CN112206231A - 苦参碱衍生物在治疗非酒精性脂肪性肝炎中的用途 - Google Patents

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张娜
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Abstract

本发明提供一种苦参碱衍生物在治疗非酒精性脂肪性肝炎中的用途，苦参碱衍生物结构如式一所示，
Figure DDA0002717829030000011
其中，R1为苯基、苄基、单杂环基或稠环基，所述苯基、苄基、单杂环基或稠环基各自独立地被一个或多个选自氢、卤素、C1‑C4烷基、C1‑C4烷氧基、三氟甲氧基、三氟甲基、硝基、氨基、羟基、C1‑C4烷酰氨基、氰基、C1‑C4烷硫基、C1‑C4烷氨基、C1‑C4烷氧酰基、C3‑C15环烷基或C1‑C4烷基磺酰基的取代基取代；R2为H或C1‑C4烷基；式一所示化合物通过抑制肝纤维化、抑制炎症及调节脂代谢从而发挥治疗非酒精性脂肪性肝炎的作用。

Description

苦参碱衍生物在治疗非酒精性脂肪性肝炎中的用途
技术领域
本发明属于医药用途领域，具体涉及一种苦参碱衍生物在治疗非酒精性脂肪性肝炎中的用途。
背景技术
随着人们生活条件改善和饮食习惯改变，代谢性疾病已成为影响范围最广的一类疾病。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)被广泛认为是代谢综合征的肝脏表现，主要表现是无酗酒人群肝脏脂肪蓄积，进而导致炎症和纤维化，部分患者最后会进展成肝硬化和肝癌，已成为丙肝被治愈后的第一大肝病，是肝硬化与肝癌最重要风险因素与头号原因。NASH患病率逐年升高并呈年轻化趋势，目前全球超过1亿的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者已发展成NASH，预计在2030年将突破3.5亿。因此，NASH成为一个影响人数巨大的常见病，已经跃居除肿瘤和糖尿病以外的第三大热门领域。
然而，目前为止尚未有优异药物在晚期临床显示疗效，尚无任何药物被美国食品药品监督管理局(FDA)或欧洲药品管理局(EMA)批准用于临床服务患者。原因是多方面的，①NASH异质性高、发病机理复杂，未知因素很多，新药开发盲目性大，绝大多数临床试验以失败告终；②代谢疾病药物开发相对困难，能量代谢是生物体最需要保护的功能；③NASH进展比较缓慢，属于慢性疾病，需要患者长期服药，甚至终身使用，对安全性提出了更高的要求，远远高于肿瘤药物等其他药物。脂肪变性、炎症和纤维化是NASH的三大主要病症，单纯的改善脂肪变性、炎症和纤维化中的一种症状，并不能很好地治疗NASH。
苦参碱(Matrine,MAT)是豆科植物苦参(Sophora flavesens)的根茎中提取出的一种活性生物碱，是苦参中主要活性成分。苦参碱具有广阔的药理学活性，经研究具有抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等作用。对苦参碱进行结构修饰获得的12N-取代胺甲酰基苦参碱衍生物可通过抑制COL1A1启动子的活性发挥抗肝纤维化的作用，但该类衍生物不具有抑制炎症和调节脂代谢的功能。筛选出能够同时调节脂代谢、抑制炎症和抗肝纤维化的药物从而治疗NASH是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明通过对苦参碱衍生物的进一步筛选，发现一类对NASH具有较好治疗效果的苦参碱衍生物。
本发明其中一个技术方案提供一种式一所示化合物、其立体异构体或其可药用盐在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物中的用途，
Figure BDA0002717829010000021
其中，
R1为苯基、苄基、单杂环基或稠环基，所述苯基、苄基、单杂环基或稠环基各自独立地被一个或多个选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、三氟甲氧基、三氟甲基、硝基、氨基、羟基、C1-C4烷酰氨基、氰基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氨基、C1-C4烷氧酰基、C3-C15环烷基或C1-C4烷基磺酰基的取代基取代；
R2为H或C1-C4烷基。
进一步改进的方案中，所述NASH为合并肝纤维化的NASH。
进一步改进的方案中，R1为苯基。
进一步改进的方案中，R2为丙基。
进一步改进的方案中，R1为被三氟甲基取代的苯基。
进一步改进的方案中，式一所示化合物选自：
Figure BDA0002717829010000031
术语解释
本发明所用术语“卤素”包括但不限于氟、氯、溴等。
本发明所用术语“烷基”是指直链或支链饱和烃基，例如C1-C4烷基。烷基的非限制性实施例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基等。
本发明所用术语“烷氧基”是指具有“W-O-”结构的基团，其中W为烷基，例如C1-C4烷氧基，烷氧基的非限制性实施例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和叔丁氧基等。
