CN103735549A - 盐酸去亚甲基小檗碱在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了如式(I)所示的盐酸去亚甲基小檗碱在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用。

Description

盐酸去亚甲基小檗碱在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸去亚甲基小檗碱在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用。

背景技术

随着人民生活方式和饮食结构的改变，长期高脂饮食极易导致非酒精性脂肪肝病(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)的发生。目前，全球普通人群中非酒精性脂肪肝病患病率高达20％以上，且有低龄化趋势。据估计未来全世界范围内将会有三分之一以上的人患非酒精性脂肪肝病的危险，明显超过乙型肝炎、丙型肝炎及酒精性肝病的发病率，已成为临床最常见的肝病。非酒精性脂肪肝病按其病理可分为非酒精单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及相关的肝硬化和肝癌。

目前，有关非酒精性脂肪肝病的发病机制尚不十分清楚。一般认为高脂诱导作为初次打击，长期摄入高脂食物会使机体通过氧化应激产生过量的活性氧(ROS，Reactive OxygenSpecies)，活性氧自由基的增加会导致包括蛋白酶在内的重要蛋白质以及DNA的过氧化损伤，导致肝内脂肪酸利用减少、肝细胞合成甘油三酯能力增强，诱发肝脏脂肪聚集。在氧化应激相关的脂质过氧化物及炎性细胞因子的作用下，脂肪变性的肝细胞发生第二次打击，造成肝脏炎症、坏死和纤维化。另外，长期高脂饮食引进肠道屏障功能受损，肠源性内毒素与脂多糖进入体内，能显著增加炎性细胞因子的转录与释放，炎性因子产生炎症放大效应，刺激星状细胞向成纤维细胞转化，导致肝纤维化的发生。

非酒精性脂肪肝病如不及时治疗，将会转变非酒精性肝硬化并发肝癌，严重影响着人民的生活与健康。目前临床上常用的非酒精性脂肪肝病治疗药物有甘草类、水飞蓟素类、双环醇类、多烯磷脂酰胆碱和还原型谷胱甘肽等药物。这些药物均有不同程度的抗氧化、抗炎和保护肝细胞膜及细胞器等作用，临床应用可改善肝脏生物化学指标。这些药物有的价格昂贵，有的效果不显著。因此，研发安全有效治疗非酒精性脂肪肝病的治疗药物已成为当前肝病药物治疗研究的热点领域。

近年来人们对小檗碱研究非常活跃，发现小檗碱除抗菌活性外，还具有降血糖、降血脂、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等药理作用。通过动物和人体临床试验，人们发现小檗碱具有治疗非酒精性脂肪肝病的药物治疗作用。在研究小檗碱体内代谢过程中，发现小檗碱在体内经肝脏代谢可产生去亚甲基小檗碱。有关去亚甲基小檗碱治疗非酒精性脂肪肝病的药物治疗作用研究尚未见报道。本发明专利首次发现去亚甲基小檗碱具有治疗非酒精性脂肪肝病的药物作用。

盐酸去亚甲基小檗碱，如式(I)所示，又名去亚甲基小檗碱盐酸盐或脱亚甲基小檗碱盐酸盐。

盐酸去亚甲基小檗碱(式I)的英文名为Demethyleneberberine Hydrochloride或Demethyleneberberine Chloride。本发明专利将它简称为DMB。式(I)中的骨架结构为去亚甲基小檗碱，它是盐酸去亚甲基小檗碱的活性成份。国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)将式(I)中的有机结构部分去亚甲基小檗碱命名9，10-dimethoxy-5,6-dihydroisoquinolino[2，1-b]isoquinolin-7-ium-2,3-diol，其中文名为9，10-二甲氧基-5，6-二氢异喹啉[2，1-b]异喹啉-7-鎓-2，3-二羟基。它的分子式：C19H18N04+，分子量为：324.35。化学文摘号(CAS)为：25459-91-O。去亚甲基小檗碱(DMB)可以与无机酸或有机酸形成多种盐，如氯化盐、硫酸盐、磷酸盐、溴化盐、碘化盐、枸橼酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐等分子形式存在。

去亚甲基小檗碱(DMB)存在于天然药用植物芸香科植物黄柏(Cortex PhellodendriChinensis)中，可以通过化学分离纯化法加以制备，得到符合药理学研究要求的高纯度产品。有报道认为它在体外对多种革兰阳性及阴性菌均具有抑菌作用。由于药用植物中含量较低，价格昂贵，有关去亚甲基小檗碱(DMB)其它相关药理活性的研究报道很少。

