KR20180054770A - 간 재생 촉진 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 (A)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 사용하는 것에 의해 대상에서 간 재생을 가속화, 촉진 또는 증가시키거나, 간 질량을 증가시키는 방법에 관한 것이다:
[화학식 A]

여기에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, m, 및 n은 본원에서 기술되는 바와 같다.

Description

간 재생 촉진 방법

간 부전은 약물-유도 간독성, 바이러스 감염, 맥관 손상, 자가면역 질환, 및 외상을 포함하는 많은 만성 및 급성 임상적 병태에서 일어난다. 또한, 대사의 유전적 오류가 있는 환자는 간 부전이 발생할 위험이 있을 수 있다. 이들 임상적 병태의 결과로서 일어나는 간 부전의 증상은, 예를 들어, 급성 간염, 만성 간염, 또는 간경화를 포함한다.

만성 간 질환은 시간 경과에 따른 간 조직의 점진적 파괴를 특징으로 한다. 간경화 및 섬유증을 포함하는 몇 가지 간 질환이 이 카테고리에 해당하는데, 후자는 종종 간경화의 전조이다. 만성 C형 간염 바이러스 감염 및 비-알코올성 지방간염이 만성 간 질환의 두 가지 주요 원인이다. 일단 간에서 간경화 또는 섬유증이 일어나면, 일반적으로 비가역적인 것으로 고려된다. 현재 통상적인 처치는 간에서 간경화의 임의의 추가적 진행을 방지하고 간경화로부터 일어날 수 있는 합병증을 완화하는 것에 초점을 두고 있다. 좀 더 진행된 단계의 간경화에서, 유일하게 알려진 처치는 간 이식이다.

급성 간 질환에서, 간은 손상된 후 재생될 수 있다. 질환이 새로운 세포를 재생시킬 수 있는 간의 용량을 넘어서 진행될 경우, 신체의 전체 대사가 심각하게 영향을 받는다. 간 기능의 손실은 필수적인 신체 기능(즉, 에너지 공급, 산-염기 균형 및 체온 조절)의 파괴와 함께 대사 불안정성을 야기할 수 있다. 대형의 간 손상 이후, 간 조직은 그 재생 및 대사 기능을 잃고, 간 이식이 통상적으로 사용되는 치료적 전략이다.

그러나, 간 이식의 임상적 적용은 한 번에 안전하게 이식될 수 있는 인간 간세포, 간 조직 및 간 세포 수의 이용 가능성에 의해 제한된다.

주요 간 절제술 이후 수술-전 간 질량을 회복하는 환자의 능력은 잘 알려져 있다. 다양한 매개체가 시험관내 및 생체내 둘 다에서 간 미토겐으로 알려져 있지만, 간 재생에 관여하는 정확한 기전은 정의되지 않은 상태이다(Michalopoulos, et al. Science, 1997, 276, 60-66). 간 재생을 촉진하기 위한 노력에서의 중요한 문제는 많은 치료제가 생체내 제한된 효과를 보유한다는 것이다. 적절한 기능적 간 질량의 재생을 촉진하기 위한 약리학적 처치의 이용 가능성은 이에 따라 간 부전으로 인한 많은 사망을 방지할 수 있을 중요한 진전이 될 것이다.

임상적 설정에서 간세포 증식을 촉진 또는 증가시키는 능력은 몇 가지 중요한 적용을 가질 것이다. 이는 건강한 간 조직의 양을 증가시키고 부적절한 잔존 기능성 간 질량으로 인해 수술-후 시기에 간 부전으로 인한 환자의 사망을 방지함으로써 이전에 절제 불가능한 간 악성종양이 절제되도록 허용할 것이다. 더욱이, 간 부전에 앞서 적절한 간 기능을 회복할 속도로 자연적으로 간이 재생되도록 유도될 수 있다면 독성, 대사성, 또는 바이러스성 원인으로 인한 간 부전으로 고통받는 환자가 사망 또는 간 이식을 피할 수 있다.

진행중인 연구 노력에도 불구하고, 간 재생 및 보수를 촉진하는 개선된 방법에 대한 요구가 남아있다. 다양한 간독성 물질, 질환 또는 병리학적 상태에 의해 야기되는 간 손상을 치료하기 위해 간세포 증식을 촉진하는 치료적 전략의 개발이 요구된다. 본 발명은 이러한 요구를 다루고 있다.

본 발명의 목적은 간 재생을 가속화, 촉진 또는 증가시키고 간 질량을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 감소된 간 기능을 갖는 대상에서 간 재생을 가속화, 촉진 또는 증가시키는 방법에 관한 것이다:

[화학식 A]

여기에서:

R₁은 수소 또는 C₁-C₆ 알킬이고;

R₂, R₃, R₅, 및 R₆은 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록실이고;

R₄는 CO₂H, C(O)NH(CH₂)_mSO₃H, C(O)NH(CH₂)_nCO₂H, 또는 OSO₃H이고; 그리고

m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 또는 3이다.

본 발명은 추가로, 감소된 간 기능을 갖는 대상에서 간 재생을 가속화, 촉진 또는 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서의, 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도에 관한 것으로, 여기에서 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, m, 및 n은 본원에서 정의되는 바와 같다.

본 발명은 또한, 감소된 간 기능을 갖는 대상에서 간 재생을 가속화, 촉진 또는 증가시키기 위한, 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것으로, 여기에서 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, m, 및 n은 본원에서 정의되는 바와 같다.

다른 양태에서, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 감소된 간 기능을 갖는 대상에서 간 질량을 증가시키는 방법에 관한 것이다:

[화학식 A]

여기에서:

R₁은 수소 또는 C₁-C₆ 알킬이고;

R₂, R₃, R₅, 및 R₆은 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록실이고;

R₄는 CO₂H, C(O)NH(CH₂)_mSO₃H, C(O)NH(CH₂)_nCO₂H, 또는 OSO₃H이고; 그리고

m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 또는 3이다.

본 발명은 추가로, 감소된 간 기능을 갖는 대상에서 간 질량을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서의, 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도에 관한 것으로, 여기에서 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, m, 및 n은 본원에서 정의되는 바와 같다.

본 발명은 또한, 감소된 간 기능을 갖는 대상에서 간 질량을 증가시키기 위한, 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것으로, 여기에서 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, m, 및 n은 본원에서 정의되는 바와 같다.

본 발명은 추가로, 감소된 간 기능을 갖는 대상에서 간 재생을 가속화, 촉진 또는 증가시키거나, 간 질량을 증가시키기 위한, 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 여기에서 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, m, 및 n은 본원에서 정의되는 바와 같다.

본 발명은 추가로, 감소된 간 기능을 갖는 대상에서 간 재생을 가속화, 촉진 또는 증가시키거나, 간 질량을 증가시키는 방법에 사용하기 위한, 화학식 (A)의 화합물을 포함하는 키트에 관한 것으로, 여기에서 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, m, 및 n은 본원에서 정의되는 바와 같다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에서 기술되는 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다 하더라도, 적절한 방법 및 재료가 아래 기술된다. 이 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 구체적인 설명으로부터 명백할 것이다.

도 1은 토끼(이하, "PVE 연구 토끼"로 지칭됨)에서 컴퓨터 단층촬영(CT) 및 문맥조영술 측정, 그리고 간문맥 색전술을 위한 연구 개요 또는 실험적 접근법 및 계획을 보여주는 차트이다.
도 2는 시간(일)에 대한 PVE 연구 토끼의 체중(그램)을 나타내는 그래프이다.
도 3은 시간(일)에 대한 PVE 연구 토끼(n=군 당 11)의 비-색전 간엽의 꼬리쪽 간 용량(CLV, %)에서의 증가를 나타내는 그래프이다.
도 4는 간 중량(그램)에 대한 컴퓨터 단층촬영 용량(CT, mL)을 나타내는 그래프이다.
도 5는 시간(일)에 대한 PVE 연구 토끼(n=군 당 11)의 색전 간엽의 머리쪽 간엽 용량(CrLV, %) 수준에서의 저하를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 PVE 7일 후 PVE 연구 토끼의 비대 및 위축 간 절편에서 증식 세포 핵 항원(PCNA)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 6b는 PVE 7일 후 PVE 연구 토끼의 비대 및 위축 간 절편에서 간세포 성장 인자(HGF)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 6c는 PVE 7일 후 PVE 연구 토끼의 비대 및 위축 간 절편에서 포크헤드 박스 m1b(Foxm1b)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 6d는 PVE 7일 후 PVE 연구 토끼의 비대 및 위축 간 절편에서 세포 분열 주기 25B(Cdc25b)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 6e는 PVE 7일 후 PVE 연구 토끼의 비대 및 위축 간 절편에서 콜레스테롤 7 α-하이드록실라아제(Cyp7a1)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 6f는 PVE 연구 토끼의 비대 및 위축 간 절편에서 스테롤 12 α-하이드록실라아제(Cyp8b1)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 6g는 PVE 연구 토끼의 비대 및 위축 간 절편에서 유기 용질 전달체 베타(OSTB)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 6h는 PVE 연구 토끼의 비대 및 위축 간 절편에서 소형 헤테로다이머 파트너(SHP)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 7a는 PVE 연구 토끼의 회장에서 파네소이드 X 수용체(FXR)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 7b는 PVE 연구 토끼의 회장에서 소형 헤테로다이머 파트너(SHP)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 7c는 PVE 연구 토끼의 회장에서 증식 세포 핵 항원(PCNA)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 7d는 PVE 연구 토끼의 회장에서 유기 용질 전달체 베타(OSTB)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 7e는 PVE 연구 토끼의 회장에서 초기 성장 반응 단백질 1(EGR1)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 7f는 PVE 연구 토끼의 회장에서 포크헤드 박스 m1b(Foxm1b)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 7g는 PVE 연구 토끼의 회장에서 세포 분열 주기 25b(cdc25b)의 상대적 발현을 나타내는 막대그래프이다.
도 8은 시간(시간 및 일)에 대한 PVE 연구 토끼(n=군 당 5)에서의 혈청 담즙산염의 총 농도(㎛ol/L)를 나타내는 그래프이다.
도 9는 희생시 꼬리쪽 간엽 중량과 연관되는 CT 용량 측정에 의해 결정된 CLV의 그래프이다.
도 10은 모든 순차적 스캔에서 한 마리 토끼의 간담도 신티그래피 이미지를 보여준다.
도 11a는 전처치 단계에서 체중 kg 당 TLV를 보여주는 막대그래프이다.
도 11b는 PVE에 따른 CLV에서의 증가를 보여주는 그래프이다.
도 11c는 PVE에 따른 CrLV에서의 저하를 보여주는 그래프이다.
도 11d는 간담도 신티그래피에 의해 측정된 ^99mTc-메브로페닌의 총 간 섭취의 막대그래프이다.
도 11e는 제-7일에 기준선 측정으로부터 ^99mTc-메브로페닌 섭취에 대한 꼬리쪽 간엽의 할당에서의 증가를 보여주는 막대그래프이다.
도 11f는 100× 배율에서 Ki67 염색 간 절편의 이미지 및 Ki67-양성 간세포의 정량을 보여준다.
도 11g는 제-7일에서의 값에 대한 체중의 변화 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 12a는 PVE 전 및 후의 혈장 ALT(알라닌 트랜스아미나아제) 수준을 보여준다.
도 12b는 PVE 전 및 후의 혈장 AST(아스파테이트 트랜스아미나아제) 수준을 보여준다.
도 12c는 PVE 전 및 후의 혈장 γGT(감마-글루타밀 트랜스퍼라아제) 수준을 보여준다.
도 12d는 PVE 전 및 후의 혈장 ALP(알칼리 포스파타아제) 수준을 보여준다.
도 12e는 꼬리쪽 간엽의 H&E-염색 절편의 정량적 점수를 보여준다.
도 13 a 및 b는 회장 및 간 유전자 발현에 대한 오베티콜산의 효과를 보여준다.
도 14는 순환 담즙산염의 수준을 보여준다.
도 15는 담즙산염 항상성/증식 관련 전사 수준을 보여준다.
도 16a 내지 16e는 부분적 간절제 이후 재생에 대한 실질 간 질환의 영향을 보여준다.
도 17a는 대조(모의 수술) 및 rBDL 7일 후 또는 OCA 처치 추가의 총 간 중량(체중의 백분율로서 표시됨)을 보여준다.
도 17b는 대조(모의 수술) 및 rBDL 7일 후 또는 OCA 처치 추가의 총 간 중량(체중 300 g 당 건조 중량으로서 표시됨)을 보여준다.
도 17c는 대표적인 Ki67-염색 간 절편을 보여준다.
도 17d는 Ki67 양성의 정량적 평가를 보여준다.
도 17e는 간에서 증식- 및 FXR-관련 유전자의 발현 수준을 보여준다.
도 17f는 회장에서 증식- 및 FXR-관련 유전자의 발현 수준을 보여준다.
도 18은 간 성장 및 간담도 손상 파라미터의 상관 분석을 보여준다.
도 19a는 건강한 래트(위 선), 담즙정체-후 래트(rBDL, 중간 선), 및 오베티콜산으로 처치된 rBDL 래트(OCA, 아래 선)의 부분적(70%) 간절제(PHx) 이후 간 재성장을 보여준다.
도 19b는 PHx 직후(좌측) 및 5일 후(우측) 잔존 간의 건조 중량을 보여준다.
도 19c는 PHx 1일 후(좌측) 및 5일 후(우측) 증식 간세포의 수를 보여준다.
도 19d는 다양한 증식 및 FXR-관련 유전자의 간 발현을 보여준다.
도 20은 헤마톡실린 및 에오신-(H&E, 좌측), 피크로시리우스 레드-(PSR, 우측 상단) 및 Ki67-염색 간 슬라이드의 대표적 이미지를 보여준다.
도 21은 Bsep-매개 담즙산을 통한 담즙정체성 손상에 대한 OCA의 효과를 보여준다.
도 22는 래트에서 혈장, 간, 및 담즙의 담즙산 풀 조성에 대한 폐색성 담즙정체 및 오베티콜산 처치의 영향을 보여준다.

정의

본 명세서 및 청구범위에 사용되는 특정 용어를 여기에 모았다.

본원에서 사용되는 "간 질환"이라는 용어는 간 장애를 의미한다. 일반적으로, 간 질환은 신체의 간의 형태학적 및/또는 기능적 온전성의 교란을 초래하는 임의의 병태에 의해 야기될 수 있다. 간 질환의 병인 및 치료는, 예를 들어, Oxford Textbook of Medicine(Warrell, Oxford Textbook of Medicine, David A. Warrell, Timothy M. Cox, John D. Firth, Oxford University Press, USA; Fifth edition (July 22, 2010))에 기술되어 있다.

본원에서 사용되는 "만성 간 질환"이라는 용어는 섬유증 및 간경화로 이어지는 간 실질의 점진적 파괴 및 재생을 포함하는 간의 질환 과정을 의미한다. 만성 간 질환 원인은 신체의 간을 포함하여 조직 세포의 점진적 분해 및 재생을 야기하는 임의의 병태일 수 있다. 이 과정은 보통 섬유증 또는 간경화를 초래하고 만성 간 부전의 경우 잠재적으로 치명적일 수 있다. 만성 간 질환의 근원의 분류는 다음의 5개 집단으로 나뉜다: (i) B형 및 C형 간염 또는 사이토메갈로바이러스 또는 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스와 같은 바이러스성 원인, (ii) 혈색소증, 비-알코올성 지방간 질환 또는 윌슨병(Wilson's disease)과 같은 대사성 원인, (iii) 자가면역성 만성 간염, 원발성 담관성 간경화 또는 원발성 경화성 담관염과 같은 자가면역 반응 원인, (iv) 알코올성 간 질환 또는 니트로푸란토인, 아미오다론, 또는 메토트렉세이트와 같은 독소-관련 원인, 그리고 (v) 우심부전과 같은 다른 여러 가지 원인. 만성 간 질환의 주요 원인은 알코올의 과용으로, 간경화 및 간염으로 이어진다. 따라서, 최고 위험군은 알코올 남용 경향이 있는 사람이다. 만성 간 질환과 관련되는 증상은 간 내에서 변성의 수준에 의존한다.

본원에서 사용되는 "급성 간 질환"이라는 용어는 황달과 같은 간 질환의 최초 징후 이후 급속히 중증 합병증의 출현을 의미하고, 간이 지속적 손상을 갖는 것을 나타낸다. 합병증은, 예를 들어 간성 뇌병증 및, 예를 들어 혈액에서 프로트롬빈 시간 및 혈청 알부민의 수준으로 측정되는, 손상된 단백질 합성이다. 1993 분류는 초급성을 1주 이내로, 급성을 8 내지 28일로, 그리고 아급성을 4 내지 12주로서 정의한다(Williams, et al. Lancet, 1993, 342, 273). 이것은 질환 진화의 속도가 예후에 강하게 영향을 미친다는 사실을 반영한다. 근본적인 병인은 결과의 또 다른 중대한 결정 요인이다(Grady, et al. Postgrad Med J, 2005, 81, 148). "급성 간 부전"은 간이 그의 기능 능력을 신속하게 잃을 때 일어난다. 급성 간 부전은 간에 대한 치명적인 공격 이후 신속하게 진전되는 복잡한 다중-시스템의 병으로 뇌병증의 발생으로 이어진다. 더욱 흔히, 간 부전은 수년에 걸쳐 서서히 발생하는 반면, 급성 간 부전에서 간 부전은 수일의 문제로 발생한다.

본원에서 사용되는 "이식된 간"은 대상으로 이식된 간을 의미하고, 또한 공여자의 간의 일부로 구성되는 이식편에 상응하는 소위 "부분 간 이식"도 포함한다. 간 이식은 또한 간문맥으로의 간세포(유전적으로 변형되거나 증식 또는 분화하도록 자극된)의 주입을 의미한다. 간문맥 색전술(PVE)은 주요 간 절제 계획이 있는 환자에서 향후 잔존 간 용량을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

간 이식의 맥락에서 사용되는 "간 재생"이라는 용어는 손실된 간 조직이 간 이식 또는 부분 간 이식의 간세포 성장에 의해 대체되는 형태학적 변화를 의미하지만, 또한 간 기능의 개선, 회복, 또는 정상화와 같은 생화학적 변화도 포함한다. 본 발명의 조성물에 의해 처치받을 특정 대상은, 예를 들어 간염, 알코올, 바이러스, 약물 또는 원인 불명의 간 경화, 또는 간암과 같은 간 질환에 의해 야기되는 간 부전을 치료하기 위해 간이 전체적으로 절제된 후 부분 간 이식을 받은 환자를 포함한다.

