CN109953989B - 2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3h-吲哚鎓碘化物的药物应用 - Google Patents

2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3h-吲哚鎓碘化物的药物应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种化合物(E)‑2‑(4‑哌啶基苯乙烯)‑1,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚鎓碘化物在制备抑制A549细胞生长，促进A549细胞凋亡与自噬药物中的应用，其中能够有效促进A549细胞凋亡与自噬的药物剂量为1～10μM。本发明为(E)‑2‑(4‑哌啶基苯乙烯)‑1,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚鎓碘化物作为一种有效的工具，用于研究抑制mTOR活性、研发非小细胞肺癌治疗药物奠定了基础。

Description

2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓碘化物的药 物应用
技术领域
本发明涉及荧光化合物(E)-2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓碘化物(简略记为PSI)的药物用途，尤其涉及其在制备抑制A549细胞生长，促进A549细胞凋亡与自噬药物中的应用。
背景技术
癌症是导致死亡的原因之一。肺癌又是世界上癌症相关死亡的主要原因。大约85％的肺癌是非小细胞肺癌。癌症的治疗有以下几种常规的方法，即手术，放射治疗，激素治疗，化疗(单独或联合)和靶向治疗。化疗是抗癌的有效方法，它可以干扰细胞分裂过程，影响肿瘤血管生成或通过各种信号通路诱导癌细胞死亡，但对正常细胞有潜在危害。自噬是一种重要的细胞内分解代谢机制，可以去除功能失调的细胞器和胞内无用的大分子，以防止细胞应激。自噬分为mTORC1(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)依赖型和非依赖型，其中mTORC1依赖型自噬即mTORC1被抑制后激活自噬。越来越多的证据表明，自噬在生理和病理过程中起着至关重要的作用，包括肿瘤，感染，衰老和心血管疾病。近年的研究揭示自噬在肿瘤发生以及治疗中具有重要的作用，自噬作为癌症治疗的靶点，对肿瘤治疗具有重要意义。
目前已经报道的自噬激活剂有雷帕霉素，它能够靶向哺乳动物雷帕霉素靶点mTORC1，抑制其活性，促进自噬。雷帕霉素成为研究自噬与肿瘤关系的有力工具。但是，雷帕霉素在临床上具有加速疾病进程(例如肌萎缩侧索硬化症)的风险。因此，迫切需求研发更多具有激活自噬活性的化合物或制剂。经检索，有关荧光化合物(E)-2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓碘化物在制备抑制A549细胞生长，促进A549细胞凋亡与自噬药物中的应用的专利还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种化合物(E)-2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓碘化物在制备抑制A549细胞生长，促进A549细胞凋亡与自噬药物中的应用。
本发明所述的化合物(E)-2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓碘化物在制备抑制A549细胞生长，促进A549细胞凋亡与自噬药物中的应用，其中所述(E)-2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓碘化物的结构式如式(I)所示：
Figure GDA0002071854310000021
上述的应用中：所述(E)-2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓碘化物能够有效促进A549细胞凋亡的剂量为1～10μM。
上述的应用中：所述(E)-2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓碘化物能够有效促进A549细胞自噬的剂量为1～10μM
上述化合物PSI抑制A549癌细胞生长，促进其自噬以及凋亡的细胞生物学实验及结果如下：
1.化合物PSI对A549细胞存活率的影响。
实验组：分别将浓度为0.1，1，5，10，20μM的PSI处理A549细胞24h以及48h。阴性对照：0.02％DMSO(v/v)；阳性对照：临床抗癌药物五氟尿嘧啶。
