JP6724240B2

JP6724240B2 - 疾患の処置におけるネクチニブおよびその薬学的に許容可能な塩の新規な使用

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Description

本発明は医学生物学に関し、特に、疾患の処置における（３−（（１Ｈ−ピラゾール［３，４−ｂ］ピリジン−５−置換）エチニル）−４−メチル−Ｎ−（４−（（４−メチルピペラジン−１−置換）メチル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ベンズアミド）（３−（（１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌ［３，４−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ−５−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）ｅｔｈｉｎｙｌ）−４− ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−（４−（（４−ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）ｍｅｔｈｙｌ）−３−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）（ネクチニブ（Ｎｅｃｔｉｎｉｂ）またはＧＺＤ８２４）およびその薬学的に許容可能な塩の新規な使用に関する。

急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は、Ｂリンパ球またはＴリンパ球の髄内の異常な過形成に由来する悪性腫瘍性疾患である。異常過形成芽細胞は骨髄中で凝集し、髄膜、リンパ節、生殖腺、肝臓などの髄外の組織に侵入しながら、正常な血液生成の機能を阻害する。中国では、ＡＬＬ発病率は約０．６７／１００，０００であり、ここにおいて、油田および汚染地域の発病率は、全国のそれより著しく高い。ＡＬＬの発生率のピークは幼年期（０〜９歳）にあり、これは小児白血病の７０％以上を占めることがある。ＡＬＬは、成人患者の白血病の約２０％を占め、これは高リスク白血病に属する。急性リンパ芽球性白血病は免疫マーカーに基づいてＢ細胞タイプおよびＴ細胞タイプに分類することができ、ここで、前者は４つのサブタイプ、即ちＮｕｌｌ−ＡＬＬ、Ｃｏｍｍｏｎ−ＡＬＬ、Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ、Ｂ−ＡＬＬ、に分けることができる。

前駆Ｂリンパ芽球性白血病（Ｐｒｅ−ＢＡＬＬ）はＡＬＬの一種であり、これは初期のＢリンパ球前駆体が骨髄、血液およびリンパ系器官において悪性増殖および凝集することを特徴とする。これは最も一般的な種類のＡＬＬでもある。現在、高い再発率を示し、約２５％の小児に生じるＰｒｅ−ＢＡＬＬの臨床的な処置は主として化学療法である。非特異性の抗悪性腫瘍薬での処置は重篤な有毒副作用を引き起こす場合がある。したがって、前駆Ｂ細胞急性リンパ球の処置における新規な薬の開発は極めて重要で緊急なものだった。

非受容体チロシンキナーゼＳｒｃは高度に保存されたＳｒｃ−ファミリータンパク質チロシンキナーゼ（ｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄＳｒｃ−−ｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｓ）のメンバーに属する。Ｓｒｃファミリーは、Ｂｌｋ、Ｂｒｋ、Ｆｇｒ、Ｆｒｋ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ、ｃ−Ｓｒｃ、Ｓｒｍおよびｃ−Ｙｅｓなどのメンバーを含む、最も早くそして最も深く研究されているファミリーである。アミノ酸配列によれば、これは２つのサブタイプに分けることができ、これらのうちの１つはＳｒｃ、Ｆｙｎ、ＹｅｓおよびＦｇｒを含み、これは広く異なる組織で発現され；これらのうちのもう１つは、造血細胞と関係のあるＬｃｋ、Ｂｌｋ、ＬｙｎおよびＨｃｋを含んでいる。ＳＣＲは、乳癌、肺癌、黒色腫、腺癌、頭頚部癌、卵巣癌、結腸癌細胞および白血病などの多数のヒト腫瘍で非常に発現しており、その活性は、腫瘍の発生、発達および予後に密接に関係している。

導入期および地固め期の間のＡＬＬの処置におけるイマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）の併用は非常に良い効果が得られるが、中枢神経系白血病（ＣＮＳ−Ｌ）は依然として処置プロセスの間に容易に起こり得る。そのほかに、イマチニブはＰｈ−ＡＬＬのＣＲ率を増大させる場合があるが、これは顕著に生存率を増大させないことがある。研究は、処置前にＰｈ−ＡＬＬ患者においてＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ突然変異が起こることと、Ｓｒｃキナーゼ活性化という状況も存在することと、を示している。したがって、ＡＢＬ／ＳＲＣ二重キナーゼ阻害剤の探求は最も有望なＡＬＬ処置戦略である。