迄今为止，现有技术中没有关于盐酸去亚甲基小檗碱或去亚甲基小檗碱(DMB)具有治疗非酒精性脂肪肝病药物作用的记载和报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗非酒精性脂肪肝病的化合物，特别是提供了如式(I)所示的盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)作为治疗非酒精性脂肪肝病的药物应用。

本发明通过棕榈酸钠诱导细胞模拟非酒精性脂肪肝的脂质累积，通过共孵育盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)，考察DMB对细胞模拟非酒精性脂肪肝脂质累积的治疗作用。采用人肝细胞株HepG2，以200μM棕榈酸钠(Palmitate Sodium，PA)诱导，模拟非酒精性脂肪肝的脂质累积，给药组同时给予20μM DMB，而对照及模型组给予相同剂量的赋形剂，共孵育24h后，油红O染色。实验结果分析表明，20μM DMB能显著降低由棕榈酸钠诱导引起的HepG2肝细胞中脂质累积，提示DMB在细胞水平具有抵抗由于脂质累积造成的肝损伤的功能。

本发明利用小鼠为研究对象，通过高脂喂养成功建立了小鼠非酒精性脂肪肝病模型。通过给药治疗，考察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对非酒精性脂肪肝病的治疗作用，研究发现盐酸去亚甲基小檗碱对小鼠非酒精性脂肪肝病具有药物治疗作用。治疗方案是高脂喂养小鼠产生非酒精性脂肪肝病模型，通过腹腔注射给予小鼠DMB，给药组分别设置了20mg／kg(IP)，30mg／kg(IP)或40mg/kg(IP)三个剂量组，对照及模型组同时给予相同体积赋形剂。于4周后处死动物小鼠，取小鼠血清及肝脏进行分析。实验结果表明，小鼠经高脂喂养4周后，与正常组相比模型组小鼠血清ALT升高2.8倍，而与模型组相比，DMB低剂量、中剂量和高剂量给药组ALT分别降低72.6％、82.0％和72.8％，均能显著降低高脂喂养小鼠非酒精性脂肪肝病引起的ALT升高，达到正常水平。由此可见，DMB具有明显的抗非酒精性脂肪肝病和保护肝功能的作用。

除此之外，与正常组相比，高脂喂养模型组小鼠肝TC和肝TG分别升高2.3倍和1.5倍。而与模型组相比，DMB低剂量给药组肝TC和肝TG分别降低了61.6％和54.7％；DMB中剂量给药组肝TC和肝TG分别降低了53.4％和54.5％。DMB高剂量给药组肝TC和肝TG分别降低了72.1％和65.7％。DMB低、中和高剂量给药组均能显著降低高脂诱导的小鼠非酒精性脂肪肝病引起的TC和TG升高，恢复至正常水平。表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)能有效地改善高脂诱导引起的脂代谢紊乱，加速脂肪转运，防止高脂诱导的非酒精性肝脂肪堆积和脂肪肝病。

同时，与正常对照组相比，高脂诱导模型组GSH、MDA分别降低27.0％和升高3.7倍。而与高脂诱导模型组相比，DMB低剂量、中剂量和高剂量组MDA分别降低59.3％、73.2％和81.3％，而GSH分别升高37.3％、44.7％和46.5％，接近正常组水平。研究结果表明DMB具有显著降低脂质过氧化产物MDA水平，促进GSH再生，增强肝脏自由基的清除能力。

肝脏病理学研究结果表明，正常对照组的肝脏形态未见异常，高脂模型组则出现肝脏中央静脉周围中度或重度的肝细胞水肿，胞浆疏松淡染或肝细胞脂肪变性，病理学结果显示非酒精性脂肪肝模型成功可靠。而DMB低、中和高剂量组均可明显减轻上述肝细胞病变：低剂量组肝细胞脂肪变性明显减轻(轻度或中度)，中剂量组基本无明显脂肪变性，而有轻度或中度的肝细胞水肿，高剂量组则与正常组无异，无明显肝细胞水肿或脂肪变性。实验结果表明，DMB可以有效减轻由于高脂引起的小鼠肝脏脂肪病变。