본원에서 사용되는 "간 재생을 가속화시키는 것", "간 재생을 촉진시키는 것" 그리고 "간 재생을 증가시키는 것"이라는 구절은, 비처치 대조와 비교하여, 최종 질량 및 그 질량에 도달하는 속도에서의 증가로, 최종 간 질량에 도달하기 위해 요구되는 기간이 더 짧은 것 또는 증가된 최종 간 질량(예를 들어, 컴퓨터 단층촬영에 의해 측정된), 또는 둘 다에 의해 입증된다.

화학식 (A)의 화합물의 "치료적으로 유효한 양"은 화합물 또는 화합물들의 양(분량 또는 농도)이다. 대상으로 투여되는 화합물의 양은 간 손상의 특정 단계, 투여의 방식, 만약 있다면, 공동-투여되는 화합물, 및 일반적인 건강, 다른 질환, 연령, 성별, 유전자형, 체중 및 약물에 대한 내약성과 같은 대상의 특징에 의존한다. 당업자는 이들 및 다른 인자에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

본원에서 사용되는 "대상"은 인간 또는 동물(동물의 경우, 더욱 전형적으로는 포유류)을 말한다. 일 양태에서, 대상은 인간이다.

본원에서 사용되는 "C₁-C₆ 알킬"이라는 용어는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 모이어티를 의미한다. "C₁-C₄ 알킬"은 1, 2, 3, 또는 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 모이어티를 의미한다. C₁-C₆ 알킬 모이어티의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 및 t-부틸을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 "대사물질"이라는 용어는 화학식 (A)의 화합물의 글루쿠로니드화 및 황산화 유도체를 의미하는데, 여기에서는 하나 이상의 글루쿠론산 또는 황산 모이어티가 본 발명의 화합물에 연결된다. 글루쿠론산 모이어티는 상기 화합물의 하이드록실기(예를 들어, 3-하이드록실, 7-하이드록실, 11-하이드록실, 및/또는 12-하이드록실)와의 글리코시드 결합을 통해 상기 화합물에 연결될 수 있다. 본 화합물의 황산화 유도체는 하이드록실기(예를 들어, 3-하이드록실, 7-하이드록실, 11-하이드록실, 및/또는 12-하이드록실)의 황산화를 통해 형성될 수 있다. 대사물질의 예는, 본원에서 기술되는 화합물의 3-O-글루쿠로니드, 7-O-글루쿠로니드, 11-O-글루쿠로니드, 12-O-글루쿠로니드, 3-O-7-O-디글루쿠로니드, 3-O-11-O-디글루쿠로니드, 3-O-12-O-디글루쿠로니드, 7-O-12-O-디글루쿠로니드, 및 3-O-7-O-12-O-트리글루쿠로니드, 그리고 본원에서 기술되는 화합물의 3-설페이트, 7-설페이트, 11-설페이트, 12-설페이트, 3,7-비설페이트, 3,11-비설페이트, 3,12-비설페이트, 7,12-비설페이트, 3,7,11-트리설페이트, 및 3,7,12-트리설페이트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 모체 화합물이 이의 산 또는 염기 염을 형성함으로써 변형된 본 발명의 화합물의 유도체를 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 금속 또는 유기산 염; 카복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염; 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어 비-독성 무기 또는 유기 산으로부터 형성되는 모체 화합물의 통상적인 비-독성 염 또는 4급 암모늄염을 포함한다. 예를 들어, 이러한 통상적인 비-독성 염은 2-아세톡시벤조산, 2-하이드록시에탄 설폰산, 아세트산, 아스코르브산, 벤젠 설폰산, 벤조산, 중탄산, 카본산, 시트르산, 에데트산, 에탄 디설폰산, 푸마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 글리콜릴아르사닐산, 헥실레조르신산, 하이드라밤산, 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산, 하이드록시말레산, 하이드록시나프토산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 라우릴 설폰산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄 설폰산, 납실산, 질산, 옥살산, 파모산, 판토텐산, 페닐아세트산, 인산, 폴리갈락투론산, 프로피온산, 살리실산, 스테아르산, 염기성아세트산, 숙신산, 설팜산, 설파닐산, 설푸르산, 탄닌산, 타르타르산, 및 톨루엔 설폰산으로부터 선택되는 무기 및 유기 산으로부터 유도되는 것들을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

"약제학적으로 허용 가능한 담체"라는 구절은 해당 분야에 인식되어 있고, 예를 들어, 신체의 한 기관, 또는 부분으로부터 신체의 다른 기관, 또는 부분으로 임의의 대상 조성물을 전달 또는 수송하는 데 관련되는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약제학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 포함한다. 각각의 담체는 대상 조성물의 다른 성분과 혼화 가능하고 환자에 유해하지 않다는 의미에서 "허용 가능"하다. 특정 구현예에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 비-발열성이다. 약제학적으로 허용 가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예를 들어 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스; (2) 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스, 및 이의 유도체, 예를 들어 카복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예를 들어 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예를 들어 낙화생유, 면실유, 해바라기씨유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜류, 예를 들어 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올류, 예를 들어 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르류, 예를 들어 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 무-발열물질 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸알코올; (20) 인산염 완충액; 및 (21) 약제학적 제형에 이용되는 다른 비-독성 혼화 가능 물질.

본원에서 사용되는 "약제학적 조성물"은 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 제형을 의미한다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 벌크로, 또는 단위 제형으로 존재한다. 단위 제형은, 예를 들어 캡슐, IV 백, 정제, 분무 흡입기 상의 싱글 펌프, 또는 바이알을 포함하는 임의의 다양한 형태이다. 조성물의 단위 용량에서 활성 성분(예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 이의 염의 제형)의 양은 유효량이고 관련되는 특정 처치에 따라 달라진다. 당업자는 환자의 연령 및 병태에 따라 투여량에 일상적인 변화를 줄 필요가 있음을 인정할 것이다. 투여량은 또한 투여의 경로에 의존할 것이다. 경구, 눈, 안과용, 폐, 직장, 비경구, 경피, 피하, 정맥내, 근육내, 복막내, 비강내 등을 포함하는 다양한 경로가 고려된다. 이 출원의 화합물의 국소 또는 경피 투여를 위한 제형은 산제, 스프레이, 연고제, 페이스트, 크림제, 로션제, 겔제, 용액제, 패치제 및 흡입제를 포함한다. 다른 구현예에서, 활성 화합물은 멸균 조건 하에서 약제학적으로 허용 가능한 담체와, 그리고 요구되는 임의의 보존제, 완충제, 또는 추진제와 혼합된다.

"조합 요법"(또는 "공동-요법")은, 이들 치료제(즉, 본 발명의 화합물 및 적어도 제2 약제)의 공동-작용으로부터 유익한 효과를 제공하도록 의도된 특정 처치 섭생의 일부로서, 본 발명의 화합물 및 적어도 제2 약제의 투여를 의미한다. 조합의 유익한 효과는 치료제의 조합으로부터 야기되는 약동학적 또는 약력학적 공동-작용을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이들 치료제의 조합 투여는 전형적으로 정의된 시기(선택된 조합에 따라 보통 몇 분, 몇 시간, 수일 또는 수주일)에 걸쳐 실시된다. "조합 요법"은 우연히 및 임의로 본 출원의 조합을 야기하는 별개의 단독요법 섭생의 일부로서 이들 치료제의 둘 이상의 투여를 포괄하도록 의도될 수 있지만, 일반적으로는 그렇지 않다. "조합 요법"은 이들 치료제의 순차적 방식의 투여, 즉 각각의 치료제가 상이한 시간에 투여되는 것뿐만 아니라, 이들 치료제 또는 적어도 두 개의 치료제의 실질적으로 동시적 방식의 투여를 포함하도록 의도된다. 실질적으로 동시적인 투여는, 예를 들어 고정된 비율의 각각의 치료제를 갖는 단일 캡슐 또는 각각의 치료제에 대한 단일 캡슐을 복수로 대상에 투여하는 것에 의해 달성될 수 있다. 각각의 치료제의 순차적 또는 실질적으로 동시적인 투여는 구강 경로, 정맥내 경로, 근육내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 임의의 적절한 경로에 의해 달성될 수 있다. 치료제는 동일한 경로에 의하거나 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 선택된 조합의 제1 치료제는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있는 한편, 조합의 다른 치료제는 경구로 투여될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 모든 치료제가 경구로 투여될 수 있거나, 모든 치료제가 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 치료제가 투여되는 순서는 거의 중요하지 않다.

"조합 요법"은 또한 다른 생물학적 활성 성분 및 비-약물 요법(예를 들어, 수술 또는 기계적 처치)와의 추가적 조합에서 위에 기술된 치료제의 투여를 포함한다. 조합 요법이 추가로 비-약물 처치를 포함하는 경우, 치료제 및 비-약물 처치의 조합의 공동-작용으로부터 유익한 효과가 달성되는 한 비-약물 처치는 임의의 적절한 시간에 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절한 경우, 유익한 효과는 비-약물 처치가 치료제의 투여로부터 일시적으로 제거될 때, 아마도 수일 또는 수주일까지도 여전히 달성된다.

본 발명의 방법

본 발명은 치료적으로 유효한 양의 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 감소된 간 기능을 갖는 대상에서 간 재생을 가속화, 촉진 또는 증가시키거나, 간 질량을 증가시키는 방법을 제공한다:

[화학식 A]

여기에서:

R₁은 수소 또는 C₁-C₆ 알킬이고;

R₂, R₃, R₅, 및 R₆은 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록실이고;

R₄는 CO₂H, C(O)NH(CH₂)_mSO₃H, C(O)NH(CH₂)_nCO₂H, 또는 OSO₃H이고; 그리고

m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 또는 3이다.

일 구현예에서, 본 방법은 간 재생을 촉진 또는 증가시키는 것에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 본 방법은 간 재생을 촉진시키는 것에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 간 재생을 증가시키는 것에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 방법은 간 재생을 가속화시키는 것에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 본 방법은 간 질량을 증가시키는 것에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₁은 수소이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₁은 비치환된 C₁-C₆ 알킬이다. 추가의 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₁은 비치환된 C₁-C₃ 알킬이다. 추가의 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₁은 메틸, 에틸, 및 프로필로부터 선택된다. 추가의 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₁은 에틸이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₂는 수소이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₁은 하이드록실이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₃는 수소이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₃는 하이드록실이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₄는 CO₂H이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₄는 C(O)NH(CH₂)_mSO₃H이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₄는 C(O)NH(CH₂)_nCO₂H이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₄는 OSO₃H이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₄는 CO₂H 또는 OSO₃H이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₅는 수소이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₅는 하이드록실이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₆는 수소이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₆는 하이드록실이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₆는 α-하이드록실이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₆는 β-하이드록실이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₁은 메틸, 에틸 또는 프로필이고, R₅는 수소이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₁은 메틸, 에틸 또는 프로필이고, R₆는 수소이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₁은 메틸, 에틸 또는 프로필이고, R₅ 및 R₆은 각각 수소이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 R₂는 수소이고, R₃는 하이드록실이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 m은 1이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 m은 2이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 m은 3이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 n은 1이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 n은 2이다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 n은 3이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 화합물은

(1), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 화합물은

(2), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 염이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은 화학식 (A)의 화합물로, 여기에서 염은 나트륨 또는 트리에틸암모늄 염이다.

일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은

(3)이다.

다른 구현예에서, 본 발명에 사용되는 화합물은

(4)이다.

또 다른 구현예에서, 화학식 (A)의 화합물은 FXR 효능제이다.

간 재생은, 예를 들어 화학요법, 지방증, 또는 담즙정체에 의해 야기되는 실질조직의 병리가 있는 환자에서 심하게 손상된다[DeMeijer 2010; Farges 2013; Hubert 2015].

특히 폐색성 담즙정체가 있는 환자에서 주요 간 절제를 수행하는 위험은 수십 년 전에 인식되었고[Dixon 1983] 담관 악성종양이 있는 황달 환자의 현재의 수술적 관리를 형성하였다. 담즙정체성 간의 불량한 재생 능력은, 담즙정체를 완화시키거나 절제 전 간 크기를 증가시키기 위한 수술전 담도 배액술(van der Gaag, et al. N Engl J Med . 2010, 362(2):129-37), 간문맥 색전술(PVE)[VanGulik 2008], 및 ALPPS(Oldhafer, et al. Ann Surg . 2016, 263(5):839-41)과 같은 침습적 절차의 도입에 박차를 가하였다.

특정 구현예에서, 화학식 (A)의 화합물은 손상된 간을 재생시키는 것, 손상된 간의 질량을 증가시키는 것, 또는 손상된 간의 기능을 개선하는 것, 또는 이의 조합에 사용하기 위한 것이다.

증진된 간 재생 및/또는 간 질량의 증가 및/또는 기능의 개선은 간 또는 간 절편을 대상의 손상되거나 기능부전의 간을 대체하기 위해 대상에 이식되는 경우에 요망될 수 있다. 일 구현예에서, 대상은 이식된 간을 갖는다. 일 구현예에서, 대상은 절제된 간을 갖는다. 일 구현예에서, 감소된 간 기능은 외과 수술, 질환, 병리학적 상태, 또는 손상의 결과이다. 다른 구현예에서, 감소된 간 기능은 외과 수술의 결과이다. 일 구현예에서, 외과 수술은 간 동맥 색전술 또는 간문맥 조작(portal venous manipulation)이다. 일 구현예에서, 외과 수술은 간암 화학색전술(transarterial chemoembolization, TACE)이다. 일 구현예에서, 외과 수술은 부분 간절제술이다. 일 구현예에서, 본 화합물은 외과 수술 전 또는 후에, 또는 조합으로 투여된다.

이식된 간 또는 간 절편의 질량을 증가시키거나 간 재생을 촉진시키기 위해, 화학식 (A)의 화합물은 이식될 간이 아직 생체외에 있는 동안, 간 수용자에 대한 수술 중에 즉시, 그리고/또는 수술 수일 후에 이식될 간으로 직접 적용될 수 있다. 수술에 의한 간의 일부의 계획된 제거로 인해(예를 들어, 간에서의 종양으로 인해), 또는 간염으로 인해 간 재생이 요구될 경우, 투여의 시기는 수술-전 및 수술-후 투여 시기로 나누어질 수 있다. 예를 들어, 투여가 4 내지 5일 동안인 경우 화학식 (A)의 화합물은 수술 전 1 내지 2일, 그리고 수술 후 3 내지 4일 동안 추가로 투여하는 것이 가능하다.

간 재생이 요구되는 병태는 간의 일부가 수술로 인해 제거되는 경우, 간이 외상으로 인해 손상된 경우, 또는 상당한 정도의 급성 간 기능부전을 야기하는 질환 진행으로 인해 간이 손상된 경우(제거되지 않음, 예를 들어 간염)의 상황을 포함한다.

일 구현예에서, 간의 손상에 대한 원인일 수 있는 질환 또는 병태는 알코올에 대한 노출에 의해 유도되는 급성 간 손상, 예를 들어 지방증, 알코올성 간염 또는 간경화; 급성 바이러스성 간염, 예를 들어 A형 간염; 윌슨병(Wilson's disease)과 같이 구리, 또는 철(혈색소증)의 이상 저장을 야기하는 대사성 질환; 약물 또는 독소에 대한 노출에 의해 야기되는 급성 간 손상, 자가면역 과정에 의해 야기되는 급성 간염, 예를 들어 자가면역성 간염, 또는 비만이나 급성 지방간염의 다른 원인에 의해 야기되는 급성 간 손상으로부터 선택된다.

별개의 구현예에서, 간의 손상에 대한 원인일 수 있는 질환 또는 병태는 B형 또는 C형 간염 바이러스 감염 또는 알코올에 의해 유도되는 만성 간 손상으로부터 선택된다. 만성 B형 간염, 간경화뿐만 아니라 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)도 포함된다. NAFLD은 단순 지방증으로부터 비-알코올성 지방간염(NASH)까지의 범위에 걸친 임상적 및 병리학적 증후군을 기술하기 위해 선택되는 용어이다.

일 구현예에서, 감소된 간 기능은 뇌힘줄 황색종증(CTX), 원발성 경화성 담관염(PSC), 약물 유도 담즙정체, 임신 중 간내 담즙정체, 비경구 영양 관련 담즙정체(PNAC), 박테리아 과성장 또는 패혈증 관련 담즙정체, 자가면역성 간염, 만성 바이러스성 간염, 알코올성 간 질환, 간 이식 관련 이식편대숙주병, 선천성 간 섬유증, 총담관결석증, 육아종 간 질환, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 유육종증, 윌슨병(Wilson's disease), 고셰병(Gaucher's disease), 혈색소증, 및 알파 1-항트립신 결핍증으로부터 선택되는 질환 또는 병리학적 상태의 결과이다.

간 재생은 비처치 대조와 비교하여, 다양한 응고 인자와 같은, 간에 의해 생산되는 단백질의 혈청 내 더 높은 수준에 의해 명백한 간 기능의 개선을 야기하는 기능성이어야 한다. 특히, 간 기능 또는 온전성은 해당 분야에 잘 알려진 임의의 많은 파라미터를 측정하는 것에 의해 평가될 수 있는데; 예를 들어, 지연된 혈청 프로트롬빈 시간(혈액 응고)은 손상된 간의 징후이거나; 알부민 수준은 만성 간 질환에서 저하되거나; 혈장 중 알칼리 포스파타아제 수준은 큰 담도 폐색, 간내 담즙정체 또는 간의 침윤성 질환으로 증가하거나; 증가된 총 빌리루빈은 간에서 문제의 징후일 수 있거나; 감마 글루타밀 트랜스펩티다아제(GGT)는 경미한, 준임상적 수준의 간 기능부전에서도 상승할 수 있거나; 5' 뉴클레오티다아제 수준은 간내 또는 간외 담도계에 대한 손상 또는 담즙정체를 반영하거나; 또는 간 글루코오스 생산은 손상된 간에서 감소된다.

약제학적 조성물

"약제학적 조성물"은 하나 이상의 화학식 (A)의 화합물을 대상에 투여하기에 적절한 형태로 함유하는 제형이다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 벌크로, 또는 단위 제형으로 존재한다. 투여의 용이성 및 제제의 균일성을 위해 조성물을 단위 제형으로 제형화하는 것이 유리할 수 있다. 단위 제형에 대한 규격은 활성 시약의 독특한 특징 및 달성될 특정 치료적 효과에 의해 좌우되고 이에 직접적으로 의존한다.