本发明所用术语“烷酰氨基”是指具有“W-C(O)NH-”结构的基团，其中W为烷基，所述烷酰氨基可为C1-C4烷酰氨基等，烷酰氨基的非限制性实施例包括甲酰氨基、乙酰氨基等。
本发明所用术语“烷基磺酰基”是指具有“W-S(O)2-”结构的基团，其中W为烷基，所述烷基磺酰基可为C1-C4烷基磺酰基等，烷基磺酰基的非限制性实施例包括甲磺酰基、乙磺酰基等。
本发明所用术语“烷硫基”是指具有“W-S-”结构的基团，其中W为烷基，所述烷基磺酰基可为C1-C4烷硫基等，烷硫基的非限制性实施例包括甲硫基、乙硫基等。
本发明所用术语“烷氨基”是指具有“W-NH-”结构的基团，其中W为烷基，所述烷基磺酰基可为C1-C4烷氨基等，烷氨基的非限制性实施例包括甲氨基、乙氨基、N,N-二甲氨基等。
本发明所用术语“烷氧酰基”是指具有“W-C(O)-”结构的基团，其中W为烷基，所述烷氧酰基可为C1-C4烷氧酰基等，烷氧酰基的非限制性实施例包括甲氧酰基、乙氧酰基等；
本发明所用术语“环烷基”是指饱和或部分饱和的环状烃基，组成环烷基的碳原子数可为3-15个，例如3-10个。具体的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基等。
本发明所用术语“单杂环基”是指构成环的原子除碳原子外，还至少含有一个选自N，O或S的杂原子，可分为五元单杂环基、六元单杂环基；单杂环基的非限制性实施包括但不限于四氢吠喃基、四氢吡喃基、四氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、异噁唑基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、三嗪基、吗啉基、噻重氮等；本发明的单杂化基优选：呋喃基、吡啶基、吡唑基、咪唑基、吗啉基、吡咯基、异噁唑基、噻重氮等；优选地呋喃基、吡啶基等。
本发明所用术语“稠环基”是指苯环与单杂环基或单杂环基之间构成的稠环结构，稠环基的非限制性实施包括但不限于苯并噻吩、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并吡咯等，本发明优选苯并噻吩等。
“可药用盐”指在制药上可接受的并且具有母体化合物的所需药理学活性的本发明化合物的盐。这类盐包括：与无机酸或与有机酸形成的酸加成的盐，所述的无机酸例如盐酸，硝酸，硫酸，氢溴酸，磷酸等；所述有机酸例如乙酸，丙酸，己酸，丙酮酸，乳酸，琥珀酸，苯甲酸，苹果酸，富马酸，马来酸，酒石酸，柠檬酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，水杨酸，硬脂酸等；或在母体化合物上存在的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子或碱土金属离子取代时形成的盐；或与有机碱形成的配位化合物，所述有机碱诸如乙醇胺，三乙醇胺，N-甲基葡糖胺等。
本发明另一技术方案提供一种药物组合物在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物中的用途，所述药物组合物含有式一所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂，
Figure BDA0002717829010000051
其中，
R1为苯基、苄基、单杂环基或稠环基，所述苯基、苄基、单杂环基或稠环基各自独立地被一个或多个选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、三氟甲氧基、三氟甲基、硝基、氨基、羟基、C1-C4烷酰氨基、氰基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氨基、C1-C4烷氧酰基、C3-C15环烷基或C1-C4烷基磺酰基的取代基取代；
R2为H或C1-C4烷基。
进一步改进的方案中，式一所示化合物选自：
Figure BDA0002717829010000052
本发明的式一所示的化合物、其立体异构体、或其可药用盐与药学上可接受的载体或赋形剂可根据给药途径配成各种适宜的剂型。
当口服用药时，本发明药物组合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当皮肤局部施用时，本发明药物组合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
当注射给药时，本发明药物组合物可制成无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液，也可以是冻干形式。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