（３−（（１Ｈ−ピラゾール［３，４−ｂ］ピリジン−５−置換）エチニル）−４−メチル−Ｎ−（４−（（４−メチルピペラジン−１−置換）メチル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ベンズアミド）（ネクチニブ、ＧＺＤ８２４）は、Ｂｃｒ−ＡｂｌＷＴおよびＢｃｒ−ＡｂｌＴ３１５Ｉから突然変異した一種の第三世代小分子阻害剤であり、これは慢性骨髄白血病を効果的に処置することができ、特に、特にグリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）耐性の抗白血病患者に対してより優れた処置効果を示す［ＣＮ２０１０１０２１６６０３．７；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１３］。

しかしながら、（３−（（１Ｈ−ピラゾール［３，４−ｂ］ピリジン−５−置換）エチニル）−４−メチル−Ｎ−（４−（（４−メチルピペラジン−１−置換）メチル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ベンズアミド）（頭文字ＧＺＤ８２４）が、リンパ球白血病、特に前駆Ｂリンパ芽球性白血病、（Ｐｒｅ−ＢＡＬＬ）に対して優れた処置効果を有するかどうかは、まだ未知である。

これに基づいて、本発明の目的のうちの１つは、疾患の処置における（３−（（１Ｈ−ピラゾール［３，４−ｂ］ピリジン−５−置換）エチニル）−４−メチル−Ｎ−（４−（（４−メチルピペラジン−１−置換）メチル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ベンズアミド）（ネクチニブ、ＧＺＤ８２４）およびその薬学的に許容可能な塩の新規な使用を提供することである。

前述の目標を達成するための技術的解決法は以下のとおりである。

急性リンパ芽球性白血病を処置するための薬剤の製造における、（３−（（１Ｈ−ピラゾール［３，４−ｂ］ピリジン−５−置換）エチニル）−４−メチル−Ｎ−（４−（（４−メチルピペラジン−１−置換）メチル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ベンズアミド）およびその薬学的に許容可能な塩の使用。

前駆Ｂリンパ芽球性白血病を処置するための薬剤の製造における、（３−（（１Ｈ−ピラゾール［３，４−ｂ］ピリジン−５−置換）エチニル）−４−メチル−Ｎ−（４−（（４−メチルピペラジン−１−置換）メチル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ベンズアミド）、およびその薬学的に許容可能な塩の使用。

Ｐｈ陰性前駆Ｂリンパ芽球性白血病を処置するための薬剤の製造における、（３−（（１Ｈ−ピラゾール［３，４−ｂ］ピリジン−５−置換）エチニル）−４−メチル−Ｎ−（４−（（４−メチルピペラジン−１−置換）メチル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ベンズアミド）、およびその薬学的に許容可能な塩の使用。

本発明では、本発明者らは、長期試験により、何千もの類似の化合物から、ＧＺＤ８２４（ネクチニブ）を発明的に発見した。ＧＺＤ８２４は、ＳＲＣプロテインキナーゼを標的とすることにより、急性リンパ性白血病の処置、特に前駆Ｂリンパ芽球性白血病の処置、および、特にＰｈ陰性前駆Ｂリンパ芽球性白血病の処置に適用することができる。

