CN103494813A - 盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗急慢性酒精性肝病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了如式(I)所示的盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗急、慢性酒精性肝病药物中的应用。

Description

盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗急慢性酒精性肝病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防或治疗急、慢性酒精性肝病药物中的应用。 

背景技术

长期大量饮酒，极易形成酒精性肝病。酒精性肝病按其病理可分为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。中国是世界上酿酒最早的国家，也是世界上的饮酒大国。近年来，酒精性肝病在我国逐年增加，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。目前有关酒精性肝病的发病机制尚不十分清楚。一般认为酒精作为初次打击，通过氧化应激促使活性氧(ROS，Reactive Oxygen Species)增加，诱发肝脏脂肪聚集。在氧化应激相关的脂质过氧化及炎性细胞因子的作用下，脂肪变性的肝细胞发生第二次打击，造成肝脏炎症、坏死和纤维化。另外，酒精引进肠道屏障功能受损，肠源性内毒素与脂多糖进入体内，能显著增加炎性细胞因子的转录与释放，炎性因子产生炎症放大效应，刺激星状细胞向成纤维细胞转化，导致肝纤维化的发生。乙醇代谢产物乙醛能与多种蛋白质结合，其结合产物具有很强的免疫原性，刺激机体产生抗体引起免疫损伤，导致包括蛋白酶在内的重要蛋白质以及DNA的损伤。因此，酒精性肝病的发生与发展与酒精及其代谢产物的毒性密切相关。这些毒性产物会引发肝细胞内活性氧(ROS)增加并诱发炎症，最终导致体内一系列正常生理、生化反应的紊乱。酒精性肝病如不及时治疗，将会转变酒精性肝硬化并发肝癌。 

目前临床上用于治疗酒精性肝病的药物不多。S-腺苷蛋氨酸治疗可以改善酒精性脂肪肝患者的临床症状和生物化学指标。多烯磷脂酰胆碱对酒精性脂肪肝患者有防止组织学恶化的趋势。甘草酸制剂、水飞蓟素类、多烯磷脂酰胆碱和还原型谷胱甘肽等药物有不同程度的抗氧化、抗炎和保护肝细胞膜及细胞器等作用，临床应用可改善肝脏生物化学指标。这些药物有的价格昂贵，有的效果不显著。因此，研发安全有效治疗酒精性肝病的治疗药物已成为当前药物研究的热点领域之一。 

盐酸去亚甲基小檗碱，如式(I)所示，又名去亚甲基小檗碱盐酸盐或脱亚甲基小檗碱盐酸盐 

盐酸去亚甲基小檗碱(式I)的英文名为Demethyleneberberine Hydrochloride或Demethyleneberberine Chloride。本发明专利将它简称为DMB。式(I)中的骨架结构为去亚甲基小檗碱，它是盐酸去亚甲基小檗碱的活性成份。国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)将式(I)中的有机结构部分去亚甲基小檗碱命名9.10-dimethoxy-5，6-dihydroisoquinolino[2，1-b]isoquinolin-7-ium-2.3-diol，其中文名为9，10-二甲氧基-5，6-二氢异喹啉[2，1-b]异喹啉-7-鎓-2，3-二羟基。它的分子式：C₁₉H₁₈NO₄ ⁺，分子量为：324.35。化学文摘号(CAS)为：25459-91-0。去亚甲基小檗碱可以与无机酸或有机酸形成多种盐，如氯化盐、硫酸盐、磷酸盐、溴化盐、碘化盐、枸橼酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐等分子形式存在。 

去亚甲基小檗碱存在于天然药用植物芸香科植物黄柏(Cortex Phellodendri Chinensis)中，由于含量较低，相关活性研究很少。有报道认为它在体外对多种革兰阳性及阴性菌均具有抑菌作用。近年来人们对小檗碱研究非常活跃，发现小檗碱除抗菌活性外，还具有降血糖、降血脂、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等药理作用。人们在研究小檗碱体内代谢过程中，发现小檗碱在体内经肝脏代谢亦可产生去亚甲基小檗碱，但对该代谢产物的药理治疗作用研究和应用未见报道。 

迄今为止，现有技术中没有关于盐酸去亚甲暴小檗碱或去亚甲基小檗碱对急、慢性洒精性肝病预防和/或治疗作用的记载和报道。 

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种预防或治疗急、慢性酒精性肝病的化合物，特别是提供了如式(I)所示的盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)作为预防或治疗急、慢性酒精性肝病药物的应用。 

本发明通过建立急、慢性酒精性肝损伤动物模型，观察盐酸去亚甲基小檗碱对急、慢性酒精肝损伤的预防与治疗作用并探讨其作用机理。研究结果表明，盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对酒精急性中毒和急、慢性酒精性肝损伤具有预防保护和治疗作用。 

