CN110141566B

CN110141566B - Sglt2抑制剂在调控炎症中的应用

Info

Publication number: CN110141566B
Application number: CN201810141053.3A
Authority: CN
Inventors: 谢伟东; 徐晨珂; 钟今; 王威; 许乃寒; 张雅鸥
Original assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority date: 2018-02-11
Filing date: 2018-02-11
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2038-02-11
Also published as: CN110141566A

Abstract

本发明公开了一种SGLT2抑制剂在调控炎症中的应用。本发明提供了SGLT2抑制剂在如下任一中的应用：(a1)制备用于预防和/或治疗炎症性疾病的产品；(a2)预防和/或治疗炎症性疾病。SGLT2抑制剂抗炎作用机制主要通过抑制免疫细胞内糖代谢，激活自噬，上调p62蛋白的表达，抑制炎症因子的产生，从而改善炎症症状。大多数SGLT2抑制剂已经经受临床安全性检测，因此相对比较安全。

Description

SGLT2抑制剂在调控炎症中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及钠-葡萄糖共转运体2(Sodium-glucose co-transporter 2,以下简称SGLT2)抑制剂在调控炎症中的应用。

背景技术

炎症是机体组织对外界刺激如病原体，细胞损伤，或者其他刺激性物质一种复杂的生物防御性反应[Ferrero-Miliani,L.,Nielsen,O.H.,Andersen,P.S.&Girardin,S.E.Chronic inflammation:importance of NOD2and NALP3in interleukin-1betageneration.Clinical and experimental immunology 147,227-235,doi:10.1111/j.1365-2249.2006.03261.x(2007).]。但过度炎症会引起机体组织器官的损伤。在炎症应激的情况下，免疫细胞会释放大量的炎症因子，过多过久的炎症因子的释放会促使组织炎症损伤的发生，从而诱发多种疾病，比如腹膜炎，风湿性关节炎，动脉粥样硬化[Baldrighi,M.,Mallat,Z.&Li,X.NLRP3 inflammasome pathways inatherosclerosis.Atherosclerosis 267,127-138,doi:10.1016/j.atherosclerosis.2017.10.027(2017).]，糖尿病[Xie,W.&Du,L.Diabetes is aninflammatory disease:evidence from traditional Chinese medicines.Diabetes,obesity&metabolism 13,289-301,doi:10.1111/j.1463-1326.2010.01336.x(2011).]，甚至包括癌症[Bisogno,L.S.&Keene,J.D.RNA regulons in cancer andinflammation.Current opinion in genetics&development 48,97-103,doi:10.1016/j.gde.2017.11.004(2017).]。严重时，炎症进展甚至会诱发机体出现多器官功能衰竭而死亡。因此，需要使用合适的药物来控制炎症。

目前抗炎药物主要有甾体类抗炎药物和非甾体类抗炎药物(NSAIDs)。甾体类抗炎药物主要通过阻断炎症介质的功能和增强抗炎因子作用而发挥抗炎效应，比如可的松激素类效果显著，但长期使用，副作用较大，可引起神经错乱[Parissis,D.,Syntila,S.A.&Ioannidis,P.Corticosteroids in neurological disorders:The dark side.Journalof clinical neuroscience:official journal of the Neurosurgical Society ofAustralasia 44,1-5,doi:10.1016/j.jocn.2017.05.040(2017).]，代谢紊乱，骨质疏松等。而NSAIDs抗炎机制主要通过抑制环加氧酶1或2(COX1或2)，过氧化酶等抑制前列腺素(PG)的合成[Aranda,J.V.,Salomone,F.,Valencia,G.B.&Beharry,K.D.Non-steroidalAnti-inflammatory Drugs in Newborns and Infants.Pediatric clinics of NorthAmerica 64,1327-1340,doi:10.1016/j.pcl.2017.08.009(2017).]。但这些NSAIDs如阿司匹林通常会有些胃肠道反应，如胃溃疡，胃出血等，患者顺应性比较差[Shin,S.J.,Noh,C.K.,Lim,S.G.,Lee,K.M.&Lee,K.J.Non-steroidal anti-inflammatory drug-inducedenteropathy.Intestinal research 15,446-455,doi:10.5217/ir.2017.15.4.446(2017).]。因此，临床仍然缺乏理想的抗炎药物。

