CN112294808B - 盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯在制备预防或治疗药物性肝损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯在制备预防或治疗药物性肝损伤药物中的应用。由于盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯相较于盐酸去亚甲基小檗碱，稳定性增加，口服吸收和生物利用度提高，并具有抗炎、抗氧化活性，在给药治疗对乙酰氨基酚导致急性肝损伤的过程中，可延长病患生存时间，为病患赢得宝贵的治疗时间。

Description

盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯在制备预防或治疗药物性肝损伤 药物中的应用

技术领域:

本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯在制备预防或治疗急性肝损伤药物中的应用。

背景技术：

药物性肝损伤(Drug-induced liver injury，DILI)是由药物本身或其代谢产物以及特殊体质对药物的超敏或耐受性降低所导致的肝损伤。一般将药物性肝损伤的致病机制分为两类，一类是损伤程度具有剂量依赖性，由药物及其中间代谢产物对肝脏直接发挥的毒性作用；另一类是机体对药物的特异质反应，此类药物性肝损伤具有不可预测性，受到遗传等因素的影响。数据统计显示，我国药物性肝损伤的发病率均高于20/10万人，平均为23.80/10万人。在美国和英国，常用的解热镇痛药——对乙酰氨基酚(扑热息痛)是引起药物性肝损伤最多的药物，也是造成急性肝衰竭最多的药物。与欧美等西方国家不同，对乙酰氨基酚造成的肝损伤虽不是我国造成药物性肝损伤的首要因素，但临床上含有对乙酰氨基酚的药品多为非处方药，国家非处方药手册中收载了68种含有对乙酰氨基酚的药品，并且除常用西药外，部分中成药中也加入了对乙酰氨基酚。故患者能够通过简单便捷的途径获得这类含有对乙酰氨基酚的药物，且在大多数药物包装上并没有明确标注对乙酰氨基酚的肝毒性，从而易导致对乙酰氨基酚的过量使用或重复使用造成肝损伤。

对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)导致肝损伤的发病机制是APAP相关研究的热点话题，目前依据对乙酰氨基酚导致肝损伤的机制可将其分为代谢损伤和炎症损伤两个阶段。过量的对乙酰氨基酚在体内经细胞色素P₄₅₀ 2E1(CYP2E1)代谢产生毒性代谢产物N-乙酰对苯醌亚胺(NAPQI)，进而导致肝脏线粒体和肝细胞的氧化应激以及结构损伤是对乙酰氨基酚造成肝损伤的重要因素，大量研究显示具有抗氧化作用的物质能够缓解APAP造成的肝损伤。

盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯(式1)是盐酸去亚甲基小檗碱的结构修饰物。迄今为止，现有技术中没有关于盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯对预防和/或治疗对乙酰氨基酚导致急性肝损伤药物中的应用的记载和报道。盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯的应用将会为因为APAP造成的肝损伤的病患提供一个新的临床药物选择。

发明内容：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯在制备预防或治疗药物性肝损伤药物中的应用；特别是提供了盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯作为预防或治疗对乙酰氨基酚导致急性肝损伤药物的应用。

技术方案

盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯在制备预防或治疗药物性肝损伤药物中的应用。

特别是提供了盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯作为预防或治疗对乙酰氨基酚导致急性肝损伤药物的应用。

根据本发明还涉及含有作为活性成份的盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1～95％重量％的盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1～100mg。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂如琼脂粉、干燥粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成份本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、分散剂、渗透压调节剂、增溶剂和pH调节剂。如稀释可选用水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、甘油、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂，还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或香料等。这些辅料是本领域常用的。

本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌过虑器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。

为了达到用药目的，增加治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。当然用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。

对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。

给药剂量是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

有益效果

盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯是盐酸去亚甲基小檗碱的结构修饰物，对其酚羟基结构进行保护，增加药物稳定性，提高药物胃肠道吸收，增加生物利用度。此外，盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯进入肝脏后仍具有抗氧化和抗炎等药理活性，可大大降低APAP引起的氧化应激以及炎症效应，缓解APAP造成的急性肝损伤。