本发明通过T-AOC法分析盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)的体外抗氧化活性，实验结果显示，在200μM、400μM浓度下，盐酸去亚甲基小檗碱的抗氧化能力与阳性对照药维生素C(Vc)无显著差异，盐酸去亚甲基小檗碱随着浓度升高，其抗氧化活性逐渐加强。表明盐酸去亚甲基小檗碱在体外具有很强的抗氧化活性。另外，本发明还采用ROS探针法，利用荧光探针DCFH-DA与ROS结合产生荧光的性质，通过细胞培养、荧光显微镜和流式细胞仪分析去亚甲基小檗碱对ROS的清除作用。研究结果表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)在细胞水平上对ROS有很强的清除作用。过量ROS(Reactive Oxygen Species)对细胞具有损伤作用，酒精在肝脏内会诱发肝细胞内ROS的大量增加，ROS是诱发酒精性肝病的重要致病因子。因此，本发明首次发现盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)具有体内、外的抗氧化活性，这为开展DMB治疗 酒精性肝病研究奠定了重要的理论基础。 

本发明通过MTT法，细胞水平分析DMB毒性，研究结果表明：当盐酸去亚甲基小檗碱浓度小于50μM时，对正常细胞的生长无促进或抑制作用。采用实验动物体内毒性试验研究发现，当小鼠静脉注射盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)为20mg/kg(IV)时，小鼠生活正常，无死亡现象。当静脉注射量为30mg/kg时，两周内小鼠有一半死亡。因此，盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)的LD₅₀为30mg/kg。与盐酸小檗碱静脉注射LD₅₀9.0mg/kg相比，盐酸去亚甲基小檗碱的毒性较低，安全性更好。受试样品的毒性试验是开展药理治疗研究的重要前提。 

本发明通过小鼠为动物模型，研究发现盐酸去亚甲基小檗碱对乙醇(酒精)引起的小鼠急性肝中毒具有保护作用。小鼠灌胃酒精(6g/kg)1h后，DMB给药组分别给予20mg/kg(IP)和40mg/kg(IP)药物治疗，模型组给予相同剂量的赋形剂，3h后观察小鼠睡眠情况。以翻正反射为标准，酒精中毒4h后模型组有一半小鼠都处于昏睡状态，翻正反射消失；而经DMB高或低剂量治疗组小鼠4h后均恢复翻正反射，状态较为清醒。本发明结果表明DMB对高剂量酒精引起的中毒反应具有良好的防护作用。 

本发明以小鼠为动物试验模型，通过预防性给药治疗，考察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对急性酒精性肝损伤的预防性治疗作用。预防性治疗方案是在给酒精造模型之前，分别通过灌胃给予小鼠DMB，给药组分别设置了150mg/kg(IG)或300mg/kg(IG)两个剂量组。给药两周后，再用6g/kg的酒精量给小鼠灌胃，每12小时灌胃一次，共三次，使小鼠产生急性酒精性肝损伤，末次灌胃酒精6小时后，处死动物小鼠。实验结果分析表明，DMB给药组，无论是低剂量组或高剂量给药组，均能显著降低小鼠急性酒精性肝损伤引起的ALT和AST升高作用，显示出DMB抗酒精性肝损伤和保护肝功能的作用。实验结果还显示DMB低剂量给药组血清TG、肝TG和肝TC分别降低了44.5％、50.6％和54.8％，但血清中HDL-C则升高了42.9％；DMB高剂量给药组血清TG、肝TG和肝TC分别降低了45.3％、36.1％和53％，而血清中HDL-C则升高了55.5％。这此结果DMB能有效地改善酒精引起的脂代谢紊乱，加速脂肪转运，防止酒精引起的肝脂肪堆积和脂肪肝。此外，与模型组相比，DMB低剂量和高剂量组MDA分别降低30.6％和29.7％，而GSH分别升高41.4％和64.7％，GPx活性分别提高了31.1％、和45.6％，CAT活性分别提高了28.6％和38.8％。这些研究结果表明DMB具有降低脂质过氧化产物MDA水平，促进GSH再生，增强肝脏自由基的清除能力。肝脏病理学研究结果表明：小鼠急性酒精损伤模型组则出现肝脏中央静脉周围肝细胞脂肪和水样变性。盐酸去亚甲基小檗碱预防给药组可明显减轻上述肝细胞病变，使之恢复正常或接近于正常水平。这些实验结果充分地说明了盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)能有效地预防治疗急性酒精引起的肝损伤肝病。 

