KR20220107036A

KR20220107036A - 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 염, 그의 제조 방법, 약제학적 조성물, 및 용도

Info

Publication number: KR20220107036A
Application number: KR1020227022153A
Authority: KR
Inventors: 송 우; 화 순; 진란 장; 윈쉬엔 장; 저 왕; 칭윈 양; 린 지앙; 지한 첸; 징 선; 지에 장; 치 장; 준셍 한; 퉁 친; 위안위안 장
Original assignee: 인스티튜트 오브 마타리아 메디카, 차이니스 아카데미 오브 메디컬 사이언스; 장춘 인텔리크라운 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2020-09-15
Publication date: 2022-08-01
Also published as: WO2021103749A1; EP4050004A1; EP4050004A4; AU2020390812A1; JP2023508844A; CN112851626A; US20230002343A1; CN112851626B

Abstract

본 발명은 약제화학 분야에 관한 것으로, 특히 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 그의 제조 방법, 약제학적 조성물 및 간 질환 등의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 염, 그의 제조 방법, 약제학적 조성물, 및 응용

본 발명은 약제화학 분야에 관한 것으로, 특히 좌선성(left-handed) 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 그의 제조 방법, 약제학적 조성물 및 간 질환 등의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 그의 용도에 관한 것이다.

간질환은 세계적인 질병의 일종으로, 중국은 간질환 대국이다. 현재 중국에는, 바이러스성 간염을 중심으로, 다양한 원인으로 인한 간 손상 및 간 염증으로 고통받는 환자들이 다수 있다. 통계적으로 중국에서 만성 간염(후기 만성 간염으로 인한 간경변, 간암 포함)에 의해 초래되는 연간 직접적인 경제적 손실액은 9000억 인민폐에 달한다. 최근에는 약물 유발성 간질환, 알코올성 및 비알코올성 지방간 질환, 및 자가면역성 간질환의 발병률도 해마다 증가하는 경향을 보이고 있다. 안전하고 효과적인 간질환의 예방 및 치료용 약물의 개발은 언제나 전 세계에 걸쳐 다양한 연구기관과 제약회사의 연구 핫스팟이다.

바이시클롤(Bicyclol)은, 중국 의학원 재료연구소(Institute of Materia Medica Chinese Academy of Medical Science, MMA)에서 최초로 개발된, 중국 독립적인 지적재산권으로 중국에서 간염 치료용 화학약품의 카테고리 1의 일종이며, 임상에서 간 보호 및 효소 분해에 대한 양호한 효과, 간염 바이러스에 대한 특정 활성, 중대한 이상 반응이 없는 편리한 투여, 및 광범위한 약리 활성의 장점이 있다. 바이시클롤과 관련된 연구 성과는, "제9회 국가 과학 기술 5개년 중점 과제 공로상(2002)", 2002년 중국 제약 산업의 10대 뉴스, 베이징 과학 기술진보의 1등상(2005), 2007년 국가 과학 기술진보의 2등상(2007) 등을 포함하여 다수의 상을 연속적으로 수상했으며, 바이시클롤은, 미국, 유럽연합, 일본, 한국 등 16개 국가/지역에서 화합물 발명 특허권으로 보호받고 있고, 대만 지역에서는 우크라이나와 같은 국가에 판매되었다. 2001년 11월 인민 대회당에서 열린 기자 간담회에서 바이시클론의 시판이 발표된 날 이래로, 중국에 막대한 사회적, 경제적 이익을 가져다 주었다.

그러나 바이시클롤은 생물학적 수용성이 열악하여 생체이용률이 높지 않다. 중국 의학원 재료연구소의 연구원들은 바이시클롤의 구조를 최적화하고, 바이사이클릭 모르핀과 그의 염이 양호한 약리학적 활성과 약동학적 특성을 가지고 있음을 발견했다(Wu Song, Sun Hua, et al., Bicyclol Derivative and Preparations and Applications Thereof, 201610922563.5). 이전 연구 결과를 바탕으로 연구원들은 바이사이클릭 모르핀의 라세미체를 분리하고, 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 염이, 라세미체, 및 덱스트로 모르폴린과 그의 염보다 항염 및 간 보호 측면에서 더 우수한 약리 활성 및 약동학적 특성을 가지고 있음을 발견했다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 그의 제조 방법, 및 간 질환 등의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 그의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다음과 같은 기술적 해결수단을 제공한다.

본 발명에 따른 기술적 해결수단의 제1 측면은 화합물 5로 나타난 구조를 가진 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 하기 식 (I)로 표시되는 구조를 가지는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하는 것이다:

.

여기서, 무기산 및 유기산으로부터 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 제조할 수 있다. 여기서, X는 무기산 및 유기산 중에서 선택되고; 무기산은 플루오르화수소산, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아세트산, 황산 및 인산으로부터 선택되고; 유기산은 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산, 퀸산, 캄포르산, 캄포르술폰산, 아스파르트산, 글루탐산, 피로글루탐산, L-타르타르산, L-디벤조일 타르타르산, L-디-p-메틸벤조일 타르타르산, L-디에틸 타르트레이트, L-말산, L-캄포르산, L-10-캄포술폰산, R-(-)-만델산, L-퀸산, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-피로글루탐산, D-타르타르산, D-디벤조일 타르타르산, D-디-p-메틸벤조일 타르타르산, D-디에틸 타르트레이트, D-말산, D-캄포르산, D-10-캄포술폰산, S-(-)-만델산, D-퀸산, D-아스파르트산, D-글루탐산, 및 D-피로글루탐산으로부터 선택되고, 여기서 유리 염기 대 산의 비는 임의로 1:1, 2:1 또는 3:1이다. 여기서 바람직한 구조는 다음과 같다.

