。#指示p<0.05，##指示p<0.01，并且###指示p<0.001，全部与由实线指示的实验组相比)。
部分肝切除术后的肝再生长在接受奥贝胆酸的胆汁淤积后的大鼠中停滞
在确定OCA增加胆汁淤积性肝脏的大小之后，研究了在70％PHx后OCA是否还加速肝再生。出乎意料的是，与未处理的rBDL和对照大鼠相比，在OCA处理的rBDL动物中肝再生停滞(图19A)。对这个意外发现有两种可能的解释。首先，在PHx当天，Fgfr4表达显著下调(图19D)。因此，OCA组中肝脏质量的较慢恢复可能是由于促有丝分裂Fgf15信号转导的接替减少所致。如下发现支持这一思路：在对照和未处理的rBDL动物中在PHx后的第1天，Fgfr4转录物水平升高(图19D，下面所讨论的)。此外，在未用OCA处理的rBDL大鼠中在PHx之后的Fgfr4的早期诱导之后是在PHx后的第2天的Fgfr4mRNA水平的急剧下降，这与肝再生长的停止相一致(图19A、D)。其次，在OCA组中PHX时的残余肝脏的干重已高于其他两组(图19B)。由于肝再生的速度与去除的肝脏量成正比，并且因此与残余肝脏的大小成反比[Michalopoulos 1997；Yamanaka1993]，在OCA处理的动物中在PHx后的再生长率降低可能是由切除前肝脏大小的扩大导致的。与这个前提一致，在PHx后的五天，rBDL+OCA大鼠的肝重与体重比与对照动物相似(图19B)。未处理的rBDL组中这一比率相对于对照保持较低，这指示OCA组中的较慢再生速率最终不会危害损害肝脏质量恢复的程度。
为了更仔细地研究这些发现，在PHx后的前五天监测FXR相关基因的表达和增殖参数。除了Fgfr4之外，在对照和未处理的rBDL大鼠中在PHx后的第一天，肝Fxr也显著上调(图19D)。在这些组中同时的Ccnd1的诱导(图19D)和Ki67+肝细胞的出现(图19C)支持先前的观点，即Fxr-Fgf15-Fgfr4信号转导轴是肝再生所需的(Uriarte等人，Gut.[肠]2013,62(6):899-910；Naugler PLoS One.[公共科学图书馆期刊]2014,9(5):e97426)。因此，在PHx后的第二天在未处理的rBDL动物中的再生长停滞与Fxr和Fgfr4表达的丧失平行(图19A-D)。这一发现不仅可以解释胆汁淤积性肝脏再生耗竭的问题，而且还可以强化用于靶向这种途径以增加肝再生的原理。
与对肠道Fgf15表达的强烈前PHx诱导相一致(图17)，在再生长阶段期间，OCA处理的动物中肝Fgfr4表达保持低水平。正如由相对于未处理的rBDL和对照大鼠的Fxr靶标Shp的高转录水平所指示的，OCA对肝Fxr的影响在Phx后的前两天最为显著。后者得到PHx后的第1天肝Fxr mRNA轻微降低的支持。尽管通过OCA成功诱导肝Fxr靶标，但在任何组中肝再生期间肝Foxm1表达都没有改变(图19D)。
与再生长动力学相反，在PHx后的第一天，OCA组中Ki67+肝细胞的数量最高(图19C和20)，这指示增殖增加。这一矛盾可能源于PHx之前OCA诱导的肝脏质量增加。在切除前由OCA诱导增殖信号转导可能导致在PHx后的第一天观察到的Ki67染色的峰值，而Fgfr4表达的丧失和肝脏再生终止信号(如转化生长因子β(Tgfβ)和细胞因子信号转导的抑制因子3(Socs3))的诱导(图19D)可能导致OCA组中肝脏质量延迟恢复。在OCA组中这种停滞的再生长也符合‘肝静止’范例(Moschetta等人，Gastroenterology[肠胃病学],2015,149(3):537-40；Naugler等人，Gastroenterology[肠胃病学]2015,149(3):728-40)，因为在PHx之前较大的肝脏(即，OCA处理的肝脏)(图17B)需要较少的扩大以达到固定的、预先确定的肝重与体重比。图19B证实了这一观点，该图显示了在PHx后的五天，OCA组中的肝脏大小与健康对照相当。