本发明在预防性治疗成功的基础上，开展治疗性实验研究，考察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对急性酒精性肝损伤的直接治疗作用。此方案是在急性酒精肝损伤前，并不预先给予DMB作预防，而是用7g/kg酒精(乙醇)量给小鼠灌胃，每12小时灌胃一次，共三次， 使小鼠产生急性酒精性肝损伤。在每次灌胃酒精后1小时，采用腹腔注射(IP)法快速给予DMB治疗，末次灌胃酒精6小时后，处死动物小鼠。实验结果表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)治疗后，治疗组小鼠血清ALT和AST、肝脏TG和肝脏TC等生化指标以及氧化损伤指标MDA均恢复并接近正常对照组水平，同时DMB还能升高抗氧化指标GSH水平。这些实验结果说明：无论是预防性治疗还是直接治疗，盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)均能有效地预防和/或治疗急性酒精性肝损伤肝病。 

本发明还通过制备动物小鼠慢性酒精性肝损伤模型，考察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对小鼠慢性酒精性肝损伤的治疗与保护作用。小鼠经含有6％酒精的液体饲料(L-D)喂养5周后，处死小鼠。实验显示模型组小鼠血清ALT等生化指标明显上升，而盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)40mg/kg(IP)给药后，治疗组血清ALT、AST、肝脏TG和TC水平分别下降，并恢复至对照组正常水平。模型组小鼠肝脏MDA含量升高至正常组的64.8％，而DMB给药治疗后，其MDA值下降了26.2％，结果表明DMB对慢性酒精性肝损伤具有很好的抗氧化作用。模型组小鼠肝重/体重比升高至正常组的17.3％，而DMB给药组治疗后，与模型组相比，治疗组小鼠的肝重/体重比降低了21.3％，恢复至正常水平。肝脏病理学研究结果表明，正常对照组的肝脏形态未见异常，模型组动物肝细胞肿胀，胞浆疏松，水样变性明显，部分肝细胞呈气球样变，部分模型组动物可见肝细胞脂肪变性，小灶性坏死和炎细胞浸润。给药组上述病变明显减轻，恢复至接近正常对照组。这些结果表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对慢性酒精性肝损伤肝病具有预防和治疗作用。 

本发明所用盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)产品采用常规化学与分离纯化法制得。本实验室采用高效液相色谱(HPLC)分析检测，其纯度达98％以上，并经化学法、质谱(MS)法和核磁共振(¹H-NMR)法分析鉴定，表明本研究所用盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)产品化学结构正确。此项研究表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)其纯度和化学结构符合开展体内、外生物学活性和药理作用研究要求。 

根据本发明还涉及含有作为活性成份的盐酸去亚甲基小檗碱和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1～95％重量％的盐酸去亚甲基小檗碱。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1～100mg。 

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。 

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。 

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。 

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、 乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。 

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。 

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。 

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂如琼脂粉、干燥粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。 

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成份本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。 

例如，将本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、分散剂、渗透压调节剂、增溶剂和pH调节剂。如稀释可选用水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、甘油、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂，还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。 

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或香料等。这些辅料是本领域常用的。 

本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌过虑器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、 或通过将组合物加热灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。 

为了达到用药目的，增加治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。当然用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。 

对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。 

给药剂量是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。 

去亚甲基小檗碱既是药用植物芸香科植物黄柏中存在的天然产物，又是小檗碱在体内肝脏中的代谢产物，天然环保，无毒高效。本发明提供了盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗急、慢性酒精性肝病药物中的作用和用途。 

术语 

DMB：盐酸去亚甲基小檗碱 

ALT：谷丙转氨酶； 

AST：谷草转氨酶； 

TG：甘油三酯； 

CHOL：胆固醇； 

TC：总胆固醇； 

LDL-c：低密度脂蛋白胆固醇； 

HDL-c：高密度脂蛋白胆固醇； 

MDA：丙二醛； 

GSH：谷胱甘肽； 

CAT：过氧化氢酶； 

GPX：谷胱甘肽过氧化物酶； 

L-D：Liber-Decarli全营养酒精液体饲料 

LD₅₀：半数致死量 

IP：腹腔注射 

IV：静脉注射 

IG：灌胃 

附图说明

图1盐酸去亚甲基小檗碱的HPLC分析图 

图2盐酸去亚甲基小檗碱的质谱图 

图3盐酸去亚甲基小檗碱的¹H-NMR图 

图4T-AOC分析法检测DMB的抗氧化活性 

图5DMB抑制HepG2细胞中由过氧化氢诱导产生ROS 

其中，A：荧光显微镜观察；B：流式细胞分析图；C：流式细胞分析荧光强度图 

图6DMB对HepG2和L02细胞存活率的影响 

其中，A：DMB对HepG2的生长影响；B：DMB对L02的生长影响 

图7急性酒精肝损伤小鼠肝组织病理形态和肝细胞超微结构的变化 

其中，A，B：正常小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；C，D：酒精损伤模型小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；(E，F：DMB低剂量组小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；G，H：DMB高剂量组小鼠肝组织HE染色图(×200，×400) 

图8慢性酒精肝损伤小鼠肝组织病理形态和肝细胞超微结构的变化 

其中，A，B：正常小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；C，D：酒精损伤模型小鼠肝组织HE染色图(×200，×400)；E，F：DMB低剂量组小鼠肝组织HE染色图(×200，×400) 