肝脏中胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)1c与2是肝脏中甘油三酯以及胆固醇合成相关的关键性调控蛋白。当它们表达水平升高时，将会促进肝脏脂质合成代谢，导致肝脏脂肪和胆固醇积累增加。定量PCR(qRT-PCR)分析表明，高脂模型组小鼠肝脏中SREBP家族(SREBPlc，SREBP2)的mRNA表达含量与正常对照组相比，显著性升高，分别为正常对照组的2.37以及3.10倍，而腹腔给药40mg／kg治疗组小鼠肝脏的SREBP家族mRNA含量相较于模型组则明显降低，SREBP1C以及SREBP2的基因表达分别降低了69.07％以及75.10％，达到正常组水平。表明给药DMB治疗可以有效减少脂肪肝病中肝脏中SREBP的表达，从而减少甘油三酯和胆固醇的合成，达到缓解脂肪肝病的功效。同时，高脂模型组小鼠肝脏中炎症相关基因(TNF-α，IL-1β)的表达相较于正常对照组有显著性增加，分别为正常对照组的4.61以及3.15倍，而腹腔给药40mg／kg组小鼠肝脏的炎症相关基因则明显降低表达，TNF-α和IL-1β的基因表达较于模型组分别降低了90.68％及93.34％，且低于正常对照组。研究结果说明DMB能有效缓解脂肪肝病中的炎症因子的表达，从而减少由于炎症对脂肪肝病造成的“二次打击”。

肉毒碱脂酰转移酶-1A(CPT-1A)是体内脂肪酸β-氧化分解代谢的关键酶，该酶蛋白基因表达增加，将会促进肝脏中脂肪分解代谢，减少肝脏中脂质积累。蛋白免疫印迹(Westernbloting)分析表明，高脂模型组小鼠肝脏内肉毒碱脂酰转移酶1A(CPT-1A)的蛋白表达相较于正常对照组显著性降低，而腹腔给药40mg／kg组小鼠肝脏的CPT-1A蛋白表达较模型组明显提高，恢复至正常水平。因此，DMB能提高肝脏脂肪分解代谢能力，有效缓解由于高脂引起的非酒精性脂肪肝病。

本发明所用盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)产品采用常规化学与分离纯化法制得。本实验室采用高效液相色谱(HPLC)分析检测，其纯度达98％以上，并经化学法、质谱(MS)法和核磁共振(¹H-NMR)法分析鉴定，表明本研究所用盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)产品化学结构正确。此项研究表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)其纯度和化学结构符合开展体内、外生物学活性和药理作用研究要求。

根据本发明还涉及含有作为活性成份的盐酸去亚甲基小檗碱和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有O.1～95％重量％的盐酸去亚甲基小檗碱。在单元剂型中本发明化合物一般含量为O.1～100mg。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和／或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂如琼脂粉、干燥粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成份本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和／或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、分散剂、渗透压调节剂、增溶剂和pH调节剂。如稀释可选用水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、甘油、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂，还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或香料等。这些辅料是本领域常用的。

本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌过虑器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。

为了达到用药目的，增加治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。当然用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。

对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。

给药剂量是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

去亚甲基小檗碱既是药用植物芸香科植物黄柏中存在的天然产物，又是小檗碱在体内肝脏中的代谢产物，天然环保，无毒高效。本发明提供了盐酸去亚甲基小檗碱在制备治疗非酒精性脂肪肝病中的作用和用途。

术语

DMB：盐酸去亚甲基小檗碱；

ALT：谷丙转氨酶；

TG：甘油三酯；

TC：总胆固醇；

MDA：丙二醛；

GSH：谷胱甘肽；

IP：腹腔注射；

NAFLD：非酒精性脂肪肝病；

NASH：非酒精性脂肪肝炎；

SREBP：胆固醇调节元件结合蛋白；

TNF-α：肿瘤坏死因子-α；

IL-1β：白细胞介素1β；

CPT-1A：肉毒碱脂酰转移酶1A；

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(蛋白免疫印迹分析中内参)；

Cyclophilin A(Peptidylprolyl Isomerase A)：肽酰脯氨酰异构酶A(亲环素A)(qRT-PCR分析中内参)

附图说明

图1DMB对HepG2细胞中由棕榈酸钠诱导的脂质累积的影响

其中，A，B：正常HepG2细胞油红O染色图(×200，×400)；C，D：棕榈酸钠诱导模拟非酒精性脂肪肝损伤的HepG2细胞油红0染色图(×200，×400)；E，F：201μM DMB逆转棕榈酸钠诱导模拟非酒精性肝损伤的HepG2油红O染色图(×200，×400)