图19显示了在用奥贝胆酸处理的胆汁淤积后的大鼠中肝脏再生长停滞。特别地，图19A显示了健康大鼠(黑线)、胆汁淤积后的大鼠(rBDL，绿线)和用奥贝胆酸处理的rBDL大鼠(OCA，红线)的部分(70％)肝切除术(PHx)后的肝再生长。图19B显示了PHx后立即(左)和5天(右)时残余肝脏的干重。图19C显示了PHx后第1天(左)和第5天(右)增殖的肝细胞的数量。图19D描绘了各种增殖相关基因和Fxr相关基因的肝表达(BW＝体重；rBDL＝可逆性胆管结扎(胆汁淤积)；OCA＝奥贝胆酸。*指示与对照组相比p<0.05。#表示与由实线所指示的实验组相比p<0.05。$指示在实验组内与基线(第0天)相比p<0.05)。
OCA通过调节胆汁酸转运加重阻塞性胆汁淤积期间的胆道损伤
已经证明，Fxr激动剂[Liu 2003]或Fxr靶标FGF19/Fgf15[Luo 2014；Modica2012]减弱胆汁淤积性肝损伤。还发现，Fxr的遗传缺失实际上通过改变BA解毒和排泄来减少BDL诱导的肝损伤[Wagner 2003a；Stedman2006]。为了进一步检查OCA处理的效果，在PHx之前和PHx之后的前五天评估肝损伤的血清和组织学标志物。伴随监测与BA稳态有关的各种基因的表达。
胆汁淤积
在PHx之前，在接受OCA的rBDL大鼠中丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)水平显著高于其他两组，这指示加重的肝胆损伤(图21A-C)。血浆γ谷氨酰转移酶浓度遵循与ALP相同的动力学。组织学分析揭示在PHx时rBDL组中相似程度的肝细胞坏死和纤维化改变(图21D)。由于组织学变化是胆汁淤积性损伤的滞后指标，所以血浆和组织学损伤曲线之间明显的断开可能与组合型OCA处理和BDL的相对短的持续时间有关。
为了探索OCA对基线处肝脏生物化学的影响，评估了与BA代谢和运输有关的各种Fxr靶基因的表达。通过上调基底外侧BA输出物Mrp3(图21F)来使RBDL大鼠适应BA超载，这类似于在胆汁淤积性小鼠和患者中所见到的应答[Schaap 2009；Boyer 2006]。OCA处理导致Mrp3的诱导比在未处理的rBDL动物中更强(图21F)，并同时上调基底外侧BA输出物Ostβ和Mrp4(图21F)。另外，编码小管BA输出物的原型Fxr靶标Bsep几乎上调8倍(图21F)。由于OCA诱导胆汁淤积[Roda 2014；Fiorucci 2005a]，所以基线处的肝脏损伤曲线很可能是通过将BA经有Bsep强制泵入阻塞的胆道系统引起的。这可能会由于胆道压力提高而导致胆道梗塞[Wagner 2003a；Fickert 2002]。在OCA处理七天后，从肝外胆管回收的胆汁的显著增加和胆管BA输出的升高也支持了这一观点(图21E)。已观察到利胆药对BDL诱导的肝损伤的相当副作用[Weerachayaphorn 2014]。Bsep在介导这种作用中的关键作用得到了以前的发现的支持，即Bsep的药理学抑制降低了小鼠的胆汁淤积性损伤[Chen 2015]。后者也由以下证实：在PHx之前所见到的Bsep表达、肝外胆汁体积和胆道损伤标志物(图18)之间的正相关性。尽管存在由OCA引起的肝BA负荷减少(图21E)，但在基线处OCA处理的动物中肝细胞损伤也增加了(图21A)。这可能是继发于小管反应和相关的嗜中性粒细胞流入(图20)，或者可能与BA池的组成的轻微变化有关，有利于更高毒性的鹅脱氧胆酸盐(图22)。