図１は、異なる濃度のＧＺＤ８２４でＰｒｅ−ＢＡＬＬ細胞株（ＮＡＬＭ６およびＳＵＰＢ１５）をそれぞれ処置することによる細胞活性テストの結果の図である。図２は、ＧＺＤ８２４（３μＭ、１μＭ）およびＤＭＳＯでＮＡＬＭ６およびＳＵＰＢ１５の細胞をそれぞれ処置した後のアポトーシステストの結果の図である。図３は、ＧＺＤ８２４（３μＭ）およびＤＭＳＯでＮＡＬＭ６およびＳＵＰＢ１５の細胞をそれぞれ処置する細胞周期テストの結果の図である。図４は、ＧＺＤ８２４（１μＭ）およびＤＭＳＯで、５人の患者の初代Ｐｒｅ−ＢＡＬＬ細胞をそれぞれ処置するアポトーシステストの結果の図である。図５は、ＧＺＤ８２４（１μＭ）またはＤＭＳＯで、健康なドナーのＢ細胞を共培養するアポトーシステストの結果の図である。図６は、イマチニブおよびＤＭＳＯでＰＤＸマウスモデルを処置した結果の図である。図７は、２週間の間、ＧＺＤ８２４、イマチニブ、およびＤＭＳＯで、免疫不全のマウス（ＮＳＩ）にそれぞれ構築されたＰＤＸマウスモデルを処置した結果の図である。図８は、患者Ｐ＃１に由来する初代Ｐｒｅ−ＢＡＬＬで構築されたＰＤＸマウスをＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯで処置した後の、マウスの血液、脾臓および骨髄中で検出されたＰｒｅ−ＢＡＬＬの比率の結果の図である。図９は、患者Ｐ＃１に由来する初代Ｐｒｅ−ＢＡＬＬで構築されたＰＤＸマウスをＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯで２週間処置し、屠殺した後に、フローサイトメトリーによりマウスの血液、脾臓および骨髄中で検出されたＰｒｅ−ＢＡＬＬの比率の結果の図である。図１０は、患者Ｐ＃１（Ｂ）、Ｐ＃２（Ｃ）およびＰ＃３（Ｄ）、に由来する初代Ｐｒｅ−ＢＡＬＬで構築されたＰＤＸマウスを、ＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯで処置した後の、マウスの血液、脾臓および骨髄の統計分析によるヒトＣＤ４５陽性細胞の比率の結果の図である。図１１は、患者Ｐ＃４に由来する初代Ｐｒｅ−ＢＡＬＬで構築されたＰＤＸマウスをＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯで処置した後の、マウスの血液、脾臓および骨髄中で検出されたＰｒｅ−ＢＡＬＬの比率の結果の図である。図１２は、患者Ｐ＃４（Ｆ）およびＰ＃５（Ｇ）に由来する初代Ｐｒｅ−ＢＡＬＬで構築されたＰＤＸマウスをＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯで処置した後の、マウスの血液、脾臓および骨髄の統計分析によるヒトＣＤ４５陽性細胞の比率の結果の図である。図１３は、ウェスタンブロット法によって検出された、ＧＺＤ８２４で処置されたＮＡＬＭ６細胞の結果の図である。図１４は、２４時間の間、３μＭのＧＺＤ８２４またはＤＭＳＯでＮＡＬＭ６細胞を処置した後の、４つの遺伝子、即ちＢＣＬ−ＸＬ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＣＫＮ１Ａ、の検出された発現の結果の図である。図１５は、２４時間の間、ＧＺＤ８２４、ＳＲＣ阻害剤（ＫＸ２−３９１）、ＳＴＡＴ３阻害剤（ＨＯ−３８６７）またはＤＭＳＯでＮＡＬＭ６細胞を処置した後に、アポトーシスキット（アネキシンＶ、ＰＩ）により検出されたアポトーシスの結果の図である。図１６は、実施例６における統計分析によるアネキシンＶ陽性細胞の比率の結果の図である。図１７は、統計分析によるアネキシンＶ陽性細胞の比率の結果の図である。図１８は、ウェスタンブロット法によって検出された、ＧＺＤ８２４で処置されたＮＡＬＭ６細胞の結果の図である。図１９は、ウェスタンブロット法によって検出された、ＧＺＤ８２４で処置された初代Ｐｒｅ−ＢＡＬＬ細胞の結果の図である。図２０は白血病細胞を死滅させるＧＺＤ８２４のメカニズムの図である。

長期試験の後、本発明の発明者らは、ＧＺＤ８２４（ネクチニブ）がＰｒｅ−ＢＡＬＬ細胞活性の減少、Ｐｒｅ−ＢＡＬＬ細胞周期停止の誘導、Ｐｒｅ−ＢＡＬＬアポトーシスの誘導について、機能を有することを発見した。その上、Ｐｈ−ｐｒｅ−ＢＡＬＬ細胞は、ＧＺＤ８２４に対してＰｈ＋Ｐｒｅ−ＢＡＬＬ細胞よりも感受性が高い。ＧＺＤ８２４はまた、ＳＲＣキナーゼ、ＳＴＡＴ３、ＲＢおよびｃ−Ｍｙｃのリン酸化をダウンレギュレートすることができる。

以下、ＧＺＤ８２４または図中でＤ８２４と呼ばれる（３−（（１Ｈ−ピラゾール［３，４−ｂ］ピリジン−５−置換）エチニル）−４−メチル−Ｎ−（４−（（４−メチルピペラジン−１−置換）メチル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ベンズアミド）は、既知の方法に従って合成され得られた。

実施例１
ＧＺＤ８２４は、急性リンパ芽球性白血病に対し、特に前駆Ｂリンパ芽球性白血病に対して、より良い抗腫瘍効果を有する。ＧＺＤ８２４は、Ｐｒｅ−ＢＡＬＬ細胞株の増殖を抑制し、そのアポトーシスを誘導し、Ｇ０／Ｇ１期でＰｒｅ−ＢＡＬＬ細胞周期を抑制することができる。