有益效果：本发明提供的式一所示化合物能够显著改善BDL大鼠肝内胆管增生和炎症，抑制胶原增生；能够抑制炎症因子的表达同时抑制白介素6(interleukin6,IL-6)及下游STAT3的磷酸化发挥抗炎作用；可显著降低大鼠血清中甘油三酯(Triglyceride，TG)和胆固醇(cholesterol，CHO)含量；能够降低由OA诱导引起的肝实质细胞系HL-7702细胞中脂质堆积，可显著降低金黄地鼠肝内脂质堆积；由此得出，式一所示化合物通过抑制肝纤维化、抑制炎症及调节脂代谢从而发挥治疗非酒精性脂肪性肝炎的作用。
附图说明
图1为实验过程中动物体重、肝指数和肾指数的变化图；
其中，A为sham组、BDL组和DB13组治疗后大鼠的体重变化图，
B为各组大鼠的肝指数结果；C为各组大鼠的肾指数结果；
图2为BDL大鼠肝脏组织学实验结果；
其中，A为取肝切片行H&E染色(放大10倍)结果；B-D为大鼠肝组织病理切片胆管增生、炎症、坏死双盲评分结果；
图3为BDL大鼠肝脏天狼星红染色结果；
其中，A为取肝切片用天狼星红(放大10倍)染色结果；B为天狼星红染色通过用ImageJ软件将红色染色区域除以总面积结果；
图4为对BDL诱导的肝纤维化的保护作用与抑制炎症细胞因子表达结果图；
其中，A为IL-1β、IL-6、TNF-α在sham组、BDL组和DB13组的蛋白表达，GAPDH作为装载控制；B为用Taqman基因表达试剂盒RT-PCR检测大鼠肝脏炎症相关基因的mRNA表达，并用Gadph标准化；C为磷酸化STAT3(P-STAT3)在大鼠肝脏中的蛋白表达，总STAT3作为负荷控制；
图5为OA诱导的HL-7702细胞甘油三酯和胆固醇的含量结果；
其中，A和B为不同处理的细胞内TG和CHO的含量；C为不同细胞的油红O染色(放大10倍)；D为从60％异丙醇溶液中提取油红O染色后HL-7702细胞对染料含量的吸收结果；
图6为不同组处理的油酸诱导的HL-7702细胞脂质含量结果；
其中，A为用10倍放大镜观察不同组的脂质滴；B为各组绿色荧光平均值；
图7为各组处理后对金黄地鼠体重和肝重的影响；
其中，A为不同组金黄地鼠的体重变化图；B为不同组金黄地鼠的相对肝重；
图8为不同组处理了高脂饲料条件下金黄地鼠肝脏组织学结构图；
其中，A为取肝切片用H&E和油红O染色(放大10倍)；B-C为对照组、HFD组和DB13组金黄地鼠肝组织中的甘油三酯和胆固醇浓度。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实验例一BDL大鼠模型上的抗肝纤维化实验
1.1实验方法
1.1.1动物分组及手术
1、将雄性Sprague-Dawley大鼠(体重为160-180g)，随机分为假手术(sham)组、BDL组及DB13组；每组动物8只，其中BDL组和DB13组进行了BDL(Bile Duct Ligation，胆总管结扎)手术；手术当日视为第0日。
2、手术前，先于动物实验室内适应性饲喂两天；手术前一晚，将动物禁食，正常饮水。术前将操作台紫外消毒30min，所有手术器械高压灭菌，取一次性使用缝合线等物品准备。将手术器械及缝合用针浸泡于75％酒精中；将大鼠置于小动物麻醉剂中，吸入异氟烷，进行麻醉。
3、待动物完全麻醉，剃去腹部被毛，使用碘伏充分消毒手术部位及周围皮肤，上腹部正中开腹，止血钳夹取两侧皮肤打开腹部，用无菌棉棒抬高肝缘，暴露出十二指肠，找到肝与肠连接的胆总管。
4、用尖头弯镊将胆总管与周围脂肪分离，在近肝门处和近十二指肠处用缝合线各结扎两道，从结扎位置中间剪断胆总管，将内脏恢复原样。
5、向腹部撒1％维生素K止血及青霉素预防感染后，依次缝合内皮，外皮，并再次使用碘伏消毒手术及周围皮肤；sham组只开腹，不结扎胆管。
6、待动物清醒后，正常给予饮食和饮水。
1.1.2给药
手术后第二天开始，连续给药14天。sham组给予生理盐水作为对照，BDL组给予溶剂作为对照；DB13组(50mg·kg-1,使用0.05％CMC溶液配置为混悬液)每日灌胃口服体重对应体积化合物溶液；每日称重，并连续给药14天。
1.1.3动物样品收集
1、第15日为收样日，收样前一晚，将大鼠移至代谢笼中，禁食，自由饮水，收集期间尿液及粪便。收集后尿液静置30min沉淀后，取上清1mL，以3000rpm，离心5min，离心后取上清，稀释10倍，用于测量尿中生化指标；粪便直接于离心管中，-80℃冻存。
2、将动物腹腔注射10％水合氯醛麻醉后，开腹。腹主动脉取血，血样室温静置30min后，3000rpm离心5min，取上清，用于测量血清中生化指标。
3、结扎后大鼠由于胆管阻塞，会在肝门下方产生胆泡，吸取其中胆汁，测量体积后，取1mL，3000rpm离心5min，离心后取上清，稀释10倍，用于测量胆汁中生化指标。
1.1.4动物生化指标的测定
使用日立7180型全自动生化分析仪和相关指标检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)，对相应动物样品指标进行检测，检测结果见表1。
A：血清样品：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBIL)、总胆固醇(CHO)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)；若检测时结果超出检测范围，则使用双蒸水稀释后再次检测。
B：尿及胆汁样品：总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBIL)。