值得注意的是，基底外侧BA输入物Ntcp在OCA组中轻度上调(图22E)，而Ntcp在胆汁淤积期间通常受Fxr抑制以限制肝细胞BA负荷[Zollner 2005；Lionarons 2016]。先前在用Fxr激动剂GW4064处理的患有肝内(但非肝外)胆汁淤积的小鼠中观察到类似的Ntcp抑制的丧失[Liu 2003]。还预期，肝Cyp7a1会被OCA抑制[Liu 2003]，无论是通过Shp，通过Fgf15-Fgfr4，还是两者的组合[Inagaki 2005；Modica 2012；Naugler 2015；Li 2014a]。尽管存在肝细胞Fxr激活(上文所讨论的)和回肠Fgf15表达的迹象(图22F)，但OCA不改变肝细胞Shp(图21D)或Cyp7a1mRNA水平(图22F)。这两个发现都重申，胆汁淤积期间BA合成(的调节)不受FXR和SHP独立地控制，但涉及其他BA受体和转录(共)激活剂，例如像，孕烷X受体和肝核因子[Geier 2005；Fiorucci 2014]。在胆汁淤积性条件下Ntcp[Jung 2004；Geier2007]和Cyp7a1[Wagner 2003a；Schaap2009]的调节中的种间差异也可以解释这些观察结果。然而，由rBDL引起的肝BA含量的上升被OCA处理有效地抵消了(图22E)，这表明在OCA处理期间由Cyp7a1引起的持续BA产生和有Ntcp引起的BA摄取可能几乎没有危害性后果。
再生
与常规胆汁流量的恢复一致，肝胆损伤标志物在rBDL组中在PHx后的48h内正常化，尽管在OCA处理的动物中恢复更缓慢(图22A-C)。尽管下降了～4倍，但再生期间OCA组中的ALP水平保持高于其他研究组(图22B)。在OCA处理的动物中，胆红素清除率也略微滞后(图22C)，鉴于ALT低值这可能反映了由MRP2引起的小管胆红素输出受损和由MRP3引起的代偿性基底外侧输出(图22F)[Keppler 2014]，而不是受损的肝功能。在组织学水平上，在PHx之前在rBDL组中所见到的适当程度的肝细胞坏死在再生阶段期间逐渐消退(图5F)，这与血清损伤标志物的下降趋势一致。在PHx后的第5天，在所有对照动物中都观察到具有非导管病因的门静脉周纤维化，这表明这是正常再生应答的一部分。在两个rBDL组中都见到类似程度的门静脉周至中隔纤维化。这指示在PHx之前由OCA引起的胆道损伤标志物的增加并不加剧肝切除术后的肝损伤。因此，在再生阶段期间在任何研究组中都没有发现死亡。
如图21中所示，在对照大鼠(对照系)以及未处理(rBDL系)或接受奥贝胆酸(OCA，rBDL-OCA系)的(后)胆汁淤积性大鼠中，在部分肝切除术(PHx)之前(t＝0)和之后获得的血浆中的ALT(A)、ALP(B)和胆红素水平(C)。肝部分的组织学评分显示为平均评分±范围(D)。评分系统和代表性图像显示在表1和图20中。在PHx之前，血浆、肝组织和胆汁BA输出的总胆汁酸(BA)水平(E)。对照组和rBDL组的BA总数据也发表在早期报告中[Lionarons 2016]。与肝细胞BA稳态有关的基因的表达(F)。在(F)中编码的组颜色类似于(A-E)。(缩写：ALP＝碱性磷酸酶；ALT＝丙氨酸转氨酶；rBDL＝可逆性胆管结扎(胆汁淤积)；OCA＝奥贝胆酸。*指示与对照组相比p<0.05，并且#表示与实线所指示的实验组相比p<0.05)。
讨论
肝再生受损对经受大部分肝脏手术的实质性肝病患者仍有严重风险。这里提供的数据指示，Fxr激动剂OCA可用于改进胆汁淤积性患者的手术管理。最重要的是，OCA在PHx之前引发了胆汁淤积性大鼠肝脏的生长。在饲喂含胆酸的饮食的健康小鼠中观察到肝脏大小的类似增加，但在Fxr敲除的动物中未见到[Huang 2006]。这指示Fxr(激动剂)可以在不存在确定的促有丝分裂触发物(如PHx)的情况下刺激肝生长。虽然根本机制尚未完全了解，但BA似乎能够改变肝脏大小。最近表明，无限制的BA合成以及循环BA的随之上升使人源化小鼠肝脏的大小增加了约3倍[Naugler 2015]。然而，扩增的BA池本身是否足以引发肝细胞增殖是可疑的，因为BDL也增加全身BA水平但不诱导肝生长，可能是由于在BDL条件下缺乏肠道Fxr刺激。在这方面，对肝脏含水量的校正似乎很重要，因为在大鼠以及小鼠中在BDL后的总肝脏质量增加[Modica 2012]，这指示湿肝脏质量的增加可能代表炎性假象(例如水肿)。