具体实施方式

下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 

一、理化性质试验 

本发明所用盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)为药用级天然提取物，纯度为98％。外观为橙黄色粉末，无臭。熔点220℃-222℃。易溶于DMSO，甲醇，热水，微溶于冷水或乙醇，极微溶于氯仿，乙酸乙酯，不溶于乙醚。为了开展有效的药理学活性研究，本研究首先对DMB纯度与化学结构进行分析鉴定。 

实施例1.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)纯度分析 

方法：采用HPLC方法分析，将DMB用甲醇溶解，并经0.22um微孔滤膜过滤，配成终浓度为20ng/ul样品准备分析。HPLC色谱仪：Agilentl200高效液相色谱仪。色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×150mm，5um)。流动相：(A)水(含0.1％的甲酸)，(B)乙腈(含0.1％的甲酸)。HPLC梯度洗脱条件：Omin，10％B；0-15min，90％B；15-18min，90％B；18-20min，10％B；20-24，10％B。检测波长：349nm。柱温：30℃，流速：1.0ml/min，进样体积：10ul。 

结果：HPLC分析结果如图1所示，盐酸去亚甲基小檗碱的保留时间为6.639min，纯度大于98.0％以上，符合生物活性和药理学实验研究要求。 

实施例2盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)的结构鉴定 

方法：分子结构鉴定采用质谱和核磁共振波谱分析法。质谱仪器为Waters Q-TOF MicroTM，离子化方式：ESI(+)，质量扫描范围：m/z80-1000，毛细管电压：2500V，锥孔电压：25V，离子源温度：100℃，雾化气温度：200℃，锥孔气流速：50L/hr，雾化气流速：400L/hr。核磁共振波谱仪(¹H-NMR)为AVANCE AV-300，照射频率为300MHz，所用溶剂：氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)，所用标准物为四甲基硅烷(TMS)。 

结果：去亚甲基小檗碱的正离子质谱分析结果如图2所示，ESI-MS(m/z)：分子离子基峰[M-Cl]⁺＝324.2和[MH-Cl]⁺325.2。这与去亚甲基小檗碱的理论分子量相一致，盐酸去亚甲基小檗碱中的氯离子在质谱ESI(+)中无显示。按中国药典(2010年版，第二部)附录III中有关氯化物的鉴别(1)反应方法鉴定氯离子。取DMB0.1克，加水20ml，缓缓加热溶解后，加硝酸0.5ml，冷却，放置10分钟，过滤，向滤液中滴加硝酸银试液后，生成白色凝乳状沉淀，离心，收集沉淀，沉淀中加氨试液溶解，再加稀硝酸酸化后，沉淀生成。表明本实验样品盐酸去亚甲基小檗碱中含有氯离子。质谱和化学分析法显示盐酸去亚甲基小檗碱分子量正确。 

盐酸去亚甲基小檗碱的¹H-NMR(DMSO-d6)氢谱分析结果如图3所示，DMB分子中各种氢的归属见表1。¹H-NMR图谱中去亚甲基小檗碱分子中2，3位的两酚羟基峰显著，分别位于δ9.4101(s，1H)和10.2117ppm。这与参照品小檗碱的标准氢谱图中所没有的，表明去亚甲基小檗碱结构正确。另外，图3中δ2.5072为溶剂峰，δ3.3658为水峰。 

表1盐酸去亚甲基小檗碱的化学位移和氢归属(1H-NMR，DMSO-d6) 

我们还对DMB进行了碳谱(¹³C-NMR)和红外光谱(IR)测试分析，均表明DMB结构 正确定，相关图谱未给出。以上结果表明本研究所用样品盐酸去亚甲基小檗碱结构正确，符合生物活性和药理学研究要求。 

二、生物活性试验 

实施例3.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)体外水平的抗氧化活性 

方法：采用T-AOC法，体外检测盐酸去亚甲基小檗碱的抗氧化能力。具有抗氧化活性的物质可以使总抗氧化试剂T-AOC(total antioxidant capability)中Fe³⁺还原成Fe²⁺，后者可与菲林类物质形成稳定的络合物，520nm比色可检测出其抗氧化能力的高低。根据这一原理抗氧化活性强的物质，将会增加反应后有色产物的生成量，使520nm的吸光值增加。 

结果：实验结果显示，在200μM、400μM浓度下，盐酸去亚甲基小檗碱的抗氧化能力与Vc无显著差异；但800μM、1600μM、3200μM浓度下，Vc显示出了更强的抗氧化能力，如图4所示。与阳性对照药物维生素Vc相同，盐酸去亚甲基小檗碱随着浓度升高，其抗氧化活性逐渐加强。表明盐酸去亚甲基小檗碱具有很强的抗氧化活性。 