1.1.5动物样品切片的制作
1.1.5.1蜡块和切片的制作
1、脱水：将已经固定好的组织块，依次放入50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇及无水乙醇中，每次浸泡时间为1至数小时。
2、透明：放入二甲苯中，浸泡1至数小时，彻底替换出组织块中的酒精。
3、浸蜡：将透明过的组织块，先后置于盛有蜡液的蜡杯中，置于高于石蜡熔点3℃左右的温箱中，浸蜡约2-4h。
4、包埋：准备好表面光亮的小纸盒或金属包埋框盒，倒入蜡液，将已浸透蜡液的组织块置于中间，将盒水平放置于4℃，待蜡块冷却凝固。
5、将蜡块固定在切片机上，将厚度调节为5-8μm，切片；切下的薄片放在温水(45℃左右)中展平，用软笔将切片轻轻贴在载玻片上，于45℃恒温箱中烘干。
1.1.5.2苏木素-伊红(H&E)染色
1、脱蜡：将干燥的切片放在65℃烘箱中融化石蜡1h；待石蜡融化后，过三次二甲苯Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ，每次时间为5-10min。
2、入水：依次将切片移入无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、50％乙醇中，每次分别浸泡5-10min；随后移入PBS中3-5min，再次移入新的PBS中浸泡3-5min。
3、核染色：将切片移入苏木素染色液中，浸染数秒至数分钟。
4、分化：移入水中2min后立即移入分化液(1％盐酸酒精溶液)中，浸泡几秒至数十秒。
5、反蓝：将切片置于湿盒中，在流水中，洗涤10-30min，使细胞核染色为鲜蓝色或天蓝色。
6、胞浆染色：将切片移入伊红染色液中，浸泡2-5min。
7、漂洗：将切片置于水中，洗涤，洗去伊红染液浮色。
8、脱水：依次将切片移入50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇中，浸泡3-5min，再将切片移入二甲苯中，过三次Ⅲ→Ⅱ→Ⅰ，每次5-10min，以透明切片。
9、封片：取出切片，在切片上滴一滴树胶，取干净的盖玻片，从一侧缓缓盖上，避免产生气泡；于室温通风处晾干。
1.1.5.3天狼猩红(Sirius Red)染色
1、脱蜡：同1.1.5.2.1。
2、入水：同1.1.5.2.2。
3、染色：将切片浸入Sirius-Red-饱和苦味酸染色液中，浸染1h；随后用酸化水溶液浸洗两遍。
4、脱水及透明：同1.1.5.2.8。
5、封片：同1.1.5.2.9。
1.2实验结果
1.2.1动物体重实验结果
统计各组动物体重，与动物第0日体重比较，得出给予DB13处理后，动物体重较BDL组及sham组有较明显的下降；给药期间，观察动物状态，较为活泼，状态较好，可见DB13对动物体重的降低不影响动物生存状态(如图1A所示)。同时BDL组与sham组相比，肝指数(肝重与体重比值)与肾指数(肾脏重量与体重比值)显著性升高(p＜0.01)；DB13处理后并不影响肝指数及肾指数(如图1B和图1C所示)，证明该剂量给药不具有明显毒性。
1.2.2大鼠肝功能实验结果
大鼠血清、尿液及胆汁样品中部分生化指标的测定结果如表1所示。
表1各组大鼠血清、胆汁、尿液生化指标结果(n＝8)
Figure BDA0002717829010000111
Figure BDA0002717829010000121
与sham组相比，#p＜0.05，##p＜0.01；与BDL组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
从表中可以发现，BDL组相较于sham组，大鼠血清中的谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST、碱性磷酸酶ALP、总胆固醇CHO、低密度脂蛋白LDL、总甘油三酯TG、γ-氨基丁酸γ-GT、总胆汁酸TBA及总胆红素TBIL都显著升高(p＜0.01)，同时，BDL组胆汁及尿液中TBA及TBIL均有明显升高(p＜0.01)，以上结果证明建模成功，手术后动物发生了明显的胆汁淤积及肝损伤。
经DB13以50mg·kg-1剂量灌胃给药后，相较于BDL组，给药后能降低血清中AST、ALP、LDL、TBiL含量，显著降低CHO和TG水平(p＜0.05)，并能够降低尿中TBA及TBiL含量。
以上结果证明：DB13能够一定程度上改善大鼠肝功能，并对大鼠脂质代谢产生影响。
1.2.3大鼠肝脏病理实验结果
1、收样后观察肝表面，sham组肝脏整体红润，体积较小，柔软且表面光滑；BDL组肝脏表面存在颗粒突起，质地较硬，体积变大且整个肝脏呈现棕黄色；DB13组肝脏与BDL组相比，表面较光滑，证明DB13能够一定程度改善BDL引起的肝损伤。
2、病理切片H&E染色显示：sham组肝脏样本肝小叶完整、胞浆丰富，无明显炎症浸润、坏死及胆管增生；BDL组模型肝脏结构发生明显改变，出现大量胆管增生，肝小叶结构被破坏，同时有淋巴细胞及浆细胞浸润，出现明显的组织坏死；DB13组能够改善肝脏中胆管增生(如图2A所示)。通过对病理切片双盲评分，可以一定程度上表示肝脏内胆管增生、炎症以及坏死程度，通过对所有动物肝脏组织H&E病理切片进行双盲评分，结果发现BDL组较sham组有明显的胆管增生及炎症(p＜0.01)，同时也出现了明显的坏死(p＜0.05)，而给予DB13后，相较于BDL组，胆管增生和炎症评分均有明显降低(p＜0.01)，坏死也得到一定程度改善(如图2B-D所示)。