가능한 제형은 경구, 설하, 버칼, 비경구(예를 들어, 피하, 근육내, 또는 정맥내), 직장, 경피, 비강내 및 흡입 투여를 포함하는 국소용으로 적절한 것들을 포함한다. 특정 환자에 가장 적절한 투여의 수단은 치료되는 질환의 성질 및 중증도 또는 사용되는 요법의 성질 및 활성 화합물의 성질에 의존할 것이지만, 가능한 경우, 경구 투여가 FXR 매개 질환 및 병태의 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있다. 경구 투여에 적절한 제형은 정제, 캡슐, 카세제, 로젠지와 같이 각각 소정량의 활성 성분을 함유하는 분리된 단위로서; 산제 또는 과립제로서; 수성 또는 비-수성 액체 중 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 또는 유중수 유제로서 제공될 수 있다.

설하 또는 버칼 투여에 적절한 제형은 활성 화합물 및, 전형적으로 풍미 기제, 예를 들어 당 및 아카시아 또는 트라가칸트를 포함하는 로젠지 및 불활성 기제, 예를 들어 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로오스 아카시아에 활성 화합물을 포함하는 향정(pastille)을 포함한다.

비경구 투여에 적절한 제형은 전형적으로 소정 농도의 활성 화합물을 함유하는 멸균 수용액을 포함하는데; 용액은 의도된 수용자의 혈액과 등장성일 수 있다. 비경구 투여에 적절한 추가의 제형은 생리적으로 적절한 공동-용매 및/또는 착화제, 예를 들어 계면활성제 및 사이클로덱스트린을 함유하는 제형을 포함한다. 수중유 유제도 비경구 제형을 위해 적절한 제형이다. 비록 이러한 용액은 정맥내 투여될 수 있다 하더라도, 이들은 또한 피하 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다.

직장 투여에 적절한 제형은 좌제 기제를 형성하는 하나 이상의 고체 담체, 예를 들어 코코아 버터에 활성 성분을 포함하는 단위-용량 좌제로서 제공될 수 있다.

국소 또는 비강내 적용에 적절한 제형은 연고, 크림, 로션, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어졸 및 오일을 포함한다. 이러한 제형을 위해 적절한 담체는 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌글리콜, 알코올, 및 이의 조합을 포함한다.

본 발명의 제형은 임의의 적절한 방법에 의해, 통상적으로 액체 또는 미세하게 분리된 고체 담체 또는 둘 다와 활성 화합물을 요구되는 비율로 균일하고 밀접하게 혼합하고, 다음에 필요에 따라, 생성된 혼합물을 원하는 형상으로 성형하는 것에 의해 제조될 수 있다.

예를 들어, 정제는 활성 성분의 분말 또는 과립과 하나 이상의 선택적 성분, 예를 들어 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 또는 계면활성 분산제를 포함하는 밀접한 혼합물을 압축하는 것에 의해, 또는 분말화된 활성 성분과 불활성 액체 희석제의 밀접한 혼합물을 성형하는 것에 의해 제조될 수 있다. 흡입에 의한 투여를 위해 적절한 제형은 다양한 유형의 계량된 용량의 가압된 에어졸, 분무기, 또는 취분기에 의해 생성될 수 있는 미세 입자 분말 또는 분무를 포함한다.

구강을 통한 폐 투여를 위해, 분말 또는 액적의 입자 크기는, 기관지 수상 구조로의 전달을 보장하기 위해, 전형적으로 0.5 내지 10 ㎛ 또는 1 내지 5 ㎛ 범위이다. 비강 투여를 위해서는, 비강내 보유를 보장하기 위해 10 내지 500 ㎛ 범위의 입자 크기가 사용될 수 있다.

계량된 용량 흡입기는, 전형적으로 액화된 추진제에 활성 성분의 현탁액 또는 용액 제형을 함유하는 가압된 에어졸 분배기이다. 사용 중에, 이들 기구는 전형적으로 10 내지 150 ㎛인 계량된 용량을 전달하기 위해 조정된 밸브를 통해 제형을 배출하여, 활성 성분을 함유하는 미세 입자 스프레이를 생산한다. 적절한 추진제는 특정 클로로플루오로카본 화합물, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 및 이의 혼합물을 포함한다. 제형은 추가로 하나 이상의 공동-용매, 예를 들어 에탄올 계면활성제, 예를 들어 올레산 또는 소르비탄 트리올리에이트, 항산화제 및 적절한 풍미제를 함유할 수 있다.

분무기는 전형적으로 공기 또는 산소인 압축된 가스의 좁은 벤투리 구멍을 통한 가속화에 의하거나, 또는 초음파 교반에 의해 활성 성분의 용액 또는 현탁액을 치료적 에어졸 분무로 변환시키는 상업적으로 이용 가능한 기구이다. 분무기에 사용하기 적절한 제형은 액체 담체 중 활성 성분으로 구성되고 제형의 40% w/w까지, 바람직하게는 20% w/w 미만을 포함한다. 담체는, 바람직하게는, 예를 들어 염화나트륨의 첨가에 의해 체액과 등장성으로 만들어진, 전형적으로 물 또는 희석된 알코올 수용액이다. 선택적 첨가제는 제형이 멸균으로 제조되지 않을 경우 보존제, 예를 들어 메틸 하이드록시-벤조에이트, 항산화제, 풍미제, 휘발성 오일, 완충제 및 계면활성제를 포함한다.

흡입에 의한 투여에 적절한 제형은 취분기에 의해 전달되거나 코로 들이쉬는 방식으로 비강에 넣을 수 있는 미세하게 분쇄된 분말을 포함한다. 취분기에서 분말은, 전형적으로 젤라틴 또는 플라스틱으로 만들어진 캡슐 또는 카트리지에 함유되는데, 이는 사용시 천공 또는 개방되고 흡입시 기구를 통해 들어온 공기에 의해, 또는 수동으로 작동되는 펌프에 의해 분말이 전달된다. 취분기에 이용되는 분말은 활성 성분 단독으로, 또는 활성 성분, 적절한 분말 희석제, 예를 들어 유당, 및 선택적인 계면활성제를 포함하는 혼합 분말로 구성된다. 활성 성분은 전형적으로 제형의 0.1 내지 100% w/w를 포함한다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 활성 성분으로서 본 발명의 화합물을 적어도 하나의 약제학적 담체 또는 희석제와 함께, 및/또는 혼합물로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이들 약제학적 조성물은 간 재생을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

담체는 약제학적으로 허용 가능하고 조성물 중의 다른 성분과 혼화 가능, 즉 유해한 효과를 갖지 않아야 한다. 담체는 고체 또는 액체일 수 있고 바람직하게는 단위 제형, 예를 들어 0.05 내지 95 중량%의 활성 성분을 함유할 수 있는 정제로서 제형화된다. 요망될 경우, 다른 생리적으로 활성인 성분이 또한 본 발명의 약제학적 조성물에 도입될 수 있다.

위에 특별히 언급된 성분에 추가하여, 본 발명의 제형은 문제의 제형의 유형과 관련하여 약학 분야의 당업자에게 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적절한 제형은 풍미제를 포함할 수 있고 비강내 투여에 적절한 제형은 향료를 포함할 수 있다.

실시예

실시예 1. 화학식 (A)의 화합물의 합성

화학식 (A)의 화합물은 해당 분야의 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 특히, 본 발명의 화합물은 미국 특허 제7,786,102호, 제7,994,352호, 및 제7,932,244호에 공개된 절차에 따라 제조될 수 있다.

실시예 2. 화합물 1의 합성

[화합물 1]

메틸 3α-하이드록시-7-케토-5β-콜라네이트의 제조.

17.0 kg의 3α-하이드록시-7-케토-5β-콜란산, 68 kg의 메탄올 및 0.17 kg의 메탄설폰산을 반응기에 넣었다. 다음에 반응 혼합물을 30 내지 60℃로 1시간 동안 가열하고 25.5 kg의 탈염수를 첨가하였다. 다음에 얻어진 혼합물을 교반하고, 양호한 침전이 얻어질 때까지 20 내지 25℃까지 냉각한 다음, 추가로 0 내지 15℃까지 냉각하였다. 침전을 여과하고 물과 메탄올의 혼액으로 세척하고 오븐에서 약 40℃로 추가 건조하였다. 이와 같이 15 kg의 메틸 3α-하이드록시-7-케토-5β-콜라네이트가 얻어졌다. 화학량론적 수율은 85.2%였다.

메틸 3α-트리메틸실록시-7-케토-5β-콜라네이트의 제조.

15.0 kg의 메틸 3α-하이드록시-7-케토-5β-콜라네이트, 45 kg의 톨루엔, 7.5 kg의 트리에틸아민, 및 7.5 kg의 트리메틸클로로실란을 반응기에 넣었다. 혼합물을 70 내지 80℃까지 가열하고 이 온도에서 약 1시간 동안 교반 하에 유지한 다음, 37.5 kg의 물을 첨가하고 혼합물을 15 내지 20℃에서 교반하였다. 다음에 하부의 수상을 분리하고 제거하였다. 유기상을 오일상 잔류물이 얻어질 때까지 농축하고, 여기에 15 kg의 테트라하이드로푸란을 첨가하였다. 이와 같이 얻어진 메틸 3α-트리메틸실록시-7-케토-5β-콜라네이트를 함유하는 용액을 다음 단계에 사용하였다.

메틸 3α,7α-디-트리메틸실릴옥시-5β-콜라네이트의 제조.

30 kg의 테트라하이드로푸란을 반응 용기에 부하한 다음, 혼합물을 -90℃ 내지 -60℃ 사이의 온도로 하였다. 9.8 kg의 100% 리튬 디이소프로필아미드 및 9.3 kg의 트리메틸클로로실란을 첨가하고, (b)에서 제조되고 메틸 3α-트리메틸실록시-7-케토-5β-콜라네이트를 함유하는 전체 용액을 따라 부었다. 다음에 혼합물을 약 1시간 동안 -60℃ 내지 -90℃ 사이의 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 다음에 4.50 kg의 중탄산나트륨 및 60 kg의 물의 용액을 따라 붓고 혼합물을 0 내지 10℃에서 교반하고 하부 수상을 분리하여 제거하였다. 다음에 하부 상을 오일상 잔류물이 얻어질 때까지 농축하고, 여기에 45.0 kg의 염화메틸렌을 첨가하였다. 이와 같이 얻어진 메틸 3α,7α-디-트리메틸실릴옥시-5β-콜라네이트의 용액을 다음 단계로 보냈다.

메틸 3α-하이드록시-6-에틸리덴-7-케토-5β-콜라네이트의 제조.

이전 단계로부터 온 염화메틸렌 중 메틸 3α,7α-디-트리메틸실릴옥시-5β-콜라네이트의 전체 용액을 반응기에 넣고 -90℃ 내지 -60℃ 사이로 냉각하였다. 1.97 kg의 아세트알데히드 및 5.5 kg의 삼불화붕소 에테레이트를 다음에 첨가하였다. 반응 혼합물을 위의 온도로 2 내지 4시간 동안 교반 하에 유지하고, 그 후 30 내지 35℃까지 가열하고 그 온도로 약 2 내지 4시간 동안 유지하였다. 다음에 60 kg의 물을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 교반하고 수상을 분리하였다. 이와 같이 얻어진 메틸 3α-하이드록시-6-에틸리덴-7-케토-5β-콜라네이트를 함유하는 용액을 다음 단계에서 사용하였다.

3α-하이드록시-6-에틸리덴-7-케토-5β-콜란산의 제조.

이전 단계에서 얻어진 염화메틸렌 중 메틸 3α-하이드록시-6-에틸리덴-7-케토-5β-콜라네이트의 용액을 반응기에 넣었다. 다음에 오일상 잔류물이 얻어질 때까지 용매를 증류로 제거하고, 여기에 15 kg의 메탄올을 첨가하였다. 다음에 반응 혼합물을 45 내지 50℃까지 가열하고 7.5 kg의 30% 수산화나트륨을 첨가하고, 반응 혼합물을 위의 온도로 약 1시간 동안 유지하였다. 다음에 30 kg의 물에 이어서 45.0 kg의 염화메틸렌 및 7.5 kg의 85% 인산을 첨가하였다. 하부 유기상을 분리하고 수상을 그 뒤에 제거하였다. 페이스트상 잔류물이 얻어질 때까지 용매를 유기상으로부터 증류로 제거하였다. 약 37.5 kg의 에틸아세테이트를 잔류물에 첨가하고 혼합물을 65 내지 75℃까지 가열한 다음, 10 내지 35℃까지 냉각하였다. 침전을 얻어, 여과하고 에틸아세테이트로 세척하고, 건조하였다. 8.0 kg의 3α-하이드록시-6-에틸리덴-7-케토-5β-콜란산은, 메틸 3α-하이드록시-7-케토-5β-콜라네이트에 대해 계산하여, 51.8%의 화학량론적 수율로 얻어졌다.

3α-하이드록시-6β-에틸-7-케토-5β-콜란산의 제조.

8.0 kg의 3α-하이드록시-6-에틸리덴-7-케토-5β-콜란산, 48.0 kg의 물, 5.1 kg의 30% 수산화나트륨, 0.80 kg의 5% 팔라듐/탄소를 반응기로 넣었다. 반응 혼합물을 1 내지 3기압 사이의 압력으로, 수소 흡수가 더 이상 보이지 않을 때까지 수소화하였다.

3α-하이드록시-6α-에틸-7-케토-5β-콜란산의 제조.

바로 위의 반응의 종결시, 혼합물을 95 내지 105℃까지 가열하고 그 온도로 몇 시간 동안 유지하여 3α-하이드록시-6β-에틸-7-케토-5β-콜란산이 상응하는 에피머인 원하는 3α-하이드록시-6α-에틸-7-케토-5β-콜란산으로 전환되도록 하였다. 현탁액을 여과하고 촉매를 회수하였다. 5.1 kg의 85% 인산 9.6 kg의 에틸아세테이트를 여과된 용액에 첨가하고 반응 혼합물을 40 내지 70℃ 사이의 온도까지 가열하였다. 이것을 0 내지 30℃ 사이의 온도까지 냉각하고 침전을 여과로 회수하였다. 에틸아세테이트로 세척한 후, 침전을 오븐에서 65℃로 건조하였다. 5.0 kg의 3α-하이드록시-6α-에틸-7-케토-5β-콜란산이 수득되었다. 화학량론적 수율: 62.2%. m.p. 185 내지 188℃.

3α,7α-디하이드록시-6α-에틸-5β-콜란산(화합물 1)의 제조.

5.0 kg의 3α-하이드록시-6α-에틸-7-케토-5β-콜란산, 5.0 kg의 물, 2.50 kg의 수산화나트륨을 반응기에 부하하였다. 다음에 혼합물을 70 내지 105℃까지 가열하고 2.50 kg의 물에 용해된 수소화붕소나트륨의 혼합물을 따라 붓고, 다음에 혼합물을 1시간 동안 따뜻하게 유지하고, 실온까지 냉각하고, 10.0 kg의 탈염수, 15.0 kg의 염화메틸렌 및 3.00 kg의 85% 인산을 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 하부 유기상을 분리하고 수상을 제거하였다. 조 생성물의 결정화는 유기 용액을 냉각하는 것에 의해 얻어졌다. 이 생성물을 50 kg의 탈염수 및 1.10 kg의 30% 암모니아에 용해시켰다. 다음에 완전한 용액이 얻어질 때까지 혼합물을 교반하였다. 혼합물을 20 내지 50℃로 유지하고, 1.50 kg의 인산을 따라 부었다. 침전된 혼합물을 20 내지 50℃ 사이의 온도에서 교반한 다음, 침전을 여과로 회수하고, 물로 세척하고 건조하였다. 4.50 kg의 3α,7α-디-하이드록시-6α-에틸-5β-콜란산(화합물 1). 화학량론적 수율: 89.6%.

실시예 3. 화합물 2, 3 및 4의 합성

3α-테트라하이드로피라닐옥시-7-케토-5β-콜란-24-오익산(2A)의 제조.

디옥산(12 ml) 중 3,4-디하이드로-2H-피란(1.74 ml, 19 mmol)을 디옥산(55 ml) 중 p-톨루엔설폰산(115 mg, 0.6 ml) 및 6α-에틸-7-케토리토콜산(5.0 g, 12 mmol)의 용액으로 서서히 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 다음에 물(40 ml)을 첨가하고, 혼합물을 진공 하에 부분적으로 농축하고 EtOAc(4회/25 ml)로 추출하였다. 유기 분획을 합하여 염수(1회/50 ml)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조하고 진공 하에 증발시켜 6 g의 화합물 2A를 수득하였다. 조 유도체를 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

3α-테트라하이드로피라닐옥시-6α-에틸-7-케토-24-노르-5β-콜란-23-요오다이드(3A)의 제조.

300 W 텅스텐 램프 조사 하에, CCl₄(75 ml) 중 요오드(5 g, 20 mmol)를 CCl₄(200 ml) 중 2A(5.5 g, 11 mmol) 및 테트라-아세트산납(4.9 g, 11 mmol)의 용액으로 적가하였다. 반응 혼합물을 색깔이 변하지 않을 때까지 교반하였다(18시간). 혼합물을 냉각하고 Celite^® 상에서 여과하였다. 유기상을 5% Na₂S₂O₃ 용액, 5% NaOH, 염수(15 ml)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조하고 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 플래시 크로마토그래피로 경석유(light petroleum)/EtOAc 95/5의 혼합물을 이동상으로 사용해서 정제하여 4.6 g의 화합물 3A(40% 수율)를 수득하였다.

3α-하이드록시-6α-에틸-7-케토-24-노르-5β-콜란-23-요오다이드(4A)의 제조.

화합물 3A(2.2 g, 3.8 mmol)를 THF(50 ml) 중 HCl 37%의 용액에서 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO₃ 용액(20 ml), H₂O(20 ml), 및 염수(20 ml)로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조하고, 진공 하에 증발시켜 1.4 g의 화합물 4A(80% 수율)를 수득하였다. 조 유도체를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

3α-tert-부틸디메틸실릴옥시-6α-에틸-7-케토-24-노르-5β-콜란-23-요오다이드(5A)의 제조.

CH₂Cl₂(30 ml) 중 4A(1.4 g, 2.8 mmol)의 용액으로, tert-부틸디메틸실릴클로라이드(496 mg, 3.22 mmol) 및 이미다졸(230 mg, 3.36 mmol)을 첨가하고 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO₃ 용액(30 ml), 염수(30 ml)로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조하였다. 유기상을 진공 하에 증발시켜 1.5 g의 화합물 5A(87% 수율)를 수득하였다. 조 유도체를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

3α-tert-부틸디메틸실릴옥시-6α-에틸-7-케토-24-노르-5β-콜란-23-올(6A)의 제조.