图2DMB对小鼠非酒精肝损伤保护作用的肉眼观图

其中，A-E：DMB预防性治疗对4周高脂喂养诱导的非酒精性肝损伤小鼠肝功能的保护作用的肉眼观图，分别为正常对照组，高脂模型组，DMB低、中和高剂量组

图3DMB对高脂诱导的非酒精性脂肪肝病病理学影响

其中，A，B：正常小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；C，D：高脂诱导非酒精性肝病模型小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；E，F：DMB低剂量组小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；G，H：DMB中剂量组小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；I，J：DMB高剂量组小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)

图4DMB对高脂诱导的非酒精性脂肪肝病相关基因的表达调控

其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs Model Group

图5DMB对高脂诱导的非酒精性脂肪肝病肝CPT-1A蛋白质的表达影响

具体实施方式

下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对体外非酒精性脂肪肝的保护作用

方法：采用油红O染色法，体外检测盐酸去亚甲基小檗碱的抗非酒精性脂肪肝的能力。取对数生长期的人肝细胞HepG2(ATCC)接种于24孔细胞培养板(Costar)内，以添加10％胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司，批号：20120927)的DMEM培养基(Gibico，批号：1312056)培养24小时后，除正常对照组加入相同赋形剂外，均加入200μM棕榈酸钠(Palmitate Sodium，PA)，给药组同时加入20μM的DMB，孵育24小时后，4％中性甲醛固定细胞，油红O染色，观察脂质累积情况。油红0属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三酯结合呈小脂滴状。脂溶性染料能溶于组织和细胞中的脂类，它在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当细胞爬片或组织切片置于染液时，染料离开染液而溶于组织内的脂质(如脂滴)中，使组织内的脂滴呈橘红色。根掘这一原理，抗脂质累积以保护非酒精性脂肪肝作用越明显，油红O染色累积的橘红色越少。

结果：实验结果显示，200μM棕榈酸钠作用24小时能明显诱导HepG2细胞中的脂质累积，表明此种细胞模型模拟非酒精性脂肪肝脂质累积是稳定可靠的，而在20μM浓度下，给药盐酸去亚甲基小檗碱组的HepG2中脂质累积程度明显小于模型组，趋于正常对照组水平，表明DMB的抗脂质累积能力明显，提示盐酸去亚甲基小檗碱对非酒精性脂肪肝具有潜在的治疗作用，结果如图1所示。

实施例2.高脂喂养诱导的非酒精性肝病小鼠模型制作

本实施例中高脂饲料脂肪供能60％，蛋白质供能20％，碳水化合物供能20％。具体高脂饲料配方(500g)为：猪油181.5g，食用油12.5g，一水柠檬酸1.7g，氯化钾0.575g，碳酸氢钠5.25g，蔗糖87.5g，麦芽糊精85g，酪蛋白114g，羧甲基纤维素钠1g，胆固醇2.5g，猪胆盐0.5g，复合维生素片(善存)5粒；猪油加热融化后，加入各成分搅拌均匀(复合维生素片碾碎)后，放入-20℃冰箱中10-15分钟成模，取出后切成合适大小于-20℃冰箱中保存。饲料猪油、蔗糖、食用油、酪蛋白、麦芽糊精、食用级羧甲基纤维素钠以及复合维生素片(善存)购于市面超市或药店(食用级)，其余成分购于国药集团化学试剂有限公司。

方法：雄性ICR小鼠，购于扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2013-0004，体重18-22克，适应6天后，随机分为2组，每组16只，分别为正常对照组、高脂模型组。正常对照组喂食正常饲料，高脂模型组喂食高脂饲料，自由饮食摄水。分别于第2周、第4周末每组抽取8只，禁食过夜，摘眼球取血，静置30分钟，离心3000rpm／10min，常规分离血清。血清中ALT活性测定采用南京建成试剂盒产品(赖氏法，批号：20131224)，TC试剂盒(COD-PAP法，批号：131521)以及TG试剂盒(GPO-PAP法，批号：131521)均购于北京中生北控公司。

结果：实验结果如表1所示。小鼠经2周高脂喂养后，与正常组相比，模型组小鼠血清ALT升高50％，肝脏TC和TG分别升高50％和26.7％(肝TG含量约为肝湿重的2.8％)，虽各项指标均有显著性升高，但未达到一般药理学定义的非酒精性肝病的损伤标准(ALT>40U／L；肝脏TG含量占肝湿重>5％)。而小鼠经4周高脂喂养后，与正常组相比，模型组小鼠血清ALT升高2.8倍，肝脏TC和TG分别升高2.3倍和2.5倍(肝TG含量约为肝湿重的5.3％)，各项指标均有显著性升高，也均达到一般药理学定义的非酒精性肝病的损伤标准(ALT>40U／L；肝脏TG含量占肝湿重>5％)，表明采用本实施例中的高脂饲料配方，4周高脂喂养ICR小鼠构建小鼠非酒精性肝病的模型的达标可靠的，成功的动物模型是后续药理药效学研究提供了保障。