１．１２種類の細胞、つまりＮＡＬＭ６（Ｐｈ陰急性リンパ芽球性白血病細胞株）およびＳＵＰＢ１５（Ｐｈ陽性急性リンパ芽球性白血病細胞株）を、異なる濃度（０−３μＭ／Ｌ）のＧＺＤ８２４でそれぞれ処置した。２４時間後にＣＣＫ８を加える。その混合物を２時間培養し、次に、４５０ｎｍでのその吸収値をマイクロプレートリーダーで検出した。結果は、ＧＺＤ８２４での処置がその細胞活性を顕著に減少させることができることを示し、ＧＺＤ８２４が上述の２種類の細胞の増殖を顕著に抑制でき、特にＮＡＬＭ６の増殖を阻害し、そして、抑制率は薬物濃度に正の相関があることを実証した。これら６種類の細胞に対するＧＺＤ８２４の増殖抑制機能に基づく細胞活性のチャートをプロットし、これは図１に示すとおりである。

１．２異なる濃度のＧＺＤ８２４（３μＭ、１μＭ）およびＤＭＳＯでＮＡＬＭ６およびＳＵＰＢ１５の細胞をそれぞれ２４時間処置した後に、アポトーシスキット（アネキシンＶ、ＰＩ）を使用してアポトーシスを検出した。結果に関しては図２を参照。異なる濃度（３μＭ／Ｌ、１μＭ／Ｌ）のＧＺＤ８２４で２種類の細胞ＮＡＬＭ６およびＳＵＰＢ１５をそれぞれ２４時間処置した後に、細胞をアポトーシスキット（アネキシンＶ、ＰＩ）で染色し、アポトーシスをフローサイトメトリーで検出した。結果は図２に示される。

結果は、ＧＺＤ８２４での処置がこれらの２種類の細胞のアポトーシスを顕著に増強することができることを示し、ＧＺＤ８２４が前述の２種類の細胞のアポトーシスを顕著に促進できること、特にＮＡＬＭ６細胞のアポトーシスを増強することを実証する。図２の左側は、ＧＺＤ８２４およびＤＭＳＯでの処置後のアポトーシスのフローパターンを示す；図２の右側は、ＧＺＤ８２４およびＤＭＳＯでの処置後の、統計分析による、アネキシンＶ陽性細胞の比率を示す。

１．３２種類の細胞、つまりＮＡＬＭ６およびＳＵＰＢ１５を、ＧＺＤ８２４（３μＭ／Ｌ）およびＤＭＳＯでそれぞれ２４時間処置し、次いで細胞周期キットでそれらを処置した後、細胞周期をフローサイトメトリーで測定した。結果は、ＧＺＤ８２４での処置がＧ０／Ｇ１期でこれら２種類の細胞の比率を増加させることができることを示し、ＧＺＤ８２４がＧ０／Ｇ１期に上述の２種類の細胞の細胞周期を抑制すること、特にＮＡＬＭ６細胞の細胞周期を抑制することができることを実証する。結果に関しては図３を参照。図の左側は、処置された細胞周期のフローパターンを示す；右側は、統計分析による、処置されたアネキシンＶ陽性細胞の比率を示す

実施例２
実験は、ＧＺＤ８２４が、Ｂ細胞を死滅させずに、患者由来の初代Ｐｒｅ−ＢＡＬＬ細胞の細胞アポトーシスを促進することができることを示す。

２．１急性リンパ芽球性白血病患者由来の骨髄穿刺サンプルを、リンパ球分離流体で分離して、白血病細胞を分離した。Ｐ＃１、Ｐ＃２、Ｐ＃３の急性リンパ芽球性白血病細胞は３人のＰｈ−患者に由来し、Ｐ＃４、Ｐ＃５は２人のＰｈ＋患者に由来する。ＧＺＤ８２４（１μＭ／Ｌ）で５人の患者由来の白血病細胞を２４時間処置し、アポトーシスキット（アネキシンＶ、ＰＩ）でそれらを染色した後に、アポトーシスをフローサイトメトリーで検出した。結果は、ＧＺＤ８２４での処置が白血病細胞のアポトーシスを顕著に増強することができることを示し、ＧＺＤ８２４は白血病細胞が死滅するまで急性リンパ芽球性白血病患者由来の白血病細胞のアポトーシスを促進できることを実証する。結果に関しては図４を参照。図４の上部は、ＧＺＤ８２４およびＤＭＳＯで処置された初代細胞のアポトーシスのフローパターンを示し、図４の下部は、ＧＺＤ８２４およびＤＭＳＯで処置された、統計分析による、アネキシンＶ陽性細胞の比率を示す。