본 발명에 따른 기술적 해결수단의 제2 측면은, 제1 측면에 따른 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염의 제조 방법을 제공하는 것이며, 이하에 나타난 바와 같다:

a) 바이시클롤의 수산기를 염소화하여 화합물 2를 얻는 단계;

b) 화합물 2를 모르폴린과 반응시켜 화합물 3을 얻는 단계;

c) 화합물 3을 키랄산 Y와 반응시켜 염을 형성하고, 염 용해도의 차이를 이용하여 유기 용매에서 분리(resolution)를 행하여 L형 거울상이성질체(levo enantiomer)로서 염 4를 얻는 단계로서, 상기 L형 거울상 이성질체는 95.0% 초과의 거울상 이성질체 과잉 백분율(enantiomeric excess percentage)(%e.e.)을 가지며, 여기서 키랄산 Y는 L-타르타르산, L-디벤조일 타르타르산, L-디-p-메틸벤조일 타르타르산, L-디에틸 타르타르산, L-말산, L-캄포르산, L-10-캄포르술폰산, R-(-)-만델산, L-퀸산, L-아스파르트산, L-피로글루탐산, D-타르타르산, D-디벤조일 타르타르산, D-디-p-메틸벤조일 타르타르산, D-디에틸 타르트레이트, D-말산, D-캄포르산, D-10-캄포르술폰산, S-(-)-만델산, D-퀸산, D-아스파르트산, D-글루탐산, D-피로글루탐산 및 이들 산의 유도체로부터 선택되며, 유리 염기 대 산의 비는 임의로 1:1, 2:1 또는 3:1이고, 상기 유기 용매는 에틸 아세테이트, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 및 혼합 용매로부터 선택되는 단계;

d) 염기의 작용하에 염 4가 유리 아민이 되도록 하는 단계;

e) 유리 아민 5를 산 X와 반응시켜 염을 형성하여 구조식 (I)의 화합물을 얻는 단계.

여기서, X에 대한 정의는 본 발명에 따른 기술적 해결수단의 제1 측면에서의 정의와 같다.

본 발명에 따른 기술적 해결수단의 제3 측면은, 치료적 및/또는 예방적 유효량의 본 발명의 제1 측면에 따른 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 및 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 고체 또는 액체 부형제 및/또는 보조제와 조합되어, 인간 또는 동물 용도에 적합한 임의의 투여 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물은 전형적으로 그의 약제학적 조성물에 0.1 내지 95 중량%의 양으로 존재한다.

본 발명의 화합물 또는 이를 함유하는 약학적 조성물은 단위 제형으로 투여될 수 있으며, 투여 경로는 경구 투여, 정맥 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 비강, 구강 점막, 눈, 폐 및 호흡기, 피부, 질, 직장 등과 같은, 경장 또는 비경구일 수 있다.

투여 제형은 액체 제형, 고체 제형 또는 반고체 제형일 수 있다. 상기 액체 제형은 용액(순용액 및 콜로이드 용액 포함), 유제(o/w형, w/o형 및 복합 유제 포함), 현탁제, 주사제(물 주사제, 분말 주사 및 주입제 포함), 점안액, 점비액, 로션 및 리니먼트제일 수 있고; 상기 고형 제형은 정제(일반정, 장용코팅정, 버칼정, 확산정, 츄어블정, 발포정 및 구강내 붕괴정 포함), 캡슐제(경질 캡슐, 연질 캡슐 및 장용성 코팅 캡슐 포함), 과립, 분말, 펠렛, 점적 환제, 좌제, 펠리클, 패치, 에어로졸(분말), 스프레이 등일 수 있고; 상기 반고체 제형은 연고, 겔, 페이스트 등일 수 있다.

본 발명의 화합물은 일반적인 제형으로, 또한 지속 방출 제형, 제어 방출 제형, 표적 제형 및 다양한 마이크로입자 투여 시스템으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 화합물을 정제로 제조하기 위해, 희석제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 윤활제 및 공용매를 포함하는, 당업계에 공지된 다양한 부형제가 사용될 수 있다. 희석제는 전분, 덱스트린, 자당, 포도당, 유당, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 미결정 셀룰로오스, 황산칼슘, 수산화칼슘, 탄산칼슘 등일 수 있고; 습윤제는 물, 에탄올, 이소프로판올 등일 수 있고; 결합제는 전분 슬러리, 덱스트린, 시럽, 벌꿀, 포도당 용액, 미결정 셀룰로오스, 아카시아 슬러리, 젤라틴 슬러리, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 아크릴 수지, 카보머, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 등일 수 있고; 붕해제는 건조 전분, 미결정 셀룰로오스, 저치환도 히드록시프로필 셀룰로오스, 가교 폴리비닐피롤리돈, 가교 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 스타치 나트륨, 중탄산나트륨 및 시트르산, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르, 황산 도데실 나트륨 등일 수 있고; 윤활제 및 공용매는 탈크 분말, 실리카, 스테아레이트, 타르타르산, 유동 파라핀 및 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다.

정제는 추가로 당의정, 필름 코팅정, 장용 코팅정, 2층 및 다층정과 같은 코팅정으로 제조될 수 있다.

투여 단위를 캡슐화하기 위해서는, 유효성분인 본 발명의 화합물을 희석제 및 공용매와 혼합하고, 생성된 혼합물을 경질 캡슐 또는 연질 캡슐에 직접 투입한다. 또한, 유효성분인 본 발명의 화합물을 희석제, 결합제 및 붕해제와 혼합하여 과립 또는 펠렛을 제조한 후 경질 캡슐 또는 연질 캡슐에 투입한다. 본 발명의 화합물의 정제를 제조하기 위한 다양한 종류의 희석제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 및 공용매는 또한 본 발명의 화합물의 캡슐제를 제조하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물을 주사제로 제조하기 위해, 용매로서 물, 에탄올, 이소프로판올, 프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는, 가용화제, 공용매, pH 조절제 및 삼투압 조절제를 적당량 첨가할 수 있고; 상기 가용화제 또는 공용매는 폴록사머, 레시틴, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 등일 수 있고; 상기 pH 조절제는 포스페이트, 아세테이트, 염산, 수산화나트륨 등일 수 있고; 상기 삼투압 조절제는 염화나트륨, 만니톨, 포도당, 인산염, 아세트산염 등일 수 있다. 주사용 동결건조 분말을 제조하는 경우 프로판트(proppant)로서 만니톨 및 포도당을 첨가할 수도 있다.

추가적으로, 착색제, 방부제, 향미제, 또는 기타 첨가제가 또한 필요에 따라 약제학적 제형에 첨가될 수 있다.