아세톤(12 ml) 중 5A(1.2 g, 1.96 mmol)의 용액으로, Ag₂CO₃(1.1 g, 3.9 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 환류한 다음 실온까지 냉각하고, Celite^® 상에서 여과하여 아세톤으로 세척하고 유기상을 합하여 농축해서 1 g의 화합물 6A를 수득하였다. 조 유도체를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

3α-tert-부틸디메틸실릴옥시-7α-하이드록시-6α-에틸-24-노르-5β-콜란-23-올(7A)의 제조.

THF(50 ml) 및 H₂O(12.5 ml)의 혼액 중 6A(1 g, 1.96 mmol)의 용액으로, NaBH₄(740 mg, 19.6 mmol)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 30분 동안 교반하였다. 반응 용액을 진공 하에 부분적으로 농축하고 CHCl₃(3회/20 ml)로 추출하였다. 유기상을 합하여 염수(1회/50 ml)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조하고, 진공 하에 증발시켰다. 조 잔류물을 실리카겔 플래시 크로마토그래피로 CH₂Cl₂:MeOH 99:1의 혼액을 이동상으로 사용해서 정제하여 0.8 g의 7A(81% 수율)를 수득하였다.

3α-tert-부틸디메틸실릴옥시-7α-하이드록시-6α-에틸-24-노르-5β-콜란-23-설페이트 트리에틸암모늄 염(화합물 2)의 제조.

-3℃로 냉각된 THF(7 ml) 중 7A(0.5 g, 0.99 mmol)의 용액으로, Et₃N(0.3 ml, 2.1 mmol)을 첨가하고 생성된 혼합물을 10분 동안 교반하였다. ClSO₃H(0.1 ml, 1.5 mmol)를 첨가하고 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 다음에 물(10 ml)을 첨가하고 혼합물을 CH₂Cl₂(3회/15 ml)로 추출하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조하고, 진공 하에 증발시켰다. 조 황산염 유도체를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

3α,7α,23-트리하이드록시-6α-에틸-24-노르-5β-콜란-23-설페이트 트리에틸암모늄염(화합물 3)의 제조.

아세톤(8 ml) 중 화합물 2(0.5 g, 0.77 mmol)의 용액으로, PdCl₂(CH₃CN)₂(10 mg, 0.05 eq)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 진공 하에 농축하고 중압(medium pressure) Lichroprep RP-8로 MeOH/H₂O 8/2 혼액을 이동상으로 사용해서 정제하여 0.115 g의 화합물 3(mp 118 내지 121℃)을 수득하였다.

3α,7α,23-트리하이드록시-6α-에틸-24-노르-5β-콜란-23-설페이트 나트륨염(화합물 4)의 제조.

아세톤(4 ml)과 H₂O(0.08 ml)의 혼액 중 화합물 2(0.4 g, 0.72 mmol)의 용액으로, PdCl₂(CH₃CN)₂(10 mg, 0.05 eq)를 첨가하고 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 Celite^® 상에서 여과하고 진공 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 10% NaOH의 메탄올 용액으로 2시간 동안 처리하였다. 생성된 혼합물을 진공 하에 농축하고 CH₃OH/H₂O(7:3)의 혼액을 이동상으로 사용한 액체 중압 정제로 0.09 g의 화합물 4(25% 수율)를 수득하였다.

실시예 4. 토끼에서 간문맥 색전술( PVE )에 대한 화합물 1(6-ECDCA로도 언급 됨)의 효과

배경

간 종양의 완전한 절제는 악성 간 종양의 치유적 처치를 위한 외과 수술이다. 그러나, 잔존 간이 너무 작아서 적절한 간 기능 및 용량의 요구에 부합하지 못할 수 있다. 이러한 이유로, 이들 환자에서는 간이 절제 불가능한 것으로 고려된다. 향후 잔존 간(future remnant liver, FRL)의 크기 및 기능을 수술 전에 증가시키기 위하여 다양한 절차가 개발되었다. 절제 불가능한 환자에서 FRL을 증가시키기 위한 하나의 절차는 간문맥 색전술(portal vein embolization, PVE)이다.

PVE는 간의 부분에서 다른 부분의 계획된 간 절제에 앞서 간 재생을 증가시키는 임상적 절차이다. 이 절차 중, 바늘은 간으로, 그리고 종양의 가장 큰 부분이 공급받는 간의 부분에서의 혈관으로 경피적으로 삽입된다. 미세구가 색전 구역으로 혈류를 공급하는 간문맥으로 주입되어 혈류의 차단을 야기한다. 이러한 색전 간엽의 봉쇄는 비-색전 간엽이 성장하는 것을 촉진하여, 사실상 간이 재생되도록 속이게 된다. 성장은 환자가 수술 후 의존할 나머지 간 분엽을 확대시키는 효과를 갖는다. 남게 될 간의 양이 작아서 이전에 종양이 수술 불가능한 것으로 간주되었던 환자는 이제 종양을 제거하는 수술을 받을 수 있다. 수 주일 후, 간의 비-색전 측은 수술이 실행 가능한 선택인 수준까지 재생될 것이다.

아래의 생체내 동물 모델의 결과는 6-ECDCA가 간 재생을 가속화시키고 간 질량을 증가시키는 것을 입증하였다.

재료 및 방법

동물 연구

평균 체중 3.0±0.5 kg의 암컷 뉴질랜드 흰 토끼를 온도-조절된 방에서 표준화된 실험실 조건 하에 1주일 동안 적응시켰다. 동물을 개별 수용하고, 표준 실험실 음식 및 물에 자유롭게 접근하도록 하고, 1일 당 12-시간 광/암 주기를 받도록 하였다. 토끼를 6-ECDCA를 받는 2개 군 및 비히클을 받는 2개의 대조군으로 나누었다. 구체적으로 PVE 연구 토끼는 다음의 군으로 분류되었다:

제1군: 정상 식이(6-ECDCA 10 mg/kg/일, 경구 위관 영양)(N=6), 동물은 PVE 7일 후에 희생시킴.

제2군: 정상 식이(비히클)(N=6), 동물은 PVE 7일 후에 희생시킴.

제3군: 정상 식이(6-ECDCA 10 mg/kg/일, 경구 위관 영양)(N=6), 동물은 PVE 3일 후에 희생시킴.

제4군: 정상 식이(비히클)(N=6), 동물은 PVE 3일 후에 희생시킴.

도 1은 토끼에서 컴퓨터 단층촬영(CT) 및 문맥조영술 측정, 그리고 간문맥 색전술을 위한 연구 개요 및 계획을 기술한다.

간문맥 색전술

토끼 간은 4개의 간엽으로 구성되고, 이중 3개는 머리쪽으로 위치하고 4번째는 꼬리쪽으로 위치한다. 토끼 PVE 모델에서 총 간 용량의 대략 80%를 차지하는 머리쪽 간엽이 색전되었다. 토끼를 0.03 mg/kg 부프레노르핀 및 0.02 mg/kg 엔로플록사신의 피하 주사 후 뒤로 누운 자세로 놓았다. 토끼는 수술 후 3일 동안 1일 1회 엔로플록사신 0.02 mg/kg을 피하로 받았다. 동물을 25.0 mg/kg 케타민 및 0.2 mg/kg 덱스메데토미딘의 근육내 주사로 마취시켰다. 이소플루란 1% 내지 2%를 O₂/공기(1:0.7 L/분)와 함께 사용하여 마취를 유지시켰다. 심박수 및 동맥 산소 포화도를 수술 내내 연속적으로 맥박산소측정법으로 측정하였다.

개별 문맥 가지를 확인하기 위해 문맥조영술을 수행하였다. 문맥 가지가 꼬리쪽 간엽으로 통과한 후, 머리쪽 간엽에 공급하는 주 문맥 가지로 미세카테터를 위치시켰다. 3개의 백금 코일(6 mm)의 유동 중지 및 배치까지, 동물은 조영제(Visipaque) 및 90 내지 180 μm 폴리비닐알코올(PVA) 입자의 초기 혼합물에 이어서, 300 내지 500 μm PVA 입자의 주입을 받았다. PVE 직후 문맥조영술로 색전술 군에서 머리쪽 문맥 혈류의 완전 폐색을 확인하였다. 꼬리쪽 및 머리쪽 간엽의 비대 및 위축 반응은 색전술 전 및 색전술 3일 및 7일 후 CT 용량측정을 사용하여 측정하였다.

CT 용량측정

다상 CT 스캔은 64-슬라이스 CT 스캔(Brilliance 64-채널; Philips, Eindhoven, The Netherlands)을 사용하여 수행되었다. 토끼를 뒤로 누운 자세로 놓았다. 공(blank) 시리즈 이후, 조영 증강 스캔을 조영제 주사(4 mL Visipaque)에 이어서 3 mL NaCl 주사 후, 15초(동맥 상), 30초(문맥 상), 및 45초(정맥 상)에 수행하였다. 간의 3D-재건은 재건된 2 mm 축 슬라이스를 사용하여 만들었다. 전체 간 및 머리쪽과 꼬리쪽 간엽을 수동으로 묘사하였고 총 간 용량(TLV) 및 꼬리쪽 간 용량(CLV) 및 머리쪽 간 용량(CrLV)을 계산하였다.

PVE 전 CLV는 다음 공식을 사용하여 TLV의 백분율로서 표현하였다:

PVE 이후, %CLV는 다음 공식을 사용하여 계산하였다:

CLV에서의 증가는 다음 공식을 사용하여 계산하였다:

CrLV는 이에 따라 계산하였다.

통계적 분석

통계적 분석은 사회 과학용 통계 패키지(Statistical Package for Social Sciences(SPSS 18.0; SPSS, Chicago, Illinois)) 및 GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego, CA)으로 수행하였다. 순위 데이터(ranked data)를 기반으로 혼합-모델 분석을 사용하여 CT 용량측정 데이터를 비교하였다. 연속적 비모수 데이터는 만-휘트니 U 검정(Mann-Whitney U test)에 의해 비교하였다. 군 내의 상이한 시점에 대한 비모수 연속 데이터는 윌콕슨 부호 순위 검정(Wilcoxon signed rank test)을 사용하였다. 변수 간의 상관관계는 피어슨(Pearson) r 상관 계수를 사용하여 시험하였다. 모든 통계적 검정은 양측 검증(2-tailed)이었고, 차이는 P 값≤0.05에서 유의미한 것으로 고려되었다. 데이터는 달리 명시되지 않는 한, 평균±SD로서 표현되었다.

다음 측정이 실시되었다: (1) 체중, (2) 색전 및 비-색전 간엽의 컴퓨터 단층촬영, (3) 간에서 세포 주기-관련 및 담즙산염 항상성-관련 전사물의 발현, (4) 회장 전사물의 발현, 및 (5) 혈청 총 담즙산염 농도.

체중 측정

각각의 토끼의 전체 체중을 각각의 연구 일에 측정하였고 이 데이터는 도 2에 제공된다. 이 데이터는 6-ECDCA 또는 비히클 처치 동물의 체중 사이의 차이가 통계적으로 유의미하지 않은 것을 나타낸다.

컴퓨터 단층촬영

컴퓨터 단층촬영 측정은 기준선, 제6일, 및 색전 3일 후 및 7일 후에 수행되었다. 도 3은 시간에 대한 색전 간엽의 꼬리쪽 간 용량(CLV; %)에서의 증가를 나타내는 그래프이다. 도 3에서의 데이터는 6-ECDCA가 비-색전 간엽의 비대를 가속화시키는 것을 보여준다. 도 5는 시간에 대한 PVE 연구 토끼의 색전 간엽의 머리쪽 간엽 용량(CrLV, %) 수준에서의 저하를 나타내는 그래프이다. 도 5에서의 데이터는 6-ECDCA가 색전 간엽의 위축에 영향을 미치지 않은 것을 나타낸다.

간에서 세포 주기-관련 및 BA 항상성-관련 전사물의 발현

도 6a 내지 6d는 색전 7일 후 간의 비대 및 위축 부분에서 세포 주기-관련 전사물의 상대적 발현에 대한 6-ECDCA의 효과를 기술한다. 도 6e 내지 6h는 색전 7일 후 간의 비대 및 위축 부분에서 담즙산염 항상성-관련 전사물의 상대적 발현에 대한 6-ECDCA의 효과를 기술한다.

회장 전사물의 발현

도 7a 내지 7g는 색전 7일 후 회장 전사물에 대한 6-ECDCA의 효과를 기술한다.

혈청 담즙 농도

혈청 담즙산염 농도는 기준선, 3시간, 및 PVE 1일 후, 3일 후, 및 7일 후에 측정되었다. 총 혈청 담즙산염은 제조자의 지침(Diazyme Laboratories, Poway, CA)에 따라 효소적 방법에 의해 분석되었다. 도 8은 시간(일)에 대한 PVE 연구 토끼(n=군 당 5)에서의 혈청 담즙산염의 총 농도(㎛ol/L)를 나타내는 그래프이다. 이전에, 혈장 담즙산염은 PVE 이후 재생 반응에 대한 예측적 인자로서 검사되었다. PVE 이후 초기에 혈장 담즙산염 수준은 PVE의 토끼 모델에서 재생 반응과 강하게 상관되는 것으로 입증되었다(Hoekstra, et al. J. Surgical Research, 2012, 178, 773-778).

대조적으로, 도 8에서의 데이터는, 비록 6-ECDCA는 대조군에 비해 비-색전 엽에서 비대를 가속화하는 것을 보여주었지만(도 3 참조), 6-ECDCA로 처치받은 동물에서 혈청 담즙산염의 농도가 PVE 1일 후 대조군에 비해 상대적으로 더 낮은 것을 나타낸다.

실시예 5. 토끼에서 간문맥 색전술( PVE )에 대한 화합물 1(6- ECDCA 또는 OCA 또는 오베티콜산으로도 언급됨)의 효과

간문맥 색전술(PVE)은 주요 간 절제 계획이 있는 환자에서 향후 잔존 간 용량을 증가시키기 위해 사용된다. 담즙산염-활성화 전사 인자 파네소이드 X 수용체(FXR)는 부분적 간절제 이후 보상적 간 성장의 초기 단계에 연루되는 사건인 증식성 담즙산염 신호전달의 핵심 매개체이다. 이 연구의 목적은 PVE-유도 간 성장에 대한 강력한 FXR 효능제(오베티콜산, OCA)의 효과를 평가하는 것이다. 간 성장은 CT 스캐닝, 간담도 신티그래피 및 이미지 분석에 의해, 그리고 증식성 표지 Ki67에 대한 면역화학에 의해 평가하였다. 간 손상은 혈장 트랜스아미나아제의 측정 및 간 조직학의 평가에 의해 검사하였다.

36마리 토끼를 PVE 7일 전에 시작하여 PVE 7일 후까지 계속되는, 매일 OCA (10 mg/kg) 경구 위관 영양 또는 비히클 사이에서 무작위화하였다. 머리쪽 간엽의 PVE는 폴리비닐 알코올 입자 및 코일을 사용하여 제0일에 수행하였다. 꼬리쪽 간 용량(CLV)은 CT 용량측정으로 제-7일, 제-1일, 제+3일 및 제+7일에 분석하였다. 간 기능(즉, 메브로페닌 섭취)은 간담도 신티그래피를 사용하여 동물의 하위군에서 정량하였다. 분석된 추가 파라미터는 혈장 트랜스아미나아제 수준, H&E- 및 Ki67- 염색 간 절편의 조직학적 점수, 그리고 FXR 표적 유전자 발현이었다.

재료 및 방법

동물

대학 의료 센터(Academic Medical Center)의 동물 윤리 및 복지 위원회는 모든 실험 프로토콜(BEX35AC 및 BEX35AD)을 승인하였다. 평균 체중 2941(±267) 그램의 36마리 뉴질랜드 흰 토끼(Charles River, Gennat, France)를 실험 투입 전 1주일 동안 적응시켰다. 토끼를 12시간 광/암 주기의 온도-조절된 방에 군으로 수용하고, 물과 표준 사료에 무제한 접근하도록 하였다.

실험 디자인

6마리 토끼의 6군에 PVE를 계획하였다. 동물을 경구 위관 영양(3 kg 동물에 1.5 mL)을 통한 매일 오베티콜산(Intercept Pharmaceuticals) 처치(1% 메틸 셀룰로오스 중 10 mg/kg) 또는 비히클(1% 메틸 셀룰로오스, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, the Netherlands) 중 하나로 무작위 할당하였다. 처치는 PVE 7일 전에 개시하고, PVE 3일 후 또는 7일 후 희생시까지 계속하였다.

간문맥 색전술

동물을 케타민(25 mg/kg, Nimatek, Eurovet, Bladel, The Netherlands) 및 메데토미딘(0.2 mg/kg, Dexdomitor, Orion, Espoo, Finland)의 피하 주사에 의해 마취하였다. O₂/공기(1:1, 3 L/분)와 혼합된 이소플루란 2%(Forene; Abbott Laboratories, Kent, United Kingdom)를 사용하여 마취를 유지하였다. 수술전 진통제는 부프레노르핀(0.03 mg/kg, Temgesic, Reckitt Benckiser Healthcare, Hull, United Kingdom)으로 구성되었다. 예방 항생제는 피하 주사 베이트릴(0.2 mg/체중 kg, Bayer Healthcare, Berlin, Germany)로 구성되었다.

PVE는 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다(van den Esschert JW, et al. Ann Surg 2012; 255(2):311-8). 정중선 개복후, 하장간막 정맥의 가지에 18G 카테터(Hospira Venisystems, Lake Forest, IL, US)를 사용하여 캐뉼러를 삽입하였다. 디지털 감산 문맥조영술 하에, Transend-ex 0.36 mm Х 182-cm 가이드 와이어(Boston Scientific)가 있는 레니게이드 3F 미세카테터(Renegade 3F microcatheter)(Boston Scientific, Natick, MA)를 머리쪽 간엽으로 가는 주 문맥 가지에 위치시켰다. 폴리비닐 알코올 입자(90 내지 180 ㎛ 및 300 내지 500 ㎛ 직경, Cook, Bloomington, IN) 및 2개의 섬유질 백금 코일(4.0 및 6.0 mm; Boston Scientific)을 카테터를 통해 주입하여 머리쪽 간엽으로 가는 문맥 가지를 폐색하였다. PVE는 문맥조영술에 의해 확인하였고, 장간막 정맥은 결찰을 사용하여 막았다. 복부는 2층으로 덮었다. PVE 이후 3일 동안 매일 베이트릴을 투여하였다.