具体而言：

本发明所用盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯产品采用常规化学合成法制备，采用高效液相色谱(HPLC)分析检测，其纯度达99％以上，并经过化学法、质谱法和核磁共振法分析鉴定，表明本实验室所用的盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯产品化学结构正确。盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯化学结构稳定，此项研究表明盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯其纯度和化学结构符合开展体内、体外生物学活性和药理作用研究要求。

本发明通过大鼠口服给药，借助高效液相色谱(HPLC)检测盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)与盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯(DMB-DA)血药浓度变化，盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯与盐酸去亚甲基小檗碱相比药物浓度达到峰值时间明显缩短，表明盐酸去亚甲基小檗碱通过乙酸酯修饰后，药物吸收速度增强，药效起效时间缩短，对急性损伤病情进行最快的改善,解决了DMB无法口服给药的难题。

本发明通过建立APAP诱导肝细胞损伤建立细胞模型，观察盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯对APAP诱导肝细胞损伤的预防与治疗作用。研究结果表明，盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯对APAP诱导的肝细胞损伤具有预防保护和治疗作用。

本发明通过建立APAP诱导小鼠肝损伤建立动物模型，观察盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯对APAP诱导动物肝损伤的预防与治疗作用。研究结果表明，盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯对APAP诱导的动物肝损伤具有预防保护和治疗作用。

术语

DMB-DA：盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯

DMB：盐酸去亚甲基小檗碱

APAP：对乙酰氨基酚

ALT/AST:谷丙转氨酶/谷草转氨酶

HPLC：高效液相

附图说明

图1盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯的HPLC分析图

图2盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯的质谱图

图3盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯缓解APAP诱导L02细胞损伤

图4 APAP诱导小鼠模型肝损伤小鼠肝照片

A：正常对照组；B：APAP模型组；C：APAP+DMB-DA-10mg/kg组；D：APAP+DMB-DA-20mg/kg组

图5 APAP肝损伤模型小鼠肝组织病理形态变化

A：正常对照组；B：APAP模型组；C：APAP+DMB-DA-10mg/kg组；D：APAP+DMB-DA-20mg/kg组

图6盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯改善APAP诱导小鼠模型ALT水平

图7盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯改善APAP诱导小鼠模型AST水平

图8血药浓度检测

A：DMB的血药浓度曲线；B：DMB-DA的血药浓度曲线

图9不同温度下DMB-DA的吸光度残留率

图10不同光照条件下DMB-DA的吸光度残留率。

具体实施方式

下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1.盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯制备

方法：称取1.2g DMB，放入50mL圆底烧瓶中，再加入10mL乙酸酐混匀后加入200μL浓硫酸；70℃条件下搅拌反应2h，反应液倒入10mL冰的纯净水中，用保鲜膜封闭后置于4℃冰箱内静置30分钟，过滤，滤饼可用适量冰水洗涤，滤饼干燥后即为产品。

结果：获得盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯，产品表观为黄色粉末。

实施例2.盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯纯度分析

方法：采用HPLC方法分析，将盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯用乙腈溶解，并经0.22μm微孔滤膜过滤，配成终浓度200μg/ml样品。HPLC色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪。色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×150mm，5μm)。流动相：A：20mM磷酸盐缓冲液,B:乙腈。HPLC梯度洗脱条件：0-13min，20％B-55％B；13-14min，55％B；14-15min，20％B；15-16min，20％B。检测波长：349nm。柱温：30℃，流速：1.0ml/min，进样体积1μl。

结果：HPLC分析结果如图1所示，盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯的保留时间为6.520min，纯度大于99％以上，符合生物活性和药理学实验研究要求。

实施例3.盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯结构鉴定

方法：分子结构鉴定采用红外光谱、质谱和核磁共振波谱等分析法。质谱仪器为watersQ-TOF MicroTM，离子化方式：ESI(+)，质量扫描范围：m/z80-1000，毛细管电压：2500v，锥孔电压：25v，离子源温度：100℃，雾化温度：200℃，锥孔气流速：50L/hr，雾化气流速：400L/hr。

结果：盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯的正离子质谱分析结果如图2所示，ESI-MS(m/z):分子离子峰[M+H]+＝408.1,这与盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯的理论分子量保持一致。