糖代谢在免疫细胞激活及炎症发生发展过程中起了十分重要的作用。免疫细胞激活过程中，往往伴随细胞内糖代谢增加。比如病原体感染可以引起免疫细胞代谢“重编程”，糖代谢会应激性增加，活化免疫细胞，以适应病原体刺激，杀灭入侵的病原体。实际上，免疫细胞激活时，与肿瘤细胞类似，葡萄糖摄取加快，有氧糖酵解(即Warburg效应)增加[Cheng,S.C.et al.mTOR-and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basisfor trained immunity.Science(New York,N.Y.)345,1250684,doi:10.1126/science.1250684(2014).]，以产生必要的能量和促进细胞内生物合成，从而加速免疫细胞的生长与增殖。抑制免疫细胞的有氧糖酵解可以抑制部分免疫细胞的生长与增殖。重要的是，抑制有氧糖酵解，将抑制免疫细胞的免疫功能。在缺营养和禁食的情况下，免疫细胞表面葡萄糖转运体1(GLUT1)的表达将降低，糖摄取减少，免疫功能也将减弱[Donnelly,R.P.&Finlay,D.K.Glucose,glycolysis and lymphocyte responses.Molecular immunology68,513-519,doi:10.1016/j.molimm.2015.07.034(2015).]。因此，糖代谢对免疫功能调节起十分重要的作用。抑制细胞内糖代谢已经成为控制免疫细胞活性的一个重要策略。

自噬在调控炎症方面起了十分重要的作用，增强自噬可以削弱炎症过程[Matsuzawa-Ishimoto,Y.,Hwang,S.&Cadwell,K.Autophagy and Inflammation.Annualreview of immunology,doi:10.1146/annurev-immunol-042617-053253(2017).]。P62(Sequestosome-1,又叫SQSTM1)是一种参与自噬过程调节的重要因子，除此以外，p62参与蛋白降解过程和激活氧化应激防御系统，在控制炎症发生发展过程中起十分重要的作用[Ishii,T.,Warabi,E.,Siow,R.C.&Mann,G.E.Sequestosome1/p62:a regulator ofredox-sensitive voltage-activated potassium channels,arterial remodeling,inflammation,and neurite outgrowth.Free radical biology&medicine 65,102-116,doi:10.1016/j.freeradbiomed.2013.06.019(2013).]。

SGLT2抑制剂是目前上市的一类降糖药物，它主要通过抑制肾脏近曲小管葡萄糖的重吸收，从而降低血糖[Boldys,A.&Okopien,B.Inhibitors of type 2sodium glucoseco-transporters--a new strategy for diabetes treatment.Pharmacologicalreports:PR 61,778-784(2009).]。安全性和有效性都已经经受了临床评价[Filippas-Ntekouan,S.,Filippatos,T.D.&Elisaf,M.S.SGLT2inhibitors:are they safe？Postgraduate medicine,1-11,doi:10.1080/00325481.2018.1394152(2017).]。

发明内容

本发明的目的是提供一种SGLT2抑制剂的新用途。

第一，本发明要求保护SGLT2抑制剂在如下任一中的应用：

(a1)制备用于预防和/或治疗炎症性疾病的产品；

(a2)预防和/或治疗炎症性疾病。

第二，本发明要求保护SGLT2抑制剂在如下任一中的应用：

(b1)制备用于预防和/或治疗炎症性疾病的并发症的产品；

(b2)预防和/或治疗炎症性疾病的并发症。

第三，本发明要求保护SGLT2抑制剂在如下任一中的应用：

(c1)制备用于抑制炎症的产品；

(c2)抑制炎症。

第四，本发明要求保护SGLT2抑制剂在如下任一中的应用：

(d1)制备用于抑制细胞内糖代谢的产品，或者抑制细胞内糖代谢；

(d2)制备用于促进细胞自噬的产品，或者促进细胞自噬；

(d3)制备用于上调细胞内p62蛋白表达的产品，或者上调细胞内p62蛋白表达；

(d4)制备用于抑制细胞内炎症因子产生的产品，或者抑制细胞内炎症因子产生。

第五，本发明要求保护SGLT2抑制剂在如下中的应用：制备用于抑制细胞内葡萄糖的无氧和/或有氧糖酵解的产品，或者抑制细胞内葡萄糖的无氧和/或有氧糖酵解。

第六，本发明要求保护SGLT2抑制剂在如下中的应用：制备用于促进细胞内LC3-II/LC3-I蛋白比率上调的产品，或者促进细胞内LC3-II/LC3-I蛋白比率上调。