实施例4.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)细胞水平的抗氧化活性 

方法：用ROS探针法，细胞水平检测盐酸去亚甲基小檗碱对ROS的清除作用。过氧化氢H₂O₂(1mM)刺激肝癌细胞株(HepG2)15min后，即可产生大量ROS(Reactive OxygenSpecies)损伤细胞。细胞培养液中给予盐酸去亚甲基小檗碱(50μM)预处理2h，利用荧光探针DCFH-DA(50uM)与ROS结合产生荧光的性质，荧光显微镜下观察盐酸去亚甲基小檗碱对ROS的清除作用。另外还采用流式细胞仪检测荧光强度，分析盐酸去亚甲基小檗碱对ROS清除作用。 

结果：荧光显微镜法和流式细胞仪分析法均显示50μM DMB能显著性抑制过氧化氢在HepG2细胞中产生的ROS，其结果与阳性对照品50μM的维生素C(Vc)相当，如图5所示。生物体内的多种疾病均涉及ROS的产生和氧化应激反应，如酒精性肝病就涉及ROS的产生。盐酸去亚甲基小檗碱抗氧化活性为开展疾病治疗的药理学研究提供了生物学基础。 

三、毒性试验 

实施例5.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)的细胞水平毒性试验 

方法：采用MTT法，细胞水平检测盐酸去亚甲基小檗碱对细胞生长的抑制作用。将肝癌细胞株(HepG2)和正常肝细胞株(L02)分别按细胞数4×10⁴/cm²接种于96孔中，培养24小时，当细胞处于生长旺盛期，加入不同浓度的盐酸去亚甲基小檗碱，分别给药处理24小时 和48小时后，每孔加入20μl的MTT(5mg/ml)，继续孵育4h后取出，吸净培养基，每孔加150μl DMSO，摇床上振荡10min后，490nm处测吸光度。 

结果：盐酸去亚甲基小檗碱对肝癌HepG2细胞株有促进生长的作用，如图6所示。当盐酸去亚甲基小檗碱浓度为50μM时，24小时处理细胞后，细胞生长增加2.8倍。但盐酸去亚甲基小檗碱在高浓度表现出对正常肝细胞株L02有生长抑制作用。而当它的浓度小于50μM时，则对细胞株L02的生长无促进或抑制作用。细胞生物学试验表明盐酸去亚甲基小檗碱对细胞生成没有抑制作用。 

实施例6.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)的动物毒性试验 

方法：利用动物试验法体内水平分析盐酸去亚甲基小檗碱的毒性试验。实验动物采用ICR小鼠18-22g，雌雄各半。本发明研究所用动物小鼠均来自南京医科大学实验动物中心(苏SCXK，2013-0005)，所有动物实验均按江苏省和中国药科大学实验动物管理与操作要求进行。动物饲养于25℃、相对湿度60-75％的条件下，适应性喂养1周后开始实验。本发明实验选用DMB低剂量组为20mg/kg(IV)、高剂量组为30mg/kg(IV)。动物分三组，溶剂对照组、低剂量给药组和高剂量给药组，每组10只，雌雄各半。盐酸去亚甲基小檗碱浓度分别为：3.0mg/ml和2.0mg/ml，给药体积10ml/kg。采用一次性大剂量尾静脉给药(IV)，记录发生中毒死亡的时间基本在5-10min内死亡，死亡前表现的特点浑身抽搐，呼吸短促，几分钟后死亡，及时解剖肉眼未发现器官异常。个别小鼠抽搐，很快缓解，可恢复正常，继续观察2周，活动、行为正常。其中雌鼠存活较雄鼠多，耐受好。 

结果：持续观察2周，存活下来的小鼠活动状态一切正常。实验结果表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)静脉注射(IV)毒性剂量LD₅₀的参考值为30mg/kg，而盐酸小檗碱静脉注射(IV)的LD₅₀为9.0mg/kg(Food and Chemical Toxicology，2010，48:1105-1110)。由此说明盐酸去亚甲基小檗碱比盐酸小檗碱毒性低。 

表2静脉注射(IV)盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)的毒性(LD₅₀) 

四、药理实验研究 

实施例7.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对小鼠酒精中毒的保护作用 

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24克，随机分为4组，每组8只。正常组、酒精中毒模型组、DMB低剂量组(10mg/kg，IP)和DMB高剂量组(40mg/kg，IP)。除正常组以外的小鼠均灌胃酒精(6g/kg)刺激，1h后给药组给予相应剂量的药物治疗，模型组给予相同剂量的赋形剂，3h后观察小鼠睡眠情况。 

结果：实验结果表明DMB对高剂量酒精引起的中毒反应具有良好的防护作用，以翻正反射为标准，酒精中毒4h后模型组有一半小鼠都处于昏睡状态(4/8)，翻正反射消失；而经DMB高或低剂量治疗组小鼠4h后均恢复翻正反射，状态较为清醒。 