实施例4.盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯(DMB-DA)缓解APAP诱导L02细胞损伤

方法：选择10mmol/L的APAP对L02细胞系进行造模。细胞消化后利用胎盼兰计数，按4×10⁴/cm²的密度接种到96孔板内，每孔200mL 1640培养基(含10％FBS)；细胞培养24h后，将96孔板分为9组(依次为空白、APAP和2/4/8/16/32/64/128μg/mL DMB-DA的给药组)，每组设有6个复孔，其中空白对照组和APAP组的培养基中含有0.1％的DMSO；细胞培养6h后将培养基换为无血清培养基，继续培养1h后，除空白对照组外，其余组将细胞培养基换为APAP浓度为10mmol/L的培养基，细胞继续培养12h后，采用MTT检测法检测细胞的存活率；

结果：结果如图3所示，与APAP模型相比，不同剂量给药组的细胞活力从低剂量到高剂量呈现出逐渐升高的趋势，且在8μg/mL的剂量下达到最高并与APAP模型组相比细胞活力显著性升高，然后逐渐下降，说明DMB-DA能够预防APAP的肝细胞毒性，且最佳的药物浓度为8μg/mL。

实施例5.盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯(DMB-DA)对APAP诱导肝损伤病理改变的保护作用

方法：适应性喂养一周后的C57BL/6小鼠随机分为4组，对照组(CTRL)，模型组(APAP)，DMB-DA低剂量组(10mg/kg)，DMB-DA高剂量组(20mg/kg)，每组7只。DMB-DA给药组小鼠按照体重预先腹腔注射DMB-DA药液，对照组和模型组按照体重注射含有2％(v/v)DMSO的无菌生理盐水，连续三天，造模前禁食15h，第四天按照体重再次给予给药组DMB-DA药液，1h后模型组和DMB-DA给药组小鼠以体重为依据，按照500mg/kg的剂量一次性腹腔注射APAP溶液，对照组给予相同体积的生理盐水，计时6h后实验结束，对处死小鼠，对小鼠肝组织进行拍照，并对其进行HE染色进行病理学检查。

结果：小鼠肝脏形态如图4所示，A图为空白对照组，可见肝脏表面光滑，颜色呈现均匀的淡红色，肝脏质地柔软无肿胀的现象；B图为APAP模型组，肝脏可见明显肿胀，颜色不均匀，部分肝脏出现发白的现象，部分肝脏出现充血的现象；C图为DMB-DA低剂量组(10mg/kg)，肝脏颜色较模型组均匀，肿胀现象明显缓解，未出现发白的现象；D图为DMB-DA高剂量组(20mg/kg)，可见肝脏表面光滑，颜色均匀为淡红色，肝脏肿胀明显缓解。肝脏HE染色如图5所示，A图为空白对照组，可见肝小叶结构完整，肝细胞间间隙清晰，细胞核清晰可见，细胞质均匀丰富，肝索排列整齐；B图为APAP模型组，可见细胞质部分染色浅且出现大量空泡，已不见肝细胞结构，可知肝细胞严重破坏，肝索结构消失，肝小叶结构也遭到严重破坏，说明肝脏整体结构遭到破坏；C图为10mg/kg DMB-DA给药组，可见胞质空泡明显减少，但肝细胞间隙不清，肝索结构虽不清晰但能小叶结构没有受到严重影响；D图为20mg/kg DMB-DA给药组，细胞质空泡明显减少，细胞质较均匀丰富，肝细胞间隙较清晰，可见肝索呈反射状整齐排列，说明肝脏细胞和整体结构完好，综上所述，DMB-DA能够预防APAP导致的肝损伤。

实施例6.盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯(DMB-DA)对APAP诱导肝损伤的保护作用