CT 용량측정

다상 CT 스캔(Brilliance 64, Philips, Eindhoven, The Netherlands)을 제-7일, 제-1일, 제+3일, 및 제+7일에 수행하였다. 동물(n=처치군 당 18)을 마취하고 22G 카테터를 측부 귀 정맥에 넣었다. 기준선 스캔을 하고 3 mL의 조영제 용액(Visipaque, GE Healthcara, Waukesha, WI)을 주사하였다. 동맥, 문맥 및 정맥 상 스캔을 각각 15초, 30초, 45초 후 시행하였다. 용량 분석은 수동 묘사를 사용하여 5-mm 축 슬라이스의 3D 재건에서 수행하였다. 꼬리쪽 간 용량(CLV) 및 총 간 용량(TLV)을 결정하고 CLV에서의 증가를 다음 공식을 사용하여 결정하였다:

머리쪽 간 용량(CrLV; CrLV = TLV-CLV)에서의 저하를 계산하기 위해 동일한 식이 사용되었다. CLV에서의 증가 및 CrLV에서의 저하는 기준선으로서 제-1일 값을 사용하여 계산하였다. 그래프 목적으로, CLV 및 CrLV에서의 변화는 제0일(PVE 시점)에서 시작하여 표시된다. 재생률은 다음 공식을 사용하여 계산하였다:

CT 용량측정 데이터를 검증하기 위해, 희생시 용량 측정을 희생시 실제 간 중량(정밀 등급, Sartorius, Goettingen, Germany)과 상관시켰다(도 9; 회색 사각형은 대조군으로부터의 동물을 나타내고, 흑색 삼각형은 OCA 처치 동물을 나타내고; 상관관계는 스피어먼의 순위 상관 계수(Spearman's rank correlation coefficient)를 사용하여 검정하였다).

간담도 신티그래피

간 기능은 ^99mTc-표지된 (2,4,6 트리메틸-3-브로모)이미노디아세트산(^99mTc-메브로페닌, Bridatec, GE Healthcare, Eindhoven, the Netherlands)으로 간담도 신티그래피(HBS)를 사용하여 제-7일, 제-1일, 제+3일 및 제+7일에 평가하였다. 토끼(n=처치군 당 6)를 마취시키고 간과 심장이 대형 시야(field-of-view) 싱글 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT/CT) 카메라(Siemens Symbia T16) 아래 위치하도록 화상 테이블에 놓았다. 관심 영역을 혈액 풀 판독을 위해 좌심실 주위로, 총 간 섭취를 위해 전체 간 주위로, 그리고 꼬리쪽 간엽 주위로 이동시켰다(도 10; 황색 관심 영역(ROI)은 좌심실을, 적색 ROI는 전체 간을, 그리고 핑크색 ROI는 꼬리쪽 간엽을 묘사하고; 머리쪽 간엽 활동에서의 현저한 저하 및 꼬리쪽 간엽 활동에서의 증가는 간문맥 색전술 이후 보였다). 토끼 당, 50 MBq ^99mTc-메브로페닌의 용량을 포착 개시 전에 직접 측부 귀 정맥을 통해 투여하였다.

앞쪽 및 뒤쪽 카메라의 기하 평균 데이터세트를 분석에 사용하였다. 간 ^99mTc-메브로페닌 섭취율을 관류에 대해 교정된, 2분에 걸친 ^99mTc-메브로페닌 섭취의 증가로서 계산하였다. 총 간 섭취를 총 간 ^99mTc-메브로페닌 섭취율로 나타내고, 분 당 주입된 용량의 백분율로서 계산하였다. 개별 ^99mTc-메브로페닌 섭취율은 분엽 활동의 분포를 기반으로 하여 꼬리쪽 간엽에 대해 계산하였고 t = -7일에서의 기준선 측정에 대하여 교정하였다.

조직학

간 조직(좌측 및 꼬리쪽 간엽)을 완충된 포르말린에 48시간 동안 고정시키고, 그 뒤 탈수하고 파라핀에 매립하였다. 간 조직의 4-마이크론 절편을 절단하고 표준 헤마톡실린 및 에오신 염료로 염색하였다. 절편을 표 1에 따라 소엽 및 문맥 염증에 대하여 점수를 매겼다. 추가로, 간 절편을 이전에 구체적으로 기술된 바와 같이, 간세포 증식을 정량하기 위해 Ki67 항체, 그리고 헤마톡실린 대조염색으로 염색하였다(van der Loos CM, et al. J Histochem Cytochem 2013; 61(1):11-8; Marsman HA, et al. Br J Surg 2013; 100(5):674-83). Ki67-양성 간세포는 군 할당에 대하여 블라인딩된 간병리학자(JV)에 의해 동물 당 총 5개 고출력장에서 계수하였다. 간 조직학은 제3일 및 제7일에 n=처치군 당 6에서 평가하였다.

임상 화학

혈청 알라닌 트랜스아미나아제(ALT), 아미노 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST), 감마-글루타밀 트랜스퍼라아제(γGT), 및 알칼리 포스파타아제(ALP)를 임상 화학 부서(Department of Clinical Chemistry)(Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands)에서 Cobas 8000 모듈러 분석기(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 처치군 당 12마리 동물로부터 얻어진 샘플에 대하여 측정하였다.

PCR (중합효소 연쇄 반응)

총 RNA를 말단 회장 및 (비)색전 간엽으로부터 Tri 시약(Ambion)을 사용하여 분리하였다. DNAseI(Promega, Leiden, the Netherlands)으로 처리 후, iSCRIPT cDNA 합성 키트(BioRad, Veenendaal, the Netherlands)를 사용하여 750 ng의 총 RNA를 cDNA로 전환시켰다. 정량적 RT-PCR(실시간 중합효소 연쇄 반응)을 IQ5 Cycler에서 SYBR 그린 케미스트리(SYBR Green MasterMix, BioRad) 및 7.5 ng 총 RNA 당량의 cDNA를 주형으로 사용하여 수행하였다. 발현 수준은 LinReg 소프트웨어(Ramakers C, et al. Neurosci Lett 2003; 339(1):62-6)를 사용하여 계산하였고 Rplp0, Hprt 및 Gapdh의 기하 평균으로 정규화하였다. 프라이머 서열은 표 2에 제공된다. 예상되는 생성물 크기는 아가로오스 겔 전기영동에 의해 점검하였다. PCR 분석은 제3일 및 제7일에 n=처치군 당 6에서 얻어진 조직을 사용하여 수행하였다.

통계적 분석

군 간의 비모수 데이터에서의 차이는 만-휘트니 U-검정((Mann-Whitney U-test) 또는 크러스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 검정을 사용하여 검정하였다. CLV 증가 또는 CrLV 저하에 대한 OCA의 효과는 만-휘트니 U-검정을 사용하여 곡선 아래 면적 분석에 의해 얻어진 값에 대하여 분석하였다. 혈장 실험실 값 사이의 차이는 반복 측정 ANOVA를 사용하여 분석하였다. 상관관계는 스피어먼의 순위 상관 계수를 사용하여 검정하였다. 모든 통계적 분석은 Graphpad Prism 6.0(Graphpad Inc, La Jolla, CA)을 사용하여 수행되었다.

결과: 오베티콜산은 간문맥 색전술 이후 간 재생을 가속화시킨다

동물은 머리쪽 간엽의 색전술을 받기 전 7일 동안 FXR 효능제인 오베티콜산(OCA)으로 전-처치되었다. 총(TLV), 꼬리쪽(CLV, PVE 이후 재생) 및 머리쪽 간엽(CrLV, PVE 이후 위축)의 용량을 실험 과정 동안 평가하였다. 동물을 PVE 3일 후 및 7일 후에 희생시켰다.

7일의 OCA 전처치는 PVE의 시기에 OCA의 적절한 조직 수준을 확보하기 위해 선택되었다.²⁴ 마우스에서, 콜산 풍부 식이는 FXR 의존적 방식으로 자발적 간 성장을 유도하였다(Huang W, et al. Science 2006; 312(5771):233-6). 따라서, 간 성장이 OCA에 의해 유도되는지 여부를 전-처치 시기(제-7일부터 제-1일까지)에 TLV(총 용량) 분석에 의해 먼저 평가하였다(Huang W, et al. Science 2006; 312(5771):233-6). 두 시점 모두에서, 체중에 대해 교정된 TLV는 군 간에 유사하였고, 두 군 다에서 시점 간에 유사하였다(도 11a; 데이터는 윌콕슨 부호 순위 검정(Wilcoxon matched-pairs signed rank) 및 만-휘트니 U-검정으로 분석하였다. N=군 당 17). 따라서, OCA는 자발적 간 성장을 유도하지 않았다.

다음에, PVE-유도 간 성장에 대한 OCA의 효과를 검사하였다. 비록 2마리 동물이 마취의 유도 및 장간막 정맥 캐뉼라 삽입 중에 기술적 문제로 인해 실험의 종결 전에 사망하였지만, PVE 절차는 잘 인용되었다. 이에 따라, 용량측정 데이터는 PVE 3일 후까지 34마리 토끼에서 이용 가능한 한편, 22마리 동물로부터의 데이터가 PVE 7일 후 간 용량 평가에 이용 가능하였다.

꼬리쪽 간엽의 간 비대는 PVE 3일 후 및 7일 후에 평가하였고 제-1일 값으로부터의 증가 백분율로서 표현하였다. PVE 3일 후, 꼬리쪽 비-색전 간의 용량은 OCA 군에서 비히클 대조와 비교하여 2.2-배 증가하였다(도 11b, 56.1±20.3% 대 26.1±15.4%, P < 0.001; 값은 제-1일에서의 용량에 대한 증가 백분율을 나타내고; 데이터는 개별 시점에서 곡선 아래 면적 값에 대하여 만-휘트니 U-검정을 사용하여 분석하였다. N=제3일까지 군 당 17, 그리고 N=제7일까지 군 당 11). PVE 7일 후, 꼬리쪽 간 용량에서의 증가는 OCA-처치 동물에서 1.5-배 더 높게 유지되어(102.0±38.2 대 67.6±17.7%, P = 0.02), OCA가 최초 7일에 간 재생을 가속화시키는 것을 나타낸다. 색전된 부분의 간 용량에서의 저하는 두 군 사이에 유사하였다(도 11c; 값은 제-1일에서의 용량에 대한 저하 백분율을 나타내고; 데이터는 개별 시점에서 곡선 아래 면적 값에 대하여 만-휘트니 U-검정을 사용하여 분석하였다. N=제3일까지 군 당 17, 그리고 N=제7일까지 군 당 11). 이론에 구애되지 않고, 이들 데이터는 OCA가 재생에 대하여 직접적 효과가 있고 색전된 머리쪽 간엽의 위축에 영향을 미치지 않는 것을 시사한다.

OCA에 의해 유도된 용량 증가는 실제 간 기능도 증가될 때에만 관련된다. 이것은 임상-수술 업무에 일상적으로 사용되는 간 기능에 대한 표지인 메브로페닌 섭취를 정량화하는 것에 의해 평가되었다. 메브로페닌의 총 간 섭취는 두 군 다에서 제-1일에 유사하였고 안정적으로 유지되었다(도 11d; 데이터는 반복 측정 ANOVA를 사용하여 분석되었다. N=군 당 6). 총 간 메브로페닌 섭취에 대한 비-색전된 꼬리쪽 간엽(CLF 할당)의 기여는 PVE 3일 후 및 7일 후 두 군 다에서 증가하였다. 그러나, 증가는 PVE 3일 후 OCA-처치 동물에서 더 컸으며(44.5±5.4% 대 36.0±3.7%, P=0.02), 이는 OCA가 비-색전된 간엽의 기능적 용량의 증가를 촉진하는 것을 나타낸다(도 11e; 데이터는 반복 측정 ANOVA를 사용하여 분석되었다. N=군 당 5 내지 6). OCA 처치 동물에서 상승된 용량 증가가 비대 또는 과형성을 반영하는지 여부를 검사하기 위해, 간 절편을 휴지기 간세포에서는 발현되지 않는 증식 표지 Ki67로 염색하였다. Ki67-양성 간세포의 증가된 수는 OCA 군에서 제+3일에 분명하였고, 제+7일에는 군들에서 수가 유사하였다. (도 11f; 데이터는 만-휘트니 U-검정을 사용하여 분석하였다). 증가된 간세포 증식은 이에 따라 OCA 처치 동물에서 PVE 3일 후 증가된 간 성장의 기저를 이룬다.

간 용량 계산에서 교란 변수로서 체중 변화를 배제하기 위해, 동물의 체중을 매일 측정하였다. 체중은 두 군 다에서 PVE 이후 유사한 정도까지 저하되었다(도 11g; 데이터는 반복 측정 ANOVA를 사용하여 분석하였다. N = 군 당 17). PVE 이전의 체중 증가는 두 군 다에서 유사하였고, 이는 OCA가 잘 인용되었음을 나타낸다.

도 9a 내지 9g에서, *는 군 사이에 p < 0.05를 나타내고, **는 P < 0.01을 나타내고, 그리고 ***는 P < 0.001을 나타낸다. 약어: OCA, 오베티콜산; TLV, 총 간 용량; CLV, 꼬리쪽 간 용량; CrLV, 머리쪽 간 용량; TLF, 총 간 기능; CLF, 꼬리쪽 간 기능.

요약

PVE 3일 후, OCA 군에서 CLV의 증가는 대조군보다 2.2-배 더 컸고(56.1±20.3% 대 26.1±15.4, P<0.001), 이 증가는 PVE 7일 후 유의미하게 더 높게 유지되었다(+1.5배, P=0.02). 제+3일에 꼬리쪽 간 기능에서의 증가는 OCA 처치 동물에서 더 컸다(+1.2배, P=0.02). Ki67-양성 간세포의 수는 PVE 3일 후 OCA-처치 동물에서 1.6-배 더 높았다(P<0.05). OCA- 및 비히클-처치 동물에서 혈장 트랜스아미나아제 수준은 유사하였고 H&E 절편에서 조직학적 점수 또한 두 군 다에서 유사하였다. 전사물 분석은 회장 및 간 FXR 활성화 둘 다를 보여주었다.

OCA는 토끼 모델에서 PVE 이후 간 재생을 가속화시켰다. OCA 처치는 이에 따라 PVE의 효능을 증가시키고, 이에 의해 주요 간 절제 이후 간 부전을 방지하고 절제 가능성을 증가시킬 수 있을 것이다.

이 연구는 OCA가 과형성 작용을 통해 PVE 이후 최초 3일에 걸쳐 비-색전 부분의 용량 증가를 가속화시키는 것을 보여준다. OCA는 간 재생을 증진시키는 약리학적 개입으로서의 가능성을 갖는다.

오베티콜산은 주목할 만한 간세포 및 담관 손상과 관련되지 않는다.

OCA 처치가 간 손상을 초래하는지 여부를 검사하기 위해, 실험 과정 동안 트랜스아미나아제 수준을 측정하였다. PVE는 두 군 다에서 제+1일에 피크 수준으로 ALT 및 AST의 일시적인 상승을 유도하였고, 이후 기준선 값으로 복귀하였다(도 12a 및 12b). 수준은 측정 내내 군 사이에 유사하였다(도 12a 및 12b). γGT 및 ALP 또한 PVE 전에 두 군 다에서 안정적으로 유지되었다. PVE 이후 γGT 및 ALP는 OCA 처치 동물에서 약간 더 높았으나, 수준은 두 군 다에서 PVE 이후 기준선 위로 증가하지 않았다(도 12c, 12d). 이들 결과는 OCA가 간세포 손상 또는 담즙정체를 야기하지 않았음을 보여준다. 도 12a 내지 12d에서 데이터는 n=군 당 5 내지 11에서 평균(±SEM)으로 제시된다. 군 간의 차이는 이원 변량분석(two-way ANOVA)을 사용하여 검정하였다. *는 P < 0.05를 나타내고, **는 P < 0.01을 나타낸다.

간 조직학에 대한 OCA의 잠재적 영향을 검사하기 위해, 꼬리쪽 간엽의 H&E 염색된 절편을 맹검 방식으로 점수를 매겼다. 경도의 문맥 및 소엽 염증 및 경도의 동양혈관 팽창이 군 간에 차이 없이 모든 동물에서 관찰되었다(도 12e; 데이터는 n=군 당 5 내지 6에서 중앙값(범위)으로 제시되고; 두 군 다에서 대표적인 간 절편은 제3일 및 제7일에 H&E 염색으로 100Х 배율임). 꼬리쪽 간엽에서 일부 색전 물질의 역류에 의해 야기되는 이물질 반응이 총 4마리 동물에서 관찰되었으며, 대조군에서 2마리는 제3일에 희생시켰고, OCA 군에서 1마리는 제3일에 희생시켰고 OCA 군에서 1마리는 제7일에 희생시켰다. 이것은 군 간에 차이가 없었고 색전 물질의 역류는 간 비대에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다. 소형 액적 거대공포성 지방증이 군 간의 차이 없이 두 군 다에서 제3일 및 제7일에 관찰되었고, 이는 부분 간절제의 마우스 모델에서 경도 지방증의 이전의 관찰과 일치한다(Dai G, et al. Hepatology 2008; 47(4):1277-87).

OCA는 회장 및 간 FXR을 활성화시킨다

OCA의 전사적 영향을 평가하기 위해, FXR 표적 유전자 발현을 PVE 3일 후 및 7일 후에 수확된 말단 회장 및 간에서 분석하였다. FXR은 말단 회장 및 간 둘 다에서 발현되고, 둘 다 토끼에서 간 재생에 기여하는 것으로 생각된다(Borude, et al. Hepatology 2012; 56(6):2344-52; Zhang, et al. Hepatology 2012; 56(6): 2336-43).

OCA는 Fxr의 회장 발현에 대해서는 그 자체로 영향을 미치지 않지만, 제+3일에 회장 Shp의 유도를 야기하였다(도 13a; 동물은 7일 동안 오베티콜산(OCA)으로 전-처치되었고 머리쪽 간엽의 색전술을 받았다. 말단 회장(패널 a) 및 꼬리쪽 간(패널 b)을 PVE 3일 후 및 7일 후에 희생시 수확하였다. 유전자 발현을 RTqPCR로 분석하였다. 데이터는 비히클 군과 비교하여 발현 배수로서 표현된다. 데이터는 n=군 당 5 내지 6에서 평균(±SEM)으로 제시된다. 군 사이에서 *은 P < 0.05를 나타내고 **는 P < 0.01을 나타낸다). 이것은 Fxr의 표적 유전자인 Shp와 연관된다. Ostβ의 회장 발현은 설치류 및 인간에서 Fxr에 의해 조절되는 것으로 보고되었지만(Landrier, et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006; 290(3):G476-85; Zollner, et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006; 290(5):G923-32), OCA에 의해 영향을 받지 않았다. 담즙산염 합성 효소 Cyp7a1의 간 발현은 OCA 처치 동물에서 제+3일에 강하게 억제되었다(도 13b). 이것은 리프레서 Shp의 전사적 유도 없이 일어났으며, 이는 Shp 비의존성 Fgf19 신호전달이 Cyp7a1의 관찰된 억제의 원인이 될 수 있음을 시사한다. Fgf19에 대한 간 수용체는 Fgfr4 및 βKlotho에 의해 형성된다. Fgfr4의 발현은 OCA 처치에 의해 영향을 받지 않았고, 전사 수준에서 약한 하향 조절이 3일 후 βKlotho에서 관찰되었다(도 13b). 이들 발견은 회장 Fgf19의 OCA-매개 유도에 의한 Cyp7a1의 하향조절과 일치한다.