3、Sirius Red染色显示：sham组大鼠肝组织内只出现极少量的胶原纤维；而经手术后BDL组肝脏切片中胶原纤维染色明显增加(p＜0.01)；给予DB13处理后，胶原纤维的面积及密度均明显减少(p＜0.01)(如图3A-B)。
1.3结论
DB13可以显著改善BDL大鼠的肝内病理情况，并显著抑制肝内胶原纤维蓄积，抑制肝纤维化。
实验例二抑制BDL大鼠肝内炎症因子表达实验
2.1实验方法
依次剥离肝脏、肾脏、回肠，称取肝重及肾重。取肝最大叶中间两块置于包埋盒中，其一浸没在10％的福尔马林溶液中用于制作石蜡切片，另一片置于液氮中用于制作冰冻切片；剩余肝页、肾脏、回肠，切成小块，于液氮中速冻后置于离心管中，-80℃长期保存，用于检测动物组织样品中相关mRNA及蛋白的表达。
2.1.1化合物对目的基因mRNA表达水平影响的检测
2.1.1.1总RNA的提取
1、样品处理：
A：贴壁细胞样品：弃去培养基，按1mL/10cm2的比例加入Trizol试剂，静置5min，使细胞充分裂解，随后用移液器将细胞全部吹打下来，转移进1.5mL离心管中。
B：动物组织：将冻存于-80℃或液氮中的动物组织称取50～100mg，向玻璃研磨管中加入1mL Trizol试剂，将组织块倒入，使用手提式高速匀浆机迅速研磨，至无明显组织块。上述过程全部在冰上或冰浴中完成，研磨后的组织匀浆在4℃离心机中以12000rpm离心15min，离心后吸取上清转移到新的离心管中。
2、按200μL·mL-1Trizol试剂的比例向上述样品中加入氯仿，盖紧管盖后，剧烈振摇15s，勿使用振荡器，易造成基因组污染，振摇后室温静置3min。
3、4℃，12000rpm，离心15min。离心后样品分为3层，底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。吸取400μL上层于新的EP管中。
4、加入相同体积的70％乙醇，上下轻晃，混匀。
5、使用Ultrapure RNA kit(江苏康为世纪生物科技有限公司)。
6、将上述水相与乙醇混合物混匀后，加入离心柱中，以12000rpm，离心1min。
7、弃去废液，向离心柱中加入700μL RW1试剂，随后以12000rpm，离心1min。
8、弃去废液，向离心柱中加入500μL RW2试剂，随后以12000rpm，离心1min，此步骤重复两次。
9、弃去废液，盖紧管盖，以12000rpm，离心2min，使馆内液体全部流入收集管中。
10、弃去收集管，换上无RNase的离心收集管，静置10min，待离心柱中乙醇挥发干净。
11、向离心柱中滤膜部位添加适量无RNase水，盖紧管盖，室温静置2min，随后以12000rpm，离心2min(若RNA量不够，可以吸取收集得到的RNA溶液重新滴入滤膜，再次洗脱；洗脱体积易在30μL～100μL)。
每管取2μL用于测定浓度，其余保存于-80℃。
2.1.1.2逆转录(Reverse Transcription)PCR
根据浓度计算，每个样品取出1μg，使用Roche公司的Transcriptor first strandcDNA synthesis kit合成cDNA，具体步骤如下：
1、在0.2mL无RNase PCR管中配置如下反应体系：
Figure BDA0002717829010000151
将上述组分混匀后，于65℃变性10min，随后立即插入冰浴中。
2、待冷却后向上述反应体系中继续加入如下组分，配成20μL反应体系：
Figure BDA0002717829010000152
将上述组分混匀后，于55℃反应30min，合成cDNA，随后85℃加热5min使Transcriptor Reverse Transcriptase失活。向所得cDNA中加入100μL无菌水，混匀后保存于-80℃或直接用于后续实验。
2.1.1.3实时定量(Real-Time)PCR
1、Taqman
以2.1.1.1.2实验得到的cDNA为模板，采用Roche公司的Fast Universal ProbeMaster(ROX)进行Real-Time PCR反应，按照下表配置反应体系(20μL):
Figure BDA0002717829010000153
将上述体系混合均匀，离心后，置于实时定量PCR反应仪器中，设定反应程序如下：
Hold stage：95℃2min，
Cycle：95℃15s，60℃30s；40～55个循环
其中，荧光信号值在每个循环的末尾收集，采用相对CT值法，以GAPDH作为内参基因，分析目的基因的相对表达量，判断化合物对细胞或动物组织中相关基因表达的影响。
2、SYBR
以2.1.1.1.2实验得到的cDNA为模板，采用TaKaRa公司的One Step
Figure BDA0002717829010000161
PrimeScriptTMRT-PCR Kit II进行Real-Time PCR反应，按照下表配置反应体系(20μL)：