由于Fxr在肠-肝轴的两端都表达，因此辨别OCA对肝生长的影响是否起源于肝脏和/或小肠中是不确定的。我们的转录分析指向后者，因为肠道Fxr靶标(如Fgf15)的强烈诱导与增殖性肝Fgfr4-Stat3途径的激活是耦合的[Kong 2014；PadrissaAltés 2015]。OCA对肝Fxr靶标(如Ntcp和Cyp7a1)表达的作用较不明确。肠道Fxr在驱动肝生长中的明显重要性得到了研究的支持，这些研究说明Fgf15对PHx后的肝再生是不可或缺的[Uriarte 2013；PadrissaAltés 2015]，而肝细胞Fxr的选择性遗传缺失只能稍微延迟再生[Borude 2012]。鉴于rBDL期间由OCA引起的胆道损伤的增加(以下所讨论的)，还要求进一步定义了肠道和肝Fxr对肝再生的相对贡献。最近开发的FGF19类似物M70可用于规避阻塞性胆汁淤积期间肝Fxr刺激这一缺点。虽然工程化FGF19对肝生长的预期效果仍有待实验证实，但M70可减少Mdr2-/-和BDL小鼠中的肝脏损伤[Zhou 2015；Luo2014]，并抑制健康志愿者中的BA合成[Luo2014]。
考虑到在OCA组中PHx后的肝脏质量恢复受到切除前肝肿大的大幅影响，目前的实验不能确定OCA是否也能够在PHx后加速肝再生。肝脏大小的差异和Fgfr4的下调削弱了增殖应答[Yamanaka 1993]，并且甚至可能将再生模式指向肥大而不是增殖[Miyaoka 2012]，从而阻止了与其他组中的再生动力学的准确和可靠的比较。鉴于可译性，手术前增加肝脏大小的能力比加速小肝残余物的生长更吸引人。
在该模型中同时进行PHx和胆汁引流，而PHC患者通常在手术前数周进行胆汁引流，以使肝脏从胆汁淤积打击中恢复。在用OCA处理的胆汁淤积性动物中见到的胆道损伤的增加，其也已经与其他胆汁分泌诱导化合物(如奥替普拉[Weerachayaphorn 2014]和熊去氧胆酸[Fickert 2002])一起观察到，可能在术前胆汁引流的环境中几乎不造成伤害。这一前提得到了以下证实：再生阶段期间损伤标志物的快速正常化，以及在胆汁流不完全阻塞，如原发性胆汁性肝硬化的情况下，OCA在治疗胆汁淤积症方面的治疗性成功[Hirschfield2014]。考虑到BA输出物的强烈诱导，可以想到，OCA甚至可以在胆汁引流后加快BA清除率。如果是这样，OCA可以通过缩小引流和手术之间的间隔来减少与引流相关的并发症，如胆管炎[Yokoyama 2014]。Fxr激动剂(如熊去氧胆酸)也增加胆汁固有免疫功能的这一观点可以进一步抑制引流相关的并发症[Daldebert 2009]。在动物模型中临时分离胆管减压术和肝切除术还将限制参数如炎症、水肿和营养状况对切除后肝脏和体重的影响，这在目前的工作中不能不重视。
OCA仅用于治疗患有良性障碍，如非酒精性脂肪性肝炎的患者[NeuschwanderTetri 2014]。然而，受益于OCA对肝生长的影响的绝大多数患者都患有肝胆恶性肿瘤。所有的增殖性干预都携带诱导肿瘤进展作为副作用的风险，如前面对PVE所证明的[Hoekstra 2012b；Simoneau 2015；Kokudo 2001]。OCA对恶性肿瘤的潜在影响可能因癌症类型而异。在一方面，FXR靶标Fgf15似乎能够加速FGFR4阳性肝细胞癌的生长[Ho 2009]。在另一方面，FXR抑制PHC[Dai 2011]和结肠直肠癌[Modica 2008]的生长。初步安全性研究指示，2年高剂量治疗(25mg/kg)不会导致小鼠恶性转化(Adorini L.，Intercept制药公司(Intercept Pharmaceuticals))。

Claims (19)

1.一种在患有肝功能降低的受试者中加速、促进或增加肝再生的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的具有式(A)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是氢或C1-C6烷基；