OCA 처치는 제+7일에 감소된 간 Fxr 발현을 초래하였다. 간에서 Ostβ 발현은 제+3일에 OCA 처치 동물에서 상승하였다. 정반대로, 회장 Shp 발현은 OCA에 의해 유도되는 한편, 이것은 간에서 관찰되지 않는다. 최종 OCA 투여와 희생 사이의 기간은 9 내지 12시간 범위였고, 일관된 장-기간 전사적 영향을 관찰하는 데 차선일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 유전자 발현 분석으로부터의 발견의 종합은 OCA 처치가 회장 및 간 FXR 둘 다의 활성화를 초래하는 것을 나타낸다.

논의

이 연구에서는 PVE의 토끼 모델에서 강력한 FXR 효능제인 OCA의 간 재생에 대한 효과를 검사하였다. 비히클 대조와 비교하여 OCA-처치 동물에서 PVE 3일 후에 CLV에서의 2.2-배 증가 및 7일 후에 CLV에서의 1.5-배 증가에 의해 입증되는 바와 같이, OCA는 PVE 7일 후 간 재생을 가속화시켰다. 또한, 간담도 신티그래피는 OCA 처치 동물에서 PVE 3일 후 꼬리쪽 간엽의 증진된 섭취 용량(1.2배, P=0.02)을 밝혔다. 이것은 Ki67+ 간세포 수에서의 증가를 수반하였고, 이는 PVE 플러스 OCA가 OCA 없는 PVE보다 더 강력한 과형성 반응을 이끌어낸 것을 나타낸다. OCA에 의해 유도된 가속화된 간 재생은 큰 임상적 가능성을 보유한다.

현재의 데이터는 강력한 FXR 효능제 OCA가 표준화된 토끼 모델에서 PVE 3일 후 꼬리쪽 간엽의 용량 증가를 강력하게 상승시킨 것을 보여준다. 증가된 용량은 증식성 표지 Ki67에 대한 증진된 간세포 양성으로부터 추론된 과형성에 기인한다. 이들 결과는 OCA가 PVE로부터 간 절제까지의 시간을 감소시킬 수 있을 것임을 나타내는데, 이는 PVE 이후 화학요법의 필요성을 회피하는 것과 같은 몇 가지 이점을 가질 수 있을 것이다. 더욱이, OCA는 PVE에 대한 간의 성장 반응을 개선시킬 수 있을 것이고, 이는 매우 작은 FLR로 환자의 절제 가능성을 증가시킬 수 있을 것이다. 또한, 이들 결과를 간절제에 대하여 추론할 때, OCA에 의한 증가된 간 재생은 절제후 간 부전을 방지할 수 있을 것이다. 환자는 확장된 간 절제 이후 첫날에 가장 간 부전이 생기기 쉽고(Etra JW, et al. HPB (Oxford) 2014; 16(10):875-83), 간 재생의 조기 개시는 더 낮은 간 부전의 발생과 관련된다(Shirabe K, et al. Scand J Surg 2013; 102(2):101-5). 이들 첫날에 증진된 간 재생을 통해, OCA는 간 부전의 위험 및 그 결과로써 일어나는 질병율 및 사망율을 감소시키는 데 있어서 혜택을 준다.

용량 및 기능의 증가, 그리고 증가된 수의 Ki67+ 간세포는 가속화된 재생을 나타내고, 이는 PVE 3일 후에 가장 현저하였다. 본 발명자들은 환자에서 FRL의 기능적 증가가 PVE 이후 용량 증가를 앞서는 것을 이전에 보여주었다(de Graaf W, et al. Br J Surg 2011; 98(6):825-34). 따라서, OCA-처치 동물은 제+3일에서의 간 기능 평가 이전에 PVE 이후 초기 시기에 이미 대조군 동물보다 증가된 섭취 용량을 가질 수 있을 것이다. 토끼에서의 더 높은 대사율과 관련하여, 간의 재생은 인간에 비해 토끼에서 더 높은 속도로 일어나는 한편, 마우스 및 래트에서는 대사가 토끼보다 훨씬 더 높다(West GB, et al. J Exp Biol 2005; 208(Pt 9):1575-92). PVE 7일 후 비히클 처치 토끼에서 67 내지 71%의 CLV에서의 중앙값 증가(van den Esschert, et al. Ann Surg . 2012; 255(2):311-8)는 분엽(segment) 4를 포함하는 PVE를 받은 일련의 선택된 환자에서 34일의 중앙값 이후 향후 잔존 간 용량의 62% 증가에 필적한다(Shindoh J, et al. J Am Coll Surg 2013; 217(1):126-33; discussion 133-4). ALPPS의 세팅에서, PVE 7일 후의 CLV 증가는 ALPPS의 최초 단계 9일 후의 중앙값 시기 이후 FRL 용량에서의 74% 증가와 부합한다(Shindoh J, et al. J Am Coll Surg 2013; 217(1):126-33; discussion 133-4). 이에 따라, 토끼에서의 7일은 인간에서 PVE 4 내지 5주 및 ALPPS 이후 9일과 유사하다. 이들 시간 간격에서, OCA는 인간에서 재생 과정을 잠재적으로 가속화시킨다.

OCA는 간 재생을 효과적으로 증진시키는 약리학적 개입으로서 사용될 수 있다. PVE의 토끼 모델에서 OCA를 사용하는 것은, 조직학 및 혈장 트랜스아미나아제에 의해 평가된 바와 같이 간 손상의 징후 없이 간 용량, 간 기능 및 간세포 증식 측면에서 가속화된 간 성장이 달성될 수 있음을 보여줄 수 있다. OCA는 PVE의 효능을 증가시키고 PVE로부터 간 절제까지의 시간을 감소시킬 뿐 아니라, 주요 간절제 이후 절제후 간 부전의 예방에서 가능성을 갖는다[Olthof,et al. 2016 공개를 위해 제출됨].

실시예 5a. 토끼에서 간문맥 색전술( PVE )에 대한 오베티콜산의 효과

담즙산염 신호전달은 간 조직의 수술적 손실 이후 보상적 간 재성장을 위해 요구된다. 담즙산염 수용체 FXR은 이 과정에서 중요한 역할을 한다. 이 연구에서 본 발명자들은 확장된 간 수술 계획이 있는 환자에서 향후 잔존 간 용량을 증가시키기 위한 개입인 간문맥 색전술(PVE) 이후 재생 반응에 FXR이 연루되는지 여부를 탐색하였다.

방법

성체 암컷 토끼는 머리쪽 간엽의 색전술(제0일) 이전 및 이후 7일 동안 비히클 또는 FXR 효능제 오베티콜산(OCA; 10 mg/kg, 매일 경구 위관 영양)을 받았다. PVE의 유효성은 문맥조영술에 의해 확인되었고, 꼬리쪽 간 용량(CLV)은 CT-용량측정 분석에 의해 제-7일, 제-1일, 제+3일 및 제+7일에 분석하였다. 토끼는 제+3일 및 제+7일에 희생시켰다(n=군 당 5 내지 6).

결과

OCA는 PVE 3일 후 CLV에서 더 큰 증가를 유도하였고(59.3±19.2% 대 대조에서의 29.7±16.1%, P=0.001), 7일 후 두 군 다에서 유사한 용량 증가를 얻었다. 두 군 다에서, PVE는 3시간 후 수준이 증가하고 제+3일에 정상화되는 유사한 패턴의 혈청 담즙산염 상승을 야기하였다. 제+3일에 수확된 조직의 분석에서는, 간 담즙산염 함량이 OCA-처치 동물의 비대된 부분에서 감소한 것을 밝혔다(60.1[IQR 16.0] 대 대조에서의 100.1[IQR 75.1] nmol/g; P=0.016)(도 14). 담즙산염 합성 효소 Cyp7a1의 감소된 발현(-7.1배; P=0.004) 및 기저측 담즙산염 유출 펌프 서브유닛 Slc51b의 증진된 발현(+6.5배; P=0.004)이 이러한 저하에 기여했을 수 있다. 유사분열로의 진입을 위해 요구되는 포스파타아제인 Cdc25b의 발현은 OCA-처치 동물의 비대 간 분엽에서는 증가하였지만(+1.6배; P=0.006) 위축 간 분엽에서는 그렇지 않았다(+1.1배; P=0.52). 비-색전 분엽에서의 Cdc25b 발현은 제+3일에 FXR 표적 유전자 Slc51b(ρ=+0.80, P=0.002) 및 Cyp7a1(ρ=-0.62, P=0.033)와 상관되었고, CLV에서의 증가 백분율과 관련되는 경향이 있었다(ρ=+0.57, P=0.055)(도 15).

OCA는 과형성 효과를 통해 꼬리쪽 간엽의 PVE-유도 용량 증가를 가속화시켰다. OCA는 팽창하는 꼬리쪽 간엽에서 담즙산염 함량을 저하시켰다. 감소된 담즙산염 합성(Cyp7a1) 및 증진된 담즙산염 유출(Ostb)이 감소된 꼬리쪽 담즙산염 함량에 기여할 수 있다. OCA는 꼬리쪽 엽에서 유사분열로의 진입에 요구되는 포스파타아제인 Cdc25b의 발현을 증진시켰다. 이는 FXR-조절 유전자의 발현과 상관되었고, CLV 증가와 관련되는 경향이 있다.

결론

OCA는 토끼에서 PVE 이후 최초 3일에 간 재생을 가속화시켰고, 대조 및 OCA-처치 동물은 7일 후 비-색전 분엽에서 유사한 용량 증가를 가졌다. 개선된 담즙산염 항상성 및 증식 유전자(예를 들어, Cdc25b)의 유도는 PVE 이후 초기 단계에서 증가된 성장률의 기저가 될 수 있다.

OCA 처치는 간 병변의 절제 가능성을 확장시키고 절제-후 간 부전의 예방에 서 가능성을 갖는다.

실시예 6. FXR 효능제 오베티콜산은 폐색성 담즙정체가 있는 래트에서 간 성장을 유도한다

재료 및 방법

동물

성체 수컷 비스타(Wistar) 래트(300-325 g)를 Harlan(Horst, the Netherlands)으로부터 구입하여, 1주일 동안 적응시키고, 표준화된 실험실 조건 하에 수용하여(12시간 광-암 주기, 실온=21±2℃, 습도=50±10%) 물과 사료(Hope FarmsWoerden, the Netherlands)에 무제한 접근하도록 하였다. 각각의 수술 절차 전에, 동물은 0.025 mg/kg의 부프레노르핀을 마취제로서 피하로 받았고, 이후 공기/O₂의 혼합물(1:1 용량비, 2 L/분) 및 2 내지 3%의 이소플루란(Forene, Abbott Laboratories, Chicago, IL)으로 전신 마취를 유도하고 유지하였다. 모든 래트의 중심 체온은 절차 동안 발열 매트 및 가열 램프로 37.0±0.2℃로 유지시켰다[NRC 2011].

실험 디자인

적응 시기 이후, 래트를 규정 사료 식이를 지속하거나 메티오닌 및 콜린-결핍(MCD) 식이(Harlan Teklad, Madison, WI)로 3주 동안 전환하여 중등도 간 지방증을 유도하였다[Heger 2011a]. 제2 식이 주간의 시작에, 래트는 모의 수술을 받거나 가역적 담관 결찰(rBDL)을 받았다. rBDL을 위해, 간외 담관에 폐쇄된 원위 팁을 갖는 실라스틱 튜브(Silastic Tubing)(길이=±7.5 cm, 내경=0.8 mm, 외경=1.4 mm, Dow Corning, Midland, MI)에 연결된 폴리에틸렌 카테터(길이=±1.5 cm, 내경=0.4 mm, 외경=0.9 mm, Braun, Melsungen, Germany)와 캐뉼러를 삽입하였다[Kloek 2008]. 모의 수술을 받은 동물은 담관 폐색을 유도하지 않는, 담관 이동을 포함하는 복부 수술을 받았다. rBDL 래트의 군은 비처치로 두거나 매일 오전 7:30 내지 9:00 사이에 FXR 효능제 오베티콜산(OCA, 0.5% 메틸셀룰로오스 중 10 mg/kg, 체중 300 g 당 1.5 mL)의 경구 위관 영양을 받았다.

BDL 또는 모의 수술 7일 후, 모든 래트는 70% PHx를 받았다[DeGraaf 2011]. 모든 rBDL 래트에서, PHx 직전에 닫힌 캐뉼러 팁을 제거하고 캐뉼러를 십이지장으로 삽입하는 것에 의해 장관 담즙 흐름을 회복시켰다. 모든 처치군의 동물은 PHx 이후 규정 사료를 섭취하였다. OCA 처치는 PHx 이후 희생시까지 계속되었다. 도식 1에 나타낸 바와 같이, 연구는 다음 5개 실험군(n=시점 당 군 당 4 내지 6마리 동물)으로 구성되었다: 대조군(모의), 지방증(MCD), 담즙정체(rBDL), 지방증과 담즙정체 조합(rBDL+MCD), 및 담즙정체+OCA(rBDL+OCA).

도식 1은 연구 디자인의 도식적 개요를 보여준다. 130마리 래트를 5개 연구 부문으로 분류하였다. 동물을 부분 간절제(PHx, 즉 희생 제0일) 전 또는 PHx 1 내지 5일 후에 희생시켰다(n=4 내지 6/군). rBDL 군에서, 담도 배액술은 PHx 직후 수행되었다(rBDL = 가역적 담관 결찰; Chol. = 담즙정체; MCD = 메티오닌 및 콜린-결핍 식이; OCA = 오베티콜산; rBDL = 가역적 담관 결찰; steatochol. = 단순 지방증 및 담즙정체의 조합).

기준선(즉, PHx 직전) 및 PHx 1 내지 5일 후에, 동물을 이소플루란 마취 하에 실혈에 의해 안락사시켰다. 혈액 샘플을 대정맥으로부터 헤파린-항응고화 진공채혈관(BD, Franklin Lakes, NJ)에 수집하고 10분 동안 원심분리하였다(3000×g, 4℃). 기준선에서 희생시킨 rBDL 동물에서, 담즙을 확장된 간외 담관으로부터 시린지로 흡입하고, 중량을 달고 -80℃에 저장하였다. 간 및 회장을 절제하고, 중량을 달고, 로핑하고(loafed), 10%(vol/vol) 중화시킨 포르말린 용액(J.T. Baker, Center Valley, PA)에 고정시켜 액체 질소에서 급속-동결하고 -80℃로 저장하거나, RNAlater(Qiagen, Venlo, the Netherlands)에 수집하여 -20℃로 저장하였다. 간 재성장을 재생된 간 질량으로부터 계산하고, PHx 이전 총 간 질량의 백분율로서 표현하였다. 예상된 잔존 간 질량을 절제된 간 분엽의 중량을 사용하여 계산하였으며, 이는 총 간 질량의 70%를 나타낸다. 간 수분 함량에 대하여 교정하기 위해 건조 간 중량을 측정하였다[Kloek 2010a].

조직학

포르말린 고정 후, 간 표본을 탈수시키고, 파라핀-매립하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E), 콜라겐 유형 I 및 III 염료 피크로시리우스 레드, 또는 증식 표지 Ki67으로 염색하였다[Marsman 2013]. H&E- 및 피크로시리우스 레드-염색된 간 조직학의 반-정량 분석은 표 1에 상술된 채점 시스템을 사용하여 실험군에 대하여 블라인딩된 숙련된 간병리학자(JV)에 의해 수행되었다. Ki67-양성 간세포 핵은 4개의 무작위-선택된 현미경 필드에서 200× 배율로 2 관찰자(RFG 및 PBO)에 의해 수동으로 계수되었다.

정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응

전사적 분석을 수행하였다[Olthof 2015]. 간 샘플을 MagNA Lyser로 균질화하고 총 RNA를 고순도 RNA 조직 키트(High Pure RNA Tissue Kit)(둘 다 Roche Applied Sciences, Penzberg, Germany)로 추출하였다. 제조자의 지침에 따라 SensiFAST cDNA 합성 키트(Bioline, London, UK)를 사용하여 1 ㎍의 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. SensiFAST SYBR No-ROX 믹스(Bioline)를 사용하여 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응을 LightCycler 480(Roche, Basel, Switzerland)에서 수행하였다. 형광 데이터를 처리하고 분석하여 회장 샘플에 대해서는 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Hprt), 그리고 간 샘플에 대해서는 유비퀴틴 C(Ubc) 및 베타-2-마이크로글로불린(B2m)의 기하 평균으로 정규화하였다. 이들 참조 유전자는 실험군 및 시점에서 가장 안정한 것으로 입증되었다(데이터 미도시). 프라이머는 NCBI Primer Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용하여 인트론 또는 엑손-엑손 접합을 포괄하고 잔류 게놈 DNA의 증폭을 방지하도록 디자인하였다(표 2). 녹는 곡선 분석 및 아가로오스 겔 전기영동을 사용하여 프라이머 특이성을 검증하였다.

사이토카인 측정

Diax 900 조직 균질기(Heidolph, Schwabach, Germany)를 사용하여 ±100 mg의 래트 간을 얼음 위에서 프로테아제 억제제 칵테일(cOmplete ULTRA, Roche)을 함유하는 1400 ㎕의 5 mM NaPi 완충액(pH = 7.4) 중 균질화하였다. 균질액을 10분 동안 10,000×g(4℃)에서 원심분리하고 상등액 중 TNF-α 및 IL-6 수준을 키트 매뉴얼(R&D systems, Minneapolis, MN)에 따라 ELISA로 측정하였다. 사이토카인 농도는 균질액 단백질 함량으로 정규화하였다(Protein Assay Kit, Pierce, Rockford, IL).