투여 목적을 실현하고 치료 효과를 향상시키기 위해, 본 발명의 약물 또는 약제학적 조성물은 임의의 공지된 투여 방법에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 투여 용량은 예방 또는 치료할 질병의 특성 및 중증도, 환자 또는 동물의 개별 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 광범위한 범위에서 변할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 화합물에 대한 1일 투여량의 적합한 범위는 0.001-5mg/kg 체중이다. 상기 투여량은 의사의 임상 경험 및 다른 치료 수단의 사용을 포함한 투여 요법에 따라 1회 용량 단위로 투여하거나 여러 용량 단위로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물 또는 조성물은 단독으로 또는 다른 치료 약물 또는 대증 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물이 다른 치료제와 상승 효과를 나타내는 경우에는 실제 상황에 따라 투여량을 조절해야 한다.

본 발명에 따른 기술적 해결수단의 제4 측면은, 간 관련 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어서, 제1 측면에 따른 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 및 제3 측면에 따른 약제학적 조성물의 용도를 제공하는 것이다. 여기서, 간 관련 질환은, 특히 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 약물 유발성 간 질환, 알코올성 간 질환, 비알코올성 간 질환, 자가면역성 간 질환, 간질환 진행에 의한 간섬유화, 간경변, 및 간부전을 포함하는 간 손상 관련 질환 및 간염 관련 질환으로부터 선택된다.

본 발명에서 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염은 다양한 간 손상 동물 모델에서 덱스트로 거울상 이성질체 및 라세미체보다 우수한 약리 활성을 나타내며, 유의한 통계적 차이가 있다(P<0.05). 또한, 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염은 덱스트로 거울상 이성질체 및 라세미체보다 우수한 약동학적 특성을 가진다.

도 1은 4-아세트아미도페놀로 인한 세포 배양 상청액의 LDH 수준 증가에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 감소 효과를 보여준다(n=3-4). **P<0.01, 블랭크 대조군과 비교; #P<0.05, 모델군과 비교.

본 발명은 간질환 치료용 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 그의 제조방법, 약제학적 조성물 및 그의 용도를 제공한다. 하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 열거되지만, 본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하지 않는다. 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 대한 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명에서 제공하는 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 염의 핵자기 공명 스펙트럼은 Varain Mercury-500 핵자기 공명 측정기를 사용하여 TMS를 내부 표준으로 하여 측정하고, 질량 스펙트럼은 ZAB-2F 질량 분석기를 사용하여 측정한다.

실시예 1: L형(levo) (-)IMM-H014의 제조

a. SOCl₂/DMF; b. TEA/CH₂Cl₂ 또는 CH₃COCH₃; c. L-DBTA/EA; d. NaHCO₃/H₂O/EA; e. CH₃SO₃H/EA.

건조 DMF 50ml가 가해진, 자기 교반기와 온도계가 장착된 100ml 삼구 플라스크에 화합물 1(즉, 바이시클롤, 5.1g, 13.1mmol)을 투입하고, 고체를 완전히 용해시켰다. 빙욕에서 반응계를 0℃로 냉각시킨 후, 계의 온도가 5℃를 넘지 않도록 제어하면서 SOCl₂(4.5ml, 61.8mmol)를 천천히 적가하였다. 적가 후, 원료가 완전히 반응하였음을 TLC가 나타낼 때까지 빙욕에서 30분 동안 반응을 지속하였다. 반응계를 쇄빙(crushed ice) 약 100g에 붓고 충분히 교반하여 다량의 백색 고체를 석출시킨 후 여과하고, 필터 케이크를 소량의 증류수 및 에테르로 세척하고 배수 건조하였다. 생성물을 공기에 의해 자연 건조시키고 칭량하여 총 4.9g의 백색 고체(화합물 2)를 생성하였다 (수율: 91.7%).

아세톤 25ml와 트리에틸아민 2.2ml가 가해진 50ml 둥근바닥 플라스크에 모르폴린(1.28g, 14.7mmol)을 투입하고, 상온에서 교반하면서 화합물 2(2.76g, 6.8mmol)를 가하였다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 반응시키고 밤새 정치시켰다. TLC는 원료가 완전히 반응했으며, 시스템에서 핑크색 불용성 고체가 생성되었음을 나타내었다. 여과와 함께, 여과액을 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 생성된 황색 오일을 진공 컬럼(석유 에테르:에틸 아세테이트 = 2:1)으로 분리하고, 생성물 성분을 수집하여 총 3.1g의 무색 오일(화합물 3)을 생성하였다 (수율: 92.3%). MS-FAB [M+H]+=460.1.

화합물 3(3.0g, 6.54mmol)을 칭량하고 에틸 아세테이트 45ml에 용해시키고 L-디벤조일타르타르산(L-DBTA, 1.2g, 3.27mmol)을 가하였다. 상온에서 혼합물을 교반하여 백색 고체를 석출시키고, 30분 후, 여과하여 고체를 수집하고, 60℃에서 1시간 더 건조한 후 칭량하여 총 1.25g의 백색 고체(좌선성 바이사이클릭 모르폴린: L-디벤조일 타르타르산 = 2:1)를 수득하였다 (수율: 56.8%). 키랄 HPLC 분석으로 중간체 4의 거울상 이성질체 과잉 백분율(%e.e.)은 98.0%, [α]₂₅=-130.4 (CH₂Cl₂)였다.

중간체 4(1.25g)를 에틸 아세테이트 25mL로 분산시키고 포화 탄산수소나트륨 용액 25mL로 2회 세척하고 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 농축하여 무색 오일을 얻었다. 오일을 에틸 아세테이트 10ml에 용해시키고 메탄설폰산 120㎕를 가하였다. 실온에서 교반하면서 결정화를 수행하였다. 여과와 함께, 생성된 고체를 메탄올 10 ml로 재결정화하여, 0.7 g의 (-)IMM-H014를 생성하였다 (백색 고체, HPLC 순도 >98.0%, [α]₂₅=-65.6 (CH₂Cl₂)). ¹H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ7.45 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 6.14 (s, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.96 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 4.37 (dd, J = 13.3, 4.0 Hz, 1H), 4.16 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 4.05 (d, J = 19.7 Hz, 8H), 3.96-3.81 (m, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.57 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 3.41 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.91 (s, 3H), 2.79-2.68 (m, 1H), 2.50 (d, J = 11.3 Hz, 1H).