第七，本发明要求保护SGLT2抑制剂在如下任一中的应用：

(f1)制备用于下调机体血清中炎症因子水平的产品，或者下调机体血清中炎症因子水平；

(f2)制备用于抑制机体炎症损伤的发生和/或发展的产品，或者抑制机体炎症损伤的发生和/或发展。

在上述第四至六方面所述的应用中，所述细胞为处于炎症应激状态下的细胞。所述炎症为脂多糖(LPS)诱导的炎症。所述细胞为RAW264.7细胞或THP-1细胞。

在上述第四方面和第七方面所述的应用中，所述炎症因子具体可为如下任一：白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。其中，IL-1可为IL-1α和/或IL-1β。

在上述第七方面所述的应用中，所述炎症为肺部炎症。所述炎症为脂多糖(LPS)诱导的炎症。所述机体具体为小鼠。

在上述第一至第七方面所述的应用中，所述SGLT2抑制剂具体为Canagliflozin(以下简称CAN)。

在上述第一至第七方面所述的应用中，所述产品可为药品或保健品。

所述产品(药品或保健品)可以液体、干粉或浸膏的形式存在，并与各种常规辅料制备成胶囊、片剂、注射液、丸剂、颗粒剂、散剂等各种具有保健或药用功效的剂型，可单独或与其它药物组合用于预防和治疗炎症性疾病及其并发症

本发明的优点是：SGLT2抑制剂抗炎作用机制主要通过抑制免疫细胞内糖代谢，激活自噬，上调p62蛋白的表达，抑制炎症因子的产生，从而改善炎症症状。大多数SGLT2抑制剂已经经受临床安全性检测，因此相对比较安全。

附图说明

图1为不同种类的降糖药物对体外LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症因子IL-1a和IL-6水平的影响。Nor，正常对照；各药物终浓度均为40μM；数据表示为均数±标准差(n＝3)，*P<0.05、**P<0.01vs LPS阴性对照(LPS)。

图2为CAN对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的基因表达水平的影响。Nor，正常对照；CAN终浓度均为10、20和30μM(分别为CAN10，CAN20，CAN30)；数据表示为均数±标准差(n＝3)，*P<0.05、**P<0.01vs LPS阴性对照(LPS)。

图3为CAN对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的蛋白表达水平的影响。Nor，正常对照；CAN终浓度均为10、20和30μM(分别为CAN10，CAN20，CAN30)；数据表示为均数±标准差(n＝3)，*P<0.05、**P<0.01vs LPS阴性对照(LPS)。

图4为CAN对LPS诱导的人THP-1细胞炎症因子的蛋白表达水平的影响。Nor，正常对照；CAN终浓度均为10、20和30μM(分别为CAN10，CAN20，CAN30)；数据表示为均数±标准差(n＝3)，*P<0.05、**P<0.01vs LPS阴性对照(LPS)。

图5为CAN对LPS诱导的RAW264.7细胞糖代谢的影响。Nor，正常对照；CAN终浓度均为10、20和30μM(分别为CAN10，CAN20，CAN30)；数据表示为均数±标准差(n＝3)，*P<0.05、**P<0.01vs LPS阴性对照(LPS)。

图6为CAN对LPS诱导的RAW264.7细胞自噬的影响。CAN0，阴性对照(CAN终浓度为0)；CAN20和CAN40，CAN终浓度分别为20和40μM)；LPS-，未用LPS处理组；LPS+，用LPS处理组；LPS，LPS处理组；CAN，CAN处理组(终浓度为20μM)；3-MA(3-methyladenine)，3-MA处理组(终浓度为10μM)。数据表示为均数±标准差(n＝3),*P<0.05、**P<0.01vs CAN0(图下左)或**P<0.01LPS/CAN/3-MA vs LPS/CAN(图下右)。