담즙산 풀 조성물의 고성능 액체 크로마토그래피 분석

담즙산을 분리하고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정량하였다[Lionarons 2016]. 담즙 또는 혈장 샘플(20 μL)을 5용량의 아세토니트릴의 첨가에 의해 제단백하였다. 원심분리(20,000×g에서 10분)한 후, 용매를 상등액으로부터 증발시키고 담즙산염을 200 μL의 25% 메탄올에 용해시켰다. 간 균질액을 위해, 100 mg의 간 조직을 30 내지 90초 동안 500 μL의 물 중에서 초음파처리하였다. 1 mL의 아세토니트릴을 첨가하여 단백질 침전을 얻었다. 그 후 샘플을 20,000×g에서 10분 동안 원심분리한 후, 상등액을 분석에 사용하였다. 결과는 균질액 단백질 함량에 대하여 정규화하였다. 100 μL의 샘플을 20℃에서 가동되는 Hypersil C18 HPLC 컬럼(Thermo Scientific, Waltham, MA)에 적용하였다. 출발 용출액은 6.8 mM 포름산암모늄(pH=3.9)으로 구성되고, 이어서 다음 농도의 아세토니트릴로 선형 구배 또는 등용매 용출로 하였다: 28%(1분), 38%(13분), 42%(19분), 61%(20분), 63%(25분), 80%(28분), 80%(31분) 및 0%(33분). 유속은 0.8 mL/분이었다. 검출은 Nano Quantity Analyte Detector QT-500(Quant Technologies, Blaine, MN)를 사용하여 실시하였다. 담즙산은 종류 당 별도의 교정 곡선을 사용하여 정량하였다. 담관 담즙산 농도를 총 담즙 용량과 곱하여 담관 담즙산 산출량을 계산하였다.

통계적 분석

모든 통계적 분석은 0.05의 유의 수준(α)에 따라 GraphPad Prism(버전 6.0, La Jolla, CA)으로 수행되었다. 모든 수치 변수는 (대략적으로) 가우스 분포를 따르는 것으로 가정되었고, 이에 따라 스튜던트 t-검정 또는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 터키 사후 교정(Tukey's post-hoc correction)으로 분석하였다. 대응표본 변수(paired variables)는 대응표본 t-검정(paired t-test)을 사용하여 분석하였다. 조직학 점수는 카이-제곱 검정(chi-square tests)을 사용하여 분석하였다. 상관관계는 피어슨 적률 상관 계수(Pearson product-moment correlation coefficient)를 사용하여 검정하였다.

결과

폐색성 담즙정체는 부분 간절체 후 간 재생을 손상시킨다

간 재생은 종종 건강한 간을 갖는 동물에서 연구되는데, 이는 화학요법, 지방증, 담즙정체, 또는 이들 인자의 조합이 발생된 간을 갖는 환자가 우세한 수술 실무와 극명한 대조를 이룬다. 이들 병태는 간 재생을 손상시키고 수술-후 결과에 부정적인 영향을 미치기 때문에[DeMeijer 2010; Farges 2013; Hubert 2015], 첫 번째 목적은 실질조직 병리의 다양한 병태 하에 70% PHx 이후 간 재생을 조사하는 것이었다. PHx 이전 실질조직 염증에 대한 rBDL 및 MCD 처치의 효과는 이전에 보고되었다[Lionarons 2016].

도 16은 건강한 래트 간이 PHx 5일 후 이들의 원래 질량의 대략 90%까지 재생된 것을 보여준다(도 16a, 두 번째, 대조군 곡선). 단순 지방증을 갖는 래트 간은 비손상된 간만큼 효과적으로 재생되었는데(도 16a, 첫 번째, MCD 곡선), 이는 더 일반적인 단순 지방증보다는 지방간염이 간 재생을 위태롭게 한다는 초기 발견을 입증한다[Marsman 2013; Reiniers 2013; Reddy 2012; Farrell 2002]. 대조적으로, 간 재성장은 단순 지방증이 있거나 없는 rBDL 동물에서 현저하게 손상되었다(도 16a 내지 16c). 이들 군에서 손상된 간 재생은 이미 PHx 1일 후에 분명하였다(도 16a 및 16b). rBDL 간의 성장은 PHx 2일 후 침체되었고 초기 간 질량의 60%를 넘지 못했는데, 이는 다른 연구 부문보다 더 낮았다(도 16a 및 16c).

간 재생의 패러다임과 관련하여[Fausto 2006; Michalopoulos 1997], 일탈된 재성장률이 PHx 후 사이토카인 생산과 관련되는지 여부를 결정하기 위해 사이토카인 Il-6 및 Tnf-α의 간 수준을 정량하였다. 이전부터 존재하는 염증에 고유하게[Lionarons 2016], 간 사이토카인 수준은 실질조직 간 질환이 있는 모든 동물에서 PHx 이전에 이미 상승하였다(도 16d 및 16e). Il-6 및 Tnf-α는 기준선과 비교하여 건강한 래트에서 PHx 1일 후에 증가한 반면, 다른 연구 군에서는 이 증가가 관찰되지 않았다(도 16d 및 16e). PHx 이후 사이토카인 급증의 결여는 이전부터 존재하는 실질조직 간 손상이 있는 래트에서 간 재성장의 결함에 기여할 수 있을 것이다. 재생 프로파일(도 16a)을 기반으로, 나머지 실험은 rBDL 동물에서 PHx 이후간 재생을 개선시키는 것에 초점을 맞추었다.

오베티콜산은 간 절제 전 담즙정체 래트에서 간 성장을 유도한다

rBDL 래트의 감소된 재생 가능성(도식 1)은 중단된 장 BA 전달 및 간내 BA 축적과 관련된 독성에 의해 야기되는 철폐된 장 Fxr 신호전달로부터 초래되는 것으로 보인다. rBDL 래트에서 손상된 간 재생은 FXR 효능제 OCA의 경구 투여를 통해 장 FXR 신호전달을 회복시키는 것에 의해 개선될 수 있을 것이다.

PHx 이전에 희생시킨 동물의 총 간 질량은 대조군과 비교하여 rBDL 군 둘 다에서 더 높았다(도 17a). 그러나, 간 수분 함량(예를 들어, 염증성 부종에 기인하는)에 대한 교정 후, 증가된 간 질량은 OCA-처치 동물에서만 관찰되었고(도 17b), 이는 rBDL-유도 담즙정체가 염증과 관련된다는 것(Lionarons, et al. Sci Rep. 2016, 6:31829), 그리고 OCA가 간 성장을 자극한다는 것이 확인한다. 따라서, Ki67 염색에 의해 측정된 간세포 증식 및 Ccnd1에 의해 암호화되는 세포 주기 표지 CyclinD1의 발현은 비처치 rBDL 또는 비-담즙정체 동물과 비교하여 rBDL+OCA 군에서 더 확연하였다(도 17c 내지 17e). Ki67 염색 및 Ccnd1 발현도 둘 다 건조 간 질량과 양으로 상관되었다(도 18a 내지 18c). 비-손상된 간에서 간세포는 정지 상태에 있으므로(도 17c 및 17d), 이들 결과는 rBDL 군에서 증식이 담즙정체성 간 손상의 복구를 목적으로 하는 간 항상성 반응의 일부임을 시사한다. 그러나, 증식성 신호전달에도 불구하고, 간 과형성은 OCA 처치가 없는 7-일 rBDL 시기 동안 일어나지 않았다(도 17b).

OCA-유도 간세포 증식은 직접적(간) 경로 및/또는 간접적 장 경로를 통해 진행된다고 한다. 직접적 경로는 간세포 Fxr 표적 유전자 Foxm1에 의해 매개되는데[Zhang 2012], 이는 세포 주기 진행을 매개하고 PHx 이후 효과적인 간 재생에 필수적이다[Huang 2006; Chen 2010c; Wang 2002a]. 간접적 경로는 장 Fxr-연계된 유사분열촉진 Fgf15의 생산 및 간 Fgfr4를 통한 신호전달을 포함한다[PadrissaAltes 2015; Kong 2014; Uriarte 2014]. 간접적 경로가 간 Foxm1b 발현을 또한 증가시키는지 여부에 대해서는 의견 일치가 없다는 점이 주목되어야 할 것이다[Zhang 2012; PadrissaAltes 2015].

Fxr 및 Foxm1의 간 발현 수준은 두 rBDL 군 사이에 유사하였다(도 17e). 따라서, 직접적 경로는 아마도 OCA에 의해 유도되는 증식성 신호전달의 원인일 것 같지 않다. 대조적으로, 회장 Fgf15 전사는 OCA를 받은 rBDL 래트에서 강하게 상향조절되었고(대략 20배), 이것은 Fxr 표적 유전자 Shp의 현저한 상향조절과 일치하였다(도 17f). 따라서, OCA 처치는 회장 Fxr 자체의 약간의 하향조절과 함께 장 Fxr의 활성화로 이어졌다. 회장 Fgf15 및 Shp 발현은 비처치 rBDL 동물에서 강하게 억제되었고(도 17f), 이는 rBDL 이후 회장 Fxr 리간드(즉, BA)의 전달 실패에 기인하는 것으로 보인다[Naugler 2014]. Fgf15은 간세포에서 이의 동족 (공동)수용체 Fgfr4 및 βKlotho에 결합하고, 이는 Stat3 경로의 활성화를 통한 증식성 신호전달로 이어진다[PadrissaAltes 2015]. 비록 Fgfr4가, 아마도 음성 피드백 루프를 통해[Fong 2003; Wong 2002], 전사 수준에서 하향조절되었음에도 불구하고(도 17e), Stat3은 상당히 상향조절되었고(도 17e), 이는 Fgfr4를 통한 신호전달이 여전히 유효하였음을 시사한다. 따라서, Fgfr4 전사 수준은 건조 간 질량에 음으로 상관된 한편, Stat3 전사 수준은 강한 양의 상관관계를 나타냈다(도 18). 위의 발견은 OCA로 처치된 rBDL 래트에서 간 성장에서의 장-간 축의 연루를 지지한다.

도 17a 내지 17f는 오베티콜산이 간 절제 전 담즙정체 래트에서 간세포 증식 및 간비대를 유도하는 것을 보여준다. 구체적으로, 도 17a 및 17b는 대조(모의 수술) 및 rBDL 7일 후 또는 OCA 처치 추가의 총 간 중량(간 중량은 체중의 백분율로서(a) 또는 체중 300 g 당 건조 중량으로서(b) 표시됨); 대표적인 Ki67-염색 간 절편(c) 및 Ki67 양성의 정량적 평가(d); 및 간(e) 또는 회장(f)에서 증식- 및 Fxr-관련 유전자의 발현 수준을 보여준다(여기에서, BW = 체중; FOV = 시계; OCA = 오베티콜산; rBDL = 가역적 담관 결찰(담즙정체). *는 p < 0.05를 나타내고, **는 p <0.01을 나타내고, 그리고 ***는 p < 0.001를 나타내는데, 모두 대조군에 대한 것이다. ^#는 p < 0.05를 나타내고, ^##는 p < 0.01을 나타내고, 그리고 ^###는 p < 0.001을 나타내는데, 모두 실선으로 표시한 실험군에 대한 것이다).

부분 간절제 후 간 재성장은 오베티콜산을 받은 담즙정체-후 래트에서 정지된다

OCA가 담즙정체성 간의 크기를 증가시키는 것이 확립된 후, OCA가 또한 70% PHx 이후 간 재생을 가속화시키는지 여부가 조사되었다. 예상치 못하게, 간 재성장은 OCA-처치 rBDL 동물에서 비처치 rBDL 및 대조군 래트와 비교하여 정지되었다(도 19a). 이러한 예상치 못한 발견에 대한 두 가지 가능한 설명이 있다. 첫째로, Fgfr4 발현은 PHx 날에 현저하게 하향조절되었다(도 19d). 따라서, OCA 군에서 더 느린 간 질량의 회복은 유사분열촉진 Fgf15 신호전달의 감소된 전달로부터 야기될 수 있을 것이다. Fgfr4 전사 수준이 대조군 및 비처치 rBDL 동물에서 PHx 1일 후 상승되었다는 발견은 이러한 사고 방식을 지지한다(도 19d, 아래 논의됨). 더욱이, OCA로 처치되지 않은 rBDL 래트에서 PHx 이후 Fgfr4의 조기 도입은 PHx 2일 후 Fgfr4 mRNA 수준의 급격한 저하가 뒤따르는데, 이는 간 재성장의 중단과 일치한다(도 19ad). 둘째로, PHx 시기에 잔존 간의 건조 중량은 다른 두 군보다 OCA 군에서 이미 더 높았다(도 19b). 간 재생의 속도가 제거된 간의 양에 비례하고, 따라서 잔존 간의 크기와 역으로 관련되므로[Michalopoulos 1997; Yamanaka 1993], OCA-처치 동물에서 PHx 이후 감소된 재성장률은 절제 전 간 크기의 팽창으로부터 야기되었을 수 있다. 이러한 전제와 관련하여, rBDL+OCA 래트의 간-대-체중 비율은 PHx 5일 후 대조군 동물과 유사하였다(도 19b). 이 비율은 비처치 rBDL 군에서 대조군에 비해 더 낮게 유지되었고, 이는 OCA 군에서 더 느린 재생률은 궁극적으로 간 질량 회복의 정도를 위태롭게 하지 않았음을 나타낸다.

이들 발견을 더 정밀하게 조사하기 위해, FXR-관련 유전자의 발현 및 증식 파라미터를 PHx 이후 최초 5일을 모니터링하였다. Fgfr4와 별개로, 간 Fxr은 대조군 및 비처치 rBDL 래트에서 PHx 1일 후 현저하게 상향조절되었다(도 19d). 이들 군에서 동시적인 Ccnd1의 유도(도 19d) 및 Ki67⁺ 간세포의 출현(도 19c)은 Fxr-Fgf15-Fgfr4 신호전달 축이 간 재생에 요구된다는 이전의 개념을 지지한다(Uriarte, et al. Gut. 2013, 62(6):899-910; Naugler PLoS One. 2014, 9(5):e97426). 따라서, PHx 2일 후 비처치 rBDL 동물에서 정체된 재성장은 Fxr 및 Fgfr4 발현의 손실과 병행되었다(도 19a 내지 19d). 이러한 발견은 담즙정체성 간에서 재생의 고갈을 설명할 뿐만 아니라, 간 재생을 증진시키기 위해 이 경로를 표적으로 하는 근거를 강화할 수 있을 것이다.

장 Fgf15 발현의 강력한 PHx-전 유도와 관련하여(도 17), 간 Fgfr4 발현은 재성장 단계 동안 OCA-처치 동물에서 낮게 유지되었다. 간 Fxr에 대한 OCA의 효과는, 비처치 rBDL 및 대조군 래트와 비교하여 Fxr 표적 Shp의 높은 전사 수준에 의해 나타나는 바와 같이, Phx 이후 최초 2일에 가장 확연하였다. 후자는 PHx-후 제1일에 간 Fxr mRNA에서의 약간의 저하에 의해 뒷받침된다. OCA에 의한 간 Fxr 표적의 성공적인 도입에도 불구하고, 간 Foxm1 발현은 어느 군에서도 간 재생 동안 변화하지 않았다(도 19d).

재성장 동역학과 대조적으로, Ki67⁺ 간세포의 수는 PHx 1일 후에 OCA 군에서 가장 높았는데(도 19c 및 20), 이는 증가된 증식을 나타낸다. 이러한 차이는 PHx 이전 간 질량에서의 OCA-유도 증가로부터 기인할 수 있다. 절제 전 OCA에 의한 증식성 신호전달의 유도는 PHx 1일 후에 관찰된 Ki67 염색에서의 피크를 야기했을 수 있는 한편, Fgfr4 발현의 손실 및 전환 성장 인자 베타(Tgfβ) 및 사이토카인 신호전달 3(Socs3)의 억제자와 같은 간 재생의 종결에 대한 신호의 유도(도 19d)는 OCA 군에서 간 질량의 지연된 회복을 설명할 수 있을 것이다. OCA 군에서의 이러한 정지된 재성장은 또한 '헤파토스탯(hepatostat)' 패러다임과도 부합하는데(Moschetta, et al. Gastroenterology, 2015, 149(3):537-40; Naugler, et al. Gastroenterology 2015, 149(3):728-40), PHx 이전에 더 큰 간(즉, OCA-처치 간(도 17b)은 고정된, 미리 정의된 간-대-체중 비율에 도달하기 위해서는 더 적은 팽창을 요구할 것이기 때문이다. 이 개념은 OCA 군에서 간 크기가 PHx 5일 후 건강한 대조군과 유사한 것을 보여주는 도 19b에 의해 입증된다.

도 19는 간 재성장이 오베티콜산 처치 담즙정체-후 래트에서 정지된 것을 보여준다. 구체적으로, 도 19a는 건강한 래트(흑색 선), 담즙정체-후 래트(rBDL, 녹색 선), 및 오베티콜산으로 처치된 rBDL 래트(OCA, 적색 선)의 부분(70%) 간절제(PHx) 이후 간 재성장을 보여준다. 도 19b는 PHx 직후(좌측) 및 5일 후(우측) 잔존 간의 건조 중량을 보여준다. 도 19c는 PHx 1일 후(좌측) 및 5일 후(우측) 증식하는 간세포의 수를 보여준다. 도 19d는 다양한 증식 및 FXR-관련 유전자의 간 발현을 보여준다(BW = 체중; rBDL = 가역적 담관 결찰(담즙정체); OCA = 오베티콜산. *는 대조군에 대하여 p < 0.05를 나타낸다. ^#는 실선으로 표시한 실험군에 대하여 p < 0.05를 나타낸다. ^$는 실험군 내에서 기준선(0일)에 대하여 p < 0.05를 나타낸다).

OCA는 담즙산 수송을 조절하는 것에 의해 폐색성 담즙정체 중 담관 손상을 악화시킨다

Fxr 효능제[Liu 2003] 또는 Fxr 표적 FGF19/Fgf15[Luo 2014; Modica 2012]는 담즙정체성 간 손상을 약화시키는 것을 보여주었다. 또한, Fxr의 유전적 결실은 BA 해독 및 배설을 변화시키는 것에 의해 BDL-유도 간 손상을 실제로 감소시키는 것으로 밝혀졌다[Wagner 2003a; Stedman 2006]. OCA 처치의 효과를 추가로 조사하기 위해, 간 손상에 대한 혈청 및 조직학적 표지를 PHx 이전 및 PHx 이후 최초 5일에 평가하였다. BA 항상성과 관련된 다양한 유전자의 발현을 부수적으로 모니터링하였다.