实施例8.DMB预防性治疗对急性酒精性肝损伤小鼠肝功能的保护作用 

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24克，随机分为4组，每组10只。4组分别为正常对照组、模型组、DMB低剂量给药组(150mg/kg)和高剂量给药组(300mg/kg)。给药组连续灌胃给药2周，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物灌胃给予6g/kg酒精，每12h一次，共三次。末次酒精灌胃后6h处死小鼠，摘眼球取血，静置30分钟，离心3000rpm/10min，常规分离血清。用南京建成试剂盒分析测定血清中ALT和AST活性。 

结果：实验结果如表3所示。小鼠经连续3次酒精灌胃(IG)后，与正常组相比模型组小鼠血清ALT、AST分别升高129％和54.7％，而DMB给药组，无论是低剂量组(150mg/kg，IG)或高剂量(300mg/kg，IG)给药组，均能显著降低小鼠急性酒精性肝损伤引起的ALT、AST升高作用。由此可见，DMB具有明显的抗酒精性肝损伤和保护肝功能的作用。 

表3DMB预防性治疗对急性酒精性肝损伤小鼠ALT和AST影响 

实施例9.DMB预防性治疗对急性酒精性肝损伤脂(TG、TC)代谢的调节 

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24g，随机分为4组，每组10只。4组分别为正常对照组、模型组、DMB低剂量给药组(150mg/kg，IG)和高剂量给药组(300mg/kg，IG)。给药组连续灌胃给药2周，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物灌胃给予6g/kg酒精，每12h一次，共三次。末次酒精灌胃后6h处死动物，摘眼球取血，静置30分钟，离心3000rpm/10min，常规分离血清。采用中生北控生物试剂盒，分析 测定血清中TG和HDL-c值。另外，末次酒精灌胃后6h处死动物，取同一部位肝组织，于冰浴上以PBS制成10％肝匀浆。按北京中生北控公司试剂盒说明测定肝脏甘油三酯、胆固醇，并计算含量(nmol/mg prot)。 

结果：实验结果如表4所示。与正常组相比，模型组小鼠血清TG、肝TG和肝TC分别升高62.8％、61.8％、187％，而血清中HDL-C降低30.8％。与模型组相比，DMB低剂量给药组血清TG、肝TG和肝TC分别降低了44.5％、50.6％和54.8％，但血清中HDL-C则升高了42.9％；DMB高剂量给药组血清TG、肝TG和肝TC分别降低了45.3％、36.1％和53％，而血清中HDL-C则升高了55.5％。实验表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)能有效地改善酒精引起的脂代谢紊乱，加速脂肪转运，防止酒精引起的肝脂肪堆积和脂肪肝。 

表4DMB预防性治疗对急性酒精性肝损伤小鼠脂(TG、TC)代谢的调节 

实施例10.DMB预防性治疗对急性酒精性肝氧化损伤的保护作用 

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24g，随机分为4组，每组10只。4组分别为正常对照组、模型组、DMB低剂量给药组(150mg/kg)和高剂量给药组(300mg/kg)。给药组连续灌胃给药2周，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物灌胃给予6g/kg酒精，每12h一次，共三次。末次酒精灌胃后6h处死动物，不同小鼠取同一部位肝组织，于冰浴上以PBS制成10％肝匀浆。按照试剂盒(南京建成)说明测定肝组织中脂质过氧化物MDA水平。DTNB法测定抗氧化物质GSH。根据试剂盒(南京建成)说明分析肝脏中抗氧化酶CAT和GPx水平。 

结果：如表5所示，与对照组相比，模型组急性酒精肝损伤导致小鼠肝脏脂质过氧化物MDA升高93.8％，GSH降低18.6％，GPx和CAT活性分别降低30.2％、31.3％。与模型组相比，DMB低剂量和高剂量组MDA分别降低30.6％和29.7％，而GSH分别升高41.4％和64.7％，以及GPx活性分别提高了31.1％、和45.6％，CAT活性分别提高了28.6％和38.8％。研究结果表明DMB具有降低脂质过氧化产物MDA水平，促进GSH再生，增强肝脏自由基的清除能力。 

表5DMB预防性治疗对酒精性肝损伤肝脏抗氧化作用 

实施例11.DMB预防性治疗对急性酒精肝损伤病理学改变的保护作用 

方法：雄性ICR小鼠，体重22-24g，随机分为4组，每组10只。4组分别为正常对照组、模型组、DMB低剂量给药组(150mg/kg)和高剂量给药组(300mg/kg)。给药组连续灌胃给药1周，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组动物灌胃给予6g/kg酒精，每12h一次，共三次。末次酒精灌胃后6h处死动物，取肝脏大叶同一部位组织以10％甲醛固定，HE染色进行病理学检查。 