图7为CAN对LPS诱导的RAW264.7细胞p62基因和蛋白表达的影响。CAN0，阴性对照(CAN终浓度为0)；CAN20和CAN40，CAN终浓度分别为20和40μM；LPS-，未用LPS处理组；LPS+，用LPS处理组；数据表示为均数±标准差(n＝3)，*P<0.05、**P<0.01vs CAN0。

图8为CAN对LPS诱导的Raw264.7细胞p62和IL-1α共定位的影响。Nor，正常对照；LPS，仅加LPS(1μg/ml)的阴性对照，LPS+CAN，添加LPS(1μg/ml)同时添加CAN的给药组(终浓度均为20μM)。

图9为CAN对LPS诱导的小鼠血清炎症因子IL-6和TNF-α的影响。数据表示为均数±标准差(n＝7-8)，*P<0.05、**P<0.01vs LPS阴性对照(LPS)。

图10为CAN对LPS诱导的小鼠肺部组织病理变化的影响(放大倍数100倍)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、体外脂多糖诱导炎症细胞模型制作及活性评价

一、实验材料

1、化合物

SGLT2抑制剂(CAN,Empagliflozin,Dapagliflozin,Bexagliflozin，Ipragliflozin和Tofogliflozin hydrate)，Metformin hydrochloride，Rosglitazone，Glibenclamide，Salsalate，Liraglutide,Sitagliptin和Insulin均购自于美国MedChemExpress(MCE)公司；三氯甲烷来源于天津市红岩化学试剂厂，二甲亚砜(DMSO)、无水乙醇和异丙醇购自生工生物工程(上海)股份有限公司；脂多糖(LPS)购买于美国Sigma-Aldrich公司(Lot.No.L4391)，用超纯水溶解后于-20℃冻存。

2、细胞来源

小鼠单核/巨噬细胞(RAW264.7)和人外周血单核细胞(THP-1)购买自中国科学院上海生科院细胞资源中心。

3、细胞生物学试剂

DMEM高糖粉末培养基(CP2205)和胰酶(Trypsin,R001100)均购买自美国ThermoFisher Scientific公司(Gibco^TM)；胎牛血清(FBS,P30-3302)来源于德国PanBiotech公司；细胞转染脂质体Lipofectamine^TM 2000和Lipofectamine^TM 3000来自于美国ThermoFisher Scientific公司(Invitrogen^TM)，及减血清培养基来源于美国ThermoFisherScientific公司(Gibco^TM Opti-MEM^TM I)。

4、分子生物学试剂

siRNA来自于上海吉玛制药技术有限公司；TRIzol^TM RNA提取试剂(RNAiso Plus)来源于美国ThermoFisher Scientific公司(Invitrogen^TM，15596-026)；Oligo dT引物、RNA酶抑制剂(RRI)、dNTP(10mM)、M-MLV逆转录酶、M-MLV 5X缓冲液、

Green qPCR试剂均来源于日本Takara公司；引物由美国ThermoFisher Scientific公司(Invitrogen^TM)合成，引物序列如表1所示。

表1本实施例中所用到的引物

5、生化试剂

小鼠IL-1α、TNF-α、IL-6，以及人TNF-α、IL-6检测ELISA试剂盒均购自深圳市达科为生物技术有限公司。

6、实验耗材

10cm细胞培养板，细胞培养6孔板及12孔、24孔板，移液管，离心管均购自于广州洁特生物过滤股份有限公司(Jet Biofil)公司，细胞成像用载玻片购买自美国Premiere公司，细胞成像用盖玻片来源于美国ThermoFisher Scientific公司。

二、实验方法

1、RAW264.7细胞炎症模型制作及药物测试

RAW264.7细胞用DMEM高糖培养基(含10％小牛血清加入，100单位/mL青毒素、10μg/mL链霉素)，在37℃、5％CO₂条件下恒温培养箱中培养。开始实验时，种植细胞在6孔板或12孔板上，取对数生长，融合接近50-80％的RAW264.7细胞，炎症模型使用LPS(终浓度：1μg/ml)诱导3-12小时。测试药物根据需要用DMSO或PBS溶解，配制不同的浓度(10-40μM)备用。测试药物浓度经细胞毒MTT实验证明，所测试的药物浓度在测试规定的时间内，未产生明显的细胞毒性反应。药物在制作LPS诱导的炎症模型前半小时给予，和细胞培养液充分混匀。对照使用DMSO或磷酸缓冲液(PBS)溶液。实验结束收集细胞培养液和细胞裂解液冷冻-80℃备用。