２．２ＧＺＤ８２４によるＢ細胞の死滅。正常なドナー由来の骨髄穿刺サンプルを、リンパ球分離流体で分離して正常な白血球を得、これを磁気ビーズで分離して正常なＢ細胞を得た。健康なドナー由来のＢ細胞とＧＺＤ８２４（１μＭ／Ｌ）を２４時間共培養した後、アポトーシスをアポトーシスキット（アネキシンＶ、ＰＩ）で検出する。結果は、ＧＺＤ８２４での処置が初代Ｂ細胞のアポトーシスを顕著に促進することができないことを示す。ＧＺＤ８２４は初代白血病細胞を特異的に死滅させることができるが、正常なＢ細胞を死滅させないことが図４で実証されうる。結果に関しては図５を参照。図５の左側は、ＧＺＤ８２４およびＤＭＳＯで処置されたアポトーシスのフローチャートを示し、図５の右側は、ＧＺＤ８２４およびＤＭＳＯで処置された、統計分析による、アネキシンＶ陽性細胞の比率を示す。

実施例３
本実施形態は、ＧＺＤ８２４がＰＤＸマウスにおいてインビボでＰｒｅ−ＢＡＬＬ細胞の増殖を抑制することができることを説明する。

３．１従来の方式に従い、患者由来の初代白血病細胞を免疫不全マウス（ＮＳＩ）に移植してＰＤＸマウスモデルを構築した。移植の２か月後、患者由来の白血病細胞がマウスの脾臓の９５％以上を占める。ＰＤＸマウスの脾臓由来の１×１０^６の白血病細胞（Ｐ＃１、Ｐ＃２およびＰ＃３）を、尾静脈を介して８週齢のＮＳＩマウスの体に移植し、半致死量（ｓｅｍｉｌｅｔｈａｌｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｄｏｓｅ）の照射線量で処置した。マウスを各群３匹ずつ３つの群に分けた。ヒトＣＤ４５の比率がフローサイトメトリーによってＰＤＸマウスの末梢血白血球の１％±０．２％に達する時、ＰＤＸマウスは、ＧＺＤ８２４（２５ｍｇ／ｋｇ）、イマチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ）およびＤＭＳＯでそれぞれ２週間処置され、次いで屠殺された。３患者中でモデル化された、ＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯを投与されたＰＤＸマウスの脾臓のサイズの比較により、結果は、ＧＺＤ８２４群中のマウスの脾臓のサイズは他の２つの群のものより顕著に小さいことを示し、ＧＺＤ８２４はマウスの脾臓においてヒト白血病細胞（Ｐ＃１、Ｐ＃２、Ｐ＃３）の浸潤を顕著に減少させることができることを実証した。結果に関しては図６を参照。上の図は、ＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯで処置され屠殺されたマウスの脾臓のサイズを比較する写真を示し；および、下の図は、統計分析による、ＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯ群のマウスの脾臓の重量を示す。

３．２患者由来の初代白血病細胞を、免疫不全のマウス（ＮＳＩ）に移植してＰＤＸマウスモデルを構築した。ＰＤＸマウスの由来の１×１０^６の白血病細胞（Ｐ＃４およびＰ＃５）を、尾静脈を介して８週齢のＮＳＩマウスの体に移植し、半致死量（ｓｅｍｉｌｅｔｈａｌｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｄｏｓｅ）の照射線量で処置した。マウスを各群３匹ずつ３つの群に分けた。ヒトＣＤ４５の比率がフローサイトメトリーによってＰＤＸマウスの末梢血白血球の１％±０．２％に達する時、ＰＤＸマウスは、ＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯでそれぞれ２週間処置され、次いで屠殺された。２患者中でモデル化された、ＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯを投与されたＰＤＸマウスの脾臓のサイズの比較により、結果は、ＧＺＤ８２４群における脾臓のサイズは他の２つの群のものと顕著な差が無いことを示し、ＧＺＤ８２４は、マウスの脾臓における２患者由来の白血病細胞（Ｐ＃４およびＰ＃５）の浸潤を顕著に減少させることができないことを実証した。結果に関しては図７を参照。

図７の上部は、ＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯ群で屠殺されたマウスの脾臓のサイズを比較する写真を示す。