表1不同喂食时间对高脂喂养诱导小鼠非酒精性肝病模型的影响

实施例3.DMB对高脂喂养诱导的非酒精性脂肪肝病小鼠肝功能的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，购于扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2013-0004，体重18-22克，适应6天后，随机分为5组，每组8只。5组分别为正常对照组、模型组、DMB低剂量给药组(20mg／kg，IP)、中剂量给药组(30mg／kg，IP)和高剂量给药组(40mg／kg，IP)。造模同时给药组连续腹腔注射给药4周，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。术次给药后禁食过夜，摘眼球取血，静置30分钟，离心3000rpm／10rmin，常规分离血清。用南京建成试剂盒分析测定血清中ALT活性(赖氏法，批号：20131224)。

结果：实验结果如表2所示。小鼠经高脂喂养后，与正常组相比模型组小鼠血清ALT升高2.8倍，与模型组相比，DMB低剂量(20mg／kg，IP)、中剂量(30mg／kg，IP)和高剂量(40mg／kg，IP)给药组ALT分别降低72.6％、82.0％和72.8％，均能显著降低高脂喂养小鼠非酒精性脂肪肝病引起的ALT升高，趋于正常水平。由此可见，DMB具有明显的抗非酒精性脂肪肝损伤和保护肝功能的作用。

表2DMB对高脂喂养诱导的非酒精性肝病小鼠ALT的影响

实施例4.DMB对高脂喂养诱导的非酒精性脂肪肝病脂代谢的调节

方法：分组、造模及给药方案同实施例1，末次给药后禁食过夜，处死动物，取同一部位肝组织，于冰浴上以PBS制成10％肝匀浆。按试剂盒说明测定肝脏TC和TG值，并计算含量(μg／mg prot)。TC试剂盒(COD-PAP法，批号：131521)以及TG试剂盒(GPO-PAP法，批号：131521)均购于北京中生北控公司。

结果：实验结果如表3所示。与正常组相比，高脂喂养模型组小鼠肝TC和肝TG分别升高2.3倍和1.5倍。与模型组相比，DMB低剂量给药组肝TC和肝TG分别降低了61.6％和54.7％，；DMB中剂量给药组肝TC和肝TG分别降低了53.4％和54.5％，；DMB高剂量给药组肝TC和肝TG分别降低了72.1％和65.7％。DMB低、中和高剂量给药组均能显著降低高脂诱导的小鼠非酒精性脂肪肝病引起的TC和TG升高，使之恢复至正常水平。实验表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)能有效地改善高脂诱导引起的脂代谢紊乱，加速脂肪转运，防止高脂诱导引起的非酒精性肝脂肪堆积和脂肪肝病。

表3DMB对高脂喂养诱导的非酒精性脂肪肝病脂代谢的调节

实施例5.DMB对高脂诱导的非酒精性脂肪肝病氧化损伤的保护作用

方法：分组、造模、给药方案及脏器获取、匀浆同实施例2。按照试剂盒说明测定肝组织中脂质过氧化物MDA及抗氧化物质GSH水平。MDA试剂盒(TBA法，批号：20131121)以及GSH试剂盒(DTNB法，批号：20131220)均购于南京建成生物工程研究所。

结果：实验结果如表4所示。与对照组相比，高脂诱导模型组小鼠肝脏脂质过氧化物MDA升高3.7倍，GSH降低38.9％。与模型组相比，DMB低剂量、中剂量和高剂量组MDA分别降低59.3％、73.2％和81.3％，而GSH分别升高63.4％、72.2％和74.3％。研究结果表明DMB具有显著降低脂质过氧化产物MDA水平，促进GSH再生，增强肝脏自由基的清除能力，从而减少由于体内过氧化物堆积造成对肝脏的“二次打击”损伤，保护肝脏的功能。