2、THP-1细胞炎症模型制作及药物活性测试

THP-1细胞培养和炎症模型制作同以上步骤1中的RAW264.7细胞。

3、ELISA实验

(1)细胞培养液和细胞裂解液样品收集：取出6孔板或12孔板细胞，暂放冰上。立即收集上清液备用。而细胞用PBS洗涤两三次，根据实际的细胞量加入适量的裂解液，充分吹打，冰上静置至少10min，在摇床上80rpm的转速晃动至彻底裂解细胞。在4℃，12000rpm条件下离心10min后，上清即为收集到的细胞裂解液蛋白样品。

(2)蛋白浓度测定：于96孔板每孔加入考马斯亮蓝(G250)200μL，然后分别加入2μL蛋白样品后混匀，使用酶标仪于595nm检测吸光度。同样的，测定一系列已知浓度BSA标准品的吸光度，绘制浓度与吸光度的标准曲线，计算未知蛋白样品的浓度。

(3)加入100μL稀释后的样品，每孔加入50μL生物素化抗体(Biotinylatedantibody)，混匀后，盖上封板膜，37℃温育90min。

(4)扣去孔内液体，加入200μL/孔洗涤液；停留1min后，重复4次。

(5)每孔加入100μL加入稀释后的辣根过氧化物酶偶联的亲和素(Streptavidin-HRP)。盖上封板膜，37℃温育30min。重复步骤(4)。

(6)加入100μL显色液，37℃避光温育5-30min之间，根据孔内颜色的深浅来判定终止反应。

(7)每孔加入100μL终止液终止反应。10min内，用检测波长为450nm读值。

4、RT-PCR实验

(1)取出待处理的6孔板，吸去培养基，加入1mL PBS洗2遍，每孔加入1mL RNAisoPlus。将6孔板置于摇床冰上以120rpm转速摇晃5min，液体分别吸入1.5mL离心管。

(2)向每个离心管中加入200μL氯仿，剧烈摇晃15s，冰上静置10min至分层。4℃，12000rpm离心10min，此时溶液分为三层，小心吸出最上层液体到新的离心管，然后加入相同体积的异丙醇，轻轻上下颠倒使其混匀，置于冰上10min。

(3)4℃，12000rpm离心10min，弃上清，管底可以看到少量白色的沉淀，即为RNA。

(4)每管加入700μL用DEPC水配制的75％乙醇，上下颠倒，4℃，12000rpm离心5min，弃上清。重复一次后，瞬时离心，使管壁吸附的液体集中到管底，用移液枪小心吸出液体。

(5)打开离心管盖，室温晾干5min，白色沉淀逐渐变为透明。根据沉淀多少，加入20～50μL DEPC水溶解沉淀。

(6)使用Nanodrop2000仪器测定RNA浓度。

(7)取出反转录所需试剂，融化后放置冰上。

(8)按照下述配方配制反转录体系：

(9)将上述体系与预变性处理的样品混合，于PCR仪上反转录，反应条件如下：30℃，10min；42℃，60min；85℃，5min；4℃，∞。

(10)待反应完毕，取出EP管，冰上静置2min，离心待用。

(11)取出RT-PCR相关试剂，按照如下配方配制qPCR反应体系：

(12)配制分装于8连管，并按照如下条件于qPCR仪上反应：

95℃30s；95℃15s，60℃31s，40个循环，收集信号。

收集得到基因的Ct值，采用2^一△△Ct方法进行计算，得到目的基因与内参基因β-actin的相对量。每个样本3个重复，实验结果重复3次以上。

三、实验结果

1、不同种类的降糖药物对体外LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症因子IL-1α和IL-6水平的影响