비교예 1: 덱스트로 거울상 이성질체 (+)IMM-H014의 제조

화합물 3(3.0g, 6.54mmol)을 추가로 취하여 에틸 아세테이트 45ml에 용해시키고 D-디벤조일 타르타르산(1.2g, 3.27mmol)을 가하였다. 혼합물을 상온에서 교반하여 백색 고체를 석출시키고, 30분 후 고체를 수집하여 60℃에서 1시간 건조시키고, 칭량하여 1.2 g의 백색 고체(덱스트로 바이사이클릭 모르핀: D-디벤조일 타르타르산 = 2:1)를 생성하였다 (수율: 54.5%). 키랄 HPLC 분석으로 중간체 4의 거울상 이성질체 과잉 백분율(%e.e.)은 97.3%, [α]₂₅=+133.2 (CH₂Cl₂)였다.

중간체(1.2g)를 에틸 아세테이트 25mL로 분산시키고, 포화 탄산수소나트륨 용액 25mL로 2회 세척하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 농축하여 무색 오일을 얻었다. 오일을 에틸 아세테이트 10ml에 용해시키고 메탄설폰산 120㎕를 가하였다. 실온에서 교반하면서 결정화를 수행하였다. 여과와 함께, 생성된 고체를 메탄올 10 ml로 재결정화하여, 0.6g의 (+)IMM-H014를 얻었다 (백색 고체, HPLC 순도 >98.0%, [α]₂₅=-78.2 (CH₂Cl₂)). ¹H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ7.45 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 6.14 (s, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.96 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 4.37 (dd, J = 13.3, 4.0 Hz, 1H), 4.16 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 4.05 (d, J = 19.7 Hz, 8H), 3.96-3.81 (m, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.57 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 3.41 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.91 (s, 3H), 2.79-2.68 (m, 1H), 2.50 (d, J = 11.3 Hz, 1H).

약리학적 실험

실험예 1: 피토헤마글루티닌(ConA)-유발성 급성 면역 간 손상에 대한 IMM-H014 광학 거울상 이성질체의 효과

1. ConA-유발성 마우스 급성 면역 간 손상 모델의 구축 방법 및 투여 방법

SPF-등급 수컷 ICR 마우스(20-22g)를 순응시킨 후 무작위로 5개 군으로 나누었다: 블랭크 대조군, ConA-유발 모델군, 200 mg/kg (+)IMM-H014 군, 200 mg/kg (-)IMM-H014 군 및 200 mg/kg (±)IMM-H014 군, 각 군에 10마리의 마우스. 각 투여군은 1일 1회 위내 투여하였고, 총 3회 투여하였다. 블랭크 대조군과 모델군은 동일한 용량의 생리식염수를 위내 투여하였다. 마지막 투여 2시간 후, 블랭크 대조군을 제외한 각 군의 마우스에 꼬리 정맥에 20 mg/kg ConA를 1회 주사하였고, 각 투여량은 10 ml/kg이었다. 마우스는 금식시켰지만, 16시간 동안 물 부족 상태가 아니었으며 동물은 추가 치료를 기다리게 했다.

2. 생화학적 지수의 측정

마우스의 목을 베고 혈액을 채취하고 혈액 샘플을 실온에서 2시간 동안 그대로 유지하고 4000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 내 ALT, AST 및 LDH 함량은 전자동 생화학 분석기로 검출하였다.

3. 통계 분석

각 데이터는 숫자 평균 ± 표준 편차(±SD)로 표시되었다. 그룹간 비교는 t-테스트로 하였으며, P<0.05는 유의한 차이가 있음을 나타내었다.

4. 실험 결과

4.1 혈청 간 손상의 바이오마커 ALT의 ConA-유발성 증가에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 효과

혈청 ALT 수준은 간 손상 정도와 직접적이고 양인 상관 관계를 나타내며, 간 손상에 대한 혈청 바이오마커로 알려져 있다. 표 1의 결과는 20 mg/kg ConA가 마우스에서 유의한 간 손상을 초래하고 혈청 ALT 수준이 블랭크 대조군과 비교하여 유의하게 증가하였음을 보여주었다(P<0.001). (+)IMM-H014 및 (-)IMM-H014 모두가 혈청 ALT의 ConA-유발성 증가를 유의하게 감소시킬 수 있었다(P<0.001). IMM-H014 거울상 이성질체에 의한 ALT 감소율은 각각 95.3% 및 97.3%였으며, ALT 함량은 블랭크 대조군 수준으로 감소하였다. (+)IMM-H014 및 (-)IMM-H014 모두가 ConA-유발성 면역 간 손상에 대해 유의한 보호 효과를 보였고, (-)IMM-H014의 활성은 (+)IMM-H014의 활성보다 약간 우수했다. 동일한 용량의 (±)IMM-H014와 비교하여, 마우스 혈청 ALT 수준의 ConA-유발성 증가에 대한 (+)IMM-H014 및 (-)IMM-H014의 감소 효과는, (±)IMM-H014(역시 현저한 효능을 보였고, ALT의 감소율은 88.6%였음)의 효과보다 우수했고, 여기서 ALT에 대한 (-)IMM-H014의 감소 효과는 (±)IMM-H014의 효과와 비교하여 통계적 차이(P<0.05)를 가졌다. .

표 1. 마우스 혈청 ALT의 ConA-유발성 증가에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 감소 효과(n=10)

4.2 혈청 간 손상의 바이오마커 AST의 ConA-유발성 증가에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 효과

혈청 AST 수준의 증가는 또한 간세포 손상, 특히 간세포 미토콘드리아 손상의 중요한 지표 중 하나이며, 미토콘드리아가 손상되면 혈청 AST 수준이 현저하게 증가하여, 간세포의 중증도를 반영한다. 그 결과를 표 2에 나타내었으며, 20 mg/kg ConA는 마우스 간세포 미토콘드리아에 유의한 손상을 일으키고, 혈청 AST 수준은 블랭크 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(P<0.001). (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 및 (±)IMM-H014 모두가 혈청 AST의 ConA-유발성 증가 수준을 감소시킬 수 있었다. 모델군과 비교하여, (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 및 (±)IMM-H014에 의한 AST 감소율은 각각 44.8%, 72.9% 및 22.2%였으며, 여기서 (-)IMM-H014 군은 모델군과 비교하여 통계적 차이(P<0.01)를 보였다. AST를 감소시키는 (+)IMM-H014 및 (-)IMM-H014의 활성은 (±)IMM-H014의 활성보다 우수하였고, (-)IMM-H014의 활성은 최적이며 동일한 용량에서 (±)IMM-H014 군과 비교하여 통계적 차이(P<0.05)를 가졌다.