表4DMB对高脂诱导的非酒精性脂肪肝病氧化损伤的保护作用

实施例6.DMB对高脂诱导的非酒精性脂肪肝病病理学影响

方法：分组、造模及给药方案同实施例1，末次给药后禁食过夜，处死动物，取同一部位肝组织，以10％甲醛固定，HE染色进行病理学检查。

结果：肉眼观察各组小鼠发现，模型组小鼠相较于正常对照组小鼠明显在喂食高脂饲料中期(1-2周)毛发先呈现光亮发油状态，后逐渐无暗淡光泽，小鼠易受惊吓、易怒，略有虚弱态。而各给药组小鼠在喂食高脂饲料中期(1.5-2.5周)毛发也略光亮发油，末期毛发仍稍有发油，基本趋于正常，小鼠活动活跃，无明显虚弱状。解剖后裸眼观察各组小鼠肝脏发现，正常对照组肝脏表面光滑，颜色红润，高脂模型组肝脏肿大，表面略有粗糙、斑点，颜色偏黄白色，DMB各剂量组均可明显改善肝脏外观，颜色恢复偏红色，无明显斑点，结果如图2所示。肝脏病理学研究结果表明，正常对照组的肝脏形态未见异常，高脂模型组则出现肝脏中央静脉周围中度或重度的肝细胞水肿，胞浆疏松淡染或肝细胞脂肪变性，病理学结果显示非酒精性脂肪肝模型成功可靠。而DMB低、中和高剂量组均可明显减轻上述肝细胞病变：低剂量组肝细胞脂肪变性明显减轻(轻度或中度)，中剂量组基本无明显脂肪变性，而有轻度或中度的肝细胞水肿，高剂量组则基本与正常组无异，无明显肝细胞水肿或脂肪变性，结果如图3所示。

实施例7.DMB对高脂诱导的非酒精性脂肪肝病相关基因的表达调控

方法：分组、造模及给药方案同实施例1，末次给药后禁食过夜，处死动物，取正常对照组、高脂模型组以及DMB高剂量组同一部位肝组织约25mg，提取RNA，用于定量PCR分析，检测肝脏内脂代谢以及炎症相关基因的表达量。其中，胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)1c与2分别与肝脏甘油三酯以及胆固醇合成相关，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与白介素1β(IL-1β)与炎症相关，在非酒精性脂肪肝病变中，SREBP家族以及炎症相关基因表达会有所增加。

结果：模型组小鼠肝脏SREBP1c以及SREBP2表达均明显高于正常对照组，分别为正常对照组的2.37以及3.10倍，腹腔给药DMB40mg／kg的小鼠肝脏SREBP家族mRNA含量显著减少，SREBP1C以及SREBP2的基因表达分别相较于模型组降低了69.07％以及75.10％，达到正常组水平，表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)通过有效降低SREBP家族的基因表达，减少肝脏中脂质的合成和累积，能有效缓解非酒精性肝病症。同时，模型组小鼠肝脏炎症相关基因(TNF-α以及IL-1β)表达明显高于正常对照组，分别为正常对照组的4.61以及3.15倍，给药DMB后，小鼠炎症相关基因表达显著降低，TNF-α和IL-1D的基因表达较于模型组分别降低了90.68％及93.34％，且低于正常对照组，表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)可通过有效降低炎症相关基因的表达，减少炎症反应，从而缓解由于炎症引发的对肝脏的“二次打击”，结果如图4所示。

实施例8.DMB对高脂诱导的非酒精性脂肪肝病中肝脏CPT-1A的调节

方法：分组、造模及给药方案同实施例1，末次给药后禁食过夜，处死动物，取于常对照组、高脂模型组以及DMB高剂量组同一部位肝组织约0.1g，提取蛋白，用于蛋白免疫印迹分析，检测肝脏内肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(CPT-1A)的蛋白表达量。CPT-1A是脂代谢途径中β-氧化的限速酶，在脂代谢中的地位十分重要，在非酒精性脂肪肝病变中，肝脏CPT-1A表达会有所减少，脂代谢减少，从而引发脂质在肝中的不断累积。

结果：模型组小鼠肝脏CPT-1A蛋白表达均明显低高于正常对照组，给药DMB后，小鼠肝脏CPT-1A蛋白含量显著增加，表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)通过有效提高CPT-1A的蛋白表达，增加肝脏中脂肪的氧化代谢，减少脂质的累积，能有效缓解非酒精性肝病肝中脂肪积累，结果如图5所示。

Claims (3)

1.如式(I)所示的盐酸去亚甲基小檗碱在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用。

2.一种预防或治疗非酒精性脂肪肝病的药物组合物，其特征在于，含有药物有效剂量的如式(I)所示盐酸去亚甲基小檗碱及药用载体。

3.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释剂及各种微粒给药系统。

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