结果如图1所示。LPS可以诱导细胞内炎症因子IL-1α和细胞外培养基中IL-6水平显著升高。我们用ELISA的方法分别检测了SGLT2抑制剂(CAN,Empagliflozin,Dapagliflozin,Bexagliflozin，Ipragliflozin和Tofogliflozin hydrate)，Metforminhydrochloride，Rosglitazone，Glibenclamide，Salsalate，Liraglutide,Sitagliptin和Insulin等降糖药物的对上述炎症因子IL-1α和IL-6的影响。我们发现相同的浓度(40μM)CAN的作用强度最强，可以显著抑制细胞内IL-1α生成和IL-6释放。接下来我们对CAN的作用进行系统的测试。

2、CAN为代表的SGLT2抑制剂显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的水平

(1)基因水平

结果如图2所示。与未加LPS的空白对照比较，LPS可以在6小时时，显著促使RAW264.7细胞IL-1α，IL-6和TNF-α的mRNA大量表达。SGLT2抑制剂可以剂量依赖的显著抑制LPS所引起的炎症因子表达IL-1α和IL-6增加，但对TNF-α基因表达没有影响。

(2)蛋白水平

结果如图3所示。与未加LPS的空白对照比较，LPS在3和6小时，可以显著促使RAW264.7细胞生成大量的IL-1α，以及释放大量的炎症因子IL-6和TNF-α，但SGLT2抑制剂可以显著抑制LPS所引起的细胞内IL-1α白水平的增加，显著抑制IL-6及TNF-α释放到细胞外培养基中。

3、CAN为代表的SGLT2抑制剂显著抑制LPS诱导的THP-1细胞因子的蛋白水平

结果如图4所示。CAN剂量依赖的显著抑制LPS诱导的THP-1细胞中炎症因子IL-1β产生以及TNF-α的释放。

实施例2、CAN为代表的SGLT2抑制剂抗炎机制研究

一、实验材料

1、生化试剂

p62(PM045)来自于Medical&Biological Laboratories公司；LC3(L7543)来自于Sigma-Aldrich公司；β-actin抗体(A1978)来自于Sigma-Aldrich公司；葡萄糖试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司；细胞内糖代谢测试试剂盒(Agilent Seahorse XFpGlycolysis Stress Test Kit，XFp FluxPak，103022-100，美国Agilent Technologies,Inc.公司)；ECL试剂(Pierce^TM ECL Western blotting substrate)购自美国ThermoFisherScientific公司)。

2、引物序列

p62(Forward：5’-GAACTCGCTATAAGTGCAGTGT-3’；Reverse：5’-AGAGAAGCTATCAGAGAGGTGG-3’)，由美国ThermoFisher Scientific公司(Invitrogen^TM)合成。对照使用实施例1表1中的Actin引物。

3、仪器

荧光共聚焦显微镜(FV1000，日本Olympus公司)；Seahorse XFp细胞能量代谢仪。

4、其他试剂同实施例1。

二、实验方法

1、糖代谢实验

(1)细胞内糖代谢实验

将RAW264.7细胞按实施例1中的方法进行培养。使用Seahorse XFp细胞能量代谢仪和相关试剂盒，按说明书进行操作。测试原理：细胞摄入葡萄糖后，糖酵解会产酸，而用特定的探针测试细胞外酸化率(ECAR)，可以反映细胞内糖酵解的情况，添加葡萄糖时，糖酵解明显增加，添加寡霉素C(Oligomycin C)时，由于其可以抑制线粒体氧化磷酸化而导致无氧糖酵解进一步增加，而最后添加2-脱氧葡萄糖(2-DG)时由于抑制了葡萄糖的摄取，所以整个细胞内的糖酵解将会急剧下降。实验分为三组：不添加LPS和相应药物的正常对照组，只添加LPS的模型对照组，以及添加LPS同时添加药物CAN的处理组，每组重复三次。LPS添加终浓度为1μg/ml，而药物CAN添加终浓度20μM。测试三组细胞在分别添加葡萄糖、寡霉素C、2-DG时细胞内糖代谢的情况。

(2)细胞培养液中葡萄糖消耗实验

将RAW264.7细胞按实施例1中的方法进行培养。实验分为五组：不添加LPS和药物的正常对照组，只添加LPS的模型对照组，以及添加LPS同时添加不同终浓度的药物CAN的处理组(10，20，30μM各一组，共三组)，每组重复三次。温孵12小时，收集细胞培养液，用葡萄糖试剂进行葡萄糖浓度的测定。