표 2. 마우스 혈청 AST의 ConA-유발성 증가에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 감소 효과(n=10)

4.3 혈청 LDH의 ConA-유발성 증가에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 효과

간이 손상되면 혈청 LDH 수준도 간세포 손상의 상황과 정도를 반영할 수 있다. 그 결과를 표 3에 나타내었다. 꼬리 정맥 주사에 의한 20 mg/kg ConA 투여는 심각한 간세포 손상을 일으켰고, 혈청 LDH 수준은 블랭크 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(P<0.001). (-)IMM-H014는 ConA-유발성 혈청 LDH 증가 수준을 유의하게 감소시킬 수 있었고, LDH 감소율은 최대 54.4%로, 모델군과 비교하여 통계적 차이(P<0.01)를 보였다. (+)IMM-H014 역시 혈청 LDH 증가에 대한 감소 효과가 있었고 감소율은 27.6%로, 모델군과 비교하여 통계적 차이가 없었다. (±)IMM-H014는 현재 용량에서 LDH 증가에 대한 미약한 감소 효과만을 보였고, 감소율은 6.4%였다. LDH 수준 감소 측면에서, (-)IMM-H014의 활성은 여전히 (+)IMM-H014 및 (±)IMM-H014의 활성보다 우수하였고, 동일한 용량에서 (-)IMM-H014와 (±)IMM-H014 간에 통계적 차이가 있었다(P<0.05).

표 3 마우스 혈청 LDH의 Con-A-유발성 증가에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 감소 효과(n=10)

실험예 2. 에티오닌-유발성 비알코올성 지방간 질환에 대한 IMM-H014 광학 거울상 이성질체의 효과

1. 에티오닌-유발성 마우스 비알코올성 지방간 모델의 구축 방법 및 투여 방법

SPF-등급 수컷 ICR 마우스(20-22g)를 순응시킨 후 무작위로 5개 군으로 나누었다: 블랭크 대조군, 에티오닌-유발 모델군, 200 mg/kg (+)IMM-H014 군, 200 mg/kg (-)IMM-H014 군 및 200 mg/kg (±)IMM-H014 군, 각 군에 5마리의 마우스. 모델 구축 3일 전에, 각 투여군은 1일 1회 위내 투여하였고, 총 3회 투여하였다. 블랭크 대조군과 모델군은 동일한 용량의 생리식염수를 위내 투여하였다. 각 투여량은 10mL/kg이었다. 마지막 투여 1시간 후, 각 군의 마우스에 250 mg/kg의 에티오닌을 1회 위내 투여하였다. 투여량은 20ml/kg이었다. 마우스는 금식시켰지만, 24시간 동안 물 부족 상태가 아니었으며 동물은 추가 치료를 기다리게 했다.

2. 간 조직 내 중성지방 및 콜레스테롤 함량의 결정

마우스는 개흉술을 시행하여 4℃에서 생리식염수로 세척한 간을 적출하였다. 간 조직의 일부를 용해물과 전기 균질기를 이용하여 10% 간 조직 균질액으로 제조하고, 그 중 일부를 중성지방 키트 및 콜레스테롤 키트의 측정 방법에 따라 측정하여 중성지방 및 콜레스테롤을 결정하고, 나머지 부분은 BCA 단백질 정량 키트로 측정하여 그 안의 단백질 함량을 결정하였다. 간 조직 내 중성지방과 콜레스테롤은 단백질 보정(protein correction)을 하였다.

3. 통계 분석

SPSS 소프트웨어를 채택하여 각각의 데이터는 수평균±표준편차(±SD)로 표시되었다. 그룹간 비교는 t-테스트로 하였으며 P<0.05는 유의한 차이가 있음을 나타내었다.

4. 실험 결과

4.1 마우스 간 조직 콜레스테롤(TC) 함량의 에티오닌-유발성 증가에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 효과

에티오닌은 메티오닌의 대사를 방해하여 아포지단백의 합성에 더욱 영향을 미침으로써, 간세포에서 합성된 콜레스테롤과 중성지방 등이 혈액으로 수송되지 못하여, 간세포 지질이 축적되어, 약물 유발성 비알코올성 지방간 모델이 형성되게 하였다. 그 결과는 표 4에 나타나 있으며, 250 mg/kg 에티오닌은 블랭크 대조군과 비교하여 간 조직의 콜레스테롤 함량의 유의한 증가(P<0.05)를 초래할 수 있었다. (+)IMM-H014 및 (-)IMM-H014 모두가 간 조직 TC의 에티오닌-유발성 축적을 감소시킬 수 있었으며, IMM-H014 거울상 이성질체(즉, (+)IMM-H014 및 (-)IMM-H014)에 의한 TC 감소율는 각각 27.2%, 32.4%로, (-)IMM-H014 군이 모델군과 비교하여 통계적 차이(P<0.05)를 보였다. (±)IMM-H014 역시 에티오닌-유발성 간조직 TC 증가에 유의한 억제 효과가 있었고, 모델군과 비교하여 통계적으로 차이가 있었다(P<0.05). (-)IMM-H014의 활성은 (±)IMM-H014의 활성보다 약간 우수하였다.

표 4. 에티오닌-유발성 마우스 간 조직 TC 축적에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 감소 효과(n=10)

4.2 마우스 간 조직 중성지방(TG) 함량의 에티오닌-유발성 증가에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 효과

그 결과를 표 5에 나타내었다. 250 mg/kg 에티오닌은 블랭크 대조군에 비해 간 조직 내 TG 함량의 유의한 증가(P<0.05)를 초래하여 비알코올성 지방간의 증상을 나타내었다. (-)IMM-H014는 에티오닌-유발성 간조직 TG 축적을 유의하게 감소시킬 수 있었으며, TG 감소율은 39.0%로 모델군과 비교하여 통계적으로(P<0.05) 차이가 있었다. (+)IMM-H014는, 단지 7.1%의 감소율로, 에티오닌-유발성 간 조직 TG 증가에 대해 약한 감소 효과를 나타냈다.