図７の下部は、統計分析による、ＧＺＤ８２４、イマチニブおよびＤＭＳＯ群のマウスの脾臓の重量を示す。

３．３ＧＺＤ８２４群、イマチニブ群またはＤＭＳＯ群のマウスを屠殺した後に、血液（図８の上部）、脾臓（図８の中央）および骨髄（図８の下部）の組織を、ギムザ染色法またはヘマトキシリン・エオシン染色法で染色した。１０−２０μＬのマウス血液液滴をガラスのスライドにピペットで移し、スライドに均等に広げ、室温で日陰で乾燥させ、ギムザ作動流体（Ｇｉｅｍｓａｗｏｒｋｉｎｇｆｌｕｉｄ）で１５分間染色し、溶離剤で溶出された。中性のホルムアルデヒドで２４時間固定した後に、マウスの脾臓および骨髄を脱水し、透明にし、ワックスをかけ、包埋し、スライスし、染色し、次いで顕微鏡で観察した。結果は、ＧＺＤ８２４が、イマチニブとＤＭＳＯのものと比べて、マウスの血液、脾臓および骨髄における患者Ｐ＃２に由来する初代白血病細胞の浸潤を顕著に減少させることができることを示す。

実施例４
本実施形態において、患者の初代ｐｒｅ−ＢＡＬＬによって構築されたＰＤＸマウスに対する実験的研究は、ＧＺＤ８２４がｐｒｅ−ＢＡＬＬの移植率を抑制できることを示している。

４．１投与の後、患者Ｐ＃１に由来するＰＤＸマウスを屠殺した。マウスの血液を赤血球可溶化物で処置して末梢血白血球を得た。マウスの脾臓を１００メッシュスクリーンで粉砕して、脾臓単細胞を得た。マウスの骨髄中の骨髄細胞を１ｍＬ注射器で洗浄してマウス骨髄単細胞を得た。前述の工程から得られたマウス末梢血白血球、マウス脾臓単細胞およびマウス骨髄単細胞を、抗−ＣＤ４５−ＰＥ抗体で染色し、フローサイトメトリーで検出した。結果は、ＧＺＤ８２４がイマチニブおよびＤＭＳＯのものと比較して、マウスの血液、脾臓および骨髄におけるヒトＣＤ４５陽性細胞の比率を顕著に減少させることができることを示し、これは、ＧＺＤ８２４が、イマチニブおよびＤＭＳＯのものと比較して、マウスの血液、脾臓および骨髄における患者Ｐ＃１に由来する初代白血病細胞の浸潤を顕著に減少させることができることを実証する。結果に関し図９を参照すると、これは、マウスの血液、脾臓および骨髄におけるヒトＣＤ４５陽性細胞の比率のフローパターンを示す。

４．２図９と同じ処置方法を使用して、マウスの血液、脾臓および骨髄中のＣＤ４５陽性細胞の比率をフローサイトメトリーによって検出し、異なる患者（Ｐ＃１（Ｂ）、Ｐ＃２（Ｃ）、Ｐ＃３（Ｄ））に由来するＰＤＸマウスの血液、脾臓および骨髄におけるＣＤ４５陽性細胞の比率を統計分析によって得た。結果は、ＧＺＤ８２４が、イマチニブおよびＤＭＳＯのものと比較して、マウスの血液、脾臓および骨髄中のヒトＣＤ４５陽性細胞の比率を顕著に減少させることができることを示し、これは、ＧＺＤ８２４が、マウスの血液、脾臓および骨髄における患者Ｐ＃１、Ｐ＃２およびＰ＃３に由来する初代白血病細胞の浸潤を顕著に減少させることができることを実証する。結果に関しては図１０を参照。

４．３図９と同じ処置方法を使用して、患者Ｐ＃４に由来するＰＤＸマウスを投与の後に屠殺した。マウスの血液、脾臓および骨髄におけるヒトＣＤ４５陽性細胞の比率を分析した。結果は、ＧＺＤ８２４が、イマチニブとＤＭＳＯのものと比較して、マウスの血液中のヒトＣＤ４５陽性細胞の比率を顕著に減少させることができることを示し、これは、ＧＺＤ８２４が、マウス血液における患者Ｐ＃４に由来する初代白血病細胞の浸潤を顕著に減少させることができることを実証する。結果に関しては図１１を参照。これは、マウスの血液、脾臓および骨髄におけるヒトＣＤ４５陽性細胞の比率のフローチャートを示す。