Figure BDA0002717829010000162
反应程序如下：
Hold stage：95℃30s，
Cycle：95℃3s，60℃30s；40～55个循环
为验证引物的特异性，在以上程序进行完毕后，要进入绘制溶解曲线的程序，具体反应如下：
95℃15s；60℃1min；95℃15s
反应结束后，采用相对CT值法，以GAPDH作为内参基因，分析目的基因的相对表达量，判断化合物对细胞或动物组织中相关基因表达的影响。
2.1.2化合物对目的基因的蛋白表达水平影响的检测
2.1.2.1蛋白样品的制备
1、蛋白提取
A：细胞样品：弃去孔板中液体，沿壁用预冷的PBS漂洗细胞一边，加入细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂)，于冰浴中裂解30min；随后使用细胞刮刀刮下细胞，将液体转移至离心管中，4℃，以12000rpm离心15min，收集上清液。
B：动物组织样品：将冻存于-80℃或液氮中的动物组织称取50～100mg，向玻璃研磨管中加入1mL细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂)，用手提式高速匀浆机充分研磨匀浆1～2min，至看不到明显的组织块；将研磨管冰浴裂解30min，随后以4℃，1200rpm，离心15min，将上清转移至离心管中。
2、蛋白浓度的测定
本论文中采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(碧云天公司)测定总蛋白浓度，以保证上样蛋白量的均一性，具体步骤如下：
配置标准液：将1.2mL蛋白标准液加入到30mg标准蛋白BSA中，充分溶解，得到25mg·mL-1的蛋白标准储液。取适量25mg·mL-1蛋白标准液，稀释至终浓度为0.5mg·mL-1，并冻于-20℃长期保存。
根据待测样品数量，配置适当体积的BCA工作液，以试剂A:试剂B＝50:1(V/V)比例配置，充分混匀，以96孔板作为测量板，每孔加入200μL工作液。
将0.5mg·mL-1标准蛋白按照0、1、2、4、8、12、16、20的体积加到含有工作液的96孔板中，同时补入相应体积的无菌水使加样总体积为20μL，得到浓度梯度的标准品对照孔。
向每个样品孔中加入2μL待测样品和18μL无菌水，得到稀释10倍的样品。
将孔板在振荡器上振荡混匀1min，随后置于37℃孵育箱中孵育30min，孵育结束后，于570nm波长测定各孔吸光度值。
以标准品蛋白浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制蛋白浓度标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。
3、蛋白样品制备
使用细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)稀释样品至0.5μg·μL-1，根据稀释后样品总体积，向样品中加入5×Loading Buffer，至终浓度为1×。
于金属浴(95℃)中加热变性蛋白样品10min，加热后立即置于冰上冷却，使水蒸气凝结，防止蛋白浓度改变，冷却后瞬时离心后混匀，即可上样，或冻于-20℃保存，以备上样。
2.2实验结果
与sham组相比，BDL组肝脏样品中IL-1β、IL6、TNF-α基因和蛋白的表达水平均有明显升高，而经DB13处理后，IL-6基因和蛋白的表达水平均得到了明显抑制(p＜0.05)(图4A-B)；通过对IL-6下游信号通路STAT3的检测，发现DB13能够显著降低由BDL引起的P-STAT3(Tyr705)的磷酸化(p＜0.05)(图4C)。以上结果证明，DB13能够在体内一定程度上抑制BDL大鼠肝中炎症反应，减轻由炎症引起的损伤及纤维化。
2.3结论
化合物DB13可以抑制肝内胆管增生和炎症，可以抑制炎症因子及作用通路，进而发挥抗炎的效果。
实验例三抑制OA诱导HL-7702细胞内脂肪蓄积实验
3.1实验方法
3.1.1油酸诱导液的配制
1、称取1.2g BSA(Bovine Serum Albumin，总胆汁酸)于50mL离心管中，向管内加入6mL PBS溶液，不震荡或混匀，直接于高速离心机中以8000rpm离心20min，得到20％BSA溶液，此时管内溶液为淡黄色澄清液体。(此步骤将BSA加入离心管时尽量使粉末分布于管底。)
2、吸取38.08μL OA(Oil acid，油酸)溶液，加入6mL 0.1mol·L-1NaOH溶液中，于75℃水浴30min，充分皂化；水浴结束后得到20mM油酸钠皂化液，此时管内溶液为无色澄清液体。
3、将保温的OA溶液迅速加入BSA溶液中，轻晃摇匀，得到10mM OA-BSA溶液；待冷却后观察液体成浅黄色透明澄清液体，于BSA溶液性状无明显差异，无固体或絮状物体存在。
4、将配置好的油酸诱导液于细胞操作台内过0.22μm滤膜除菌后，分装于4℃长期保存。
3.1.2油酸诱导细胞脂肪蓄积
1、取对数生长期的HL-7702细胞，接种于6孔细胞培养板内，待细胞汇合度达85％时，弃去培养基，更换为含0.5％BSA的RPMI1640培养基，饥饿24h。