结果：肝脏病理学研究结果表明，正常对照组的肝脏形态未见异常，酒精(6g/kg)模型组则出现肝脏中央静脉周围肝细胞脂肪和水样变性。DMB低和高剂量组均可明显减轻上述肝细胞病变，使之恢复接近于正常水平，如图7所示。 

实施例12.DMB治疗对急性酒精性肝损伤小鼠肝功能的保护作用 

方法：雄性ICR小鼠，22-24g，随机分为4组，每组8只，4组分别为正常对照组、模型组、DMB低剂量组(20mg/kg，IP)、DMB高剂量组(40mg/kg，IP)。除正常对照组外，其余各组动物灌胃给予7g/kg酒精，每12h一次，共三次。DMB给药组小鼠每次被灌胃酒精刺激后1h给予相应剂量的药物治疗，其余各组给予相同剂量的赋形剂。末次酒精灌胃后6h处死动物，摘眼球取血，室温静置30分钟后，4℃离心离心3000rpm/10min，常规分离血清。采用南京建成公司试剂盒分析测定血清中ALT和AST值。 

结果：实验结果如表6所示。小鼠经连续3次酒精灌胃后，与正常组相比模型组小鼠血清ALT、AST分别升高84.9％和46.5％，而DMB给药组，无论是低剂量(20mg/kg，IP)或高剂量(40mg/kg，IP)治疗，均能显著降低小鼠急性酒精性肝损伤引起的ALT、AST升高作用，并恢复至正常水平。由此可见，DMB具有明显的治疗急性酒精性肝损伤作用。 

表6DMB治疗对急性酒精性肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响 

实施例13.DMB治疗对急性酒精性肝损伤脂(TG、TC)代谢的调节作用 

方法：雄性ICR小鼠，22-24g，随机分为4组，每组8只，4组分别为正常对照组、模型组、DMB低剂量组(20mg/kg，IP)、DMB高剂量组(40mg/kg，IP)。除正常对照组外，其余各组动物灌胃给予7g/kg酒精，每12h一次，共三次。DMB给药组小鼠每次被灌胃酒精刺激后1h给予相应剂量的药物治疗，其余剂量给予相同剂量的赋形剂。末次酒精灌胃后6h处死动物，摘眼球取血，室温静置30分钟后，4℃离心离心3000rpm/10min，常规分离血清。采用中生北控生物试剂盒，分析测定血清中TG、TC和HDL-c值。另外，末次酒精灌胃后6h处死动物，取同一部位肝组织，于冰浴上以PBS制成10％肝匀浆。按北京中生北控公司试剂盒说明书方法，测定肝脏甘油三酯、胆固醇，并计算含量(nmol/mg prot)。 

结果：实验结果如表7所示。与正常组相比，模型组小鼠血清TG、肝TG、肝TC分别升高378.9％、284.6％、108.0％，而血清中HDL-C降低44.8％。与模型组相比，DMB低剂量治疗组小鼠血清TG、肝TG和肝TC分别降低了31.1％、33.6％和44.9％，但血清中HDL-C则升高了52.3％；DMB高剂量治疗组血清TG、肝TG和肝TC分别降低了54.5％、55.3％和62.2％，而血清中HDL-C则升高了31％。实验表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)能有效地改善酒精引起的TG和TC脂质代谢紊乱，防止酒精引起的肝脂肪堆积，加速肝脂肪转运。 

表7DMB对急性酒精性肝损伤小鼠脂代谢的治疗作用 

实施例14．DMB治疗对急性酒精性肝氧化损伤的保护作用 

方法：雄性ICR小鼠，22-24g，随机分为4组，每组8只，4组分别为正常对照组、模型组、DMB低剂量组(20mg/kg,IP)、DMB高剂量组(40mg/kg,IP)。除正常对照组外，其余各组动物灌胃给予7g/kg酒精，每12h一次，共三次。DMB给药组小鼠每次被灌胃酒精刺激后1h给予相应剂量的药物治疗，其余剂量给予相同剂量的赋形剂。末次酒精灌胃后6h处死动物，不同小鼠取同一部位肝组织，于冰浴上以PBS制成10％肝匀浆。按照试剂盒(南京建成)说明测定肝组织中脂质过氧化物MDA水平。两步离心法提取肝脏线粒体，采用DTNB法测定线粒体中抗氧化物质GSH。 

结果：如表8所示，与对照组相比，模型组急性酒精肝损伤导致小鼠肝脏脂质过氧化物MDA升高114．3％，线粒体GSH降低37．9％。与模型组相比，DMB低剂量治疗组和高剂量治疗组MDA分别降低26.3％和47.4％，而线粒体GSH分别升高57.4％和73.3％。研究结果表明DMB具有促进GSH再生，增强肝脏自由基的清除，防止脂质过氧化的能力。 