方法：适应性喂养一周后的C57BL/6小鼠随机分为4组，对照组(CTRL)，模型组(APAP)，DMB-DA低剂量组(10mg/kg)，DMB-DA高剂量组(20mg/kg)，每组7只。DMB-DA给药组小鼠按照体重预先腹腔注射DMB-DA药液，对照组和模型组按照体重注射含有2％(v/v)DMSO的无菌生理盐水，连续三天，造模前禁食15h，第四天按照体重再次给予给药组DMB-DA药液，1h后模型组和DMB-DA给药组小鼠以体重为依据，按照500mg/kg的剂量一次性腹腔注射APAP溶液，对照组给予相同体积的生理盐水，计时6h后实验结束，对小鼠进行取血，室温静置30min后，4℃离心3000rpm/min，常规分离血清，采用南京建成公司试剂盒分析测定血清中的ALT和AST。

结果：在正常生理状况下，ALT和AST主要存在于肝细胞内，AST也存在于心脏细胞中，血清中ALT和AST的水平较低，人类正常血清中ALT/AST的水平均为0-40U/L，从实验数据可见正常小鼠血清中ALT的水平为10U/L左右，AST的水平为20U/L左右，当肝脏受损时，ALT和AST大量释放进入血液，导致血液中ALT/AST的水平显著升高。如图6、图7所示，与空白组相比，APAP模型组的ALT和AST显著升高，说明肝脏受损严重；而与APAP模型组相比，DMB-DA给药组的ALT和AST的水平均显著下降，且20mg/kg剂量下的ALT和AST的水平与10mg/kg剂量相比显著下降，说明DMB-DA能够缓解APAP导致的肝损伤。

实施例7.盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯(DMB-DA)血药浓度的HPLC检测

方法：大鼠灌胃给予300mg/kg剂量的样品(DMB-DA和DMB)，分别在给药后0min、5min、15min、30min、1h、2h、3h、6h、9h、12h和24h通过眼眶取血，血液样本静置保存在1.5mLEP管中；血液样本在室温下静置1h后，在4℃下4000×g离心10min，取上清；取100μL上清，并加入100μL色谱级甲醇，振荡混匀后，4℃下10000×g离心10min，取上清，重复上述操作；上清在60℃水浴锅中加热，挥发除去甲醇；再加入100μL色谱级乙腈，振荡使残留物充分溶解，4℃下10000×g离心10min，HPLC检测。

结果：如图8所示，给大鼠灌胃DMB后，不同时间点采血进行检测，发现在给药3h后DMB的血药浓度达到最高，但由于大鼠的个体差异，血药浓度有所差异但达峰时间基本一致；给大鼠灌胃DMB-DA后，不同时间点进行采血进行检测，发现在给药1h后DMB-DA的血药浓度达到最高，但由于大鼠的个体差异，血药浓度有所差异但达峰时间基本一致；DMB-DA比DMB提前2小时到达最高血药浓度。

实施例8.盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯稳定性检测

8-1温度对DMB-DA稳定性的影响

方法：取12份5mg DMB-DA粉末置于10mL EP管中，分别加入5mL乙腈使其完全溶解，设置温度为25℃，40℃，60℃和80℃，每组设置3个平行，在不同温度下分别加热1h，2h，3h，4h，5h后取样品，在375nm波长下检测其吸光度值。

结果：如图9所示为不同温度下处理DMB-DA不同时间后在375nm波长下的吸光度残留率，可见不同温度处理不同时间后吸光度的残留率在100％附近上下波动，没有显著降低的趋势，故表明DMB-DA具有较好的稳定性，在受热的情况下不易分解。

8-2光照对DMB-DA稳定性的影响

方法：取6份5mg DMB-DA粉末置于10mL EP管中，分别加入5mL乙腈使其完全溶解，将其分为两组，每组设置3个平行，一组暴露于日光下照射，一组置于暗处，每天吸取样品在375nm波长下检测其吸光度值。

结果：如图10所示为光照和避光下，不同时间后DMB-DA在375nm波长下的吸光度残留率，可见吸光度残留率没有降低的趋势，说明光照对DMB-DA的稳定性影响较小，且DMB-DA不易分解，因此在储存过程中不必刻意避光。

Claims (1)

1.盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯制备预防或治疗对乙酰氨基酚导致急性肝损伤药物的应用，其中所述的盐酸去亚甲基小檗碱乙酸酯的结构式为

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