담즙정체

PHx 이전에, 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT) 및 알칼리 포스파타아제(ALP) 수준은 다른 두 군보다 OCA를 받은 rBDL 래트에서 상당히 더 높았고, 이는 악화된 간담도 손상을 나타낸다(도 21a 내지 21c). 혈장 감마 글루타밀트랜스퍼라아제 농도는 ALP와 동일한 역학을 따랐다. 조직학적 분석에서는 PHx의 시기에 rBDL 군에서 유사한 정도의 간세포 괴사 및 섬유증 변화를 밝혔다(도 21d). 조직학적 변화는 담즙정체성 손상에 대한 늦은 지표이므로, 혈장과 조직학적 손상 프로파일 사이의 명백한 단절은 아마도 OCA 처치와 BDL 조합의 비교적 짧은 지속 기간과 관련된다.

기준선에서 간 생화학에 대한 OCA의 효과를 탐색하기 위해, BA 대사 및 수송과 관련되는 다양한 Fxr 표적 유전자의 발현을 평가하였다. rBDL 래트를 기저측 BA 유출자 Mrp3를 상향조절하는 것에 의해 BA 과부하에 적응시켰는데(도 21f), 이는 담즙정체 마우스 및 환자에서 보이는 반응과 유사하다[Schaap 2009; Boyer 2006]. OCA 처치는 비처치 rBDL 동물보다 더 강력한 Mrp3의 유도(도 21f), 그리고 동시에 상향조절된 기저측 BA 유출자 Ostβ 및 Mrp4를 초래하였다(도 21f). 또한, 소도관 BA 유출자를 암호화하는 전형적 Fxr 표적 Bsep는 거의 8배 상향조절되었다(도 21f). OCA는 담즙분비를 유도하므로[Roda 2014; Fiorucci 2005a], 기준선에서의 간 손상 프로파일은 폐색된 담도계로의 Bsep를 통한 BA의 강제적 펌핑에 의해 야기되는 것으로 보인다. 이것은 고조된 담관 압력에 기인하여 담관 경색을 야기할 수 있다[Wagner 2003a; Fickert 2002]. OCA 처치 7일 후 상승된 담관 BA 산출량 및 간외 담관으로부터 회수된 담즙의 실질적 증가도 이러한 개념을 지지한다(도 21e). BDL-유도 간 손상에 대한 담즙분비촉진제의 비슷한 부작용이 관찰되었다 [Weerachayaphorn 2014]. 이 작용을 매개하는 데 있어서 Bsep의 결정적인 역할은 Bsep의 약리학적 억제가 마우스에서 담즙정체성 손상을 감소시킨다는 이전의 발견에 의해 지지된다[Chen 2015]. 후자는 또한 PHx 이전에 보이는 Bsep 발현, 간외 담즙 용량, 그리고 담관 손상에 대한 표지 사이의 양의 상관관계(도 18)에 의해 입증된다. OCA에 의한 간 BA 부하의 감소에도 불구하고(도 21e), 간세포 손상은 또한 기준선에서 OCA-처치 동물에서 증가하였다(도 21a). 이것은 소도관 반응 및 관련된 호중구 유입에 따른 이차적인 것이거나(도 20), 더 독성인 케노데옥시콜레이트에 유리한 BA 풀의 조성물에서의 약간의 변화에 관련되는 것일 수 있을 것이다(도 22).

특히, 기저측 BA 유출자 Ntcp는 OCA 군에서 경미하게 상향조절되었고(도 22e), 한편 Ntcp는 간세포 BA 부하를 제한하기 위해 담즙정체 동안 Fxr에 의해 정상적으로 억제된다[Zollner 2005; Lionarons 2016]. Ntcp 억제의 유사한 손실은 이전에 Fxr 효능제 GW4064로 처치된 간내(간외에서는 아님) 담즙정체를 갖는 마우스에서 보였다[Liu 2003]. 간 Cyp7a1은 Shp를 통하거나, Fgf15-Fgfr4를 통하거나, 또는 둘 다의 조합을 통해[Inagaki 2005; Modica 2012; Naugler 2015; Li 2014a], OCA에 의해 억제될 것으로 또한 예상되었다[Liu 2003]. 간세포 Fxr 활성화(위에 논의됨) 및 회장 Fgf15 발현(도 22f)의 징후에도 불구하고, OCA는 간세포 Shp(도 21d) 또는 Cyp7a1 mRNA 수준(도 22f)을 변화시키지 않았다. 두 발견은 모두 담즙정체 동안 BA 합성(의 조절)이 FXR 및 SHP에 의해 독립적으로 조절되지 않지만, 예를 들어 프레그난 X 수용체 및 간 핵 인자와 같은 전사적 (공동)활성화제 및 다른 BA 수용체를 포함한다는 것을 재확인한다[Geier 2005; Fiorucci 2014]. 담즙정체 조건 하에 Ntcp[Jung 2004; Geier 2007] 및 Cyp7a1[Wagner 2003a; Schaap 2009]의 조절에 있어서 종간 차이는 또한 이들 관찰을 설명할 수 있을 것이다. 그러나, rBDL에 의해 야기되는 간 BA 함량에서의 상승은 OCA 처치에 의해 효과적으로 상쇄되었는데(도 22e), 이는 OCA 처치 동안 Cyp7a1에 의한 지연된 BA 생산 및 Ntcp에 의한 BA 섭취가 유해한 결과를 거의 갖지 않을 것 같음을 시사한다.

재생

비록 회복이 OCA-처치 군에서 더 점진적이라 할지라도, 규칙적인 담즙 흐름의 회복과 일치하여, 간담도 손상 표지는 rBLD 군에서 PHx 이후 48시간 이내에 정상화되었다(도 22a 내지 22c). 약 4-배 저하에도 불구하고, ALP 수준은 재생 동안 다른 연구 부문보다 OCA 군에서 더 높게 유지되었다(도 22b). 빌리루빈 청소율 또한 OCA-처치 동물에서 미미하게 지연되었는데(도 22c), 이는 낮은 ALT 값에 비추어 손상된 간 기능보다는 MRP2에 의한 손상된 소관 빌리루빈 유출 및 MRP3에 의한 보상적 기저측 유출을 반영할 수 있다(도 22f)[Keppler 2014]. 조직학적 수준에서, PHx 전 rBDL 군에서 보인 보통 정도의 간세포 괴사는 재생 단계 동안 점차 진정되었는데(도 5f), 이는 혈청 손상 표지에서의 하향 경향과 일치한다. 비-소도관 병인을 갖는 문맥주위 섬유증은 PHx 5일 후에 모든 대조군 동물에서 관찰되어, 이것이 정상적인 재생 반응의 일부임을 시사한다. 유사한 정도의 문맥주위 내지 중격 섬유증은 rBDL 군 둘 다에서 보였다. 이것은 PHx 전 OCA에 의해 야기되는 담관 손상 표지에서의 증가가 간절제 후 간 손상을 악화시키지 않았음을 나타낸다. 따라서, 재생 단계 동안 어느 연구 군에서도 주목되는 사망율은 없었다.

도 21에 나타낸 바와 같이, 대조군 래트(대조군 선), 및 비처치되거나(rBDL 선) 오베티콜산을 받은(OCA, rBDL-OCA 선) 담즙정체(후) 래트에서 부분 간절제(PHx) 이전(t=0) 및 이후에 얻어진 혈장 중 ALT(a), ALP(b), 및 빌리루빈 수준(c). 평균 점수±범위로 나타낸 간 절편의 조직학적 점수(d). 채점 시스템 및 대표적 이미지는 표 1 및 도 20에 나타낸다. PHx 이전 혈장, 간 조직, 및 담관 BA 산출량의 총 담즙산(BA) 수준(e). 대조군 및 rBDL 군의 총 BA 데이터 또한 앞서의 보고에 공개되어 있다[Lionarons 2016]. 간세포 BA 항상성과 관련된 유전자의 발현(f). (f)에서 군의 색깔 부호는 (a) 내지 (e)와 유사하다. (약어: ALP = 알칼리 포스파타아제; ALT = 알라닌 아미노트랜스퍼라아제; rBDL = 가역적 담관 결찰(담즙정체); OCA = 오베티콜산. *는 대조군에 대하여 p < 0.05를 나타내고 #는 실선으로 나타낸 실험군에 대하여 p < 0.05를 의미한다).

논의

손상된 간 재생은 주요 간 수술을 받는 실질조직 간 질환 환자에서 심각한 위험으로 남아있다. 여기에 제시되는 데이터는 Fxr 효능제 OCA가 담즙정체 환자의 수술적 관리를 개선시키기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 가장 중요하게는, OCA가 PHx 이전 담즙정체 래트 간의 성장을 촉발시켰다. 간 크기에서 유사한 증가가 콜산-함유 식이를 공급한 건강한 마우스에서 관찰되었지만, Fxr 녹-아웃 동물에서는 보이지 않았다[Huang 2006]. 이것은 Fxr(효능제)이 PHx와 같은 확립된 유사분열 촉발제의 부재시 간 성장을 자극할 수 있음을 나타낸다. 비록 근본적인 기전은 불완전하게 이해되었지만, BA는 간 크기를 변화시킬 수 있는 것으로 보인다. 억제되지 않은 BA 합성 및 그 결과로서 나타나는 순환 BA의 상승은 인간화된 마우스 간의 크기를 약 3-배 증가시켰다는 것이 최근에 밝혀졌다[Naugler 2015]. 그러나, 확장된 BA 풀 그 자체로 간세포 증식을 촉발시키기에 충분한지 여부는 의문인데, BDL 또한 전신적 BA 수준을 증가시키지만, 아마도 BDL 조건 하에서 장 Fxr 자극의 결핍으로 인해 간 성장은 유도하지 않기 때문이다. 간 수분 함량에 대한 교정은 그 점에 있어서 중요한데, 총 간 질량이 마우스뿐만 아니라 래트에서 BDL 이후 증가하기 때문으로[Modica 2012], 건조되지 않은 간 질량에서의 증가는 아마도 염증성 인공물(예를 들어, 부종)에 상당하는 것을 나타낸다.

Fxr은 장-간 축의 두 말단 다에서 발현되므로, 간 성장에 대한 OCA의 효과가 간 및/또는 소장에서 기원하는 것인지 여부를 구별하는 것은 근거가 없다. 본 발명자들의 전사적 분석은 후자를 향하는데, Fgf15과 같은 장 Fxr 표적의 강한 유도가 증식성 간 Fgfr4 - Stat3 경로의 활성화에 연결되기 때문이다[Kong 2014; PadrissaAltes 2015]. Ntcp 및 Cyp7a1과 같은 간 Fxr 표적의 발현에 대한 OCA의 효과는 덜 명확하였다. 간 성장을 구동하는 데 있어서 장 Fxr의 분명한 중요성은 Fgf15가 PHx 이후 간 재생에 필수적임을 명시한 연구에 의해 지지되고[Uriarte 2013; PadrissaAltes 2015], 한편 간세포 Fxr의 선택적 유전자 결실은 재생을 단지 약간 지연시킨다[Borude 2012]. 간 재생에 대한 장 및 간 Fxr의 상대적 기여를 추가로 정의하는 것은, rBDL 동안 OCA에 의해 야기되는 담관 손상에서의 증가에 비추어 또한 요구된다(아래 논의됨). 최근에 개발된 FGF19 유사체 M70은 폐색성 담즙정체 동안 간 Fxr 자극의 이러한 결점을 극복하기 위해 사용될 수 있을 것이다. 비록 조작된 FGF19의 간 성장에 대한 기대 효과가 실험적으로 입증되지는 않았지만, M70은 Mdr2 ^-/- 및 BDL 마우스에서 간 손상을 감소시키고[Zhou 2015; Luo 2014], 건강한 지원자에서 BA 합성을 억제한다[Luo 2014].

OCA 군에서 PHx-후 간 질량 회복이 절제-전 간비대에 의해 강하게 영향을 받는다는 것을 고려하면, 현재의 실험은 OCA가 PHx 이후 간 재생을 또한 가속화시킬 수 있는지 여부를 결정할 수 없다. 간 크기에서의 차이 및 Fgfr4의 하향조절은 증식 반응을 둔화시키고[Yamanaka 1993] 증식 대신에 비대를 향한 재생의 방식을 지시할 수조차 있어[Miyaoka 2012], 이에 의해 다른 군에서 재생 역학의 정확하고 신뢰성 있는 비교를 방해한다. 전환성에 비추어, 수술 전 간 크기를 증가시키는 능력은 작은 간 잔유물의 성장을 가속화하는 것보다 더 매력적이다.

PHx 및 담도 배액술이 이 모델에서 동시에 수행된 반면, PHC 환자는 보통 수술 수주일 전에 담도 배액술을 받아, 간이 담즙정체 강타로부터 회복되도록 한다. 올티프라즈[Weerachayaphorn 2014] 및 우르소데옥시콜산[Fickert 2002]과 같은 다른 담즙분비-유도 화합물에서도 관찰된, OCA로 처치된 담즙정체 동물에서 보이는 담관 손상의 증가는 수술-전 담도 배액술의 설정에서 거의 위해를 야기하지 않는 것으로 보인다. 이 전제는 재생 단계 동안 손상 표지의 신속한 정상화, 그리고 원발성 담관성 간경화와 같은 담즙 흐름의 불완전 폐색이 있는 담즙정체성 병태를 치료하는 데 있어서 OCA의 치료적 성공에 의해 입증된다[Hirschfield 2014]. BA 유출자의 강력한 유도를 고려하면, OCA는 담도 배액술 이후 BA 청소율을 촉진할 수조차 있을 것으로 생각된다. 그렇다면, OCA는 배액술과 수술 사이의 간격을 좁힘으로써 담관염과 같은 배액술-관련 합병증을 감소시킬 수 있을 것이다[Yokoyama 2014]. 우르소데옥시콜산과 같은 Fxr 효능제가 또한 담관 고유의 면역 기능을 증가시킨다는 개념은 배액술-관련 합병증을 추가로 억제시킬 수 있을 것이다[Daldebert 2009]. 동물 모델에서 담관 감압과 간 절제의 일시적 분리는 또한, 절제 후 체중 및 간에서의 영양 상태, 그리고 염증, 부종과 같은 파라미터의 영향을 제한할 것으로, 이는 현재의 작업에서 무시될 수 없을 것이다.

OCA는 비-알코올성 지방간염과 같은 양성 장애가 있는 환자를 치료하는 데 전용으로 사용되었다[NeuschwanderTetri 2014]. 그러나, 간 성장에 대한 OCA의 효과로부터 혜택을 받을 환자의 대부분은 간담도 악성종양으로 고통을 받는다. 모든 증식성 개입은, PVE에 대해 앞서 입증된 바와 같이, 부작용으로서 종양 진행을 유도할 위험을 갖는다[Hoekstra 2012b; Simoneau 2015; Kokudo 2001]. 악성종양에 대한 OCA의 잠재적 효과는 암 유형에 따라 상이할 수 있다. 한편으로, FXR 표적 Fgf15는 FGFR4-양성 간세포 암종의 성장을 촉진하는 것으로 보인다[Ho 2009]. 반면, FXR은 PHC[Dai 2011] 및 대장암[Modica 2008]의 성장을 억제한다. 예비 안전성 연구에서는 2년의 고-용량 처치(25 mg/kg)가 마우스에서 악성종양 변환을 초래하지 않음을 나타낸다(Adorini L., Intercept Pharmaceuticals).

Claims (19)

1. 치료적으로 유효한 양의 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 감소된 간 기능을 갖는 대상에서 간 재생을 가속화, 촉진 또는 증가시키는 방법:
   [화학식 A]
   

   

   
   여기에서:
   R₁은 수소 또는 C₁-C₆ 알킬이고;
   R₂, R₃, R₅, 및 R₆은 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록실이고;
   R₄는 CO₂H, C(O)NH(CH₂)_mSO₃H, C(O)NH(CH₂)_nCO₂H, 또는 OSO₃H이고; 그리고
   m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 또는 3이다.
2. 제1항에 있어서, R₄는 CO₂H 또는 OSO₃H인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R₁은 메틸, 에틸 또는 프로필이고, R₅ 및 R₆은 각각 수소인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R₂는 수소이고, R₃는 하이드록실인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은
   

   

   , 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인 방법.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은
   

   

   , 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 염인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 염은 나트륨 또는 트리에틸암모늄 염인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 이식된 간을 갖는 방법.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 절제된 간을 갖는 방법.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 감소된 간 기능은 외과 수술, 질환, 병리학적 상태, 또는 손상의 결과인 방법.
12. 제11항에 있어서, 감소된 간 기능은 외과 수술의 결과인 방법.
13. 제12항에 있어서, 외과 수술은 간 동맥 색전술 또는 간문맥 조작(portal venous manipulation)인 방법.
14. 제12항에 있어서, 외과 수술은 부분 간절제술인 방법.
15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 외과 수술 전 또는 후에, 또는 조합으로 투여되는 방법.
16. 제11항에 있어서, 감소된 간 기능은 뇌힘줄 황색종증(CTX), 원발성 경화성 담관염(PSC), 약물 유도 담즙정체, 임신 중 간내 담즙정체, 비경구 영양 관련 담즙정체(PNAC), 박테리아 과성장 또는 패혈증 관련 담즙정체, 자가면역성 간염, 만성 바이러스성 간염, 알코올성 간 질환, 간 이식 관련 이식편대숙주병, 선천성 간 섬유증, 총담관결석증, 육아종 간 질환, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 유육종증, 윌슨병(Wilson's disease), 고셰병(Gaucher's disease), 혈색소증, 및 알파 1-항트립신 결핍증으로부터 선택되는 질환 또는 병리학적 상태의 결과인 방법.
17. 제11항에 있어서, 감소된 간 기능은 간세포 암종, 간내 악성종양 및 간외 악성종양으로부터 선택되는 질환 또는 병리학적 상태의 결과인 방법.
18. 제11항에 있어서, 감소된 간 기능은 약물-유도 손상 또는 신체 손상으로부터 선택되는 손상의 결과인 방법.
19. 치료적으로 유효한 양의 화학식 (A)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 감소된 간 기능을 갖는 대상에서 간 질량을 증가시키는 방법:
    [화학식 A]
    

    

    
    여기에서:
    R₁은 수소 또는 C₁-C₆ 알킬이고;
    R₂, R₃, R₅, 및 R₆은 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록실이고;
    R₄는 CO₂H, C(O)NH(CH₂)_mSO₃H, C(O)NH(CH₂)_nCO₂H, 또는 OSO₃H이고; 그리고
    m 및 n은 각각 독립적으로 1, 2, 또는 3이다.

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