표 5. 에티오닌-유발성 간 조직 TG 축적에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 감소 효과(n=10)

실험예 3. 4-아세트아미도페놀-유발성 간세포 손상에 대한 IMM-H014 광학 거울상 이성질체의 효과

1. 세포 배양

인간 간암 HepG₂ 세포는 정상 인간 간세포의 특성을 잘 유지했으며, 10%의 소 태아 세륨(페니실린 100U/mL 및 스트렙토마이신 100μg/mL 포함)을 포함하는 DMEM 배지에서 다음과 같은 배양 조건에서 배양하였다: 37℃, 5% CO₂ 및 포화 습도. 트립신 0.25% 및 EDTA 0.02%를 함유하는 용액을 소화 및 계대에 사용하였다.

2. 4-아세트아미도페놀-유발성 시험관내 간세포 손상에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 보호 효과

MTT 방식을 채택했다. HepG₂ 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고 24시간 배양 후, (+)IMM-H014, (-)IMM-H014, (±)IMM-H014를 무독성 농도로 첨가하면서, 4-아세트아미도페놀(APAP, 최종 농도 8mM)을 첨가하였다. 실험을 위해 바이시클롤 양성 대조군, 용매 대조군 및 모델군을 설정하였다. 배양은 24시간 동안 계속되었다. 배양액 100㎕를 취하여 원심분리한 후, LDH 검출 키트 내 전자동 생화학 분석기를 이용하여 LDH 농도를 검출하였다. 잔류 배양액은 버리고, 각 웰에 MTT(0.5 mg/mL) 용액 100 μL를 첨가하여 4시간 동안 배양을 계속하였다. MTT 용액을 버리고 각 웰에 DMSO 150μL를 첨가하였다. 혼합 발진기에 의해 혼합물을 진동시키고, 마이크로플레이트 리더에서 570 nm의 파장에서 흡광도 값을 측정하였다. 세포 생존율(%) = (투여군의 OD 평균/용매 대조군의 OD 평균) × 100%.

3. 통계 분석

4. 실험 결과

(+)IMM-H014 10μM, (-)IMM-H014 10μM, (±) IMM-H014 10μM은 48시간 동안 HepG₂ 세포에 작용했으며, 세포에 유의한 독성은 없었고, 각각의 세포 생존율은 90%였다. 농도는 APAP 손상된 간세포에 대한 보호 효과를 조사하는데 사용되었다. 그 결과를 표 6에 나타내었고, 8mM의 APAP는 HepG₂ 세포를 유의하게 손상시킬 수 있었고, 세포 생존율은 블랭크 대조군과 비교하여 단지 38.33%(P<0.001)였다. (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 및 (±)IMM-H014는 각각 10μM의 용량에서 APAP-유발성 시험관내 인간 간세포 손상에 유의한 보호 효과를 가졌고(P<0.05, P<0.001, P<0.01), 세포 생존율의 증가율은 각각 41.4%, 74.8%, 32.1%였다. (-)IMM-H014의 활성은 상대적으로 최적이었으며, 동일한 투여량에서 (±)IMM-H014 투여군과 비교하여 통계적 차이를 보였다(P<0.05). 바이시클롤은 또한 APAP-유발성 간세포 손상을 유의하게 개선할 수 있었다(P<0.05).

표 6. 간세포 생존율의 4-아세트아미도페놀-유발성 감소에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 효과(n=3-4)

LDH(락트산 탈수소효소)는 세포 에너지 대사에 중요한 효소 중 하나이다. 세포가 죽으면 세포막이 파괴되고 LDH가 세포질에서 방출되며 LDH 수준은 세포 손상 정도에 비례한다. 그 결과를 도 1에 나타내었고, 8mM APAP는 24시간 동안 HepG₂ 세포에 작용했으며, 세포 배양 상청액 중 LDH 수준은 블랭크 대조군에 비해 유의하게 증가하여(P<0.01), 심각한 간세포 손상을 추가로 나타낸다. (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 및 (±)IMM-H014는 각각 10μM의 용량에서 LDH 수준을 감소시킬 수 있으며, 여기서 (-)IMM-H014 및 (±)IMM-H014의 LDH 수준은 모델군에 비해 통계적으로 차이가 있었고(P<0.05, P<0.05), (-)IMM-H014 군의 감소 효과는, 동일한 용량에서 (±)IMM-H014 군과 비교하여 약간 우수하였다.

실험예 4: 사염화탄소-유발성 간세포 손상에 대한 IMM-H014 광학 거울상 이성질체의 효과

1. 세포 배양

2. 사염화탄소-유발성 시험관내 간세포 손상에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 보호 효과

MTT 방식을 채택했다. HepG₂ 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고 24시간 배양 후, (+)IMM-H014, (-)IMM-H014, (±)IMM-H014를 무독성 농도로 첨가하면서, 사염화탄소(CCl₄, 최종 농도 0.6%)를 첨가하였다. 실험을 위해 바이시클롤 양성 대조군, 용매 대조군 및 모델군을 설정하였다. 그들은 24시간 동안 세포에 지속적으로 작용했다. 배양액은 버리고, 각 웰에 MTT(0.5mg/mL) 용액 100㎕를 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. MTT 용액을 버리고 각 웰에 DMSO 150μL를 첨가하였다. 혼합 발진기에 의해 혼합물을 진동시키고, 마이크로플레이트 리더에서 570 nm의 파장에서 흡광도 값을 측정하였다. 세포 생존율(%) = (투여군의 OD 평균/용매 대조군의 OD 평균) × 100%.

3. 통계 분석

데이터는 숫자 평균 ± 표준 편차(±SD)로 표시되었다. 그룹간 비교는 t-테스트로 하였으며, P<0.05는 유의한 차이가 있음을 나타내었다.

4. 실험 결과

(+)IMM-H014 10μM, (-)IMM-H014 10μM, (±) IMM-H014 10μM은 48시간 동안 HepG₂ 세포에 작용했으며, 세포에 유의한 독성은 없었고, 각각의 세포 생존율은 90%였다. 농도는 CCl₄ 손상된 간세포에 대한 보호 효과를 조사하는데 사용되었다. 그 결과를 표 7에 나타내었고, 0.6%의 CCl₄는 HepG₂ 세포를 유의하게 손상시킬 수 있었고, 세포 생존율은 블랭크 대조군과 비교하여 77.50% (P<0.001)였다. (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 및 (±)IMM-H014는 각각 10μM의 용량에서 CCl₄-유발성 시험관내 인간 간세포 손상에 유의한 개선 효과를 가졌고(P<0.05, P<0.01, P<0.01), 세포 생존율의 증가율은 각각 12.59%, 34.66%, 18.74%였다. 동일한 투여량의 (±)IMM-H014와 비교하여, (-)IMM-H014는 CCl₄-유발성 간세포 손상에 대해 더 개선된 보호 활성을 보였다. 바이시클롤은 또한 APAP-유발성 간세포 손상을 유의하게 개선할 수 있었다.