2、细胞自噬实验

(1)自噬相关因子的表达

将RAW264.7细胞按实施例1中的方法进行培养。收集RAW264.7细胞样品，用Western Blotting的方法测试药物浓度在20和40μM时，细胞内p62、LC3I型和II型表达情况。在另外一个单独的实验，收集RAW264.7细胞样品，参考以上方法提取RNA，测试p62基因表达情况。

(2)自噬抑制剂对炎症因子IL-1α的影响

使用自噬抑制剂3-MA调查CAN的抗炎作用是否与自噬信号通路有关。实验分为四组：LPS处理组(终浓度1μg/ml)，LPS(终浓度1μg/ml)+3-MA处理组(终浓度为10μM)，LPS(终浓度1μg/ml)+CAN组(终浓度20μM)，LPS(终浓度1μg/ml)+CAN(终浓度20μM)+3-MA(终浓度为10μM)处理组。同时处理细胞3-6小时，用上述ELISA试剂盒测试细胞内IL-1α的水平。

3、Western Blotting蛋白表达实验

(1)蛋白样品收集：取出6孔板或12孔板细胞，暂放冰上。用PBS洗涤三两次。根据实际的细胞量加入适量的裂解液，充分吹打，冰上静置至少10min，80rpm在摇床上晃动至彻底裂解细胞。在4℃，12000rpm条件下离心10min后，小心挑出管底DNA，上清即为收集到的蛋白样品。

(3)电泳样品制备：通过上一步浓度测定所得的结果，配制相同蛋白含量且相同体积的电泳样品，并加入5×上样缓冲液，100℃金属浴10min使蛋白变性。

(4)凝胶电泳：将提前配制的胶板置于电泳槽，加入电泳液，点样并加蛋白marker后开始跑胶。恒压80V跑30min，待跑过上层浓缩胶后，恒压120V电泳直至完成。

(5)转膜：按海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵的三明治结构从负极至正极，顺序组装转膜夹，置于转膜槽中，倒入转膜液，恒压69V转膜1.5h。

(6)封闭：取出转好的膜，用TBST于摇床上120rpm洗涤5min，加入5％的脱脂牛奶/TBST封闭液中，室温下于摇床上以80rpm的转速温孵1h；

(7)孵育一抗：倒掉封闭液，根据目的蛋白的大小，剪下所需的目的条带，加入用3％BSA/TBST稀释的一抗，室温下于摇床上以80rpm的转速温孵30min，而后于4℃孵育过夜。

(8)洗膜：回收一抗，加入TBST于120rpm洗膜10min，重复4次。

(9)孵育二抗：根据一抗的来源分别孵育小鼠、兔、山羊的二抗，二抗用5％牛奶/TBST稀释，于摇床上以80rpm的转速室温温孵1h。

(10)洗膜：回收二抗，加入TBST于摇床上以120rpm的转速洗膜10min，重复5次。

(11)孵育底物：从TBST中将膜小心夹出，在超纯水中轻轻洗涤，在吸水纸上虹吸微微沥干，将配置好的ECL试剂均匀滴加到蛋白膜上，反应2min后将膜置于曝光夹中进入暗室显影。

(12)显影：向曝光夹中放入胶片，曝光数分钟不等，取出胶片，先后置于显影液与定影液中，之后用清水冲洗后烘干。

(13)分析结果：标注显影完成的胶片，扫描为灰度模式图片，分析结果。

4、荧光共聚焦实验

将RAW264.7细胞按实施例1中的方法进行培养。实验分为五组：不添加LPS和药物的正常对照组(Normal)，只添加LPS(1μg/ml)的模型对照组，以及添加LPS(1μg/ml)同时添加药物CAN(20μM)的处理组，每组重复三次。主要检测p62和IL-1α细胞共定位情况，主要步骤如下：