2、细胞饥饿24h后，弃去原培养基，向需要诱导的孔内加入终浓度为0.6mmol·L-1的油酸-RPMI1640培养基孵育不同时间诱导细胞脂肪蓄积。
3、饥饿24h后，对照组更换为含0.5％BSA的RPMI1640培养基；诱导组加入0.6mmol·L-1的油酸-RPMI1640培养基；DB13组在对照组与诱导组中分别加入不同浓度DB13，作用相应时间，观察脂质蓄积情况。
3.1.3总甘油三酯(TG)及总胆固醇(CHO)含量测定
1、样品处理：
A：弃去经不同处理后细胞孔板内培养基，加入PBS漂洗一遍，用胰酶消化并轻吹混匀为单细胞悬液，PBS清洗两次后室温250×g离心5min，弃去上清；向细胞沉淀中加入2％TritonX-100，于冰上裂解40min，4℃，3000rpm离心5min。
B：称取各组动物肝脏组织重量，按重量(mg):体积(μL)＝1:9，向动物组织中加入9倍无水乙醇，置于玻璃研磨管中，于冰浴下研磨匀浆；待观察不到明显组织块后，吸取液体与离心管中，以2500rpm，离心20min。
2、取上述样品离心后上清，按照总TG测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定TG浓度；按照总CHO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定CHO浓度；同时取上清测定样品中蛋白浓度；细胞内TG及CHO含量以μmol·g-1蛋白表示；动物组织内TG及CHO含量以mmol·mg-1表示。
3.1.4细胞脂肪染色(油红O染色)
3.1.4.1油红染色液的配制
1、称取0.5g油红O干粉，溶解于100mL异丙醇中，充分溶解后使用滤纸过滤，配制成油红染色液储液，于4℃避光保存。
2、油红工作液的配制：将储液与蒸馏水按3:2比例稀释，滤纸过滤去沉淀，此时管内为深红色液体；实验前现配现用。
3.1.4.2细胞染色
1、弃去经不同处理后细胞孔板内培养基，PBS漂洗两次，加入4％多聚甲醛固定细胞30min。
2、弃去固定液，PBS漂洗两次；向每孔中加入60％异丙醇溶液浸洗2min，以促进后续染色；随后弃去液体，加入油红染色工作液染色10min。
3、染色结束后弃去染液，用60％异丙醇调色，控制时间以免着色过浅；随后用流水冲洗。
4、加入苏木素染液复染，染色时间控制在30s左右，放置因核着色过深覆盖油红染色；随后流水反蓝。
3.1.4.3细胞脂肪含量测定(油红染色)
1、进行油红染色实验，停止于3.1.4.2.3，即不进行苏木素染核操作。
2、向每孔中加入60％异丙醇，于37℃孵育10-30min，充分溶解于细胞内脂肪结合的油红染料；随后于515nm处测定吸光度值，以通过油红染色量反映细胞内脂肪含量。
3.1.4.4细胞内脂质染色(BODIPY染色)
1、弃去经不同处理后孔板内培养基，小心沿壁加入PBS漂洗细胞3次。
2、取适量体积无FBS的RPMI1640培养基置于37℃温浴后，向其中加入1mg·mL- 1BODIPY染色液(已提前使用无水乙醇配制，浓度为3.8mM)，至终浓度为3.8μM，混匀。
3、向每孔内加入适量含BODIPY的培养基，避光于37℃孵育30min。
4、弃去染色液，用PBS漂洗2次后，向每孔中加入DAPI(购于碧云天科技公司，Beyotime Biotechnology)染核1min。
5、弃去染液，用PBS漂洗3次后于荧光显微镜下观察或拍照。
3.2实验结果
1、在未经OA诱导的HL-7702细胞中，加入DB13并不会对细胞TG和CHO含量产生影响。经OA诱导24h后，HL-7702细胞内TG含量(p＜0.05)和CHO含量(p＜0.01)均有明显上升；而在OA诱导的细胞中同时加入不同浓度的DB13，发现DB13可以显著抑制由OA诱导引起的TG和CHO含量的增加(p＜0.05)(图5A-B)。
2、对OA诱导的细胞进行油红染色后结果显示：未经OA处理的HL-7702细胞及只给予DB13并未产生明显的脂肪蓄积；经OA诱导24小时后，HL-7702细胞内出现大量脂滴，出现明显的红色染色区域；经DB13处理后，红色染色区域明显减少(图5C)。
3、经油红染色结果显示：OA诱导后，HL-7702细胞中油红染色程度明显上升(p＜0.01)，而经DB13处理后，可以显著降低细胞中油红染色程度(p＜0.01)(图5D)。
以上结果证明OA成功诱导HL-7702细胞产生脂肪蓄积，同时DB13能够显著抑制由OA诱导引起的细胞内脂肪堆积。
4、对OA诱导处理的细胞进行BIODIPY染色结果显示：OA诱导会引起HL-7702细胞产生明显的绿色荧光及脂质颗粒，而DB13处理后，可以抑制脂质在细胞中的蓄积(图6A-B)。
3.3结论
DB13在细胞水平能够很好地抑制由油酸诱导引起的人肝实质细胞系HL-7702细胞中脂质蓄积，具有较好的抑制脂质堆积作用。
实验例四抑制高脂饲料饲喂金黄地鼠肝内脂质堆积实验
4.1实验方法
使用高脂饲料饲喂金黄地鼠3周，对照组(Control)及高脂饲料诱导(HFD)组给予生理盐水，DB13组给予高脂饲料并同时给予DB13(50mg·kg-1)，以验证DB13在动物体内对脂质蓄积的抑制作用。
4.2实验结果