표 7. 4-아세트아미도페놀에 의한 간세포 생존율 감소에 대한 IMM-H014 거울상 이성질체의 효과(n=3-4)

약동학 실험

실험예 5

1. 실험 목적

수컷 SD 랫트에 IMM-H014의 단일 거울상 이성질체 및 라세미체를 위내 투여하여 랫트 체내에서의 약동학적 특성을 비교하였다.

2. 실험 장치 및 재료

2.1 실험 장치

Agilent 6470 삼중 4극 직렬(triple tandem quadrupole) LC-MS 미터(Agilent Technologies Inc.), Mettler AG135-모델 전자 분석 저울, 피펫 건, TDL-5-A 원심분리기, SIGMA 미니 원심분리기, 질소 송풍기 및 동물 체중계.

2.2 실험 재료

(+)IMM-H014, (-)IMM-H014, (±)IMM-H014; 메탄올(MS 등급, Fisher Scientific Inc. 제품, cat# 179097); 아세토니트릴(MS 등급, Fisher Scientific Inc. 제품, cat# 177802); 탈이온수(Hangzhou Wahaha Co.); 포름산(HPLC 등급, ROE SCIENTIFIC INC, cat# 6F2941); 에틸 아세테이트(MS 등급, Fisher Scientific Inc. 제품, cat# 166828); 1.5 ml EP 튜브.

2.3 실험 동물들

Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 구입한 수컷 SD 랫트 36마리(200±10g). 랫트는 중국 의학원 재료연구소의 동물 사육실 청정실에서, 매일 12시간 동안 23±2℃의 온도와 55±5%의 상대 습도에서 조명을 쬐며 사육했다. 실험동물은 자유롭게 물과 음식물을 섭취할 수 있었고, 2주간의 순응 후 실험을 시작하였다. 본 연구는 중국 의학원 재료연구소의 동물 실험윤리 위원회 규정을 준수한다.

3. 동물 실험

3.1 동물의 분류 및 투여

수컷 SD 랫트 36마리를 (+)IMM-H014 위내 투여군, (-)IMM-H014 위내 투여군 및 (±)IMM-H014 위내 투여군을 포함하는 각 군에서, 6마리씩 6개 군으로 무작위로 나누었다. 투여량은 50 mg/kg이었다. 랫트는 투여 전 12시간 동안 금식시켰고, 물은 자유롭게 마실 수 있게 하였다.

3.2 투여 용액의 제조

IMM-H014 원료 의약품 100mg을 칭량하여 정제수 20ml에 용해시켜 투여 용액 5mg/ml를 제조하고, 이것을 체중에 따라 1회 용량(1ml/100g)으로 투여하였다.

3.3 혈장 샘플의 수집

투여 전 0시간과, 투여 후 5분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 5시간, 8시간, 12시간 및 24시간째에, 안저 정맥총(fundus plexus venosus)에서 250μL의 혈액을 채취하고, 10μL의 헤파린나트륨을 포함하는 EP 튜브에 투입하고, 4000rpm에서 10분간 원심분리한 후 혈장을 채취하여 -80℃의 냉장고에 보관하였다.

4. 분석 방법

4.1 용액 제조

4.1.1 원액의 제조

IMM-H014 대조군 시료 5mg을 정밀하게 칭량하여 5ml 메스플라스크에 넣고 메탄올로 용해시켜 눈금까지 희석하여 1.0mg/ml의 대조군 원액을 제조하였다.

4.1.2 내부 표준 작업용액의 제조

카르바마제핀 대조군 시료 5.0 mg을 정밀히 칭량하여 5 mL 메스플라스크에 넣고 메탄올을 가하여 용해시키고 일정 부피로 조절하여, 1.0 mg/mL 농도의 내부 표준 원액을 제조하였다. 50 μL의 원액을 정밀하게 피펫팅하고 10 mL 메스플라스크에 넣고, 메탄올을 첨가하여 희석하고 각도 눈금(degree scale)에서 일정 부피로 조절하여, 5.0 μg/mL 농도의 내부 표준 농축 원액을 제조하였다. 내부 표준 농축원액 5.0 mL를 정밀하게 피펫팅하여 50 mL 메스플라스크에 넣고 메탄올을 가하여 희석하고 각도 눈금에서 일정 부피로 조절하여, 500ng/mL 농도의 내부 표준 작업용액을 조제하였다. .

4.1.3 일련의 농도 및 품질 관리 표준 용액으로 표준 곡선 작업 용액의 제조

1.0 mg/mL IMM-H014 원액 100 μL를 정밀하게 피펫팅하고 10 mL 메스플라스크에 넣고 메탄올로 희석하여 10 μg/mL의 IMM-H014 용액을 제조하였다. 용액을 메탄올로 단계적으로 희석하여, 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 및 5000 ng/ml 농도의 IMM-H014 시리즈 표준 용액을 제조했다.

1.0 mg/ml IMM-H014 원액을 정밀하게 피펫팅하고 메탄올로 단계적으로 희석하여 5, 100 및 4000 ng/ml 농도의 양 조절 표준 용액(quantity control standard solution)을 제조했다.

4.1.4 매트릭스 표준 곡선 시료 및 품질 관리 시료의 제조

2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 및 5000ng/ml의 표준 용액 50㎕를 각각 정밀하게 피펫팅하고, 30℃에서 질소 가스를 불어 건조시키고, 여기에 랫트 블랭크 혈장 50㎕를 추가했다. 혼합물을 3분 동안 휘저은 후 매트릭스 표준 곡선 시료를 제조했다.

5, 100, 및 4000 ng/ml의 표준용액 50㎕를 각각 정밀하게 피펫팅하고, 30℃에서 질소 가스를 불어 건조시키고, 여기에 랫트 블랭크 혈장 플라50㎕를 추가했다. 혼합물을 3분 동안 휘저은 후 품질 관리 시료를 제조했다.