结果表明：在用1，5，10，20μM的PSI处理A549细胞24h以及48h后能够显著抑制A549细胞的生长和存活，见图1。
2.化合物PSI对A549细胞形态的影响。
实验组：分别将浓度为0.1，1，5，10，20μM的PSI处理A549细胞3h，6h，12h，24h后拍摄细胞形态变化。对照组：0.02％DMSO(v/v)。
结果表明：在上述浓度与时间条件下，PSI能够减少A549细胞的数量并促进凋亡小体的释放，见图2。
3.化合物PSI对A549细胞的抑制作用优于临床药物5FU
实验组：分别计算荧光化合物PSI以及5FU处理A549细胞48h的半抑制浓度(IC50)。发现PSI的IC50值(1.1μM)小于临床药物5FU(7.1μM)。
4.化合物PSI促进A549细胞凋亡。
实验组：分别将浓度为1，5，10μM的PSI处理A549细胞24h后检测核糖聚合酶PARP蛋白切割情况。对照组：0.02％DMSO(v/v)。
结果表明：在上述条件下，PSI能够显著促进促进PARP蛋白切割，所以PSI能够显著促进A549细胞凋亡，见图3。
5.化合物PSI促进LC3-Ⅱ蛋白水平升高以及P62蛋白水平降低。
实验组：分别将浓度为1，5，10μM的PSI处理A549细胞24h后检测轻链蛋白LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ以及P62蛋白水平变化情况。对照组：0.02％DMSO(v/v)。
结果表明：在上述条件下，PSI能够显著促进LC3-Ⅱ水平上升以及P62蛋白水平下降，所以可能会促进A549细胞自噬，见图4。
6.化合物PSI促进LC3-Ⅱ点状聚集增多。
实验组：分别将浓度为1，5，10μM的PSI处理稳定转染带有GFP标签LC3-Ⅱ的U87细胞24h后，拍摄观察细胞中LC3-Ⅱ的点状聚集情况。对照组：0.02％DMSO(v/v)。
结果表明：在上述条件下，PSI能够显著促进LC3-Ⅱ点状聚集增多，所以PSI能够促进细胞自噬，见图5。
7.化合物PSI促进A549完整的自噬流。
实验组：将10μM的PSI与Bafilomycin A1分别处理以及结合处理A549细胞24h后检测LC3-Ⅱ蛋白水平变化情况。对照组：0.02％DMSO(v/v)。
结果表明：10μM的PSI与Bafilomycin A1结合处理细胞后LC3-Ⅱ蛋白水平高于单独添加Bafilomycin A1。说明化合物PSI能够促进A549完整的自噬流，见图6。
8.化合物PSI通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTORC1促进自噬。
实验组：将10μM的PSI分别处理A549细胞3h，6h，12h，24h后检测mTORC1下游底物蛋白p70S6K磷酸化水平。对照组：0.02％DMSO(v/v)。
结果表明：在上述条件下，PSI能够抑制p70S6K磷酸化，表明抑制mTORC1。显示PSI能够通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTORC1促进自噬，见图7。
上述的实验数据统计学处理：
实验数据以平均值±标准误差表示，经t检验：P<0.05表示有显著性差异；P<0.01表示有极显著性差异。
由上述实验及其结果，可以得出如下结论：
PSI能够显著抑制A549细胞生长，并且抑制作用优于临床药物5FU。为癌症药物的研究和开发奠定了基础。实验证实：一定浓度(1，5，10μM)的PSI能够显著促进A549细胞凋亡与自噬并能够促进A549细胞完整自噬流。此外，PSI通过mTORC1依赖的方式抑制mTORC1活性从而促进自噬。
附图说明
图1：PSI抑制A549细胞存活。
其中A:PSI处理A549细胞24h后，检测A549细胞存活率。
B:PSI处理A549细胞48h后，检测A549细胞存活率。
图2：PSI促进A549形态改变并释放凋亡小体。
不同浓度PSI处理A549细胞3h,6h,12h以及24h后，拍照观察A549细胞形态变化。
图3：PSI促进A549细胞凋亡。
不同浓度PSI处理A549细胞24h后，检测PARP蛋白切割水平。
图4：PSI促进A549细胞自噬。
其中A：不同浓度PSI处理A549细胞24h后，检测LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ蛋白水平。
B：不同浓度PSI处理A549细胞24h后，检测P62蛋白水平。
图5：PSI促进稳定转染GFP-LC3的U87细胞LC3-Ⅱ发生点状聚集。
不同浓度PSI处理U87细胞24h后，拍摄LC3-Ⅱ点状聚集情况。
图6：PSI促进A549细胞完整的自噬流。
10μM PSI以及Bafilomycin A1分别以及结合处理细胞24h后，检测LC3-Ⅱ蛋白水平。