(1)将状态良好的RAW264.7细胞接种到预先放置有处理过的无菌盖玻片的培养皿中，加入CAN与LPS处理6小时。

(2)加入1mL 4％多聚甲醛，室温15min固定细胞。PBS洗涤3次。

(3)加入1mL 0.25％Triton对细胞通透处理10min。而后用PBS洗涤3次。

(4)室温，封闭液3％BSA封闭，时间一般为60min。

(5)室温一抗孵育1h。用PBS漂洗3次。

(6)室温避光，二抗孵育1h。PBS漂洗3次。

(7)加另外一种抗体时，重复步骤(5)和(6)。

(8)添加DAPI染液。

(9)封片及检测：滴加封片剂一滴，室温挥干，激光共聚焦显微镜成像。

三、实验结果

1、糖代谢实验结果

ECAR水平表示细胞内糖酵解情况，可以看到LPS可以促进细胞内糖酵解水平，但CAN抑制RAW264.7细胞内的葡萄糖的无氧和有氧糖酵解，同时也显著抑制细胞外葡萄糖的消耗(图5)。提示其作用可能与抑制葡萄糖的转运有关。

2、CAN为代表的SGLT2抑制剂对细胞自噬的影响

CAN显著促进LC3-II/LC-I蛋白比率上调，可能促进自噬进程。自噬能抑制炎症过程，我们通过使用3-MA，一种经典的自噬抑制剂，发现3-MA可以取消CAN对炎症因子IL-1α的下调作用，表明CAN的抗炎作用可能与调节自噬通路有关(图6)

3、CAN为代表的SGLT2抑制剂对p62表达及IL-1α共定位的影响

CAN不管是在有无LPS的情况下，均剂量依赖的显著促进p62的蛋白与基因表达(图7)。p62蛋白水平增加与基因表达水平增加有关，而不是降解受到抑制的影响。

4、p62和IL-1α共定位情况

在LPS刺激的情况下，p62和IL-1α的水平均显著增加，而CAN处理后p62和IL-1α水平明显下降，最为重要的是，p62聚集体明显增大，p62和IL-1α有一个明显的共定位，结果会导致促进IL-1α的降解(图8)。p62一个重要的功能是具有促使蛋白降解和抗炎作用。CAN可以促使p62的表达增加，从而促使降解IL-1α的能力增强。

实施例3、小鼠体内脂多糖诱导肺部炎症模型制作及活性评价

一、实验材料

1、实验动物和食物

NIH雄性小鼠(20g左右)购自广东省医学实验动物中心(SPF级，许可证号：粤监证字，SCXK(粤)2013-0002)。SPF级食物购自广东省医学实验动物中心。

2、化学试剂

4％多聚甲醛：多聚甲醛4g，用100ml生理盐水配制。麻醉剂：10％乌拉坦注射液:10g乌拉坦，用100ml生理盐水配制。

二、实验方法

将实验组和对照组动物按体重均衡分组后，开始进行实验。首先将适量LPS与CAN分别溶于PBS中，配制好相关溶液。提前12h与提前1h分别向实验组按剂量50mg/kg灌胃CAN一次，同时对照组灌胃PBS。向实验组和对照组按剂量50mg/kg腹腔注射LPS。注射LPS 4小时后，对实验动物进行麻醉，眼眶取血20滴，离心取血清用上述ELISA试剂盒进行IL-6和TNF-α浓度的测定；取动物的肺脏组织，放入10％福尔马林溶液中固定，之后进行常规的病理切片分析。

三、实验结果

1、CAN对LPS诱导的小鼠血清炎症因子水平的影响

给予CAN的小鼠，血清IL-6和TNF-α水平显著降低，这些情况和体外细胞实验结果基本一致(图9)。

2、CAN对LPS诱导的小鼠肺部炎症损伤病理切片结果的影响

在LPS刺激后，小鼠肺部组织出现了明显的病理变化，表现为支气管分泌粘液增加，支气管损伤，肺泡体积变小，说明小鼠出现了肺部炎症水肿的情况，而给予CAN，可显著肺部炎症的发生(图10)。这些结果说明CAN在一些炎症性疾病具有一定的应用前景。

Claims

1.SGLT2抑制剂在制备用于预防和/或治疗炎症性疾病的产品中的应用；

所述炎症为脂多糖诱导的肺部炎症；所述SGLT2抑制剂为Canagliflozin；

所述产品为药品。