4.2 시료의 전처리

혈장 시료 50μL를 정밀하게 피펫팅하고, 내부 표준 작업 용액 10μL를 첨가한 후, 1.5ml EP에 투입했다. 이것들을 30초 동안 휘젓고, 에틸 아세테이트 500μl를 첨가했다. 그런 다음 5분간 휘젓고 진동시키고, 4℃에서 10분간 정치한 후, 13000 r에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 취하고 30℃에서 N₂를 불어 건조시켰다. 잔류물을 초기 이동상 100 μL를 첨가하여 재용해시키고, 13000 r에서 5분간 원심분리하고, 상등액을 측정용 샘플링 병에 옮겼다.

4.3 크로마토그래피 조건

크로마토그래피 컬럼: Agilent ZORBAX SB-C18(2.1×100 mm, 3.5 μm)

이동상 A: 물 (0.1% 포름산, 1mM 암모늄 아세테이트); 이동상 B: 아세토니트릴 (0.1% 포름산)

컬럼 온도: 35℃; 샘플링 양: 3μL

용리: 0-2분: B의 40%-53%; 2-3분: B의 53%-40%

4.4 질량 분석 조건

이온 소스: ESI; 검출 모드: 양이온; 건조 가스의 온도: 300℃; 건조 가스의 유량: 질소 가스, 11 L/min; 분무 가스: 질소, 15 psi; 모세관 전압: 4000V; 스캐닝 모드: 다중 반응 측정(MRM); 이온 쌍 및 관련 전압 매개변수는 다음과 같다:

5. 데이터 처리

시료를 수집한 후 얻은 원본 데이터를 MassHunter QQQ 데이터 처리 소프트웨어를 채택하고 처리하여, 혈액-약물 농도 데이터를 얻었고; 그런 다음, DAS 소프트웨어를 통해 약동학적 매개변수를 계산하고; 마지막으로 SPSS 소프트웨어를 적용하여 t-테스트를 수행하여, 광학 활성은 동일하지만 배치가 다른 약물들과, 광학 활성이 다른 약물들 간에 통계적 차이가 있는지 비교했으며, 여기서 P<0.05는 유의한 차이가 있는 것으로 간주되었다.

이 연구에서는, SD 랫트의 3개 그룹에 IMM-H014의 단일 거울상 이성질체와 라세미체를 각각 위내 투여하여, 랫트 몸체에서 약동학적 특성을 연구했다. 연구 결과, 위내 투여된 (-)IMM-H014 및 (±)IMM-H014의 생체내 노출 수준이 (+)IMM-H014보다 우수한 것으로 나타났다.

표 8 각 랫트 그룹에 대한 평균 약동학 매개변수(이상값 제외)

Claims

좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염으로서,
좌선성 바이사이클릭 모르폴린의 구조는 하기 화합물 5로 나타내고, 약제학적으로 허용되는 염은 하기 구조식 (I)을 가지고,

상기 식에서, X는 무기산 및 유기산으로부터 선택되는, 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염.
제1항에 있어서,
상기 무기산은 플루오르화수소산, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아세트산, 황산 및 인산을 포함하고;
상기 유기산은 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산, 퀸산, 캄포르산, 캄포르술폰산, 아스파르트산, 글루탐산, 및 피로글루탐산을 포함하는, 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염.
제1항에 있어서,
상기 유기산은 L-타르타르산, L-디벤조일 타르타르산, L-디-p-메틸벤조일 타르타르산, L-디에틸 타르트레이트, L-말산, L-캄포르산, L-10-캄포르술폰산, R-(-)-만델산, L-퀸산, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-피로글루탐산, D-타르타르산, D-디벤조일 타르타르산, D-디-p-메틸벤조일 타르타르산, D-디에틸 타르트레이트, D-말산, D-캄포르산, D-10-캄포르술폰산, S-(-)-만델산, D-퀸산, D-아스파르트산, D-글루탐산, 및 D-피로글루탐산으로부터 선택되는, 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염.
제1항에 있어서,
상기 약제학적으로 허용되는 염은 하기 구조를 가진 (-)-바이사이클릭 모르폴린 메탄설포네이트로부터 선택되는, 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염:
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염의 제조 방법으로서,
하기 단계를 포함하는 제조 방법:

a) 바이시클롤의 수산기를 염소화하여 화합물 2를 얻는 단계;
b) 화합물 2를 모르폴린과 반응시켜 화합물 3을 얻는 단계;
c) 화합물 3을 키랄산 Y와 반응시켜 염을 형성하고, 염 용해도의 차이를 이용하여 유기 용매에서 분리(resolution)를 행하여 L형 염(levo salt) 4를 얻는 단계로서,
상기 키랄산 Y는 L-타르타르산, L-디벤조일 타르타르산, L-디-p-메틸벤조일 타르타르산, L-디에틸 타르타르산, L-말산, L-캄포르산, L-10-캄포르술폰산, R-(-)-만델산, L-퀸산, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-피로글루탐산, D-타르타르산, D-디벤조일 타르타르산, D-디-p-메틸벤조일 타르타르산, D-디에틸 타르트레이트, D-말산, D-캄포르산, D-10-캄포르술폰산, S-(-)-만델산, D-퀸산, D-아스파르트산, D-글루탐산 및 D-피로글루탐산으로부터 선택되며;
상기 유기 용매는 에틸 아세테이트, 아세톤, 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올 및 상기 용매들을 다른 비율로 혼합하여 얻어진 용매로부터 선택되고;
L형 거울상 이성질체 및 덱스트로 거울상 이성질체의 %e.e. 값이 각각 95% 초과인, 단계;
d) 염기의 작용하에 염 4가 유리 아민이 되도록 하는 단계;
e) 선택적으로, 유리 아민 5를 산 X와 반응시켜 염을 형성하여 구조식 (I)의 화합물을 얻는 단계,
여기서, X에 대한 정의는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같음.
치료적 및/또는 예방적 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 및 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 좌선성 바이사이클릭 모르폴린 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 제5항에 따른 약제학적 조성물의, 간 관련 질환의 예방 및/또는 치료용 약제의 제조에 있어서의 용도.
제7항에 있어서,
상기 간 관련 질환이 간 손상 관련 질환 및 간염 관련 질환을 포함하는, 용도.
제7항에 있어서,
상기 간 관련 질환이 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 약물 유발성 간 질환, 알코올성 간 질환, 비알코올성 간 질환, 자가면역성 간 질환, 간질환 진행에 의한 간섬유화, 간경변, 및 간부전으로부터 선택되는, 용도.