４．４図９と同じ処置方法を使用して、マウスの血液、脾臓および骨髄中のＣＤ４５陽性細胞の比率をフローサイトメトリーによって検出し、異なる患者（Ｐ＃４（Ｆ）およびＰ＃５（Ｇ））に由来するＰＤＸマウスの血液、脾臓および骨髄におけるＣＤ４５陽性細胞の比率を統計分析によって得た。結果は、ＧＺＤ８２４が、イマチニブとＤＭＳＯのものと比較して、マウスの血液中のヒトＣＤ４５陽性細胞の比率を顕著に減少させることができることを示し、これは、ＧＺＤ８２４が、イマチニブおよびＤＭＳＯのものと比較して、マウスの血液における患者Ｐ＃４およびＰ＃５に由来する初代白血病細胞の浸潤を顕著に減少させることができる。結果に関しては図１２を参照。

実施例５
本実施形態は、ＧＺＤ８２４がＰｒｅ−ＢＡＬＬ細胞のリン酸化されたＳＲＣタンパク質の発現を効果的に抑制することを説明する。

５．１ＧＺＤ８２４で処置されたＮＡＬＭ６細胞をウェスタンブロット法によって検出した。異なる濃度（３μＭ／Ｌ、１μＭ／Ｌ）のＧＺＤ８２４でＮＡＬＭ６細胞を２４時間処置した後に、細胞を収集し溶解してタンパク質を抽出した。ウェスタンブロット法の手順に従い、抽出された全タンパク質を、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＲＣ、ＳＲＣ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｒｂ、Ｒｂおよびｃ−Ｍｙｃ抗体で分析した。結果は、ＧＺＤ８２４が、白血病細胞におけるリン酸化ＳＲＣ、リン酸化ＳＴＡＴ３、およびリン酸化Ｒｂタンパク質の発現を抑制することを示す。タンパク質の観点から、ＧＺＤ８２４はＳＲＣ／ＳＴＡＴ３シグナル経路を抑制することによって白血病細胞を死滅させる。実験結果に関しては図１３を参照。

５．２３μＭ／ＬのＧＺＤ８２４およびＤＭＳＯで２４時間処置した後に、ＮＡＬＭ６細胞を１ｍｌのＴＲＩｚｏｌに収集してＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへ逆転写した。細胞のこれらの２つの群の４つの遺伝子、すなわちＢＣＬ−ＸＬ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＣＫＮ１Ａの発現を、螢光量的ＰＣＲ法で検出した。実験結果は、ＧＺＤ８２４で処置されたＮＡＬＭ６細胞において、ＤＭＳＯで処置されたものと比べて、ＢＣＬ−ＸＬ、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫ４遺伝子の発現がダウンレギュレートされたことと、ＣＣＫＮ１Ａの発現がアップレギュレートされたこととを示し、これは、アポトーシスを抑制し、細胞周期を促進する関連遺伝子の発現をダウンレギュレートし、そして細胞周期を抑制する遺伝子をアップレギュレートすることができることを意味する。分子の観点から、白血病細胞を死滅させるＧＺＤ８２４のメカニズムを説明することができる。実験結果に関しては、図１４を参照。

５．３ＧＺＤ８２４、ＳＲＣサプレッサー（ＫＸ２−３９１）、ＳＴＡＴ３サプレッサー（ＨＯ−３８６７）またはＤＭＳＯでＮＡＬＭ６細胞を２４時間処置した後に、アポトーシスをアポトーシスキット（アネキシンＶ、ＰＩ）の使用により検出した。アネキシンＶ陽性細胞の比率を統計的手法によって分析した。結果は、ＳＲＣサプレッサー（ＫＸ２−３９１）およびＳＴＡＴ３サプレッサー（ＨＯ−３８６７）で処置されたＮＡＬＭ６細胞におけるアポトーシスの比率がほとんど同じであることを示し、ＧＺＤ８２４がＳＲＣ／ＳＴＡＴ３シグナル経路を通じてＮＡＬＭ６細胞を抑制することを実証する。ＳＲＣサプレッサー（ＫＸ２−３９１）およびＳＴＡＴ３サプレッサー（ＨＯ−３８６７）と比較して、ＧＺＤ８２４で処置されたＮＡＬＭ６細胞はアポトーシスの最も高い比率を示し、ＧＺＤ８２４がＳＲＣ／ＳＴＡＴ３シグナル経路とは別の他のシグナル経路の抑制によって白血病細胞を死滅させることを実証する。実験結果に関しては、図１５を参照。