表8DMB治疗对酒精性肝氧化损伤的抗氧化作用 

实施例15.DMB对慢性酒精性肝损伤小鼠肝功能的保护作用 

方法：雄性ICR清洁级小鼠，体重24-26克，随机分为3组，每组7只。分别为正常对照组、模型组、DMB组(40mg/kg,IP)。模型组和给药组给予含6％乙醇的L-D全营养液体饲料，正常对照组给予不含乙醇、但含有相同能量的正常L-D全营养液体饲料。连续喂养5周后处理小鼠，摘眼球取血，4℃离心3500rpm，取上层血清分析测定ALT和AST值。 

结果：小鼠用L-D酒精液体饲料喂食5周后，与正常相比，模型组小鼠血清ALT和AST值分别上升了137％和150.7％。DMB给药组处理后，ALT和AST值分别恢复至正常组值，如表9所示。表明DMB对慢性酒精性肝损伤小鼠肝功能具有很好的保护作用。 

表9DMB对慢性酒精性肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响 

实施例16.DMB对慢性酒精性肝损伤小鼠肝脂(TG、TC)的代谢调节作用 

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为3组，每组7只。分别为正常对照组、模型组、DMB组(40mg/kg，IP)。模型组和给药组给予含6％乙醇的LD液体饲料，正常对照组给予含相同能量的正常LD液体饲料。连续喂养5周后处理小鼠，取同一部位肝脏于冰浴上以PBS制成10％匀浆液。按北京中生北控公司试剂盒说明测定肝脏中的TG和TC。 

结果：小鼠用L-D酒精液体饲料喂食5周后，模型组小鼠肝脏TG和TC含量分别升高到正常组的169.3％和192.1％。DMB给药组治疗后，其TG和TC值分别恢复、并降至正常对照值，如表10所示。表明DMB对慢性酒精性肝损伤小鼠肝脏脂(TG、TC)代谢有很好的调节作用。 

表10DMB对慢性酒精性肝损伤小鼠肝脂(TG、TC)的代谢调节 

实施例17.DMB对慢性酒精性肝氧化损伤的保护作用 

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为3组，每组7只。分别为正常对照组、模型组、DMB组(40mg/kg，IP)。模型组和给药组给予含6％乙醇的LD液体饲料，正常对照组给予含相同能量的正常LD液体饲料。连续喂养5周后处理小鼠，取同一部位肝脏于冰浴上以PBS制成10％匀浆液。采用SDS法测定肝脏中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量。 

结果：小鼠用L-D酒精液体饲料喂食5周后，模型组小鼠肝脏MDA含量升高至正常组的64.8％，DMB给药组治疗后，其MDA值下降了26.2％。如表11所示。结果表明DMB对慢性酒精性肝损伤具有很好的抗氧化作用。 

表11DMB对小鼠慢性酒精性肝氧化损伤的抗氧化作用 

实施例18.DMB对小鼠慢性酒精性肝损伤肝重/体重比增大的保护作用 

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为3组，每组7只。分别为正常对照组、模型组、DMB组(40mg/kg，IP)。模型组和给药组给予含6％乙醇的LD液体饲料，正常对照组给予含相同能量的正常LD液体饲料。连续喂养5周后处理小鼠，称量小鼠体重并取全肝称重计算。 

结果：小鼠用L-D酒精液体饲料喂食5周后，模型组小鼠肝重/体重比升高至正常组的17.3％。DMB给药组治疗后，与模型组相比，治疗组小鼠的肝重/体重比降低了21.3％，恢复至正常水平，如表12所示。实验结果表明DMB对慢性酒精性肝损伤引起的小鼠肝重/体重比增大有很好的调节作用。 

表12DMB对慢性酒精性肝损伤小鼠肝重/体重比的调节作用 

实施例19.DMB对慢性酒精性肝损伤病理学改变的保护作用 

方法：雄性ICR小鼠，体重24-26克，随机分为3组，每组7只。分别为正常对照组、模型组、DMB组(40mg/kg，IP)。模型组和给药组给予含6％乙醇的LD液体饲料，正常对照组给予含相同能量的正常LD液体饲料。连续喂养5周后处理小鼠，取肝脏大叶同一部位组织以10％甲醛固定，HE染色进行病理学检查。 

结果：肝脏病理检验结果表明，正常对照组肝脏形态未见异常，模型组动物肝细胞肿胀，胞浆疏松，水样变性明显，部分肝细胞呈气球样变和脂肪变性，小灶性坏死和炎细胞浸润。而给药组上述病变明显减轻，恢复至接近正常对照组水平，如图8所示。 

Claims (3)

1.如式(I)所示的盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗急、慢性酒精性肝病药物中的应用。 

。

2.一种预防或治疗急、慢性酒精性肝病的药物组合物，其特征在于，含有药物有效剂量的如式(I)所示盐酸去亚甲基小檗碱及药用载体。 

3.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释剂及各种微粒给药系统。 

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