1、每日给药称量体重之后发现：金黄地鼠状态较好，且DB13能够一定程度上降低金黄地鼠体重(图7A)；同时高脂饲料饲喂会引起相对肝重的明显升高，而DB13对相对肝重并无明显影响(图7B)，提示该剂量该给药方式无明显毒性，动物耐受性好。
2、对金黄地鼠血清中相关指标进行测定，发现HFD饲喂引起了金黄地鼠血清中总胆固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白的显著上升(p＜0.01)，而给予DB13后能显著降低金黄地鼠血清中总胆固醇含量(p＜0.05)，同时也能够一定程度上降低金黄地鼠血清中甘油三酯以及高密度脂蛋白的水平，结果如表2所示。
表2各组血清中生化指标结果
Figure BDA0002717829010000221
与对照组相比，##p＜0.01；与HFD组相比，*p＜0.05。
从表中可以得出，DB13在血清水平能一定程度上改善HFD饲喂金黄地鼠产生的脂肪蓄积。
3、在对动物肝脏样品进行收取时，肉眼可以观察到对照组金黄地鼠肝脏呈红色，而HFD诱导组金黄地鼠肝脏肿大，表面呈乳白或苍白色，切面有明显油腻感，而给予DB13处理后肝脏情况有所改善，油腻感有所减轻。
4、对金黄地鼠肝脏样品切片进行H&E切片染色结果显示：HFD组金黄地鼠肝内结构发生改变，细胞肿胀并能看到胞质内充盈脂滴空泡，而DB13给药后肝细胞形态有所改善；油红O染色也可以明显看出，HFD饲喂后金黄地鼠肝内出现明显的甘油三酯堆积，而DB13组肝内脂肪蓄积得到了明显改善(图8A)。
5、基于切片结果，对金黄地鼠肝组织内甘油三酯和胆固醇含量进行了测定，结果显示：HFD组肝内甘油三酯及胆固醇含量明显升高(p＜0.01)，发生了明显的脂肪蓄积；给予DB13则显著抑制肝内脂肪蓄积(p＜0.01)(图8B-C)。
4.3结论
DB13可以在体内抑制肝内脂肪蓄积，并对血中胆固醇含量有一定改善作用，证明DB13能够较好地改善HFD饲喂所引起的脂肪代谢紊乱，肝内脂质堆积，起到对非酒精性脂肪性肝病的治疗作用。
经过以上实验得出：本发明提供的式一化合物在BDL大鼠模型中显示出良好的抗肝纤维化和抗炎作用，并在OA诱导引起的肝实质细胞系HL-7702细胞和高脂饲料喂养的金黄地鼠模型显示出抑制脂质蓄积的作用，具有成为治疗NASH药物的开发价值。

Claims (8)

1.式一所示化合物、其立体异构体或其可药用盐在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物中的用途，
Figure FDA0002717827000000011
其中，
R1为苯基、苄基、单杂环基或稠环基，所述苯基、苄基、单杂环基或稠环基各自独立地被一个或多个选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、三氟甲氧基、三氟甲基、硝基、氨基、羟基、C1-C4烷酰氨基、氰基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氨基、C1-C4烷氧酰基、C3-C15环烷基或C1-C4烷基磺酰基的取代基取代；
R2为H或C1-C4烷基。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述非酒精性脂肪性肝炎为合并肝纤维化的非酒精性脂肪性肝炎。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，R1为苯基。
4.如权利要求3所示的用途，其特征在于，R2为丙基。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，R1为被三氟甲基取代的苯基。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，式一所示化合物选自：
Figure FDA0002717827000000021
7.一种药物组合物在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物中的用途，其特征在于，所述药物组合物含有式一所示化合物、其立体异构体、或其可药用盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂，
Figure FDA0002717827000000022
其中，R1为苯基、苄基、单杂环基或稠环基，所述苯基、苄基、单杂环基或稠环基各自独立地被一个或多个选自氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、三氟甲氧基、三氟甲基、硝基、氨基、羟基、C1-C4烷酰氨基、氰基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氨基、C1-C4烷氧酰基、C3-C15环烷基或C1-C4烷基磺酰基的取代基取代；
R2为H或C1-C4烷基。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，式一所示化合物选自：
Figure FDA0002717827000000031
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