実施例６
本実施形態は、ＧＺＤ８２４がＰｒｅ−ＢＡＬＬ細胞のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル経路を効果的に抑制することができることを説明する。

６．１ヒトの初代白血病細胞をＰ＃２ＰＤＸマウスの血液、脾臓および骨髄から収集し、これらの３つの異なるマウスの臓器に由来する白血病細胞を、１μＭ／ＬのＧＺＤ８２４またはＤＭＳＯと２４時間共培養した。アネキシンＶ陽性細胞の比率を統計的手法によって分析した。結果は、マウスの骨髄に由来する白血病細胞のアポトーシスの比率が最低であることを示し、骨髄環境における白血病細胞はある種の防御因子のためにＧＺＤ８２４に対する感受性が低いことを実証する。結果に関しては図１６を参照。

６．２ヒトの初代白血病細胞をＰ＃１ＰＤＸマウスの脾臓から抽出し、ＤＭＳＯ、ＧＺＤ８２４（１μＭ／Ｌ）、ＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）またはＧＺＤ８２４（１μＭ／Ｌ）およびＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）と２４時間共培養した。アネキシンＶ陽性細胞の比率を統計的手法によって分析した。結果は、ＧＺＤ８２４が初代白血病細胞のアポトーシスを促進することができ、サイトカインＩＧＦ−１を加えることで、初代白血病細胞のアポトーシスに対するＧＺＤ８２４の効果を部分的に逆転させることができることを示し、ＧＺＤ８２４が白血病細胞を死滅させる時にＩＧＦ−１によって活性化されるシグナル経路が関与していることを実証している。実験結果に関しては図１７を参照。

６．３異なる濃度（３μＭ／Ｌ、１μＭ／Ｌ）のＧＺＤ８２４でＮＡＬＭ６細胞を２４時間処置した後に、細胞を収集し溶解した。免疫ブロット法により、抗−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ、ＡＫＴおよびＩＲＳ１抗体を使用して可溶化物を分析した。結果は、ＧＺＤ８２４が白血病細胞のリン酸化されたＡＫＴおよびＩＲＳ１の発現をダウンレギュレートすることができることを示し、ＧＺＤ８２４はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル経路を抑制することによっても白血病細胞を死滅させることを実証する。実験結果に関しては図１８を参照。

６．４ＧＺＤ８２４で処置された初代Ｐｒｅ−ＢＡＬＬ細胞をウェスタンブロット法で検出する。細胞を、ＤＭＳＯ、ＧＺＤ８２４（１μＭ）、ＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）またはＧＺＤ８２４（１μＭ）およびＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）でそれぞれ２４時間共培養した。細胞を収集し溶解した。可溶化物をｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ、ＡＫＴおよびＩＲＳ１抗体で分析した。ＧＺＤ８２４は、２つのシグナル経路、すなわちＳＲＣ／ＳＴＡＴ３、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、を抑制することにより、白血病細胞を死滅させ、Ｐｈ−ＡＬＬ患者のための処置において十分に適用されうる。結果に関しては図２０を参照。

前述の実施例における技術的特徴はそれぞれ任意に組み合わせることができる。簡潔さのため、上記の実施例における異なる技術的特徴の可能な組み合わせのすべてが本明細書に記述されているわけではない。しかしながら、これらの技術的特徴の組み合わせが矛盾していない限り、本明細書に記載の範囲に属すると考慮されるものとする。

前述の実施例は、単に具体的かつ詳細に記載された本発明のいくつかの実施形態を提供するに過ぎず、これらは本発明の保護の範囲に対する制限と見なされるべきでない。当業者は本発明の概念から逸脱することなく異なる変更および修正を行うことができ、これらの変更および修正は本発明の保護の範囲に属するものとすることに留意されたい。したがって、本特許の保護の範囲は請求項に基づいて決定されるべきである。

Claims

前駆Ｂリンパ芽球性白血病を処置するための薬剤の製造における、（３−（（１Ｈ−ピラゾール［３，４−ｂ］ピリジン−５−置換）エチニル）−４−メチル−Ｎ−（４−（（４−メチルピペラジン−１−置換）メチル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ベンズアミド）およびその薬学的に許容可能な塩の使用。
Ｐｈ陰性前駆Ｂリンパ芽球性白血病を処置するための薬剤の製造における、（３−（（１Ｈ−ピラゾール［３，４−ｂ］ピリジン−５−置換）エチニル）−４−メチル−Ｎ−（４−（（４−メチルピペラジン−１−置換）メチル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ベンズアミド）およびその薬学的に許容可能な塩の使用。