图7：PSI抑制mTOR信号通路。
10μM PSI分别处理A549细胞3h,6h,12h以及24h后检测P70S6K蛋白磷酸化水平。
具体实施方式
实施例1：PSI处理A549细胞后SRB法存活率检测。
(1)加入化合物PSI处理事先种于96孔板的细胞。(2)化合物处理24h以及48h后弃旧培养液，加入100μL的三氯醋酸，置于4℃固定细胞1h。(3)弃固定液。用双蒸水洗五遍，动作轻柔，室温晾干。(4)每孔加入50μL的SRB，室温摇床，10分钟。(5)用1％醋酸洗5遍，室温晾干。(6)每孔加入100μL浓度10mM/L的非缓冲液Tris碱，置于摇床10分钟。(7)选择540nm激发光，测OD值。
结果表明：PSI处理细胞24h和48h后能够浓度依赖性的降低A549细胞存活率，见图1。
实施例2：PSI处理A549细胞后，形态变化以及凋亡水平检测。
将A549细胞接种于直径6cm的培养皿中，用37℃，CO2孵箱内培养12h后，加入PSI处理3h,6h,12h以及24h后，置于倒置显微镜下拍摄细胞形态。
将A549细胞接种于直径6cm的培养皿中，用37℃，CO2孵箱内培养12h之后，加入PSI处理24h，裂解细胞，收集细胞裂解液，4℃下，12000g离心15min，取上清，用western blot检测不同细胞中PARP蛋白切割水平。
结果表明：不同浓度PSI处理A549细胞不同时间后，能够显著降低细胞的密度，促进凋亡小体的释放；不同浓度PSI处理A549细胞24h后能够显著促进PARP蛋白的切割，见图3。
实施例3：PSI处理A549细胞后，western blot检测自噬水平。
将A549细胞接种于直径6cm的培养皿中，用37℃，CO2孵箱内培养12h之后，加入PSI处理24h，裂解细胞，收集细胞裂解液，4℃下，12000g离心15min，取上清，用western blot检测不同处理细胞中LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ以及P62蛋白水平。
结果表明：不同浓度PSI处理A549细胞后能够显著升高LC3-Ⅱ的蛋白水平，降低P62蛋白水平，见图4。
实施例4：PSI处理U87细胞后，共聚焦显微镜检测LC3-Ⅱ点状聚集。
将U87细胞接种于直径2cm的玻璃底培养皿中，用37℃，CO2孵箱内培养12h之后，加入不同浓度PSI处理24h，PBS冲洗3次后加入1毫升多聚甲醛固定20分钟，弃多聚甲醛，用PBS洗涤细胞3次后拍照。
结果表明：不同浓度PSI处理U87细胞24h后能够显著促进LC3-Ⅱ的点状聚集，见图5。
实施例5：PSI处理A549细胞后，自噬流完整性检测。
将A549细胞接种于直径6cm的培养皿中，用37℃，CO2孵箱内培养12h之后，分别加入PSI以及Bafilomycin A1或结合二者处理24h，裂解细胞，收集细胞裂解液，4℃下，12000g离心15min，取上清，用western blot检测不同处理细胞中LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ蛋白水平。
结果表明：10μM PSI以及Bafilomycin A1结合处理A549细胞24h后LC3-Ⅱ水平显著高于Bafilomycin A1单独处理，见图6。
实施例6：PSI处理A549细胞后mTORC1活性检测。
将A549细胞接种于直径6cm的培养皿中，用37℃，CO2孵箱内培养12h之后，加入PSI处理3h，6h，12h，24h小时，裂解细胞，收集细胞裂解液，4℃下，12000g离心15min，取上清，用western blot检测不同处理细胞中LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ蛋白水平。
结果表明：10μM PSI处理A549细胞3h，12h以及24h后能够显著上促进P70S6K蛋白磷酸化，见图7。

Claims (1)

1.化合物(E)-2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓碘化物在制备抗人非小细胞肺癌药物中的应用，其中所述(E)-2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓碘化物的结构式如式(I)所示：
Figure FDA0002994407730000011
CN201910252607.1A 2019-03-29 2019-03-29 2-(4-哌啶基苯乙烯)-1,3,3-三甲基-3h-吲哚鎓碘化物的药物应用 Active CN109953989B (zh)

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