R2、R3、R5、和R6各自独立地是氢或羟基；
R4是CO2H、C(O)NH(CH2)mSO3H、C(O)NH(CH2)nCO2H、或OSO3H；并且
m和n各自独立地是1、2、或3。
2.如权利要求1所述的方法，其中R4是CO2H或OSO3H。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中R1是甲基、乙基或丙基，并且R5和R6各自是氢。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中R2是氢，并且R3是羟基。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该化合物是
或其药学上可接受的盐。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该化合物是
或其药学上可接受的盐。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该化合物是一种药学上可接受的盐。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该盐是钠盐或三乙基铵盐。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该受试者具有移植的肝脏。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该受试者具有切除的肝脏。
11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该肝功能降低是外科手术、疾病、病理状态或损伤的结果。
12.如权利要求11所述的方法，其中该肝功能降低是外科手术的结果。
13.如权利要求12所述的方法，其中该外科手术是肝动脉栓塞或门静脉操作。
14.如权利要求12所述的方法，其中该外科手术是部分肝切除术。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中该化合物在该外科手术之前或之后或组合给予。
16.如权利要求11所述的方法，其中肝功能降低是选自以下的疾病或病理状态的结果：脑腱黄瘤病(CTX)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、药物引起的胆汁淤积、妊娠肝内胆汁淤积症、肠外营养相关的胆汁淤积(PNAC)、细菌过度生长或败血症相关的胆汁淤积、自身免疫性肝炎、慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、肝移植相关的移植物抗宿主病、先天性肝纤维化、胆总管结石病、肉芽肿性肝病、斯耶格伦氏综合征(Sjogren's syndrome)、结节病、威尔逊氏病、高歇氏病(Gaucher's disease)、血色素沉积症、和α1-抗胰蛋白酶缺乏症。
17.如权利要求11所述的方法，其中肝功能降低是选自以下疾病或病症的结果：肝细胞癌、肝内恶性肿瘤和肝外恶性肿瘤。
18.如权利要求11所述的方法，其中该肝功能降低是选自以下损伤的结果：药物诱导的损伤或物理性损伤。
19.一种在患有肝功能降低的受试者中增加肝脏质量的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的具有式(A)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是氢或C1-C6烷基；
R2、R3、R5、和R6各自独立地是氢或羟基；
R4是CO2H、C(O)NH(CH2)mSO3H、C(O)NH(CH2)nCO2H、或OSO3H；并且
m和n各自独立地是1、2、或3。
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